ES2278043T3

ES2278043T3 - Sistema de deteccion universal de multiples variantes.

Info

Publication number: ES2278043T3
Application number: ES02762133T
Authority: ES
Inventors: Linda Andrus; Carmen Nicola Nichols
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 2001-04-17
Filing date: 2002-04-17
Publication date: 2007-08-01
Anticipated expiration: 2022-04-17
Also published as: US20130288231A1; US20120258446A1; CN1279182C; US8192939B2; KR20040018354A; DE60216445D1; US20040053284A1; WO2002083927A3; EP1390544B1; ATE346958T1; WO2002083927A2; DE60216445T2; ZA200308906B; AU2002307359B2; US7348164B2; CA2444174A1; JP2004532027A; EP1390544A4; HK1065825A1; EP1390544A2

Abstract

Un método de reacción de cadena de extensión de cebador para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra, comprendiendo el método: (a) hibridar un cebador inverso con la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de cadena de extensión de cebador; (b) extender el cebador inverso utilizando la molécula de ácido nucleico objetivo como plantilla para formar un producto de extensión de cebador inverso, en el que el cebador inverso unido al producto de extensión de cebador inverso constituye un producto de amplificación de cebador inverso; (c) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador inverso a partir de su plantilla; (d) hibridar un cebador directo con: (i) una molécula de ácido nucleico que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo, si se encuentra presente; o (ii) el producto de amplificación de cebador inverso.

Description

Sistema de detección universal de múltiples variantes.

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos nº 60/284.334, depositada el día 17 de abril de 2001.

Antecedentes de la invención

La detección de variantes genéticas relacionadas de manera muy próxima, es un reto importante en el diagnóstico analítico. Los patógenos, tales como, por ejemplo, los virus y las bacterias, mutan por lo general de manera frecuente y forman tales variantes genéticas.

Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1), que tienen distintos orígenes, son diferentes unas de otras. Los diferentes tipos de VIH-1 se dividen en grupos y sub-tipos. El grupo más importante M consiste en diez sub-tipos identificados actualmente, designados como sub-tipos A a H, J y K. Adicionalmente a los virus del grupo M, han sido identificados otros dos grupos, el N y el O, (Simon y otros, 1998, Nature Med, 4:1032-1037). Dentro de los grupos y sub-tipos, se están generando nuevas cepas de virus de forma continua debido a la naturaleza propensa al error de la maquinaria de replicación del VIH-1.

De forma similar, el virus de la hepatitis C (HCV) no existe como población de ARN homogénea. Incluso dentro de un mismo individuo infectado, pueden coexistir numerosos genomas (quasi-especies) virales heterogéneos. Además, múltiples genotipos del HCV han sido identificados en base al análisis de secuencia nucleótida de variantes virales aisladas a partir de diferentes regiones geográficas. Existen actualmente seis genotipos principales de HCV, clasificados numéricamente del 1 al 6. Los genotipos están sub-divididos además de acuerdo con el sub-tipo.

Debido a esta variación genética de los patógenos dentro de una especie, la gama de pruebas diagnósticas que proporcionan resultados fiables está altamente limitada. La mayor parte de los métodos de detección actualmente disponibles para la detección de patógenos en una muestra, están basados tanto en la detección de los antígenos de los patógenos, anticuerpos inducidos por patógenos, como en las enzimas intrínsecas de los patógenos, por ejemplo la transcriptasa inversa de VIH intrínseca. Además de presentar inconvenientes, tales métodos no son, con frecuencia, muy sensibles. Por ejemplo, el método implementado actualmente mediante bancos de sangre para protegerse de la infección por VIH-1 de los donantes de sangre, consiste en la detección de anticuerpos respecto a las proteínas del virus. Este método falla en cuanto a detectar individuos en la fase aguda temprana de la infección que no han desarrollado todavía anticuerpos de diagnóstico respecto al virus.

Los métodos de protección que están basados en la detección de secuencias de ácido nucleico, son sensibles y apropiados. Sin embargo, estas pruebas pueden no ser siempre fiables para la detección de variantes genéticas relacionadas de manera muy próxima.

S.K. Poddar en "Molecular and Cellular Probes" 14 (2000), 25-32, describe la PCR con la utilización de una sonda de baliza molecular para detectar un gen objetivo de adenovirus, y compara la sensibilidad de la PCR simétrica con la sensibilidad de la PCR asimétrica.

El documento WO 00/68436 describe una amplificación de ácido nucleico basada en sistemas de detección para el Virus de Inmunodeficiencia Humana.

El documento WO 01/07652 describe una amplificación de ácido nucleico basada en un sistema de detección para el Virus de la Hepatitis B Humana.

Barlow y otros, en "Journal of Virological Methods" 52 (1995) 65-74, analiza productos de PCR genotipo obtenidos con la utilización de un kit Amplicor VIH-1.

Jurinke y otros, en "Genetic Analysis: Biomolecular Enginnering" 14 (1998) 97-102, aplica PCR inclusiva y espectrometría de masas para una detección del Virus de la Hepatitis B basada en el ADN.

Bennett y otros, en "Journal of Virological Methods" 83 (1999) 11-20, describe un método de PCR cuantitativo para ensayar cargas pro-virus de VIH-1 en células mononucleares sanguíneas periféricas.

Uno de los métodos actualmente disponibles de detección basada en secuencia de ácido nucleico, utiliza balizas moleculares (Tyagi y Kramer, 1996, Nat. Biotechnol. 14(3): 303-308). Las balizas moleculares son sondas de oligonucleótido de una sola hebra, que tienen una estructura de vástago-lazo (véase la Figura 1). La porción de lazo de la molécula es una secuencia de sonda complementario a una molécula de ácido nucleico objetivo. El vástago se forma mediante fijación con calor de secuencias de brazo complementarias a los extremos de la secuencia de sonda. Una mitad fluorescente se fija al extremo de un brazo; y una mitad de extinción se fija al extremo del otro brazo. La hibridación de cada uno de los brazos del vástago respecto al otro, mantiene estas dos mitades en relación de proximidad cercana, provocando que la fluorescencia del fluoróforo se extinga por transferencia de energía (Figura 1a). En presencia del objetivo de ADN complementario de la baliza, la estructura de lazo hibrida al objetivo, impidiendo que los brazos del vástago se mantengan hibridados. El fluoróforo y el extinguidor se separan físicamente, y se obtiene fluorescencia (Figura 1b).

Las balizas moleculares se utilizan actualmente para PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores de la PCR están diseñados para amplificar un segmento específico de ADN, normalmente de una longitud menor de 200 pares de base. La baliza está diseñada típicamente de modo que su lazo es complementario con una región corta (20-25 p.b.) de una de las hebras de ADN amplificadas. La región complementaria de estas hebras de ADN amplificadas constituye la porción de estas hebras que ha sido añadida a los cebadores.

Las balizas moleculares son altamente específicas en la secuencia. De hecho, una de las aplicaciones de principio de esta tecnología en los últimos años, ha sido en la discriminación alélica o "genotipado molecular". La sensibilidad de las balizas moleculares a la variación de secuencia, permite la discriminación incluso entre polimorfismos nucleótidos simples en una secuencia objetivo dada (Tyagi y otros, 1998, Nat. Biotechnol., 16(1): 49-53; Kostrikis y otros, 1998, Science, 279: 5354: 1228-9; Marras y otros, 1999, Genet. Anal., 14(5-6) 151-6; Tapp y otros, 2000, Biotechniques, 28(4): 732-8).

Hasta la fecha, esta sensibilidad a la variación de secuencia ha limitado severamente la aplicación de la tecnología de baliza molecular al diagnóstico de infección viral. Las balizas moleculares no pueden detectar eficazmente las secuencias variables de objetivos de ADN o de ARN. Por ejemplo, una baliza diseñada para reconocer el producto de la PCR a partir de una cepa A de VIH, puede no reconocer un producto de la PCR de una cepa B de VIH (véase la Figura 2).

De este modo, la tecnología actual puede requerir varias balizas diferentes para permitir la detección de todos los genotipos de virus diferentes. Es decir, incluso aunque se sepa que existen algunas regiones altamente conservadas del genoma del VIH-1, es probable que se necesiten varias balizas diferentes para detectar todos los sub-tipos conocidos de este virus. Además, incluso con el uso de varias balizas diferentes, puede que no se detecten otras variantes de VIH-1 que no hayan sido identificadas.

De este modo, la tecnología actual no proporciona una prueba diagnóstica conveniente o eficaz para la detección de todas las variantes de patógenos genéticos relacionados.

Existe por tanto una necesidad urgente de un ensayo sensible, conveniente, de protección basado en ácido nucleico, capacitado para detectar variantes genéticas relacionadas de forma muy próxima. Por ejemplo, existe la necesidad de ensayos que sean capaces de detectar virus, bacterias u otros patógenos, directamente en la sangre contaminada. Tales ensayos son necesarios para detectar unidades de sangre o plasma procedentes de individuos en las etapas agudas tempranas de un infección patógena, es decir, antes de que el individuo desarrolle anticuerpos de diagnóstico respecto al virus.

En consecuencia, uno de los propósitos de la presente invención consiste en superar las anteriores limitaciones de la técnica anterior, mediante la provisión de una prueba diagnóstica conveniente y eficaz para la detección de múltiples variantes de una molécula de ácido nucleico objetivo particular.

Sumario de la invención

Estos y otros objetos, según resultará evidente para los expertos en la técnica, han sido alcanzados mediante la provisión de un método para detectar diagnósticamente las variantes de un patógeno dado, tal como VIH, hepatitis C, hepatitis B (BHV), Parvovirus B19, etc, con el uso de una única sonda de detección, es decir, un sistema de detección multi-variante universal. En una realización, la sonda única de detección es una baliza molecular.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Es una ilustración gráfica de una baliza molecular. A la temperatura adecuada de fijación con calor, la baliza: (A) bien formará, en ausencia de una secuencia objetivo complementaria, una estructura de vástago-lazo que origine que la mitad de extinción (\Box) apague la luminiscencia de la mitad informadora (O); o (B) se enlazará en presencia de un objetivo complementario, con el objetivo, permitiendo que el informador emita su señal.

Figura 2: PCR convencional que utiliza balizas moleculares. Los cebadores de la PCR están diseñados para amplificar un segmento de ARN viral. Una baliza molecular se diseña de modo que su lazo de sonda hibridará un segmento del producto de la PCR que es interno a los dos cebadores de la PCR. La baliza está capacitada para hibridar el producto de la PCR de la cepa A del virus, pero falla en cuanto a detectar el producto de la PCR de la cepa B debido a que está desemparejada con la secuencia objetivo (mostrado en la posición inferior).

Figura 3: Una ilustración gráfica de uno de los principios de la invención. (a) Los cebadores de la PCR adelante y atrás (>30 p.b.) están diseñados para hibridar directamente, "extremo a extremo", el ARN (o el ADN) objetivo y su hebra complementaria, respectivamente, de tal modo que el producto de la PCR generado no posea ninguna secuencia de intervención. El lazo específico de objetivo de la baliza molecular, ha sido diseñado para hibridar la secuencia de ADN creada por la unión de uno de los cebadores y del complemento del otro cebador. Los cebadores de la PCR hibridarán los patrones objetivo con residuos desemparejados, indicados con "X". Las líneas punteadas indican hibridación. (b) La secuencia de ADN del producto de la PCR amplificado a partir de todos los patrones, es idéntica a la secuencia combinada de uno de los cebadores y del complemento del otro cebador. La baliza molecular es capaz así de hibridar el producto de la PCR generado a partir de todos los patrones.

Figura 4: Un ejemplo del método. Una amplificación de diferentes sub-tipos de VIH que utilizan cebadores de "extremo a extremo" y una baliza molecular diseñada para reconocer una secuencia creada por la unión de uno de los cebadores y el complemento del otro cebador. Los desemparejamientos entre la secuencia de las variantes de VIH y cualquiera de los cebadores o lazo de baliza, han sido mostrados en negrita, en posición inferior.

Figura 5: Ilustración de Variaciones en la Posición del Cebador. (A). El lazo de baliza puede estar diseñado para hibridar una secuencia amplificada, creada de igual manera por los dos cebadores de la PCR según se muestra en (I). Alternativamente, la baliza puede estar diseñada para hibridar "simétricamente" una secuencia amplificada, creada principalmente tanto por el cebador directo como por el cebador inverso, según se muestra en (II) a (IV). En una variación adicional, los cebadores adelante y atrás están separados por un espacio de separación de nucleótido que corresponde con una zona altamente conservada del genoma viral.

Figura 6: Alineamiento de secuencia de ADN del lazo V3 y de las regiones que lo flanquean, de cuatro variantes de VIH que muestran las posiciones de la baliza molecular y de los cebadores para ambas PCR tanto convencional como de "extremo a extremo". (a). La proteína que codifica la hebra del VIH/RT-1 está alineada con el de las otras 3 variantes del virus, VIH/RT-10, VIH-38-1 y VIH/38-3. Los desemparejamientos con la secuencia de VIH/RT-1 y con la baliza molecular, se muestran en posición inferior en negrita. La posición relativa de los cebadores directo y inverso para la PCR convencional, se indican mediante líneas de puntos (.....) y discontinuas (- - - - -), respectivamente. La posición relativa de los cebadores directo y inverso para la PCR de extremo a extremo, se indican mediante doble línea (====) y mediante líneas continuas (-), respectivamente. La posición de la sonda de baliza se muestra por encima de la secuencia. Todos los cebadores y las secuencias de sonda de baliza se derivan de la secuencia VIH/RT-1. (b). Estructura de la baliza molecular. El lazo de sonda se muestra en posición superior, los nucleótidos de vástago complementarios se muestran en posición inferior. El FAM fluoróforo se conjuga en el extremo 5', el extinguidor DABCYL se conjuga en el extremo 3'.

Figura 7: Comparación de los métodos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real Convencional y de Extremo a Extremo. PCR Cuantitativa en Tiempo Real de cuatro variantes diferentes de VIH utilizando: (a) métodos de PCR convencionales o (b) de "Extremo a Extremo". Reacciones PCR que contenían 10^{6} copias de VIH/RT-1 (*), VIH/RT-10(\medcirc), VIH/38-1(\ding{116}), VIH/38-3(\boxempty), sin plantilla (+), o 150 ng de ADN Humano (x).

Figura 8: Análisis de Gel de Agarosa de Productos Generados mediante PCR Convencional. El gel muestra productos PCR generados a partir de VIH/RT-1, VIH/RT-10, VIH/38-1 y VIH/38-3 mediante el método de PCR convencional. Canal 1: escalera de 50 pb, Canal 2: Sin plantilla, Canal 3: VIH/RT-1, Canal 4: VIH/RT-10, Canal 5: VIH/38-1, Canal 6: VIH/38-3.

Figura 9: Un ejemplo de una curva estándar para la cuantificación de ARN de HCV utilizando RT-PRC de "extremo a extremo", con detección de producto utilizando una baliza molecular. (a). La RT-PCR de "Extremo a Extremo" para ARN de HCV se realizaron con la introducción de 0, 10, 25, 50, 100, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5} ó 10^{6} moléculas de ARN de HCV sintéticas por reacción RT-PCR. Se midió el cambio de fluorescencia (delta Rn) a la temperatura de fijación con calor para cada ciclo de PCR en el Detector de Secuencia ABI 7700. Los valores (Ct) de umbral fueron calculados a continuación utilizando el software (equipo lógico) proporcionado con el instrumento. (b). Se trazó el número de copia de ARN de cada muestra estándar respecto al valor Ct (*). Los valores Ct para las muestras (\medcirc) de prueba desconocidas, se trazan con respecto a la curva estándar, y el número de copia de ARN se extrapola desde el eje X.

Figura 10: Una ilustración paso a paso de una reacción de amplificación de la invención.

Descripción detallada de realizaciones preferidas

La presente invención proporciona un método para determinar la presencia de una molécula objetivo de ácido nucleico en una muestra biológica, con el uso de una única sonda de detección.

El método comprende la amplificación de una molécula objetivo de ácido nucleico por medio de una reacción de cadena de extensión de cebador en la que los cebadores de la reacción son un conjunto de cebadores de "extremo a extremo", incluyendo el cebador directo y el inverso, según se describe en lo que sigue. (Véanse las Figuras 3 y 4).

La molécula objetivo de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico cuya secuencia total o parcial es suficientemente conocida para la realización de cebadores de reacción de cadena de extensión de cebador. La molécula objetivo de ácido nucleico puede ser de hebra simple o doble.

La molécula objetivo de ácido nucleico existe a modo de familia de secuencias altamente homólogas. Estas diferentes secuencias comprendidas en la familia se mencionan como variantes. El origen de las variantes incluye, por ejemplo, mutaciones y poliformismos de genes.

Las moléculas de ácido nucleico que se sabe que tienen variantes incluyen, por ejemplo, virus y bacterias. Los ejemplos de virus incluyen el VIH, HCV, HBV y parvovirus B19 humano. Los ejemplos de bacterias incluyen la E. coli, S. pneumoniae, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, M. Tuberculosis y Borrelia species (enfermedad de Lyme).

Una muestra biológica a partir de la cual se puede detectar una molécula objetivo de ácido nucleico, es cualquier fluido corporal, células o detritos celulares. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen la sangre, suero, semen, mucosa u otros exudados corporales.

La presente invención puede ser utilizada en cualquier tipo de reacción de cadena de extensión de cebador que conduzca a la amplificación de la molécula objetivo de ácido nucleico, o de una sub-región de esta molécula. Las reacciones de amplificación incluyen, por ejemplo, la reacción de cadena de polimerasa (PCR), incluyendo PCR cuantitativa; amplificación de desplazamiento de hebra (SDA); amplificación ajustada de transcripción (TMA); y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA). NASBA amplifica el ARN. NASBA ha sido descrita en el documento EP-A-0 329 822.

El proceso de amplificación de la reacción de cadena de polimerasa (PCR) convencional, es bien conocido en la técnica. Las condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de cadena de polimerasa se describen en las Patentes U.S. núms. 4.683.195; 4.683.202 y 4.965.188. Los vendedores comerciales, tal como Perking Elmer (Norwalk, Conn.), comercializan reactivos de PCR y publican protocolos de PCR. Una mezcla de reacción de amplificación de PCR contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación. Típicamente, la mezcla contiene un agente para de polimerización, tal como polimerasa de ADN termoestable; trifosfatos de desoxinucleósido 5' (dNTP's); y un catión de metal divalente en un tampón adecuado.

Cualquiera de las secuencias objetivo de ADN o de ARN, puede ser amplificada con los métodos de la presente invención. En el caso de amplificación PCR de un objetivo de ARN, tal como un ácido nucleico genómico viral, la primera etapa consiste en la síntesis de una copia de ADN (cADN) de la secuencia objetivo. La transcripción inversa puede ser llevada a cabo como etapa separada o, con preferencia, en una reacción combinada de transcripción inversa-cadena de reacción de polimerasa (RT-PCR). La amplificación RT-PCR de ARN, es bien conocida en la técnica y se encuentra descrita en las Patentes U.S. núms. 5.322.770 y 5.310.652; Myers y Gelfand, 1991, Biochemistry 30(31): 7661-7666; Patente U.S. núm. 5.527.669; Young y otros, 1993, J. Clin. Microbiol. 31(4): 882-886; y Young y otros, 1995, J. Clin. Microbiol. 33(3): 654-657.

Los cebadores están también incluidos en la mezcla de reacción de la PCR. Un cebador es un oligonucleótido que, con la hibridación en una molécula patrón de ácido nucleico, es capaz de actuar como punto de iniciación de síntesis durante una reacción de amplificación. El ácido nucleico patrón es la molécula de ácido nucleico objetivo inicial; y los productos de amplificación se generan a partir de estas moléculas.

La longitud de los cebadores de la presente invención no es crítica. Típicamente, las gamas de longitud del cebador van desde alrededor de 15 hasta 55 nucleótidos; más típicamente, desde alrededor de 20 hasta 45 nucleótidos; y más típicamente, desde alrededor de 25 hasta 35 nucleótidos. Con preferencia, los cebadores están construidos de modo que son relativamente largos (>30 bases) para optimizar el número de desemparejamientos que pueden ser tolerados entre un cebador y su plantilla. Un par cebador no necesita ser de la misma longitud. Por ejemplo, el cebador directo puede ser de hasta veintinueve nucleótidos, mientras que el cebador inverso puede ser de hasta veintiocho nucleótidos.

Los cebadores pueden ser naturales o sintéticos. Para la PCR, los cebadores son, con preferencia, oligodesoxirribonucleótidos de hebra simple.

La hibridación se refiere a la formación de una estructura dúplex mediante dos ácidos nucleicos de hebra simple, debido al apareamiento de base complementaria. La hibridación puede ocurrir entre hebras de ácido nucleico totalmente complementarias o entre hebras de ácido nucleico "sustancialmente complementarias" que contengan regiones menores de desemparejamiento, es decir, variantes. El grado de desemparejamiento tolerado puede ser controlado mediante un ajuste adecuado de las condiciones de hibridación. Las condiciones bajo las cuales solamente se hibridarán hebras de ácido nucleico totalmente complementarias, se conocen como "condiciones de hibridación estricta" o "condiciones de hibridación de secuencia específica". Los dúplex estables de la secuencias sustancialmente complementarias pueden ser obtenidos bajo condiciones de hibridación menos estrictas.

Las condiciones de hibridación, es decir, la exactitud, de la presente invención, se establecen de modo que los cebadores pueden tolerar desemparejamientos entre los cebadores y la plantilla, permitiendo con ello la hibridación en todas las variantes genéticas. Por ejemplo, las condiciones podrían ser establecidas de modo que se puede producir la hibridación entre un cebador y una plantilla con hasta un 20% de pares de base entre el cebador y la plantilla desemparejados.

Los expertos en la técnica de la tecnología de ácidos nucleicos, pueden determinar condiciones adecuadas de hibridación que consideren empíricamente un número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud y la concentración de pares de base del oligonucleótido, la resistencia iónica, la incidencia de pares de base desemparejados, y la temperatura elegida para la fijación con calor del oligonucleótido, siguiendo las enseñanzas de la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, y otros, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Wetmur, 1991, Critical Reviews in Biochem. and Mol. Biol. 26(3/4): 227-259; Ausubel y otros. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., Nueva York) en Unidad 2.10; y la Patente U.S. núm. 5.789.550.

A continuación se realiza una descripción detallada de un ciclo de una reacción de cadena de extensión de cebador según la presente invención. La reacción específica descrita en la PCR. Sin embargo, se pueden utilizar otros tipos de reacciones de cadena de extensión de cebador en los métodos de la presente invención.

La Figura 10 proporciona una ilustración paso a paso de una reacción de amplificación de la invención. La molécula objetivo de ácido nucleico ha sido representada mediante T. Las X en el interior de la secuencia objetivo, representan sitios de variaciones potenciales.

La molécula objetivo de ácido nucleico puede existir como molécula de hebra simple, o como parte de una molécula de doble hebra. En el ejemplo ilustrado en la Figura 10, la molécula objetivo de ácido nucleico es de doble hebra. TC representa una molécula de ácido nucleico que es complementaria de T.

Al igual que en la PCR convencional, en cada ciclo de la reacción de amplificación, cualquiera de las moléculas de ácido nucleico de doble hebra de una muestra se transforman en hebra simple por desnaturalización. La Hibridación tiene lugar entonces entre los cebadores y las moléculas objetivo de ácido nucleico. La Figura 10(a) ilustra la hibridación entre un cebador inverso (RP) y una secuencia objetivo (T) de ácido nucleico.

Según se muestra en la Figura 10(b), los cebadores inversos son extendidos a continuación, utilizando las moléculas objetivo de ácido nucleico como patrones, para formar productos de amplificación de cebador inverso (RPA). Los productos de amplificación de cebador inverso (RPA) comprenden el cebador inverso (RP) unido al producto de extensión de cebador inverso (RPE). A los efectos de esta descripción, el producto de extensión de cebador inverso es el segmento de ácido nucleico que se añade al cebador inverso.

Tal y como puede apreciarse a partir de la Figura 10(b), algunas de las variaciones (X) contenidas en la secuencia objetivo no aparecen en la RPA. Específicamente, la porción de la RPA que se forma con el RP, no contiene variaciones.

Según se muestra en la Figura 10(c), los productos de amplificación de cebador inverso formados en la etapa (b) son desnaturalizados de sus patrones.

Los cebadores directos (FP) son hibridados con uno cualquiera de: (i) moléculas de ácido nucleico que son complementarias con las moléculas objetivo de ácido nucleico (TC), si están presentes; o bien (ii) los productos de amplificación de cebador inverso (RPA). La Figura 10(d) ilustra la realización anterior. Las moléculas de ácido nucleico complementarias con las moléculas objetivo de ácido nucleico, estarán presentes si las moléculas objetivo de ácido nucleico fueran parte de una molécula de doble hebra.

Los cebadores directos son extendidos a continuación, utilizando como patrones las moléculas complementarias a ácido nucleico (TC) o utilizando los productos de amplificación de cebador inverso (RPA). La Figura 10(e) ilustra la realización anterior.

Según se muestra en la Figura 10(e), los cebadores directos se extienden para formar productos de amplificación de cebador directo (FPA). El producto de amplificación de cebador directo (FPA) comprende el cebador directo (FP) unido al producto de extensión de cebador directo (FPE). A los efectos de esta descripción, el producto de extensión de cebador directo es el segmento de ácido nucleico que se añade al cebador directo.

Según se muestra en la Figura 10(e), cuando se compara con la secuencia objetivo, algunas de las variaciones (X) contenidas en la secuencia objetivo no aparecen en la FPA.

Específicamente, la porción de la FPA que se forma a partir del FP, no contiene variaciones.

Según se muestra en la Figura 10(f), los productos de amplificación de cebador directo formados en la Figura 10(e),
son desnaturalizados de sus patrones.

Según se muestra en la Figura 10(g), los cebadores inversos se hibridan con la porción FPE de la FPA.

Según se muestra en la Figura 10(h), los cebadores inversos son extendidos, utilizando la porción FP de la FPA como patrones, para formar productos adicionales de amplificación de cebador inverso (ARPA), en los que un cebador inverso unido a un producto de extensión de cebador inverso adicional (ARPE) constituye un ARPA.

Según se muestra en la Figura 10(i), los productos ARPA son desnaturalizados de sus patrones.

Según se muestra en la Figura 10(j), los cebadores directo se hibridan con la porción RPE de la RPA.

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Según se muestra en la Figura 10(k), los cebadores directo son extendidos, utilizando la porción RP de las RPAs como patrones, para formar productos de amplificación de cebador directo adicionales, en los que un cebador directo unido a un producto de extensión de cebador directo adicional constituye un AFPA.

Según se muestra en la Figura 10(I), los productos AFPA son desnaturalizados de sus patrones.

Las etapas (g) a (I) se repiten, utilizando los productos de amplificación de cebador inverso adicional y los productos de amplificación de cebador directo adicional como patrones para los cebadores inverso y directo, un número de veces suficiente para producir una cantidad detectable de producto de amplificación de cebador inverso adicional y/o de producto de amplificación de cebador directo adicional. Con preferencia, las etapas se repiten utilizando un instrumento automatizado de repetición de ciclo. Un número suficiente de veces significa al menos alrededor de diez veces, con preferencia al menos alrededor de veinte veces; más preferiblemente al menos alrededor de treinta veces; y más preferiblemente al menos alrededor de cuarenta veces.

Se han descubierto ventajas cuando los cebadores se hibridan con los productos de amplificación de una determinada manera, que los inventores denominan como de "extremo a extremo".

Según puede apreciarse en la Figura 10(g), la secuencia de los productos de amplificación de cebador directo y de los productos de amplificación de cebador directo adicional, son tales que el nucleótido, en el extremo 3' del cebador inverso, se hibrida con el nucleótido en el extremo 5' del producto de extensión de cebador directo o del producto de extensión de cebador directo adicional.

De manera análoga, según puede apreciarse en la Figura 10(j), la secuencia de los productos de amplificación de cebador inverso y los productos de amplificación de cebador inverso adicional son tales que el nucleótido en el extremo 3' del cebador directo, hibrida con el nucleótido en el extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional.

La Figura 10 ilustra la reacción de cadena de extensión de cebador de solamente una variante. Según se ha indicado anteriormente, todas las variantes de una familia de patógenos pueden ser amplificados mediante el método de la invención.

Los productos de amplificación adicionales son idénticos, con independencia de la variante a partir de la cual fueron generados. De este modo, en el ejemplo mostrado en la Figura 10, los productos de amplificación de cebador inverso adicional tienen la secuencia del cebador inverso unido directamente al producto de extensión de cebador inverso adicional. El producto de extensión de cebador inverso adicional es complementario al cebador directo (complemento de cebador directo). Véase la Figura 10(h).

De manera análoga, los productos de amplificación de cebador directo adicional tienen la secuencia del cebador directo unida directamente al producto de extensión de cebador directo adicional. El producto de extensión de cebador directo adicional es complementario al cebador inverso (complemento de cebador inverso). Véase la Figura 10(k).

Por lo tanto, todos los productos de amplificación de cebador adicional tienen secuencias que son combinaciones del cebador inverso y del complemento de cebador directo, o bien del complemento de cebador inverso y del cebador directo. Puesto que los cebadores directo y inverso tienen todos las mismas secuencias, todos los productos de amplificación de cebador adicional tienen las mismas secuencias. En otras palabras, todas las variaciones potenciales han sido eliminadas.

En otra realización, la secuencia de los productos de amplificación de cebador directo y los productos de amplificación de cebador directo adicional son tales que el nucleótido en el extremo 3' del cebador inverso, hibrida con un nucleótido separado del nucleótido en el extremo 5' del producto de extensión de cebador directo o del producto de extensión de cebador directo adicional por una distancia de separación de nucleótidos. Análogamente, la secuencia de los productos de amplificación de cebador inverso y los productos de amplificación de cebador inverso adicional, son tales que el nucleótido en el extremo 3' del cebador directo hibrida con un nucleótido separado del nucleótido en el extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional mediante un espacio de separación de nucleótidos.

En ambos casos, el espacio de separación comprende una secuencia conocida que ha de ser altamente conservada. Se conocen regiones altamente conservadas de los genomas de virus y bacterias. Por ejemplo, en la secuencia publicada de HCV, se sabe que alargamientos cortos de ácidos nucleicos en la región 5' de no codificación del genoma viral son altamente conservados entre genotipos de HCV (Okamoto y otros, J. Gen. Virol., 1991, 2697-2704; Smith y otros, J. Gen. Virol., 1995, 76: 1749-1761; Simmonds y otros, J. Gen. Virol., 1993, 74: 2391-2399).

El espacio de separación contiene con preferencia no más de cinco nucleótidos. Si el espacio de separación contiene de dos a cinco nucleótidos, uno o dos de los nucleótidos pueden estar desemparejados, e incluso hibridar con la secuencia de sonda. Si el espacio de separación contiene un nucleótido, este nucleótido puede ser un desemparejamiento. Con preferencia, no existe ningún desemparejamiento.

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Una vez que se ha completado la reacción de amplificación, la presencia de los productos de amplificación de cebador inverso adicional o de los productos de amplificación de cebador directo adicional, se detecta mediante métodos conocidos en la técnica.

Con preferencia, el método de detección está basado en la detección de las secuencias de ácido maleico de los productos de amplificación de cebador inverso adicional o de los productos de amplificación de cebador directo adicional. La sonda de detección utilizada en dicho método comprende una secuencia que es susceptible de hibridación con los productos de amplificación de cebador inverso adicional o con los productos de amplificación de cebador directo adicional. Puesto que estos productos de amplificación son idénticos, solamente se necesita una sonda de detección para detectar de manera fiable todos los productos de amplificación.

Adicionalmente, la identidad de los productos de amplificación permite que se utilicen condiciones de hibridación estrictas durante la hibridación requerida para la detección. El uso de condiciones estrictas conduce a resultados más fiables en virtud de la reducción de la posibilidad de falsos positivos derivados de secuencias no objetivas casualmente similares.

La sonda de detección puede ser ADN, ARN o una combinación de ambos. Pueden estar incluidos nucleótidos modificados, tal como por ejemplo, ácido péptido nucleico (PNA), nucleótidos a base de nitropirol, o 2'-O-metilribonucleótidos. Los nucleósidos del ácido nucleico o las moléculas de ácido nucleico modificado, pueden estar enlazadas de alguna manera habitual, es decir, mediante enlaces fosfato. Alternativamente, los nucleósidos pueden estar enlazados a través de enlaces modificados, por ejemplo fosforotionatos.

En una realización, la secuencia de sonda hibrida sobre la unión en los productos de amplificación. Es decir, la secuencia de sonda hibrida una porción de ambas secuencia FP y secuencia AFPE de la AFPA; o la secuencia de sonda hibrida una porción tanto de la secuencia RP como de la secuencia ARPE de la ARPA.

En esta realización, la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento de uno de los cebadores y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al otro cebador. De manera más específica, la secuencia de sonda comprende una cualquiera de: (i) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador inverso; (ii) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso y de la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador directo. La secuencia de sonda comprende secuencias completas o parciales del cebador, y del complemento del otro cebador.

La secuencia de sonda puede ser formada con porciones iguales de la secuencia de nucleótido de uno de los cebadores y de la secuencia de nucleótido del complemento de otro cebador. En tal caso, la secuencia de sonda "hibridará simétricamente" con los productos de amplificación. (Véase la Figura 5A(I)).

Con preferencia, para una sensibilidad mejorada, la secuencia de sonda puede estar diseñada con vistas a "hibridar simétricamente" los productos de amplificación. En particular, la secuencia de sonda puede estar formada por porciones desiguales de la secuencia de nucleótido de uno de los cebadores y la secuencia de nucleótido del complemento de otro cebador. (Véase la Figura 5A (II-IV)). Por ejemplo, desde alrededor de un 60% hasta alrededor de un 99% de la secuencia de sonda, comprende la secuencia de nucleótido de uno de los cebadores. El resto de la secuencia de sonda (por ejemplo, desde alrededor de un 1% hasta alrededor de un 40%) comprende la secuencia de nucleótido del complemento del otro cebador. Más preferentemente, el porcentaje de la secuencia de sonda que corresponde a la secuencia de uno de los cebadores va desde alrededor del 80% hasta alrededor del 97%.

Cuando la secuencia de los productos de amplificación adicional contiene un segmento de uno de los cebadores unido directamente a un segmento del complemento del otro cebador, la secuencia de sonda puede estar diseñada para hibridar exactamente todos, o una parte de, los productos de amplificación adicionales.

Cuando los productos de amplificación adicionales contienen un espacio de separación de intervención, el espacio de separación constituye con preferencia una secuencia conocida de modo que la secuencia de onda puede estar diseñada para ser totalmente complementaria al espacio de separación. Sin embargo, una secuencia de sonda puede hibridar los productos de amplificación adicionales que contienen un cierto número de residuos desemparejados en el espacio de separación, según se ha descrito en lo que antecede.

En vez de una hibridación sobre la unión, la secuencia de sonda puede hibridarse también exclusivamente con el segmento del producto de amplificación adicional que es complementario a un cebador. En consecuencia, en esta realización, la secuencia de sonda comprende cualquiera de: la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, y no la secuencia de sonda de un segmento que sea complementario al cebador inverso, o bien la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, y no la secuencia de nucleótido de un segmento que sea complementario al cebador directo.

En una realización de las reacciones de cadena de extensión de cebador de la invención, se utilizan las mismas concentraciones del cebador directo y del cebador inverso. En esta realización, se dice que las concentraciones son simétricas.

En una realización preferida, se utilizan "concentraciones asimétricas" de los cebadores directo y inverso. En particular, para una sensibilidad mejorada, el cebador cuya secuencia de nucleótido forma parte de la secuencia de sonda, se proporciona en una concentración inferior en la muestra en comparación con el otro cebador. Las "concentraciones asimétricas" de cebadores son particularmente preferidas si las secuencias de sonda "se hibridan simétricamente" con los productos de amplificación adicional que sean complementarios a un cebador.

Por ejemplo, si la secuencia de sonda comprende un segmento de la secuencia de nucleótido del cebador directo, entonces la relación molar del cebador directo respecto al cebador inverso (FP:RP) es de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:20. Análogamente, si la secuencia de sonda comprende un segmento de la secuencia de nucleótido del cebador inverso, entonces la relación molar del cebador inverso respecto al cebador directo (RP:FP) es de aproximadamente 1:5 hasta aproximadamente 1:20, más preferentemente desde aproximadamente 1:6 hasta aproximadamente 1:15, y más preferentemente es de aproximadamente 1:10.

Después vez que ha tenido lugar la reacción de amplificación en la muestra biológica un número suficiente de veces, la sonda de detección se pone en contacto con la muestra. La secuencia de sonda de la sonda de detección se hibrida con cualesquiera productos de amplificación adicionales que puedan estar presentes en la muestra. Si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo (exclusivamente o comprendiendo además la secuencia de nucleótido de un segmento del complemento de cebador inverso), la secuencia de sonda se hibridará con los productos de amplificación de cebador inverso adicional. Análogamente, si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso (exclusivamente o comprendiendo además la secuencia de nucleótido de un segmento del complemento de cebador directo), la secuencia de sonda se hibridará con los productos de amplificación de cebador directo adicionales.

En una realización preferida, la sonda de detección es una sonda de generación de señal auto-alterable. Esta sonda comprende una primera secuencia de ácido nucleico; una segunda secuencia de ácido nucleico complementario a la primera secuencia de ácido nucleico; y una secuencia de sonda que conecta la primera secuencia de ácido nucleico con la segunda secuencia de ácido nucleico. La primera secuencia de ácido nucleico está unida a una mitad informadora que es capaz de generar una señal detectable. La segunda secuencia de ácido nucleico está unida a una mitad interactiva que capaz de alterar la señal generada por la mitad informadora cuando la mitad informadora y la mitad interactiva están en relación de proximidad suficientemente cercana una con la otra. Por ejemplo, cuando la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se hibridan una con la otra, lo que se conoce como "conformación cerrada", la mitad informadora se lleva a su proximidad con la mitad interactiva. Por lo tanto, la señal se altera. Alterar la señal incluye reducir, es decir extinguir; incrementar; o cambiar de algún otro modo la señal, tal como la intensidad o la longitud de onda de la señal. La extinción de la señal incluye reducir o eliminar la señal.

Las mitades informadora e interactiva pueden estar unidas en cualquier punto de la sonda de detección que permita la alteración, por parte de la mitad interactiva, de una señal generada por la mitad informadora para la detección de los productos de amplificación adicionales. En la realización preferida, la mitad informadora y la mitad interactiva están unidas a las terminaciones distales de la sonda de generación de señal auto-alterable.

En ausencia de productos de amplificación adicionales, la sonda de detección está en conformación cerrada. Las mitades informadora e interactiva están en relación de proximidad cada una con la otra. Por lo tanto, la señal está alterada.

Tras la hibridación de la secuencia de sonda con el producto de amplificación de cebador inverso adicional o con el producto de amplificación de cebador directo adicional, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico de la sonda de detección resultan desnaturalizadas. Esto se conoce como "conformación abierta".

Tras la desnaturalización, la mitad interactiva ya no está más en relación de proximidad suficiente para que la mitad informadora altere la señal. Se detecta la diferencia entre la señal alterada y la señal inalterada. Cuando la mitad interactiva extingue la señal, por ejemplo, la señal inalterada se incrementa; o si la extinción ha sido completa, se genera una señal.

La resistencia de la hibridación formada entre el primer y el segundo ácidos nucleicos (es decir, el vástago de la sonda), puede ser ajustada mediante experimentación rutinaria para conseguir un funcionamiento apropiado. Por ejemplo, la resistencia es una función de la longitud de los nucleótidos. Las longitudes de la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico están comprendidas, con preferencia, en la gama de alrededor de 3 a 15, más preferentemente de alrededor de 4 a 7 nucleótidos. Adicionalmente a la longitud, la resistencia de la hibridación puede ser reducida disminuyendo el contenido de G-C e insertando desemparejamientos desestabilizadores en los nucleótidos.

La longitud de la secuencia de sonda no es crítica. Sin embargo, la longitud no puede ser tan corta como para que no se alcance la vinculación efectiva con los productos de amplificación adicionales. Adicionalmente, la longitud no puede ser tan grande como para que separación de la mitad informadora y la mitad interactiva no puede ser conseguida a pesar de que la secuencia de sonda esté hibridada con los productos. Con preferencia, la secuencia de sonda comprende desde alrededor de diez hasta alrededor de treinta nucleótidos; más preferiblemente desde alrededor de dieciocho hasta alrededor de veinticuatro nucleótidos; y más preferiblemente, desde alrededor de diecinueve hasta alrededor de veintidós nucleótidos. Las sondas pueden estar libres en solución, o pueden estar ligadas a una superficie sólida.

Se puede utilizar en los procedimientos cualquier concentración de sonda de detección que produzca una señal detectable. Por ejemplo, la concentración de la sonda de detección puede estar provista en la muestra según una concentración aproximadamente igual a la de uno, o ambos, de los cebadores.

Con preferencia, la concentración de la sonda de detección es mayor que la concentración de los cebadores. De esta manera, la sonda de detección se ve favorecida en su competición entre el cebador, cuya secuencia de ácido nucleico forma parte de la secuencia de sonda, y la sonda de detección para los productos de amplificación adicionales. Este incremento de la concentración de la sonda de detección resulta particularmente preferido cuando la secuencia de sonda "se hibrida simétricamente" con los productos de amplificación, o se hibrida exclusivamente con la porción de los productos de amplificación adicionales que son complementarios con un cebador, según se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la sonda de detección puede ser proporcionada en una concentración que sea de alrededor de 1,3 a alrededor de 5 veces, más preferiblemente de alrededor de 1,5 a alrededor de 3 veces, y más preferiblemente de alrededor del doble de grande que la concentración del cebador cuya secuencia de ácido nucleico no forma parte de la secuencia de sonda.

En una realización preferida, la secuencia de sonda está formada, por ejemplo, por al menos el 65% de la secuencia del cebador directo; el cebador directo se proporciona en una concentración que es alrededor de diez veces menor que la concentración del cebador inverso; y la sonda de detección se proporciona en una concentración que es alrededor del doble de grande que el cebador inverso.

Una señal inalterada generada por la mitad informadora, constituye una indicación de que la molécula objetivo de ácido nucleico se encuentra presente en la muestra. El nivel de señal inalterada detectable generada por la sonda, es proporcional a la cantidad de moléculas objetivo de ácido nucleico presentes en la muestra.

La señal detectable de las sondas de detección puede ser cualquier clase de señal incluyendo, por ejemplo, una señal luminiscente, una señal de tinte de color, o una señal radiactiva. En la realización preferida, la señal detectable es una señal luminiscente. La señal luminiscente puede ser un señal fluorescente o una señal quimiluminiscente.

En una realización, las mitades informadora e interactiva de esta invención constituyen un par "FREI". (Selvin, P.R., "Fluorescence Resonance Energy Transfer", Métodos de Enzimología 246: 300-335 (1995)). Los pares FRET se basan en la transferencia de energía para la generación de la señal. La mitad informadora absorbe energía a una primera longitud de onda y emite una segunda longitud de onda, más larga. La mitad interactiva absorbe algo, o la mayor parte, de la energía emitida hasta el punto de que el espectro de la mitad interactiva se solapa con el espectro de emisión. Si la mitad interactiva es un extinguidor, el extinguidor libera la energía en forma de calor. Si la mitad interactiva es un fluoróforo, la mitad interactiva re-emite una tercera longitud de onda, aún más larga. El mecanismo de interacción de par FRET requiere que el espectro de absorción de la mitad interactiva se solape con el espectro de emisión de la mitad informadora. La eficacia de la interacción FRET es linealmente proporcional a ese solapamiento.

En otra realización, la mitad informadora y la mitad interactiva son un par no-FRET. En particular, la mitad interactiva no necesita tener un espectro de absorción que se solape con el espectro de emisión de la mitad informadora. Es decir, la longitud de onda de absorción de la mitad interactiva puede ser más corta que la máxima excitación y la longitud de onda de emisión de la informadora. Los pares no-FRET se encuentran descritos en la Patente U.S. núm. 6.150.097. La señal detectable de un par no-FRET puede ser un cambio en los espectros de absorción, como alternativa a un cambio en la fluorescencia.

Con preferencia, las mitades informadoras de las sondas de detección utilizadas en los métodos de esta invención, son fluoróforas. El fluoróforo puede ser un tinte de xantano, un tinte de cianina, un derivado dansil, EDANS, cumarina, tal como 3-fenil-7-isocianatocumarina, lucífero (fósforo) amarillo, BODIPY, Cy3, Cy5, Cy7, Texas red®, eritrosina, naftilamina, Oregon green®, tintes de flúor ALEXA, acridinas, tales como la 9-isotiocianatoacridina y naranja acridina, N-(p-(2-benzoxazolil)fenil) maleimida, benzoxadiazoles, estilbenos y pirenos.

El tinte de xanteno puede ser fluoresceína o rodamina. Con preferencia, la fluoresceína es 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 6-carboxifluoresceína (6-FAM); 2',4',1,4-tetraclorofluoresceína (TET); 2',4',5',7',1, 4-hexaclorofluoresceína (HEX); eosina; verde de calcio; isotiacianato de fluoresceína (FITC); o NED. Con preferencia, el tinte de rodamina es el tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX); 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxirodamina (JOE), o tetrametilrodamina (TMR). Muchas formas adecuadas de estos compuestos se encuentran comercialmente disponibles con varios sustituyentes sobre sus anillos xanteno, los cuales pueden ser utilizados como el sitio para enlazar o como funcionalidad de enlace para la unión a un oligonucleótido.

El fluoróforo puede ser un compuesto de naftilamina. Los compuestos de naftilamina tienen un grupo amino en la posición alfa o beta. Incluidos entre tales compuestos de naftilamina se encuentran el 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftaleno sulfonato, y 2-p-toluidinil-6-naftaleno sulfonato.

El fluoróforo puede ser también un fluoróforo de combinación. Un ejemplo de un fluoróforo de combinación lo constituyen los dímeros de fluoresceína-rodamina, descritos por ejemplo por Lee y otros (1997), Nucleic Acids Research 25: 2816. Los fluoróforos pueden ser elegidos de modo que absorban y emitan en el espectro visible o fuera del espectro visible, tal como en las gamas del ultravioleta o del infrarrojos.

Con preferencia, las mitades interactivas de las sondas de detección utilizadas en los métodos de esta invención son extinguidores. El extinguidor puede ser DABCYL, antroquinona, nitrotiazol, nitroimidazol o verde malaquita. Variantes de DABCYL, tales como DABSYL, DABMI o rojo metilo, son también adecuadas. También, los compuestos asimétricos de tinte de cianina, descritos en la patente U.S. núm. 6.080.868, pueden ser utilizados como mitad extinguidora.

Adicionalmente, los fluoróforos pueden ser utilizados también como extinguidores. Por ejemplo, los fluoróforos que no fluorecen en la gama de detección cuando la sonda está en conformación abierta, pueden extinguir la fluorescencia cuando están en relación de proximidad con otros fluoróforos.

Un ejemplo de una sonda de generación de señal auto-alterable, consiste en una sonda de baliza molecular. El lazo de una sonda de baliza molecular corresponde con la secuencia de sonda, según se ha descrito anteriormente. Las secuencias de nucleótido, mencionadas como "brazos", corresponden a la primera y la segunda secuencias de nucleótido, según se ha descrito anteriormente. Las sondas de baliza molecular han sido descritas en la Patente U.S. núm. 5.925.517; en la solicitud PCT WO 95/13399; en la solicitud PCT WO 97/39008; y por Tyagi y Kramer (1996), Nature Biotechnology 14: 303.

Adicionalmente, las sondas de baliza molecular pueden ser modificadas de cualquier manera que permita la detección de los productos de amplificación. Las sondas modificadas incluyen, por ejemplo, las sondas de baliza molecular de "longitud de onda cambiante" descritas en la Patente U.S. núm. 6.037.130. En particular, estas sondas modificadas tienen estructura de sonda de baliza molecular básica, en particular, un lazo, un doble vástago, un extinguidor por un extremo, y una mitad informadora, típicamente un fluoróforo, opuesta al extinguidor del otro extremo. La informadora se menciona como "informadora recolectora". La modificación de la sonda consiste en que la sonda incluye una extensión de varios nucleótidos más allá de la "informadora recolectora". La extensión termina en un nucleótido que está enlazado con una "informadora emisora", típicamente otro fluoróforo. En presencia de la molécula objetivo de ácido nucleico, el extinguidor se separa de las informadoras. En esta conformación abierta, la "informadora recolectora" absorbe energía procedente de la fuente de excitación, pero transfiere una porción significativa de la energía, en algunas construcciones la mayor parte de la energía, hasta la "informadora emisora", la cual recibe la energía transferida y la emite a su longitud de onda característica, más larga.

En otra realización, la sonda de detección incluye un par de oligodesoxinucleótidos complementarios con las regiones contiguas de los productos de amplificación adicionales. (Cardullo y otros (1988), Proc. Nat'l. Acad. Sci. 85: 8790-8794, y Heller y otros, EP 00 70685). Un oligodesoxinucleótido contiene la mitad informadora en su extremo 5', y el otro oligodesoxinucleótido contiene la mitad interactiva en su extremo 3'. Cuando la sonda está hibridada con la secuencia objetivo, las dos mitades son llevadas a una relación muy cercada cada una con la otra. Cuando la muestra se estimula con luz de una frecuencia apropiada, se produce la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia desde una mitad a la otra, produciendo un cambio medible de la respuesta espectral de las mitades, señalando de ese modo la presencia de objetivos.

Todavía en otra realización, la sonda de detección incluye un par de oligodesoxinucleótidos. En el par es complementario uno con el otro. También, uno del par tiene la secuencia de la molécula de ácido nucleico objetivo, y el otro del par tiene la secuencia que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo. (Morrison y Stols, "Sensitive Fluorescence-Based Thermodynamic and Kinetic Measurements of DNA Hybridization in Solution", Biochemistry 32: 309-3104 (1993), y documento EP 0232967 A2 de Morrison, en el que se reivindica prioridad de la solicitud de Estados Unidos nº de serie 817.841, depositada el 10 de Enero de 1986). Cada oligodesoxinucleótido de la sonda incluye una mitad informadora conjugada en su extremo 3', y una mitad interactiva conjunto por su extremo 5'. Cuando los dos oligonucleótidos de la sonda han sido fijados con calor cada uno con el otro, la mitad informadora de cada uno se mantiene en relación de proximidad cercana con respecto a la mitad interactiva del otro. Con la sonda en esta conformación, si la informadora se estimula después con luz de una longitud de onda apropiada, la señal es alterada, preferentemente extinguida, por parte de la mitad interactiva. Sin embargo, cuando cualquier molécula de la sonda se enlaza con un objetivo, el efecto alterador del oligodesoxinucleótido complementario de la sonda está ausente. Con esta conformación, se genera una señal. Los oligodesoxinucleótidos de la sonda son demasiado largos para su auto-extinguido mediante FRET cuando existe conformación de enlace con el objetivo.

La señal generada por la sonda de detección puede ser detectada y medida con cualquier medio conocido en el estado de la técnica, que proporcione una detección y una medición fiables.

Por ejemplo, el ABI 7700 (fabricado por Applied Biosystems, Inc., de Foster City, CA), está adaptado para medir la emisión de señal, típicamente emisiones de fluorescencia. El ABI 7700 utiliza fibras ópticas conectadas a cada cavidad de una disposición de tubo de reacción de amplificación de 96 cavidades. El instrumento incluye un láser para excitar las mitades informadoras y es susceptible de medir la intensidad de la señal, típicamente la intensidad de los espectros de fluorescencia, a partir de cada tubo con monitorización continua durante la amplificación.

Los productos de amplificación adicionales pueden ser cuantificados mediante mediciones a punto final y en tiempo real. En un modo a punto final, la medición de señal se realiza una vez que se ha completado la reacción de amplificación, por ejemplo, después de que se han completado todos los ciclos de una reacción de amplificación. En un modo en tiempo real, la medición de señal se realiza múltiples veces durante la reacción de amplificación, por ejemplo después de cada termociclo de una reacción de amplificación. Se prefiere el modo de tiempo real cuando se requiere una medición cuantitativa de la cantidad inicial de molécula de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, el número de copias de ácidos nucleicos virales o bacterianos presentes en una muestra.

La cantidad absoluta de una molécula de ácido nucleico objetivo presente en una muestra de prueba con anterioridad a la amplificación, puede ser determinada utilizando una curva estándar. Por ejemplo, una curva estándar puede ser generada a partir de los resultados obtenidos a partir de una serie de reacciones paralelas de cadena de extensión de cebador. Estas reacciones paralelas pueden ser realizadas sobre una serie de muestras estándar que contengan una cantidad conocida de molécula de ácido nucleico que sea similar a la molécula de ácido nucleico objetivo. Se utiliza una serie de alrededor de cinco a alrededor de veinte muestras estándar de diferentes cantidades conocidas. Las reacciones de extensión paralelas utilizan los mismos reactivos condiciones de reacción que los usados en la reacción de extensión de la molécula de ácido nucleico objetivo.

En cada reacción paralela, el incremento de intensidad de la señal en comparación con la intensidad de base de la señal (delta de Rn), se mide a la temperatura de fijación con calor para cada ciclo de amplificación. El valor de base es la magnitud de la señal detectada con anterioridad a la formación de los productos de amplificación adicionales. Se calculan los valores de umbral (Ct) para cada reacción. Ct es el núcleo de ciclo de amplificación en el que la intensidad de la señal generada es distinguible de la intensidad de la señal de base. La cantidad de partida del ácido nucleico de cada muestra estándar puede ser representada con respecto a su valor Ct correspondiente. Esta representación es la curva estándar.

En general, el valor de umbral debe ser suficientemente alto como para ser estadísticamente diferente del valor de base, pero inferior a la señal obtenida a partir del fenómeno de saturación asociado a las reacciones de amplificación. Típicamente, el valor de umbral de establece en alrededor de diez desviaciones estándar por encima de la intensidad media de la señal de base. (Véase, por ejemplo, Heid, y otros Genome Research 6: 986-994 (1996)).

Se calcula también el valor Ct para la muestra que incluye la molécula de ácido nucleico objetivo. Este valor Ct puede ser representado frente a la curva estándar. Utilizando la curva estándar, se puede cuantificar la cantidad de molécula de ácido nucleico en la muestra de la prueba, por extrapolación. La Figura 9 ilustra este método de cuantificación de objetivo PCR (en el caso de ARN de HCV), utilizando los cebadores PCR de "extremo a extremo" y las condiciones de reacción descritas en el Ejemplo que sigue.

El software de ordenador proporcionado con los instrumentos de detección, por ejemplo el ABI 7700, está capacitado para registrar la intensidad de la señal durante el transcurso de una amplificación. Estos valores registrados pueden ser utilizados para calcular el incremento de la intensidad de la señal sobre una base continua. Aunque el instrumento ABI 7700 se utiliza típicamente para monitorizar fluorescencia, no se necesita determinar los valores Ct a partir de las mediciones de fluorescencia. Los valores Ct podrían ser determinados a partir de mediciones de una diversidad de tipos de señales.

La presente invención se refiere también a kits, unidades multi-contenedoras que comprenden componentes útiles para la puesta en práctica del presente método. El kit comprende un conjunto de cebadores "extremo a extremo" para la amplificación de las variantes de un patógeno particular; y una sonda, tal como las sondas de emisión de señal auto-alterable que se han descrito en lo que antecede. En algunos casos, las sondas se fijan a una membrana de soporte adecuada. Otros componentes opcionales del kit incluyen, por ejemplo, un agente para catalizar la síntesis de los productos de extensión de cebador, los trifosfatos de nucleósido de substrato, los tampones apropiados para las reacciones de amplificación y/o de hibridación, un estándar de referencia de ácido nucleico para permitir la cuantificación de las plantillas de moléculas en las muestras de prueba, e instrucciones para llevar a cabo el presente método.

Ejemplos

Los ejemplos de la presente invención que se exponen a continuación, han sido proporcionados únicamente a efectos ilustrativos y no limitan el alcance de la invención. Las numerosas realizaciones de la invención comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones que siguen a los ejemplos, resultarán evidentes para los expertos en la técnica con la lectura del texto anterior y de los ejemplos que siguen.

Detección de Variantes de HCV

Se realizó una comparación de tres métodos diferentes para la detección basada en ácido nucleico de ocho cepas de HCV que son prototipos para los principales genotipos y sub-tipos del HCV. Los cuatro métodos de detección utilizados fueron: (A). La baliza RT-PCR de "extremo a extremo" de la presente invención, (B). Baliza RT-PCR convencional, y (C). La Prueba COBAS AMPLICOR HCV MONITOR, Versión 2.0 (COBAS HCM-2; Roche Diagnostic Systems Inc., Branchburg, NJ). La COBAS HCM-2, que en un ensayo basado en RT-PCR, fue llevado a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La baliza RT-PCR convencional y la baliza RT-PCR de "extremo a extremo", fueron llevadas a cabo como sigue:

Se diseñaron cebadores PCR para amplificar un segmento de la región 5' de no codificación del ARN genómico de HCV. La secuencia de ácido nucleico de esta región del genoma se conserva de forma relativamente alta entre los genotipos y los sub-tipos de HCV.

Se diseñaron cebadores convencionales para la baliza PCR para amplificar un segmento de 101 p.b. de ADN correspondiente a los nucleótidos 66 a 166 de la secuencia publicada de HCV-H [Inchauspe y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 10292-10296, 1991; Genbank M67463]. El espacio de intervención entre los dos cebadores RT-PCR convencionales tiene una longitud de 61 p.b. Los cebadores son como sigue:

	Cebador directo:	5'-ACGCAGAAAGCGTCTAGCCA-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 1);
	Cebador inverso:	5'-GTACTCACCGGTTCCGCAGA-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 2).

Los cebadores para RT-PCR de "extremo a extremo" de la presente invención fueron diseñados de tal modo que no existía ningún espacio de nucleótido de intervención entre los dos cebadores. La región amplificada es un segmento de 51 p.b. que corresponde a los nucleótidos 83 a 133 de la secuencia publicada de HCV-H. Los cebadores son como sigue:

	Cebador directo:	5'-CCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGC-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 3);
	Cebador inverso:	5'-CCCGGGAGGGGGGGTCCTGGAG-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 4).

Para ambas PCR convencional y de "extremo a extremo", la baliza molecular utilizada para la detección del producto PCR fue 5'FAM-ccgggcTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTgcccgg-DABCYL-3' (NÚM. de ID. de SEC.: 5). Los ácidos nucleicos del vástago se muestran en la posición inferior, y los ácidos nucleicos del lazo de la sonda (correspondientes a los nucleótidos 91 a 113 de la secuencia HCV-H) se muestran en la posición superior.

El ADN complementario fue transcrito inverso a partir del ARN de plasma extraído, con la utilización del cebador inverso convencional, o bien del cebador inverso de "extremo a extremo" que se han descrito anteriormente. Cada 20 \mul de reacción contenía 2,5 \muM de cebador inverso, 1 unidad de transcriptasa inversa Mo-MuLV (GIBCO BRL, Grand Island, NY), tampón de transcriptasa inversa 1X (GIBCO BRL), 5 mM de ditiotreitol (DTT), 0,06 unidades de RNasin (Pomega, Madison, WI), y 0,5 mM de dNTPs, es decir, dATP, dTTP, dCTP y dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las reacciones fueron incubadas a 42ºC durante 45 minutos. La transcriptasa inversa fue desactivada a continuación mediante una incubación adicional a 95ºC durante 2 minutos.

Para la amplificación y detección de PCR, los productos de la transcripción inversa fueron incubados en un volumen final de 50 \mul de mezcla de reacción que contenía cebador directo (0,1 \muM para PCR "extremo a extremo" y 1 \muM para PCR convencional), 1 \muM de cebador inverso, 1,25 unidades de polimerasa AmpliTaq Gold (Applied Biosystems, Foster City, CA), 1X AmpliTaq Bold Buffer II (Applied Biosystems), 2 mM de MgCl_{2}, 0,2 mM de dNTPs, y 10 ng de baliza molecular. La amplificación PCR se realizó en el Detector de Secuencia Applied Biosystems 7700 utilizando los siguientes parámetros de repetición cíclica: 95ºC durante 10 minutos (activación de enzima), seguido de 44 ciclos [95ºC, 30 segundos (desnaturalización); 60ºC, 1 minuto (fijación con calor); 72ºC (extensión)]. Se midió la fluorescencia relativa de la baliza molecular a la temperatura de fijación con calor. La cuantificación de las plantillas moleculares de HCV fue alcanzada con la inclusión de una curva estándar de ARN en cada experimento RT-PCR. La curva estándar fue construida utilizando 10, 25, 50, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5} ó 10^{6} moléculas de ARN Transcrito de HCV sintético, diluido en 1 \mug/ml de tARN de levadura (Ambion, Austin, TX).

La tabla I muestra una comparación de los tres métodos diferentes para la detección de ocho cepas de HCV. Estas cepas son prototipos de los genotipos y sub-tipos principales de HCV. El ensayo de baliza de "extremo a extremo" de la presente invención, (A) detecta los ocho genotipos/sub-tipos, mientras que la baliza PCR (B) convencional falla en cuanto a la detección de los Genotipos 4a y 5a.

Los resultados del ensayo COBAS-HCM-2 son presentados como Unidades Internacionales. Aunque se han sugerido varios factores de conversión (Saldanha y otros, Vox Sang, 1999;/6(3): 149-158; Cuijpers y otros, 2001; 81(I): 12-20), la relación exacta entre I.U. y el número de copia de ARN de HCV, está aún sometido a debate, en particular para los genotipos de HCV distintos del 1a y 1b. Debido a esto, Roche Diagnostic Systems no sugiere actualmente un factor de conversión para los resultados obtenidos con el ensayo COBAS-HCM-2. A efectos analíticos, se supone por tanto que I.U. y número de copia de ARN, son equivalentes. En comparación con el ensayo COBAS-HCM-2, el ensayo de baliza RT-PCR de "extremo a extremo" es equivalente a, o ligeramente más sensible para los Genotipos 1a, 1b, 2b y 6a, pero es 1 log(10-veces) más sensible para el Genotipo 4a, log (3,2-veces) más sensible para los Genotipos 2a y 5a, y 0,3 log(2-veces) más sensible para el Genotipo 3a. En la Tabla 2 se muestra un análisis estadístico que compara la sensibilidad relativa de los dos ensayos.

TABLA 1

1

^{1}. \begin{minipage}[t]{150mm} Las muestras probadas fueron plasma de chimpancés que fueron infectados con cada una de las cepas prototipo de HCV: cepa H [Inchauspe y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 88: 10292-10296, 1991; Genbank M67463], HC-J4/91 [Okamoto y otros, Virology, 190: 894-899, 1992; Genbanck D10750], HC-J6 [Okamoto y otros, J. Gen. Virol., 72: 2697-2704, 1991; Genbank D00944], HC-J8 [Okamoto y otros, Virology, 188: 331-341, 1992; Genbank D10988], S52 [Bukh y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 4942-4946, 1992; Genbank M84837], ED43 [Chamberlain y otros, 78: 1341-1347, 1997; Genbank Y11604], SA13 [Bukh y otros, J. Infect. Dis., 178: 1193-1197; Genbank AF064490], HK6a [Adams y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 393-396, 1997; Genbank Y12083]. \end{minipage}

TABLA 2 Ensayos de Detección de Genotipos de HCV mediante Baliza PCR "Extremo a Extremo" y COBAS HCM-2

3

^{1}. \begin{minipage}[t]{150mm} Los resultados se presentan como \pm desviación media estándar de (n) ensayos repetidos. Los resultados del ensayo COBAS HACM-2 se expresan como Unidades Internacionales (I.U.)\end{minipage}

^{2}. \begin{minipage}[t]{150mm} La diferencia de veces en la sensibilidad de dos ensayos se calcula como la relación aritmética de los valores obtenidos por la Baliza PCR de "Extremo a Extremo" con respecto a los obtenidos mediante el Ensayo Roche Monitor. Se calcularon dos valores P ajustados con la utilización del software GraphPad InStat.\end{minipage}

Protección de Muestras de Plasma procedentes de Individuos Infectados con diversos Genotipos de HCV

La PCR de "extremo a extremo" de la presente invención fue utilizada para proteger un subconjunto de muestras de plasma de un paciente del Panel Maste ICBS de HCV. Este panel, que está siendo expandido continuamente, es recopilado por los Centros de Control de Enfermedades (CDC) en colaboración con el Consorcio Internacional para Seguridad Sanguínea (ICBS). El panel consiste en muestras de plasma recopiladas en diversas regiones geográficas. Todas las muestras son protegidas respecto al anticuerpo de HCV y son sometidas a análisis de genotipo en dos laboratorios de pruebas independientes en el CDC y en Visible Genetics Inc. (VGI).

Un total de 192 muestras, comprendiendo muestras de plasma recogidas en Egipto, Vietnam e Indonesia, fueron proporcionadas por el CDC. De éstas, 134 fueron relacionadas como que eran inequívocamente positivas en cuanto a ARN de HCV en base a los datos de genotipado de PCR obtenidos mediante CDC, VGI o ambos. Se relacionaron cinco muestras como poseedoras de datos inequívocos o de conflicto sobre el genotipo de PCR. Cincuenta y tres muestras fueron relacionadas como no genotipables (es decir, negativas en cuanto a ARN de HCV).

El ARN total fue extraído a partir de 70 \mul de plasma recién licuado utilizando un procedimiento de extracción robótica en el que el ARN es vinculado y eluido a partir de membranas PVDF en formato de placa de 96 cavidades (Lee y Prince, 2001, Transfusión; 41: 483-487). El ARN total fue obtenido en un volumen de 50 \mul de agua libre de nucleasa. Diez microlitros de ésta (equivalentes a 14 \mul de plasma), fueron sometidos a continuación a transcripción inversa y PCR utilizando los cebadores de "extremo a extremo" (NÚM. de ID. de SEC.: 3 y NÚM. de ID. de SEC.: 4) y baliza molecular (NÚM. de ID. de SEC.: 5) descritos anteriormente.

La tabla 3 muestra los resultados de RT-PCR para las 134 muestras inequívocamente positivas de HCV presentes en el panel. La PCR de "extremo a extremo" detectó sucesivamente la gran mayoría de aislados de HCV de todos los genotipos. De las 53 muestras que no fueron positivas en cuanto a ARN de HCV en los ensayos de genotipo, solamente una muestra dio una señal PCR débilmente positiva (10^{3,1} moléculas de ARN por ml).

Las muestras con una carga de virus menor de \sim700 copias/ml (9,9 copias por 14 \mul de plasma), no pudieron ser detectadas utilizando la combinación de extracción robótica y de RT-PCR de "extremo a extremo" descrita anteriormente. Los resultados mostradas en la Tabla 3 demuestran claramente que la presente invención permite la detección de diversos genotipos HCV con un simple conjunto de cebadores de "extremo a extremo" y de baliza molecular.

TABLA 3

4

*** \begin{minipage}[t]{148mm} Muestras para las que el análisis de genotipado indicó infección mezclada o que ha sido incluso listada por separado como clasificación indeterminada.\end{minipage}

\newpage

Comparación de PCR de "Extremo a Extremo" y PCR Convencional para la Detección de las Variantes del Grupo M de VIH-1 Sub-tipo B

La Figura 6a muestra un alineamiento de secuencias de ADN pro-viral que corresponde a la región V3 y de secuencias flanqueadoras de cuatro variantes diferentes de VIH, todas del grupo M (Mayor) sub-tipo B (VIH/RT-1, VIH/RT10, VIH/38-1 y VIH/38/3). La región V3 es el segmento más altamente variable del genoma del VIH. Se diseñó una baliza molecular con estructura de sonda-lazo exactamente idéntica a la variante VIH/RT-1 (nucleótidos 76-97 en la secuencia V3 representada). Esta secuencia de sonda posee 1, 3 o 4 desemparejamientos con las variantes VIH/RT-10, VIH/38-1 y VIH/38-3, respectivamente (Figura 6a).

Los cebadores de PCR para PCR de "extremo a extremo", fueron diseñados como sigue. El cebador directo (5'-acaatacaagaaaaaggataactatgggac-3') (NÚM. de ID. de SEC.: 6) corresponden a los nucleótidos 65-94 de la secuencia de VIH/RT-1 mostrada en la Figura 6a. El cebador directo se conoce como NBF. El cebador inverso (5'tttctcctgttg
tataaagtactctccccg-3') (NÚM. de ID. de SEC.: 7) corresponde a los nucleótidos 95-124 de la misma secuencia. El cebador inverso se conoce como NBR.

Los cebadores para PCR convencional fueron diseñados para generar el producto PCR de 177 p.b., como sigue. El cebador directo (5'taatagtacagctgaatgaatctg-3') (NÚM. de ID. de SEC.: 8) corresponde a los nucleótidos 14-37 de la secuencia de VIH/RT-1 mostrada en la Figura 6a. El cebador inverso (5'gttttaaagtgttattccatgc-3') (NÚM. de ID. de SEC.: 9) corresponde a los nucleótidos 168-190 de la misma secuencia.

La Figura 7 muestra los resultados de un experimento para comparar la capacidad de la PCR de baliza convencional con la PCR de "extremo a extremo" para la detección de cada una de las 4 variantes de VIH mostradas en la Figura 6a. Las reacciones PCR contenían 10^{6} plantillas de moléculas de VIH/RT-1, VIH/RT-10, VIH/38-1 o VIH/38-3, la baliza molecular mostrada en la Figura 6b, y cualquiera de los cebadores convencionales o de "extremo a extremo" descritos anteriormente. La reacción PCR convencional contenía, ya sea ninguna plantilla, o ya sea 150 ng de ADN genómico humano. La amplificación se llevó a cabo en el Perkin Elmer 7700 utilizando los siguientes parámetros de ciclización: 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC durante 30 segundos (desnaturalización), 50ºC durante 1 minuto (fijación por calor) y 72ºC durante 30 segundos (extensión). La fluorescencia de la baliza molecular fue medida a la temperatura de fijación con calor de 50ºC. La fluorescencia fue representada a continuación gráficamente respecto al número de ciclo de la PCR. La eficacia de la amplificación/ detección de la PCR se determina mediante el "ciclo de umbral", es decir, el ciclo PCR de número más bajo requerido para generar una señal fluorescente positiva.

Según se muestra en la Figura 7a, la técnica PCR de baliza convencional fue capaz de detectar tanto el VIH/RT-1 (emparejamiento exacto con la baliza) el VIH/RT-10 (desemparejamiento uno), con un ciclo de umbral equivalente (ciclo 23), aunque el nivel de pico de la fluorescencia obtenida en el último caso fue \sim2 veces más baja que la de la plantilla de emparejamiento exacto. Las técnicas PCR de baliza convencional fallaron en cuando a detectar tanto el VIH/38-1 (3 desemparejamientos) como el VIH/38-3 (4 desemparejamientos), a pesar del hecho de que el producto PCR fue generado a partir de las 4 variantes, como se muestra mediante análisis de gel (Figura 8).

Por el contrario, la técnica PCR de "extremo a extremo" fue capaz de detectar las cuatro variantes de VIH (0, 1, 3 ó 4 desemparejamientos) con ciclo de umbral comparable (Figura 7b). De manera importante, no se detectó ninguna señal en los tubos de reacción que no contenían ninguna plantilla, o que contenían 150 ng de ADN genómico humano.

Detección de Diferentes Sub-tipos de VIH-1 Grupo M

Los cebadores de PCR fueron diseñados para amplificar un segmento del gen "gag" del ARN genómico de VIH-1, el cual está relativamente bien conservado entre los diferentes Sub-tipos de VIH-1 Grupo M. A pesar de esta conservación relativa, los Sub-tipos de VIH-1 muestran una diversidad de secuencia de nucleótido superior al 20% dentro de esta región del genoma (Roberton y otros, 1999, en: Human Retrovirus and AIDS 1999, págs. 492-505, Editors Kuiken y otros, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, Nuevo México).

Los cebadores convencionales para PCR de baliza, fueron diseñados para amplificar un segmento de ARN de 94 p.b. correspondiente a los nucleótidos 1478 a 1571 de la secuencia publicada del aislado HXB2 del Sub-tipo B de VIH-1 [Ratner y otros, 1985, Nature, 313(6000): 277-284; Genbank K03455]. El espacio interviniente entre los dos cebadores convencional y RT-PCR, es de 53 p.b. Los cebadores son como sigue:

	Cebador directo:	5'-AACCAAGGGGAAGTGACATA-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 10);
	Cebador inverso:	5'-ATTTCTCCTACTGGGATAGGT-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 11).

Los cebadores para la RT-PCT de "extremo a extremo" de la presente invención, fueron diseñados para amplificar un segmento de 57 p.b. correspondiente a los nucleótidos 1502 a 1558 de la secuencia publicada HXB2 de VIH-1. No existe ningún espacio de intervención entre los dos cebadores. Los cebadores son como sigue:

	Cebador directo:	5'- GAACTACTAGTACCCTTCAGGAACAAATAG-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 12);
	Cebador inverso:	5' -GGATAGGTGGATTATTTGTCATCCATC-3'	(NÚM. de ID. de SEC.: 13).

Para ambas PCR convencional y de "extremo a extremo", la baliza molecular utilizada para la detección del producto de la PCR fue: 5'-FAM- cgcctTACCCTTCAGGAACAAATAGaggcg - DABCYL-3' (NÚM. de ID. de SEC.: 14). Los ácidos nucleicos de vástago se muestran en la posición inferior, y los ácidos nucleicos de lazo de sonda (correspondientes a los nucleótidos 1512 a 1530 de la secuencia HXB2 de VIH-1) se muestran en posición superior.

Virus aislados de los Sub-tipos A, B, C, D, F y G de VIH-1 fueron obtenidos como sobrenadantes de cultivo libres de células del Programa Reactivo de Investigación y Referencia de SIDA, División de SIDA, NIAID, NIH. El ARN fue extraído de 140 \mul de sobrenadante de cultivo recién licuado. El ADN complementario fue transcrito inversamente del ARN extraído, utilizando el cebador inverso convencional, o bien el cebador inverso de "extremo a extremo" descrito anteriormente. Las condiciones de reacción para ambas síntesis de cADN y amplificación de PCR, fueron esencialmente las mismas que las descritas en lo que antecede para el HCV. Todos los ensayos fueron llevados a cabo por triplicado. La cuantificación de moléculas de plantilla de VIH se logró mediante inclusión de una curva estándar de ARN en cada experimento de RT-PCR. La curva estándar fue construida utilizando 1, 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5} ó 10^{6} moléculas de ARN de VIH-1, diluidas en 1 \mug/ml de tARN de levadura (Ambion, Austin, TX).

La tabla 4 muestra una comparación de la RT-PCR convencional y la RT-PCR de "extremo a extremo" para la detección de Sub-tipos de VIH-1. El ensayo de "extremo a extremo" de la presente invención (A.) detecta los 6 Sub-tipos de VIH-1 probados, mientras que el ensayo convencional falla en cuanto a la detección de los Sub-tipos A, D y G.

TABLA 4

6

^{1}. \begin{minipage}[t]{145mm} Las muestras de prueba fueron aisladas de virus obtenidos como sobrenadantes de cultivos libres de células del Programa Reactivo de Investigación y Referencia de SIDA, División de SIDA, NIAID, NIH.\end{minipage}

^{2}. \begin{minipage}[t]{145mm} Aislados proporcionados por The UNAIDS Network para Aislamiento y Caracterización de VIH, y los DAIDS, NIAID.\end{minipage}

^{3}. Abimiku y otros, 1994, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 10(II): 1581-1583.

Adaptación del Método para la Detección Simultánea de Ambas Variantes de HIV-1 Grupo M y VIH-1 Grupo O

Los aislados de virus del Grupo O de VIH-1 (Ausente), muestran una marcada variación de secuencia respecto a los miembros del Grupo M (Mayor) de VIH-1. Aunque los virus del Grupo O son principalmente prevalentes en partes de África, su frecuencia entre las muestras recogidas por bancos de sangre fuera de África parece ser creciente (Jaffe y Schochetman, 1998, Infect Dis. Clin. North Am.; 12(1): 39-46; Cuturier y otros, 2000, AIDS; 14(3): 289-296; Fed. Regist., 1997, 23 Sept.; 62(184): 49695). La presente invención permite la detección de miembros de ambos Grupo M y Grupo O utilizando un simple conjunto de cebadores de "extremo a extremo" y baliza molecular.

Los cebadores para RT-PCR de "extremo a extremo" de la presente invención fueron diseñados para amplificar un segmento de 64 p.b. del gen "pol" del ARN genómico de VIH-1, correspondiente a los nucleótidos 4750 a 4813 de la secuencia publicada HXB2 de VIH-1. No existe ningún espacio de intervención entre los dos cebadores. Los cebadores son como sigue:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+ Cebador directo: \+ 5'
-CAGCAGTACAAATGGCAGTATTCATTCACAATTT-3' \+ (NÚM. de
ID. de SEC.: 15);\cr  \+ Cebador inverso: \+ 5'
-CTGTATCCCCCAATCCCCCCTTTTCTTTTA-3' \+ (NÚM. de ID.
de SEC.:
16).\cr}

La baliza molecular utilizada para la detección del producto PCR fue 5'-FAM-cgcacgGCAGTATTCATTCAC
CAATTTTcgtgcg -DABCYL-3' (NÚM. de ID. de SEC.: 17). Los ácidos nucleicos de vástago se muestran en la porción inferior, y los ácidos nucleicos de lazo de sonda se muestran en la posición superior.

Los nuevos cebadores y balizas, fueron probados a continuación en cuanto a su capacidad para amplificar y detectar aislados de virus VIH-1 de Grupo M (Sub-tipos A, B, C, D, F y G) y de Grupo O, los cuales fueron obtenidos como sobrenadantes de cultivo libre de células del Programa Reactivo de Investigación y Referencia de SIDA, División de SIDA, NIAID/NIH. Con anterioridad a la extracción del ARN, todos los sobrenadantes celulares fueron diluidos 1000 veces en solución salina regulada de fosfato (PBS). La extracción del ARN se realizó en el sobrenadante diluido, esencialmente como se ha descrito en lo que antecede, salvo en que a continuación del aislamiento, Todas las muestras de ARN fueron tratadas con DNasa libre de RNasa (Ambion, Austin, TX), para asegurar la extracción de ADN proviral contaminante. El ADN complementario fue transcrito inversamente a partir del ARN extraído, utilizando el cebador inverso de "extremo a extremo" (NÚM. de ID. de SEC.: 16), descrito anteriormente. Las condiciones de reacción tanto para la síntesis de cADN como para la amplificación de PCR, fueron esencialmente las mismas que las descritas anteriormente. La cuantificación de las moléculas de plantilla de VIH-1 se logró mediante la inclusión de una curva estándar de ARN en cada experimento RT-PCR.

La tabla 5 muestra los resultados de la RT-PCR utilizando los cebadores de "extremo a extremo" de la región "pol" según la presente invención, y una comparación con el Ensayo COBAS AMPLICOR VIH-1 Monitor, Versión 1.0 (Roche Diagnostics, Branchbug, NJ). El ensayo RT-PCR de "extremo a extremo" fue capaz de detectar todos los aislados probados del Grupo M y del Grupo O, con una sensibilidad igual a (Grupo M, Sub-tipos B y C) o mayor que (Grupo M, Sub-tipos A, D y F) el Ensayo COBAS AMPLICOR VIH-1 Monitor (1.0). Este último ensayo falló en cuanto a la detección de cualquiera de los aislados de virus probados del Grupo O, y también falló en cuanto a la detección del Sub-tipo G del Grupo M. Estos datos están de acuerdo con un informe reciente de que ni el Ensayo COBAS AMPLICOR VIH-1 Monitor (1.0) ni su versión mejorada (1.5) son capaces de detectar virus del Grupo O (Yang y otros, Transfusión, 2001; 41: 643-651). Por el contrario, la presente invención permite la detección de todos los aislados de virus con un simple conjunto de cebadores de "extremo a extremo" y baliza molecular.

TABLA 5

7

^{ 1}. \begin{minipage}[t]{145mm} Con anterioridad a la extracción de ARN, todos los sobrenadantes libres de células fueron diluidos 1000 veces en PBS (para RT-PCR de "extremo a extremo") o bien en plasma humano normal (para Monitor COBAS Amplicor VIH-1, Versión 1.0). \end{minipage}

^{2}. \begin{minipage}[t]{145mm} Los aislados de virus son como se ha descrito en el Tabla 3, aislado L20571, Gurtler LG y otros, 1994, J. Virol., 68: 1581; aislado Y14496, Loussert-Ajaka I, y otros, J. Virol. 69:5640, 1995.\end{minipage}

^{3}. \begin{minipage}[t]{145mm} La PCR o la RT-PCR de "extremo a extremo" también se llevó a cabo sobre 100 ng de ADN o ARN humano, para verificar que las señales observadas eran debidas a amplificación de virus, y no a amplificación de ácidos nucleicos humanos contaminantes.\end{minipage}

Claims

1. Un método de reacción de cadena de extensión de cebador para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra, comprendiendo el método:

(a) hibridar un cebador inverso con la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de cadena de extensión de cebador;

(b) extender el cebador inverso utilizando la molécula de ácido nucleico objetivo como plantilla para formar un producto de extensión de cebador inverso, en el que el cebador inverso unido al producto de extensión de cebador inverso constituye un producto de amplificación de cebador inverso;

(c) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador inverso a partir de su plantilla;

(d) hibridar un cebador directo con:

(i): una molécula de ácido nucleico que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo, si se encuentra presente; o

(ii): el producto de amplificación de cebador inverso;

(e) extender el cebador directo utilizando la molécula de ácido nucleico objetivo complementaria, si está presente, o el producto de amplificación de cebador inverso, como plantilla, en el que el cebador directo unido al producto de extensión de cebador directo constituye un producto de amplificación de cebador directo;

(f) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador directo a partir de su plantilla;

(g) hibridar el cebador inverso con el producto de amplificación del cebador directo;

(h) extender el cebador inverso utilizando el producto de amplificación de cebador directo como plantilla para formar un producto de extensión de cebador inverso adicional, en el que el cebador inverso unido al producto de extensión de cebador inverso adicional constituye un producto de amplificación de cebador inverso adicional;

(i) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador inverso adicional a partir de su plantilla;

(j) hibridar el cebador directo con el producto de amplificación de cebador inverso;

(k) extender el cebador directo, utilizando el producto de amplificación de cebador inverso como plantilla para formar un producto de extensión de cebador directo adicional, en el que el cebador directo unido al producto de extensión de cebador directo adicional constituye un producto de amplificación de cebador directo adicional;

(l) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador directo adicional a partir de su plantilla;

(m) repetir las etapas (g) a (l) utilizando el producto de amplificación de cebador inverso adicional y el producto de amplificación de cebador directo adicional como plantillas para el cebador directo y el cebador inverso, respectivamente, un número de veces suficiente para producir una cantidad detectable de producto de amplificación de cebador inverso adicional o de producto de amplificación de cebador directo adicional, y

(n) detectar la presencia del producto de amplificación de cebador inverso adicional o del producto de amplificación de cebador directo adicional;

en el que el nucleótido presente en el extremo 3' del cebador inverso se hibrida con:

(i) el nucleótido del extremo 5' del producto de extensión de cebador directo del producto de extensión de cebador directo adicional, o

(ii) un nucleótido separado del nucleótido presente en el extremo 5' del producto de extensión de cebador directo o del producto de extensión de cebador directo adicional, por una distancia de separación de nucleótidos, en el que la distancia de separación comprende una secuencia que se sabe que está altamente conservada, y en el que el espacio de separación comprende desde alrededor de uno hasta alrededor de cinco nucleótidos, y

en el que el nucleótido presente en el extremo 3' del cebador directo hibrida con:

(i) el nucleótido del extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional, o

(ii) un nucleótido separado del nucleótido que está en el extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional, por un espacio de separación de nucleótidos, en el que el espacio de separación comprende una secuencia que se sabe que está altamente conservada, y en el que el espacio de separación comprende desde alrededor de uno hasta alrededor de cinco nucleótidos.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico objetivo se sabe que tienen secuencias variables.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la reacción de cadena de extensión de cebador es una reacción de cadena de polimerasa (PCR).

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico objetivo es un virus.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el virus es el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el virus es del virus de la hepatitis C (HCV) o el virus de la hepatitis B (HBV).

7. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el espacio de separación comprende una región altamente conservada del genoma del virus.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el espacio de separación comprende alrededor de dos nucleótidos.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la molécula de ácido nucleico que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo de la etapa (d)(i), se proporciona por separado como cADN de la molécula de ácido nucleico objetivo.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que detectar la presencia del producto de amplificación de cebador inverso adicional o del producto de amplificación de cebador directo adicional, comprende:

(A) proporcionar una sonda generadora de señal auto-alterable, en el que la sonda comprende:

(i): una primera secuencia de ácido nucleico unida a una mitad informadora capacitada para generar una señal detectable;

(ii): una segunda secuencia de ácido nucleico que:

(a): es complementario a la primera secuencia de ácido nucleico, y

(b): está unida a una mitad interactiva capacitada para alterar la señal de la mitad informadora cuando la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se hibridan cada una con la otra, y

(iii): una secuencia de sonda que conecta la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico; en la que la secuencia de sonda comprende cualquiera de:

(a): la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, o

(b): la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, y

(B) poner en contacto los productos de amplificación con la sonda;

en el que, cuando la secuencia de sonda de la sonda hibrida con el producto de amplificación de cebador inverso adicional o con el producto de amplificación de cebador directo adicional, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico resultan desnaturalizadas, generando con ello una señal por medio de la mitad informadora, y

en el que la señal generada por la mitad informadora indica la presencia de la molécula objetivo.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende una cualquiera de:

(a) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, y no la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador inverso, o

(b) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, y no la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador directo.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende una cualquiera de:

\newpage

(a) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador inverso, o

(b) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador directo.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nivel de señal detectable generada por la sonda, es proporcional a la cantidad de moléculas de ácido nucleico objetivo que hay en la muestra.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que alrededor del sesenta hasta alrededor del noventa y cinco por ciento de la secuencia de sonda, comprende una cualquiera de:

(i) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, o

(ii) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que:

si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, la relación molar entre el cebador inverso y el cebador directo está comprendida en la gama de alrededor de 1:5 hasta alrededor de 1:20, o

si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, la relación molar del cebador directo con respecto al cebador inverso está comprendida en la gama de alrededor de 1:5 hasta alrededor de 1:20.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende entre alrededor de diez y alrededor de treinta residuos de nucleótido.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la secuencia de sonda comprende desde alrededor de dieciocho hasta alrededor de veinticuatro residuos de nucleótido.

18. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la señal detectable es una señal luminiscente.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la señal luminiscente es una señal fluorescente.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la señal luminiscente es una señal quimiluminiscente.

21. El método de la reivindicación 10, en el que la mitad informadora está unida a la terminación 5' o a la terminación 3' de la sonda generadora de señal auto-alterable.

22. El método de la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva está unida a la terminación 5' o a la terminación 3' de la sonda generadora de señal auto-alterable.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad informadora es un fluoróforo.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el fluoróforo es un tinte de xanteno, un tinte de cianina, un derivado de dansil, EDANS, cumarina, lucífero amarillo, BODIPY, Cy3, Cy5, Cy7, Texas red®, eritrosina, naftilamina, Oregón green®, o combinaciones de los mismos.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el tinte de xanteno es una fluoresceína o una rodamina.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la fluoresceína se elige en el grupo consistente en 5-carboxifluoresceína (5-FAM); 6-carboxifluoresceína (6-FAM); 2',4',1,4-tetraclorofluoresceína (TET); 2',4',5',7',1,4-hexaclorofluoresceína (HEX); eosina; verde de calcio, y NED.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la rodamina se elige en el grupo consistente en tetrametil-6-carboxirodamina (TMRA); tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX); 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxirodamina (JOE), y tetrametilrodamina.

28. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva es un extinguidor.

29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el extinguidor es DABCYL, antroquinona, nitrotiazol, nitroimidazol o verde malaquita.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el DABCYL es DABSYL, DABMI o rojo de metilo.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva es un fluoróforo.

32. El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación son medidos y cuantificados mediante análisis a punto final.

33. El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación se miden y se cuantifican mediante análisis en tiempo real.

34. El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación son medidos con la utilización de una curva estándar derivada de una serie de mediciones de ciclo de umbral.

35. Un kit para la detección de moléculas de ácido nucléico objetivo presentes en una muestra, en el que se sabe que las moléculas de ácido nucleico objetivo tienen secuencias variables, que comprende:

(i) un conjunto de cebadores útiles para el método de la reivindicación 1;

(ii) reactivos para llevar a cabo la reacción de cadena de extensión de cebador, y

(iii) una sonda generadora de señal auto-alterable, que detecta la presencia de productos de amplificación de cebador, en el que la sonda comprende una primera secuencia de ácido nucleico unida a una mitad informadora capaz de generar una señal detectable; una segunda secuencia de ácido nucleico unida a una mitad interactiva capaz de alterar la señal de la mitad informadora; y una secuencia de sonda que conecta la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico.