ES2277947T3 - Procedimientos de uso de un polipeptido afin a il-17 humana para tratar enfermedades. - Google Patents
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Abstract
El uso de un polipéptido que comprende los aminoácidos 19-197 del LP-48 como se muestra en SEQ ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una afección mediada por inflamación en un mamífero, en el que dicho trastorno se selecciona de sepsis, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA).
Description
Procedimientos de uso de un polipéptido afín a
IL-17 humana para tratar enfermedades.
La invención se refiere al tratamiento o
prevención de trastornos asociados con apoptosis de células
endoteliales o mediados por inflamación en mamíferos. Más
particularmente, la invención se refiere al tratamiento o prevención
de sepsis, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria
sistémica, síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA),
aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria y vasculopatía por aloinjerto.
El revestimiento de células endoteliales del
lumen vascular tiene un papel central en la modulación del tono
vascular, coagulación, permeabilidad, flujo sanguíneo, angiogénesis
y trombolisis. El mantenimiento de la homeostasis de la población
de células endoteliales vasculares incluye un balance de
proliferación, necrosis y apoptosis.
El proceso de apoptosis o muerte celular
programada, es un proceso de muerte celular controlado genéticamente
por el que diferentes estímulos activan una cascada de proteasas
celulares. Estas proteasas, conocidas como caspasas, escinden
específicamente estructuras celulares llevando al desmembramiento de
una célula en pequeños cuerpos apoptóticos sin liberación de
contenidos celulares o daño a las células circundantes. La apoptosis
de células endoteliales conduce a una alteración de la función
endotelial a través de la distorsión de la arquitectura de monocapa
endotelial como una consecuencia de la forma alterada y el tamaño
reducido de las células apoptóticas. Puede inducirse la apoptosis
de las células endoteliales por cualquiera de una cantidad de
estímulos ambientales, incluyendo radiación, glucosa elevada,
eliminación de la matriz extracelular y separación de células de la
membrana basal (Fujita y col., Int. Arch. of Allergy and Immunol.
117: 202 (1998)).
La apoptosis en células endoteliales puede
potencialmente estimularse directa o indirectamente por medio de
lipopolisacáridos ("LPS"). LPS, una endotoxina conocida, es un
componente de la membrana exterior de las bacterias gram negativas.
Además, las plantas y bacterias y virus patogénicos liberan
sustancias inductoras de lipopolisacáridos. El LPS es el principal
mediador en el desarrollo de choque inducido por endotoxinas. Las
estructuras químicas de moléculas de LPS obtenidas de diferentes
bacterias pueden variar de una manera específica de especie; sin
embargo, la región llamada región del lípido A es común a todas las
moléculas de LPS (Riestschel, E., y col. in Handbook of Endotoxins,
Elsevier, 1: 187-214 (1984)). La región del lípido A
media muchos, si no todos, los cambios fisiopatológicos
dependientes de LPS que caracterizan la sepsis y la bacteriemia por
gram negativos. LPS es una de las causas principales de muerte en
seres humanos aquejados con sepsis por gram negativos (van Deventer
y col., Lancet, 1: 605 (1988); Ziegler y col., J. Infect. Dis. 136:
19-28 (1987)). El LPS liberado de una infección por
bacterias gram negativas puede también jugar un papel en la
patología de afecciones autoinmunes tal como el síndrome de Reiter,
que está asociado con la artritis reumatoide.
La exposición a LPS causa que las células
endoteliales, leucocitos polimorfonucleares y células del linaje
monocito/macrófago liberen rápidamente una diversidad de productos
celulares, incluyendo sustancias inmunorreguladoras que son capaces
de iniciar, modular o mediar respuestas y procesos inmunes celulares
y humorales. Estudios demostraron que el LPS induce la liberación,
por parte de monocitos/macrófagos, de citoquinas inflamatorias
tales como TNF-\alpha, IL-1,
IL-6, e IL-12 las que juegan un
papel principal en la cascada de acontecimientos que llevan al
choque endotóxico.
El factor de necrosis tumoral (TNF) es
aparentemente un mediador primario de choque séptico (Beutler y
col., N. Eng. J. Med. 316: 379 (1987)). La inyección intravenosa de
LPS en animales y seres humanos produce una liberación rápida y
transitoria de TNF-\alpha (Beutler y col.,
Science, 229: 869 (1985); Mathison y col., J. Clin. Invest. 81:
1925 (1988)). La apoptosis es una de las muchas respuestas celulares
activadas tras la liberación de TNF-\alpha y su
subsiguiente unión a receptores celulares de
TNF-\alpha. Varios estudios han demostrado que el
TNF-\alpha induce directamente la apoptosis de
células endoteliales (Fujita y col., Int. Arch. of Allergy and
Immunol. 117: 202(1998)). In vitro, muchas células
endoteliales humanas son susceptibles de sufrir apoptosis por
TNF-\alpha sólo en presencia de inhibidores de
transcripción de ARN o inhibidores de síntesis de proteínas (tal
como cicloheximida). La supervivencia de la células epiteliales de
vena umbilical humana (HUVEC) tras la exposición a
TNF-\alpha, IL-1, o LPS, es
dependiente de la síntesis de proteínas citoprotectoras. Los
inhibidores de síntesis de proteínas previenen la síntesis de estas
proteínas tras la exposición a TNF-\alpha,
IL-1 o LPS (Zen y col., J. Biol. Chem. 274: 28808
(1999); Polunovsky y col., Exp. Cell Res. 214: 584 (1994)). También
se demostró que una proteína de unión a TNF puede proteger a ratones
contra la muerte inducida por LPS como también contra la apoptosis
de células endoteliales (Hamimovitz-Friedman y
col., J. Exp. Med. 186: 1831(1997)). Se piensa por
consiguiente que la inducción de TNF-\alpha como
respuesta a LPS juega un rol fundamental en la apoptosis de las
células endoteliales.
Además de TNF-\alpha, el
interferón-\gamma (IFN-\gamma) e
IL-12 también contribuyen a la sepsis inducida por
LPS (Ozmen, L., y col., J. Exp. Med. 180: 907, (1994)). Las células
T y células NK secretan IFN-\gamma. Los efectos
inmunomoduladores de IFN-\gamma son amplios y
diversos. En monocitos/macrófagos, las actividades de
IFN-\gamma incluyen: aumento de la expresión de
antígenos del CMH de clase I y Il; aumento de la producción de
IL-1, del factor activador de plaquetas y de
H_{2}0_{2}; protección de monocitos contra lisis mediada por
células LAK; regulación negativa de expresión de ARNm de
IL-8 que es regulada positivamente por
IL-2; y, con LPS, inducción de la producción de NO
(Billiau, A. y R. Dijkmans, Biochem. Pharmacol. 40: 1433 (1990);
Sen, G. C. y P. Lengyel, J. Biol. Chem. 267: 5017 (1992); Gusella,
G. L. y col., J. Immunol. 151: 2725 (1993); Bulut, V. y col.,
Biochem. Biophys. Res. Commun. 195: 1134 (1993)). El
IFN-\gamma demostró también ser quimiotáctico
para monocitos pero no para neutrófilos (Issekutz, A. C. y T. B.
Issekutz, J. Immunol.151: 2105 (1993)). El
IFN-\gamma potencia selectivamente la secreción de
IgG2a por medio de las células B estimuladas por LPS y la secreción
de IgG3 en activación de células B mediadas por antígenos tipo 2
independientes en células T (Snapper, C. M. y col., J. Exp. Med.
175: 1367 (1992); Snapper, C. M. y col., J. Immunol. 140: 2121
(1988)). También se informó que induce su propia expresión
(Halloran, P. F. y col., J. Immunol. 148: 3837 (1992)). El
IFN-\gamma mostró regular positivamente la
expresión de ICAM-1, pero no de
E-Selectin o VCAM-1 en células
endoteliales (Thornhill, M. H. y col., Scand. J. Immunol. 38:279
(1993)). Por otra parte, el IFN-\gamma mostró
contribuir a la reacción de Swan inducida por bacterias gram
negativas (Ogasawara, K. y col., J. Immuno. 160: 3522 (1998)). El
IFN-\gamma estimula a macrófagos y monocitos a
secretar TNF-\alpha y a su vez regula
positivamente la expresión del receptor de
TNF-\alpha.
A diferencia del IFN-\gamma,
la IL-12 es producida por macrófagos y linfocitos B.
La IL-12 demostró tener múltiples efectos en
células T y células NK (D'Andrea, A. y col., J. Exp. Med. 176: 1387
(1992); Chan, S. H. y col., J. Exp. Med.173: 869 (1991)). Estos
efectos incluyen la estimulación de producción de
IFN-\gamma y TNF por medio de células T y NK
activadas y latentes, sinergizando con otros inductores de
IFN-\gamma a niveles transcripcional y post
transcripcional la inducción la expresión del gen de
IFN-\gamma, potenciando la actividad citotóxica
de las células NK y T latentes, induciendo y sinergizando con
IL-2 la generación de células (LAK) killer
activadas por linfoquinas, actuando como un
co-mitógeno para estimular la proliferación de las
células T latentes e inducir la proliferación de células T y NK
activadas (D'Andrea, y col., (1992)). Las evidencias indican que la
IL-12, producida por macrófagos en respuesta a
agentes infecciosos, es un mediador central de la respuesta inmune
mediada por células por medio de sus acciones en el desarrollo,
proliferación y actividades de las células Th1 (Locksley, R. M.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90: 5879 (1993); Trinchieri, G.,
Immunol. Today 14: 335 (1993); Scott, P., Science, 260: 496 (1993);
Hseih, C. S. y col., Science 260: 547 (1993)). Estas actividades de
la IL-12 son antagonizadas por factores que están
asociados con el desarrollo de células T helper no comprometidas en
células Th2 y con la mediación de respuesta inmune humoral (por ej.,
IL-4 e IL-10; Locksley, R. M.,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90: 5879 (1993); Trinchieri, G.,
(1993); Scott, P., Science 260: 496, (1993); y Hseih, C. S. y col.,
Science 260: 547 (1993)).
Además de en la sepsis,
IFN-\gamma e IL-12 están regulados
positivamente en muchas otras enfermedades inflamatorias. Por
ejemplo, se ha demostrado que los anticuerpos contra
IL-12 pueden prevenir recaídas espontáneas e
inducidas por superantígenos de encefalomielitis autoinmune
experimental (EAE), una enfermedad autoinmune del sistema nervioso
central mediada por células T que sirve como un modelo para
esclerosis múltiple (Constantinescu, C. S. y col., J. Immunology,
161: 5097 (1998)). Se informó también que bloqueando la producción
de IFN-\gamma en células T a través del uso de
anticuerpos anti-IL-18 puede
obstaculizarse el desarrollo de la encefalomielitis autoinmune
experimental (Zamvil, S. S. y col., Annu. Rev. Immunol. 8: 579
(1990)).
También se considera a la diabetes tipo I como
enfermedad autoinmune. Más específicamente, está caracterizada por
una infiltración mononuclear espontánea del páncreas. La progresión
de la enfermedad hacia la insulitis se correlaciona con un aumento
de células Th1 y la pérdida subsiguiente de células \beta que dan
como resultado una deficiencia de insulina (Shehedeh, N. N. y col.,
J. Autoimmun., 6: 291-300(1993); Rothe, H., y
col., Diabetologia, 37: 1154-1158 (1994)). Los
efectos destructivos del IFN-\gamma producido por
estas células T se aliviaron usando anticuerpos neutralizantes para
IFN-\gamma o IL-12 (Debray Sachs,
M. y col., J. Autoimmun., 4: 237-248 (1994)).
Es importante la sinergia entre
IL-12 e IL-8 para la producción de
IFN-\gamma a partir de células T y células NK, lo
que mantiene la inflamación (Micallef, M. y col., J. Immunol., 26:
1647-1651 (1996)). Además de la estimulación de la
secreción de IFN-\gamma, IL-12
también aumenta la expresión del receptor de IL-18
en células Th0 y células B. Se demostró que IL-18
es producida por condrocitos articulares e induce respuestas
proinflamatorias y catabólicas, y se encontró producción aumentada
de IL-18 en líquido sinovial de pacientes con
artritis reumatoide (Tsaiwei, O., J. Immunol. 162:
1096-1100 (1999); Arthritis Rheum. 40: 274
(1997)).
Otra molécula proinflamatoria conocida es
IL-17. Es producida por linfocitos T activados,
principalmente por células T de memoria (Rouvier, E. y col., J.
Immunol., 150: 5445 (1993); Yao, Z. y col., J. Immunol., 155: 5483
(1995); Kennedy, J., y col., J. Interferon Cytokine Res., 16: 611
(1996); Fossiez, F. y col., J. Exp. Med., 183: 2593(1996)).
La IL-17 aparenta mediar la comunicación entre el
sistema inmune y el sistema hematopoyético. La
IL-17 derivada de células T induce la secreción de
IL-6, IL-8, ICAM-1 y
G-CSF por parte de los fibroblastos, aparentemente
por un mecanismo mediado por NF-kB (Yao, Z. y col.,
Immunity, 3: 811 (1995)). La IL-6, a su vez,
promueve el desarrollo de colonias de granulocitos/macrófagos y
G-CSF dirige el desarrollo de neutrófilos (Fossiez,
F. y col., J. Exp. Med. 183: 2593 (1996); Ikebuchi, K. y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. (USA), 84: 9035 (1987); Berliner, N., y col.,
Bloo, 85: 799 (1995); Roberts, A. W. y Metcalf, D., Exp. Hematol.
22: 1156 (1994); Broxmeyer, H. E., J. Exp. Med., 183: 2411
(1996)).
IL-17 también potencia la
proliferación de células T parcialmente activadas y regula
positivamente la producción de óxido nítrico en cartílago
osteoartrítico (Yao, Z. y col., Immunity 3: 811 (1995); Attur, M. G.
y col., Arthritis Rheum. 40: 1050 (1997)).
A diferencia de las citoquinas mencionadas hasta
el momento, IL-10 es una citoquina antiinflamatoria.
La IL-10 es una citoquina pleiotrófica que inhibe
la producción de una cantidad de citoquinas (incluyendo
IL-1, GM-CSF, TNF,
IL-6, IL-8, IL-10,
IL-12, e IFN-\gamma) por parte de
células Th-1 activadas, células NK y
monocitos/macrófagos. IL-10 demostró también
inhibir la actividad citotóxica de los macrófagos y estimular la
proliferación y diferenciación de células B, células cebadas y
células T del timo (Moore, K. W. y col., Annu. Rev. Immunol., 11:
165 (1993); Fiorentino, D. F. y col., J. Exp. Med., 170: 2081
(1989); Mosmann, T. R., Adv. Immunol., 56: 1 (1994)).
En el documento WO 99/60127 de Li, y col. se
informó un nuevo miembro de la superfamilia de las interleuquinas,
IL-17C (Li, y col., PNAS, 97 (2):
773-778). En el Documento WO 99/61617 se describió
una secuencia idéntica como IL-21. A pesar de la
identificación in silico de la secuencia polipeptídica de
esta citoquina, la utilidad terapéutica de la administración
exógena del polipéptido mismo, o agonistas o antagonistas del mismo,
permanece sin resolver en la técnica.
La presente invención se refiere generalmente a
procedimientos y terapias para prevenir o tratar eficazmente la
aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, sepsis, bacteriemia por gram
negativos, enfermedades alérgicas autoinmunes, diabetes tipo 1,
inflamación, artritis reumatoide, SDRA, vasculopatía por aloinjerto
y afecciones o síntomas relacionados con las mismas, administrando
polipéptidos LP-48 funcionales y por consiguiente
interviniendo en los mecanismos subyacentes de estos trastornos.
En un aspecto, la presente invención provee el
uso de un polipéptido que comprende los
aminoácidos19-197 del LP-48 como se
muestra en SEQ ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir un trastorno mediado por inflamación en un
mamífero, en el que dicho trastorno se selecciona de sepsis, choque
séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y síndrome de
distrés respiratorio agudo (SDRA).
En otro aspecto, la presente invención provee el
uso de un polipéptido que comprende los aminoácidos
19-197 del LP-48 como se muestra en
SEQ ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para tratar o
prevenir trastornos asociados con apoptosis de células endoteliales
en un mamífero, en el que dicho trastorno se selecciona de
aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, síndrome de distrés respiratorio
agudo (SDRA) y vasculopatía por aloinjerto.
Los polinucleótidos de preferencia para la
práctica de la presente invención son aquellos que codifican el
polipéptido LP-48 en toda su longitud como se
muestra en SEQ ID Nº 2. Los polinucleótidos de más preferencia son
aquellos que codifican el polipéptido LP-48 maduro
como está representado por los aminoácidos 19-197 de
SEQ ID Nº 2. Los polipéptidos de mayor preferencia para la práctica
de la presente invención son aquellos que comprenden los
polinucleótidos que codifican LP-48 unidos en marco
a secuencias de polinucleótidos adicionales que codifican
secuencias de aminoácidos diferentes de LP-48.
Un polipéptido de preferencia para la práctica
de la presente invención es el polipéptido LP-48 en
toda su longitud como se muestra en SEQ ID Nº 2. Un polipéptido de
más preferencia es el polipéptido LP-48 maduro
representado por los aminoácidos 19-197 de SEQ ID Nº
2. Los polipéptidos de mayor preferencia para la práctica de la
presente invención son proteínas de fusión de LP-48
que comprenden un polipéptido de LP-48 o un
fragmento del mismo unido a secuencias de aminoácidos adicionales
de polipéptidos diferentes de LP-48. En particular,
la proteína de fusión de LP-48 para uso en la
invención puede comprender los aminoácidos 19-197
del LP-48 como se muestra en SEQ ID Nº 2 o una
secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº 2, y una
secuencia de inmunoglobulina de dominio constante.
El término "LP-48" se
refiere a la secuencia de ácido nucleico, SEQ ID Nº 1, o a la
secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº 2, de un miembro de la
superfamilia de las interleuquinas. LP-48 se informó
como IL-17C (Documento WO 99/60127; Li, y col.,
PNAS, 97 (2): 773-778), y también aparece en la base
de datos GenBank con el nº de acceso AF152099. También aparece una
secuencia idéntica como IL-21 en el Documento WO
99/61617.
El gen de LP-48 (SEQ ID Nº 1)
comprende un único gran marco de lectura abierto, que codifica un
polipéptido de 197 aminoácidos (SEQ ID Nº 2). Se espera que la
expresión de SEQ ID Nº 1 in vivo o por células de mamíferos
in vitro daría como resultado una proteína madura de 179
aminoácidos. Tal proteína madura está incluida dentro de la
definición de "LP-48" o "polipéptido
LP-48".
Las secuencias de LP-48 pueden
aislarse de la naturaleza o pueden producirse por medios sintéticos
o recombinantes. La frase "polipéptido LP-48",
como se usa en este documento, supone la inclusión, pero no se
limita a, formas glicosiladas, no glicosiladas y/o modificadas del
polipéptido LP-48 como se muestra en la SEQ ID Nº 2
(o el polipéptido LP-48 maduro) además comprende
una o más sustituciones conservativas de, adiciones de, o
delecciones de, la secuencia de aminoácido como se muestra en SEQ
ID Nº 2 a condición de que dichas formas modificadas del
polipéptido LP-48 demuestren actividad biológica
sustancialmente similar como la de los polipéptidos
LP-48 descritos en este documento en al menos en
uno de los ensayos ejemplificados en este documento. El término
"actividad" o la frase "actividad biológica" en referencia
al polipéptido LP-48 trata de la capacidad de un
polipéptido LP-48 para inducir, in vivo y/o
in vitro, una o más de las consecuencias biológicas
atribuidas a polipéptidos LP-48 por la presente
descripción. Por consiguiente, la actividad de polipéptidos
LP-48 puede evaluarse por medio de uno o más de los
ensayos in vivo o in vitro que se ejemplifican en este
documento. Una actividad biológica de preferencia incluye, por
ejemplo, la capacidad de proteger contra el choque séptico inducido
por LPS como se determina por el procedimiento descrito en el
Ejemplo 12.
El término "polipéptido
LP-48" también supone abarcar polipéptidos que
contienen pro-, o preprosecuencias, que cuando al procesarse dan
como resultado la producción de polipéptido LP-48 o
fragmento del mismo. La secuencia líder natural de
LP-48 humano, representada por aminoácidos
1-18 de la SEQ ID Nº 2, es un ejemplo de una
pro-secuencia tal que al ser procesada podría dar
como resultado la producción de un polipéptido LP-48
o un fragmento del mismo.
De manera similar, los polinucleótidos o
polipéptidos LP-48 útiles para la práctica de la
presente invención adicionalmente pueden contener además otras
secuencias de polinucleótidos o polipéptidos diferentes de
LP-48, respectivamente, a condición de que el
polipéptido codificado por ello aún retiene una actividad funcional
esencial de LP-48 como se describe en este
documento. De manera más específica, los polipéptidos
LP-48 útiles en la práctica de la presente
invención también incluyen moléculas de proteínas quiméricas que no
se encuentran en la naturaleza que comprenden una fusión
traduccional, o en algunos casos una fusión enzimática, en la que
dos o más proteínas diferentes o fragmentos de las mismas están
unidos de manera covalente en una cadena polipeptídica única. Un
polipéptido LP-48 de preferencia para la práctica de
la presente invención comprende al menos un fragmento funcional del
polipéptido LP-48 en su extensión total como se
muestra en la SEQ ID Nº 2 y al menos una función efectora de un
dominio de inmunoglobulina constante. Las moléculas de fusión son
una subclase de fusiones de polipéptidos quiméricos de polipéptidos
LP-48 que además contienen una porción de una
secuencia de inmunoglobulina (referida en este documento como
LP-48-Ig). Las fusiones quiméricas
LP-48-Ig también pueden comprender
formas monoméricas, homo- o heteromultiméricas, y particularmente
homo- o heterodiméricas, u homo- o heterotetraméricas;
opcionalmente, las formas quiméricas pueden estar en formas
diméricas o formas de cadenas pesadas homodiméricas. Las formas
tetraméricas que contienen una unidad estructural de cuatro cadenas
son las formas naturales en las que se presentan IgG, IgD e IgE.
Una estructura de cuatro cadenas también puede repetirse. Se
conocen en la técnica diversas formas quiméricas que contienen una
inmunoglobulina nativa (Documento WO 98/25967). La proteína humana
madura del Ejemplo 12 es un ejemplo de una
"LP-48-Ig". Como se usa en este
documento, el término
"LP-48-Ig" designa moléculas
similares a anticuerpos que combinan al menos un dominio
LP-48 con las funciones efectoras del dominio de
inmunoglobulina constante. La secuencia de dominio de
inmunoglobulina constante puede obtenerse a partir de cualquier
inmunoglobulina, tales como los subtipos IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o
IgG-4, IgA (incluyendo IgG-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM. Las fusiones de preferencia
contienen el LP-48 fusionado con el extremo amino
de la región Ig. Sin embargo, también se contemplan las fusiones de
un polipéptido LP-48 o un fragmento del mismo con
el extremo C terminal de la región Ig.
Los polipéptidos fusionados
LP-48 también pueden comprender residuos de
aminoácidos adicionales, tal como etiquetas de afinidad que ayudan
en la purificación o identificación de la molécula o proveen sitios
de unión a un ligando natural. Estos residuos adicionales de
aminoácidos están típicamente ubicados en, pero no se limitan a, el
extremo N- o C- terminal del polipéptido LP-48.
El término "marcado por epitope" que se usa
en este documento se refiere a un polipéptido quimérico que
comprende un polipéptido LP-48, o secuencia de
dominio del mismo, fusionado a un "polipéptido marcador". El
polipéptido marcador tiene suficientes residuos para proveer un
epitope contra el que pueda hacerse un anticuerpo, o que pueda ser
identificado por algún otro agente y aún es suficientemente corto
para no interferir con la actividad del polipéptido
LP-48. De preferencia el polipéptido marcador
también es bastante único de manera que el anticuerpo no reacciona
de manera cruzada con otros epitopes. Generalmente los polipéptidos
marcadores adecuados tienen al menos seis residuos aminoácidos y
usualmente entre aproximadamente 8 y aproximadamente 50 residuos
aminoácidos (de preferencia, entre aproximadamente 10 y
aproximadamente 20 residuos).
El término "aminoácido" se usa en este
documento en su sentido más amplio, e incluye tanto aminoácidos que
se presentan naturalmente como los que se presentan de manera no
natural, incluyendo análogos de aminoácidos y derivados. Los
últimos incluyen moléculas que contienen un fragmento de aminoácido.
Un experto en la técnica reconocerá, en vista de esta amplia
definición, que en este documento la referencia a un aminoácido
incluye, por ejemplo, aminoácidos L-proteogénicos
que se presentan naturalmente; aminoácidos D-; aminoácidos
modificados químicamente tales como análogos de aminoácidos y
derivados; aminoácidos no proteogénicos que se presentan
naturalmente tales como norleucina, \beta-alanina,
ornitina, etc.; y compuestos sintetizados químicamente que tienen
propiedades conocidas por los expertos en la técnica por ser
característicos de los aminoácidos.
Es ventajosa en una cantidad de maneras
diferentes la incorporación de aminoácidos que se presentan de
manera no natural, incluyendo aminoácidos no nativos sintéticos,
aminoácidos sustituidos, o uno o más aminoácidos-D
en un análogo LP-48 ("polipéptidos
D-LP48"). Los polipéptidos que contienen
aminoácidos-D exhiben estabilidad aumentada in
vitro o in vivo en comparación con los que contienen
aminoácidos-L. De este modo, la construcción de
polipéptidos que incorporan aminoácidos-D, pueden
ser particularmente útiles cuando se desea o requiere estabilidad
mayor in vivo. Más específicamente los
péptidos-D son resistentes a peptidasas y proteasas
endógenas, por eso proveen biodisponibilidad mejorada de la
molécula y tiempos de vida prolongados in vivo cuando tales
propiedades son deseables. Cuando se desea permitir al péptido
permanecer activo solamente por un período corto de tiempo, el uso
de aminoácidos-L en estos casos permitirá a las
peptidasas, proteasas endógenas digerir la molécula, limitando por
eso la exposición de la célula a la molécula. Adicionalmente, los
péptidos-D no pueden procesarse eficazmente para la
presentación restringida al complejo mayor de histocompatibilidad de
clase II a las células T cooperadoras, y por lo tanto tienen menos
probabilidad de inducir respuestas inmunes humorales en todo el
organismo.
Además del uso de aminoácidos-D,
los expertos en la técnica son conscientes de que las modificaciones
en la secuencia de aminoácidos de un péptido, polipéptido o
proteína puede dar como resultado una segunda generación de
péptidos equivalentes, o posiblemente mejorados, que exhiben
características funcionales equivalentes o superiores cuando se los
comparan con las secuencias de aminoácidos originales. Las
alteraciones en los polipéptidos LP-48 de la
presente invención que resultan en análogos de LP-48
pueden incluir una o más inserciones de aminoácidos, delecciones,
sustituciones, truncamientos, fusiones, movimientos de secuencias de
subunidades, y similares, cualesquiera por manipulación humana, a
condición de que las secuencias producidas por tales modificaciones
tengan sustancialmente la(s) misma(s)
actividad(es) (o mejorada o reducida, como sea deseable) que
las secuencias de polipéptidos LP-48 descritas en
este documento. El término "análogo de LP-48"
se refiere a cualquier forma modificada de un polipéptido
LP-48 que exhibe sustancialmente la misma actividad
biológica o mejorada in vivo y/o in vitro en
comparación con la forma no modificada correspondiente y es más
deseable farmacéuticamente, en al menos un aspecto, comparado con
el polipéptido LP-48 no modificado
correspondiente.
Como se usa en este documento, el término
"análogo de LP-48" tiene la intención de
abarcar los polipéptidos LP-48 como se definieron
en este documento en el que el polipéptido LP-48
comprende además al menos una modificación normalmente no nativa de
polipéptidos LP-48. El término "modificación"
incluye cualquier cambio en la estructura (es decir, un cambio
cualitativo) de una proteína. Dichas modificaciones pueden incluir,
pero no están limitadas a, cambios en la secuencia de aminoácidos,
variación de empalme transcripcional o traduccional, modificaciones
pre o post traduccionales a la secuencia de ADN o ARN, agregado de
macromoléculas o moléculas pequeñas de ADN, ARN o proteína, tales
como péptidos, iones, vitaminas, átomos, moléculas que contienen
azúcares, moléculas que contienen lípidos, pequeñas moléculas y
similar, bien conocidos en la técnica. Un tipo de modificación
proteica es el por medio de uno o más cambios en la secuencia de
aminoácidos (sustitución, deleción o inserción). Tales cambios
podrían incluir, en uno o más aminoácidos, un cambio de un
aminoácido cargado a un aminoácido con carga diferente, de un
aminoácido no cargado a un aminoácido cargado, de un aminoácido
cargado a un aminoácido no cargado, como se discute a continuación
o anteriormente. Otro tipo de modificación de proteínas es por
medio de cambios en el procesamiento de la proteína en la célula. Un
ejemplo no limitante es cuando algunas proteínas tienen una
"etiqueta de localización" que especifica en qué sitio de la
célula (o afuera de ella) deberían usarse. Tal etiqueta o marcador
puede estar en la forma de un péptido, un azúcar o un lípido, el
que al agregarse o eliminarse de la proteína, determina dónde está
localizada la proteína en la célula.
Un nuevo tipo de modificación de proteína es el
debido a la unión de otras macromoléculas a una proteína. Este
grupo puede incluir, pero no está limitado a, cualquier
adición/eliminación de tal macromolécula. Estas moléculas pueden
ser de muchos tipos y pueden ser permanentes o temporarias. Los
ejemplos incluyen: (i) polirribosilación, (ii) ADN/ARN (de hebra
simple o doble); (iii) lípidos y fosfolípidos (por ejemplo, para
unión a membrana); (iv) sacáridos/polisacáridos; y (v)
glicosilación (agregado de distintos tipos de azúcar y ácidos
siálicos - en una diversidad de estructuras simples y ramificadas).
Otro tipo de modificación de proteínas es el debido a la unión de
otras moléculas pequeñas a las proteínas. Los ejemplos pueden
incluir, pero no están limitados a: (i) fosforilación; (ii)
acetilación; (iii) uridilación; (iv) adenilación; (v) metilación, y
(vi) agregado de casquetes (diversas modificaciones complejas del
extremo N terminal de la proteína por razones variadas). La mayor
parte de estos cambios se usan frecuentemente para regular una
actividad de una proteína, (v) y (vi) también se usan para cambiar
la semivida de la propia proteína. Estos cambios en las proteínas
pueden detectarse en electoforesis en 2 dimensiones en gel
incorporando varias técnicas, tales como etiquetado, cambios en pI,
anticuerpos y otras técnicas específicas dirigidas a las moléculas
mismas, conocidas en la técnica. Puede haber cambios de peso
molecular, pero usualmente pueden no ser detectables mediante 2DGE.
Para detectar y caracterizar estas modificaciones resulta de
preferencia MALD (espectrometría de masa de desorción láser asistida
por matriz). Tales modificaciones están generalmente dirigidas
generalmente a mejorar cualquier característica terapéutica pobre
de un polipéptido LP-48 no modificado aumentando la
especificidad por aquella molécula como blanco, solubilidad,
estabilidad, semivida del suero, afinidad por receptores marcados,
susceptibilidad a proteolisis, resistencia a la depuración in
vivo, facilidad de purificación y/o disminución de antigenicidad
y/o frecuencia requerida de administración.
El término "causa" intenta incluir los
acontecimientos moleculares de inicio dan como resultado los
síntomas de apoptosis, inmunodeficiencia, cáncer, inflamación, y/o
enfermedades infecciosas o están implicados en la respuesta del
organismo a inmunodeficiencia, cáncer y/o enfermedad infecciosa; el
término "media" incluye cualquier acontecimiento molecular que
forme parte de la cadena causal de acontecimientos que dan como
resultado los síntomas de apoptosis, inmunodeficiencia, cáncer,
inflamación, y/o enfermedad infecciosa o son parte de la respuesta
del organismo a la inmunodeficiencia, cáncer, inflamación, y/o
enfermedades infecciosas.
El término "marcador HIS" como se usa en
este documento se refiere a la secuencia LP-48, o
porción de la misma, fusionada a una secuencia de polipéptido muy
rica en histidina. Esta marcador HIS tiene residuos de histidina
suficientes para proveer un medio de purificación único para
seleccionar por las propiedades de los residuos de histidina
repetidos, y aún es lo suficientemente corto como para no interferir
con la actividad de la secuencia extracelular del dominio de
LP-48.
Otros marcadores ejemplares incluyen, pero no se
limitan a, un marcador "HA", que contiene aminoácidos de un
fragmento de una hemaglutinina, y un marcador "FLAG" (Immunex
Corp., Seattle, WA), un marcador de seis aminoácidos. Estos y otros
polipéptidos marcadores apropiados generalmente tienen al menos seis
residuos aminoácidos y usualmente desde aproximadamente 4 hasta
aproximadamente 20 residuos aminoácidos (de preferencia, desde
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 10 residuos, y de más
preferencia 6, tal como HHHHHH). El marcador HA corresponde a un
epitope derivado del polipéptido de hemaglutinina de influenza
(Wilson y col., Cell 37: 767-778 (1984)). La fusión
del marcador HA con el polipéptido blanco permite fácilmente la
detección y la recuperación del polipéptido recombinante con un
anticuerpo que reconoce el epitope HA. El marcador FLAG se aplica
de manera similar para la detección y purificación del polipéptido
con un anticuerpo que reconoce el epitope FLAG.
Como se usa en este documento, el término
"inmunoadhesión", algunas veces nombrado como una fusión Fc,
designa moléculas similares a anticuerpos que combinan la
especificidad de unión de una proteína heteróloga (una
"adhesión") con las funciones efectoras de dominios constantes
de inmunoglobulinas. Estructuralmente, las inmunoadhesiones
comprenden una fusión de una secuencia de aminoácidos con la
especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de unión
y reconocimiento de antígeno de un anticuerpo (es decir,
"heterólogo"), y una secuencia de dominio constante de
inmunoglobulina. La parte de adhesión de una molécula de
inmunoadhesión típicamente es una secuencia de aminoácido contigua
que comprende al menos el sitio de unión de un receptor o un
ligando. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la
inmunoadhesión puede obtenerse a partir de cualquier
inmunoglobulina, tales como IgG-1,
IgG-2, IgG-3 o subtipos
IgG-4, IgA (incluyendo IgA-1 e
IgA-2), IgE, IgD o IgM.
El término "antagonista" se usa en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que bloquea parcial
o totalmente, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un
polipéptido LP-48 nativo descrito en este
documento. De manera similar el término "agonista" se usa en el
sentido más amplio e incluye cualquier molécula que imita una
actividad biológica de un polipéptido LP-48 nativo
descrito en este documento. El término "antagonista"
específicamente incluye anticuerpos o fragmentos de anticuerpos
antagonistas, ribozimas, ácidos nucleicos anti sentido, así como
moléculas orgánicas pequeñas. Los procedimientos para la
identificación de agonistas o antagonistas de un polipéptido
LP-48 pueden comprender el contacto de un
polipéptido LP-48 con una molécula agonista o
antagonista candidata y la medición de un cambio detectable en una o
más actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido
LP-48.
Los "anticuerpos" (Abs) e
"inmunoglobulinas" (Igs) son glicoproteínas que tienen las
mismas características estructurales. Mientras que los anticuerpos
exhiben especificidad de unión a un antígeno específico, las
inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas
similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígeno.
Los polipéptidos de la última clase son, por ejemplo, producidos a
bajos niveles por el sistema linfático y a niveles aumentados por
mielomas. El término "anticuerpo" se usa en el sentido más
amplio y abarca específicamente, sin limitación, anticuerpos
monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos
multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados
por al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos
mientras que exhiban la actividad biológica deseada.
Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden
una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia la región
variable o de unión al antígeno de un anticuerpo intacto. Los
ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab',
F(ab')1 y fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales
(Zapata y col., Protein Engin. 8 (10): 1057-1062
(1995)); moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de
anticuerpos.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena
única" o "sFv" comprenden los dominios V_{H} y V_{L} del
anticuerpo, en el que estos dominios están presentes en una cadena
de polipéptidos única. De preferencia, el polipéptido Fv además
comprende un conector de polipéptidos entre el dominio V_{H} y
V_{L}, que permite al sFv formar la estructura deseada para la
unión al antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun, The
Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore,
eds., Springer-Verlag, New York, págs.
269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a
fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de unión al
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena
pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable de cadena liviana
(V_{L}) en la misma cadena de polipéptidos
(V_{H}-V_{L}). Al usar un conector que es
demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios
en la misma cadena, los dominios están forzados a aparearse con los
dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión
al antígeno. Los diacuerpos están descritos de manera más completa
en, por ejemplo, los documentos EP 404.097 y WO 93/11161; y
Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
6444-6448(1993).
Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido
identificado y separado y/o recuperado de un componente de su medio
natural. Los componentes contaminantes de su medio natural son
materiales que podrían interferir con usos para el anticuerpo como
diagnóstico o terapéuticos, y pueden incluir enzimas, hormonas y
otros solutos proteináceos o no proteináceos. Resulta de
preferencia que el anticuerpo esté purificado (1) hasta más del 95%
en peso de anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y
de más preferencia más del 99% en peso, (2) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de
aminoácidos N terminal o interna por medio del uso de un
secuenciador de tasa rotatoria, o (3) hasta homogeneidad por
SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras usando azul Coomassie, o de preferencia, tinción de
plata. Los anticuerpos aislados incluyen el anticuerpo in
situ dentro de células recombinantes ya que al menos un
componente del medio natural del anticuerpo no estará presente.
Generalmente, sin embargo, los anticuerpos aislados se prepararán
mediante al menos una etapa de purificación.
El término "anticuerpo" como se usa en este
documento describe anticuerpos, fragmentos de anticuerpos (tales
como, pero no limitados a, Fab, Fab', F(ab')_{2} y
fragmentos Fv) y versiones modificadas de los mismos, como se
conocen en la técnica (por ej., quiméricos, humanizados,
recombinantes, aparentados, resurfaced o
injertados-CDR). Se supone que el término
"anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales (MAbs), anticuerpos quiméricos, anticuerpos
multiespecíficos (por ej., biespecíficos, triespecíficos, etc),
moléculas de unión a polipéptidos de cadena única y anticuerpos
anti-idiotípicos (anti-id).
El término "aislado" en referencia a un
polinucleótido o polipéptido de LP-48 se refiere a
una molécula de LP-48 que ha sido identificada y
separada y/o recuperada de al menos un contaminante a partir del que
ha sido producida. Los componentes contaminantes son materiales que
pueden incluir componentes celulares, tales como enzimas, hormonas
y otros solutos proteináceos o no proteináceos. Generalmente, sin
embargo, las moléculas de LP-48 aisladas se
prepararán mediante al menos una etapa de purificación.
"Sustitución conservativa" o "sustitución
conservativa de aminoácidos" se refiere a un reemplazo de uno o
más residuos aminoácido en una proteína o péptido. Las sustituciones
conservativas de interés se muestran en la Tabla 1 junto con
sustituciones de preferencia. Si tales sustituciones mantienen o
mejoran la función deseada, entonces se introducen más cambios
sustanciales, se agregan a la lista como sustituciones ejemplares
en la Tabla 1 o como se describe además a continuación en referencia
a las clases de aminoácidos, y se seleccionan los productos. Una
sustitución en una posición particular puede constituir 1, 2, 3, 4,
5, 10, 15, 20 aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Los residuos que se presentan naturalmente están
divididos en grupos en base a las propiedades comunes de la cadena
lateral:
- (1)
- hidrofóbos: cys, ser, thr;
- (2)
- hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
- (3)
- ácidos: asp, glu;
- (4)
- básicos: asn, gln, his, lys, arg;
- (5)
- residuos que influencian la orientación de cadena: gly, pro; y
- (6)
- aromáticos: trp, tyr, phe.
El término "fragmento de los mismos" como
se usa en este documento se refiere a un fragmento, parte o
subregión de una molécula de ácido nucleico o proteína cuya
secuencia está descrita en este documento, tal que el fragmento
comprende 10, 15, 20 o más aminoácidos, o 15, 30, 45, 60 o más
nucleótidos contiguos en el compuesto original de proteína o ácido
nucleico. Al referirse a compuesto de ácido nucleico, "fragmento
del mismo" se refiere a 20, 30, 45, 60 o más nucleótidos
contiguos, derivados del ácido nucleico original, y también, debido
al código genético, de la secuencia complementaria. Por ejemplo si
el fragmento implica la secuencia
5'-AGCTAG-3', entonces "fragmento
del mismo" incluirá también la secuencia complementaria,
3'-TCGATC-5'.
"Fragmento funcional" o "fragmento
funcionalmente equivalente", como se usa en este documento, se
refiere a una región, o fragmento de una proteína en toda su
extensión, o secuencia de aminoácidos que son capaces de competid
con LP-48 endógeno o nativo por la unión a un
receptor de LP-48 natural o expresado de manera
recombinante. La presente invención también provee el uso de
fragmentos de las proteínas de LP-48 descritas en
este documento en el que dichos fragmentos retienen la capacidad de
unirse a un ligando natural. Como se usa en este documento,
"fragmentos funcionales" incluye fragmentos fusionados o no
fusionados a secuencias adicionales que retienen y exhiben, bajo
condiciones adecuadas, bioactividad medible, por ejemplo, protección
contra la exposición a LPS in vivo. Los fragmentos
funcionales de las proteínas descritas en este documento pueden
producirse como se describe en el mismo, de preferencia usando
técnicas de clonación para crear versiones más pequeñas del
LP-48 funcionante, quitando secuencia del extremo
5', del extremo 3', de ambos extremos, o de un sitio
interno.
interno.
La presente invención incluye procedimientos
para usar proteínas LP-48 así como cualquier análogo
funcional que retiene la capacidad para usarlo terapéuticamente de
acuerdo con la presente invención. Pueden realizarse modificaciones
de la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las sustituciones
provistas en la Tabla 1.
El término "homólogo" se refiere a una
molécula de un organismo dado que exhibe similitud y/o identidad de
secuencia y tiene actividad biológica sustancialmente similar a la
molécula de un organismo diferente. Por ejemplo, un polipéptido de
ratón que funciona en el ratón de manera equivalente a la que
funciona el LP-48 humano en seres humanos se puede
denominar homólogo de LP-48 de ratón. El término
"homólogo" intenta también abarcar dos o más genes o proteínas
de diferentes organismos o dentro de un mismo organismo que exhiben
similitud y/o identidad de secuencia. El término "homólogo"
como se usa en este documento incluye variantes alélicas, así como
variantes empalmadas de una secuencia de polinucleótidos de
LP-48.
Como se usa en este documento, un "homólogo
funcional" de LP-48 mantiene la capacidad de
unión tal que es capaz de unir al menos uno de sus ligandos
naturales. Además, la afinidad de unión típicamente será de al
menos 30%, 40% o 50% de la de LP-48 nativo de SEQ ID
Nº 2, y de más preferencia al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% o
mayor que el 100%, 110%, 120%, 150%, 200% o 1000%.
El término "proteína de fusión" denota una
molécula de proteína híbrida que no se presenta en la naturaleza
que comprende una fusión traduccional o fusión enzimática en la que
dos o más segmentos de proteínas diferentes que no se presentan
naturalmente en una secuencia contigua se unen covalentemente,
generalmente un una única cadena peptídica.
También como se usa en este documento, el
término "apoptosis anormal" se refiere a apoptosis excesiva y/o
impropia. Típicamente se observa apoptosis anormal en células y
tejidos que han sufrido agresión física, química o biológica.
Tales agresiones incluyen, pero no se limitan a,
daño físico, infección viral, infección bacteriana, isquemia,
irradiación, quimioterapia y similares.
El término "similar" o "similitud"
describe la relación entre diferentes compuestos de ácido nucleico o
secuencias de aminoácidos en la que dichas secuencias o moléculas
están relacionadas por identidad parcial de secuencia o similitud
de secuencia en un o más bloques o regiones dentro de dichas
moléculas o secuencias.
Al referirse a secuencias de aminoácidos, el
término "similar" o "similitud" describe residuos
aminoácidos que son idénticos entre diferentes secuencias de
aminoácidos, o representan sustituciones conservativas de
aminoácidos entre diferentes secuencias. Las sustituciones
conservativas de aminoácidos se presentan en la Tabla 1 y se
discuten a continuación. El término "identidad" describe
residuos aminoácidos que son idénticos entre diferentes secuencias
de aminoácidos.
Se define la similitud o identidad de secuencia
de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de
LP-48 identificada en este documento como el
porcentaje de residuos aminoácidos en una secuencia candidata que
son similares o idénticos a los residuos aminoácidos en una
secuencia de polipéptidos de LP, tras alinear las secuencias e
introducir huecos, si es necesario, para alcanzar la secuencia con
el porcentaje máximo de similitud o identidad.
La alineación para el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse
de diversas maneras conocidas por los expertos en la técnica, por
ejemplo, usando programas informáticos públicamente disponibles
tales como los programas ALIGN, ALIGN-2, Megalign
(DNASTAR) o BLAST (por ej., Blast, Blast-2,
WU-Blast2). Los expertos en la técnica pueden
determinar los parámetros adecuados para medir la alineación,
incluyendo algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima a
lo largo de toda la extensión de las secuencias a comparar. Por
ejemplo, en la generación de valores de porcentaje de identidad
generados usando WU-BLAST-2
[Altschul, y col., Methods in Enzymology 266: 460-80
(1996)], con WU-BLAST-2 típicamente
se establecen los parámetros de búsqueda como valores por defecto.
Los valores no establecidos por defecto, los parámetros ajustables,
se establecen típicamente con los siguientes valores: período de
superposición = 1; fracción de superposición = 0,125; umbral (T) =
11; y matriz de puntuación = BLOSUM 62. Para los objetivos de este
documento, se determina un valor de porcentaje de identidad de
secuencia de aminoácidos dividiendo (a) el número de residuos
aminoácidos idénticos coincidentes entre la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de LP de interés y la secuencia de
aminoácidos de interés de comparación (es decir, la secuencia contra
la que se compara el polipéptido de LP de interés) como se
determina por medio de WU-BLAST-2,
por (b) el número total de residuos aminoácidos del polipéptido de
LP de interés, respectivamente.
El término "identidad" con respecto a
secuencias de ácidos nucleicos como se usa en este documento está
definido como el porcentaje de nucleótidos en la secuencia
candidata que son idénticos a los nucleótidos en una secuencia de
prueba tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es
necesario, para alcanzar el porcentaje máximo de identidad de
secuencia. La alineación para el objetivo de determinar el
porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos puede
lograrse de diversas maneras conocidas por los expertos en la
técnica, por ejemplo, usando programas informáticos públicamente
disponibles tales como los programas ALIGN, ALIGN-2,
Megalign (DNASTAR) o BLAST (por ej., Blast,
Blast-2). Los expertos en la técnica pueden
determinar los parámetros adecuados para medir la alineación,
incluyendo algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima a
lo largo de toda la extensión de las secuencias a comparar. Para
los objetivos de este documento, sin embargo, se generan los
valores de porcentaje de identidad usando el programa
WU-BLAST-2 (módulo BLASTN)
[Altschul, y col., Methods in Enzymology 266:
460-80 (1996)]. La mayoría de los parámetros de
búsqueda con WU-BLAST-2 se
establecen por defecto. Los valores no establecidos por defecto, es
decir, los parámetros ajustables, se establecen típicamente con los
siguientes valores: período de superposición = 1; fracción de
superposición = 0,125; umbral (T) = 11; y matriz de puntuación =
BLOSUM 62. Para los objetivos de este documento, se determina un
valor de porcentaje de identidad de secuencia de ácidos nucleicos
dividiendo (a) el número de nucleótidos idénticos coincidentes
entre la secuencia de de ácido nucleico de la molécula ácido
nucleico que codifica el polipéptido de LP de interés y la molécula
de ácido nucleico de interés de comparación (es decir, la secuencia
contra la que se compara la molécula de ácido nucleico que codifica
el polipéptido de LP de interés) como se determina por medio de
WU-BLAST-2, por (b) el número total
de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de LP de interés.
Además de calcular el porcentaje de identidad de
secuencia, el algoritmo de BLAST también realiza un análisis
estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ej.,
Karlin y Altschul, 1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:
5873-5787). Una medida de similitud provista por el
algoritmo de BLAST es la menor suma de probabilidades
(P(N)), que provee una indicación de la probabilidad por la
que podría ocurrir coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos
o aminoácidos al azar.
Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico
es similar a una secuencia de referencia si la menor suma de
probabilidades en una comparación del ácido nucleico de prueba con
el ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1,
de más preferencia menor que aproximadamente 0,01 y de mayor
preferencia menor que aproximadamente 0,001.
El término "célula huésped" como se usa en
este documento se refiere a cualquier célula eucariota o procariota
que es adecuada para propagar y/o expresar un gen clonado contenido
en un vector que se introduce en dicha célula huésped, por ejemplo,
por medio de transformación o transfección o similar.
El término "hibridación" como se usa en
este documento se refiere a un procedimiento en el que un compuesto
(o sonda) de ácido nucleico de hebra única se une con una hebra
complementaria a través de apareamiento de bases de nucleótidos. El
grado de hibridación depende de, por ejemplo, el grado de similitud,
la rigurosidad de la hibridación y la longitud de las hebras a
hibridar. "Hibridación selectiva" se refiere a la hibridación
bajo condiciones de rigurosidad alta.
La "rigurosidad" de las reacciones de
hibridación la determina fácilmente un experto en la técnica, y
generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de
la sonda, temperatura de lavado y concentración de sales. En
general, las sondas de ácidos nucleicos más largas necesitan
temperaturas más elevadas para hibridar adecuadamente, mientras que
las sondas de ácidos nucleicos más cortas necesitan temperaturas más
bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN
desnaturalizado de rehibridar cuando están presentes hebras
complementarias en un medio a una temperatura por debajo de su
punto de fusión. A mayor grado de homología deseada entre la sonda
y la secuencia hibridable, puede usarse mayor temperatura relativa.
Como resultado, esas temperaturas relativas elevadas tenderían a
hacer las reacciones más rigurosas, mientras que las temperaturas
más bajas las harían menos rigurosas. Para obtener detalles
adicionales y explicación acerca de rigurosidad de reacciones de
hibridación, ver, Ausubel, y col., Current Protocols in Molecular
Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Condiciones rigurosas" o "condiciones de
rigurosidad alta", como se definen en este documento, pueden
identificarse por aquellas que
- (1)
- usan fuerza iónica baja y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 15 mM/citrato de sodio 1,5 mM/dodecilsulfato de sodio 0,1% a 50ºC;
- (2)
- usan durante la hibridación un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida 50% v/v con 0,1% de seroalbúmina de ternera/ficoll 0,1%/polivinilpirrolidona 0,1%/tampón fosfato de sodio 50 mM a pH 6,5 con 750 mM de cloruro de sodio/citrato de sodio 75 mM a 42ºC; o
- (3)
- usan formamida 50%, 5X SSC (cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM), fosfato de sodio 50 mM (pH 6,8), pirofosfato de sodio 0,1%, 5X solución de Denhardt, ADN sonicado de esperma de salmón (50 \mug/ml), SDS 0,1% y dextransulfato 10% a 42ºC con lavados a 42ºC en 0,2 X SSC (cloruro de sodio 30 mM/citrato de sodio 3 mM) y 50% formamida a 55ºC, seguido por un lavado de alta rigurosidad constituido por 0,1 X SSC conteniendo EDTA a 55ºC.
Pueden identificarse las "condiciones
moderadamente rigurosas" como las describieron Sambrook, y col.
[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring
Harbor Press, (1989)], e incluyen el uso de solución de lavado y
condiciones de hibridación (por ej., temperatura, fuerza iónica y %
SDS) menos rigurosas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de
condiciones moderadamente rigurosas es la incubación durante la
noche a 37ºC en una solución que comprende: 20% formamida, 5 X SSC
(750 mM cloruro de sodio, 75 mM citrato de sodio), 50 mM fosfato de
sodio a pH 7,6, 5 X solución de Denhardt,10% dextransulfato, y 20
mg/ml de ADN y 20 ml de ADN desnaturalizado de esperma de salmón,
seguido por lavado de los filtros en 1 X SCC a aproximadamente 37 a
50ºC. El técnico experto reconocerá cómo ajustar la temperatura,
fuerza iónica, etc., como sea necesario para acomodar factores
tales como longitud de la sonda y similares.
"Compuesto aislado de ácido nucleico" se
refiere a cualquier secuencia de ARN o ADN, construida o
sintetizada, que se diferencia por su localización distinta a la
localización natural.
El término "proteína madura" o
"polipéptido maduro" como se usa en este documento se refiere a
la(s) forma(s) de la proteína producida por la
expresión en una célula de mamífero. Existe la hipótesis de que una
vez que se inicia exportación de una cadena proteica creciente a
través del retículo endoplasmático rugoso, las proteínas secretadas
por células de mamíferos tienen una secuencia señal que se cliva del
polipéptido completo para producir la forma "madura" de la
proteína. Frecuentemente, el clivaje de una proteína secretada no es
uniforme y puede dar como resultado más de una especie de proteína
madura. El sitio de clivaje de una proteína secretada está
determinado por la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína
completa y generalmente no puede predecirse con total precisión.
Como está identificado en SEQ ID Nº 2, el péptido nativo señal de
LP-48 está codificado desde la posición del
aminoácido 1, (metionina-1) hasta aproximadamente
alanina-18. Debería destacarse, sin embargo, que el
límite C-terminal de los péptidos señal puede
variar, pero probablemente por no más de aproximadamente 5
aminoácidos, de preferencia no más de aproximadamente 4 aminoácidos,
de más preferencia no más de aproximadamente 3 aminoácidos, de más
preferencia no más de aproximadamente 2 aminoácidos, de mayor
preferencia por no más de aproximadamente 1 aminoácido. Los sitios
de clivaje para una proteína secretada pueden determinarse también
experimentalmente por secuenciación del extremo amino terminal de
una o más especies de proteínas maduras halladas dentro de una
preparación purificada de la proteína.
Una "sonda de ácido nucleico" o
"sonda" como se usa en este documento es un compuesto ácido
nucleico marcado que hibrida con otro compuesto ácido nucleico.
"Sonda de ácido nucleico" significa una secuencia de ácido
nucleico de hebra única que combinará con una secuencia de ácido
nucleico blanco de hebra única complementaria o parcialmente
complementaria para formar una molécula de doble hebra. Una sonda de
ácido nucleico puede ser un oligonucleótido o un polímero de
nucleótidos. Una sonda usualmente contendrá un fragmento detectable
que puede estar unido al extremo(s) de la sonda o ser
interno a la secuencia de la sonda.
El término "plásmido" se refiere a un
elemento genético extracromosómico. Los plásmidos descritos en este
documento están disponibles comercialmente, públicamente sin
restricciones, o pueden construirse a partir de plásmidos
fácilmente disponibles de acuerdo con los procedimientos
publicados.
\newpage
Un "cebador" es un fragmento de ácido
nucleico que funciona como un sustrato iniciador para la elongación
enzimática o sintética de, por ejemplo, un compuesto ácido
nucleico.
El término "promotor" se refiere a una
secuencia de ácido nucleico que detecta transcripción, por ejemplo,
de ADN o ARN. Un promotor inducible es aquel que se puede regular
por medio de señales ambientales, tales como fuente de carbono,
calor, o iones metálicos, por ejemplo. Un promotor constitutivo
generalmente opera a un nivel constante y no es regulable.
"Vector de clonación de ADN recombinante"
como se usa en este documento se refiere a cualquier agente que
puede replicarse de forma autónoma, incluyendo pero no limitado a,
plásmidos y fagos, que comprende una molécula de ADN dentro de la
que pueden o han sido incorporados uno o más segmentos adicionales
de ADN.
El término "expresión de ADN recombinante"
o "vector de expresión" como se usa en este documento se
refiere a cualquier vector de clonación de ADN recombinante (tal
como un plásmido o fago), en el que están presentes un promotor y
otros elementos reguladores, posibilitando de esta manera la
transcripción de un ADN insertado, que puede codificar un
polipéptido.
"Sustancialmente puro" usado en referencia
al polinucleótido o polipéptido LP-48 significa que
dicho "LP-48" está separado de otras moléculas
celulares o no celulares, incluyendo otras proteínas, lípidos,
carbohidratos u otros materiales con los que está naturalmente
asociado cuando se produce de manera recombinante o se sintetiza
sin ninguna etapa de purificación. Un polipéptido
LP-48 "sustancialmente puro" descrito en este
documento podría prepararse por medio de una diversidad de técnicas
bien conocidas por los expertos, incluyendo, por ejemplo, los
procedimientos descritos de purificación de LP-48 a
los que se hace referencia o se describen en este documento. En
formas de realización de preferencia, el polipéptido
LP-48 se purificará (1) hasta más del 95% en peso
de polipéptido LP-48 del peso de la proteína total
determinada por el método de Lowry, y de más preferencia más del
99% en peso del peso total de proteína, (2) hasta un grado
suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de
aminoácidos N-terminal o interna por el uso de un
secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta aparente homogeneidad
por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no
reductoras usando Azul Coomassie, o de preferencia, tinción de
plata, de manera tal que la banda principal constituya al menos
95%,y de más preferencia 99%, de la proteína teñida observada en el
gel.
El término "similitud suficiente" se
refiere a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que
contiene un número mínimo suficiente de aminoácidos idénticos o
sustituciones de aminoácidos relacionados (por aminoácidos
relacionados ver la Tabla 1 para sustituciones conservativas y la
discusión de grupos a continuación) o nucleótidos que una segunda
secuencia de aminoácidos o nucleótidos de tal manera que la primera
y la segunda secuencia de aminoácidos tienen un dominio estructural
común y/o funcionalidad común. Por ejemplo, las secuencias de
aminoácidos o nucleótidos que tienen al menos aproximadamente 85% de
identidad, de más preferencia al menos aproximadamente 90% de
identidad, de más preferencia al menos aproximadamente 95% de
identidad, de más preferencia al menos aproximadamente 99% de
identidad, y de mayor preferencia 100% de identidad.
El término "vector" como se usa en este
documento se refiere a un compuesto ácido nucleico usado para
introducir ADN exógeno o endógeno dentro de las células huésped. Un
vector comprende una secuencia de nucleótidos que puede codificar
una o más moléculas de proteína. Los plásmidos, cósmidos, virus y
bacteriofagos, en estado natural o que se han sometido a ingeniería
recombinante, son ejemplos de vectores comúnmente usados.
El término "regulación por disminución"
como se usa en este documento incluye reducir, inhibir, o de otra
manera causar una disminución en el nivel o actividad de una
molécula(s) o un proceso. Por ejemplo, puede usarse el
polipéptido LP-48 para regular por disminución el
nivel o actividad de una citoquina en células, de manera que el
nivel o actividad de la citoquina disminuye en comparación con el
nivel o actividad que presentaría en ausencia del polipéptido
LP-48. Alternativamente, puede usarse el polipéptido
LP-48 para regular por disminución un proceso, tal
como la inflamación.
Los términos "tratar", "tratamiento" y
"terapia" como se usan en este documento se refieren a terapia
curativa, terapia profiláctica y terapia preventiva. Un ejemplo de
"terapia preventiva" es la prevención o la disminución de una
enfermedad objetivo o una afección relacionada a la misma. Los
necesitados de tratamiento incluyen a aquellos que ya tienen la
enfermedad o afección así como los propensos a tener la enfermedad o
afección en los que pueden prevenirse la enfermedad o condición.
Los términos "tratar", "tratamiento" y "terapia" como
se usan en este documento también describen el manejo y cuidado de
un paciente para el objetivo de combatir una enfermedad, o afección
relacionada, e incluye la administración de LP-48
para aliviar los síntomas o complicaciones de dicha enfermedad o
afección.
Administración "crónica" se refiere a la
administración del agente(s) de manera continua a diferencia
de una manera aguda, de forma tal de mantener el efecto terapéutico
(actividad) inicial durante un período de tiempo extendido.
Administración "intermitente" es el tratamiento que no se
realiza de manera consecutiva sin interrupción, pero es más bien
cíclico.
El término "paciente" como se usa en este
documento se refiere a cualquier animal, incluyendo seres humanos,
animales domésticos y de granja, y animales de zoológico, deportivos
o mascotas, tales como ganado (por ej., vacas), caballos, perros,
ovejas, cerdos, conejos, cabras, gatos y animales no domesticados
como ratones y ratas. En una forma de realización de preferencia de
la invención, el mamífero en un ser humano o un ratón.
Administración "en combinación con" otro u
otros agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y consecutiva en cualquier orden.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es
la cantidad mínima de un polipéptido LP-48 o
anticuerpo que reconoce LP-48 que es necesaria para
impartir beneficio terapéutico o efecto biológico deseado a un
paciente. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz"
de un polipéptido LP-48 para un paciente que sufre o
está predispuesto a sufrir de una enfermedad o afección asociada
con LP-48 es tal cantidad que cuando se administra,
induce, alivia o de otra manera causa una mejora en los síntomas
patológicos, progresión de la enfermedad, afección fisiológica
asociada, o resistencia a sucumbir a un trastorno principalmente
caracterizado por inmunodeficiencia, cáncer, inflamación, y/o
enfermedad infecciosa cuando el polipéptido LP-48/o
anticuerpo con epitope que reconoce LP-48. La
cantidad precisa de polipéptido LP-48 o anticuerpo
con epitope que reconoce LP-48 administrada a un
paciente en particular dependerá de numerosos factores, por ej., la
actividad de unión específica de la molécula, el dispositivo de
administración usado, características físicas, intención de uso y
consideraciones del paciente, y puede determinarla fácilmente un
experto en la técnica, en base a la información provista en este
documento y que se conoce en la
técnica.
técnica.
"Vehículos" como se usa en este documento
incluye vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente
aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero expuesto a
los mismos en las dosificaciones y concentraciones usadas.
Frecuentemente el vehículo fisiológicamente aceptable es una
solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos
fisiológicamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina,
gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tal como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
carbohidratos incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes
quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sales tal como sodio; y/o
tensioactivos noiónicos tales como TWEEN®, polietilenglicol (PEG) y
PLURONICS™.
Las "sales farmacéuticamente aceptables"
incluyen, pero no se limitan a, sales preparadas con ácidos
inorgánicos, tales como sales de cloruro, sulfato, fosfato,
difosfato, hidrobromuro y nitrato, o sales preparadas con ácidos
orgánicos, tales como sales de malato, maleato, fumarato, tartrato,
succinato, etilsuccinato, citrato, acetato, lactato,
metansulfonato, benzoato, ascorbato,
para-toluensulfonato, palmoato, salicilato y
estearato, así como estolato, gluceptato y lactobionato. De manera
similar, las sales que contienen cationes farmacéuticamente
aceptables, incluyen, pero no se limitan a, sodio, potasio, calcio,
aluminio, litio y amonio (incluyendo amonio sustituido).
El término "síntoma" en referencia a
sepsis, bacteriemia por gram negativos, respuestas alérgicas,
enfermedades alérgicas autoinmunes, diabetes tipo 1, insulitis
dependiente de Th1, inmunodeficiencias, cánceres, inflamación y
enfermedades infecciosas tiene la intención de incluir, pero no
limitarse a, uno o más de los siguientes: resfriado, sudoración
profusa, fiebre, debilidad, hipotensión, leucopenia, coagulación
intravascular, choque, distrés respiratorio, fallo orgánico,
postración, piel erizada, diarrea, exudado ocular y muerte, solos o
en combinación. La lista no pretende ser exclusiva, pero puede
suplementarse con síntomas o combinaciones de síntomas que una
persona experta reconocería como asociados con sepsis, bacteriemia
por gram negativos, respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas
autoinmunes, diabetes tipo 1, insulitis dependiente de Th1,
inmunodeficiencias, cánceres, inflamación y enfermedades
infecciosas. Un síntoma asociado con sepsis, bacteriemia por gram
negativos, respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas
autoinmunes, diabetes tipo 1, insulitis dependiente de Th1,
inmunodeficiencias, cánceres, inflamación y enfermedades
infecciosas puede también estar asociado con otra afección.
Los técnicos expertos reconocerán que los
polipéptidos LP-48 usados en formas de realización
de la presente invención pueden sintetizarse por medio de una
cantidad de procedimientos diferentes tales como procedimientos
químicos bien conocidos en la técnica, incluyendo síntesis de
péptidos en fase sólida o procedimientos recombinantes. Ambos
procedimientos están descritos en la Patente de EEUU 4.617.149.
Los principios de la síntesis química en fase
sólida en polipéptidos son bien conocidos en la técnica y pueden
encontrarse en textos generales del área. Ver, por ejemplo, H. Dugas
y C. Penney, Bioorganic Chemistry (1981)
Springer-Verlag, Nueva York, 54-92.
Por ejemplo, pueden sintentizarse péptidos por procedimientos en
fase sólida usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems
430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) y ciclos de síntesis
suministrados por Applied Biosystems.
Las proteínas usadas en la presente invención
pueden producirse también mediante procedimientos de ADN
recombinante usando las secuencias del polinucleótidos
LP-48 descritas en este documento. Los
procedimientos recombinantes resultan de preferencia si se desea un
rendimiento alto. La expresión de LP-48 puede
llevarse a cabo en una diversidad de células huésped adecuadas,
bien conocidas por los expertos en la técnica. Para este fin, las
construcciones de LP-48 se introducen en una célula
huésped por cualquier medio adecuado, bien conocidos por los
expertos en la técnica. Puede usarse integración cromosómica de los
vectores de expresión de LP-48 así como vectores de
expresión mantenidos extra cromosómicamente de manera que la región
que codifica LP-48 está unida de manera operativa a
un promotor constitutivo o inducible.
Las etapas básicas en la producción recombinante
de la proteína LP-48 son:
- a)
- construir un ADN recombinante, sintético o semisintético que codifica la proteína LP-48;
- b)
- integrar dicho ADN en un vector de expresión de una manera adecuada para expresar la proteína LP-48;
- c)
- transformar o de otra manera introducir dicho vector en una célula huésped adecuada eucariota o procariota formando una célula huésped recombinante;
- d)
- cultivar dicha célula huésped recombinante de manera tal que exprese la proteína LP-48; y
- e)
- recuperar y purificar sustancialmente la proteína LP-48 por cualquier medio adecuado por los expertos en la técnica.
La producción de productos LP-48
también incluye vías donde se usan procedimientos químicos
sintéticos directos así como también productos generados por
técnicas recombinantes a partir de una célula eucariota, incluyendo,
por ejemplo, levaduras, células de plantas superiores, insectos y
mamíferos. Dependiendo del huésped usado en un procedimiento de
producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención
pueden estar glicosilados o no glicosilados. Además, la secuencia
de aminoácidos de un LP-48 puede incluir
opcionalmente una sustitución conservativa. Las moléculas de
LP-48 de preferencia están glicosiladas como
ocurriría en huéspedes eucariotas. Además, los polipéptidos
LP-48 pueden también incluir un residuo metionina
modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos
mediados por el huésped. Tales procedimientos están descritos en
muchos manuales convencionales de laboratorio, tales como Sambrook,
supra, Capítulos 17.37-17.42; Ausubel,
supra, Capítulos 10, 12, 13, 16, 18 y 20.
Los expertos en la técnica reconocerán que
debido a la degeneración del código genético (es decir, 64 codones
que codifican 20 aminoácidos), podrían introducirse numerosas
sustituciones "silenciosas" de pares de bases de nucleótidos
en una secuencia de polinucleótidos LP-48 sin
alterar la identidad de los aminoácidos codificados o del producto
proteico.
Los fragmentos de las proteínas descritas en
este documento pueden generarse por medio de cualquiera de una
cantidad de técnicas adecuadas, incluyendo síntesis química. Por
ejemplo, pueden obtenerse regiones constantes de inmunoglobulinas
por digestión de anticuerpos con papaína. Tal digestión proteolítica
de, por ejemplo, SEQ ID Nº 2, puede producir la región constante de
Ig que puede posteriormente unirse covalentemente al domino
extracelular de LP-48.
Alternativamente, las técnicas de mutagénesis de
ADN recombinante pueden proveer moléculas de LP-48
(ver por ej., K. Struhl, "Reverse biochemistry: Methods and
applications for synthesizing yeast proteins in vitro,
"Meth. Enzymol. 194: 520-535). Por ejemplo, se
introduce una serie anidada de mutaciones por deleción en un
polinucleótido que codifica LP-48 de tal manera que
varía la cantidad de delecciones de la región codificadora de la
proteína, ya sea del extremo amino terminal o del extremo carboxilo
de la molécula de proteína. Además, pueden hacerse cambios o
agregados adicionales a la molécula. Este procedimiento puede
también usarse para crear fragmentos internos de la proteína
intacta en la que se eliminan ambos extremos, carboxilo y amino
terminal. Pueden usarse varias nucleasas adecuadas para crear tales
delecciones, por ejemplo Ba131, o en el caso de compuesto de ácido
nucleico de hebra única, nucleasa Mung bean. Por simplicidad,
resulta de preferencia que el gen de LP-48 intacto
se clone en un vector de clonación de hebra única, tal como el
bacteriófago M13, o equivalente. Si se desea, los fragmentos
resultantes por deleción del gen pueden subclonarse en un vector
adecuado para propagación y expresión de dichos fragmentos en una
célula huésped adecuada.
LP-48 puede además fusionarse
con una proteína marcadora o con un marcador de epitope. Tales
fusiones incluyen, pero no se limitan a, fusiones con una enzima,
proteína fluorescente o proteína luminiscente que proveen una
función marcadora; o fusiones con cualquier secuencia de aminoácidos
que pueden usarse para purificación del polipéptido o la secuencia
de proproteína.
Los procedimientos de construcción de proteínas
de fusión (quimeras) compuestas por el dominio de unión de una
proteína y la región constante de una inmunoglobulina (designada en
este documento como
"LP-48-Ig") son generalmente
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las quimeras conteniendo la
región Fc de IgG humana y la región de unión de otros receptores de
proteínas son conocidas en la técnica para anticuerpos quiméricos.
Las estructuras de LP-48-Ig de la
presente invención pueden construirse usando procedimientos
similares a los de construcción de anticuerpos quiméricos. En la
construcción de anticuerpos quiméricos el dominio variable de uno
de los anticuerpos de una especie se sustituye por el dominio
variable de otra especie (ver el documento EP 0 125 023; EP
173,494; Munro y col., Nature, 312: 597 (1984); Neuberger y col.
Nature, 312: 604-608 (1984); Sharon y col., Nature,
309: 364-367; Morrison y col., Ann. Rev. Immunol.,
2: 239-256 (1984); Morrison y col., 1985; Boulianne
y col., Nature, 312: 643-646 (1984); Capon y col.,
Nature, 337: 525-531 (1989); Traunecker y col.,
Nature, 339: 68-70 (1989)). Aquí, se sustituye un
dominio funcional del polipéptido LP-48 por el
dominio variable de la estructura del anticuerpo receptor.
Generalmente, los procedimientos para construir
proteínas de fusión LP-48 incluyen el uso de
tecnología de ADN recombinante. El ADN que codifica un dominio
funcional puede fusionarse opcionalmente con dominios o segmentos
adicionales del polipéptidos LP-48 o con una región
constante de Ig. Puede obtenerse un polinucleótido que codifica
cualquier dominio de un polipéptido LP-48 mediante
PRC o por clivaje con enzimas de restricción. Este fragmento de ADN
se inserta fácilmente próximo al ADN codificando una región
constante de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina y, si es
necesario, la construcción resultante se confecciona mediante
mutagénesis, para insertar, deleccionar, o cambiar la secuencia de
codones. De preferencia, la región de inmunoglobulina seleccionada
es una región de inmunoglobulina humana cuando la molécula quimérica
está proyectada para el tratamiento in vivo en seres
humanos. De mayor preferencia, la región de inmunoglobulina
seleccionada es una región de IgG. Los ADN que codifican regiones
constantes de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina son
conocidos o fácilmente disponibles en bibliotecas de ADNc o pueden
sintetizarse (ver por ejemplo, Adams y col., Biochemistry, 19:
2711-2719 (1980); Gough y col., Biochemistry, 19:
2702-2710 (1980); Dolby y col., 1980; Rice y col.,
Proc. Nat'l. Acad. Sci., 79: 7862-7865 (1982);
Falkner y col., Nature, 298: 286-288 (1982); and
Morrison y col., Ann. Rev. Immunol., 2: 239-256
(1984)). Se conocen otras técnicas de preparación de moléculas
quiméricas de la preparación de quimeras de inmunoadhesión tales
como CD4-Ig (Capon y col., Nature, 337:
525-531 (1989); Byrn y col., Nature, 344: 667
(1990)) y quimeras de TNFR, tales como TNFR-IgG
(Ashkenazi, y col., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:
10535-10539 (1991); Peppel y col., J. Cell. Biochem.
Supp. 15F-P439: 118 (1991)).
Generalmente, los polipéptidos
LP-48 se producen de manera recombinante. Una vez
expresados pueden aislarse de las células aplicando técnicas
convencionales de aislamiento de proteínas a los lisados o
purificados de los medios. El control de los procedimientos de
purificación puede realizarse usando técnicas convencionales de
transferencia Western o radioinmunoensayos u otras técnicas de
inmunoensayo convencionales.
Pueden recuperarse y purificarse polipéptidos
LP-48 de cultivos de células recombinantes por medio
de procedimientos bien conocidos incluyendo precipitación con
sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de
intercambio aniónico o catiónico, cromatografía en fosfocelulosa,
cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad,
cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de exclusión por
tamaño y cromatografía de lectina. De preferencia, se usan para la
purificación cromatografía líquida de alto rendimiento
("HPLC"), cromatografía de intercambio catiónico,
cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño o
combinaciones de las mismas. En la técnica se conocen procedimientos
particulares para usar cromatografía de proteína A o G para
purificación y son particularmente aplicables cuando el
LP-48 contiene la región Fc de inmunoglobulina. Las
proteínas A y G se unen a las regiones Fc de anticuerpos IgG,
creando por consiguiente una herramienta conveniente para la
purificación de polipéptidos LP-48 que contienen la
región de IgG. La purificación del polipéptido
LP-48 supone la inclusión de partes purificadas del
quimérico (la región extracelular y la región constante de
inmunoglobulina) que se purifican por separado y se combinan
posteriormente mediante enlaces disulfuro, entrecruzamiento o
similar.
La purificación de polipéptidos
LP-48 puede realizarse mediante una cantidad de
técnicas especiales conocidas en la técnica (Kwon y col., J. Biol.
Chem., 272: 14272-14276 (1997); Kwon y col., Cell,
272: 14272-14276 (1997); Emery, J. G., y col., J.
Biol. Chem., 273: 14363-14367 (1998); Harrop y col.,
J. Biol. Chem., 273 (42): 27548-27556 (1998);
Harrop y col., J. Immunol., 161: 1786-1794 (1998))
que obtienen una ventaja particular de las características
estructurales y funcionales de estas moléculas. Además, pueden
incorporarse una cantidad de secuencias de proteínas ventajosa
dentro del polipéptido LP-48 producido, tales como
sitios de clivaje de factor Xa o una secuencia de marcador HIS o la
incorporación de epitopes específicos, conocidos en la técnica.
Pueden usarse procariotas en la producción de
proteína LP-48 recombinantes. Por ejemplo, la
Escherichia coli K12 cepa 294 (ATCC Nº 31446) es
particularmente útil para la expresión procariota de proteínas
extrañas. Pueden también usarse otras cepas de E. coli,
bacilos tales como Bacillus subtilis, enterobacterias tales
como Salmonella typhimurium o Serratia marcescans,
diversas especies de Pseudomonas y otras bacterias, tales como
Streptomyces, como células huésped en la clonación y expresión de
proteínas recombinantes de esta invención.
Las secuencias de promotores adecuadas para
guiar la expresión de genes en procariotas incluyen
\beta-lactamasa (por ejemplo, el vector pGX2907,
ATCC 39344, contiene un replicón y el gen de
\beta-lactamasa), sistemas de lactosa (Chang y
col., Nature (Londres), 275: 615 (1978); Goeddel y col., Nature
(Londres), 281: 544 (1979)), fosfatasa alcalina y el sistema
promotor de triptofano (trp) (vector pATH1 (ATCC 37695)), que está
diseñado para facilitar la expresión de un marco de lectura abierto
como una proteína de fusión trpE bajo el control del promotor trp.
También son adecuados los promotores híbridos tal como el promotor
tac (aislable del plásmido pDR540, ATCC-37282).
Incluso otros promotores bacterianos, cuyas secuencias de
nucleótidos son generalmente conocidas, pueden estar unidas al ADN
que codifica la proteína de la presente invención, usando conectores
o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción
necesario. Los promotores para uso en sistemas bacterianos también
contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno unida
operativamente al ADN que codifica los polipéptidos deseados. Estos
ejemplos son ilustrativos más que limitativos.
Las proteínas LP-48 necesarias
para la práctica de la presente invención pueden sintetizarse por
expresión directa o como una proteína de fusión que comprende la
proteína de interés como una fusión traduccional con otra proteína
o péptido que puede eliminarse por escisión enzimático o químico.
Frecuentemente se observa en la producción de ciertos péptidos en
sistemas recombinantes que la expresión al contener otras secuencias
deseadas prolonga la vida útil, aumenta el rendimiento del péptido
deseado o provee un medio conveniente para aislar la proteína. Esto
es particularmente relevante cuando se expresan proteínas de
mamífero en huéspedes procariotas. Se conoce una diversidad de
peptidasas (por ejemplo, enteroquinasa y trombina) que escinden un
polipéptido en sitios específicos o digieren los péptidos desde el
extremo amino o carboxi terminal (por ejemplo, diaminopeptidasa) de
la cadena peptídica. Además, compuestos químicos particulares (por
ejemplo, bromuro de cianógeno) clivarán una cadena polipeptídica en
sitios específicos. El técnico experto apreciará las modificaciones
necesarias para incorporar en la secuencia aminoácidos (y secuencia
codificadora sintética o semisintética si se usan medios
recombinantes) sitios de escisión interna específicos de sitio. Ver
por ejemplo, P. Carter, "Site Specific Proteolysis of Fusion
Proteins", Capítulo 13, en Protein Purification: From Molecular
Mechanisms to Large Scale Processes, American Chemical Society,
Washington, D. C. (1990).
Además, de procariotas, pueden usarse una
diversidad de sistemas de expresión de anfibios tales como ovocitos
de ranas y sistemas celulares de mamíferos. La elección de una
célula huésped en particular depende en cierta medida del vector de
expresión particular usado.
Ejemplos de células huésped de mamífero incluyen
293 (por ejemplo, ATCC CCL 1573), HepG-2 (ATCC
HB8065), CV-1 (ATCC CCL 70), LC-MK2
(ATCC CCL 7.1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 (ATCC CCL
61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL
1600), C127I (ATCC CCL 1616),HS-Sultan (ATCC CCL
1484), y BHK-21 (ATCC CCL 10).
Una amplia diversidad de vectores son adecuados
para transformar de células huésped de mamífero. Por ejemplo, los
vectores de tipo pSV2 comprenden segmentos del genoma del virus del
simio (SV40) necesarios para transcripción y poliadenilación. Se
construyó una gran cantidad de vectores plásmidos de tipo pSV2,
tales como pSV2-gpt, pSV2-neo,
pSV2-dhfr, pSV2-hyg, y
pSV2-\beta-globina, en los que el
promotor SV40 guía la transcripción de un gen insertado. Estos
vectores están ampliamente disponibles de fuentes tales como
American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland, 20852, o del National Center for Agricultural
Utilization Research, 1815 North University Street, Peoria, Illinois
61604-39999.
Los promotores adecuados para expresión en
células de mamífero incluyen el promotor tardío SV40, promotores de
genes eucariotas, tal como por ejemplo, el gen de ovoalbúmina de
pollo inducible por estrógeno, los genes de interferón, el gen de
tirosina aminotransferasa inducible por glococorticoides, el
promotor del gen de timidina quinasa y los promotores de los
principales genes de adenovirus tempranos y tardíos.
El plásmido pRSVcat (ATCC 37152) comprende
porciones de una larga repetición terminal del virus de Sarcoma
Rous, un virus que infecta pollo y otras células huésped. Esta larga
repetición terminal contiene un promotor que es adecuado para este
uso. (H. Gorman y col., Proc. Nat. Acad. Sci. (EEUU), 79,6777
(1982)). El plásmido pMSVi (NRRL B-15929) comprende
las largas terminaciones terminales del virus del Sarcoma Murino, un
virus que infecta ratones y otras células huésped. El promotor de
metalotioneína de ratón ha sido bien caracterizado para uso en
células huésped eucariotas. Este promotor está presente en el
plásmido pdBPV-MMTneo (ATCC 37224) que puede servir
como material de inicio para la construcción de otros plásmidos de
expresión que podrían también ser útiles para producir polipéptidos
LP-48.
La transfección de células huésped de mamífero
con vectores puede realizarse por medio de una pluralidad de
procedimientos bien conocidos incluyendo, pero no limitado a, fusión
de protoplasto, coprecipitación con fosfato de calcio,
electroporación y similares. Ver, por ejemplo, Sambrook, y col.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring
Harbor, N. Y. (1989).
Algunos virus también generan vectores
apropiados. Los ejemplos incluyen los adenovirus, virus
adenoasociados, el virus vaccinia, los herpesvirus, los
baculovirus, y el virus del Sarcoma Rous, como se describe en la
Patente de EEUU 4.775.624.
Los microorganismos eucariotas tales como
levaduras y otros hongos son también células huésped. La levadura
Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo eucariota de
preferencia. Otras levaduras tales como Kluyveromyces lactis
y Pichia pastoris son también adecuadas. Para la expresión en
Saccharomyces, puede usarse por ejemplo, el plásmido YRp7
(ATCC-40053). Ver, por ejemplo, L. Stinchcomb y
col., Nature, 282,39 (1979); J. Kingsman y col., Gene, 7,141
(1979); S. Tschemper y col., Gene, 10,157 (1980). El plásmido YRp7
contiene el gen TRP1 que provee un marcador seleccionable para uso
en un mutante auxótrofo trp1.
Pueden usarse anticuerpos que reconocen el
epitope LP-48 en el tratamiento de diversas
afecciones relacionadas con respuestas alérgicas, enfermedades
alérgicas autoinmunes, diabetes tipo 1, insulitis dependiente Th1,
inmunodeficiencias, cánceres, inflamación y enfermedades
infecciosas. La producción de anticuerpos incluyendo monoclonales y
policlonales, en animales, especialmente ratones es bien conocida en
la técnica. Ver por ejemplo, C. Milstein, Handbook of Experimental
Immunology, (Blackwell Scientific Pub., 1986); J. Goding, Monoclonal
Antibodies: Principles and Practice, (Academic Press, 1983).Para la
producción de anticuerpos monoclonales el procedimiento básico
comienza inyectando un ratón, u otro animal adecuado, con un
inmunógeno. Subsiguientemente se sacrifica el ratón y las células
tomadas de su bazo se fusionan con células de mieloma, dando como
resultado un hibridoma que se reproduce in vitro. Se
selecciona la población de hibridomas para aislar clones
individuales, cada uno de los cuales secreta una especie de
anticuerpo única, específica para el inmunógeno. Cada anticuerpo
obtenido de esta manera es el producto clónico de una célula B
única.
Los anticuerpos quiméricos están descritos en la
Patente de EEUU Nº 4.816.567. Esta referencia describe
procedimientos y vectores para la preparación de anticuerpos
quiméricos. Un enfoque alternativo se provee en la Patente de EEUU
Nº 4.816.397. Esta patente enseña la coexpresión de las cadenas
pesadas y livianas de un anticuerpo en la misma célula huésped.
El enfoque de Patente de EEUU Nº 4.816.397 ha
sido refinado más aún en la Publicación de Patente Europea 0 239
400. Las enseñanzas de esta Publicación de Patente Europea
representan un formato de preferencia para ingeniería genética de
anticuerpos monoclonales. En esta tecnología las regiones que
determinan complementariedad (CDRs) de un anticuerpo humano se
reemplazan con las CDRs de un anticuerpo monoclonal murino,
convirtiendo de esta manera la especificidad del anticuerpo humano
en especificidad de un anticuerpo murino.
Los anticuerpos de cadena única y bibliotecas de
los mismos son aún otra variedad de anticuerpos realizados con
ingeniería genética, tecnología que es bien conocida en la técnica.
(Ver, por ejemplo, R. E. Bird, y col., Science 242:
423-426 (1988); Publicaciones PCT Nº WO 88/01649, WO
90/14430, y WO 91/10737). La tecnología de anticuerpos de cadena
única incluye la unión covalente de las regiones de unión de las
cadenas pesadas y livianas para generar una cadena polipeptídica
única. La especificidad de unión de la molécula de anticuerpo
intacta es por lo tanto reproducida en una cadena polipeptídica
única.
Las proteínas o fragmentos adecuados de las
mismas necesarios para generar anticuerpos policlonales o
monoclonales, y diversos híbridos inter especies, o anticuerpos
humanizados, o fragmentos de anticuerpos o anticuerpos de cadena
única están descritos en este documento. Las técnicas para producir
anticuerpos son bien conocidas por los técnicos expertos. (Ver, por
ejemplo, A. M. Campbell, Monoclonal Antibody Technology: Laboratory
Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science
Publishers, Amsterdam (1984); Kohler y Milstein, Nature
256,495-497 (1975); Monoclonal Antibodies:
Principles & Applications Ed. J. R. Birch & E. S. Lennox,
Wiley-Liss (1995)).
El procedimiento de mayor preferencia para
generar MAbs para los polipéptidos y glicopéptidos de la presente
invención comprende producir dichos MAbs en un animal transgénico
modificado de manera tal que sean capaces de producir MAbs
completamente humanizados tras la exposición antigénica. Los MAbs
humanizados y los procedimientos para su producción son
generalmente conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, las Patentes
de EEUU Nº 4.704.362, 4.816.567, 5.434.340, 5.545.806, 5.530.101,
5.569.825, 5.585.089, 5.625.126, 5.633.425, 5.643.763, 5.693.761,
5.693.762, 5.714.350, 5.874.299, 5.877.397, 5.939.598, 6.023.010,
6.054.297, y las publicaciones PCT/
W09634096, PCT/W09633735, y PCT/W09824893).
W09634096, PCT/W09633735, y PCT/W09824893).
Una proteína usada como inmunógeno puede
modificarse o administrarse en un adyuvante, por inyección
subcutánea o intraperitoneal en, por ejemplo, un ratón o un conejo.
Para la producción de anticuerpos monoclonales, se retiran células
de bazo de animales inmunizados, se fusionan con células de mieloma,
tales como células SP2/0-Ag14, y se las convierte
en células de hibridoma productoras de anticuerpos monoclonales de
la manera conocida por los expertos en la técnica. Los hibridomas
que secretan una molécula de anticuerpo deseada pueden seleccionarse
por una variedad de procedimientos conocidos, por ejemplo por
ensayo ELISA, análisis de transferencia Western o radioinmunoensayo
(Lutz y col., Exp. Cell Res. 175,109-124 (1988);
Monoclonal Antibodies: Principles Applications Ed. J. R. Birch
& E. S. Lennox, Wiley-Liss (1995)).
La síntesis de polinucleótidos
LP-48 (tal como se provee en SEQ ID Nº 1) y ácidos
nucleicos relacionados que podrían codificar polipéptidos
LP-48 como se definen en este documente o fragmentos
de los mismos es bien conocida en la técnica. Ver, por ejemplo, E.
L. Brown, R. Belagaje, M. J. Ryan y H. G. Khorana, Methods in
Enzymology, 68: 109-151 (1979). Podrían generarse
fragmentos de la secuencia de ADN correspondientes a secuencias de
LP-48 usando un aparato convencional de síntesis de
ADN, tales como los sintetizadores de ADN Applied Biosystems Modelo
380A o 380B (Applied Biosystems,Inc., 850 Lincoln Center Drive,
Foster City, CA 94404) usando química de fosforamidita, ligando así
los fragmentos de manera de reconstituir la secuencia de
LP-48 entera. Alternativamente, puede usarse
química de fosfotriéster para sintetizar los ácidos nucleicos de
esta invención. (Ver, por ejemplo, M. J. Gait, ed., Oligonucleotide
Synthesis, A Practical Approach, (1984)).
En un procedimiento alternativo, a saber PCR,
las secuencias de ADN descritas en este documento, que comprenden,
por ejemplo, una porción de toda la SEQ ID Nº 1, pueden producirse a
partir de una pluralidad de materiales de inicio. Por ejemplo,
comenzando con la preparación de un ADNc (por ej., biblioteca de
ADNc) derivado de un tejido que expresa el gen de
LP-48, se preparan cebadores de oligonucleótidos
adecuados complementarios a regiones de SEQ ID Nº 1 o a cualquier
subregión de la misma, como se describe en la Patente de EEUU Nº
4.889,818. En PCR Protocols: A Guide to Method and Applications, Ed.
Michael A. Innis y col., Academic Press, Inc. (1990) se describen
otros protocolos adecuados para la PCR. Usando PCR, puede marcarse
cualquier región del gen de LP-48 por amplificación
de manera que pueden producirse secuencias completas o parciales del
gen que contienen un dominio extracelular funcional.
Podría resultar ventajoso usar cebadores de
oligonucleótidos. La secuencia de tales cebadores está diseñada
usando un polinucleótido de la presente invención para uso en la
detección, amplificación o mutación de un segmento definido de un
gen o polinucleótido que codifica un polipéptido
LP-48 usando tecnología PCR.
Debería tenerse en cuenta la fuerza iónica y la
temperatura de incubación bajo la que se usará una sonda. Se sabe
que la hibridación aumentará a medida que aumente la fuerza iónica
de la mezcla de reacción, y que la estabilidad térmica de híbridos
moleculares aumentará con la fuerza iónica creciente. Por otro lado,
los reactivos químicos tales como formamida, urea, DMSO y
alcoholes, que rompen los enlaces hidrógeno, aumentan la
rigurosidad de la hibridación. La desestabilización de los enlaces
hidrógeno por tales reactivos puede reducir en gran medida la Tm
(temperatura de fusión). En general, la hibridación óptima para
sondas de oligonucleótidos sintéticas de aproximadamente
10-50 bases de longitud se produce aproximadamente
5ºC por debajo de la temperatura de fusión de un dúplex dado. La
incubación a temperaturas por debajo de la óptima puede permitir que
hibriden secuencias de bases no coincidentes y por ello den como
resultado una especificidad disminuida.
La longitud de la secuencia de ácido nucleico
blanco y, consecuentemente, la longitud de la secuencia de la sonda
pueden ser también importantes. En algunos casos, puede haber varias
secuencias de una región particular, variando en localización y
longitud, que darán sondas con las características de hibridación
deseadas. En otros casos, una secuencia puede ser
significativamente mejor que otra aunque la primera secuencia
difiere únicamente por una única base. Finalmente, puede haber
híbridos intramoleculares e intermoleculares formados entre una
sonda si hay suficiente autocomplementariedad. Estas estructuras
pueden evitarse a través de un diseño cuidadoso de la sonda.
Existen programas informáticos disponibles para buscar este tipo de
interacción.
La presente descripción provee procedimientos
ejemplares para construir una célula huésped recombinante capaz de
expresar proteínas que comprenden polipéptidos
LP-48, dichos procedimientos comprenden transformar
o de otra manera introducir en una célula huésped un vector de ADN
recombinante que comprende una secuencia de ADN aislada que
codifica polipéptidos que comprenden secuencias como se muestran en
SEQ ID Nº 2. La célula huésped de preferencia es cualquier célula
eucariota que puede adaptarse a un alto nivel de expresión de un
gen o proteína introducido por vía exógena, y que incorporará dicha
proteína en su estructura de membrana. Los expertos en la técnica
entienden que elegir el vector de clonación o vector de expresión
más adecuado depende de una cantidad de factores incluyendo la
disponibilidad de sitios para enzimas de restricción, el tipo de
célula huésped en la que se transfectará o transformará el vector,
el objetivo de la transfección o transformación (por ej.,
transformación estable como un elemento extracromosómico, o
integración en el cromosoma del huésped), la presencia o ausencia
de marcadores fácilmente ensayables o seleccionables (por ej.,
resistencia a antibióticos y marcadores metabólicos de un tipo y de
otro), y el número de copias del gen deseadas en la célula
huésped.
Al preparar un vector de expresión, el experto
en la técnica entiende que existen muchas variables a considerar,
por ejemplo, el uso de un promotor constitutivo o uno inducible. El
médico también entiende que la cantidad de ácido nucleico o
proteína a producir dicta, en parte, la selección del sistema de
expresión. Con relación a las secuencias de promotores, resultan de
preferencia los promotores inducibles porque permiten una expresión
de alto nivel, regulable de un gen unido de manera operativa. El
técnico experto reconocerá una cantidad de promotores adecuados que
responden a una diversidad de inductores, por ejemplo, fuente de
carbono, iones metálicos y calor. Otras consideraciones relevantes
con relación a un vector de expresión incluyen la posibilidad de
incluir secuencias para dirigir la localización de una proteína
recombinante. Por ejemplo, una secuencia que codifica un péptido
señal precediendo la región codificadora de un gen es útil para
dirigir la exportación extracelular de un polipéptido resultante.
Las células huésped transformadas pueden cultivarse bajo condiciones
bien conocidas por los técnicos expertos de tal manera que se
exprese una secuencia que comprende el polipéptido como se muestra
en SEQ ID Nº 2, produciendo así una proteína LP-48
recombinante en la célula huésped recombinante.
Los ácidos nucleicos que codifican un
polipéptido LP-48 de la presente invención o
cualquiera de sus formas modificadas pueden también usarse para
generar animales transgénicos o animales "knock out" que, a su
vez, son útiles en el desarrollo y selección de reactivos
terapéuticamente útiles. Los procedimientos para generar animales
transgénicos, particularmente animales tales como ratones o ratas,
resultaron convencionales en la técnica y se describen, por
ejemplo, en las Patentes de EEUU Nº 4.736.866 y 4.870.009.
Típicamente, se marcarían células particulares para la
incorporación de un transgen de LP-48 con
potenciadores específicos de tejido. Los animales transgénicos que
incluyen una copia de un transgen introducido en la línea germinal
del animal en una etapa embrionaria puede usarse para examinar el
efecto de expresión aumentada de ADN que codifica el polipéptido
LP-48. Pueden usarse tales animales como animales de
prueba para reactivos proyectados para conferir protección de, por
ejemplo, afecciones patológicas asociadas con su sobreexpresión. De
acuerdo con esta faceta de la invención, se trata un animal con el
reactivo y una incidencia reducida de la afección patológica,
comparada con animales sin tratar que llevan el transgen, indicaría
una potencial intervención terapéutica para la afección
patológica.
Alternativamente, pueden usarse homólogos de
LP-48 no humanos para construir un animal "knock
out" que tiene un gen defectuoso o alterado que codifica un
polipéptido LP-48 particular como resultado de
recombinación homóloga entre el gen endógeno que codifica el
polipéptido LP-48 y el ADN genómico alterado
introducido en una célula embrionaria del animal. Por ejemplo,
puede usarse ADNc que codifica un polipéptido LP-48
para clonar ADN genómico que codifica ese polipéptido
LP-48 de acuerdo con técnicas establecidas. Puede
deleccionarse una porción de ADN genómico que codifica ese
polipéptido LP-48 o reemplazarse con otro gen, tal
como un gen que codifica un marcador seleccionable que puede usarse
para controlar la integración. Típicamente, se incluyen varias
kilobases de ADN vecino inalterado (en los extremos 5' y 3') en el
vector [ver, por ejemplo, Thomas y Capecchi, Cell 51 (3):
503-12 (1987) para una descripción de vectores de
recombinación homólogos]. El vector se introduce en una línea de
células madre embrionarias (por ejemplo, por electroporación), y se
seleccionan las células en las que el ADN introducido se ha
recombinado de manera homóloga con el ADN endógeno [ver, por
ejemplo, Li y col., Cell 69 (6):915-26 (1992)].
Posteriormente se inyectan las células seleccionadas en un
blastocisto de un animal (por ejemplo, un ratón o rata) para formar
quimeras de agregación [ver, por ejemplo, Bradley, Teratocarcinomas
and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed.
(IRL, Oxford, 1987), págs.113-152]. Posteriormente
puede implantarse un embrión quimérico en un animal hembra adoptivo
seudo preñado adecuado y llevar el embrión a término para crear un
animal "knock out". La progenie que contiene el ADN
recombinado de manera homóloga en sus células germinales puede
identificarse mediante técnicas convencionales y puede usarse para
engendrar animales en los que todas las células contienen ADN
recombinado de manera homóloga. Los animales knock out pueden
caracterizarse, por ejemplo, por su capacidad para defenderse contra
ciertas afecciones patológicas y por el desarrollo de afecciones
patológicas debido a la ausencia del polipéptido
LP-48 nativo.
Los mamíferos transgénicos no humanos son útiles
como modelos animales en investigación básica y en intentos de
desarrollo de fármacos. Los animales transgénicos que expresan al
menos un polipéptido LP-48 o ácido nucleico de
LP-48 pueden usarse para probar compuestos u otras
modalidades de tratamiento que pueden prevenir, suprimir o curar
una patología o enfermedad asociada con al menos una de las
actividades mencionadas anteriormente. Tales animales transgénicos
pueden también servir como un modelo para probar procedimientos de
diagnóstico para esas mismas enfermedades. Además, los tejidos
derivados de tales mamíferos transgénicos no humanos son útiles
como fuente de células para cultivo celular en esfuerzos para
desarrollar bioensayos in vitro para identificar compuestos
que modulan la actividad del polipéptido LP-48 o
desarrollar señales dependientes del polipéptido
LP-48. Un procedimiento para identificar compuestos
eficaces en el tratamiento de al menos una enfermedad previamente
descrita o patología asociada con una actividad asociada con el
polipéptido LP-48 comprende:
- a)
- generar un animal transgénico no humano que expresa un polipéptido LP-48 de la presente invención y que es, en comparación con un animal de tipo salvaje, patológicamente distinto de alguna manera detectable o medible a la versión de tipo salvaje de dicho mamífero no humano;
- b)
- exponer a dicho animal transgénico a un compuesto, y;
- c)
- determinar la progresión de la patología en el animal transgénico tratado, en el que una detención, demora, o cambio en la progresión de la enfermedad en el animal transgénico tratado con dicho compuesto comparado con la progresión del a patología en un animal control no tratado es indicativo de que el compuesto es útil para el tratamiento de dicha patología.
Un procedimiento para identificar compuestos
capaces de inhibir la actividad del polipéptido
LP-48 in vivo y/o in vitro
comprende:
- a)
- administrar un compuesto experimental a un animal transgénico no humano que expresa el polipéptido LP-48, o tejidos derivados del mismo, exhibiendo una o más afecciones fisiológicas o patológicas atribuibles a la expresión de un transgen de LP-48; y
- b)
- observar o ensayar dicho animal y/o tejidos animales para detectar cambios en dicha afección o afecciones fisiológicas o patológicas.
Un procedimiento para identificar compuestos
capaces de solucionar deficiencias en la actividad del polipéptido
LP-48 in vivo y/o in vitro
comprende:
- a)
- administrar un compuesto experimental a un animal transgénico no humano que expresa el polipéptido LP-48, o tejidos derivados del mismo, exhibiendo una o más afecciones fisiológicas o patológicas atribuibles a la alteración del gen endógeno que codifica el polipéptido LP-48; y
- b)
- observar o ensayar dicho animal y/o tejidos animales para detectar cambios en dicha afección o afecciones fisiológicas o patológicas.
La capacidad de un compuesto para modular la
actividad de un polipéptido LP-48 en el cuerpo de un
animal transgénico puede determinarse por diversos medios.
Uno de tales medios es observando la remisión de
una afección patológica en el animal transgénico que expresa el
polipéptido LP-48 tras la administración de un
compuesto. Otro medio de más preferencia es el ensayo de marcadores
para actividad de LP-48 en la sangre de un animal
transgénico previamente y tras administrarle un compuesto
experimental al animal. La habilidad del técnico en las técnicas
relevantes provee fácilmente al médico numerosos procedimientos
para ensayar cambios fisiológicos relaciones con la modulación
terapéutica de la actividad de
LP-48.
LP-48.
La "Terapia génica" incluye terapia génica
convencional, en la que el último efecto se alcanza por medio de un
tratamiento único, y la administración de agentes terapéuticos de
genes, que incluye la administración una o repetidas veces de ADN o
ARNm terapéuticamente eficaz.
Pueden usarse ARN y ADN antisentido como agentes
terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in
vivo. Ya se ha demostrado que pueden importarse oligonucleótidos
antisentido cortos dentro de células en las que actúan como
inhibidores, a pesar de sus bajas concentraciones intracelulares
causadas por su incorporación restringida por la membrana celular
[Zamecnik y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 83(12):
4143-6 (1986)]. Los oligonucleótidos pueden
modificarse para aumentar la incorporación, por ejemplo,
sustituyendo sus grupos fosfodiéster cargados negativamente con
grupos no cargados.
Existe una diversidad de técnicas disponibles
para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas
varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido dentro de
células cultivadas in vitro o in vivo en las células
del huésped previsto. Las técnicas adecuadas para la transferencia
de ácido nucleico dentro de células de mamíferos in vitro
incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección,
fusión celular, dextran-DEAE, el procedimiento de
precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas de
transferencia genética in vivo actualmente de preferencia
incluyen la transfección con vectores virales (típicamente,
retrovirales) y la transfección mediada por
proteína-liposoma recubierto de virus [Dzau y col.,
Trends in Biotechnology 11 (5): 205-10 (1993)]. En
algunas situaciones es deseable proveer la fuente de ácido nucleico
con un agente que marca las células blanco, tal como un anticuerpo
específico para una proteína de la membrana superficial celular o
la célula blanco, un ligando para un receptor en las células blanco,
etc. Cuando se usan liposomas, pueden usarse proteínas que se unen
a una proteína de membrana de la superficie celular asociadas con
endocitosis para marcar y/o facilitar la incorporación, por
ejemplo, las proteínas de cápside o fragmentos de las mismas tienen
trofismo por un tipo de célula particular, los anticuerpos contra
proteínas que sufren internalización en ciclo, proteínas que marcan
localización intracelular y aumentan la semivida intracelular. La
técnica de endocitosis mediada por receptor está descrita, por
ejemplo por Wu y col., J. Biol. Chem. 262 (10):
4429-32 (1987); y Wagner y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. EEUU 87 (9): 3410-4 (1990). Para una revisión
de marcación de genes y protocolos de terapia génica, ver Anderson,
Science 256 (5058): 808-13 (1992).
Como está demostrado en los Ejemplos 15 y 16,
los polipéptidos LP-48 pueden reducir
significativamente la apoptosis en células endoteliales humanas,
además de disminuir la apoptosis en células endoteliales, se ha
demostrado que los polipéptidos LP-48 se unen a
células endoteliales humanas (Ejemplo 17). Se vio que la apoptosis
de células endoteliales se produce en una cantidad de enfermedades
incluyendo, pero no limitándose a, aterosclerosis, hipertensión,
fallo cardiaco congestivo, hipertensión pulmonar primaria, sepsis,
síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, SDRA, disfunción
multiorgánica y vasculopatía por aloinjerto. La capacidad de
LP-48 para reducir la apoptosis de células
endoteliales humanas como de unirse a células endoteliales humanas
indica que LP-48 puede resultar útil para bloquear
la destrucción del tejido endotelial que se produce a través de la
apoptosis. De acuerdo con esto, puede usarse LP-48
para tratar aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, sepsis, síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica, SDRA, disfunción multiorgánica y
vasculopatía por aloinjertos y afecciones y enfermedades adicionales
en las que se produce apoptosis de células endoteliales.
El Ejemplo 14 muestra que los polipéptidos
LP-48 son útiles para inhibir la secreción de
IFN-\gamma, IL-12,
TNF-\alpha, IL-6 y
GM-CSF, los que son consideraros importantes en la
patogénesis de enfermedades inflamatorias y autoinmunes incluyendo,
pero no limitado a, sepsis, bacteriemia por gram negativos,
respuestas alérgicas, enfermedades autoinmunes alérgicas, diabetes
tipo 1, insulitis dependiente de Th1, inflamación, esclerosis
múltiple, artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria,
fallo hepático, SDRA y afecciones o síntomas relacionados con los
mismos. Además, el polipéptido LP-48 parece unirse a
células de ratón y células pancreáticas humanas (ver, Ejemplo 18).
Dado que los polipéptidos LP-48 son útiles para
inhibir la producción de IFN-\gamma e
IL-12 (ver Ejemplo 14), los polipéptidos
LP-48 pueden usarse para bloquear los efectos
destructivos de IFN-\gamma,
IL-12, IL-6,
TNF-\alpha, y/o IL-1\beta en el
páncreas y prevenir la apoptosis de células pancreáticas. En
consecuencia, LP-48 puede usarse para tratar la
diabetes (Ejemplo 20).
Los datos presentados en los Ejemplos 12 y 13
muestran que la sepsis, bacteriemia por gram negativos, inflamación
aguda y afecciones o síntomas relacionados con los mismos pueden
tratarse o prevenirse mediante la administración de cantidades
eficaces de polipéptidos LP-48. La administración de
proteína LP-48 recombinante purificada inhibió los
efectos producidos durante el choque endotóxico agudo y previno la
muerte. Caracterizada generalmente, la invención también se refiere
a procedimientos para prevenir o tratar afecciones causadas o
exacerbadas por la inflamación crónica incluyendo, pero no
limitándose a, respuestas alérgicas, enfermedades autoinmunes
alérgicas, diabetes tipo 1, insulitis dependiente de Th1,
inflamación, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad
intestinal inflamatoria, fallo hepático, SDRA y afecciones o
síntomas relacionados con los mismos administrando cantidades
eficaces de polipéptidos LP-48. La presente
invención además provee procedimientos para prevenir o tratar
afecciones adicionales mediadas por inflamación administrando
cantidades terapéuticamente eficaces de polipéptidos
LP-48. Estos trastornos mediados por inflamación
incluyen, pero no se limitan a acné, bronquitis aguda,
bronquiolitis, daño pulmonar agudo, conjuntivitis alérgica, rinitis
alérgica, rechazo de aloinjertos, enfermedad de Alzheimer, angina,
apoptosis, síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA),
asma, eccema atópico, quemaduras, bursitis, cerebritis,
colecistitis, bronquitis crónica incluyendo exacerbaciones agudas
de bronquitis crónica, cirrosis, dermatitis por contacto, enfermedad
de Crohn, cistitis, dermatosis, gastritis erosiva, esofagitis,
gastritis, glomerulonefritis, enfermedad injerto versus
huésped (GVHD), hepatitis, hipertensión, fibrosis pulmonar
intersticial, iritis, síndrome de intestino irritable, mastocitosis,
migraña, miastenia gravis, isquemia miocárdica, osteoartritis,
osteomielitis, pancreatitis, faringitis, prostatitis, daños por
reperfusión, sarcoidosis, sepsis, choque séptico, síndrome de
respuesta inflamatoria sistémica, síndrome de Sjogren, lupus
eritematoso sistémico, tendonitis, tonsillitis, nefritis
tubulointersticial, colitis ulcerosa, uveítis, inflamación crónica,
y afecciones y síntomas relacionados con los mismos. Como se
demuestra en el Ejemplo 21, pueden usarse polipéptidos
LP-48 en la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de enfermedad hepática. LP-48 previno
el daño hepático inducido por LPS y D-galactosamina
y protegió el 100% de ratones del fallo hepático y
muerte.
muerte.
El Ejemplo 14 muestra que LP-48
inhibe la secreción de IFN-\gamma,
TNF-\alpha, IL-1\beta e
IL-6. Estas citoquinas proinflamatorias juegan
papeles esenciales en la patogénesis de artritis reumatoide. Por
consiguiente, puede usarse LP-48 para tratar
artritis reumatoide como se demuestra en el Ejemplo 22.
La esclerosis múltiple es una enfermedad
autoinmune. IFN-\gamma e IL-12
juegan papeles críticos en el desarrollo y recaída de la
enfermedad. Se ha establecido que el bloqueo de
IL-12 e IFN-\gamma previene del
desarrollo de EAE en ratones. LP-48 inhibe
IFN-\gamma e IL-12 (Ejemplo 14) y
puede, por lo tanto, usarse para tratar la esclerosis múltiple como
se presenta en el Ejemplo 23.
Además de tratar la esclerosis múltiple, los
polipéptidos LP-48 pueden usarse en la fabricación
un medicamento para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes en
general. Por consiguiente, pueden usarse polipéptidos
LP-48 para tratar trastornos autoinmunes
incluyendo, pero no limitándose a, GVHD, artritis reumatoide, asma,
eccema, atopía, enfermedad intestinal inflamatoria, vasculitis,
soriasis, diabetes mellitus dependiente de insulina, pancreatitis,
cáncer, esclerosis múltiple, tiroiditis de Hashimoto, enfermedad de
Graves, rechazo de trasplantes, lupus eritematoso sistémico,
nefropatía autoinmune, hemopatía autoinmune, neumonía intersticial
idiopática, neumonitis por hipersensibilidad, dermatosis
autoinmune, cardiopatía autoinmune, infertilidad autoinmune,
enfermedad de Behcet, gastritis autoinmune, enfermedad pulmonar
fibrótica, hepatitis B viral fulminante, hepatitis C viral
fulminante, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, cirrosis
crónica, glomerulonefritis crónica, púrpura trombocitopénica
trombótica (PTT) y síndrome urémico hemolítico (SHU), anemia
aplásica, mielodisplasia, síndrome de disfunción multiorgánica
(SDMO), síndrome de distrés respiratorio del adulto (SDRA), y
afecciones y síntomas relacionados con los mismos.
Como se muestra en el Ejemplo 14, los
polipéptidos LP-48 inhiben la secreción de
IFN-\gamma, TNF-\alpha,
IL-12 e IL-6. De acuerdo con la
capacidad de LP-48 para inhibir estos factores, una
forma de realización de la invención provee el uso de un
antagonista de LP-48 en el tratamiento o prevención
de una afección mediada por células T. Tales afecciones mediadas
por células T incluyen, pero no se limitan a, inmunodeficiencia,
VIH, linfoma inducido por VIH, SIDA inducido por VIH, hepatitis B
viral fulminante, hepatitis C viral fulminante, hepatitis crónica,
cirrosis crónica, citoprotección durante el tratamiento del cáncer,
recuperación de quimioterapia, recuperación de terapia de
irradiación y afecciones o síntomas relacionados con las mismas.
IL-12 es un mediador central de
la respuesta inmune mediada por células en parte por sus actividades
en el desarrollo, proliferación y actividades de las células Th1
(Locksley, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU), 90: 5879 (1993);
Trinchieri, G., Immunol. Today, 14: 335 (1993); Scott, P., Science,
260: 496 (1993); Hseih, C. S. y col., Science, 260: 547 (1993)).
Estas actividades de IL-12 son antagonizadas por
factores que están asociados con el desarrollo de células T helper
no comprometidas en células Th2 y la mediación de la respuesta
inmune humoral (por ejemplo, IL-4 y
IL-10; Locksley, R. M., Proc. Natl. Acad. Sci.
(EEUU) 90: 5879, (1993); Trinchieri, G., (1993); Scott, P., Science
260: 496, (1993); y Hseih, C. S. y col., Science 260: 547 (1993)).
Como se muestra en el Ejemplo 14, LP48 es útil inhibiendo la
secreción de IL-12. Por consiguiente, puede usarse
LP-48 en el tratamiento o prevención de una afección
mediada por células Th2. A la inversa, la administración de un
antagonista de LP-48 provee una mejora de la
inmunidad mediada por células Th2.
Se han evidenciado células endoteliales
apoptóticas en modelos de aterosclerosis en animales y en seres
humanos (Stefanec, Chest, 117:841 (2000)). Se ha visto que los
factores de riesgo asociados con aterosclerosis causan típicamente
apoptosis endotelial in vitro o aumento de la cantidad de
células endoteliales circulantes in vivo. Se ha observado que
la lipoproteína de baja densidad oxidada, que induce varios cambios
asociados con las etapas tempranas de la aterosclerosis, induce
apoptosis de células endoteliales de células endoteliales de vena
endotelial humana (Harada-Shiba y col., J. Biol.
Chem., 273: 9681 (1998)). Muchas terapias que demostraron tener
efectos beneficiosos en aterosclerosis ha mostrado tener o se cree
que tienen un efecto antiapoptótico. Dada la capacidad del
polipéptido LP-48 para inhibir la apoptosis de
células endoteliales, una forma de realización de la invención
provee el uso de LP-48 en el tratamiento de
aterosclerosis.
Una característica distintiva de la hipertensión
es el enrarecimiento capilar, en el que existe una disminución del
número de capilares por volumen de tejido. De acuerdo con el modelo
de hipertensión de Goldblatt, la apoptosis endotelial contribuye en
gran parte al enrarecimiento microvascular (Stefanec, Chest, 117:
841 (2000)). Se sugirió a su vez en base a estudios in vitro
que la hipertensión tiene un efecto proapotótico en algunos tipos
de células. Además, la disfunción endotelial y el aumento en la
producción de superóxido causado por la hipertensión son
indicativos de apoptosis endotelial. Varios medios para tratar la
hipertensión pueden tener un efecto antiapoptótico. A causa de los
efectos antiapoptóticos de LP-48, una forma de
realización de la invención provee el uso de un polipéptido
LP-48 en la fabricación de un medicamento para
tratar la hipertensión y afecciones asociadas con la
hipertensión.
Estudios con modelos de animales dirigidos al
fallo cardíaco congestivo indican que la apoptosis endotelial
contribuye a esta enfermedad. Por ejemplo, en un modelo animal de
insuficiencia aórtica en el que se indujo una anomalía
hemodinámica, se observó un aumento de células endoteliales
circulantes (que son indicativas de apoptosis) 28 días tras la
inducción (Stefanec, Chest, 117: 841 (2000)). En otro ejemplo, un
modelo de rata de fallo ventricular derecho inducido con
monocrotalina mostró durante un período de 30 días un aumento
progresivo y significativo en la cantidad de células endoteliales
apoptóticas en músculo esquelético (Stefanec, Chest, 117: 841
(2000)). Este aumento de células endoteliales apoptóticas se
acompaño de un aumento de TNF y péptido natriurético atrial, que
junto con la angiotensina II pueden contribuir con la apoptosis de
células endoteliales en el fallo cardíaco congestivo. Por ello, una
forma de realización de la invención provee el uso de un
polipéptido LP-48 en el tratamiento de fallo
cardíaco congestivo reduciendo la apoptosis endotelial.
Varias observaciones asociadas con hipertensión
pulmonar primaria sugirieron que la apoptosis de células
endoteliales puede contribuir a la patogénesis de esta enfermedad.
En un modelo en rata de hipertensión pulmonar, se observó apoptosis
en la capa de células endoteliales de arteria pulmonar de rata
adulta previo al establecimiento de hipertensión pulmonar
progresiva (Jones y Rabinovitch, Circ. Res., 79: 1131 (1996)). En la
hipertensión pulmonar primaria en seres humanos se han detectado
niveles séricos aumentados de IL-1\beta, que
pueden potenciar la apoptosis de células endoteliales (Stefanec,
Chest, 117: 841 (2000)). A lo largo de estas líneas, se ha
observado que el desarrollo de hipertensión pulmonar primaria se
reduce con el tratamiento de un antagonista de receptor de
IL-1 en un modelo en rata (Voelkel y col., Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol., 11: 664 (1994)). Varios tratamientos para
la hipertensión pulmonar primaria, incluyendo prostaciclina,
bloqueadores de canales de calcio y enzima convertidora de
angiotensina tienen efectos antiapoptóticos en el endotelio
(Stefanec, Chest, 117: 841 (2000)). La capacidad de
LP-48 para reducir o prevenir la apoptosis de
células endoteliales provee por lo tanto una forma de realización
de la invención en la que se usa LP-48 en el
tratamiento de hipertensión pulmonar primaria.
Pueden formularse en una composición
farmacéuticamente aceptable polipéptidos LP-48 de
preparaciones sustancialmente purificadas o puras y/o anticuerpos
que reconocen el epitope LP-48. Por ejemplo, está
contemplada una formulación farmacéutica adaptada para el
tratamiento de una afección mediada por inflamación conteniendo un
polipéptido o un fragmento de LP-48, análogo y/o
homólogo del mismo. Tales formulaciones farmacéuticas pueden
dosificarse de una manera consistente con la buena práctica médica,
teniendo en cuenta la condición clínica del paciente individual
(especialmente los efectos laterales del tratamiento con
polipéptidos LP-48 y/o anticuerpos que reconocen el
epitope LP-48 solos), el sitio de administración de
los polipéptidos LP-48 y/o composiciones de
anticuerpos que reconocen LP-48, el procedimiento de
administración, el calendario de administración y otros factores
conocidos por los médicos.
Una cantidad eficaz de un polipéptido
LP-48 o anticuerpo que reconoce el epitope
LP-48 servirá para prevenir o tratar al menos un
síntoma de respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas autoinmunes,
diabetes tipo 1, insulitis dependiente Th1, inmunodeficiencias,
cánceres, inflamación, enfermedades infecciosas, o servirá para
modular la actividad biológica de al menos un ligando natural. Una
cantidad eficaz de un polipéptido LP-48 y/o
anticuerpo que reconoce LP-48 para prevenir o tratar
al menos un síntoma puede determinarse por medio de prevención o
alivio de afecciones o síntomas adversos de las enfermedades
tratadas. La cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptido
LP-48 y/o anticuerpo que reconoce
LP-48 para los objetivos de este documento se
determina por lo tanto mediante tales consideraciones.
Administrando niveles graduales de polipéptido LP-48
y/o anticuerpo que reconoce LP-48 dentro de una
composición farmacéutica, un clínico experto en la técnica puede
determinar la dosis terapéuticamente eficaz de un polipéptido
LP-48 y/o anticuerpo que reconoce el epitope
LP-48 para el tratamiento o prevención de
aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, sepsis, bacteriemia por gram
negativos, respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas autoinmunes,
diabetes tipo 1, insulitis dependiente Th1, inmunodeficiencias,
cánceres, inflamación y enfermedades infecciosas. Tales
determinaciones son bien conocidas en la técnica y dentro de la
habilidad del clínico para ajustar la cantidad terapéuticamente
eficaz del polipéptido LP-48 y/o anticuerpo que
reconoce LP-48 en una composición farmacéutica
acorde. Una cantidad terapéuticamente eficaz de polipéptido
LP-48 y/o anticuerpo que reconoce
LP-48 da como resultado la modulación medible de la
actividad biológica asociada con el polipéptido
LP-48.
Como propuesta general, la cantidad total
terapéuticamente eficaz de polipéptido LP-48 y/o
anticuerpo que reconoce LP-48 administrada por vía
parenteral por dosis de una composición farmacéutica estará en el
intervalo desde aproximadamente 1 \mug/kg/día hasta 10 mg/kg/día
del peso corporal del paciente. Sin embargo, como se indica a
continuación, esto estará sujeto al criterio terapéutico. De
preferencia, esta dosis es de al menos 0,001 mg/kg/día, o al menos
0,01 mg/kg/día, o al menos 0,10 mg/kg/día, o al menos 1,0
mg/kg/día.
Como otra propuesta, si se administra de manera
continua, el polipéptido LP-48 y/o anticuerpo que
reconoce LP-48 se administra típicamente en dosis
desde aproximadamente 0,1 \mug/kg/hora hasta aproximadamente 50
\mug/kg/hora, ya sea mediante 1-4 inyecciones por
día o por medio de infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo,
usando una minibomba. También puede usarse una bolsa de solución
intravenosa. La duración del tratamiento necesario para observar
cambios y el intervalo de tratamiento siguiente para se produzcan
respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado.
Las composiciones farmacéuticas que contienen el
polipéptido LP-48 y/o anticuerpo que reconoce
LP-48 pueden administrarse usando una diversidad de
formas que incluyen, pero no se limitan a, vía oral, rectal,
intracraneal, parenteral, intracisternal, intratecal, intravaginal,
intraperitoneal, intratraqueal, intrabroncopulmonar, tópica,
transdérmica (mediante polvos, ungüentos, gotas o parches
transdérmicos), bucal, o por medio de vaporización oral o nasal. Se
entiende por "vehículo farmacéuticamente aceptable" un agente
de relleno sólido no tóxico, semisólido o líquido, diluyente,
material de encapsulado o formulación auxiliar de cualquier tipo. El
término "parenteral" como se usa en este documento se refiere
a formas de administración que incluyen, pero no se limitan a,
inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal,
intraesternal, subcutánea e intraarticular. Pueden usarse también
implantes que comprenden polipéptido LP-48 y/o
anticuerpo que reconoce LP-48.
Los polipéptidos LP-48 y/o
anticuerpos que reconocen LP-48 se administran
también adecuadamente mediante sistemas de liberación sostenida.
Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida
incluyen matrices poliméricas semipermeables, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida
incluyen polilactidas (Patente de EEUU Nº 3.773.919, y Documento EP
58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma-etil-L-glutamato
(Sidman y col., Biopolymers 22: 547-556 (1983)),
poli (2hidroxietil) metacrilato (Langer, R., y col., J. Biomed.
Mater. Res. 15: 167-277 (1981))), vinilacetato de
etileno (R. Langer y col., 1982) o ácido
poli-D-3-hidroxibutírico
(Documento EP 133.988).
Las composiciones de liberación sostenida de
polipéptidos LP-48 y/o anticuerpos que reconocen
LP-48 también incluyen polipéptidos
LP-48 atrapados en liposomas. Los liposomas que
contienen polipéptidos LP-48 se preparan mediante
procedimientos conocidos per se (Documento de DE 3.218.121;
Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (EEUU) 82:
3688-3692 (1985); Hwang y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. (EEUU) 77: 4030-4034 (1980)); los Documentos
EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; la
Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; las
Patentes de EEUU Nº 4.485.045 y 4.544.545; y Documento EP102. 324.
Generalmente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño
(aproximadamente 200-800 Angstroms) en los que el
contenido de lípidos es mayor que aproximadamente 30 moles por
ciento de colesterol, ajustando la proporción seleccionada para el
tratamiento óptimo con polipéptido LP-48.
Para administración parenteral, puede formularse
el polipéptido LP-48 y/o anticuerpo que reconoce
LP-48 mezclando en el grado de pureza deseado, en
una forma de dosificación unitaria inyectable (solución, suspensión
o emulsión), con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es decir,
uno que no es tóxico para los receptores en las dosificaciones y
concentraciones usadas y es compatible con otros ingredientes en la
formulación. Por ejemplo, la formulación de preferencia no incluye
agentes oxidantes y otros compuestos que se sabe son perjudiciales
para los polipéptidos.
Generalmente, las formulaciones se preparan
poniendo en contacto el polipéptido LP-48 de manera
uniforme e íntima con vehículos líquidos o vehículos sólidos
finamente divididos o ambos. Posteriormente, si es necesario, se da
la forma deseada en la formulación al producto. De preferencia el
vehículo es un vehículo parenteral, de más preferencia una solución
que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales
vehículos incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, y
solución de dextrosa. También son útiles en este documento los
vehículos no acuosos tales como aceites fijados y oleato de etilo,
así como también los liposomas.
El vehículo contiene adecuadamente cantidades
menores de aditivos tales como sustancias que mejoran la
isotonicidad y estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos
para los receptores en las dosificaciones y concentraciones usadas
e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido
acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales
como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de
aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o
tripéptidos; proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tal como
polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido
glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos,
y otros carbohidratos incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa,
manosa o dextrinas; agentes quelantes tal EDTA; alcoholes de
azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones tal como sodio;
y/o tensioactivos noiónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o
PEG.
El polipéptido LP-48 y/o
anticuerpo que reconoce LP-48 se formula típicamente
en tales vehículos a una concentración de aproximadamente 0,1 mg/ml
a 100 mg/ml, de preferencia 1-10 mg/ml, a un pH de
aproximadamente 3 a 8. Debe entenderse que el uso de ciertos de los
anteriores excipientes, vehículos, o estabilizantes puede dar como
resultado la formación de sales del polipéptido
LP-48. Las composiciones farmacéuticas que
comprenden el polipéptido LP-48 y/o anticuerpo que
reconoce LP-48 para uso en la administración
terapéutica deben ser estériles. Se obtiene fácilmente la
esterilidad por medio de filtración a través de membranas de
filtración estériles (por ejemplo membranas de 0,2 micrómetros).
Las composiciones farmacéuticas que comprenden polipéptidos
LP-48 y/o anticuerpos que reconocen el epitope
LP-48 se colocan generalmente en un envase con una
vía de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución
intravenosa o vial con un tapón perforable por medio de una aguja de
inyección hipodérmica.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden
polipéptidos LP-48 y/o anticuerpos que reconocen
LP-48 se almacenan generalmente en envases
unitarios o de dosis múltiple, por ejemplo ampollas o viales
sellados, como una solución acuosa o como una formulación
liofilizada para reconstitución. Como un ejemplo de una formulación
liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución de
polipéptido LP-48 acuosa al 1% (p/v) esterilizada
por filtración y se liofiliza la mezcla resultante. La solución de
infusión se prepara reconstituyendo el polipéptido
LP-48 liofilizado usando Agua para Inyección
bacteriostática.
Además, las composiciones farmacéuticas que
comprenden polipéptidos LP-48 y/o anticuerpos que
reconoce el epitope LP-48 pueden usarse en el
tratamiento o prevención de sepsis, bacteriemia por gram negativos,
respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas autoinmunes, diabetes
tipo 1, insulitis dependiente Th1, inmunodeficiencias, cánceres,
inflamación y enfermedades infecciosas y/o afecciones o síntomas
relacionados con los mismos, en la que dicha composición además
comprende otros compuestos terapéuticos.
A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la
técnica a la que pertenece la invención. Aunque pueden usarse
procedimientos y materiales similares o equivalentes a aquellos
descritos en este documento en la práctica o pruebas de la presente
invención, a continuación se describen los procedimientos y
materiales adecuados. La presente solicitud controlará, los casos de
conflicto, incluyendo las definiciones. Además, los materiales,
procedimientos y ejemplos descritos en este documento son sólo
ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Los siguientes ejemplos describen más
ampliamente la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se identificó la secuencia parcial de ADN de
LP-48 a partir de la secuencia EST única en la base
de datos Incyte de una biblioteca de ADNc de próstata humana. Se
aisló toda la extensión del ADNc de una biblioteca de leucocitos
humanos por PCR. LP-48 contiene 179 aminoácidos y se
caracterizó inicialmente teniendo similitud con
IL-17 ya que es 20% idéntico a
IL-17.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se realizó análisis de transferencia Northern
para examinar la expresión del gen de IL-17 en
tejidos humanos, usando procedimientos descritos en Current
Protocols in Molecular Biology. Se marcó una sonda de ADNc
conteniendo la secuencia completa de nucleótidos del polipéptido
LP-48 con ^{32}P usando el sistema de marcación de
ADN Random Prime™ (Amersham Life Science), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Tras la marcación, se purificó la
sonda usando una columna CHROMA SPIN-100™ (Clontech
Laboratories, Inc.), de acuerdo con el protocolo número
PT1200-1 de fabricante. Posteriormente se usó la
sonda marcada purificada para examinar varios tejidos humanos en
busca de ARNm de IL-17.
Se obtuvieron transferencias Northern Múltiples
de Tejidos (MTM) que contenían diversos tejidos humanos (H) o
tejidos de sistema inmune humano (IM) de Clontech y se examinaron
con la sonda marcada usando solución de hibridación ExpressHyb
(Clontech) de acuerdo con el protocolo número
PT1190-1 del fabricante. Tras la hibridación y
lavado, se montaron las manchas y se expusieron a una película a
-70ºC durante la noche, y se revelaron las películas de acuerdo con
procedimientos convencionales. Los resultados muestran que la
expresión de LP-48 fue muy baja y no se detectó en
cerebro humano, placenta, hígado, riñón, bazo, timo, próstata,
ovario, intestino, colon, estómago, tiroides, columna vertebral,
nódulos linfáticos, tráquea, glándula adrenal. Usando técnicas
conocidas por los expertos en la técnica, RT-PCR
detectó expresión de LP-48 en testículos y
leucocitos así como en hígado y riñón fetales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Un vector de expresión en mamífero típico
contiene al menos un elemento promotor, que media el inicio de la
transcripción de ARNm, la secuencia que codifica el polipéptido y
señales necesarias para la terminación de la transcripción y
poliadenilación del transcripto. Además, cada vector de expresión en
mamífero puede tener potenciadores, secuencias Kozak y secuencias
intervinientes vecinas a sitios dadores y aceptores para empalmar
ARN.
Puede lograrse transcripción altamente eficaz
con los promotores temprano y tardío de SV40 y las repeticiones
terminales largas (LTRS) de Retrovirus, por ejemplo, RSV, HTLVI,
VIHI y el promotor temprano de citomegalovirus (CMV). Sin embargo,
también pueden usarse elementos celulares (por ejemplo, promotor de
actina humano). Los vectores de expresión adecuados para uso para
proveer LP-48 incluyen, por ejemplo, vectores tales
como pIRES1neo, pRetro-Off,
pRetro-On, PLXSN, o pLNCX (Clontech Labs, Palo Alto,
CA), pcDNA3.1 (+/-), pcDNA/Zeo (+/-) o pcDNA3.1/Hygro (+/-)
(Invitrogen), PSVL y PMSG (Pharmacia, Uppsala, Suecia), pRSVcat
(ATCC 37152), pSV2dhfr (ATCC 37146) y pBC12MI (ATCC 67109). Las
células huésped de mamífero que podrían usarse incluyen células
HeLa, 293, H9 y Jurkat humanas, células NIH3T3 y C127 de ratón,
células Cos 1, Cos 7 y CV 1, células quail QC1-3,
células L de ratón y células de ovario de hámster Chino (CHO).
Alternativamente, pueden expresarse las
secuencias de ADN que codifican LP-48 deseadas en
líneas celulares estables que contienen las secuencias de ADN para
expresar cada subunidad integradas en un cromosoma(s). La
cotransfección con un marcador seleccionable tal como dhfr, gpt,
neomicina, o higromicina permite la identificación y aislamiento de
las células transfectadas como se conoce en la técnica.
Las secuencias de ADN que codifican el
polipéptido LP-48 transfectadas pueden también
amplificarse para expresar grandes cantidades del polipéptido
codificado. El marcador DHFR (dihidrofolato reductasa) es útil para
desarrollar líneas celulares que llevan varios cientos o incluso
varios miles de copias de las secuencias de ADN de interés. Otro
marcador de selección útil es la enzima glutamina sintasa (GS)
(Murphy y col., Biochem. J. 227: 277 279 (1991); Bebbington y col.,
Bio/Technology 10: 169-175(1992)). Usando
estos marcadores, se cultivan las células de mamífero en medios
selectivos y se seleccionan las células con mayor resistencia. Estas
líneas celulares contienen el gen(es) amplificado(s)
integrado en un cromosoma. Frecuentemente se usan células de ovario
de hámster Chino (CHO) y células NSO para la producción de
proteínas y polipéptidos.
Los vectores de expresión pCl y pC4 contienen el
potente promotor (LTR) del virus Sarcoma Rous (Cullen y col.,
Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)) más un
fragmento del potenciador-CMV (Boshart y col., Cell
41: 52-1-530 (1985)). Los múltiples
sitios de clonación, por ejemplo, con los sitios de clivaje con
enzimas de restricción BamHI, XbaI y Asp718, facilitan la clonación
de las secuencias de ADN de sTNRF6. Los vectores contienen, además
del intrón 3', la señal de poliadenilación y terminación del gen de
preproinsulina de rata.
Pueden transfectarse células 293 T con un
plásmido de expresión linealizado PvuI usando el procedimiento de
coprecipitación con fosfato de calcio. Pueden seleccionarse clones
de neomicina en 400 \mug/ml de G418 y expandir los clones
seleccionados. Los clones productores pueden seleccionarse usando un
ensayo ELISA con IgG1 antihumana y análisis Northern con sonda de
ADN específica de LP-48 marcada con ^{32}P. De
manera similar, los clones que producen
LP-48-Fc pueden producirse en
células COS o CHO.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se produce un plásmido para expresar
polipéptidos LP-48 clonando un ADNc que codifica
polipéptidos LP-48 en el vector de expresión
pcDNAI/Amp o pcDNAIII (que pueden obtenerse en Invitrogen, Inc.). El
vector(es) de expresión pcDNAI/Amp y pcDNAIII contienen: (1)
un origen de replicación de E. coli eficaz para la
propagación en E. coli y otras células procariotas; (2) un
gen de resistencia a ampicilina para la selección de células
procariotas que contienen el plásmido; (3) un origen de replicación
de SV40 para propagación en células eucariotas; (4) un promotor de
CMV, un policonector, un intrón de SV40; (5) varios codones que
codifican un fragmento hemaglutinina (es decir, un marcador
"HA" para facilitar la purificación) o marcador HIS (ver, por
ejemplo, Ausubel, y col., ed., Current Protocols in Molecular
Biology, John Wiley y Sons, NY (1987-1999)) seguido
por un codón de terminación y una señal de poliadenilación
confeccionada de manera tal que puede colocarse convenientemente un
ADNc bajo el control de expresión del promotor de CMV y unido
operativamente al intrón de SV40 y la señal de poliadenilación por
medio de sitios de restricción en el policonector. El marcador HA
corresponde con un epitope derivado del polipéptido hemaglutinina
de influenza como se describió anteriormente (Wilson y col., Cell
37: 767-778 (1984)). La fusión del marcador HA con
LP-48, permite detectar y recuperar fácilmente el
polipéptidos recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitope
HA. pcDNAIII contiene además, el marcador seleccionable
neomicina.
Se clona por separado un fragmento de ADN que
codifica el polipéptido LP-48 en la región del
policonector del vector de manera que la expresión del polipéptido
recombinante es dirigida por el promotor de CMV. La inserción en el
vector es opcionalmente con o sin el epitope HA. La estrategia de
construcción del plásmido es la siguiente. Puede amplificarse un
ADN que codifica el polipéptido LP-48 usando
cebadores que contienen sitios de restricción convenientes. Los
fragmentos de ADN que codifican LP-48 amplificados
por PCR y el vector pcDNAI/Amp son digeridos con enzima(s)
de restricción adecuadas y posteriormente se une el fragmento de ADN
que codifica LP-48 a un vector digerido. Cada
mezcla de unión es transformada dentro de la cepa de E. coli
SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey
Pines Road, La Jolla, CA 92037), y se plaquea el cultivo
transformado en placas con medio con ampicilina que posteriormente
se incuban para permitir el crecimiento de colonias resistentes a
la ampicilina. El ADN de plásmidos para cada subunidad se aisla de
las colonias resistentes y se examinan mediante análisis de
restricción y otros medios la presencia del fragmento que codifica
LP-48.
Para la expresión de polipéptidos
LP-48, se cotransfectan células COS con un vector de
expresión, como se describió anteriormente, usando
DEAE-DEXTRAN, como está descrito en, por ejemplo,
Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). Se
incuban las células bajo condiciones adecuadas para la expresión de
LP-48.
El polipéptido
LP-48-HA se detecta por medio de
marcación radiactiva e inmunoprecipitación, usando procedimientos
descritos en, por ejemplo, Harlow y col., Antibodies: A Laboratory
Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York (1988). Para este fin, dos días tras la
transfección, se marcan las células por incubación en medio
conteniendo ^{35}S-cisteína durante 8 horas. Se
recogen las células y el medio, se lavan las células y se lisan con
detergente conteniendo tampón RIPA: 150 mM NaCl, 1%
NP-40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM TRIS, pH 7,5, como
describieron Wilson y col., Cell 37: 767-778 (1984).
Se precipitan las proteínas del lisado celular y del medio de
cultivo usando un anticuerpo monoclonal específico de HA.
Posteriormente se analiza la proteína precipitada por
SDS-PAGE y autorradiografía.
\newpage
En el lisado celular se observa un producto de
expresión del tamaño esperado, que no se observa en los controles
negativos.
El vector pC4 puede usarse para la expresión de
LP-48. El plásmido pC4 es un derivado del plásmido
pSV2-dhfr (ATCC Nº de Acceso 37146). El plásmido
contiene el gen de DHFR de ratón bajo el control del promotor
temprano de SV40. Pueden seleccionarse células de ovario de hámster
Chino (dhfr-) u otras células sin actividad dihidrofolato que son
cotransfectadas con plásmidos de LP-48 cultivando
las células en un medio selectivo (alfa minus MEM, Life
Technologies) suplementado con el agente quimioterapéutico
metotrexato (MTX). La amplificación de los genes de DHFR en células
resistentes a metotrexato ha sido bien documentada (ver, por
ejemplo, Alt y col., J. Biol. Chem. 253: 1357-1370
(1978); Hamlin y col., Biophys. Acta 1097: 107-143
(1990); y Page y col., Biotechnology 9: 64-68
(1991)). Las células cultivas en concentraciones crecientes de MTX
desarrollan resistencia al fármaco por superproducción de la enzima
blanco, DHFR, como resultado de la amplificación del gen de DHFR. Si
las secuencias de ADN están unidas al gen de DHFR, es normalmente
coamplificado y superexpresado. Se sabe en la técnica que este
enfoque puede usarse para desarrollar líneas celulares con mas de
1.000 copias del gen(es) amplificado(s).
Subsiguientemente, cuando se retira el metotrexato se obtienen
líneas celulares que contienen las secuencias de ADN amplificadas
integradas en uno o más cromosomas de la célula huésped.
El plásmido pC4 contiene el potente promotor de
la repetición terminal larga (LTR) del virus de Sarcoma Rous
(Cullen y col., Molec. Cell. Biol. 5: 438-447 (1985)
para la expresión de secuencias de genes insertados. PC4 contiene
además un fragmento aislado del potenciador del gen inmediato
temprano de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart y col., Cell 41:
521-530 (1985)). Secuencia abajo del promotor están
los sitios de clivaje de enzimas de restricción BamHI, XbaI, y
Asp718 que permiten la integración de las secuencias de ADN. Detrás
de estos sitios de clonación el plásmido contiene el intrón 3' y el
sitio de poliadenilación del gen de preproinsulina de rata. Pueden
usarse también otros promotores de alta eficacia para la expresión
de, por ejemplo, el promotor de \beta-actina
humana, los promotores temprano o tardío de SV40 o las repeticiones
terminales largas de otros retrovirus, por ejemplo, VIH y HTLVI.
Pueden usarse sistemas de expresión de genes Clontech
Tet-Off y Tet-On y sistemas
similares para expresar LP-48 de una manera regulada
en células de mamíferos (Gossen y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
(EEUU), 89: 5547-5551 (1982)). Pueden también usarse
para la poliadenilación de las otras señales de ARNm, por ejemplo,
de los genes de hormona de crecimiento humana o globina humana.
También pueden seleccionarse líneas celulares estables que llevan
secuencias de ADN de LP-48 integradas en sus
cromosomas tras la cotransfección con un marcador seleccionable tal
como gpt, G418 o higromicina. Resulta ventajoso usar más de un
marcador seleccionable al principio, por ejemplo G418 más
metotrexato.
Se digiere el plásmido pC4 con enzimas de
restricción y posteriormente se desfosforila usando fosfatasa
intestinal de ternero mediante procedimientos conocidos en la
técnica. Posteriormente se aisla el vector de un gel de agarosa al
1%. Se amplifica la secuencia de ADN que codifica la secuencia
completa de LP-48 usando cebadores de
oligonucleótidos de PCR correspondientes a las secuencias 5' y 3'
del gen. Ejemplos no limitativos incluyen cebadores 5' y 3' con
nucleótidos correspondientes o complementarios a una porción del
LP-48 codificado de acuerdo con los procedimientos
conocidos en la técnica.
Se digieren los fragmentos amplificados con
endonucleasas amplificadas y posteriormente se purifica otra vez en
un gel de agarosa al 1%. Posteriormente se unen los fragmentos para
cada subunidad y el vector desfosforilado por separado con T4 ADN
ligasa. Posteriormente se transforman células de E. coli
HB101 o células Azules XL-1 y se identifican las
bacterias que contienen el fragmento (o fragmentos si el vector está
adaptado para expresar las subunidades alfa y beta) insertados en
un plásmido pC4 usando, por ejemplo, análisis de enzimas de
restricción.
Se usan células de ovario de hámster Chino (CHO)
que carecen de un gen de DHFR activo para transfección. Se
cotransfectan 5 \mug de plásmidos de expresión pC4 con 0,5 \mug
del plásmido pSV2-neo usando lipofectina. El
plásmido pSV2-neo contiene un marcador dominante
seleccionable, el gen neo de Tn5 que codifica una enzima que
confiere resistencia a un grupo de antibióticos incluyendo G418. Se
siembran las células en medio alfa minus MEM suplementado con 1
\mug/ml de G418. Tras 2 días, se tripsinan las células y se
siembran en placas de clonación de hibridomas (Greiner, Alemania)
en alfa minus MEM suplementado con 10, 25, o 50 ng/ml de metotrexato
más 1 \mug/ml de G418. Tras aproximadamente 10-14
días se tripsinan los clones y se siembran en placas de petri de 6
pocillos o matraces de 10 ml usando diferentes concentraciones de
metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Posteriormente
se transfieren los clones que crecen a concentraciones más elevadas
de metotrexato a nuevas placas de 6 pocillos conteniendo
concentraciones aún más altas de metotrexato (1 mM, 2 mM, 5 mM, 10
mM, 20 mM). Se repite el mismo procedimiento hasta que se obtienen
clones a concentraciones de 100-200 mM. Se analiza
la expresión del producto deseado, por ejemplo, mediante
SDS-PAGE y transferencia Western o por análisis HPLC
en fase
inversa.
inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se fabrica fácilmente un vector de expresión
adecuado para expresar polipéptidos LP-48 o
fragmentos del mismo en una diversidad de células huésped
procariotas tal como E. coli. El vector contiene un origen de
replicación (Ori), un gen de resistencia a la ampicilina (Amp) útil
para seleccionar células que incorporaron el vector tras el
procedimiento de transformación, y además comprende las secuencias
del promotor T7 y el terminador T7 en unión operativa a una región
codificadora del polipéptido LP-48. El plásmido
pET11A (obtenido en Novogen, Madison WI) es un plásmido original
adecuado. El pET11A es linealizado por restricción con endonucleasas
NdeI y BamHI. El pET11A se une a un fragmento de ADN que lleva
extremos cohesivos NdeI y BamHI y comprende la región codificadora
del gen de LP-48 descrito por SEQ ID Nº 1 o un
fragmento del mismo.
El ADN que codifica el polipéptido
LP-48 usado en esta construcción puede modificarse
ligeramente en el extremo 5' (amino terminal de la proteína
codificada) con el fin de simplificar la purificación del producto
proteico codificado. Para este objetivo, se inserta un
oligonucleótido que codifica 8 residuos histidina tras el codón de
inicio ATG. La colocación de los residuos histidina en el extremo
amino terminal de la proteína codificada sirve para permitir el
procedimiento de purificación de proteínas en una etapa IMAC.
Se transforma un vector de expresión que lleva
un marco abierto de lectura (ORF) que codifica un polipéptido
LP-48 o fragmento del mismo y cuyo ORF está unido
operativamente a un promotor de expresión en E. coli BL21
(DE3) (hsdS gal \lambdaclts857
ind1Sam7nin51acUV5-T7gene 1) usando procedimientos
convencionales. Se eligen los transformantes, seleccionados por
resistencia a ampicilina al azar y se prueban para verificar la
presencia del vector por medio de electroforesis en gel de agarosa
usando preparaciones rápidas de plásmidos. Se cultivan las colonias
que contienen el vector en caldo L y se purifica el producto
proteico codificado por el ORF del vector por medio de
cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC),
esencialmente como se describe en la Patente de EEUU Nº
4.569.794.
Brevemente, la columna de IMAC se prepara de la
siguiente manera. Se lava una resina quelante libre de metales (por
ejemplo, Sepharose 6B IDA, Pharmacia) en agua destilada para
eliminar sustancias conservantes y se infunde con un ión metálico
adecuado [por ejemplo, Ni (II), Co (II), o Cu (II)] agregando una
solución acuosa 50 mM de cloruro metálico o sulfato metálico hasta
que aproximadamente el 75% de los espacios intersticiales están
saturados con el ión metálico coloreado. Posteriormente la columna
está lista para recibir el extracto celular bruto conteniendo el
producto proteico recombinante. Tras eliminar las proteínas no
unidas y otros materiales lavando la columna con cualquier tampón
adecuado, pH 7,5, se eluye la proteína unida en cualquier tampón
adecuado a pH 4,3, o de preferencia con un tampón que contiene
imidazol a pH 7,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se aisla un polipéptido LP-48
sustancialmente puro o fragmento del mismo de células transfectadas
o transformadas usando cualquiera de los procedimientos bien
conocidos en la técnica, o mediante un procedimiento específicamente
descrito en este documento. Se ajusta la concentración de proteína
en una preparación final, por ejemplo, por filtración a través de
un dispositivo de filtro Amicon de manera que el nivel es de
aproximadamente 1 a 5 \mug/ml. Los anticuerpos monoclonales o
policlonales pueden prepararse de la siguiente manera.
Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a
partir de hibridomas murinos de acuerdo con el método de Kohler y
Milstein (Kohler y Milstein Nature 256: 495 (1975)), o un
procedimiento modificado del mismo. Brevemente, se inocula en
repetidas veces un ratón usando unos pocos microgramos del péptido,
polipéptido o polipéptido de fusión, durante un período de unas
pocas semanas. Posteriormente se sacrifica el ratón y se aislan las
células productoras de anticuerpos del bazo. Se fusionan las células
del bazo por medio de polietilenglicol con células de mieloma de
ratón. Las células fusionadas que producen anticuerpo se identifican
mediante cualquier inmunoensayo adecuado, por ejemplo, ELISA, como
se describe E. Engvall, (Meth. Enzymol. 70: 419 (1980)).
Puede prepararse antisuero policlonal mediante
técnicas bien conocidas (ver, por ejemplo, J. Vaitukaitis y col.,
Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988 (1971)) que incluyen inmunizar
animales adecuados con uno o más de los polipéptidos de fusión de
polipéptidos LP-48, o fragmentos de los mismos
descritos en este documento. El procedimiento más fiable parece ser
administrar pequeñas dosis (por ejemplo, cantidades en nanogramos)
de antígeno en múltiples sitios intradérmicamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Para facilitar la confirmación de la expresión
de polipéptido LP-48 (sin usar anticuerpos que
reconocen el epitope LP-48), se construyó un vector
de expresión bicistrónico
(pIG1-LP-48F) por inserción de un
fragmento de PCR "sitio de entrada interno de
ribosomas"/proteína fluorescente verde potenciada (IRES/eGFP) en
el vector de expresión de mamífero pGTD (Gerlitz, B. y col.,
Biochemical Journal 295: 131 (1993)). Este nuevo vector, llamado
pIG1 contiene los siguientes puntos de referencia de secuencia: el
promotor GBMT que responde a E1a (D. T. Berg y col., BioTechniques
14: 972 (1993); D. T. Berg y col Nucleic Acids Research 20: 5485
(1992)); un sitio de clonación de ADNc de BclI único; la secuencia
IRES del virus de encefalomiocarditis (EMCV); la secuencia
codificadora de eGFP (Clontech) (Cormack, y col., Gene 173: 33
(1996)); las secuencias del sitio de empalme de antígeno "t"
pequeño de SV40/poliadenilación; el promotor temprano y el origen de
replicación de SV40; la secuencia codificadora de dihidrofolato
reductasa murina (dhfr); y el marcador de resistencia a
ampicilina/origen de replicación pBR322.
Se sintetizaron un par de cebadores conteniendo
la secuencia de ADN escindida por la enzima de restricción BcII en
su extremo 5' terminal de manera que cuando se usa para amplificar
el ADN que codifica el polipéptido LP-48 incorpora
la secuencia de ADN que codifica el epitope Flag de 8 aminoácidos en
marco con las secuencias de ADN que codifican LP-48
en el extremo 3' terminal del producto amplificado (Micele, R. M. y
col., J. Immunol., Methods 167: 279 (1994)). Estos cebadores se
usan para amplificar por PCR el ADN que codifica el polipéptido
LP-48. Posteriormente se digiere el producto
resultante de la PCR (LP-48F) con BcII (sitios de
restricción incorporados en los cebadores) y se une al sitio BcII
único de pIG1 para generar el plásmido
pIG1-LP-48F. Puede confirmarse la
orientación y secuencia de nucleótidos del ADNc de
LP-48 humano por medio de digestión por restricción
y secuenciación de doble hebra del inserto.
De esta manera, puede generarse un vector de
expresión que codifica una proteína de fusión LP-48
conteniendo el polipéptido FLAG (SEQ ID Nº 3) fusionado
directamente con el extremo C terminal del polipéptido
LP-48 maduro. La SEQ ID Nº 4, por ejemplo, muestra
los aminoácidos 19-197 de la SEQ ID Nº 2 fusionados
con los ocho aminoácidos del epitope del polipéptido marcador FLAG
(SEQ ID Nº 3).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
Con el fin de generar un vector de expresión
(pIGl-LP-48) sin Flag, se deleccionó
la secuencia de ADN de 24 bases que codifica los ocho aminoácidos
del epitope FLAG de la construcción
pIG1-LP-48F usando el equipo para
mutagenesis Quik Change (Stratagene). Se sintetizó un cebador de 35
bases y su complemento, con identidad con la secuencia de 19 bases
vecina a la secuencia FLAG y se usó para cebar la PCR usando el
plásmido como molde. Se digirió el producto de PCR con endonucleasa
de restricción DpnI para eliminar el ADN de origen, y se transformó
el producto digerido en células de E. coli Epicurean
XLI-Blue.
Se tomaron los transformantes resistentes a
ampicilina y se analizó el ADN del plásmido por digestión por
restricción. Se confirmó la deleción precisa de la secuencia de 24
bases secuenciando el ADN de
pIG1-LP-48. De acuerdo con la
deleción de la secuencia que codifica FLAG,
pIG1-LP-48 codifica la expresión del
polipéptido LP-48 maduro, de 179 aminoácidos
(aminoácidos 19-197 de SEQ ID Nº 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
Se preparó LP-48 como una
proteína de fusión acoplada a una región constante de
inmunoglobulina. La región constante de inmunoglobulina puede
contener modificaciones incluyendo aquellas que reducen o eliminan
la actividad efectora inherente a la estructura de inmunoglobulina.
(Ver, por ejemplo, la Publicación PCT Nº WO88/07089, publicada el
22 de Septiembre de 1988). Brevemente, se aplicó extensión
superpuesta por PCR para unir ADN que codifica
LP-48 al ADN que codifica la bisagra, regiones CH2 y
CH3 de IgG1 humana. Esto se realizó como se describe en las
siguientes subsecciones.
Se preparó un fragmento de ADN correspondiente a
las secuencias de ADN que codifican la totalidad o una porción de
LP-48 por medio de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) usando pares de cebadores diseñados para amplificar
secuencias que codifican LP-48 con secuencia 5' de
ADN para ATG agregada para incorporar un sitio NdeI y un sitio
EcoR47III. Un ADNc que codifica toda la extensión sirvió como molde
para amplificar LP-48. La amplificación por PCR con
estos cebadores generó un fragmento de ADN que codificó la extensión
total o una porción de LP-48. La secuencia de IgG1
humana se obtuvo de Genbank (acceso: HUMIGCC4; Takahashi y col.,
Cell 29: 671-679, 1982). Esta se recopiló en exones
y una región secuencia arriba de la región de bisagra natural
elegida como sitio de fusión. El cebador 5' se diseñó para incluir
una superposición para el amplicon LP-48. El cebador
3' fue complementario a región Fc e incorporó el codón de
interrupción de la traducción.
Las reacciones de PCR se prepararon en un
volumen final de 100 \mul compuesto de polimerasa Pfu y tampón
(Stratagene) conteniendo cebadores(1 \muM cada uno), dNTPs
(200 \muM cada uno), y 1 ng de ADN molde.
Posteriormente se escindió el fragmento
resultante con NheI y Eco4711 que reconocen los sitios únicos
incorporados en el cebador de PCR hacia adelante de la primera
reacción de PCR y el cebador de PCR inverso de la segunda reacción
de PCR. Posteriormente se clonó el fragmento digerido en un vector
de expresión, pJB02 que también se trató con estas enzimas de
restricción.
\newpage
La clonación dio como resultado clones que
contienen la fusión LP-48-Fc. La
secuencia puede confirmarse por medio de secuencias de ADN.
Primero, se cultivaron células 293T y se realizó
una transfección transitoria usando lipofectamina
(GIBCO-BRL). La caracterización del sobrenadante
reveló una proteína del tamaño esperable para un dímero del
LP-48-Fc, confirmando de esta
manera la integridad de la construcción. Se confirmó la expresión de
la proteína por medio de transferencia Western usando un anticuerpo
para IgG1 humana.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
La producción a gran escala de polipéptidos
LP-48 se efectúa cultivando en primer lugar clones
estables que expresan LP-48 en varias centrífugas
de 10 litros. Tras alcanzar confluencia, se incuban las células
durante otros 2-3 días para secretar la cantidad
máxima de LP-48 en el medio. El medio conteniendo el
polipéptido LP-48 se ajusta a 0,1% CHAPS y se
concentra en un sistema de filtración tangencial Amicon ProFlux M12
hasta 350 ml. Se centrifuga el medio concentrado a 19.000 rpm
(43.000 g) durante 15 minutos y se pasa a través de una columna
SP-5PW TSK-GEL (21,5 mm x 15 cm;
TosoHaas) a un caudal de 8 ml/min. Se lava la columna con tampón A
(20 mM MOPS, 0,1% CHAPS, pH 6,5) hasta que la absorbancia (280 nm)
regresa al valor basal y se eluyen las proteínas unidas con un
gradiente lineal desde 0,1 M hasta 0,3 M NaCl (en tampón A)
desarrollado durante 85 minutos. Se combinan las fracciones que
contienen polipéptido LP-48 y se pasan por una
columna (7,5 mm x 7,5 cm) de Heparina-5PW
TSK-GEL equilibrada en tampón B (50 mM Tris, 0,1%
CHAPS, 0,3 M NaCl, pH 7,0). Se eluye la proteína unida con un
gradiente lineal desde 0,3 M hasta 0,1 M NaCl (en tampón B)
desarrollado durante 60 minutos. Se combinan las fracciones
conteniendo polipéptido LP-48 y se pasan por una
columna de 1 cm x 15 cm Vydac C4 equilibrada con 0,1% TFA/H_{2}O.
Se eluye el polipéptido LP-48 unido con un gradiente
lineal desde 0 hasta 100% de CH_{3}CN/0,1% TFA. Se analizaron las
fracciones conteniendo polipéptido LP-48 por
SDS-PAGE y resultaron tener una pureza mayor al 95%
y se dializaron contra 8 mM NaPO_{4}, 0,5 M NaCl, 10% glicerol, pH
7,4.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Se cortó el fragmento del gen de
LP-48 de un vector DHFR por medio de digestión con
Asc I y Sal I y se purificó en gel. Posteriormente se unió este
fragmento a los sitios MluI y XhoI del plásmido pLIV.7 (provisto por
John Taylor, The J. David Gladstone Institutes) generando el
plásmido pLIV7-LP48. El plásmido pLIV.7 está
descrito por Fan, J. y col., cuando se usó para crear el plásmido
pLivhHL1 (Fan, J. y col, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 8724, (1994)).
pLiv.7 es idéntico a pLivhHL1 con la secuencia HL (lipasa hepática)
eliminada y contiene el promotor del gen apo E/región vecina a 5' y
una secuencia potenciadora hepática llamada región de control
hepático (HCR). Para microinyección en embriones, se cortó un
fragmento de ADN de 6,5 kb que abarca el gen de fusión: promotor
del gen Apo
E-LP-48-región del
control hepático (HCR) del plásmido pLIV7-LP48 por
digestión con SalI y SpeI y se purificó mediante electroforesis en
gel y extracción con perlas de vidrio.
Los ratones transgénicos se generaron usando
técnicas establecidas (Hogan, B. y col., (1986) Manipulating the
Mouse Embryo: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, N.
Y.) modificadas por Fox y Solter (Fox y Solter, Mol. Cell. Biol. 8:
5470, (1988)). Brevemente, se microinyectó el fragmento de ADN de
6,5 kb que abarca el gen de fusión: promotor del gen Apo
E-LP-48-HCR en los
pronúcleos de embriones machos en la etapa de una célula
fertilizados de novo (cigotos) de la cepa FVB/N. Se
cultivaron los embriones in vitro durante la noche para
permitir el desarrollo hasta la etapa de dos células. Posteriormente
se trasplantaron los embriones de dos células en los oviductos de
ratones seudopreñados de cepa CD-1 para permitir el
desarrollo hasta término. Para probar la presencia del transgen en
las crías recién nacidas de ratón se extirpó una pequeña parte del
dedo de la pata de cada animal y se digirió con proteinasa K para
liberar los ácidos nucleicos. Se sometió subsiguientemente una
muestra del extracto a análisis PCR usando cebadores específicos de
LP-48 humano para identificar ratones
"fundadores" que contienen el transgen. Se criaron los ratones
transgénicos fundadores para producir líneas estables de
transgénicos con niveles plasmáticos de polipéptidos
LP-48 desde 2 ng/ml hasta 100 \mug/ml dependiendo
de la línea.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
Este ejemplo demuestra que los polipéptidos
LP-48 pueden proteger contra el choque séptico
inducido por LPS en ratones. Estos datos indican que los
polipéptidos LP-48 son útiles en la prevención y el
tratamiento de tales
afecciones.
afecciones.
Se administraron 175 \mug/ratón de LPS a 10
ratones BALB/c de 10 semanas de vida (Harlan, Indianapolis) por
inyección intravenosa (en la vena lateral de la cola) para inducir
sepsis y una hora más tarde, se inyectó por vía intravenosa (1)
polipéptido LP-48 humano (50 \mug), o (2) 50
\mug de SAB como control, respectivamente. Se determinaron las
tasas de supervivencia de los ratones 24, 48 y 72 horas tras la
inyección con LPS. El polipéptido LP-48 demostró
una tasa de supervivencia relativa de 100% en un experimento y 80%
en otro experimento. La inyección de SAB no mostró protección
significativa en este modelo. El polipéptido LP-48
mostró similar protección cuando se inyectó el polipéptido
LP-48 por vía subcutánea a ratones 2 horas antes de
la exposición a LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
Se expresó LP-48 humana en
ratones FVB de acuerdo con el Ejemplo 11 y la proteína
LP-48 fue detectable por Elisa en el plasma de
ratones LP-48. Se inyectaron 175 \mug de LPS por
vía intravenosa a ratones transgénicos LP-48 o
ratones de tipo salvaje FVB de edad coincidente. Se determinaron las
tasas de supervivencia de los ratones 24, 48 y 72 horas tras la
inyección de LPS. Los ratones transgénicos LP-48
mostraron una tasa de supervivencia relativa del 100% en dos
experimentos separados.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
Durante la endotoxemia, las citoquinas tienen un
papel central en el proceso de la enfermedad (Dinarello, C. A.,
1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol.). Las citoquinas
proinflamatorias IL-12, IFN-\gamma
y TNF-\alpha son citoquinas clave de la reacción
generalizada Shwartzman (Ozmen, L. M. y col., 1994, J. Exp. Med.180:
907).TNF-\alpha, IL-12 y
IFN-\gamma son rápidamente inducidas tras la
administración de LPS y estos factores contribuyen a la letalidad
inducida por endotoxinas (Gutierrez-Ramos J. C. y
col., 1997, Immunol. 135: 3972).TNF-\gamma es el
mediador primario de mortalidad (Pfeffer, K., Cell 73: 457).
IFN-\gamma parece actuar promoviendo respuestas
aumentadas al TNF, en parte aumentando la síntesis de TNF y de sus
receptores (Doherty, G. M., y col., 1992, J. Immunol. 149: 1666).
IL-12 también puede jugar un papel crítico durante
el choque por endotoxinas, primeramente a través de su función como
inductor de IFN-\gamma (Eur. J. Immunol. 25:
672,1995). Se inyectaron 175 \mug/ratón de LPS a ratones FVB de
tipo salvaje o ratones FVB transgénicos LP-48 de
edades coincidentes por vía intravenosa. Tal dosis de LPS causó
inflamación aguda en los ratones y una tasa de muerte de 90% a 100%
en los experimentos. En respuesta al tratamiento de LPS, se
sintetizaron muchas citoquinas proinflamatorias durante las
primeras horas. Se recogió plasma a 0, 1, 3, 6 y 9 horas post
inyección de LPS. Se analizaron los niveles de
TNF-\alpha, IFN-\gamma,
IL-12, IL-6,
IL-1\beta, GM-CSF,
IL-10, e IL-18 usando procedimientos
tradicionales de ELISA. Los resultados demostraron que el
polipéptido LP-48 redujo significativamente los
niveles de IFN-\gamma, IL-12, y
GM-CSF en el plasma de los ratones. Más aún, los
niveles de TNF-\alpha e IL-6
disminuyeron moderadamente en ratones LP-48
comparado con ratones WT a 6 y/o 9 horas post tratamiento con
polipéptido LP-48. En conclusión
LP-48 inhibe la secreción de IL-12,
IFN-\gamma y GM-CSF, y también
disminuye los niveles de IFN-\gamma e
IL-6 en el modelo LP-48. La
evidencia provista aquí demuestra que la administración de
polipéptido LP-48 puede inhibir la inflamación y
puede ser un tratamiento eficaz para tratar enfermedades
inflamatorias en seres humanos incluyendo, pero no limitando a,
diabetes tipo I, esclerosis múltiple, fallo hepático, choque
séptico, sepsis, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica
(SIRS), daño por isquemia-reperfusión, mortalidad
por endotoxinas, artritis, daño pulmonar, enfermedad intestinal
inflamatoria, enfermedad de Crohn, SDRA, o cualquier enfermedad
asociada con superproducción de citoquinas proinflamatorias
incluyendo IL-12, IFN-\gamma,
GM-CSF, IL-6, y
TNF\alpha.
TNF\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Sin estar ligados a ninguna teoría en
particular, los efectos del polipéptido LP-48
previniendo el choque séptico inducido por LPS (Ejemplo 12) y
muerte (Ejemplo 13) pueden haber ocurrido en parte a través de la
inhibición de apoptosis de células endoteliales. Los estudios de
afecciones médicas consistentes con sepsis y daño pulmonar agudo
indican que la exposición a LPS puede dar como resultado la
apoptosis de células endoteliales in vivo (Stefanec, Chest
117: 841 (2000)).
Se examinaron los efectos del polipéptido
LP-48 en la apoptosis de células endoteliales en un
ensayo de apoptosis en células epiteliales de vena umbilical humana
(HUVEC). In vitro, muchas células endoteliales humanas son
susceptibles de sufrir apoptosis por TNF\alpha sólo en presencia
de inhibidores de transcripción de ARN o inhibidores de síntesis de
proteínas (tales como cicloheximida). La supervivencia de células
HUVEC tras la exposición a TNF\alpha depende de la síntesis de
proteínas citoprotectoras. Los inhibidores de síntesis de proteínas
previenen la síntesis de estas proteínas tras la exposición a
IL-1, LPS, o TNF\alpha (Zen y col, J. Biol. Chem.
274: 28808 (1999); Polunovsky y col, Exp. Cell Res. 214: 584
(1994)).
Para preparar células para un ensayo de
apoptosis, se cultivaron células endoteliales de vena umbilical
humanas (HUVEC) combinadas (P180, lote Nº9F2003) (Clonetics, San
Diego, CA) en medio de crecimiento endotelial (EGM) con 2% FBS
(Clonetics), y se mantuvieron a 37ºC, 5% CO_{2}, 95% de humedad
relativa. Tras dos a seis pasajes celulares, se sembraron las
células HUVEC a razón de 1 x 10^{5} células/pocillo en placas de
cultivo tisular de 6 pocillos con EGM completo (3 ml/pocillo).
Tras 24 horas de incubación, se cambió el medio
en todos los pocillos (3 ml/pocillo) y se agregó un polipéptido de
fusión LP-48-FLAG (que contenía el
epitope FLAG fusionado con el extremo C terminal de
LP-48 nativo, como se describió en el Ejemplo 7) a
los pocillos adecuados a 100 o 200 ng/ml durante una incubación de
16 horas previo a la inducción de apoptosis.
Se indujo la apoptosis por agregación de
cicloheximida (CHX) y TNF\alpha. Se administró CHX (ICN
Biomedicals) preparada como una solución madre de 5 mg/ml en MeOH a
las células a 10 \mug/ml, seguido por incubación durante 30
minutos. Tras la incubación en CHX, se administró a las células
TNF\alpha recombinante (R+D Systems, Minneapolis, MN) a 100 ng/ml
durante una incubación de 24 horas. Se indujo apoptosis en células
en presencia o en ausencia de LP-48. Los controles
negativos incluyeron células, CHX solo y TNF\alpha solo.
Tras la incubación con TNF\alpha, se recogió
el medio celular (que contenía células separadas) en tubos de base
redonda de 12 x 75 mm de propileno Falcon. Para recoger las células
unidas, se agregó 1 ml de trispsina/EDTA (0,25%/1 mM; GIBCO BRL
Life Technologies) previamente calentado a las monocapas durante una
incubación de 3 minutos a temperatura ambiente. Se inactivó la
tripsina agregando 0,5 ml de Solución de Neutralización de Tripsina
(TNS, Clonetics) calentada previamente. Se dispersaron las células
tripsinadas usando una pipeta para tomarlas y soltarlas,
posteriormente se combinaron con el medio que contenía las células
separadas. Se centrifugaron las células a 1000 rpm, 5 minutos a
temperatura ambiente.
Se analizó la apoptosis en las células por medio
de citometría de flujo. Se lavaron los sedimentos celulares y se
agitaron en vórtex en 400 \mul de PBS Dulbecco frío (sin calcio y
sin magnesio) (Life Technologies) conteniendo 0,1% BSA. Se
sedimentaron las células como anteriormente y se fijaron agregando
(y mezclando bien) 400 \mul de Cytofix/Cytoperm (BD Pharmingen).
La fijación se realizó sobre hielo a 4ºC durante al menos 45
minutos. Tras la fijación, se sedimentaron las células y se lavaron
(con vórtex) en 300 \mul de 1 X PERMWASH (BD Pharmingen). Se
centrifugaron nuevamente las células y se eliminó el sobrenadante.
Se aplicó una solución de anticuerpo anti-caspasa 3
activa (40 \mul) (BD Pharmingen anticaspasa 3 activa de conejo
conjugado con FITC, monoclonal, diluido 1:2 en 1 X PERMWASH) a los
sedimentos celulares. Se incubaron las células con el anticuerpo a
4ºC en la oscuridad durante 30 minutos a 2 horas. Posteriormente se
agregó PBS/SAB frío y se agitó bien con vórtex previo al análisis
de selección celular por fluorescencia activada (FACS). A
continuación se realizó el análisis FACS en un Citómetro de Flujo
COULTER™ EPICS XL-MCL (Coulter). Se excluyeron las
células muertas y se registraron 10.000
acontecimientos.
acontecimientos.
Los resultados del análisis FACS se muestran en
la Tabla 2. El porcentaje medio de tinción con anticaspasa 3 activa
(es decir, el porcentaje medio de fluorescencia verde de muestras
por duplicado menos el valor de fondo obtenido a partir de células
teñidas, sin tratar) se muestra, junto con el error estándar. Se
realizaron comparaciones estadísticas (usando una
prueba-t) entre células apoptóticas con o sin
pretratamiento con LP-48. Las células HUVEC
pretratadas con LP-48 mostraron una reducción
significativa de apoptosis en comparación con HUVEC no tratadas con
proteína o HUVEC tratadas con una proteína control, no relacionada
(VEGF o LP111). Estos resultados demuestran que
LP-48 puede reducir la apoptosis en células endoteliales.
LP-48 puede reducir la apoptosis en células endoteliales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Como se describió en el Ejemplo 15, puede
inducirse apoptosis de células endoteliales in vitro usando
cicloheximida y TNF\alpha. Alternativamente, puede inducirse
apoptosis en células endoteliales in vitro por otros medios
incluyendo, pero no limitando a, el uso de estaurosporina,
lipoproteína de baja densidad oxidada y/o radiación ionizante. Por
ejemplo, la lipoproteína de baja densidad oxidada, que induce
cambios tempranos asociados con
aterosclerosis, ha sido usada para
inducir apoptosis en HUVEC (Harada-Shiba y col, J.
Biol. Chem. 273: 9681 (1998)). La radiación ionizante induce
apoptosis in vitro en células microvasculares y
macrovasculares humanas de una manera potenciada por la presencia
de LPS (Eissner y col., Blood, 86: 4184 (1995)). Puede también
usarse radiación ionizante para inducir apoptosis in vivo.
En estudios de radiación intestinal, se observó que ratones
irradiados sufrieron apoptosis en células endoteliales
microvasculares en respuesta a la radiación ionizante (Paris y
col., Science 293: 293
(2001)).
(2001)).
Para examinar más la capacidad de
LP-48 de inhibir la apoptosis en células
endoteliales, se probó el polipéptido LP-48 en un
ensayo en el que se indujo apoptosis con estaurosporina y se analizó
usando el ensayo de apoptosis APOPercentage™ (Biocolor Ltd.,
Belfast, Irlanda del Norte). En este ensayo, se cultivaron células
HUVEC como se describió anteriormente en el Ejemplo 15 y se
sembraron a razón de 3 x 10^{4} células por pocillo en placas de
96 pocillos. Se agregó el polipéptido de fusión
LP-48-FLAG (que contenía el epitope
FLAG fusionado con el extremo C terminal de LP-48
nativa, como se describió en el Ejemplo 7) a los pocillos adecuados
a 100 o 200 ng/ml durante una incubación de 16 horas previo a la
inducción de apoptosis. La apoptosis se indujo tratando las células
con 1 \mug/ml de estaurosporina (Sigma) durante 1 hora. Se
prepararon las células y se tiñeron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante del ensayo de apoptosis APOPercentage™
(BiocolorLtd., Belfast, Irlanda del Norte).
Como se muestra en la Tabla 3, las células HUVEC
tratadas con proteína LP-48 y estaurosporina
sufrieron significativamente menos apoptosis que las HUVEC tratadas
con estaurosporina en ausencia de proteína LP-48.
Los resultados de este ensayo de apoptosis con estaurosporina
además demuestran que LP-48 puede inhibir la
apoptosis de células endoteliales. Estos resultados, junto con los
resultados del ensayo de apoptosis con TNF\alpha y CHX del Ejemplo
15, indican
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
que la proteína
LP-48 puede generalmente inhibir la apoptosis de
células endoteliales independientemente del medio por el que se
induce la
apoptosis.
La capacidad de la proteína
LP-48 para inhibir la apoptosis en células
endoteliales sugiere que la capacidad de la proteína
LP-48 para proteger ratones contra el choque séptico
inducido por LPS puede atribuirse a la capacidad de
LP-48 para reducir o prevenir al apoptosis en
células endoteliales. Por consiguiente, la administración del
polipéptido LP-48 puede ser un tratamiento eficaz
para tratar afecciones médicas caracterizadas por apoptosis en
células endoteliales, incluyendo, pero no limitando a,
aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, sepsis, bacteriemia por gram
negativos, respuestas alérgicas, enfermedades alérgicas
autoinmunes, diabetes tipo 1, insulitis dependiente de Th1,
inflamación, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, enfermedad
intestinal inflamatoria, fallo hepático, SDRA, vasculopatía por
aloinjerto y afecciones o síntomas relacionados con las mismas.
Se examinaron células HUVEC para observar la
capacidad de unir polipéptidos LP-48 en un ensayo de
unión usando polipéptidos LP-48 y anticuerpos anti
LP-48. Se expresó la proteína LP-48
y se purificó de acuerdo con los Ejemplos 7 y 10. Se cultivaron
células HUVEC como se describió en el Ejemplo 15 y se sembraron a
razón de 5 x 10^{4} células por pocillo en una placa de 96
pocillos. Se bloquearon las células con suero de caballo al 4% en
PBS, seguido por incubación con 5 \mug/ml de LP-48
durante dos horas. Posteriormente se lavaron las células tres veces
y se incubaron con anticuerpos anti LP-48 o con
anticuerpos control contra una proteína no relacionada durante 1
hora. A continuación se lavaron extensamente las células y se
detectó la unión de anticuerpos por medio de radioinmunoensayo
usando ^{125}I-proteína A.
Como se muestra en la Tabla 4, se detectaron
específicamente anticuerpos para LP-48 unidos a
HUVEC incubadas con proteína LP-48, mientras que se
observó muy poca o ninguna unión de anticuerpos para
LP-48 aplicados a HUVEC no incubadas con la
proteína LP-48. También, los anticuerpos control
mostraron poca o ninguna unión a HUVEC en presencia o en ausencia
de proteína LP-48. Estos resultados demuestran que
LP-48 puede unirse específicamente a la superficie
celular de HUVEC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
Se usaron polipéptidos LP-48
para seleccionar la presencia de su receptor en tejidos humanos. Se
expresó la proteína LP-48 y se purificó de acuerdo
con los Ejemplos 7 y 10, respectivamente. Se fijaron secciones de
tejidos humanos con paraformaldehído. Para los ensayos de unión, se
bloquearon tejidos con suero de caballo al 2% y se incubaron con 2,
10, o 20 \mug/ml de polipéptido LP-48 humano
durante 2 horas. Posteriormente se lavaron los portaobjetos 3 veces
con PBS y a continuación se incubaron con anticuerpos anti
LP-48 o anti FLAG. Se lavaron los portaobjetos 3
veces con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados
con fluorescencia. Se representó la intensidad de fluorescencia
específica tras la sustracción del valor obtenido para el control
negativo IgG. El polipéptido LP-48 se unió
específicamente al páncreas, hígado, bazo, timo, pulmón, estómago,
placenta, vejiga, tejido adiposo, tejido adrenal, tiroides, apéndice
y ganglio linfático.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
Pueden usarse polipéptidos LP-48
para seleccionar moléculas que se unen a LP-48 o
moléculas a las que se une LP-48. Las moléculas que
se unen a LP-48 pueden ser agonistas o antagonistas
de LP-48. Incluyen anticuerpos, oligonucleótidos,
proteínas (receptores) o pequeñas moléculas.
Por ejemplo, puede incubarse
LP-48 marcado con flag con lisados celulares de
células que se sospecha expresan receptores de
LP-48 en tampón conteniendo 10 mM Tris, 150 mM NaCl,
2 mM EDTA, 0,5% NP-40 e inhibidores de proteinasa
(una píldora cada 50 ml de tampón, Boehringer Mannheim), a 4ºC
durante 4 horas. Pueden recuperarse los complejos por
centrifugación, lavarse con 20 veces el volumen de tampón de unión y
eluirse en fracciones con tampón Tris-Glicina (pH
2,5). Puede separarse una alícuota de cada fracción por
electroforesis en gel de poliacrilamida. Puede teñirse el gel con
tinción de plata de acuerdo con las instrucciones del fabricante
(equipo de tinción de plata de Novex; San Diego, CA). Las muestras
combinadas que tienen bandas positivas pueden combinarse juntas y
concentrarse. Las muestras combinadas pueden separarse nuevamente en
un gel de poliacrilamida desnaturalizante y transferirse a una
membrana PVDF. Las proteínas que se unen a polipéptidos
LP-48 pueden identificarse específicamente por
microsecuenciación de acuerdo con procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica.
Alternativamente, puede(n) identificarse
receptor(es) de LP48 usando clonación de expresión (Kitamura,
Intl. J. of Hematology, 67: 351-359 (1998)).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se adquirieron ratones NOD/Bom hembra en Jackson
Lab. (Maine) de 9 semanas de edad y se mantuvieron en las
instalaciones para animales bajo condiciones y dieta convencional.
Para acelerar el desarrollo de diabetes, se trataron los ratones
con Ciclofosfamida (250 mg/kg i.p.) a los 70 días de vida. Un grupo
de ratones recibió 50 \mug/ratón/día de LP-48 por
inyección subcutánea y otro grupo de ratones recibió 50
\mug/ratón/día de SAB. Se analizó diariamente la glucosa urinaria
y se detectó hiperglucemia por medio de determinaciones de glucosa
en sangre. Se considera a los animales diabéticos cuando los niveles
de glucosa hallados están por encima de 16,7 mmol/litro
determinados por el procedimiento con hexoquinasa. Los ratones
tratados con SAB fueron diagnosticados con diabetes
10-11 días tras la inyección de Ciclofosfamida. Se
sacrificaron los ratones en los días 1, 3, 6 y 9 tras la inyección
con Ciclofosfamida para análisis de páncreas y bazo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Se tomaron ratones BALB/c (Harlan, Indianapolis)
para cada grupo experimental (6 ó 12 animales) y se les inyectó por
vía intravenosa (vena lateral de la cola) 6 mg de D (+)
Galactosamina (Sigma, 39F-0539) en 100 \mul de
PBS (GIBCOBRL) y 3 \mug de Lipopolisacárido de E. coli
026:B6 (LPS) (Difco, 3920-25-2) en
100 \mul de PBS. Una hora más tarde, se administró a los animales
una inyección intravenosa de (1) LP-48 (50 \mug)
o (2) control SAB (50 \mug), respectivamente. Se determinaron las
tasas de supervivencia de los ratones tratados 24 horas tras la
inyección de LPS. Los polipéptidos LP-48 protegieron
al 100% de los ratones de la muerte inducida por LPS y
D-galactosamina. En el mismo experimente, ratones de
tipo salvaje de edades coincidentes tuvieron una mortalidad del
71%. El tratamiento con SAB no mostró protección significativa en
este modelo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
De acuerdo con el modelo de artritis inducida
por colágeno (CIA), pueden inmunizarse ratones DBA/1 con colágeno
bovino tipo II en adyuvante y tratarse diariamente tras el
establecimiento de la enfermedad con polipéptidos
LP-48 recombinantes humanos o con solución salina.
Se controla la hinchazón de las patas de los ratones y se asigna
una puntuación clínica. También se realiza análisis histológico. El
tratamiento de CIA establecida con polipéptidos
LP-48 puede ser eficaz inhibiendo la hinchazón de
las patas así como la progresión de la enfermedad definida por la
puntuación clínica de cartílago.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Se inmunizan ratas por inyección subcutánea en
la parte posterior de las patas con 0,1 ml de epitope MBP en PBS
(1,5 mg/ml) emulsionado con igual volumen de CFA. Un grupo de
animales recibe 3 mg/kg/día de LP-48 por inyección
subcutánea, y otro grupo recibe SAB control. Posteriormente se
controla las ratas diariamente en busca de signos clínicos por un
observados cegado para el protocolo del tratamiento. La puntuación
asignada a EAE es la siguiente; 0, clínicamente normal; 1, cola
fláccida; 2, parálisis de miembros posteriores; y 3, parálisis de
miembros anteriores y posteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Se adquirieron ratones SJL/L macho de
5-6 semanas de vida, libres de patógenos en Jackson
Lab. Se obtuvo Ácido Trinitrobencensulfónico (TNBS) en
Sigma-Aldrich. Se indujo colitis por TNBS como se
describió anteriormente (Neurath, M. F., y col, 1995, J. Exp. Med.
182: 1281-1290; Kitani, A. y col 2000, J. Exp. Med.
192: 41-52). Brevemente, se administraron
1,5-2,0 mg de TNBS disuelto en etanol 50% por recto.
Siete días más tarde, los ratones perdieron peso continuamente y
mostraron otras características clínicas de colitis crónica. Para el
estudio de prevención de inducción de colitis con TNBS, se
administra LP-48 por inyección subcutánea a 2
mg/kg/día 7 días más tarde durante una semana. Un grupo control
está constituido por ratones recibiendo etanol sin TNBS. Se
controla el peso de cada ratón cada 24 horas, y se sacrifican los
ratones en múltiples puntos de tiempo para evaluar los hallazgos
histológicos y la producción de citoquinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
La apoptosis descontrolada y la inflamación
pueden llevar al síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA) o,
si están involucrados múltiples órganos, a sepsis. SDRA se encuentra
con más frecuencia con otras enfermedades serias. Treinta y ocho
por ciento (38%) de los casos de SDRA se producen en pacientes con
sepsis. Los esfuerzos en la investigación de SDRA se han enfocado
en la producción de citoquinas, específicamente
TNF-\alpha, IL-1,
IL-6, e IL-8, algunas de las cuales
están elevadas durante el SDRA. Los tratamientos experimentales que
giran en torno al antagonismo de citoquinas incluyeron
prostaglandina E1, anti-TNF, antioxidantes y
antiproteasas. Los tratamientos experimentales incluyen la
administración de corticoides, terapia ventilatoria (PEEP), terapia
de reemplazo de tensioactivos y terapia de inhalación de óxido
nítrico. Desafortunadamente, se ha observado muy poco o ningún
beneficio clínico con los tratamientos experimentales hasta la
fecha. Actualmente no hay tratamiento farmacológico aprobado por la
FDA para SDRA.
SDRA y sepsis se caracterizan por una
superactivación de las vías de citoquinas donde se produce apoptosis
masiva y/o inflamación de células en los pulmones y múltiples
órganos, respectivamente. Los conejos expuestos a hiperoxia (100%
O_{2}) durante 64 horas desarrollan síntomas clínicos que se han
reconocido como muy similares a los de SDRA en humanos. Por
ejemplo, una variable molecular para el modelo de hiperoxia es la
permeabilidad alveolar aumentada para solutos, que puede
cuantificarse. Por consiguiente, para determinar la utilidad de
polipéptidos LP-48 como profilaxis (previo a la
exposición) y/o tratamiento (previo, durante y/o tras la
exposición), puede exponerse a los conejos a hiperoxia para inducir
la sintomatología de SDRA, tratarlos con polipéptidos
LP-48, y medir la permeabilidad de solutos a través
del epitelio alveolar. Generalmente se administran polipéptidos
LP-48 en diversas concentraciones en diferentes
tiempos. Por ello, de acuerdo con una forma de realización de la
presente invención, los polipéptidos LP-48 pueden
ser útiles para mejorar la función pulmonar en pacientes con sepsis
y/o SDRA y la medida de la función pulmonar puede incluir, pero no
limitarse a, transporte de fluidos a través de los alvéolos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
26
Puede medirse la actividad funcional de
polipéptidos LP-48 y/o los efectos de anticuerpos
que reconocen LP-48 en un ensayo adecuadamente
modificado de secreción de citoquinas y proliferación de células T.
Se siembran células T esencialmente purificadas de bazo o nódulos
linfáticos (4 x 10^{5}) en 200 \mul de medio RPMI y 10% FBS y
se siembran por triplicado en placas de 96 pocillos recubiertas con
diferentes concentraciones de
anti-CD3/anti-CD28, ConA, PHA o PMS
ionomicina en presencia o en ausencia de LP-48. Tras
24, 48 ó 72 horas, se recogen los sobrenadantes para análisis de
citoquinas y se pulsan las células durante 12 horas con 1 \muCi de
[3H] timidina. Se cuantifica la incorporación de timidina usando un
contador de centelleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
Puede medirse la actividad funcional de los
polipéptidos LP-48 y/o los efectos de anticuerpos
que reconocen LP-48 en un ensayo adecuadamente
modificado de proliferación de macrófagos y secreción de citoquinas.
Se siembran macrófagos esencialmente purificados de peritoneo, bazo
o hígado (1 x 10^{5}) en 200 \mul de medio RPMI y 10% FBS y se
siembran por triplicado en placas de 96 pocillos recubiertas con
diferentes concentraciones de LPS en presencia o en ausencia de
LP-48. Tras 24, 48 ó 72 horas, se recogen los
sobrenadantes para análisis de citoquinas y se pulsan las células
durante 12 horas con 1 \muCi de [3H] timidina. Se cuantifica la
incorporación de timidina usando un contador de centelleo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
28
Puede medirse la actividad funcional de los
polipéptidos LP-48 y/o los efectos de anticuerpos
que reconocen LP-48 en un ensayo adecuadamente
modificado de cebado de células T y producción de citoquinas.
Esencialmente, se inmunizan ratones transgénicos
LP-48 y WT de seis semanas de edad (cuatro ratones
en cada grupo) con 100 \mug de KLH o HEL en adyuvante completo de
Freund (CFA) en la parte posterior de las patas. Se purifican
células T CD4+ de los nódulos linfáticos drenados y se cultivan en
presencia de células presentadoras de antígeno (APC), diferentes
concentraciones de KLH o HEL, y en presencia o en ausencia de
LP-48. Se aislan APCs de los bazos de ratones
transgénicos LP-48 o WT de seis semanas de edad y se
irradian (3.000 rads). Se prueban las respuestas de memoria de
células T. Se ensaya por medio de ELISA la secreción de citoquinas
por células T CD4+ de ratones inmunizados con KLH. Para determinar
si el mecanismo de respuesta observado con el tratamiento con LP48
se produce a nivel de APC o de respuesta intrínseca
hiperproliferativa de células T CD4+, se examinan células T CD4+
purificadas cebadas con KLH de ratones transgénicos
LP-48 y ratones de tipo salvaje para evaluar su
respuesta de memoria en presencia de APC de tipo salvaje o
transgénicas LP-48.
Se ensayan los sobrenadantes de cultivo de
respuestas de memoria de células T por ELISA para la producción de
citoquinas. Se observan los niveles de producción de citoquinas Th1
y Th2 con el fin de determinar si LP-48 está
involucrado de manera crítica en ambas diferenciaciones Th1 y Th2
durante las respuestas de memoria.
<110> ELI LILLY AND COMPANY
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para usar Un
polipéptido relacionado con IL-17 Humano Para Tratar
Enfermedad
\vskip0.400000\baselineskip
<130> X-14089
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(591)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial/desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> PÉPTIDO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(8)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Epitope Flag
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Try Lys Asp Asp Asp Asp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 187
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (5)
1. El uso de un polipéptido que comprende los
aminoácidos 19-197 del LP-48 como se
muestra en SEQ ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir una afección mediada por inflamación en un
mamífero, en el que dicho trastorno se selecciona de sepsis, choque
séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica y síndrome de
distrés respiratorio agudo (SDRA).
2. El uso de un polipéptido que comprende los
aminoácidos 19-197 del LP-48 como se
muestra en SEQ ID Nº 2 en la fabricación de un medicamento para
tratar o prevenir una afección asociada con la apoptosis de células
endoteliales en un mamífero, en el que dicha afección se selecciona
de aterosclerosis, hipertensión, fallo cardiaco congestivo,
hipertensión pulmonar primaria, síndrome de distrés respiratorio
agudo (SDRA) y vasculopatía por aloinjerto.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o
la reivindicación 2 en el que dicho polipéptido comprende una
secuencia de aminoácidos de LP-48 como se muestra en
SEQ ID Nº 2.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 en el que dicho polipéptido es una proteína
de fusión que comprende los aminoácidos 19-197 de
LP-48 como se muestra en SEQ ID Nº 2 y una secuencia
de dominio constante de inmunoglobulina.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4 en
el que el polipéptido LP-48 comprende una secuencia
de aminoácidos como se muestra en SEQ ID Nº 2.
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