ES2280214T3 - Lipoproteina desnaturalizada estabilizada y metodo para la produccion de la misma. - Google Patents

Abstract

Método de producción de lipoproteína desnaturalizada, que comprende las etapas de: congelar una solución que contiene lipoproteína para producir una solución congelada; y fundir dicha solución congelada para producir una solución que contenga lipoproteína desnaturalizada.

Description

Lipoproteína desnaturalizada estabilizada y método para la producción de la misma.

Sector técnico de la invención

La presente invención se refiere a una lipoproteína desnaturalizada estabilizada y a un método para la producción de la misma. De manera más particular, la presente invención se refiere a un método para la producción de lipoproteína desnaturalizada, que comprende las siguientes etapas: congelar una solución que contiene lipoproteína para producir una solución congelada; y fundir dicha solución que contiene lipoproteína desnaturalizada.

Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para la producción de la lipoproteína desnaturalizada descrita anteriormente, comprendiendo adicionalmente la etapa de liofilizar la solución que contiene dicha lipoproteína desnaturalizada.

La lipoproteína desnaturalizada sugiere fuertemente su asociación con numerosas enfermedades del sistema circulatorio, incluyendo enfermedades del sistema arterial coronario tales como el infarto cardíaco y estenocardia, enfermedades de las arterias cerebrales tales como el infarto cerebral y la demencia cerebrovascular, enfermedades de las arterias renales tales como la nefropatía y nefropatía diabética, y enfermedades del sistema arterial periférico tales como las obstrucciones de las arterias periféricas. Las substancias estándar para determinar la masa de lipoproteína desnaturalizada y varios reactivos experimentales para la investigación del papel fisiológico y actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada constituyen por lo tanto, en sí mismos, substancias muy importantes que afectan los resultados de la investigación. La lipoproteína desnaturalizada que ha sido estabilizada del modo descrito anteriormente, por lo tanto, es útil como sustancia estándar en un método para determinar el contenido de lipoproteína desnaturalizada en un componente sanguíneo haciendo que la lipoproteína desnaturalizada haga contacto con un anticuerpo capaz de reconocer la lipoproteína desnaturalizada y determine la reactividad del anticuerpo con una muestra y como reactivo experimental variable para la investigación del papel fisiológico y la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada.

Técnica anterior

En numerosas enfermedades del sistema circulatorio, incluyendo enfermedades del sistema arterial coronario tales como el infarto y la estenocardia, enfermedades de las arterias cerebrales tales como el infarto cerebral y la demencia cerebrovascular, enfermedades de las arterias renales tales como la nefropatía y nefropatía diabética, y enfermedades del sistema arterial periférico tales como las obstrucciones de las arterias periféricas, se sugiere fuertemente que los lípidos del suero sanguíneo juegan un papel importante. Una enorme cantidad de gastos están siendo pagados por el sistema de salud público para tratamientos médicos que utilizan depresores del lípido del suero, particularmente depresores del colesterol. Estudios recientes han producido un informe en el que una comparación entre un grupo de pacientes con dichas enfermedades y un grupo de personas sanas no revela diferencias apreciables en la cantidad absoluta de lípidos de suero entre los dos grupos y que en cambio la cantidad de LDL oxidada, un producto desnaturalizado de lipoproteína de baja densidad (LDL), presente en el suero sanguíneo es distinguiblemente distinta entre los dos grupos (Toshima, S. y otros (1996) Circulation, 94, Suppl. I: 1288). La relación entre la lipoproteína oxidada, una de las lipoproteínas desnaturalizadas, y el avance de la lesión arteriosclerótica ha sido señalada, por ejemplo, por Steinberg y otros (Steinberg, D., Parthasarathy, S. Carew, T.E, Khoo, J.C., y Witztum, J.L., (1989) N. Engl. J. Med., 320:915). En años recientes, por lo tanto, numerosos métodos de determinación utilizando la lipoproteína desnaturalizada han sido desarrollados (Publicación de Patente JP-A-08-304.395 y Publicación de Patente JP-A-09-288.106, por ejemplo) y la prueba para investigar el papel fisiológico de la lipoproteína desnaturalizada ha ido ganando importancia.

El hecho de que sea difícil la obtención de las substancias estándar necesarias para las determinaciones llevadas a cabo en dichos experimentos, sin embargo, ha complicado la situación. Con el propósito de investigar el papel fisiológico de la lipoproteína desnaturalizada, ha sido necesario tomar una gran cantidad de muestras de sangre de lipoproteína desnaturalizada de una serie de establecimientos y llevar a cabo una comparación de las mismas. Para dicha comparación, es esencial que las mediciones obtenidas en las pruebas individuales estén libres de variaciones. No puede asegurarse la reproductibilidad entre dichas mediciones a menos que se disponga de una sustancia estándar estable y excelente en reproductibilidad a lo largo de la duración necesaria para una serie de pruebas relevantes. Cuando los resultados de las pruebas son marcadamente variados entre las distintas personas que miden, debido al uso de distintas substancias estándar, la interpretación del papel fisiológico de una determinada lipoproteína desnaturalizada es tan complicada que hace imposible obtener una conclusión fija. Esta inviabilidad para obtener una sustancia estándar que se ajuste a una preservación estable ha cerrado el camino para la aplicación de la determinación de la cantidad de lipoproteína desnaturalizada presente en una determinada muestra, por ejemplo, como medio para juzgar exactamente una enfermedad a pesar del reconocimiento popular de la importancia fisiológica de dicha determinación.

Generalmente, en la determinación de la masa de proteína contenida en el suero sanguíneo, por ejemplo, ahora se lleva cabo la práctica de la estabilización mediante algún método o lo que podríamos llamar un suero sanguíneo estándar o un componente objetivo en estado de aislamiento y la utilización del producto de esta estabilización como una sustancia estándar. En cuanto a la lipoproteína en general, se ha informado sobre la existencia de un método para producir plasma sanguíneo estándar o suero sanguíneo estándar estable durante períodos de conservación prolongados mezclando de manera opcional plasma sanguíneo o suero sanguíneo conteniendo lipoproteína con azúcar no reductor, tal como la sacarosa, y liofilizando la mezcla resultante hasta que el contenido acuoso alcanza un nivel dentro del rango entre 1 y 10% en masa (Publicación de Patente EP-A-617289) y un método para producir de manera comercial un producto liofilizado estabilizado mediante la obtención de lipoproteína reconstructiva a partir de apolipoproteína y lípidos, y liofilizando y estabilizando la lipoproteína reconstructiva en presencia de un agente estabilizador, tal como sacarosa o manitol (Publicación de Patente US-A-5.652.399). Las patentes publicadas en boletines oficiales meramente intentan estabilizar la lipoproteína como medio para estabilizar la lipoproteína sin acarrear la desnaturalización de la misma y no dar a conocer la lipoproteína desnaturalizada estabilizada y un método para la producción de la misma.

Es conocido un método para obtener dicha lipoproteína desnaturalizada como lipoproteína oxidada, lipoproteína acetilada o lipoproteína conjugada con malondialdehído mediante aislamiento y purificación de la lipoproteína, por ejemplo, a través de una técnica bien conocida en la actualidad, ultracentrifugación y luego oxidación de la lipoproteína refinada con un ión metálico tal como un ión de cobre, acetilándola mediante la reacción con anhídrido acético, o permitiendo que reaccione con malondialdehído. Sin embargo, las lipoproteínas desnaturalizadas producidas mediante dicho método son más inestables que la lipoproteína no desnaturalizada e inestable en su estado desnaturalizado como para permitir un período de conservación prolongado.

En vistas del estado de este caso, la Publicación de Patente JP-A-09-288.106 ha dado a conocer un método para determinar lipoproteína humana oxidada utilizando un estándar que es producido mediante la incorporación, dentro de la lipoproteína de plasma sanguíneo, del óxido de fosfolípido obtenido oxidando de manera artificial el fosfolípido. La sustancia estándar que es utilizada en el método descrito anteriormente en el presente documento, sin embargo, es tan deficiente en cuanto a estabilidad de conservación como para requerir la preparación individual de la misma antes de cada utilización y conlleva un procedimiento complicado.

En vistas de los varios estados de la técnica relacionada, resulta deseable el desarrollo de una lipoproteína desnaturalizada capaz de ser almacenada de forma estable durante largos períodos de tiempo y un método para la producción de la misma.

Por lo tanto, los objetivos de la presente invención son dar a conocer una lipoproteína desnaturalizada con estabilidad excelente durante períodos de conservación prolongados, es decir, que la lipoproteína no produce ninguna variación apreciable en las determinaciones a lo largo de todo el tiempo de conservación y un método de producción de la misma, en el que la lipoproteína es aplicada como sustancia estándar para la determinación de la masa de lipoproteína desnaturalizada contenida en un determinado componente sanguíneo o como un reactivo experimental variable para la investigación del papel fisiológico de la lipoproteína desnaturalizada.

Descripción de la invención

En un primer aspecto, la presente invención da a conocer un método para la producción de lipoproteína desnaturalizada, que comprende las etapas de: congelar una solución que contenga lipoproteína para producir una solución congelada; y fundir dicha solución congelada para producir una solución que contenga dicha lipoproteína desnaturalizada.

En un segundo aspecto, la presente invención da a conocer una lipoproteína desnaturalizada estabilizada producida mediante un método de acuerdo con el primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención da a conocer un método para la determinación de lipoproteína desnaturalizada en una muestra, que comprende las etapas de: seleccionar una lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con dicho segundo aspecto para ser utilizada como sustancia estándar; formar una curva de calibración utilizando concentraciones prescritas de dicha sustancia estándar; hacer reaccionar la muestra con un anticuerpo que se une a la lipoproteína desnaturalizada; y medir la reactividad del anticuerpo con dicha muestra.

En un cuarto aspecto, la presente invención da a conocer un kit reactivo para la determinación de la lipoproteína desnaturalizada, que comprende lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con dicho segundo aspecto, utilizada como sustancia estándar. El conjunto o kit reactivo puede comprender un líquido diluyente para una muestra, una fase sólida formada por inmovilización de un anticuerpo, un tampón de reacción, una solución de aclarado, un anticuerpo secundario etiquetado, un reactivo de detección, y toda o una parte de lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con dicho segundo aspecto utilizada como sustancia estándar.

Realizaciones particulares de cada aspecto de la presente invención son establecidas en las reivindicaciones dependientes.

Los inventores de la presente invención, después de un estudio cuidadoso llevado a cabo para lograr los objetivos mencionados anteriormente, han encontrado que llevando a cabo un proceso que incluya como mínimo una operación de congelación en una solución que contenga lipoproteína, desnaturalizando por lo tanto la lipoproteína contenida en dicha solución, hace posible la obtención de una sustancia estándar útil para la determinación del contenido de proteína desnaturalizada en una muestra de sangre o un reactivo experimental variable útil para la investigación del papel fisiológico o la actividad fisiológica de la proteína desnaturalizada. Además, han encontrado que liofilizando la lipoproteína desnaturalizada obtenida tal como ha sido descrito anteriormente en el presente documento, se hace posible mejorar de manera prominente la estabilidad durante períodos prolongados de conservación de la lipoproteína desnaturalizada en estado seco y la estabilidad en la conservación de la lipoproteína desnaturalizada en estado seco una vez que ha sido disuelta en una solución. Los inventores de la presente invención han encontrado además que permitiendo la presencia de sacarosa, lactosa, trehalosa, albúmina de suero sanguíneo bovino (BSA), o albúmina de suero sanguíneo humano (HSA), entre otros, como agente estabilizador durante la etapa de liofilización, es posible mejorar las lipoproteínas desnaturalizadas en mayor magnitud en cuanto a la estabilidad durante períodos de conservación prolongados y dar una solución mejor para los problemas mencionados anteriormente.

La presente invención ha sido perfeccionada basándose en los conocimientos mencionados anteriormente en el presente documento.

El objetivo mencionado anteriormente es logrado a través de un método para producir lipoproteína desnaturalizada llevando a cabo un proceso que incluye como mínimo una operación de congelación en una solución que contenga lipoproteína, desnaturalizando de este modo la lipoproteína contenida en dicha solución.

El objetivo es logrado de manera adicional a través de un método para producir lipoproteína desnaturalizada estabilizada que comprende la aplicación de un proceso que incluye como mínimo una operación de congelación en una solución que contiene lipoproteína, desnaturalizando de este modo la lipoproteína contenida en dicha solución y obteniendo lipoproteína desnaturalizada y liofilizando de manera adicional la lipoproteína desnaturalizada, estabilizando de este modo la lipoproteína desnaturalizada.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra la curva de calibración producida por LDL oxidada obtenida en el Ejemplo comparativo 1 de la presente invención como una muestra, en la que la LDL oxidada es preparada mediante liofilización de LDL oxidada con cobre y luego disolviendo la LDL en seco mediante un método prescrito.

La figura 2 es un diagrama que compara las determinaciones obtenidas de la muestra preparada conservando a 4ºC la LDL oxidada obtenida en el Ejemplo comparativo 1 de la presente invención, en la que la LSL oxidada es preparada liofilizando la LDL oxidada con cobre ("LDL oxidada estándar"), y disolviendo la LDL con intervalos establecidas por un método prescrito, y las determinaciones con intervalos predeterminados obtenidos a partir de la muestra preparada conservando la LDL oxidada con cobre a 4ºC sin ser liofilizada ("LDL oxidada para comparación").

La figura 3 es un diagrama que muestra la curva de calibración producida con HDL oxidada obtenida en el Ejemplo comparativo 2 de la presente invención como una muestra, en la que la HDL oxidada es preparada liofilizando HDL oxidada con cobre y luego disolviendo la HDL en seco mediante un método predeterminado.

La figura 4 es un diagrama que compara las determinaciones obtenidas a partir de la muestra preparada conservando a 4ºC HDL oxidada, obtenida en el Ejemplo comparativo 2 de la presente invención, en la que la HDL oxidada es preparada liofilizando HDL oxidada con cobre ("HDL oxidada estándar"), y disolviendo la HDL con intervalos predeterminados por un método prescrito, y las determinaciones a intervalos predeterminados obtenidas a partir de la muestra preparada conservando HDL oxidada con cobre a 4º son ser liofilizada ("HDL oxidada para comparación").

La figura 5 es un diagrama que muestra la curva de calibración producida con la lipoproteína oxidada a [Lp(a)] obtenida en el Ejemplo comparativo 3 de la presente invención como una muestra, en la que la Lp(a) oxidada es preparada liofilizando LDL oxidada con cobre y luego disolviendo la Lp(a) en seco mediante un método predeterminado.

La figura 6 es un diagrama que compara las determinaciones obtenidas a partir de la muestra preparada conservando Lp(a) oxidada obtenida en el Ejemplo comparativo 3 de la presente invención a 4ºC en la que la Lp(a) oxidada es preparada liofilizando la Lp(a) oxidada con cobre ("Lp(a) oxidada estándar"), y disolviendo la Lp(a) con intervalos predeterminados mediante un método prescrito, y las determinaciones a intervalos predeterminados obtenidas a partir de la muestra preparada conservando la Lp(a) oxidada con cobre a 4ºC sin ser liofilizada ("Lp(a) oxidada para comparación").

La figura 7 es un diagrama que muestra la producción de lipoproteína desnaturalizada llevando a cabo un proceso que incluye una etapa de congelación de plasma sanguíneo tal como ha sido descrito en el Ejemplo 1.

La figura 8 es un diagrama para comparar las determinaciones (absorbencia) obtenidas en el Ejemplo comparativo 4 respectivamente de las muestras de suero sanguíneo humano estándar, congelado y desnaturalizado preparado en el Ejemplo comparativo 4 (2) y las muestras de LDL oxidada estándar preparadas en el Ejemplo comparativo 1 (3) ("LDL oxidada estándar") después de que las muestras hayan sido disueltas y calificadas en cuanto a estabilidad de conservación de acuerdo con el método ELISA.

La figura 9 es un diagrama que muestra la producción de lipoproteína desnaturalizada llevando a cabo un proceso que incluye una etapa de congelación de LDL humana en el Ejemplo 2.

La figura 10 es un diagrama para comparar las determinaciones (absorbencia) obtenidas en el Ejemplo 2 respectivamente de las muestras de LDL estándar desnaturalizada por congelación preparadas en el Ejemplo 2 (2) y las muestras de LDL oxidada estándar preparadas en el Ejemplo comparativo 1 (3) ("LDL oxidada estándar") después de que las muestras hayan sido disueltas y calificadas en cuanto a estabilidad de conservación de acuerdo con el método ELISA.

A continuación, se describirá la presente invención con detalle.

El primer aspecto de la presente invención consiste en dar a conocer un método para producir lipoproteína desnaturalizada estabilizada, que comprende las etapas de: congelar una solución que contiene lipoproteína para producir una solución congelada; y fundir la solución congelada para producir una solución que contenga lipoproteína desnaturalizada.

El término "lipoproteína desnaturalizada", como se usa en esta especificación, se refiere tanto a la lipoproteína desnaturalizada que ha sufrido un cambio químico como son la lipoproteína oxidada, la lipoproteína acetilada y la lipoproteína conjugada con malondialdehido obtenida por la acción del malondialdehido etc., como a la lipoproteína desnaturalizada que ha sufrido un cambio estructural tal como coagulación o cambio en la estructura tridimensional y también incluye tipos de lipoproteína desnaturalizada tales como los identificados por cambio en la carga eléctrica, cambio en el peso molecular, cambio en la afinidad para un receptor in vivo, y cambio en la capacidad para formar enlace con un anticuerpo específico de lipoproteína desnaturalizada (J. Bio. Chem. 1994, 269: 15274-15279 y la publicación de Patente JP-A-07-238,098) representada por el anticuerpo producido por FOH1a/DLH3 (Número de Depósito.: FERM BP-7171) en comparación con una lipoproteína sin desnaturalizar. La expresión "cambio en la capacidad para formar enlace con un anticuerpo específico de lipoproteína desnaturalizada representado por el anticuerpo producido por FOH1a/DLH3", tal como se ha mencionado anteriormente se refiere a la diferencia entre la magnitud de señal obtenida de un antígeno de lipoproteína sin desnaturalizar y la magnitud de señal obtenida de un antígeno de lipoproteína desnaturalizada en una operación llevada a cabo mediante la transformación de la lipoproteína sin desnaturalizar y la lipoproteína naturalizada según la presente invención cada una como un antígeno en una fase sólida insolubilizada, provocando que un anticuerpo pertinente reaccione con el antígeno solidificado, y detectando la cantidad de anticuerpo consecuentemente unida al antígeno solidificado convertida al contenido de la enzima por el uso de un anticuerpo de enzima estándar que posee especificidad respecto al anticuerpo.

La lipoproteína que se usa en la presente invención puede originarse en cualquiera de los organismos vivos. Pueden citarse como ejemplos concretos de la lipoproteína, las lipoproteínas que se originan en mamíferos tales como el hombre, la vaca, el caballo, la cabra, la oveja, el conejo, el perro y los conejillos de Indias; aves tales como las aves de corral y las codornices; peces tales como el salmón y el arenque; y microorganismos tales como las bacterias y los micetos. Además, pueden citarse como ejemplos concretos de la lipoproteína que se usa en la presente invención, lipoproteínas estructurales presentes en biomembranas, tal como la membrana celular, células mitocondriales, membranas de estructura mielínica, y membranas de células bacterianas; lipoproteínas solubles que ocurren en el plasma sanguíneo, la yema de huevo, y la leche; y fracciones de proteína obtenidas al fraccionar estas lipoproteínas antes mencionadas mediante la técnica de ultracentrifugado para quilomicrón , lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL), lipoproteína X, lipoproteína de densidad intermedia (IDL), lipoproteína a [Lp(a)], lipoproteínas de alta densidad (HDL), tal como HDL2 y HDL3, y lipoproteínas de muy alta densidad (VHDL). Estas lipoproteínas se pueden utilizar bien por separado o en forma de una combinación de dos o más elementos. De estas lipoproteínas, se usan preferentemente, quilomicrón, VLDL, LDL, LP(a), HDL2 o HDL3 de origen humano en el plasma sanguíneo o en el suero sanguíneo, y más preferentemente se utilizan mezclas de los mismos, y se usan mucho más preferentemente LDLs que se originan en el plasma sanguíneo y en el suero sanguíneo.

La lipoproteína humana que se usa típicamente en la presente invención se prepara separando una fracción con una densidad específica prescrita del suero de la sangre humana por medio de una técnica universalmente conocida como sedimentación por centrifugado o ultracentrifugado y purificando esta fracción por medio de un método hasta ahora conocido como diálisis o desalinización. Se pueden citar los siguientes métodos (1)-(3) como ejemplos concretos del método par la preparación de lipoproteína de baja densidad (LDL).

(1) En 20-30 ml de suero sanguíneo humano normal, se añade etilendiamina tetraacetato sódico (EDTA-2Na) hasta una concentración final de 1 mmol/l. La mezcla resultante se hace al añadir NaBr con ajuste a una densidad específica de 1,000. La mezcla producida se reparte en tubos de centrifugado, obteniéndose de este modo las partes de la mezcla en los respectivos tubos. Las soluciones tampón se ajustan con NaBr a diferentes niveles de densidad específica de 1,15, 1,063, 1,019, y 1,006, y se superponen respectivamente en las partes de mezcla en secuencia. A continuación los tubos que contienen las mezclas y los tampones se centrifugan juntos (120.000xg) a 4ºC durante 24 horas. Las fracciones que se forman consecuentemente se separan de modo secuencial de la superior a la inferior y se miden a densidad específica con un refractómetro para recoger las fracciones que tienen una densidad específica en el rango de 1,019-1,063 como fracciones LDL. Las fracciones LDL que se obtienen tal como se ha descrito antes se dializan, inmediatamente después de ser recogidas, con PBS [tampón fosfato de 10 mmol/l y NaCl (pH 7,4) de 140 mmol/l] que incluye 0,25 mmol/l EDTA (Publicación de Patente JP-A-07-238.098, párrafo Núm. 0040).

(2) Se añade EDTA al plasma sanguíneo humano heparinizado, hasta una concentración final de 0,25 mmol/l. El plasma sanguíneo preparado de este modo se distribuye en una unidad de volumen de 0,75 ml dentro de tubos de centrifugación (1-4 ml). Las partes del plasma sanguíneo en los respectivos tubos y 0,15 mol/l NaCl de 250 \mul que contienen 0,3 mmol/l EDTA y superpuestos en una unidad de volumen de 250 \mul en las partes se centrifugan juntos con 185.000xg a 10ºC durante 2,5 horas. Se descartan 150 \mul de la capa superior. Se cogen 750 \mul de la capa inferior y después se añaden 150 \mul de solución KBr (50% p/v) hasta una densidad específica de 1,063. Las muestras de plasma sanguíneo con la densidad específica ajustada se trasladan al fondo de los tubos de centrifugación (1-4 ml) y se centrifugan con 244.000xg a 10ºC durante 16 horas. La banda naranja en la capa superior (alrededor de 100-150 \mul) se recoge con cuidado y se dializa contra PBS que contiene 0,25 mmol/l EDT a 4ºC durante 6 horas (se sustituyen 3 litros de PBS dos veces con un intervalo de dos horas) (Publicación de Patente JP-A-08-304.395, párrafo Núm. 0050); o

(3) Del plasma sanguíneo humano obtenido con EDTA como un agente anticoagulante, se recoge la parte que tiene densidad específica 1,019-1,063 como una fracción LDL por la técnica de centrifugado. La fracción de LDL, después de haberse verificado la pureza de la misma por la formación de una simple banda nítida en el análisis por electroforesis agarosa, se dializa completamente contra una solución PBS (pH 7,4) que contiene 0,25 mmol/l EDTA (Publicación de Patente JP-A-09-288.106, párrafo Núm. 0062).

A continuación, puede citarse como un ejemplo concreto del método para preparar lipoproteína [Lp(a)], por ejemplo, el siguiente método: al plasma sanguíneo humano heparinizado, se añade EDTA hasta una concentración final de 0,25 mmol/l. La muestra de plasma sanguíneo así preparada y 250 \mul de 0,15 mol/l NaCl que contienen 0,3 mmol/l EDTA y superpuestos en la muestra, se centrifugan juntos con 105.000xg a 8ºC durante 20 horas. Se descarta la capa superior. En la capa inferior, se disuelve KBr pulverizado previamente en un mortero hasta una densidad final específica de 1,125 al tiempo que se evita la formación de burbujas. La solución resultante se centrifuga a 105.000xg a 8ºC durante 20 horas. Se recoge con cuidado la banda naranja en la capa superior y a continuación se somete a filtración por gel con Biogel A-5m (Bio-rad Corp.) con 1 mol/l NaCl, 2 mmol/l EDTA, y 10 mmol/l de tampón de fosfato como disolvente de revelado. Las fracciones obtenidas consecuentemente se evalúan cada una con un kit de medición de Lp(a) (fabricado por Termo K.K) para recoger la fracción de Lp(a). Esta fracción se trata con lisina sefarosa 4B (Farmacia Corp.). La fracción adsorbida de la misma se eluye con un tampón que contiene 0,2 mol/l de ácido \varepsilon-aminocapróico y se dializa contra PBS que contiene 0,25 mmol/l EDTA (Publicación de Patente JPPP-A-08-304.395, párrafo Num. 0052).

Pueden citarse como ejemplos conocidos del método para desnaturalizar la lipoproteína humana, que no forman parte del ámbito de la presente invención, por ejemplo, un método que consiste en oxidar la lipoproteína humana en presencia de un ión metálico, un método que consiste en acetilar la lipoproteína humana, un método que consiste en incorporar aldehído a la lipoproteína humana por el uso de malondialdehido, y un método que consiste en añadir a la lipoproteína humana una solución disuelta en un compuesto obtenido al oxidar artificialmente dicha lipoproteína tal como 1-palmitoil-2-(9-oxononanoil)-glicerol-3-fosfocolina y 1-palmitoil-2-(5-oxovaleroil)-glicerol-3-fosfocolina en un disolvente apropiado como el DMSO. De los métodos antes enumerados, se usan favorablemente el método que consiste en oxidar la lipoproteína humana en presencia de un ión metálico, el método que consiste en acetilar la lipoproteína humana, y el método que consiste en incorporar aldehído en la lipoproteína humana por el uso de malondialdehido.

A continuación se describirán con detalle los tres métodos preferidos mencionados con anterioridad.

En primer lugar, se describirá con detalle la forma de oxidar la lipoproteína humana en presencia de un ión metal. Un ejemplo del modo antes mencionado se describirá a continuación: en la lipoproteína humana (fracción) que se ha preparado tal como se ha descrito anteriormente se elimina EDTA al dializarla contra un tampón que no contiene EDTA [por ejemplo, PBS (pH 7,4)] y se ajusta a un contenido de proteína prescrito (50-2000 \mug/ml, preferentemente 100-500 \mug/ml). Para esto se añade sulfato de cobre (CuSO_{4}) hasta una concentración prescrita y a continuación se deja reaccionar con él a una temperatura en el rango aproximado de 36 a 38ºC.

Pueden citarse como ejemplos concretos de iones metálicos usados en el método mencionado anteriormente, iones de cobre que tienen su origen en floruro de cobre (II) dihidratado, bromuro de cobre (II), óxido de cobre (II), hidróxido de cobre (II), sulfato de cobre (II), sulfato de cobre (II) pentahidratado, seleniuro de cobre (I), seleniuro de cobre (II), seleniuro de cobre (II) pentahidratado, hexafluorosilicato de cobre (II) tetrahidratado, acetato de cobre (II) monohidratado, sulfato de tetraamina de cobre (II) monohidratado y bis (etilendiamina) sulfato de cobre (II) dihidratado; iones de hierro que tienen su origen en cloruro de hierro (II), bromuro de hierro (II) hexahidratado, nitrato de hierro (II) hexahidratado, tiocianato de hierro (II) trihidratado, acetato de hierro (II) tetrahidratado, oxalato de hierro (III) pentahidratado, sulfato de amonio y hierro (II) hexahidratado, sulfato de potasio y hierro dodecahidratado, sulfato de amonio y hierro (II) dodecahidratado, y sulfato de hierro; iones metálicos de hemoglobina (Hb), transferrina (Tf), y lactoferrina (Lf) y mezclas de los mismos. Entre otros iones metálicos enumerados anteriormente, se usan preferentemente los iones cobre que se originan en sulfato de cobre (II) y sulfato de cobre (II) pentahidratado y las mezclas de los mismos. Estos iones metálicos se pueden utilizar bien por separado o en forma de una combinación de dos o más elementos.

La cantidad de ión metálico que se utiliza en el modo antes descrito no necesita ser especialmente especificada, sino que sólo se requiere de ella que permita la total oxidación de la proteína humana. Puede ser tal que la concentración del ión metálico esté en el rango de 10-200 \mumoles/l, preferentemente en el rango 25-100 \mumoles/l, en base a 1 g de la lipoproteína humana que se vaya a oxidar.

En el método antes descrito, si el tiempo de reacción es excesivamente corto, la brevedad será una desventaja al impedir que la desnaturalización (oxidación) de la lipoproteína se efectúe suficientemente. En cambio, si el tiempo de reacción es excesivamente largo, el exceso será una desventaja al hacer que la lipoproteína misma se descomponga excesivamente y conlleve la pérdida de la propiedad antígena de la apoproteína, por ejemplo. Aunque el tiempo de reacción generalmente no puede definirse porque varía con la cantidad de EDTA residual y la cantidad total de la solución, está en el rango de 1 a 24 horas, preferentemente en el rango de 1 a 24 horas, preferentemente de 2 a 4 horas, a temperaturas de aproximadamente 36ºC-38ºC en el caso de la lipoproteína (fracción) preparada del modo antes descrito.

En segundo lugar, el modo de acetilación de la lipoproteína humana se describirá a continuación con detalle. Un ejemplo de este modo se describirá a continuación: la solución de la lipoproteína humana (fracción) preparada en una concentración de proteína prescrita (aproximadamente 500-2000 \mug/ml, preferentemente 500-1000 \mug/ml), tal como se ha descrito anteriormente, y acetato de sodio saturado etc., añadido a ésta en un volumen igual a la misma, se mezclan a 0ºC-4ºC durante 1-2 horas. A continuación, la mezcla resultante y el anhídrido acético añadido a esta en un volumen en el rango de 0,25 a 4 \mul (es decir, 0,5-2 \mul/mg, en base a la cantidad de lipoproteína humana) preferentemente en el rango de 0,4 a 2,4 \mul (es decir, 0,8-1,2 \mul/mg), en base a la cantidad de lipoproteína humana) se mezclan a 0ºC-4ºC durante 60-120 minutos. A continuación, la mezcla producida se dializa completamente contra PBS (pH 7,4) que contiene 0,25 mmol/l de EDTA en una proporción de 500 a 1000 veces el volumen de la mezcla producida, a 2ºC-8ºC, dos o tres veces durante no menos de dos horas cada vez.

En tercer lugar, el modo de incorporar aldehído a la lipoproteína humana mediante el uso de malondialdehido se describirá a continuación con detalle. Un ejemplo del modo antes citado se describirá a continuación: la solución de lipoproteína humana (fracción) preparada tal como se ha descrito anteriormente en una concentración de proteína prescrita (aproximadamente 0,25-1 mg/ml, preferentemente 0,25-0,5 mg/ml) en un tampón fosfato (pH 6,5) de 0,1 mol/l y una solución malondialdehido (obtenida al hidrolizar termalmente 1 mol/l de malondialdehido bisdimetil acetal a 100ºC durante cinco minutos en presencia de 0,1 mol/l de ácido clorhídrico) añadida a este en un volumen en el rango de 0,625-10 \mul (es decir, 2,5-10 \mul/mg, en base a la cantidad de lipoproteína humana), preferentemente en el rango de 1-6 \mul (es decir, 4-6 \mul/mg, en base a la cantidad de la lipoproteína humana) se dejan reaccionar entre sí a 30ºC-40ºC durante 2-4 horas. La solución de reacción resultante se dializa completamente contre PBS (pH 7,4) que contiene 0,25 mmol/l de EDTA en una proporción de 500 a 1000 veces el volumen de la mezcla producida, a 2º-8º, dos o tres veces durante no menos de dos horas cada vez.

El método contemplado por la presente invención puede además incluir una etapa para liofilizar la lipoproteína desnaturalizada obtenida tal como se menciona anteriormente con el fin de estabilizar el producto. En la presente descripción, el término "liofilización" se utiliza con el significado tal como se utiliza en el campo pertinente. Específicamente, se refiere a congelar una muestra dada, descomprimir la muestra tal como se guarda en estado de congelación, y eliminar el agua y un componente de sublimación de la muestra hasta que se seque. Las condiciones para la liofilización en la presente invención no necesitan fijarse específicamente, sino que solo se requiere que permitan estabilizar la lipoproteína desnaturalizada. La liofilización se lleva a cabo generalmente a una temperatura en el rango de -80ºC-20ºC, preferentemente en el rango de -80ºC-15ºC, a una presión en el rango de 0,667-13,33 Pa, preferentemente en el rango de 0,667-1,333 Pa, durante un período en el rango de 12 a 72 horas, preferentemente en el rango de 24 a 72 horas. Mediante esta etapa de liofilización, el contenido de agua en el producto liofilizado que contiene la lipoproteína desnaturalizada se hace caer generalmente no más del 10% de la masa, preferentemente no más del 1% de la masa.

En la presente invención, la etapa de liofilización se realiza preferentemente en presencia de un agente estabilizador. El agente estabilizador que se utiliza en el modo de realización antes descrito es el mismo agente estabilizador que se utiliza generalmente en el campo pertinente. Pueden citarse como ejemplos concretos de agente estabilizador, azúcares tales como sacarosa, lactosa y trehalosa; y proteínas tales como seroalbúmina de sangre bovina (BSA) y seroalbúmina de sangre humana (HSA). Entre estas sustancias se utilizan preferentemente, como agentes estabilizadores, sacarosa, lactosa, trehalosa, seroalbúmina de sangre bovina (BSA) y seroalbúmina de sangre humana (HSA). A este respecto, los agentes estabilizadores antes mencionados se pueden utilizar bien por separado o en forma de una mezcla de dos o más elementos. Aunque la cantidad del agente estabilizador que se utiliza no necesita fijarse específicamente, sino que sólo se requiere que permita estabilizar la lipoproteína desnaturalizada, está generalmente en el rango de 1-20% de la masa, preferentemente en el rango de 2-5% de la masa.

En la presente invención, la temporización de la adición de un agente estabilizador durante el transcurso de la liofilización, que se espera que continúe en la presencia del agente estabilizador, no necesita fijarse específicamente. La incorporación del agente estabilizador generalmente precede a la etapa de liofilización y preferentemente interviene entre la etapa de desnaturalización y la etapa de liofilización. Además, la etapa de liofilización no necesita ir necesariamente seguida por ninguna etapa que elimine la lipoproteína congelada del agente estabilizador. En consideración de la estabilidad de la preservación de la lipoproteína desnaturalizada, la presencia continuada del agente estabilizador mientras se mantiene el estado liofilizado resulta más preferible que su ausencia.

Los presentes inventores han descubierto que la lipoproteína desnaturalizada obtenida al someter la solución que contiene lipoproteína a un proceso que incluye al menos una operación de congelado, desnaturalizando de este modo la lipoproteína contenida en la solución, también puede utilizarse como una sustancia estándar con el fin de determinar la masa de lipoproteína desnaturalizada en sangre y como un reactivo para investigar el papel fisiológico y la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada y que, cuando la lipoproteína desnaturalizada obtenida tal como se ha descrito anteriormente además se liofiliza, la lipoproteína desnaturalizada destaca en estabilidad de preservación prolongada en estado seco, y la lipoproteína desnaturalizada, en estado seco, al disolverse en una solución goza de estabilidad de preservación. Los métodos del aspecto antes mencionado se han concebido en base a este conocimiento.

El método del primer aspecto de la presente invención necesita esencialmente incluir una etapa para congelar la solución que contiene lipoproteína. Se pueden citar como ejemplos concretos de solución que contiene lipoproteína, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, y quilomicrones y fracciones de lipoproteína tales como lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), lipoproteína de baja densidad (LDL), lipoproteína X, lipoproteína de densidad intermedia (IDL), lipoproteína a [Lp(a)], lipoproteínas de alta densidad (HDL) como HDL2 y HDL3, y lipoproteínas de muy alta densidad (VHDL). Entre las soluciones antes enumeradas, se utilizan, más preferentemente, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, quilomicrones, VLDL, LDL, Lp(a), HDL2, HDL3 y mezclas de las mismas, y se utilizan mucho más preferentemente como soluciones que contienen lipoproteínas: plasma sanguíneo humano, suero sanguíneo humano y LSLs que se originan en el plasma sanguíneo humano y en el suero sanguíneo humano.

El método según el primer aspecto de la presente invención requiere esencialmente someter la solución que contiene lipoproteína a un proceso que incluye una etapa de congelación. En la presente descripción, el término "proceso que incluye al menos una etapa de congelación" se refiere a un proceso que incluye al menos una etapa de congelación de parte o de todo el componente acuoso en la lipoproteína contenida en la solución o en el entorno que rodea sustancialmente a la lipoproteína. La lipoproteína desnaturalizada que se obtiene al llevar a cabo el proceso que incluye la etapa de congelación, tal como se contempla en la presente invención, puede ser cualquiera de las lipoproteínas desnaturalizadas enumeradas anteriormente. La lipoproteína desnaturalizada que se obtiene al llevar a cabo el proceso que incluye la etapa de congelación según la presente invención puede ser lipoproteína oxidada, lipoproteína obtenida al incorporar aldehído, o lipoproteína que reacciona con el anticuerpo producido por una línea celular hibridoma FOH1a/DLH3 (Núm. de Depósito: FERM BP-7171) (al que ocasionalmente se hace referencia simplemente como "anticuerpo DLH3"). La línea celular hibridoma FOH1a/DLH3 que se usa en el método descrito anteriormente se depositó el 17 de febrero de 1994 con el Núm. de Depósito FERM P-14153 en el "National institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of the Ministry of International Trade and Industry" ("Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial del Ministerio de Industria y Comercio") sito en 1-1-3, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón, bajo la denominación "Mouse-Mouse hybridoma FOH1a/DLH3" ("hibridoma ratón-ratón FOH1a/DLH3", siendo dicho depósito trasladado el 26 de mayo de 2000 al depósito basado en el Tratado de Budapest, y permanece almacenado en el instituto con el Núm. de Depósito FERM BP-7171.

Las condiciones para el proceso que incluye la etapa de congelación que se realiza en la solución que contiene lipoproteína con intención de desnaturalizar la lipoproteína en la presente invención, no necesitan limitarse especialmente sino que solo se requiere que puedan desnaturalizar la lipoproteína contenida en la solución. Además, el proceso que incluye la etapa de congelación no puede fijarse generalmente porque el efecto de congelación está muy influenciado por el medio que rodea sustancialmente la lipoproteína durante el proceso de congelación. Se espera que las condiciones para la congelación, en el proceso que incluye la etapa de congelación, por ejemplo, permitan un procedimiento que comprenda una disminución de temperatura a una velocidad de disminución de la temperatura en el rango de 0,01ºC a 10ºC/min, preferentemente en el rango de 0,01ºC a 1ºC/min hasta que alcanza un nivel en el rango de 0ºC a -196ºC, preferentemente en el rango de -5ºC a -85ºC y se congela, y se mantiene entonces una temperatura prescrita por un período en el rango de 0 a 36 horas, preferentemente en el rango de 0 a 16 horas. En una realización, es preciso que el proceso que incluye la etapa de congelación con el fin de desnaturalizar lipoproteína se realice al menos una vez y, cuando sea necesario, que se pueda repetir. Cuando se repite el proceso que incluye la etapa de congelación, el número de repeticiones adecuado está en el rango de 1 a 10, preferentemente en el rango de 1 a 4. En la presente invención, los contenidos de los procesos que se repiten pueden ser iguales o diferentes en cada etapa de congelación. Las condiciones para la etapa de congelación en cada uno de los procesos pueden ser iguales o diferentes. Si el número de repeticiones de la etapa de liofilización es superior a 10, el exceso será una desventaja económica al provocar disminución del efecto de desnaturalización de la lipoproteína.

El proceso que incluye la etapa de congelación que tiene como finalidad desnaturalizar la proteína en el primer aspecto de la invención descrita anteriormente incorpora en él una etapa de fusión después de la etapa de congelación. No necesitan limitarse las condiciones de congelación de un modo especial. La fusión se obtiene al elevar la temperatura a una velocidad de aumento de temperatura en el rango de 0,01ºC a 10ºC/min, preferentemente en el rango de 0,1ºC a 10ºC/min hasta alcanzar un nivel en el rango de 0ºC a 42ºC, preferentemente en el rango de 0ºC a 37ºC.

El proceso que incluye la etapa de congelación con el fin de desnaturalizar lipoproteínas de acuerdo con el primer aspecto de la invención descrita anteriormente, puede ser un tipo de proceso tal que incluya una etapa de secado en el transcurso del proceso. No es necesario limitar de un modo especial las condiciones del proceso que incluye la etapa de secado después de la etapa de congelación. El secado se lleva a cabo, por ejemplo, a una temperatura en el rango de -80ºC a 20ºC, preferentemente en el rango de -80ºC a 15ºC, a una presión en el rango de 0,6 a 13 Pa, preferentemente en el rango de 0,6 a 1,3 Pa, durante un período en el rango de 12 a 72 horas, preferentemente en el rango de 24 a 72 horas.

Un proceso que incluye la etapa de congelación con el fin de desnaturalizar lipoproteínas, puede ser un tipo de proceso tal que comprenda liofilizar una solución que contiene la lipoproteína, disolver la solución seca resultante en un disolvente, y posteriormente liofilizar de nuevo la solución producida. Un proceso de ese tipo no se incluye dentro del ámbito de la presente invención. La etapa de liofilización involucrada en este caso tiene la misma definición que la descrita anteriormente. El disolvente para disolver el producto obtenido en la primera liofilización no necesita ser limitado de modo especial, sino que sólo es necesario que pueda disolver el producto seco. Pueden citarse como ejemplos concretos de disolvente: agua, agua desionizada y agua destilada.

El método según el primer aspecto de la presente invención puede además comprender la liofilización de la lipoproteína obtenida por el método del primer aspecto de la presente invención descrita anteriormente y consecuentemente la estabilización de la lipoproteína desnaturalizada. La etapa de liofilización según el aspecto descrito anteriormente tiene la misma definición que en el primer aspecto, con la excepción de la temporización de la adición del agente estabilizador. Para ser más concreto, el agente estabilizador varía según los contenidos del proceso que incluye la etapa de liofilización en el primer aspecto. Cuando el proceso que incluye la etapa de congelación se realiza en la solución que contiene la lipoproteína desnaturalizada, por ejemplo, la adición del agente estabilizador puede preceder al proceso que incluye la etapa de congelación o intervenir entre la etapa de congelación, que tiene como finalidad desnaturalizar lipoproteínas, y la etapa de liofilización que tiene como finalidad estabilizar la lipoproteína desnaturalizada. Cuando la solución que contiene la lipoproteína desnaturalizada va a ser congelada, es preferible añadir el agente estabilizador antes que el proceso que incluye la etapa de congelación.

El segundo aspecto de la presente invención consiste en dar a conocer lipoproteína desnaturalizada estabilizada que se produce mediante el primer aspecto de la invención anteriormente descrita.

La lipoproteína desnaturalizada y la lipoproteína desnaturalizada estabilizada que se producen de ese modo mejoran en estabilidad de conservación prolongada y, por lo tanto, resultan útiles como sustancia estándar utilizada en un método para calcular la lipoproteína desnaturalizada contenida en un componente sanguíneo al hacer que una muestra dada contacte con un anticuerpo capaz de reconocer la lipoproteína desnaturalizada y medir la reactividad del anticuerpo con la muestra o como un reactivo experimental variable para investigar el papel fisiológico o la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada.

El tercer aspecto de la presente invención, por lo tanto, da a conocer un método para calcular la lipoproteína desnaturalizada en una muestra, y comprende las etapas de: selección de una lipoproteína desnaturalizada estable, según el segundo aspecto, como una sustancia estándar; formación de una curva de calibración usando concentraciones prescritas de una sustancia estándar; reacción de la muestra con un anticuerpo que enlaza con la lipoproteína desnaturalizada; y medición de la reactividad del anticuerpo con la muestra. El cuarto aspecto de la presente invención consiste en dar a conocer un kit reactivo para el cálculo de lipoproteína desnaturalizada que contiene lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con el segundo aspecto descrito anteriormente como una sustancia estándar.

El método para calcular la lipoproteína desnaturalizada en el tercer aspecto descrito anteriormente puede seleccionarse de entre los métodos útiles conocidos hasta ahora para el fin de la invención. Pueden citarse como ejemplos concretos del método, métodos tales como radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo de enzimas (ELISA), inmunoensayo de fluorescencia (FIA), inmunoensayo luminiscente, inmunoensayo de aglutinación, inmunonefelometría, e inmunoensayo nefelométrico, que son indicadores inmunológicos de lipoproteína desnaturalizada contenida en un componente sanguíneo obtenidos al hacer que una muestra dada haga contactar la lipoproteína con un anticuerpo capaz de reconocer la lipoproteína desnaturalizada y medir la reactividad del anticuerpo con la muestra. Pueden citarse como métodos de medición, el ensayo competitivo y la técnica "sandwich". Entre los métodos anteriormente mencionados, los métodos tales como radioinmunoensayo, inmunoensayo de enzimas, inmunoensayo de fluorescencia, e inmunoensayo luminescente que afectan a la determinación inmunológicamente, permiten el uso particularmente favorable de la lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con la presente invención como una sustancia estándar.

En el cuarto aspecto de la invención antes mencionada, el kit reactivo para la determinación de lipoproteína desnaturalizada no necesita estar particularmente fijado, sino que sólo se requiere de él que contenga lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con la presente invención como sustancia estándar. Este equipo o kit reactivo tiene la misma estructura que el kit conocido, excepto que utiliza la lipoproteína desnaturalizada estabilizada, según la presente invención, como sustancia estándar. Cuando la lipoproteína desnaturalizada estabilizada contemplada por la presente invención se usa como sustancia estándar en el método ELISA, por ejemplo, este kit reactivo comprende un líquido de disolución para una muestra, una fase sólida formada mediante la inmovilización de un anticuerpo, un tampón de reacción, una solución de lavado, un anticuerpo secundario marcado (preferiblemente un anticuerpo secundario con marca de enzima), un reactivo detector (por ejemplo, un fluido colorante), y la totalidad o una parte de la lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con la presente invención como una sustancia estándar. El modo de realización que acaba de describirse se acoge también al concepto de la presente invención. El cuarto aspecto de la presente invención, por lo tanto, da a conocer también un kit reactivo para la determinación de lipoproteína desnaturalizada, el cual comprende un líquido de disolución para una muestra, una fase sólida formada mediante la inmovilización de un anticuerpo, un tampón de reacción, una solución de lavado, un anticuerpo secundario marcado, un reactivo detector, y la totalidad o una parte de lipoproteína desnaturalizada estabilizada de acuerdo con el segundo aspecto producido como sustancia estándar como elementos que lo componen.

En el cuarto aspecto de esta invención previamente descrita, cuando la sustancia estándar no está contenida en el kit reactivo pero se mantiene en la precondición de que será sustancialmente utilizada en un kit, la sustancia estándar de acuerdo con la presente invención debe ser reconocida como elemento que compone el kit reactivo.

A continuación, el método para la producción de lipoproteína desnaturalizada de acuerdo con la presente invención y el efecto de la misma serán descritos de manera más concreta, con referencia a los siguientes ejemplos de trabajo relacionados con el método ELISA para la determinación de la actividad de lipoproteína desnaturalizada. Por supuesto, la presente invención no se ha de limitar a los siguientes ejemplos de trabajo.

Ejemplo comparativo 1

(1) Preparación de LDL

Del plasma sanguíneo humano obtenido usando EDTA como anticoagulante, una parte con densidad específica en el rango de 1,019-1,063 se recoge como fracción de LDL mediante la técnica de ultracentrifugado (mediante el ajuste de una muestra dada a una densidad específica de 1,019 a 10ºC, centrifugando la muestra con 120.000xg durante 20 horas, recogiendo el sobrenadante formado consecuentemente, ajustando el sobrenadante a una densidad específica de 1,063, y posteriormente centrifugándolo con 120.000xg durante 24 horas). En este caso, la pureza de la LDL se confirma mediante el hecho de que la muestra forma una única y clara banda cuando se evalúa mediante la técnica de electroforesis agarosa.

A continuación, esta fracción de LDL se purifica mediante su diálisis completa durante 16 horas o toda una noche contra PBS (pH 7,4) que contiene 0,25 mmol/l de EDTA. La LDL purificada, tal como se ha descrito anteriormente se disuelve en PBS (pH 7,4) que contiene 0,25 mmol/l de EDTA, hasta que la concentración de proteína LDL llega a 1 mg/ml, y se preserva en estado de disolución a 4ºC hasta su posterior uso. En el presente ejemplo, la masa de proteína se determina mediante el método de Lowry modificado. Para más precisión, esta determinación se lleva a cabo mediante la preparación de un reactivo mezclando una solución que contiene 2%(p/v) de carbonato sódico, 0,4%(p/v) de hidróxido sódico, 0,16%(p/v) de ácido tartárico, 1%(p/v) de SDS y una solución que contiene 4%(p/v) de sulfato de cobre y una proporción 100:1, mezclando este reactivo de 1,5 ml respectivamente con unas muestras dadas o una sustancia estándar (BSA) de 0,5 ml de volumen, permitiendo que los componentes relevantes reaccionen a la temperatura ambiente durante 20 minutos, mezclando inmediatamente la reacción resultante con 0,15 ml de reactivo fenol, permitiendo que reaccionen a temperatura ambiente durante 45 minutos, y midiendo la reacción producida por absorción a 660 nm.

(2) Oxidación de LDL

Se elimina el EDTA de la LDL preparada en (1) dializando no menos de 3 veces (durante no menos de dos horas cada vez) contra un volumen no inferior a 500-1000 veces el volumen de PBS (pH 7,4) que no contiene EDTA y se disuelve después en PBS (pH 7,4) que no contiene EDTA hasta que la concentración de LDL llega a los 200 \mug/ml. A continuación, 10 ml de la solución LDL resultante y sulfato de cobre (CuSO_{4}) añadido a la misma hasta que la concentración final llega a 5 \mumoles/l, se dejan incubando a 37ºC durante tres horas para llevar a cabo la oxidación de la LDL. Para añadir EDTA a la solución hasta que la concentración final de EDTA llega a 1 mmol/l, se detiene la oxidación. Se elimina el CuSO_{4} de la solución, dializando no menos de tres veces (durante no menos de dos horas cada vez) contra un volumen no menor a 500-1000 veces el volumen de PBS (pH 7,4) que contiene 1 mmol/l de EDTA. La LDL oxidada así preparada se preserva a 4ºC.

En el presente ejemplo de trabajo, la expresión de la cantidad de LDL oxidada se define por la masa de proteína del LDL como material de partida.

(3) Preparación de producto liofilizado de una LDL oxidada

La LDL oxidada preparada en (2) se diluye con PBS (pH 7,4) hasta que la concentración de la proteína llega a 6,25 ng/ml en una parte (referida como de "tipo L") y 12,5 ng/ml en otra parte (referida como de "tipo H"). Los dos tipos son cada uno bien mezclado con BSA añadido a éstos, hasta que la concentración final llega a 2%(p/v) y se añade sacarosa hasta que la concentración final llega a 5%(p/v) respectivamente. A continuación, las soluciones mezcla producidas son cada una dispensada un volumen de unidad de 1 ml en viales de vidrio, congeladas por el uso de un aparato de liofilización al vacío, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) a -50ºC durante 16 horas, liofilizadas a 20ºC a una presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expeler el componente acuoso, a continuación detenidas, y preservadas a 4ºC. En este momento, cada uno de los contenidos de agua de los productos liofilizados tiene un 0,8% de masa.

(4) Formación de la curva de calibración con el producto de liofilización de la LDL oxidada como sustancia estándar a. Producción de anticuerpo marcado con peroxidasa

Un (1) ml de solución (5 mg/ml de concentración en 0,1 mol/l de tampón borato, pH 8,0) de anticuerpo apo-B anti-humano purificado (cabra, Nippon Chemi-con Corp.) y 50 \mul de solución 2-iminotiolan-HCl (60 mmol/l de concentración en 0,1 mol/l de tampón borato, pH 8,0) añadidos a la solución, se dejan reaccionando entre ellos a 30ºC durante 30 minutos. La solución de reacción resultante se trata con una columna G-25 de sefadex (1 cm x 30 cm) (Pharmacia Corp.) equilibrada con 0,1 mol/l de tampón fosfato (pH 6,0) que contiene 5 mmol/l de EDTA. Se recoge la fracción de anticuerpo eludida por la columna. Un (1) ml de solución (10 mg/ml en concentración en 0,1 mol/l de tampón fosfato, pH 7,0) de peroxidasa de rábano (de aquí en adelante abreviada como "HRP", Toyobo K.K.) y 50 \mul de solución EMCS (50 mmol/l de solución DMSO, Dojin Kagakusha K.K.) añadida a ella, se dejan reaccionar entre si a 30ºC durante 30 minutos. La solución de reacción resultante se trata con una columna G-25 de sefadex (1 cm x 30 cm) (Pharmacia Corp.) equilibrada con 0,1 mol/l de tampón fosfato (pH 6,5). Se recoge la fracción de HRP eludida de la columna. La fracción de anticuerpo y la fracción de HRP recogida tal como se ha descrito anteriormente se mezclan y se dejan reaccionando entre si a 30ºC durante 30 minutos. La solución de reacción resultante se trata con una columna G-200 de sefadex (1 cm x 100 cm) (Pharmacia Corp.) equilibrada con 0,1 mol/l de tampón fosfato (pH 7,0). Las fracciones del anticuerpo conjugadas con HRP eludidas de la columna se mezclan y se recogen. La masa recogida como consecuencia se designa como "anticuerpo apo-B antihumano con marca de peroxidasa". La fracción recogida se diluye inmediatamente con BSA hasta que la concentración final llega a 1%(p/v) y se preserva en estado diluido a -50ºC hasta su uso.

b. Preparación de anticuerpo DLH3

Ratones Balb/c macho no menores de 8 semanas fueron criados durante dos semanas después de la administración intraabdominal de pristane (2,6,10,14-tetrametilpentadecano) con una dosis de 0,5 ml/individuo. Luego, se administró a cada uno de los ratones por vía intraabdominal una línea celular hibridoma FOH1a/DLH3, una célula capaz de producir el anticuerpo monoclonal requerido (Depósito Nº FERM BP-7171; J. Biol. Chem. 1994, 296: 15274-15279; y Publicación de Patente JP-A-07-238.098) con una dosis de 1x10^{6}/individuo. 7 a 10 días después, cuando cada uno de los ratones hubo acumulado ascitis ampliamente en el abdomen, la ascitis fue recuperada del abdomen utilizando una jeringa 18G y centrifugada a 300 rpm durante 10 minutos. A continuación se recuperó el sobrenadante. Se añadió una cantidad igual de PBS (pH 7,4) a dicho sobrenadante. A la mezcla producida se añadió gota a gota una solución de sulfato de amonio saturado en igual cantidad, durante un período de una hora manteniendo la agitación. La mezcla resultante se mantuvo con agitación adicional durante una hora y luego fue centrifugada a 3000 rpm durante 10 minutos para descartar el sobrenadante y recuperar el sedimento. Además, el sedimento fue disuelto en PBS (pH 7,4) conteniendo 0,5 mol/l de NaCl. La solución producida de este modo fue tratada con una columna Sephacryl S-300 (2,5 cm x 100 cm) (Pharmacia Corp.) equilibrada con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,5 mol/ de NaCl para recuperar una fracción de IgM, que fue designada como "anticuerpo DLH3". La concentración del anticuerpo DLH3 (mg/ml) fue determinada midiendo la absorbencia de una muestra determinada a 280 nm en una trayectoria de luz de 1 cm de longitud y dividiendo la absorbencia obtenida por 1,3.

c. Análisis ELISA sandwich

El producto liofilizado de LDL oxidizada preparado en (3) fue disuelto en 1 ml de agua purificada y luego diluido con PBS conteniendo 1 (p/v) % de BSA hasta obtener determinadas concentraciones variables (0 ng/ml, 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml, 12,5 ng/ml, y 25 ng/ml).

En los pocillos individuales de una microplaca 96F (NALGE NUNC Internacional K.K.), el anticuerpo DLH3 preparado anteriormente en el apartado "b" y diluido con Tris-HCl (pH 8,0) hasta 10 \mug/ml, fue dispensado en una cantidad unitaria de 1 \mug/pocillo e incubado a 4ºC durante 16 horas. La solución de anticuerpo formada en los pocillos fue descartada. El residuo en cada uno de los pocillos fue bloqueado mediante incubación junto con 350 \mul de Tris-HCl (pH 8,0) conteniendo 1 (p/v) % de BSA a temperatura ambiente durante dos horas. La solución de anticuerpo bloqueado fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

La solución diluida conteniendo el producto liofilizado de LDL oxidada de una concentración prescrita preparada tal como ha sido descrito anteriormente en el presente documento, fue dispensada en un volumen unitario de 100 \mul en los pocillos individuales, incubada a temperatura ambiente durante dos horas, y luego lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

Se colocó en los pocillos individuales 100 \mul de la solución obtenida mediante dilución de peroxidasa marcada o etiquetada como anticuerpo apo-B anti-humano preparada en el apartado "a" con PBS (pH 7,4) conteniendo 1 (p/v) % de BSA hasta un volumen 1000 veces mayor que el volumen original, e incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución incubada fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20 y luego se dejó que adquiriera coloración durante 30 minutos con 100 \mul de 0,03 (p/v) % de una solución de peróxido de hidrógeno acuoso conteniendo 3 mg/ml de o-fenilendiamina (Wako Pure Chemical Industries Ltd.). La reacción desarrollándose aún en la solución fue interrumpida mediante la adición de 50 \mul de 1 mol/l de ácido sulfúrico. A continuación, se midió la absorbencia de la solución a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 1. Mediante la utilización del producto liofilizado de LDL oxidada de la presente invención, se pudo formar una curva de calibración precisa tal como la que se muestra en la figura 1.

(5) Comparación de estabilidad de conservación

Los productos liofilizados de LDL oxidada preparados en (3) [LDL oxidada estándar (1) (tipo H), 12,5 ng y LDL oxidada estándar (2) (tipo L), 6,25 ng] fueron conservados a 4ºC durante períodos determinados (0, 1, 3 y 4 semanas). La LDL oxidada preparada en (2) fue diluida con PBS (pH 7,4) hasta lograr dos concentraciones de proteína de 6,25 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo L") y 12,5 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo H"). Se añadieron BSA y sacarosa a los dos tipos hasta la concentración final de 2 (p/v) % y 5 (p/v) %, respectivamente, y las soluciones resultantes fueron bien mezcladas. Las soluciones mezcladas resultantes fueron conservadas en un depósito refrigerado a 4ºC sin ser liofilizadas (es decir, la LDL oxidada para comparación (1) (tipo H), 12,5 ng/ml y la LDL oxidada para comparación (2) (tipo L), 6,25 ng/ml) fueron conservadas a 4ºC durante períodos determinados (0, 1, 3 y 4
semanas).

Después de la conservación durante los períodos predeterminados, las LDL oxidadas (1) y (2), cada una de ellas disuelta en 1 ml de agua purificada y las LDL oxidadas para comparación (1) y (2), fueron tratadas mediante el mismo procedimiento que en el anterior apartado (4) c. y se midió la absorbencia a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 2.

Tal como se muestra en la figura 2, las mediciones obtenidas a partir de las LDL oxidadas (1) y (2) prácticamente no muestran cambios respecto a las mediciones obtenidas inmediatamente después de la preparación (semana 0), mientras que las mediciones obtenidas de las LDL oxidadas para comparación (1) y (2) después de cuatro semanas de conservación, mostraron respectivamente caídas del 50% y del 45% respecto a las mediciones obtenidas inmediatamente después de la preparación (semana 0). Dichos resultados indican claramente que las LDL oxidadas para com-
paración fueron bastante inferiores en estabilidad de conservación con respecto a las LDL oxidadas estándar (1) y (2).

Ejemplo comparativo 2

(1) Preparación de HDL

A partir de plasma humano obtenido utilizando EDTA como anticoagulante, la LDL fue eliminada y una parte con densidad específica dentro del rango entre 1,063 y 1,21 fue recuperada como fracción de HDL mediante una técnica de ultracentrifugación (con 120,000xg a 10ºC durante 48 horas). En este caso, la pureza de la HDL fue confirmada por el hecho de que la muestra formó una única banda bien definida cuando fue sometida a pruebas mediante la técnica de electroforesis con agarosa.

A continuación, dicha fracción de HDL fue purificada dializando completamente durante 16 horas contra PBS (pH 7,4) conteniendo 0,25 mmol/l de EDTA. La HDL purificada tal como ha sido descrita anteriormente en el presente documento fue disuelta en PBS (pH 7,4) conteniendo 0,25 mmol/l de EDTA hasta que la concentración de proteína HDL alcanzó 1 mg/ml y fue conservada en estado disuelto a 4ºC hasta ser utilizada. En el presente ejemplo, la masa de proteína fue determinada mediante el método de Lowry modificado descrito en el Ejemplo comparativo 1.

(2) Oxidación de HDL

En la HDL preparada en (1) se elimina de EDTA dializando no menos de 3 tres veces (durante no menos de dos horas cada vez) contra no menos de 500-1000 veces en volumen de PBS (pH 7,4) sin contenido de EDTA y luego disuelta en PBS (pH 7,4) sin contenido de EDTA hasta que la concentración de HDL alcanzó 100 \mug/ml. Luego, 10 ml de la solución de HDL resultante con sulfato de cobre (CuSO_{4}) añadido a la misma hasta que la concentración final alcanzó 10 \mumol/l, fueron dejados en incubación a 37ºC durante 18 horas para efectuar la oxidación de la HDL. Se interrumpió la oxidación añadiendo EDTA a la solución hasta que la concentración final de EDTA alcanzó 1 mmol/l. Se eliminó CuSO_{4} de la solución dializando no menos de tres veces (durante no menos de dos horas por cada vez) contra no menos de 500-1000 veces en volumen de PBS (pH 7,4) conteniendo 1 mmol/l de EDTA. La HDL oxidada preparada de este modo fue conservada a 4ºC.

En el presente ejemplo de trabajo, la expresión de la cantidad de HDL oxidada fue definida por la masa de proteína de HDL como materia prima.

(3) Preparación de producto liofilizado de HDL oxidada

Se añadieron BSA y sacarosa a la HDL oxidada preparada en (2) hasta que la concentración final alcanzó 2 (p/v) % y 5 (p/v) % respectivamente, y la solución resultante fue bien mezclada. A continuación, la solución mezclada producida fue dispensada en un volumen unitario de 1 ml dentro de viales de vidrio, congelada mediante la utilización de un dispositivo de liofilización al vacío, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) a -50ºC durante 16 horas, liofilizado a 20ºC bajo presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, luego taponada, y conservada a 4ºC. En este momento, cada uno de los contenidos de agua de los productos liofilizados fue del 0,8% de masa.

(4) Formación de curva de calibración con el producto liofilizado de HDL oxidada como sustancia estándar a. Ajuste de concentración

El producto liofilizado de HCL oxidada preparada en (3) fue disuelto en 1 ml de agua purificada añadida al mismo y diluido con PBS conteniendo 1 (p/v) % de BSA hasta obtener concentraciones variables (0 ng/ml, 3,125 ng/ml, 6,25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 25 nm/ml, 50 ng/ml, y 75 ng/ml).

b. Análisis ELISA sandwich

En los pocillos individuales de una microplaca 96F (NALGE NUNC Internacional K.K.), una solución de anticuerpo monoclonal de ratón apo-AI antihumano (Nippon Chemi-con Corp.) diluida con un tampón de carbonato (pH 9,5) hasta una concentración de 10 \mug/ml fue dispensada en un volumen unitario de 0,1 ml/pocillo e incubada a 4ºC durante 16 horas. La solución de anticuerpo formada en los pocillos fue descartada. El residuo en cada uno de los pocillos fue bloqueado siendo incubado junto con 350 \mul de PBS (pH 7,4) conteniendo 1 (p/v) % de BSA a temperatura ambiente durante dos horas. La solución de anticuerpo bloqueado fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

La solución diluida conteniendo el producto liofilizado de HDL oxidada con una concentración predeterminada preparada tal como se ha descrito en el apartado "a" anterior, fue dispensada en un volumen unitario de 100 \mul a los pocillos individuales, incubada a temperatura ambiente durante dos horas, y luego lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

En los pocillos individuales se dispensó un anticuerpo DLH3 diluido con PBS (pH 7,4) conteniendo 1 (p/v) % de BSA en un volumen unitario de 100 \mul e incubado a temperatura ambiente durante una hora. La solución incubada fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20 y luego incubada junto con 100 \mul de peroxidasa etiquetada como anticuerpo IgM anti-ratón (Zymed Laboratories, Inc.) diluida hasta 1000 veces con PBS conteniendo 1 (p/v) % de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución incubada resultante fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20 y luego se dejó que adquiriera coloración con 100 \mul de 0,03 (p/v) % de una solución de peróxido de hidrógeno acuoso conteniendo 3 mg/ml de o-fenilendiamina. La reacción aún produciéndose en la solución fue interrumpida mediante la adición de 50 \mul de 1 mol/l de ácido sulfúrico. A continuación se midió la absorbencia de la solución a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 3. Mediante la utilización del producto liofilizado de HDL oxidada de la presente invención, pudo conformarse una curva de calibración precisa tal como se muestra en la figura 3.

(5) Comparación de estabilidad de conservación

Los productos liofilizados de HDL oxidada preparados en (3) [HDL oxidada estándar (1) (tipo H), 12,5 ng y HDL oxidada estándar (2) (tipo L), 6,25 ng] fueron conservados a 4ºC durante períodos predeterminados (0, 1, 2, 3 y 4 semanas). La HDL oxidada preparada en (2) fue diluida con PBS (pH 7,4) hasta obtener dos concentraciones de proteína de 6,25 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo L") y 12,5 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo H"). Se añadieron BSA y sacarosa a los dos tipos hasta la concentración final de 2 (p/v) % y 5 (p/v) % respectivamente, y las soluciones resultantes fueron bien mezcladas. Las soluciones resultantes mezcladas fueron conservadas en un depósito refrigerado a 4ºC sin ser liofilizadas [es decir, la HDL oxidada para comparación (1) (tipo H), 12,5 ng/ml y la HDL oxidada para comparación (2) (tipo L), 6,25 ng/ml] fueron conservadas a 4ºC durante períodos predeterminados (0, 1, 2, 3 y 4 semanas).

Después de la conservación durante dichos períodos predeterminados, las HDL oxidadas estándar (1) y (2) disueltas cada una en 1 ml de agua purificada y las HDL oxidadas para comparación (1) y (2) fueron tratadas mediante el mismo procedimiento del anterior punto (4) b. y se midió la absorbencia a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 4.

Tal como se muestra en la figura 4, las mediciones obtenidas a partir de las HDL oxidadas estándar (1) y (2) prácticamente no mostraron cambios respecto a las obtenidas inmediatamente después de la preparación (semana 0), mientras que las mediciones obtenidas de las HDL oxidadas para comparación (1) y (2) después de conservación en frío, mostraron respectivamente caídas del 40% y del 30% respecto a las mediciones obtenidas inmediatamente después de la conservación (semana 0). Estos resultados indican claramente que las HDL oxidadas para comparación fueron bastante inferiores en estabilidad de conservación con respecto a las HDL oxidadas estándar (1) y (2).

Ejemplo comparativo 3

(1) Preparación de Lp(a)

A partir del plasma sanguíneo humano obtenido utilizando EDTA como anticoagulante, se recuperó una parte con densidad específica dentro del rango entre 1,060 y 1,125 y fue sometida adicionalmente a filtración por gel con Biogel A-5m (Bio-rad Corp.) para recuperar una fracción Lp(a). En este caso, la pureza de la Lp(a) fue confirmada por el hecho de que la muestra formó una sola banda bien definida cuando fue sometida a pruebas mediante la técnica de electroforesis con agarosa.

A continuación, dicha fracción de Lp(a) fue purificada dializando completamente (durante 16 horas) contra PBS (pH 7,4) conteniendo 0,025 mmol/l de EDTA. Además, la Lp(a) purificada tal como ha sido descrita anteriormente fue disuelta en PBS (pH 7,4) conteniendo 0,25 mmol/l de EDTA hasta que la concentración de proteína Lp(a) alcanzó 1 mg/ml y fue conservada en estado disuelto a 4ºC hasta su utilización. En el presente ejemplo, la masa de proteína fue determinada mediante el método de Lowry modificado.

(2) Oxidación de Lp(a)

En la Lp(a) preparada en (1) se eliminó EDTA dializando no menos de 3 veces (durante no menos de dos horas cada una) contra no menos de 500-1000 veces el volumen de PBS (pH 7,4) sin contenido de EDTA y luego disuelto en PBS (pH 7,4) sin contenido de EDTA hasta que la concentración de Lp(a) alcanzó \mug/ml. A continuación, 10 ml de la solución de LDL resultante y sulfato de cobre (CuSO_{4}) fueron añadidos a la misma hasta que la concentración final alcanzó 10 \mumol/l, se dejaron incubar de manera conjunta a 37ºC durante 18 horas para efectuar la oxidación de la Lp(a). La reacción de oxidación fue interrumpida añadiendo EDTA a la solución hasta alcanzar la concentración final de EDTA de 1 mmol/l. Se eliminó de la solución CuSO_{4} dializando 2-3 veces (durante no menos de dos horas cada una) contra no menos de 500-1000 veces el volumen de PBS (pH 7,4) conteniendo 1 mmol/l de EDTA. La Lp(a) oxidada preparada de este modo fue conservada a 4ºC.

En el presente ejemplo de trabajo, la expresión de la cantidad de Lp(a) oxidada fue definida por la masa de proteína de Lp(a) como materia prima.

(3) Preparación de producto liofilizado de Lp(a) oxidada

Se añadieron BSA y sacarosa a la Lp(a) oxidada preparada en (2) hasta que la concentración final alcanzó 2 (p/v) % y 5 (p/v) % respectivamente, y la solución resultante fue bien mezclada. La mezcla resultante fue dispensada en un volumen unitario de 1 ml dentro de viales de vidrio, luego congelada a -50ºC durante 16 horas mediante la utilización de un dispositivo de liofilización, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.), liofilizada a 20ºC bajo presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, luego taponada, y conservada a 4ºC. En este momento, cada uno de los contenidos de agua de los productos liofilizados fue de 0,8% de la masa.

(4) Formación de curva de calibración con el producto liofilizado de Lp(a) oxidada como sustancia estándar a. Ajuste de concentración

El producto liofilizado de la Lp(a) oxidada preparada en (3) fue disuelto en 1 ml de agua purificada hasta alcanzar concentraciones variables (0 ng/ml, 0,15625 ng/ml, 0,3125 ng/ml, 0,625 ng/ml, 1,25 ng/ml, y 2,5 ng/ml y 5 ng/ml).

b. Análisis ELISA sandwich

En los pocillos individuales de una microplaca 96F (NALGE NUNC Internacional K.K.), una solución de anticuerpo monoclonal de ratón Lp(a) anti-humano (Nippon Chemi-con Corp.) diluida con un tampón de carbonato (pH 9,5) hasta una concentración de 10 \mug/ml fue dispensada en una cantidad unitaria de 1 \mug/pocillo e incubada a 4ºC durante 16 horas. La solución de anticuerpo formada en los pocillos fue descartada. El residuo de cada uno de los pocillos fue bloqueado mediante incubación junto con 350 \mul de PBS (pH 7,4) conteniendo 1 (p/v) % de BSA a temperatura ambiente durante dos horas. La solución de anticuerpo bloqueado fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

La solución acuosa conteniendo el producto liofilizado de la Lp(a) oxidada con concentración prescrita preparada tal como ha sido descrito en el apartado "a" anteriormente, fue dispensada en un volumen unitario de 100 \mul en los pocillos individuales, incubada a temperatura ambiente durante dos horas, y luego lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20.

En los pocillos individuales, la solución diluida obtenida diluyendo el anticuerpo DLH3 preparado en (4) b. del Ejemplo comparativo 1 hasta una concentración de 10 \mug/ml con una solución de Tris-HCl de 20 mmol/l (pH 7,4) conteniendo 1 (p/v) % de BSA fue dispensada en un volumen unitario de 100 \mul e incubada a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, la solución incubada fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20 y luego incubada junto con 100 \mul de peroxidasa etiquetada como anticuerpo IgM anti-ratón (Nippon Chemi-con Corp.) diluida hasta 1000 veces con PBS conteniendo 1 (p/v) % de BSA a temperatura ambiente durante 30 minutos. La solución incubada resultante fue lavada cuatro veces con PBS (pH 7,4) conteniendo 0,05 (v/v) % de Tween20 y luego se dejó que adquiriera coloración con 100 \mul de 0,03 (p/v) % de una solución de peróxido de hidrógeno acuoso conteniendo 3 mg/ml de o-fenilendiamina. La reacción aún produciéndose en la solución fue interrumpida añadiendo 50 \mul de ácido sulfúrico 1 mol/l. A continuación, se midió la absorbencia de la solución a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 5. Mediante la utilización del producto liofilizado de Lp(a) oxidada de la presente invención, se conformó una curva de calibración precisa tal como se muestra en la figura 5.

(5) Comparación de estabilidad de conservación

Los productos liofilizados de Lp(a) oxidada preparada en (3) [Lp(a) oxidada estándar (1) (tipo H), 12,5 ng y Lp(a) oxidada estándar (2) (tipo L), 6,25 ng] fueron conservados a 4ºC durante períodos predeterminados (0, 1, 2, 3 y 4 semanas). La Lp(a) oxidada preparada en (2) fue diluida con PBS (pH 7,4) hasta lograr dos concentraciones de proteína de 6,25 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo L") y 12,5 ng/ml (en lo sucesivo denominada "tipo H"). Se añadieron BSA y sacarosa a los dos tipos hasta la concentración final de 2 (p/v) % y 5 (p/v) %, respectivamente, y las soluciones resultantes fueron bien mezcladas. Las soluciones mezcladas resultantes fueron conservadas en un depósito refrigerado a 4ºC, sin ser liofilizadas (es decir, la Lp(a) oxidada para comparación (1) (tipo H), 12,5 ng/ml y la Lp(a) oxidada para comparación (2) (tipo L), 6,25 ng/ml) fueron conservadas a 4ºC durante períodos determinados (0, 1, 2, 3 y 4 semanas).

Después de la conservación durante los períodos predeterminados, las Lp(a) oxidadas (1) y (2), cada una de ellas disuelta en 1 ml de agua purificada, y las LP(a) oxidadas para comparación (1) y (2) fueron tratadas mediante el mismo procedimiento que en (4) c. anteriormente y se midió la absorbencia a 492 nm. Los resultados se muestran en la figura 6.

Tal como se muestra en la figura 6, las mediciones obtenidas a partir de las LP(a) oxidadas (1) y (2) prácticamente no muestran cambios respecto a las mediciones obtenidas inmediatamente después de la preparación (semana 0), mientras que las mediciones obtenidas de las Lp(a) oxidadas para comparación (1) y (2), después de cuatro semanas de conservación, mostraron respectivamente caídas del 50% y del 40% respecto a las mediciones obtenidas inmediatamente después de la conservación (semana 0). Dichos resultados indican claramente que las Lp(a) oxidadas para comparación fueron bastante inferiores en estabilidad de conservación con respecto a las Lp(a) oxidadas estándar (1) y (2).

Ejemplo 1 (1) Preparación de plasma sanguíneo humano desnaturalizada por congelación

Se tomaron muestras de sangre de cuatro sujetos utilizando heparina como anticoagulante. Se tomaron muestras de plasma sanguíneo respectivamente de las muestras de sangre mediante el método ordinario y sometidas a pruebas mediante un método similar al método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4).

A continuación, las muestras de plasma sanguíneo fueron dispensadas, cada una de ellas, en un volumen unitario de 2 ml dentro de viales de vidrio, que fueron transferidos desde temperatura ambiente (25ºC) a un congelador con una temperatura interior de -30ºC, dejadas en el interior durante no menos de tres horas, devueltos a temperatura ambiente, y se fundió completamente el contenido. El plasma sanguíneo individual que sufrió el proceso incluyendo la operación de congelación fue analizado mediante un procedimiento similar al método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Los resultados se muestran en la figura 7. La figura 7 indica claramente que cuando el proceso que incluye la operación de congelación fue llevado acabo en el plasma, la lipoproteína contenida en dicho plasma sanguíneo resultó significativamente desnaturalizada produciendo una lipoproteína desnaturalizada por congelación (LDL oxidada).

(2) Preparación de producto liofilizado de plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación

Las muestras de plasma sanguíneo que han sufrido el proceso incluyendo el total de 4 veces la operación de congelación descrita anteriormente en (1) fueron mezcladas en volúmenes iguales respectivos. La concentración de LDL desnaturalizada (LDL oxidada) de la solución mezclada resultante fue calculada a partir de la curva de calibración conformada tal como se muestra en el Ejemplo comparativo 1 (4) de acuerdo con el método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4).

A continuación, el plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (1) fue diluido hasta obtener dos concentraciones de LDL oxidada, 6,25 ng/ml (tipo L) y 12,5 ng/ml (tipo H), con 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,4) conteniendo 140 mmol/l de NaCl, BSA con concentración final de 2 (p/v) %, sacarosa con concentración final de 5 (p/v) %, y 0,25 mmol/l de EDTA-2Na. Los dos tipos de solución diluida fueron dispensados en un volumen unitario de 1 ml dentro de viales de vidrio, congelados a -50ºC durante 16 horas mediante la utilización de un dispositivo de liofilización al vacío, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.), luego liofilizados a 5ºC a presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, luego el proceso fue interrumpido, y fueron conservados a 4ºC hasta su utilización. Éste fue designado como "producto liofilizado de plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación". Cada uno de los contenidos de agua de los productos liofilizados fue del 0,8% en masa.

(3) Determinación de la concentración de producto liofilizado de plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación

El producto liofilizado del plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (2) fue disuelto en 1 ml de agua purificada añadida al mismo. Se midió la absorbencia de la solución resultante a 492 nm de acuerdo con el método para determinar la LDL oxidada mediante el método ELISA sandwich descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Cuando la concentración de LDL oxidada de la solución se determinó a partir de la curva de calibración formada en el Ejemplo comparativo 1 (4) basándose en la absorbencia encontrada en la medición, la concentración de LDL oxidada en el producto liofilizado no mostró cambios discernibles antes y después de la etapa de liofilización.

(4) Comparación de estabilidad de conservación

Los dos tipos de productos liofilizados [plasma sanguíneo humano desnaturalizada por congelación estándar (1) (tipo H), 12,5 ng y plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar (2) (tipo L), 6,25 ng] del plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (2) fueron conservados a 4ºC durante períodos predeterminados (0, 6, y 12 meses). A continuación, los dos tipos de producto liofilizado de LDL oxidada [LDL oxidada estándar (1) (tipo H), 12,5 ng y LDL oxidada estándar (2) (tipo L), 6,25 ng] preparados en el Ejemplo comparativo 1 (3) fueron conservados a 4ºC durante períodos predeterminados (0, 6 y 12 meses).

Después de la conservación durante los períodos predeterminados, los plasmas sanguíneos humanos desnaturalizados por congelación (1) y (2) y las LDL oxidadas estándar (1) y (2) fueron cada uno de ellos disueltos en 1 ml de agua purificada. Las soluciones resultantes fueron sometidas a pruebas siguiendo un procedimiento similar al método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Los resultados se muestran en la Tabla 1 dada a continuación:

TABLA 1

1

Tal como se muestra en la Tabla 1, la LDL oxidada estándar presentó una estabilidad de conservación excelente siempre que tuvo una concentración baja [LDL oxidada estándar (2)]. El plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación de acuerdo con la presente invención, que obtuvo la desnaturalización de lipoproteína mediante congelación y luego adquirió estabilidad mediante liofilización, presentó una estabilidad excelente durante períodos de conservación prolongados aún con altas concentraciones [plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar (1)] en comparación con la LDL oxidada estándar.

Ejemplo comparativo 4

(1) Preparación de suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación

Se tomaron muestras de sangre de cuatro sujetos. Muestras de suero sanguíneo fueron separadas de manera respectiva de las muestras de sangre mediante el método ordinario y fueron mezcladas. Se añadieron BSA y sacarosa al suero sanguíneo hasta alcanzar la concentración final de 2 (p/v) % y 5 (p/v) %, respectivamente, y las mezclas resultantes fueron bien mezcladas. Las mezclas fueron dispensadas en un volumen unitario de 2 ml dentro de viales de vidrio, congeladas utilizando un dispositivo de liofilización Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.) a -50ºC durante 16 horas, liofilizadas a 5ºC bajo presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, luego interrumpidas, y conservadas a 4ºC. Cada uno de los contenidos acuosos de los productos liofilizados fue de 0,8% en masa.

(2) Preparación de producto liofilizado de suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación

Se añadió agua purificada en un volumen unitario de 2 ml a los viales de vidrio conteniendo las muestras de plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparados en (1), disolviendo de este modo el contenido de los viales. Las concentraciones de LDL oxidada de las soluciones producidas fueron calculadas a partir de la curva de calibración conformada tal como se muestra en el Ejemplo comparativo 1 (4) de acuerdo con el método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4).

A continuación, el suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (1) fue diluido en dos concentraciones de LDL oxidada, 6,25 ng/ml (tipo L) y 12,5 ng/ml (tipo H), con 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,4) conteniendo 140 mmol/l de NaCl, BSA de concentración final de 2 (p/v) %, sacarosa de concentración final de 5 (p/v) %, y 0,25 mmol/l de EDTA-2Na. Los dos tipos de solución diluida fueron dispensados en un volumen unitario de 1 ml dentro de viales de vidrio, congelados a -50ºC durante 16 horas utilizando un dispositivo de liofilización al vacío, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.), luego liofilizados a 5ºC bajo una presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, luego se taponaron, y se conservaron a 4ºC hasta su utilización. Esto fue designado como "producto liofilizado de plasma sanguíneo humano desnaturalizado por congelación". Cada uno de los contenidos acuosos de los productos liofilizados fue de 0,8% en masa.

(3) Determinación de la concentración de producto liofilizado de suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación

El producto liofilizado del suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (2) fue disuelto en 1 ml de agua purificada. Cuando la concentración de LDL oxidada de la solución resultante fue determinada a partir de la curva de calibración formada en el Ejemplo comparativo 1 (4) mediante el método de determinación de la LDL oxidada de acuerdo con el método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4), la concentración de LDL oxidada en el producto liofilizado prácticamente no mostró cambios discernibles antes y después de la etapa de liofilización.

(4) Comparación de estabilidad de conservación

El producto liofilizado del suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación preparado en (2) fue disuelto con 1 ml de agua purificada produciendo dos concentraciones de LDL oxidada de 12,5 ng/ml y 6,25 ng/ml, respectivamente, para preparar las muestras de suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar, (1) (tipo H) y (2) (tipo L). Estos dos tipos de muestra fueron conservados a 4ºC durante períodos de tiempo determinados (0, 3, 7, 10 y 14 días). Luego, los dos tipos de producto liofilizado de LDL oxidada preparados en el Ejemplo comparativo 1 (3) fueron disueltos de la misma manera que ha sido descrita anteriormente para obtener LDL oxidada estándar con concentraciones de LDL oxidada de 12,5 ng/ml y 6,25 ng/ml, es decir, LDL oxidada estándar (3) (tipo H) y LDL oxidada estándar (4) (tipo L). Estos tipos fueron conservados en estado disuelto a 4ºC durante períodos de tiempo predeterminados (0, 3, 7, 10 y 14 días).

Después de la conservación durante el período predeterminado, los plasmas sanguíneos humanos desnaturalizados por congelación (1) y (2) y las LDL oxidadas estándar (3) y (4) fueron sometidos a pruebas siguiendo el método de determinación de LDL oxidada de acuerdo con el método ELISA sandwich descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en la figura 8.

TABLA 2

2

Tal como se muestra en la Tabla 2, la LDL oxidada estándar presenta una estabilidad de conservación excelente siempre que tenga una concentración baja [LDL oxidada estándar (4)]. El suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar que obtuvo la desnaturalización de lipoproteína mediante congelación y luego adquirió estabilidad mediante liofilización sobresalió significativamente en comparación con la LDL oxidada estándar en términos de estabilidad durante períodos prolongados de conservación aún cuando presentaba concentraciones altas [suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar (1)].

Ejemplo 2 (1) Preparación de LDL desnaturalizada por congelación

En la LDL preparada en el Ejemplo comparativo 1 (1) se eliminó EDTA dializando no menos que tres veces (no menos de dos horas cada vez) contra no menos de 500 – 1000 veces el volumen de PBS (pH 7,4) sin contenido de EDTA, diluida hasta una concentración de LDL de 1 mg/ml con 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,4) conteniendo 140 mmol/l de NaCl, BSA de concentración final de 2 (p/v) %, sacarosa con concentración final de 5 (p/v) %, y 0,25 mmol/l de EDTA-2Na, y bien mezclado. Luego, la solución diluida producida fue dispensada en un volumen unitario de 2 ml dentro de viales de vidrio, que fueron transferidos desde temperatura ambiente (22ºC) hasta los congeladores con temperaturas interiores de -85ºC y -30ºC, respectivamente, y fueron dejados en su interior durante no menos de una hora, y devueltos a temperatura ambiente para efectuar la disolución total del contenido de los viales. El proceso incluyendo la etapa de congelación y disolución mencionado anteriormente fue llevado acabo un total de 10 veces. Los contenidos de los viales de vidrio fueron recuperados de forma parcial durante algunos intervalos entre dichos procesos incluyendo las etapas de congelación y fusión. Las muestras obtenidas de este modo fueron sometidas a pruebas mediante el método ELISA sandwich descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Los resultados se muestran en la figura 9.

Tal como se muestra en la figura 9, la desnaturalización de LDL casi alcanzó un estado saturado cuando el proceso, incluyendo las etapas de congelación y fusión, fue llevado a cabo hasta tres veces mientras que la temperatura interna del congelador fue de -30ºC. Cuando la temperatura interna del congelador fue de -85ºC, sin embargo, la desnaturalización de LDL no alcanzó un estado de saturación a menos que el proceso, incluyendo las etapas de congelación y fusión, fuera repetido hasta nueve veces. Los resultados indican que la cantidad de producto de LDL desnaturalizada que puede ser producido varía con el descenso de la temperatura.

(2) Preparación de producto liofilizado de LDL desnaturalizada por congelación

La LDL desnaturalizada por congelación preparada llevando a cabo el proceso que incluye la etapa de congelación a temperatura interna de -30ºC del congelador en (1) hasta un total de cuatro veces, fue diluida hasta concentraciones de LDL oxidada de 6,25 ng/ml (tipo L) y 12,5 ng/ml (tipo H), con 10 mmol/l de tampón de fosfato (pH 7,4) conteniendo 140 mmol/l de NaCl, BSA con concentración final de 2 (p/v) %, sacarosa con concentración final de 5 (p/v) %, y 0,25 mmol/l de EDTA-2Na. Los dos tipos de solución diluida obtenidos de este modo fueron dispensados en un volumen unitario de 1 ml dentro de viales de vidrio, congelados a -50ºC durante 16 horas utilizando un dispositivo de liofilización al vacío, Kyowa Drier RL-201BS (Kyowa Shinku Gijutsu K.K.), luego liofilizados a 5ºC bajo una presión reducida de 1,33 Pa durante 48 horas para gasificar y expulsar el contenido acuoso, taponados, y conservados a 4ºC hasta su utilización. Esto fue designado como "producto liofilizado de LDL desnaturalizada por congelación". Cada uno de los contenidos acuosos de los productos liofilizados fue 0,8% en masa.

(3) Determinación de la concentración del producto liofilizado de LDL desnaturalizada por congelación

El producto liofilizado de la LDL desnaturalizada por congelación preparado en (2) fue disuelto en 1 ml de agua purificada añadida el mismo. Cuando la concentración de LDL oxidada de la solución resultante fue determinada a partir de la curva de calibración formada en el Ejemplo comparativo 1 (4) mediante el método de determinación de la LDL oxidada de acuerdo con el método ELISA descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4), la concentración de LDL oxidada en el producto liofilizado prácticamente no mostró cambios discernibles antes y después de la etapa de liofilización.

(4) Comparación de estabilidad de conservación después de la disolución

El producto liofilizado de la LDL desnaturalizada por congelación preparada en (2) fue disuelta con 1 ml de agua purificada produciendo dos concentraciones de LDL oxidada, 12,5 ng/ml y 6,25 ng/ml, para preparar las LDL humana desnaturalizada por congelación estándar, (1) (tipo H) y (2) (tipo L), respectivamente. Estos dos tipos de de muestras fueron conservadas a 4ºC durante períodos de tiempo predeterminados (0, 3, 7, 10 y 14 días). Luego, los dos tipos de producto liofilizado de LDL oxidada preparada en el Ejemplo comparativo 1 (3) fueron disueltos de la misma manera que ha sido descrita anteriormente para obtener LDL oxidada estándar teniendo concentraciones de LDL oxidada de 12,5 ng/ml y 6,25 ng/ml [LDL oxidada estándar (3) (tipo H) y LDL oxidada estándar (4) (tipo L)]. Estos tipos fueron conservados en estado disuelto a 4ºC durante períodos de tiempo predeterminados (0, 3, 7, 10 y 14 días).

Después de la conservación durante el período determinado se midió la absorbencia a 492 nm de las LDL desnaturalizadas por congelación estándar (1) y (2) y de las LDL oxidadas estándar (3) y (4) siguiendo el método de determinación de LDL oxidada de acuerdo con el método ELISA sandwich descrito en el Ejemplo comparativo 1 (4). Los contenidos de LDL oxidada en las muestras estándar fueron determinados a partir de la curva de calibración formada en el Ejemplo comparativo 1 (4) basándose en la absorbencia encontrada en la medición anterior. Los resultados se muestran la Tabla 3 y la figura 10.

TABLA 3

3

Tal como muestra la Tabla 3, la LDL oxidada estándar de la presente invención sobresalió en cuanto a estabilidad de conservación siempre que tuviera una concentración baja [LDL oxidada estándar (4)]. El suero sanguíneo humano desnaturalizado por congelación estándar de acuerdo con la presente invención que obtuvo la desnaturalización de lipoproteína mediante congelación y luego adquirió estabilidad mediante liofilización sobresalió de manera significativa en comparación con LDL oxidada estándar en términos de estabilidad de conservación prolongada después de la disolución aún cuando tuviera una alta concentración [LDL desnaturalizada por congelación estándar (1)].

Aplicación industrial de la invención

Se sugiere fuertemente que la lipoproteína desnaturalizada está profundamente relacionada con varias enfermedades del sistema circulatorio, incluyendo enfermedades del sistema arterial coronario tales como el infarto cardíaco y estenocardia, enfermedades de las arterias cerebrales tales como el infarto cerebral y la demencia cerebrovascular, enfermedades de las arterias renales tales como la nefropatía y nefropatía diabética, y enfermedades del sistema arterial periférico tales como las obstrucciones de las arterias periféricas. La sustancia estándar para la determinación de lipoproteína desnaturalizada en sangre y el reactivo para la investigación del papel fisiológico y la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada son substancias muy importantes que afectan los resultados de dichos experimentos.

Mediante el método de la presente invención, por lo tanto, se ha hecho posible la producción de lipoproteína desnaturalizada con cualidades sobresalientes en cuanto a estabilidad de conservación, en otras palabras, que presenta determinaciones definidas. Además de las ventajas mencionadas anteriormente, la lipoproteína estabilizada que es producida liofilizando la lipoproteína desnaturalizada obtenida llevando a cabo el método del primer aspecto de la presente invención, no sólo tiene cualidades sobresalientes en cuanto a estabilidad de conservación, sino además en estabilidad de conservación después de la disolución. La lipoproteína desnaturalizada y estabilizada contemplada por la presente invención retiene la estabilidad excelente aún cuando sea aplicada en forma de solución, es decir las formas reales de utilización. Este hecho hace que esta lipoproteína desnaturalizada y estabilizada sea altamente ventajosa para la determinación de lipoproteína desnaturalizada.

La lipoproteína desnaturalizada y estabilizada de acuerdo con la presente invención, por lo tanto, resulta útil como sustancia estándar en un método para la determinación de la lipoproteína desnaturalizada contenida en un componente sanguíneo colocando una muestra determinada en contacto con un anticuerpo capaz de reconocer la lipoproteína desnaturalizada y medir la reactividad de dicho anticuerpo en la muestra y como reactivo experimental variable para investigar el papel fisiológico y la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada. Evidentemente, ejerce un efecto muy importante en la comercialización de tecnología de diagnóstico y el desarrollo de reactivos en vistas de los varios objetivos mencionados anteriormente en el presente documento.

Claims (16)

1. Método de producción de lipoproteína desnaturalizada, que comprende las etapas de:

congelar una solución que contiene lipoproteína para producir una solución congelada;

y fundir dicha solución congelada para producir una solución que contenga lipoproteína desnaturalizada.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se repiten las etapas de congelación y fusión.

3. Método según la reivindicación 2, en el que las etapas de congelación y fusión se repiten en un rango entre 1 y 10 veces.

4. Método según la reivindicación 2, en el que las etapas de de congelación y fusión se repiten en un rango entre 1 y 4 veces

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha lipoproteína desnaturalizada es una sustancia estándar para la determinación de la presencia de lipoproteína desnaturalizada en sangre o es un reactivo experimental para la investigación del papel fisiológico o la actividad fisiológica de la lipoproteína desnaturalizada.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha lipoproteína desnaturalizada es capaz de reaccionar con un anticuerpo DLH3 que es producido por una línea celular hibridoma, hibridoma ratón-ratón FOH1a/DLD3 (Depósito Nº FERM BP-7171).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha lipoproteína es como mínimo una seleccionada del grupo que consiste en quilomicrón, VLDL, LDL, LP(a), HDL2 y HDL3.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la etapa de liofilización de la solución que contiene lipoproteína desnaturalizada.

9. Método según la reivindicación 8, que comprende adicionalmente la adición de un estabilizador a la solución que contiene lipoproteína desnaturalizada después de la fusión y antes de la liofilización.

10. Lipoproteína desnaturalizada y estabiliza producida por un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

11. Método para la determinación de lipoproteína desnaturalizada en una muestra, comprendiendo las etapas de:

selección de una lipoproteína desnaturalizada y estabilizada, tal como queda determinado en la reivindicación 10, como sustancia estándar;

formación de una curva de calibración utilizando las concentraciones prescritas de la sustancia estándar;

reacción de la muestra con un anticuerpo que se une a la lipoproteína desnaturalizada; y

medición de la reactividad del anticuerpo con la muestra.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha determinación es una determinación inmunológica.

13. Método según la reivindicación 12, en el que dicha determinación inmunológica es seleccionada a partir de un radioinmunoensayo, un inmunoensayo con enzimas, un fluoroinmunoensayo, un inmunoensayo luminiscente, un inmunoensayo por aglutinación, inmunonefelometría, y un inmunoensayo nefelométrico.

14. Método según la reivindicación 13, en el que dicho método para determinación inmunológica es un método competitivo o un método "sandwich".

15. Kit reactivo para determinación de lipoproteína desnaturalizada, que comprende la lipoproteína desnaturalizada estabilizada determinada en la reivindicación 10 como sustancia estándar.

16. Kit reactivo para determinación de lipoproteína desnaturalizada, que comprende un líquido diluyente para una muestra, una fase sólida formada por inmovilización de un anticuerpo, un tampón de reacción, una solución de lavado, un anticuerpo secundario etiquetado, un reactivo de detección, y toda o una parte de la lipoproteína desnaturalizada y estabilizada determinada en la reivindicación 10 como sustancia estándar, como elementos componentes.