ES2280393T3 - Peptidos ciclicos que tienen actividad agonista para el receptor de melanocortin-4. - Google Patents
Peptidos ciclicos que tienen actividad agonista para el receptor de melanocortin-4. Download PDFInfo
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Abstract
Un compuesto de fórmula: en donde R1 y R12 juntamente con X e Y forman un anillo de fenilo, y X es C e Y es C; ó R1 es hidrógeno, ó y R12 es hidrógeno; siendo X e Y cada uno C, y el enlace entre X e Y, un doble enlace, o bien siendo X e Y cada uno CH, y el enlace entre X e Y, un enlace simple; R2 es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos de carbono; R14 es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono; n es 0 ó 1; y Q es en donde R3, R4 y R5 son independientemente entre sí, hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, en donde cuando R4 no es hidrógeno, R3 y R5 son ambos hidrógeno; y R6 es hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, fenoxilo, o halo; R11 y R13 son cada uno independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo de 3 ó 4 átomos de carbono, cicloalquilo de 5 ó 6 átomos de carbono, ó R11 y R13 son ambos fenilo; R7 es O ó NH; R8 es hidrógeno o metilo; R9 es R10 es hidrógeno o metilo; p es 0 ó 1; m es 0, 1, 2 ó 3; y Z es R17 es hidrógeno o alquilo inferior y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Description
Péptidos cíclicos que tienen actividad agonista
para el receptor de melanocortin-4.
La obesidad está ampliamente reconocida como un
serio problema de salud para los países desarrollados y ha
adquirido un carácter de epidemia en los Estados Unidos. Más del 50%
de la población de U.S. se considera como de sobrepeso, con >25%
diagnosticado como clínicamente obesos y con un considerable riesgo
de enfermedades del corazón, diabetes mellitus no insulina
dependiente (NIDDM), hipertensión, y ciertos cánceres. Este carácter
epidémico representa una carga importante para el sistema de
cuidado de la salud en forma de unos costes proyectados para el
tratamiento de la obesidad de más de 70 mil millones de dólares
anualmente esperados solamente en los U.S.. Estrategias para el
tratamiento de la obesidad incluyen la reducción de la ingestión de
alimentos o la potenciación del gasto de energía.
Se ha demostrado que cuando se inyectó en el
tercer ventrículo del cerebro o intraperitonealmente, un
heptapéptido cíclico análogo de la hormona estimuladora del
\alpha-melanocito (\alphaMSH) que tiene
actividad agonista para el receptor de la
melanocortina-4 (MC4-R), causó una
larga y duradera inhibición de la ingestión de comida en el ratón.
Este efecto fue reversible cuando se co-administró
con un antagonista del MC4-R (Fan y col., Nature
(1997) 385: 165-168). Por lo tanto, los agonistas de
la actividad MC4-R serían de utilidad en el
tratamiento o prevención de la obesi-
dad.
dad.
Existen cinco receptores conocidos de la
melanocortina basados en la homología de la secuencia, que oscila
entre el 35 y 60% de homología entre los miembros de la familia
(Cone y col., Rec. Prog. Hormone Res. (1996)
51:287-318), pero estos receptores difieren en sus
funciones. Por ejemplo, el MC1-R es un receptor
copulado con una G-proteína, que regula la
pigmentación en respuesta al \alphaMSH, el cual es un potente
agonista del MC1-R (Cone y col., ibid.). El
agonismo del receptor MC1-R da como resultado la
estimulación de los melanocitos lo cual causa eumelanina y aumenta
el riesgo de cáncer de piel. El agonismo del MC1-R
puede tener también efectos neurológicos. La estimulación de la
actividad del MC2-R puede dar como resultado el
carcinoma del tejido adrenal. Los efectos del agonismo del
MC3-R y MC5-R no son todavía
conocidos. Todos los receptores de la melanocortina responden a la
clase de hormona peptídica de las hormonas (MSH) estimuladoras de
los melanocitos. Estos péptidos se derivan de la
pro-opiomela-nocortina (POMC), una
prohormona de 131 aminoácidos que se procesa en tres clases de
hormonas; las melanocortinas (\alpha, \beta y \gamma), la
hormona adrenocorticotropina (ACTH), y varias endorfinas (p. ej.,
la lipotropina) (Cone y col., ibid.). Debido a sus diferentes
funciones, el simultáneo agonismo de las actividades de los
múltiples receptores de la melanocortina, tiene el potencial de
ocasionar efectos colaterales innecesarios. Por lo tanto es deseable
que un agonista del MC4-R sea más selectivo para el
MC4-R que para uno o más de los otros receptores de
la
melanocortina.
melanocortina.
Haskell-Luevano y col.,
(Peptides (1996) 17(6):995-1002) describe
péptidos que contienen el tripéptido
(D)Phe-Arg-Trp y presentan
actividad melanotrópica (oscurecimiento de la piel) en el bioensayo
de la piel de rana (Rana pipiens).
Haskell-Luevano, y col., (ibid.) no describen
ninguno de los compuestos de fórmula I ó II que se describen más
adelante.
Bednarek y col., (Peptides (1999)
29:401-409) y Bednarek y col., (Biochem. Biophys.
Res. Comm. (1999) 261:209-213) describen análogos
del péptido cíclico MT-II. Ninguno describe ningún
compuesto de fórmula I ó II de los que se describen más
adelante.
Esta invención proporciona un compuesto de
fórmula:
En los compuestos de fórmula I, R^{1} y
R^{12} juntamente con X e Y, forman un anillo de fenilo y X es C
e Y es C; ó R^{1} es hidrógeno,
ó
y
R^{12} es hidrógeno; siendo X e Y cada uno C,
y el enlace entre X e Y, un doble enlace, o bien siendo X e Y cada
uno CH, y el enlace entre X e Y, un enlace simple; R^{2} es
alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 5 átomos de
carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos de carbono; R^{14} es alquilo
de 1 a 5 átomos de carbono; y n es 0 ó 1, Q es
en donde R^{3}, R^{4} y R^{5}
son independientemente entre sí, hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, hidroxilo o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono,
en donde cuando R^{4} no es hidrógeno, R^{3} y R^{5} son
ambos hidrógeno; R^{6} es hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de
carbono, alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, fenoxilo, o halo; y
R^{11} y R^{13} son cada uno independientemente entre sí,
hidrógeno, alquilo de 3 ó 4 átomos de carbono, o cicloalquilo de 5
ó 6 átomos de carbono, ó R^{11} y R^{13} son ambos fenilo;
R^{7} es O ó NH; R^{8} es hidrógeno o metilo: R^{9}
es
R^{10} es hidrógeno o metilo; p es 0 ó 1; m es
0, 1, 2 ó 3; Z es
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, de
preferencia metilo y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
El enlace punteado del compuesto de fórmula I
está hidrogenado cuando X e Y son cada uno -CH-. Por otro lado,
cuando el enlace punteado está presente, Y y X tomados conjuntamente
con R^{1} y R^{12} no forman un anillo de fenilo, y X e Y son
cada uno, átomos de C tetravalente.
Esta invención proporciona también un compuesto
de fórmula
En compuestos de fórmula II, R^{1} es
hidrógeno,
ó
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos
de carbono, alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a
5 átomos de carbono; R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono; y n es 0 ó 1, uno de R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6}
es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono o alcoxilo de
1 a 3 átomos de carbono, y los restantes son hidrógeno. R^{7} es
O ó NH. R^{8} es hidrógeno o metilo. R^{9}
es
R^{10} es hidrógeno o metilo; p
es 0 ó 1; m es 0, 1, 2 ó 3; Z
es
R^{17} es hidrógeno o alquilo
inferior, de preferencia metilo y sales farmacéuticamente aceptables
de los
mismos.
Los compuestos de fórmula I y II como también
los
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)beta
metil-Trp-Lys-NH_{2}
son agonistas del MC4-R. Es sabido que los
agonistas de la actividad del MC4-R causan la
reducción de la ingestión de alimentos en un modelo de ratón de la
obesidad humana. Por lo tanto, estos compuestos son de utilidad para
el tratamiento o prevención de la obesidad.
Todos los compuestos de fórmulas I y II
ejemplificados más adelante así como el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)-beta
metil-Trp-Lys-NH_{2},
fueron ensayados para ver la actividad agonista del
MC4-R y la actividad agonista del
MC1-R en el ensayo in vitro descrito más
adelante en el Ejemplo A de Actividad Biológica. Todos los
compuestos ensayados tuvieron una actividad agonista EC50 para el
MC4-R de menos de 500 nM, y todos presentaron por lo
menos una actividad agonista del MC4-R por lo menos
10 veces mayor que la actividad agonista del MC1-R.
En cambio, el compuesto
Ac-Nle-ciclo(Asp-Lys)-Asp-His-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}
presentó aproximadamente iguales actividades agonistas del
MC1-R y MC4-R.
El término "alquilo" significa un grupo
alquilo de cadena lineal o ramificada, y el término "alquilo
inferior" significa un grupo alquilo que contiene de 1 a 6
átomos de carbono. El término "alquenilo" significa un grupo
alquenilo de cadena lineal o ramificada. El término "alquinilo"
se refiere a un grupo alquinilo de cadena lineal o ramificada.
El término "alcoxilo" significa un grupo de
fórmula alquilo-O- en el cual alquilo es como se ha
definido más arriba. El término "fenoxilo" significa un grupo
de fórmula fenilo-O-. Excepto cuando se especifica
otra cosa, "fenilo" se refiere a un anillo de fenilo sin
substituir y "fenoxilo" se refiere a un grupo fenoxilo sin
substituir.
El término "halo" significa un grupo
seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
El término "sal farmacéuticamente
aceptable" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia
y propiedades biológicas de las bases libres o ácidos libres, las
cuales no son ni biológicamente ni de otra manera indeseables. Las
sales se forman con ácidos inorgánicos tales como el ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico,
ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como el ácido
acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido
oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido
fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido
cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido
etansulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido
salicílico, N-acetilcisteína y similares. Además,
estas sales pueden prepararse por adición de una base inorgánica o
una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de una base
inorgánica incluyen pero no están limitadas a, las sales de sodio,
potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, y similares. Las sales
derivadas de bases orgánicas incluyen pero no están limitadas a las
sales de aminas primarias, secundarias y terciarias substituidas,
incluyendo las aminas substituidas que se encuentran en estado
natural, aminas cíclicas y resinas básicas intercambiadoras iónicas,
tales como la isopropilamina, trimetilamina, dietilamina,
trietilamina, tripropilamina, etanolamina, lisina, arginina,
N-etilpiperidina, piperidina, resinas de polimina y
similares.
Los compuestos de fórmula IA están representados
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{1}, R^{3}, R^{4},
R^{5}, R^{7}, R^{8}, R^{9}, R^{10}, R^{12}, X, Y, Z, m y
p son como más arriba, y las sales farmacéuticamente aceptables de
los
mismos.
En los compuestos de fórmula IA, R^{1} y
R^{12} juntamente con X e Y forman un anillo de fenilo; o R^{1}
es hidrógeno
ó
y
R^{12} es hidrógeno, con o bien X e Y siendo
cada uno C, y el enlace entre X e Y siendo un doble enlace, o bien
con X e Y siendo cada uno CH y el enlace entre X e Y siendo un
enlace simple; R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos de
carbono; R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono; y n es 0 ó
1.
R^{3}, R^{4} y R^{5} son
independientemente entre sí, hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, hidroxilo o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono,
en donde cuando R^{4} no es hidrógeno, R^{3} y R^{5} son
ambos hidrógeno. R^{7} es O ó NH. R^{8} es hidrógeno o metilo.
R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
R^{10} es hidrógeno o metilo; p
es 0 ó 1; m es 0, 1, 2 ó 3; Z
es
R^{17} es hidrógeno o alquilo
inferior, de preferencia
metilo.
El enlace punteado de la fórmula IA puede estar
hidrogenado. Cuando la línea punteada está hidrogenada, X e Y son
ambos -CH-. Por otro lado, cuando el enlace punteado está presente,
Y y X tomados conjuntamente con R^{1} y R^{12} no forman un
anillo de fenilo, X e Y son ambos, átomos de C tetravalente.
En una versión del compuesto de fórmula IA, X e
Y son cada uno, CH y el enlace entre X e Y está hidrogenado en un
enlace simple; Z es
R^{7} es O; R^{1}
es
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono y
R^{10} y R^{12} son ambos, hidrógeno. Ejemplos de dichos
compuestos incluyen el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión preferida del compuesto de
fórmula IA, Z es
R^{7} es NH; R^{1} es
hidrógeno,
R^{2} es alquilo; y R^{10} y
R^{12} son ambos
hidrógeno.
En otra versión del compuesto de fórmula IA, Z
es
R^{7} es NH; R^{1}
es
R^{2} es alquilo; y R^{10} y
R^{12} son ambos
hidrógeno.
En una versión más específica, X e Y son cada
uno CH y el enlace entre X e Y está hidrogenado en un enlace
sencillo; n es 0; y R^{9} es
Ejemplos de estos compuestos incluyen el
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH_{2};
y penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-metil(2)Nal-Lys-NH_{2}.
En otra versión más específica del compuesto de
fórmula IA, Z es
R^{7} es NH; R^{1}
es
R^{2} es alquilo; y R^{10} y
R^{12} son ambos hidrógeno; y R^{9}
es
y R^{17} es hidrógeno o alquilo
inferior, de preferencia
metilo.
Estos compuestos incluyen aquellos en los cuales
X e Y son cada uno CH y el enlace entre X e Y es un enlace
sencillo; y uno de R^{3}, R^{4} y R^{5} es hidrógeno, halo o
alquilo y los restantes son hidrógeno, por ejemplo,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Orn)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Orn-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH_{2};
penta-ciclo-(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2};
y
Ac-ciclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2}.
Otras versiones específicas de los compuestos de
fórmula IA, son aquellos compuestos en los cuales X e Y son cada
uno CH y el enlace entre X e Y es un enlace sencillo; y R^{1}
es
uno de R^{3}, R^{4} y R^{5}
es alcoxilo, y los restantes son hidrógeno; y n es 0, por ejemplo
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOA-pc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeoApc-(D)-Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
Versiones de compuestos de fórmula IA incluyen
aquellos compuestos en los cuales cada uno de R^{1}, R^{3},
R^{4}, R^{5}, R^{8} y R^{10} es hidrógeno; R^{7} es NH;
R^{9} es
y R^{17} es hidrógeno o alquilo
inferior, de preferencia
metilo;
y p es 0, por ejemplo, ciclo(ácido
succínico-Lys)-ácido
succínico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ciclo(ácido maleico-Lys)-ácido
maleico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ciclo(ácido succínico-Dpr)-ácido
succínico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2},
ciclo(ácido maleico-Dpr)-ácido
maleico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2.}
En otra versión del compuesto de fórmula IA,
R^{1} y R^{12} juntamente con X e Y forman un anillo de fenilo.
Ejemplos de tales compuestos incluyen el ciclo(ácido
ftálico-Lys)-ácido
ftálico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
ciclo(ácido ftálico-Dpr)-ácido
ftálico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2};
y
Ac-Nle-ciclo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2}.
Los compuestos de la fórmula IB están
representados por la fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
En los compuestos de fórmula IB, R^{1} es
hidrógeno,
\vskip1.000000\baselineskip
ó
\vskip1.000000\baselineskip
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos
de carbono, alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a
5 átomos de carbono, R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono. N es 0 ó 1. R^{6} es hidrógeno, alquilo de 1 a 3
carbonos, alcoxilo de 1 a 3 carbonos, fenoxilo o
halo,
R^{7} es O ó NH. R^{8} es hidrógeno o
metilo. R^{9} es
R^{10} es hidrógeno o metilo; p es 0 ó 1; m es
0, 1, 2 ó 3; Z es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, de
preferencia metilo y las sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
En una versión de los compuestos de fórmula IB,
es decir, los compuestos de fórmula IB1, Z es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{7} es NH; R^{1} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{2} es alquilo; R^{8} y R^{10} son cada
uno hidrógeno; y R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y R^{17} es como se ha indicado
antes.
En una versión más específica de dichos
compuestos de fórmula IB1, R^{6} es hidrógeno o alquilo. Ejemplos
de dichos compuestos incluyen el:
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión más específica de dichos
compuestos de fórmula IB1, R^{6} es halo. Ejemplos de dichos
compuestos incluyen el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión más específica de dichos
compuestos de fórmula BI1, R^{6} es alcoxilo o fenoxilo. Ejemplos
de dichos compuestos incluyen el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}
y el
penta-(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
\newpage
Compuestos de fórmula IC están representados
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
En los compuestos de fórmula IC, R^{1} es
hidrógeno ó
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono o alquinilo de 2 a 5 átomos de
carbono. R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono, n es 0 ó 1,
R^{11} y R^{13} son cada uno independientemente entre sí,
hidrógeno, alquilo de 3 ó 4 átomos de carbono, cicloalquilo de 5 ó 6
átomos de carbono ó R^{11} y R^{13} son ambos fenilo; R^{7}
es O ó NH; R^{8} es hidrógeno o metilo; R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
R^{10} es hidrógeno o metilo; p es 0 ó 1; m es
0, 1, 2 ó 3; y Z es
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, de
preferencia metilo, y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
En una versión del compuesto de fórmula IC, el
compuesto de fórmula IC1, Z es
R^{7} es NH; R^{1} es
R^{2} es alquilo; R^{8} y R^{10} son cada
uno, hidrógeno; y R^{9} es
En una versión más específica de dichos
compuestos de fórmula IC1, uno de R^{11} y R^{13} es alquilo o
cicloalquilo y el otro es hidrógeno. Ejemplos de dichas
aseveraciones son:
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo-(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión más específica de dichos
compuestos de fórmula IC1, uno de R^{11} y R^{13} es fenilo y
el otro es hidrógeno o fenilo: Ejemplos de dichos compuestos
incluyen el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En una versión del compuesto de fórmula II, el
compuesto de fórmula IIA, Z es
R^{1} es
R^{2} es alquilo;
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{8} y R^{10}
son cada uno, hidrógeno;
R^{6} es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 3
átomos de carbono, o alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono;
R^{9} es
y R^{17} es como se ha indicado
antes.
En una versión de los compuestos de fórmula
II-A, como se ha descrito en el parágrafo
precedente, R^{7} es NH. En una versión más específica, R^{7}
es NH y R^{6} es hidrógeno o alquilo. Ejemplos de dichos
compuestos incluyen: penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)-Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}
y
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión específica del compuesto de
fórmula II-A, R^{7} es NH y R^{6} es halo.
Ejemplos de dichos compuestos incluyen:
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión específica del compuesto de
fórmula II-A, R^{7} es NH y R^{6} es alcoxilo.
Penta-(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)-Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)-Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
Otra versión de los compuestos de fórmula II son
aquellos compuestos de fórmula II en los cuales Z, R^{1} a
R^{5} y R^{8} a R^{10} son como se ha descrito más arriba,
R^{7} es O y R^{6} es halo. Ejemplos de dichos compuestos
incluyen:
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2}.
En otra versión del compuesto de fórmula II, los
compuestos de fórmula II-B son aquellos compuestos
en donde Z es -S-S-;
R^{1} es
\vskip1.000000\baselineskip
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{8} y R^{10}
son cada uno, hidrógeno; R^{6} es hidrógeno o halo; R^{7} es
NH; y
R^{9} es
y R^{17} es como se ha indicado
antes.
Ejemplos de dichos compuestos de fórmula II B
incluyen:
Ac-Nle-ciclo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2}.
La invención proporciona también los siguientes
compuestos:
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH_{2};
y
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)beta
metil-Trp-Lys-NH_{2}.
La nomenclatura empleada para definir los
péptidos es la usada típicamente en la especialidad, en donde el
grupo amino del N-terminal aparece a la izquierda y
el grupo carboxilo del C-terminal aparece a la
derecha. En los aminoácidos naturales se menciona uno de los
aminoácidos naturales, encontrado en las proteínas, es decir, Gly,
Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys,
Met, Phe, Tyr, Pro, Trp y His. Cuando el aminoácido tiene forma
isoméricas, es la forma L del aminoácido la que está representada a
no ser que se indique explícitamente otra
cosa.
cosa.
Las siguientes abreviaturas o símbolos se
emplean para representar los aminoácidos, grupos protectores,
disolventes, reactivos y similares.
\newpage
- Símbolo
- \underbar{Significado}
- \beta-Ala
- beta-alanina
- (2)-Nal
- (2)-naftilalanina
- Atc
- \underbar{Á}cido 2-amino\underbar{t}etralin-2-\underbar{c}arboxílico
- 5-BrAtc
- Ácido-5-bromo-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-ClAtc
- Ácido-5-cloro-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-MeOAtc
- Ácido 5-metoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-EtOAtc
- Ácido 5-etoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-iPrOAtc
- Ácido 5-isopropoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-MeAtc
- Ácido 5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-EtAtc
- Ácido 5-etil-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-iPrAtc
- Ácido 5-isopropil-2-aminotetralin-2-carboxílico
- 5-DmaAtc
- Ácido 5-dimetilamino-2-aminotetralin-2-carboxílico
- DBr
- Ácido D-2,4-diaminobutanoico
- DPr
- Ácido D-2,3-diaminopropionoico
- Sar
- Sarcosina (N-metilglicina)
- Cit
- Citrulina
- Apc
- Ácido 1-amino-4-fenilciclohexano-1-carboxílico
- 4-HOApc
- Ácido 1-amino-4-(4-hidroxifenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 4-MeOApc
- Ácido 1-amino-4-(4-metoxifenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 3-MeOApc
- Ácido 1-amino-4-(4-metoxifenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 4-EtOApc
- Ácido 1-amino-4-(4-etoxifenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 4-iPrOApc
- Ácido 1-amino-4-(4-isopropoxifenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 4-MeApc
- Ácido 1-amino-4-(4-metilfenil)ciclohexano-1-carboxílico
- 4-ClApc
- Ácido 1-amino-4-(4-clorofenil)ciclohexano-1-carboxílico
- Appc
- Ácido 4-amino-1-fenilpiperidin-4-carboxílico
- 2-MeAppc
- Ácido 4-amino-1-(2-metilfenil)piperidin-4-carboxílico
- 2-iProAppc
- Ácido 4-amino-1-(2-isopropoxifenil)piperidin-4-carboxílico
- 3-MeAppc
- Ácido 4-amino-1-(3-metilfenil)piperidin-4-carboxílico
- 3-MeOAppc
- Ácido 4-amino-1-(3-metoxifenil)piperidin-4-carboxílico
- 4-MeAppc
- Ácido 4-amino-1-(4-metilfenil)piperidin-4-carboxílico
- 4-ClAppc
- Ácido 4-amino-1-(4-clorofenil)piperidin-4-carboxílico
- 4-PhOAppc
- Ácido 4-amino-1-(4-fenoxifenil)piperidin-4-carboxílico
- Achc
- Ácido 1-\underbar{a}mino-4-\underbar{c}iclo\underbar{h}exilciclohexano-1-\underbar{c}arboxílico
- Adpc
- Ácido 1-amino-4-difenilciclohexano-1-carboxílico
- Abc
- Ácido 1-\underbar{a}mino-4-terc-\underbar{b}utilciclohexano-1-\underbar{c}arboxílico
- 3-Amb
- Ácido 3-\underbar{a}mino\underbar{m}etil \underbar{b}enzoico
- 4-Amb
- Ácido 4-\underbar{a}mino\underbar{m}etil \underbar{b}enzoico
- 2-Aba
- \underbar{Á}cido 2-\underbar{a}mino\underbar{b}enzoico
- Bu
- Butilo
- Penta
- Pentanoilo
- Fmoc
- 9-fluorenilmetoxicarbonilo
- Pmc
- 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
- Trt
- Tritilo (trifenilmetilo)
- CH_{2}Cl_{2}
- Cloruro de metileno
- CH_{3}CN
- Acetonitrilo
- DMF
- Dimetilformamida
- DIPEA
- N,N-diisopropiletilamina
- TFA
- Ácido trifluoroacético
- HOBT
- N-hidroxibenzotriazol
- DIC
- N,N'-diisopropilcarbodiimida
- BOP
- Bezotriazol-1-iloxi-tris-(dimetilamino)fosfonio hexafluorofosfato
- PyBroP
- Bromo-tris-pirrolidin-fosfonio hexafluorofosfato
- HBTU
- 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato
- FAB-MS
- Espectrometría de masas por bombardeo rápido de átomos
- ES-MS
- Espectrometría de masas por electrospray
\vskip1.000000\baselineskip
La indicación de los aminoácidos substituidos en
paréntesis, representa los análogos de la secuencia de péptidos. La
derivatización del grupo amino N-terminal, se indica
a la izquierda de la substitución del N-terminal,
separada por un guión. Esto es, por ejemplo,
Ac-His-(D)Phe-Arg-Trp-Gly-NH_{2}
indica un péptido con una secuencia de aminoácidos en la cual el
grupo acetilo ha sido substituido para el hidrógeno en el terminal
N. Los sufijos "-OH" y "-NH_{2}" después del guión o el
paréntesis se refieren respectivamente, al ácido libre y a las
formas amídicas del polipéptido.
Los péptidos lineales, empleados como
precursores de los compuestos representativos presentes pueden
sintetizarse fácilmente mediante cualquier procedimiento
convencional para la formación de una unión peptídica entre
aminoácidos. Tales procedimientos convencionales incluyen por
ejemplo cualquier procedimiento en fase de solución, que permita
una condensación entre el grupo libre alfa amino de un aminoácido o
radical del mismo, que tenga su grupo carboxilo u otros grupos
reactivos protegidos y el grupo carboxilo primario libre de otro
aminoácido o radical del mismo que tenga su grupo amino u otros
grupos reactivos protegidos.
Estos procedimientos convencionales para la
síntesis de péptidos lineales precursores incluyen por ejemplo
cualquier método de síntesis de péptidos en fase sólida. En dicho
método la síntesis de los nuevos compuestos puede efectuarse
incorporando secuencialmente los radicales de aminoácidos deseados
de uno en uno dentro de la cadena creciente del péptido, de acuerdo
con los principios generales de los métodos en fase sólida
[Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc,. 1963, 85,
2149-2154; Barany y col. The peptides,
Analysis, Synthesis and Biology ("Los péptidos, análisis,
síntesis y biología"), vol 2, Gross, E. y Meienhofer, J., Eds.
Academic Press 1-284 (1980)].
Es común en las síntesis químicas de péptidos,
la protección de los grupos reactivos de las cadenas laterales de
los varios grupos de aminoácidos con grupos de protección adecuados,
que evitarán que tenga lugar una reacción química en aquel lugar
hasta que el grupo de protección esté definitivamente eliminado.
Habitualmente es también corriente la protección del grupo amino
alfa de un aminoácido o de un fragmento mientras esta entidad
reacciona en el grupo carboxilo, seguido de la eliminación
selectiva del grupo protector del amino alfa y permite que una
posterior reacción tenga lugar en aquel sitio. Mientras los grupos
específicos de protección han sido descritos en vistas al método de
síntesis en fase sólida, debe notarse que cada aminoácido puede ser
protegido por un grupo protector convencionalmente empleado para el
respectivo aminoácido en la síntesis en fase de solución.
Los grupos amino alfa pueden ser protegidos
mediante una grupo de protección adecuado seleccionado de grupos de
protección aromáticos del tipo uretano, tal como el
benciloxicarbonil (Z) y benciloxicarbonilo substituido, tal como el
p-cloro-benciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
p-bifenil-isopropoxicarbonilo,
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y
p-metoxibenciloxicarbonilo (Moz); grupos de
protección alifáticos del tipo uretano, tales como el
t-butiloxicarbonilo (Boc),
diisopropilmetoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, y
aliloxicarbonilo. Entre los mismos, Fmoc es el más preferido para la
protección amino alfa.
Los grupos guanidino pueden ser protegidos
mediante un grupo de protección adecuado seleccionado de nitro,
p-toluen-sulfonilo (Tos), Z,
pentametilcromansulfonilo (Pmc), adamantiloxicarbonilo, y Boc. El
Pmc es el más preferido para la arginina (Arg).
Todos los disolventes, isopropanol (iPrOH),
cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), dimetilformamida (DMF) y
N-metilpirrolidinona (NMP), fueron adquiridos en
Fisher o en Burdick & Jackson y se utilizaron sin una
destilación adicional. El ácido trifluoroacético fue adquirido en
Halocarbon o Fluka y se utilizó sin una posterior purificación. La
diisopropilcarbodiimida (DIC) y la diisopropiletilamina (DIPEA) se
adquirió en Fluka o Aldrich y se utilizó sin una purificación
posterior. El hidroxibenzotriazol (HOBT) dimetilsulfuro (DMS) y el
1,2-etanoditiol (EDT) se adquirieron en Sigma
Chemical Co., y se utilizaron sin una purificación posterior. Los
aminoácidos protegidos fueron generalmente de la configuración L y
se obtuvieron comercialmente en Bache, Advanced Chem Tech, o en
Neosystem. La pureza de estos re-activos se confirmó
mediante cromatografía en capa fina, RMN y el punto de fusión,
antes de ser utilizados. La resina de bencidrilamina (BHA) fue un
copolímero de estireno - 1% de divinilbenceno
(100-200 ó 200-400 mallas) adquirida
en Bachem o en Advanced Chemtech. El contenido total de nitrógeno
de estas resinas fue por regla general entre 0,3 y 1,2 meq/g.
La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) se efectuó con un aparato LDC provisto de unas bombas
Constantametric I y III, un programador del disolvente Gradient
Master, un mezclador y un Spectromonitor III con detector UV de
longitud de onda variable. La HPLC analítica se efectuó en la
modalidad de fase inversa empleando una columna Vydac C_{18} (0,4
x 30 cm). Las separaciones preparativas por HPLC se efectuaron en
columnas Vydac (2 x 25 cm).
Los péptidos lineales se prepararon de
preferencia empleando la síntesis en fase sólida mediante el método
descrito en líneas generales por Merrifield, [J. Amer. Chem.
Soc., 1963, 85, 2149], aunque también podrían emplearse
otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica, como
ya se ha dicho anteriormente. La síntesis en fase sólida empieza
por el extremo terminal C del péptido mediante la copulación de un
aminoácido alfa protegido con una resina adecuada. Dicho material
de partida puede prepararse mediante la unión de un aminoácido
protegido en el amino alfa, mediante un engarce éster a una resina
de alcohol p-benciloxibencilo (Wang) o mediante una
unión amida entre un engarce Fmoc, tal como el ácido
p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetiloxibencil]-fenoxi-acético
(engarce Rink) con una resina de bencidrilamina (BHA). La
preparación de la resina de hidroximetilo ya es bien conocida en la
técnica. Los soportes de la resina engarce Fmoc-BHA
pueden adquirirse comercialmente y se emplean generalmente cuando
el péptido deseado que va a sintetizarse, tiene una amida sin
substituir en el ter-
minal C.
minal C.
Dado que los compuestos de la presente invención
son péptidos cíclicos, preparados mediante la formación de una
lactama o de un enlace disulfuro, los péptidos lineales precursores
se reúnen de forma que los aminoácidos o miméticos adecuados que
llevan los radicales apropiados en las cadenas laterales se colocan
en posiciones en el péptido lineal que puede finalmente ser
inducido para recibir un enlace amida intramolecular o la formación
de un enlace disulfuro. Las lactamas se forman a través de la
copulación de una funcionalidad amino de una cadena lateral de un
radical de amino ácido C terminal, con un radical distal de ácido
carboxílico, mientras que el enlace disulfuro se forma a través de
la copulación oxidante de dos radicales de cisteína apropiadamente
incorporados en el terminal C y en el terminal N ó cerca del mismo,
del péptido lineal precursor. Por ejemplo, en la preparación de los
péptidos de lactama, en los pentapéptidos lineales precursores, el
capuchón N puede emplearse como un molde para incorporar un radical
carboxilo, p. ej., una estructura X, ó en el caso de los
hexapéptidos, el péptido se escoge de forma que el radical de
aminoácido del terminal N se escoge entre uno de los aminoácidos
que contienen un grupo ácido carboxílico de la cadena lateral
protegido adecuado, p. ej., el ácido aspártico, ácido glutámico. En
los heptapéptidos lineales se incorpora el éter de ácido aspártico
o de ácido glutámico como penúltimo residuo del terminal N. En todos
los péptidos lineales precursores, es decir, los hepta, hexa y
pentapéptidos, el radical del terminal C se escoge de un aminoácido
natural o no natural que lleve un radical de la cadena lateral
básica protegido adecuadamente, capaz de formar un enlace amida
cuando se desprotege, por ejemplo lisina, ornitina, ácido
2,3-di-aminopropanoico, ácido
2,4-di-aminobutanoico. Para formar
un péptido cíclico que contenga un enlace disulfuro, en donde el
precursor es un hexapéptido lineal, el péptido se escoge de forma
que se incorpora un radical cisteína apropiadamente protegido en S,
tanto en el terminal C como en el terminal N, mientras que si el
precursor es un heptapéptido lineal los radicales de cisteína
apropiadamente protegidos en S, se incorporan tanto en el radical
del terminal C como en el penúltimo radical del terminal N, como
por ejemplo en X.
Por regla general, para preparar los péptidos
lineales, los aminoácidos o miméticos, se copulan con resina
engarce Fmoc-BHA, empleando la forma protegida con
Fmoc del aminoácido o mimético, con 2-5 equivalentes
de aminoácido y un reactivo de copulación adecuado. Después de las
copulaciones, la resina puede lavarse y secarse al vacío. La carga
del aminoácido sobre la resina, puede determinarse mediante un
análisis de aminoácidos de un alícuota de la resina
Fmoc-aminoácido o mediante la determinación de los
grupos Fmoc mediante análisis UV. Cualquier grupo aminoácido sin
reaccionar puede cubrirse con un "capuchón" mediante la
reacción de la resina con anhídrido acético y diisopropiletilamina
en cloruro de metileno.
Las resinas se llevan a través de varios ciclos
repetitivos para añadir aminoácidos secuencialmente. Los grupos de
protección Fmoc del amino alfa se eliminan en condiciones básicas.
La piperidina, piperazina o morfolina (20-40% v/v)
en DMF pueden utilizarse para este propósito. De preferencia se
utiliza la piperidina 40% en DMF.
Después de la eliminación del grupo protector
del amino alfa, los aminoácidos subsiguientes protegidos se copulan
escalonadamente en el orden deseado para obtener una resina
intermedia de péptidos protegidos. Los reactivos de activación
empleados para la copulación de los aminoácidos en la síntesis en
fase sólida de los péptidos son ya bien conocidos en la
especialidad. Por ejemplo, los reactivos apropiados para dichas
síntesis son el
benzotriazol-1-iloxi-tri-(dimetilamino)
fosfonio hexafluorofosfato (BOP),
bromo-tris-pirrolidino-fosfonio
hexafluorofosfato (PyBroP),
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfato (HBTU), y la diisopropilcarbodiimida (DIC). Se
prefieren aquí el HBTU y el DIC. Pueden emplearse otros agentes
activadores como por ejemplo, los descritos por Barany and
Merrifield [The Peptides ("Los péptidos"), vol. 20, J.
Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284].
Varios reactivos tales como el 1-hidroxibenzotriazol
(HOBT), N-hidroxisuccinimida (HOSu) y la
3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HOOBT), pueden añadirse a las mezclas de copulación con el fin de
optimizar los ciclos de síntesis. Se prefiere aquí el HOBT.
El protocolo para un ciclo de síntesis típico es
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo 1
| Paso | Reactivo | Tiempo |
| 1 | DMF | 2 x 30 seg |
| 2 | 40% de piperidina/DMF | 1 minuto |
| 3 | 40% de piperidina/DMF | 15 minutos |
| 4 | DMF | 2 x 30 seg |
| 5 | iPrOH | 2 x 30 seg |
| 6 | DMF | 3 x 30 seg |
| 7 | copulación | 60 min - 18 horas |
| 8 | DMF | 2 x 30 seg |
| 9 | iPrOH | 1 x 30 seg |
| 10 | DMF | 1 x 30 seg |
| 11 | CH_{2}Cl_{2} | 2 x 30 seg |
\vskip1.000000\baselineskip
Los disolventes para todos los lavados y
copulaciones se midieron para volúmenes de 10 - 20 ml/g de resinas.
Las reacciones de copulación durante todo el proceso de síntesis
fueron monitorizadas mediante el test de Kaiser de la ninhidrina,
para determinar la extensión del proceso [Kaiser et al.
Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598]. Se
observó una cinética de reacción lenta para el
Fmoc-Arg (Pmc) y para las copulaciones con aminas
secundarias mediante ácidos estéricamente inhibidos. Ninguna
reacción de copulación incompleta fue ni recopulada con aminoácido
activado recién preparado ni cubierta con un "capuchón"
mediante tratamiento de la resina de péptido con anhídrido acético
como se ha descrito más arriba. Las resinas de péptido totalmente
ensambladas, se secaron al vacío durante varias
horas.
horas.
Para cada compuesto, se eliminaron los grupos
bloqueadores y el péptido lineal se escindió de la resina mediante
el siguiente procedimiento. Por regla general, las resinas de
péptido se tratan con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de
dimetilsulfuro, 300 \mul de anisol y 9,5 ml de ácido
trifluoroacético, por gramo de resina, a temperatura ambiente
durante 120 minutos. La resina se separa por filtración y los
filtrados se precipitan en éter etílico enfriado. Los precipitados
se centrifugan y la capa de éter se decanta. El residuo se lava con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugan. Si se desea,
los péptidos lineales crudos se purifican mediante HPLC
preparativa. Los péptidos de aplican a la columna en un volumen
mínimo de AcOH/H_{2}O o bien de TFA 0,1%/H_{2}O. La elución con
gradiente empieza por regla general con un 10% de tampón B, 10%-60%
de B en 90 minutos, (tampón A: TFA 0,1%/H_{2}O, tampón B: TFA
0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de flujo de 8 ml/min. La detección
por UV se hace a 280 nm. Las fracciones se recogieron a intervalos
de 1,0 - 2,5 minutos y se inspeccionaron mediante HPLC analítica.
Las fracciones dictaminadas de alta pureza se juntaron y se
liofilizaron.
Para preparar las lactamas, el péptido lineal
impurificado apropiado, se disuelve en un disolvente inerte
apropiado, por ejemplo, la N-metil pirrolidona ó
DMF, de preferencia DMF, y se ajusta a un pH aparente de 8,0 por
adición de una amina terciaria base, por ejemplo, la
N-metil-morfolina, y a continuación
se trata con un reactivo formador del enlace amida, de preferencia
el BOP. La reacción se efectúa convenientemente a una temperatura
entre 40ºC y 0ºC, de preferencia aproximadamente a temperatura
ambiente. La purificación de los péptidos cíclicos crudos se
efectúa mediante HPLC preparativa. La elución con un gradiente
empieza generalmente con un 20% de tampón B, 20% - 60% de B en 90
minutos, (tampón A: TFA 0 1%/H_{2}O, tampón B: TFA
0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de flujo de 8 ml/min. La detección
por UV se hizo a 280 nm. Las fracciones se recogieron y
monitorizaron mediante HPLC analítica. Las fracciones dictaminadas
de alta pureza se juntaron y se liofilizaron.
Para preparar los péptidos cíclicos disulfuro,
el péptido lineal purificado por HPLC conteniendo dos residuos de
cisteína apropiadamente posicionados, se disuelve a un nivel de
dilución francamente alto, en un mezcla adecuada de disolventes
inertes, por ejemplo, DMSO acuoso y la solución se ajusta a un pH de
8,0 mediante la cuidadosa adición de hidróxido de amonio, A
continuación se borbotea oxígeno a través de la solución en
agitación. La reacción se efectúa convenientemente a una temperatura
entre 40ºC y 0ºC, de preferencia aproximadamente a temperatura
ambiente y el progreso de la ciclación se monitoriza mediante HPLC
analítica. Después de que la reacción ha sido dictaminada como
completa, la solución se liofiliza y el péptido cíclico crudo se
purifica mediante HPLC preparativa. La elución con gradiente
empieza generalmente con un 20% de tampón B, 20% - 60% de B en 90
minutos, (tampón A: TFA
0,1%/H_{2}O, tampón B: TFA 0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de flujo de 8 ml/min. La detección por UV se hizo a 280 nm. Las fracciones se recogieron y monitorizaron mediante HPLC analítica. Las fracciones dictaminadas de alta pureza se juntaron y se liofilizaron.
0,1%/H_{2}O, tampón B: TFA 0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de flujo de 8 ml/min. La detección por UV se hizo a 280 nm. Las fracciones se recogieron y monitorizaron mediante HPLC analítica. Las fracciones dictaminadas de alta pureza se juntaron y se liofilizaron.
La purificación de los péptidos crudos se
efectúa mediante HPLC preparativa. Los péptidos se aplicaron a
columnas con un volumen mínimo de AcOH/H_{2}O o bien de TFA
0,1%/H_{2}O. La elución del gradiente empieza generalmente con un
10% de tampón B, 10% - 60% de B en 90 minutos, (tampón A: TFA
0,1%/H_{2}O, tampón B: TFA 0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de
flujo de 8 ml/min. La detección por UV se hizo a 280 nm. Las
fracciones se recogieron a intervalos de 1,0 - 2,5 minutos y se
controlaron mediante HPLC analítica. Las fracciones dictaminadas de
alta pureza se juntaron y se liofilizaron.
La pureza de los productos finales se comprueba
mediante HPLC analítica sobre una columna de fase invertida como se
ha mencionado más arriba. La pureza de todos los productos se
dictamina que es aproximadamente de 95-99%. Todos
los productos finales se sometieron también a la espectrometría de
masas con bombardeo rápido de electrones (FAB-EM) o
bien espectrometría de masas por electrospray
(ES-EM). Todos los productos proporcionaron los
iones M+H originales esperados, dentro de límites aceptables.
El proceso para la síntesis de compuestos
representativos puede efectuarse mediante un procedimiento mediante
el cual cada aminoácido es añadido en la secuencia deseada uno tras
otro en sucesión a otro aminoácido o radical del mismo, o mediante
un procedimiento mediante el cual se sintetizan convencionalmente en
primer lugar fragmentos de péptidos con la secuencia deseada de
aminoácidos y a continuación se condensan para proporcionar el
péptido deseado.
Estos procedimientos convencionales para la
síntesis de los nuevos compuestos de la presente invención, incluyen
por ejemplo cualquier método de síntesis de péptidos en fase
sólida. En dicho método, la síntesis de los nuevos compuestos puede
efectuarse secuencialmente incorporando los radicales de aminoácido
deseados de uno en uno en la cadena creciente de péptido, de
acuerdo con los principios generales de los métodos en fase sólida
[Merrifield, R.B., J. Amer. Chem. Soc,. 1963, 85,
2149-2154; Barany y col. The peptides, Analysis,
Synthesis and Biology ("Los péptidos, análisis, síntesis y
biología"), vol 2, Gross, E. y Meienhofer, J., Eds. Academic
Press 1-284 (1980)].
Es corriente en las síntesis químicas de
péptidos, la protección de los grupos reactivos de las cadenas
laterales de los varios grupos de aminoácidos con grupos de
protección adecuados, que evitarán que tenga lugar una reacción
química en aquel lugar hasta que el grupo de protección esté
definitivamente eliminado. Habitualmente es también corriente la
protección del grupo amino alfa de un aminoácido o de un fragmento
mientras esta entidad reacciona en el grupo carboxilo, seguido de
la eliminación selectiva del grupo protector del amino alfa y
permite que una posterior reacción tenga lugar en aquel sitio.
Aunque se han descrito grupos específicos de protección con vistas
al método de síntesis en fase sólida, hay que hacer notar que cada
aminoácido puede ser protegido por un grupo protector de los
convencionalmente empleados para el respectivo aminoácido en la
síntesis en fase de solución.
Los grupos amino alfa pueden ser protegidos
mediante un grupo de protección adecuado seleccionado de grupos de
protección aromáticos del tipo uretano, tal como el
benciloxicarbonil (Z) y benciloxicarbonilo substituido, tal como el
p-cloro-benciloxicarbonilo,
p-nitrobenciloxicarbonilo,
p-bromobenciloxicarbonilo,
p-bifenil-isopropoxicarbonilo,
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), y
p-metoxibenciloxicarbonilo (Moz); grupos de
protección alifáticos del tipo uretano, tales como el
t-butiloxicarbonilo (Boc),
diisopropilmetoxicarbonilo, isopropoxicarbonilo, y
aliloxicarbonilo. Entre los mismos, Fmoc es el más preferido para la
protección amino alfa.
Los grupos guanidino pueden ser protegidos
mediante un grupo de protección adecuado seleccionado de nitro,
p-toluen-sulfonilo (Tos), Z,
pentametilcromansulfonilo (Pmc), adamantiloxicarbonilo, y Boc. El
Pmc es el más preferido para la arginina (Arg).
Todos los disolventes, isopropanol (iPrOH),
cloruro de metileno (CH_{2}Cl_{2}), dimetilformamida (DMF) y
N-metilpirrolidinona (NMP), fueron adquiridos en
Fisher o en Burdick & Jacson y se utilizaron sin una destilación
adicional. El ácido trifluoroacético fue adquirido en Halocarbon o
Fluka y se utilizó sin una posterior purificación. La
diisopropilcarbodiimida (DIC) y la diisopropiletilamina (DIPEA) se
adquirió en Fluka o Aldrich y se utilizó sin una purificación
posterior. El hidroxibenzotriazol (HOBT) dimetilsulfuro (DMS y el
1,2-etanoditiol (EDT) se adquirieron en Sigma
Chemical Co., y se utilizaron sin una purificación posterior. Los
aminoácidos protegidos fueron generalmente de la configuración L y
se obtuvieron comercialmente en Bachem, Advanced Chem Tech, o en
Neosystem. La pureza de estos re-activos se confirmó
mediante cromatografía en capa fina, RMN y el punto de fusión,
antes de ser utilizados. La resina de bencidrilamina (BHA) fue un
copolímero de estireno - 1% de divinilbenceno
(100-200 ó 200-400 mallas) adquirido
en Bachem o en Advanced Chemtech. El contenido total de nitrógeno
de estas resinas fue por regla general entre 0,3 y 1,2 meq/g.
La cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC) se efectuó sobre un aparato LDC consistente en unas bombas
Constantametric I y III, un programador del disolvente Gradient
Master, y un mezclador y un Spectromonitor III con detector UV de
longitud de onda variable. La HPLC analítica se efectuó en la
modalidad de fase invertida empleando una columna Vydac C_{18}
(0,4 x 30 cm). Las separaciones preparativas por HPLC se efectuaron
en columnas Vydac (2 x 25 cm).
Los péptidos se prepararon de preferencia
empleando la síntesis en fase sólida mediante el método descrito en
líneas generales por Merrifield, [J. Amer. Chem. Soc.,
1963, 85, 2149], aunque otras síntesis químicas equivalentes
conocidas en la técnica podrían emplearse como ya se ha dicho
anteriormente. La síntesis en fase sólida empieza por el extremo
terminal C del péptido mediante la copulación de un aminoácido alfa
protegido con una resina adecuada. Dicho material de partida puede
prepararse mediante la unión de un aminoácido protegido en el amino
alfa, mediante un engarce éster a una resina de alcohol
p-benciloxibencilo (Wang) o mediante una unión
amida entre un engarce Fmoc, tal como el ácido
p-[(R,S)-\alpha-[1-(9H-fluoren-9-il)-metoxiformamido]-2,4-dimetiloxibencil]-fenoxiacético
(engarce Rink) con una resina de bencidrilamina (BHA). La
preparación de la resina de hidroximetilo es ya bien conocida en la
técnica. Los soportes de la resina engarce
Fmoc-BHA pueden adquirirse comercialmente y se
emplean generalmente cuando el péptido deseado que va a
sintetizarse, tiene una amida sin substituir en el termi-
nal C.
nal C.
Por regla general, los aminoácidos o miméticos,
se copulan sobre la resina engarce Fmoc-BHA,
empleando la forma protegida con Fmoc del aminoácido o mimético,
con 2-5 equivalentes de aminoácido y un reactivo de
copulación adecuado. Después de las copulaciones, la resina puede
lavarse y secarse al vacío. La carga del aminoácido sobre la
resina, puede determinarse mediante un análisis de aminoácidos de un
alícuota de la resina Fmoc-aminoácido o mediante la
determinación de los grupos Fmoc mediante análisis UV. Cualquier
grupo aminoácido sin reaccionar puede cubrirse con un
"capuchón", mediante la reacción de la resina con anhídrido
acético y diisopropiletilamina en cloruro de metileno.
Las resinas se emplean a través de varios ciclos
repetitivos para añadir aminoácidos secuencialmente. Los grupos de
protección Fmoc del amino alfa se eliminan en condiciones básicas.
La piperidina, piperazina o morfolina (20-40% v/v)
en DMF, pueden utilizarse para este propósito. De preferencia se
utiliza la piperidina 40% en DMF.
Después de la eliminación del grupo protector
del amino alfa, los aminoácidos subsiguientes protegidos se copulan
escalonadamente en el orden deseado para obtener una resina
intermedia de péptidos protegidos. Los reactivos de activación
empleados para la copulación de los aminoácidos en la síntesis en
fase sólida de los péptidos son ya bien conocidos en la
especialidad. Por ejemplo, los reactivos apropiados para dichas
síntesis son el
benzotriazol-1-il-oxi-tri-(dimetilamino)
fosfonio hexafluorofosfato (BOP),
bromo-tris-pirrolidino-fosfonio
hexafluorofosfato (PyBroP),
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
hexafluorofosfato (HBTU), y la diisopropilcarbodiimida (DIC). Se
prefieren aquí el HBTU y el DIC. Pueden emplearse otros agentes
activadores como por ejemplo, los descritos por Barany y Merrifield
[The Peptides ("Los péptidos"), vol. 2, J. Meienhofer, ed.,
Academic Press, 1979, pp 1-284]. Varios reactivos
tales como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBT),
N-hidroxisuccinimida (HOSu) y la
3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina
(HOOBT), pueden añadirse a las mezclas de copulación con el fin de
optimizar los ciclos sintéticos. Se prefiere aquí el HOBT.
\newpage
El protocolo para un ciclo sintético típico es
como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo 1
| Paso | Reactivo | Tiempo |
| 1 | DMF | 2 x 30 seg |
| 2 | 40% de piperidina/DMF | 1 minuto |
| 3 | 40% de piperidina/DMF | 15 minutos |
| 4 | DMF | 2 x 30 seg |
| 5 | iPrOH | 2 x 30 seg |
| 6 | DMF | 3 x 30 seg |
| 7 | copulación | 60 min - 18 horas |
| 8 | DMF | 2 x 30 seg |
| 9 | iPrOH | 1 x 30 seg |
| 10 | DMF | 1 x 30 seg |
| 11 | CH_{2}Cl_{2} | 2 x 30 seg |
\vskip1.000000\baselineskip
Los disolventes para todos los lavados y
copulaciones se midieron para volúmenes de 10 - 20 ml/g de resinas.
Las reacciones de copulación durante todo el proceso de síntesis
fueron monitorizadas mediante el test de Kaiser de la ninhidrina,
para determinar la extensión de la realización [Kaiser et al.
Anal. Biochem. 1970, 34, 595-598]. Se
observó una cinética de reacción lenta para el
Fmoc-Arg (Pmc) y para las copulaciones con aminas
secundarias mediante ácidos estéricamente inhibidos. Ninguna
reacción de copulación incompleta fue ni recopulada con aminoácido
activado recién preparado ni cubierta con un "capuchón"
mediante tratamiento de la resina de péptido con anhídrido acético
como se ha descrito más arriba. Las resinas de péptido totalmente
ensambladas, se secaron al vacío durante varias
horas.
horas.
Para cada compuesto, se eliminaron los grupos
bloqueadores y el péptido se escindió de la resina mediante el
siguiente procedimiento. Las resinas de péptido se trataron con 100
\mul de etanoditiol, 100 \mul de dimetilsulfuro, 300 \mul de
anisol y 9,5 ml de ácido trifluoroacético, por gramo de resina, a
temperatura ambiente durante 120 minutos. La resina se separó por
filtración y los filtrados se precipitaron en éter etílico
enfriado. Los precipitados se centrifugaron y la capa de éter se
decantó. El residuo se lavó con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y
se recentrifugó. Los productos crudos se secaron al vacío.
La purificación de los péptidos crudos de
efectuó mediante HPLC preparativa. Los péptidos se aplicaron a las
columnas en un volumen mínimo de AcOH/H_{2}O ó bien de TFA
0,1%/H_{2}O. La elución con gradiente empieza por regla general
con un 10% de tampón B, 10%-60% de B en 90 minutos, (tampón A: TFA
0,1%/H_{2}O, tampón B: TFA 0,1%/CH_{3}CN) a una velocidad de
flujo de 8 ml/min. La detección por UV se hizo a 280 nm. Las
fracciones se recogieron a intervalos de 1,0 - 2,5 minutos y se
inspeccionaron mediante HPLC analítica. Las fracciones dictaminadas
de alta pureza se juntaron y se liofilizaron.
La pureza de los productos finales se comprobó
mediante HPLC analítica sobre una columna de fase invertida como se
ha mencionado más arriba. La pureza de todos los productos se
dictaminó que era aproximadamente de 95-99%. Todos
los productos finales se sometieron también a la espectrometría de
masas con bombardeo rápido de electrones (FAB-EM) o
bien espectrometría de masas por electrospray
(ES-EM). Todos los productos proporcionaron los
iones M+H originales esperados, dentro de límites aceptables.
Utilizando las técnicas descritas más arriba,
pueden sintetizarse los compuestos de esta invención de acuerdo con
los siguientes esquemas de reacción.
\newpage
Esquema de reacción
A
\newpage
Esquema de reacción
B
\newpage
Esquema de reacción
C
\newpage
Esquema de reacción
D
\newpage
Esquema de reacción
F
\newpage
Esquema de reacción
G
\newpage
Esquema de reacción
H
\newpage
Esquema de reacción
I
\newpage
Esquema de reacción
J
\newpage
Esquema de reacción
K
\newpage
Esquema de reacción
L
\newpage
Esquema de reacción
M
\newpage
Esquema de reacción
N
\newpage
Esquema de reacción
O
\newpage
Esquema de reacción
Q
\newpage
Esquema de reacción
R
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
S
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
T
\newpage
Esquema de reacción
U
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de reacción
V
R^{6} es como se ha descrito
anteriormente.
Los péptidos lineales empleados aquí como los
penúltimos intermedios en las síntesis de los péptidos cíclicos de
la presente invención (estructura 1) se preparan empleando la
metodología convencional de la síntesis de péptidos en fase,
sólida, descrita en la sección anterior. Cada ciclo consta de dos
procedimientos: la escisión inicial del grupo protector Fmoc del
nitrógeno terminal de la cadena unida a la resina, seguido por la
acilación de la función amina con un aminoácido protegido con Fmoc.
El ciclo se efectúa generalmente de acuerdo con los procedimientos
escalonados indicados en el protocolo I. La desprotección se lleva a
cabo empleando una base orgánica, por ejemplo, la piperazina,
morfolina o piperidina, de preferencia la piperidina en un
disolvente inerte apropiado, por ejemplo la
N,N-dimetilformamida (DMF) o la
N-metilpirrolidona (NMP). La reacción de
copulación puede efectuarse mediante una de las muchas condiciones
desarrolladas para la formación del enlace amida, por ejemplo
O-benzotriazol-1-il
N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HBTU)
en presencia de una base orgánica, por ejemplo,
diisopropiletilamina (DIPEA) en un disolvente inerte, por ejemplo
DMF. Alternativamente en el presente caso, el grupo amida puede
formarse empleando una carbodiimida, por ejemplo,
diisopropilcarbodiimida (DIC) junto con un agente de activación tal
como el 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) en un
disolvente inerte apropiado tal como el DMF.
En el esquema de reacción A, en el primer ciclo
de preparación de los polipéptidos lineales precursores de los
péptidos cíclicos de la estructura 1, en donde Z es NHCO, la resina
Fmoc-engarce-BHA representado por
la estructura 2 se desprotege y se condensa con
Fmoc-aminoácidos de la estructura 3 para dar los
compuestos unidos a la resina 4. En esta síntesis de los péptidos
cíclicos, es necesario que el Fmoc-aminoácido 3
contenga un requisito estructural clave, el cual es una cadena
lateral básica adecuadamente protegida, que cuando se desprotege,
puede participar en la formación del enlace amida intramolecular.
Para extender la cadena creciente del péptido, un segundo ciclo
incorpora los Fmoc-aminoácidos 5 para dar los
compuestos de la estructura 6. En el tercer ciclo, el tratamiento
del péptido engarzado a la resina 6 proporciona los intermedios de
estructura 7a en donde R^{8} es hidrógeno. Los intermedios de
estructura 7b en donde R^{8} es metilo se sintetizan como se
muestra en el esquema C.
Los intermedios de estructura 7b se preparan a
partir de los compuestos de estructura 7a como muestra el esquema
C. En este procedimiento, los compuestos de estructura 7a,
preparados tratando los compuestos de estructura 6 como se ha
descrito en los pasos 1-5 del protocolo 1, se hace
reaccionar con un aril sulfonil cloruro, de preferencia el
2-nitrobencensulfonil cloruro 23 para obtener los
compuestos de estructura 24. Esta reacción se efectúa en presencia
de un receptor de protones, por ejemplo, la piridina,
trietil-amina (TEA) o DIPEA, de preferencia DIPEA
en un disolvente inerte apropiado, de preferencia DMF. La
N-metilación del grupo sulfonamida formado, en los
compuestos de estructura 24 lavados unidos a la resina, tiene lugar
en condiciones Mitsunobu para obtener el compuesto de estructura
25. Al efectuar esta reacción las sulfonamidas de estructura 24 se
hacen reaccionar con metanol en presencia de dietil azodicarboxilato
(DEAD) y trifenilfosfina empleando metanol como disolvente. Una vez
la reacción ha sido completa, la N-metilsulfonamida
de estructura 25 unida a la resina, se lava para eliminar los
reactivos residuales y productos secundarios.
En los próximos pasos como se ha indicado en el
esquema de reacción A, el residuo de
2-nitrobencensulfonilo se elimina de la estructura
25 haciendo reaccionar el 25 con 2-mercaptoetanol y
la fuerte base orgánica 1,8-diazabiciclo
[5.4.0]undec-7-eno (DBU) en
un disolvente apropiado, de preferencia DMF, para dar el compuesto
intermedio de estructura 7b unido a la resina. El tercer ciclo del
esquema de reacción A se completa mediante la copulación de
compuestos de las estructuras 7a y 7b, bien con
Fmoc-Arg(Pmc)-OH (8), ó bien
con Fmoc-Cit-OH (9), para dar los
compuestos unidos a la resina de estructura 10.
Los próximos dos ciclos mostrados en el esquema
de reacción B tienen lugar en primer lugar mediante la reacción de
los péptidos de estructura 10 con el aminoácido
Fmoc-(D)-Phe-OH para producir el
compuesto de estructura 11 y a continuación por reacción de este
compuesto de estructura 11, bien con uno de los miméticos de
aminoácido de estructura 12 ó bien 13 para incorporar estos
aminoácidos en el péptido unido a la resina para dar los
pentapéptidos unidos a la resina, de cualquiera de las estructuras
14 y 15, en función de los miméticos de aminoácido que se emplean.
La incorporación de un aminoácido adicional que contiene cadenas
laterales de ácido carboxílico en los pentapéptidos lineales,
adecuado para participar finalmente en la formación de los péptidos
cíclicos de esta invención, se efectúa de dos maneras:
a. Como ya se ha visto en el esquema de reacción
B, un Fmoc aminoácido con una cadena lateral ácida apropiadamente
protegida, se incorpora en los pentapéptidos 14 y 15 unidos a la
resina. De esta forma, en el ciclo 6 (esquema de reacción B) el
Fmoc-Asp(OtBu)-OH (16) ó el
Fmoc-Glu(OtBu)-OH (17) se
incorpora a la cadena creciente de péptido para dar los
hexapéptidos de estructura 18 y 19 respectivamente o
alternativamente, unidos a la resina.
b. Los pentapéptidos 14 y 15 unidos a la
resina se cubren con un "capuchón" en el N, con un anhídrido
cíclico de estructura 28' (esquema de reacción F) por ejemplo,
anhídrido maleico o anhídrido ftálico, para dar los compuestos de
estructura 29 y 30 ó alternativamente,
c. Como ya se ha visto en el esquema de
reacción B, los hexapéptidos 18 y 19 unidos a la resina, pueden
reaccionar posteriormente con un aminoácido adicional para formar un
heptapéptido antes de ser cubiertos por el capuchón en N. Esto se
logra mediante la incorporación en la forma habitual, de un radical
de aminoácido, de preferencia
Fmoc-Nle-OH, para dar la estructura
21 y 22.
La formación de un capuchón en N del
heptapéptido o hexapéptido produce el grupo terminal de la función
amida del compuesto 1. De esta manera, se obtienen los
substituyentes X, Y, R^{12} y R^{1}. Para formar el capuchón en
N, en los hexapéptidos (18, 19) ó heptapéptidos (21, 22) unidos a la
resina, se trata en primer lugar el polipéptido con piperidina en
DMF para eliminar el grupo protector Fmoc, y a continuación se hace
reaccionar con un agente acilante. Como se muestra en el esquema de
reacción D para producir el compuesto de estructura 1 antes de la
formación de Z en donde X e Y son CH, y R^{1} es
el polipéptido de estructura 18
unido a la resina, se desprotege y se acila en N, para dar la amida
de estructura 27 unida a la resina, o después de la desprotección
se hace reaccionar con un isocianato para formar las ureas de
estructura 28. La acilación en N puede efectuarse mediante una gran
variedad de métodos ya bien conocidos por los expertos en la
técnica. Entre los métodos empleados
están:
(i) reacción de la funcionalidad terminal
amino, con un ácido carboxílico R^{2}-CO_{2}H en
un disolvente apropiado, tal como el DMF en presencia de HBTU, y
una base orgánica, de preferencia DIPEA;
(ii) reacción de la funcionalidad terminal amino
con un cloruro de ácido carboxílico R_{2}-COCl en
un disolvente apropiado, tal como el diclorometano en presencia de
una base orgánica, tal como la piridina, TEA y DIPEA, de
preferencia DIPEA; ó
(iii) reacción de la funcionalidad terminal
amino con un anhídrido de ácido carboxílico de estructura 28' como
se muestra en el esquema de reacción F. Esta reacción se efectúa en
un disolvente adecuado tal como el diclorometano o DMF en presencia
de una base orgánica, de preferencia DIPEA.
La reacción de formación de un capuchón en N, en
el esquema de reacción D, en donde compuestos de estructura 18 se
convierten en ureas de estructura 28, se efectúa haciendo reaccionar
el grupo terminal amino en los compuestos de estructura 28 con un
isocianato R^{2}-NCO. Esta reacción tiene lugar en
un disolvente adecuado tal como el diclorometano o DMF en presencia
de una base orgánica, de preferencia DIPEA. Cuando la acilación y
las reacciones de formación de urea están completadas, los productos
de unión a la resina 27 y 28, se lavan para eliminar los reactivos
y productos secundarios residuales. Empleando similares
condiciones, la reacción de formación de un capuchón en N, de los
polipéptidos de estructura 19, 21 y 22 unidos a la resina, se
efectúa por formación de compuestos acilados en N de estructuras 33,
35, 37 y las ureas de estructura 34, 36 y 38 (esquema de reacción
E). Sin embargo, el esquema de reacción E puede ser modificado para
obtener grupos R^{14} distintos de los derivados de Nle mediante
la utilización de aminoácidos conocidos distintos del compuesto de
estructura 20, en el esquema de reacción B para producir compuestos
de estructuras 21 y 22.
Los esquemas de reacción G y H ilustran la
escisión de los grupos de protección restantes en los polipéptidos
con un capuchón en N, 29, 30, 33 - 38, y la concomitante escisión de
los péptidos del soporte sólido. Esta reacción se efectúa empleando
un ácido orgánico fuerte, de preferencia ácido trifluoroacético,
opcionalmente en presencia de un disolvente inerte tal como el
diclorometano y trazas (1%) de agua, y opcionalmente en presencia
de uno o más fijadores de carbocación, por ejemplo, etanoditiol,
sulfuro de dimetilo, trietilsilano y anisol. La solución de
escisión del polipéptido se filtra para eliminar el soporte sólido,
a continuación se diluye con un disolvente apropiado, de
preferencia éter dietílico, y los sólidos formados se recogen por
filtración. Los polipéptidos sólidos de estructuras 39 - 44
producidos en el esquema de reacción H, pueden purificarse mediante
cromatografía de fase invertida, empleando una columna preparativa
C18.
Con las funcionalidades apropiadas disponibles
ahora para formar el enlace amida intramolecular, los polipéptidos
lineales con el capuchón en N, se someten a las condiciones de
reacción de formación de amida, ya bien conocidas en la técnica. En
consecuencia cada uno por turno de los péptidos lineales 31, 32
(esquema de reacción G) y 39 - 44 (esquema de reacción I) se
disuelve en un disolvente inerte, por ejemplo, DMSO, y mediante la
adición de una base de amina terciaria, por ejemplo, la
N-metil morfolina, la solución se ajusta a un pH
aparente de 8, antes de la adición de un reactivo de formación de
amida, por ejemplo, el BOP. La reacción se efectúa convenientemente
a una temperatura entre cero grados y 40ºC, de preferencia
aproximadamente a temperatura ambiente. La reacción se deja
transcurrir hasta que se juzga que es completa. Los métodos
corrientes empleados por los medianamente expertos, para
monitorizar el progreso de una reacción, son por ejemplo, la CCF o
HPLC analítica. Después de la eliminación de los disolventes de la
reacción al vacío, los péptidos cíclicos crudos de
estructura I en donde Z es NHCO como se muestra en el esquema de
reacción I pueden ser purificados mediante cromatografía en fase
invertida empleando una columna preparativa C18. De esta forma se
producen los compuestos de estructura 1, en donde Z es un puente
NHCO.
Los péptidos cíclicos disulfuros de estructura
1, en donde Z es S-S se preparan mediante
metodologías indicadas en los esquemas de reacción, similares a las
descritas más arriba en los esquemas de reacción A a través de H
para la preparación de las lactamas de estructura 1, en donde Z es
NHCO. Los penúltimos polipéptidos lineales se ensamblan de una
manera similar con la excepción de que los aminoácidos, que
contienen radicales protegidos de la cadena lateral de tiol, por
ejemplo Fmoc-Cys(Trt)-OH, se
incorporan en las posiciones adecuadas del polipéptido creciente
unido a la resina, de preferencia en el ciclo 1 y 6. Esta
preparación de los polipéptidos lineales unidos a la resina está
ilustrada en los esquemas de reacción J y K. Como se ha descrito
anteriormente, y se ha mostrado en el esquema L, el hexapéptido
lineal 52 unido a la resina, después de eliminar el grupo de
protección Fmoc, puede cubrirse con un capuchón en N, bien por
acilación para dar el 56, o bien mediante la reacción con un
isocianato para formar la urea 57. De la misma manera, el
hexapéptido 53 unido a la resina y los heptapéptidos 54 y 55 unidos
a la resina, se convierten en los correspondientes derivados 58, 60
y 62 acilados en N, y en los derivados de urea, 59, 61 y 63 (esquema
de reacción M).
En el esquema de reacción N, el hexapéptido 56
lineal unido a la resina cubierto con un capuchón en N, se trata
con un ácido fuerte, de preferencia ácido trifluoroacético,
opcionalmente en presencia de un disolvente inerte tal como el
diclorometano y opcionalmente en presencia de uno o más fijadores de
carbocación, por ejemplo etanoditiol, sulfuro de dimetilo,
trietilsilano y anisol. Esto causa la escisión de todos los grupos
de protección de cadenas laterales así como también la escisión del
péptido lineal del soporte sólido. La reacción se efectúa
convenientemente a una temperatura entre 0ºC y 35ºC, de preferencia
a temperatura ambiente. La solución de escisión del polipéptido se
filtra para eliminar el soporte sólido, a continuación se diluye con
un disolvente apropiado, de preferencia éter dietílico y los
sólidos formados se recogen por filtración. El polipéptido sólido
de estructura 64 así producido puede ser opcionalmente purificado
mediante cromatografía de fase invertida empleando una columna
preparativa C18. El hexapéptido lineal 64 se trata a continuación en
condiciones oxidantes ya bien conocidas por los expertos en la
especialidad, que pueden inducir tioles para formar un enlace
disulfuro. En consecuencia una solución acuosa diluida de 64, se
ajusta a pH 8,0 empleando una base inorgánica moderadamente débil,
de preferencia hidróxido de amonio, y a continuación se borbotea
oxígeno a través de la solución hasta que la ciclación se dictamina
que es completa, empleando métodos estándar, por ejemplo TLC ó HPLC.
Después de eliminar los disolventes de la reacción mediante la
liofilización, el péptido cíclico crudo (I; Z = S-S)
preparado y aislado de esta manera, puede ser purificado mediante
cromatografía de fase invertida empleando una columna preparativa
C18.
En similares condiciones a las descritas hasta
aquí en conexión con los esquemas de reacción H e I, los
polipéptidos lineales 58-63 unidos a la resina,
como muestran los esquemas O y P, se desprotegen y se escinden del
soporte sólido para dar los péptidos lineales 65-70
(esquema de reacción O), los cuales a continuación se ciclan
oxidativamente como se ha descrito más arriba, para dar los
correspondientes compuestos de estructura 1 (esquema de reacción
P).
Los Fmoc-aminoácidos empleados
en la reacción de los péptidos descritos más arriba, así como
también los agentes acilantes e isocianatos empleados para formar
el capuchón en N de los polipéptidos, son compuestos conocidos que
pueden adquirirse comercialmente. Los
Fmoc-aminoácidos 12, incluyendo sus especies, el
compuesto de estructura 13, empleado en el esquema de reacción B,
se preparan como se ha descrito hasta aquí mediante métodos que ya
son bien conocidos por los expertos en la práctica de la Química
Orgánica. En el esquema Q está descrita la preparación de las
especies de Fmoc-amino-ácidos del compuesto de
estructura 12, a partir de cetonas cíclicas. Estas especies las
cuales son de la estructura 12 y la estructura 13, 79 y 80, se
preparan de la misma manera que las especies de estructura 75 como
se describe en el procedimiento del esquema Q. Las
4-fenilciclohexanonas de estructura 71 se
convierten en hidantoínas de estructura 72 mediante tratamiento con
carbonato de amonio y cianuro de potasio. La reacción se efectúa
convenientemente en una mezcla de etanol acuoso a una temperatura
de 50ºC a 90ºC, de preferencia entre 80ºC y 90ºC. La hidrólisis
directa de las hidantoínas en aminoácidos de estructura 73 requiere
un tratamiento prolongado con una base fuerte, por ejemplo, con una
solución 6N de hidróxido de sodio o con hidróxido de bario a
temperatura de reflujo. Alternativamente, los compuestos de la
estructura 72 pueden convertirse en los derivados
bis-Boc de estructura 74. La reacción se efectúa
empleando dicarbonato de terc-butilo
[(Boc)_{2}O] en un disolvente inerte, de preferencia
tetrahidrofurano (THF) en presencia de una base orgánica amínica,
de preferencia TEA y un catalizador, el
4-dimetilaminopiridina (DMAP) a una temperatura de
cero grados a temperatura ambiente, de preferencia a temperatura
ambiente. Las hidantoínas bis-Boc de estructura 74
son fácilmente convertidas en los aminoácidos de estructura 73. La
reacción tiene lugar empleando hidróxido de sodio 1N en un
disolvente inerte, de preferencia el dimetoxietano (DME) desde cero
grados a 50ºC, de preferencia a temperatura ambiente. La protección
de la funcionalidad amino con un grupo Fmoc en un compuesto de
estructura 73 se puede efectuar en una gran variedad de condiciones
de reacción para dar el compuesto de estructura 75, el cual
constituye la especie de Fmoc-aminoácido del
compuesto de estructura 12. La reacción puede efectuarse
convenientemente mediante el tratamiento de una solución del
aminoácido 73 en una mezcla de THF o dioxano, de preferencia
dioxano y carbonato de sodio acuoso con
9-fluorenilmetoxicloroformiato (FmocCl) a una
temperatura de cero grados a temperatura ambiente, de preferencia a
temperatura ambiente. Alternativamente, el
N-(9-fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida
(FmocOSu), se añade a una solución del aminoácido 73 en acetonitrilo
acuoso que contiene una base orgánica de amina terciaria, de
preferencia TEA. La reacción se efectúa de cero grados a
temperatura ambiente, de preferencia a temperatura ambiente. En otra
variación de este procedimiento, el DME se evapora de la mezcla de
hidrólisis en la conversión de 74 a 73, y la reacción se ajusta a
aprox. pH 11. La solución resultante de la sal de sodio de 73, se
trata a continuación in situ con FmocOSu ó FmocCl en dioxano
a una temperatura de cero grados a temperatura ambiente, de
preferencia a temperatura ambiente. De la misma manera, que en el
esquema de reacción Q, las tetralonas 76, las
N-aril-4-cetopiperidinas
77, y los derivados de la ciclohexanona 78, pueden convertirse en
los correspondientes Fmoc-aminoácidos de estructuras
13, 79 y 80, todos los cuales juntamente con el 73 forman un
subgénero de estructura 12 utilizado en el esquema de reacción
B.
En el esquema de reacción Q, los compuestos de
estructura 73, en donde R^{4} representa un alcoxilo inferior
lineal o ramificado, y ambos R^{2} y R^{3} son hidrógeno en el
subgénero de estructura 82, puede ser preparado mediante la
alquilación en O del compuesto de estructura 81 como se muestra en
el esquema de reacción R. Cuando R^{16} representa un grupo
alquilo inferior sin ramificar, la alquilación se efectúa empleando
un haluro de alquilo primario de estructura R^{16} en presencia
de un carbonato de metal alcalino, por ejemplo, carbonato de sodio
o potasio. El haluro de alquilo puede ser un derivado de cloro,
bromo o yodo, de preferencia un yoduro de alquilo. La reacción
puede efectuarse convenientemente en un disolvente inerte que
promueve reacciones de desplazamiento SN_{2}, por ejemplo,
acetona, 2-butanona o
N,N-dimetilformamida, de preferencia acetona, a una
temperatura desde la temperatura ambiente hasta la temperatura de
reflujo de la solución, de preferencia la temperatura de reflujo.
Cuando R^{16} representa un grupo alquilo inferior ramificado, p.
ej., 2-propilo, la alquilación del compuesto de
estructura 81 para producir el compuesto de estructura 82, se
efectúa empleando un haluro de alquilo secundario de estructura
haluro de R^{16} en presencia de un carbonato de metal alcalino,
p. ej., carbonato de potasio. El haluro de alquilo secundario es de
preferencia un yoduro de alquilo secundario, por ejemplo, el
2-yodopropano. La reacción puede efectuarse
convenientemente en un disolvente inerte, de preferencia
N,N-dimetilformamida, a una temperatura desde la
temperatura ambiente hasta la temperatura de reflujo de la
solución, de preferencia a aproximadamente 100ºC.
Las 4-arilciclohexanonas de
estructura 71, que son los materiales de partida del esquema de
reacción Q, pueden prepararse mediante métodos que ya son bien
conocidos por un experto en la práctica de la Química Orgánica.
Como se muestra en el esquema S, el tratamiento de los haluros de
arilo de estructura 83, cuando X^{1} representa bromo o yodo con
un reactivo de metal alcalino, de preferencia el
t-butillitio, da como resultado una reacción de
transmetalación para dar el correspondiente aril litio de estructura
84. La reacción se efectúa convenientemente a -78ºC mediante la
adición de una solución de alquil litio en una solución de un
compuesto de estructura 83 en un disolvente anhidro inerte, tal
como el éter dietílico o tetrahidrofurano, de preferencia
tetrahidrofurano. El aril litio de estructura 84 producido de esta
manera, se hace reaccionar a continuación in situ con una
solución de monoacetal de
ciclohexan-1,4-diona (85) en un
disolvente inerte adecuado, por ejemplo, tetrahidrofurano, mientras
la temperatura de reacción se mantiene por debajo de -60ºC, de
preferencia a aproximadamente -78ºC para dar los carbinoles de
estructura 86. Los compuestos de estructura 87 se obtienen mediante
la deshidratación de los carbinoles de estructura 86. La reacción
se efectúa convenientemente empleando un catalizador de ácido
orgánico fuerte, de preferencia ácido
p-toluensulfónico en un disolvente inerte, por
ejemplo, benceno o tolueno, de preferencia benceno, a temperatura
de reflujo del disolvente. El agua formada se elimina de la mezcla
de re-acción con ayuda de un aparato Dean Stark
para lograr que la reacción sea completa. Los compuestos de
estructura 88, se obtienen mediante la hidrogenación de las
olefinas de estructura 87. La reacción se efectúa convenientemente
empleando un catalizador de un metal noble, por ejemplo, paladio
sobre carbón en atmósfera de hidrógeno en un disolvente inerte, por
ejemplo, etanol o acetato de etilo. La hidrogenación se efectúa
habitualmente a temperatura ambiente y 40 psi de hidrógeno, aunque
si el anillo de arilo de la estructura 87 contiene un grupo con
tendencia a la hidrogenación, p. ej., si R^{3}, R^{4}, ó R^{5}
representan cloro, la presión de reacción se mantiene a
aproximadamente 5 psi. Los compuestos de estructura 88 pueden ser
también obtenidos directamente a partir de los carbinoles de
estructura 86 mediante la eliminación reductora del grupo hidroxilo.
En esta reacción, una solución del compuesto de estructura 86
(R^{3} = R^{4} = H y R^{5} = OMe) en un disolvente inerte,
por ejemplo diclorometano, se trata con un ácido Lewis, tal como el
trifluoruro eterato de boro, y un agente reductor, por ejemplo el
trietilsilano a una temperatura desde cero grados a temperatura
ambiente. La eliminación del grupo protector del acetal en los
compuestos de estructura 88, da la cetona de fórmula 71, la cual es
el material de partida del esquema de reacción Q para la preparación
de las especies de Fmoc-aminoácido de estructura 75
del compuesto de estructura 12. La reacción es convenientemente
efectuada en acetona ó 2-butanona, de preferencia
acetona en catálisis ácida, por ejemplo ácido clorhídrico 4N ó ácido
p-toluensulfónico desde temperatura ambiente hasta
la temperatura de reflujo de la mezcla de reacción, de preferencia,
a la temperatura de reflujo.
Las beta-tetralonas
5-substituidas de estructura 76, que aparecen en el
esquema de reacción Q, las cuales son el material de partida para
la preparación del compuesto de estructura 13, son compuestos ya
conocidos, o si no son conocidos, pueden prepararse por métodos ya
conocidos por un experto en el campo de la Química Orgánica. En el
caso presente, los compuestos de estructura 76 se preparan
básicamente mediante dos métodos mostrados en los esquemas de
reacción T y U. Como se muestra en el esquema T, un ácido
hidrocinámico 2-substituido, de estructura 90, se
convierte en el correspondiente cloruro de ácido carboxílico de
estructura 91. Esta conversión puede efectuarse mediante varios
métodos, por ejemplo, mediante el tratamiento del ácido
hidrocinámico con cloruro de oxalilo, opcionalmente en presencia de
una cantidad catalítica de N,N-dimetilformamida, en
un disolvente inerte, tal como el benceno o diclorometano, de
preferencia el diclorometano. La reacción puede efectuarse
convenientemente a la temperatura desde cero grados hasta
temperatura ambiente, de preferencia a temperatura ambiente.
Alternativamente el compuesto de estructura 90 se hace reaccionar
con un reactivo que forma el cloruro de acilo tal como el cloruro
de sulfurilo en un disolvente inerte, por ejemplo, benceno o
tolueno, de preferencia tolueno a una temperatura entre la
temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la solución, de
preferencia a la temperatura de reflujo. La diazocetona de
estructura 92 se prepara mediante tratamiento del haluro de acilo
así formado de estructura 91 en un disolvente inerte, p. ej.,
diclorometano con un exceso de una solución etérea de diazometano
recién preparada. La combinación de reactivos se efectúa
convenientemente a la temperatura del baño de hielo y la reacción
se deja a continuación que prosiga a una temperatura desde cero
grados hasta la temperatura ambiente, de preferencia la temperatura
ambiente. Como se muestra en el esquema de reacción T, la ciclación
de la diazocetona de estructura 92 para obtener la tetralona de
estructura 76, se promueve mediante el dímero de acetato de rodio
(II) en un disolvente inerte, p. ej., el diclorometano. La reacción
se efectúa normalmente desde temperatura ambiente hasta la
temperatura de reflujo de la solución, de preferencia a la
temperatura de reflujo.
Los compuestos de estructura 76, los cuales son
el material de partida del esquema de reacción Q, en donde R^{6}
representa un grupo alcoxilo inferior lineal o ramificado, puede
prepararse como se muestra en el esquema de reacción U, a partir de
compuestos de estructura 93. En el esquema de reacción U, los
compuestos de estructura 94 en donde R^{15} es un grupo alquilo
inferior sin ramificar, se prepara mediante
per-O-alquilación del naftalendiol
de estructura 93 con un yoduro o bromuro de alquilo primario, de
preferencia un yoduro, en presencia de una base tal como un
carbonato de metal alcalino, por ejemplo, carbonato de sodio o
potasio. La reacción puede efectuarse en un disolvente inerte, de
preferencia N,N-dimetilformamida a una temperatura
desde la temperatura ambiente a 100ºC, de preferencia a 35ºC. Los
compuestos de estructura 97 en donde R^{15} es un alquilo
inferior ramificado, se preparan en dos pasos a partir de la
2-tetralona de estructura 94. La tetralona de
estructura 95 se somete a deshidrogenación en presencia de un
catalizador de metal noble, tal como el metal paladio (10% en
carbón) en un disolvente apropiado de alto punto de ebullición tal
como el p-cimeno, para dar el compuesto aromatizado
de estructura 96. El naftol de estructura 96 se
O-alquila a continuación con un yoduro de alquilo
secundario en presencia de una base tal como un carbonato de metal
alcalino, de preferencia carbonato de cesio para dar el compuesto de
estructura 97. La reacción puede efectuarse convenientemente en un
disolvente inerte, de preferencia
N,N-dimetilformamida a una temperatura desde la
temperatura ambiente hasta 100ºC, de preferencia, a aproximadamente
40ºC.
Las tetralonas de estructuras 76 se obtienen por
reducción de los compuestos de estructuras 94 y 97 en condiciones
de disolución del metal, seguido por una hidrólisis ácida catalizada
de los intermedios enol éteres. La transformación se efectúa
convenientemente mediante la adición en porciones de un gran exceso
de un metal alcalino tal como el sodio o el potasio, de preferencia
el sodio, a una solución a ebullición del substrato en un alcohol
inferior, de preferencia etanol, hasta que todo el material de
partida se ha consumido. Las tetralonas de estructuras 76 se
obtienen mediante el tratamiento de una solución de los enol éteres
intermedios aislados, con un catalizador ácido fuerte, de
preferencia ácido p-toluensulfónico. La hidrólisis
puede efectuarse convenientemente en una mezcla de un alcohol
inferior, de preferencia etanol, y agua a una temperatura entre la
temperatura ambiente y la temperatura de reflujo de la solución, de
preferencia la temperatura de reflujo.
En la preparación de los compuestos de
estructura 77, utilizados en el esquema de reacción Q como
materiales de partida para la obtención de los compuestos de
fórmula 79, los cuales son las especies de
Fmoc-aminoácido del compuesto de estructura 12, el
compuesto de estructura 98 se emplea como material de partida. Esto
se muestra en el esquema de reacción V. En el esquema de reacción
V, los compuestos de estructura 100 pueden prepararse mediante
reacciones ya de por sí conocidas. Por ejemplo, pueden prepararse
por copulación de la amina secundaria de estructura 98 con un
bromuro o yoduro de arilo, de preferencia un yoduro de arilo de
estructura 99 (esquema de reacción V). La reacción de copulación se
cataliza mediante un catalizador de metal noble, de preferencia
tri(dibencilidenacetona)dipaladio, en presencia de un
ligando de fosfina quelante, de preferencia
tri-o-tolilfosfina, y una base
alcóxido inhibida tal como el terc-butóxido de
sodio. La reacción se efectúa convenientemente en una atmósfera
inerte empleando un disolvente inerte tal como el dioxano o tolueno,
de preferencia dioxano, a una temperatura desde 60ºC hasta la
temperatura de reflujo, de preferencia a 90ºC. La eliminación del
grupo de protección carbonilo en el compuesto 100 para dar
compuestos de estructura 77, puede efectuarse mediante una variedad
de métodos bien conocidos en el campo de la Química Orgánica. Por
ejemplo, la desprotección puede efectuarse mediante el tratamiento
de una solución del compuesto 100 en una cetona de bajo punto de
ebullición tal como la acetona ó la 2-butanonacon
una solución acuosa de un ácido mineral, por ejemplo, ácido
clorhídrico 6N a una temperatura desde temperatura ambiente hasta la
temperatura de reflujo de la mezcla, de preferencia a temperatura
de reflujo, El compuesto de estructura 100 cuando se trata de esta
forma con un ácido mineral acuoso, forma en el esquema de reacción
V, el compuesto de estructura 77. El compuesto de estructura 77,
como se ha demostrado en la discusión del esquema de reacción Q es
el intermedio para el compuesto de estructura 79, el cual
constituye las especies del ácido de estructura 12, en donde Q
es
En el esquema de reacción A, los aminoácidos de
estructura 5, son compuestos ya conocidos, en donde
R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
Por otro lado, los aminoácidos de estructura 5,
en donde R^{17} en R^{9} es alquilo inferior, es decir, cuando
R^{9} es
se preparan a partir de un
compuesto de fórmula 101 mediante el esquema de reacción V, como
sigue:
\newpage
Esquema de reacción
W
Como se muestra en el esquema de reacción W, el
\beta-metil(nin-mes)triptófano
109, se preparó empleando el mismo método anteriormente descrito
por Boteju, L.W., Wenger K., y Hruby, V.J. Tet. Lett., 33,
7491 (1992). En el primer paso el nitrógeno del ácido
trans-indol-3-acrílico 101 se
protege por conversión en la correspondiente mesitilensulfonamida
102. La reacción se efectuó por tratamiento del ácido indol 101 con
un exceso (> 2 equiv.) de una solución de un reactivo alquil o
aril litio, por ejemplo fenil litio o n-butillitio,
de preferencia n-butillitio en un disolvente
inerte, de preferencia tetrahidrofurano, a una temperatura desde
-40ºC hasta aproximadamente -100ºC, lo más conveniente a -78ºC.
Manteniendo la temperatura de reacción a aproximadamente -78ºC, las
especies dilitiadas formadas se hicieron reaccionar con cloruro de
mesitilensulfonilo para obtener la mesitilensulfonamioda 102. El
ácido indol acrílico N-protegido, 102, se copula a
continuación con el auxiliar quiral
(R)-4-fenil-2-oxazolidinona
(ver preparación en Nicolas y col., J. Org. Chem.
1993, 58, 766-770) como sus especies
N-litiadas 104, para dar la acrilamida quiral 105.
La copulación se efectuó mediante un anhídrido mixto formado a
partir de 102. Para formar el anhídrido mixto 103, el ácido indol
acrílico N-protegido 102, se hizo reaccionar con un
cloruro de ácido adecuado, por ejemplo el cloroformiato de
t-butilo, el cloruro de
2,4,6-triclorobenzoilo o cloruro de pivaloilo, de
preferencia cloruro de pivaloilo en presencia de una base amina
terciaria, por ejemplo, trietilamina o diisopropiletilamina, de
preferencia trietilamina. Los criterios que hacen posible la
selección de un cloruro de acilo adecuado para formar el anhídrido
103 están bien establecidos y son conocidos por una persona
medianamente experta en Química Orgánica. La formación del anhídrido
se efectúa en un disolvente inerte, por ejemplo, tetrahidrofurano a
una temperatura inicial entre -100ºC y 0ºC, de preferencia
aproximadamente -78ºC. Se deja que se complete la reacción a una
temperatura entre -78ºC y 0ºC, de preferencia a aproximadamente
0ºC. El anhídrido mixto así formado 103, se hace reaccionar a
continuación in situ con una solución de
(R)-4-fenil-2-oxazolidinona
N-litiada 104, previamente preparada tratando una
solución de
(R)-4-fenil-2-oxazolidinona
en un disolvente inerte, por ejemplo, tetrahidrofurano, con una
cantidad equimolar de una solución de un reactivo alquil o aril
litio, por ejemplo fenil litio o n-butillitio, de
preferencia n-butillitio en un disolvente inerte,
por ejemplo, hexano a una temperatura entre 100ºC y cero grados, de
preferencia a aproximadamente -78ºC. La reacción de copulación la
cual proporciona la acrilamina quiral 105, se efectúa a una
temperatura inicial entre -100ºC y cero grados, de preferencia
aproximadamente -78ºC, y después de que todos los reactivos están
combinados, se deja que la reacción transcurra a una temperatura
entre -78ºC y temperatura ambiente, de preferencia a
aproximadamente la temperatura ambiente.
El momento culminante de la transformación de la
acrilamida quiral 105 en 106, es la generación controlada de los
dos nuevos centros quirales contiguos presentes en 106. La reacción
comprende la adición del 1,4-conjugado
estereoselectivo (adición de Michael) de un cuprato de metilo
formado in situ a partir del complejo bromuro
cuproso-sulfuro de dimetilo, y bromuro de metil
magnesio, al receptor Michael, el sistema carbonilo
\alpha,\beta-insaturado presente en 105. El
enolato metal-quelato resultante se halogena
directamente a continuación con un agente halogenante, de
preferencia N-bromosuccinimida, para dar el 106. De
nuevo, como en el caso de la adición Michael, la incorporación del
átomo de bromo es estereoselectiva, controlada mediante el
voluminoso grupo fenilo en el auxiliar quiral el cual efectivamente
resguarda la cara si tanto del sistema aciloxazolidinona
\alpha,\beta-insaturado como del intermedio
enolato metal-quelado, del ataque de los nuevos
reactivos. Para preparar el cuprato de metilo, se añade una
solución de bromuro de metil magnesio en éter dietílico a una
solución de complejo bromuro cuproso-sulfuro de
dimetilo (1:1) en un disolvente inerte, por ejemplo, sulfuro de
dimetilo o tetrahidrofurano, de preferencia una mezcla de los
mismos. La reacción tiene lugar a una temperatura entre -78ºC y la
temperatura ambiente, de preferencia a -4ºC. En lugar de bromuro de
metil magnesio puede añadirse cualquier bromuro de alquilo inferior
para formar R^{17} cuando R^{17} es un grupo alquilo inferior
distinto de metilo. A esta solución formada de cuprato de metilo,
se añade in situ una solución de la aciloxazolidinona
\alpha,\beta-insaturada 105 en un disolvente
inerte, de preferencia tetrahidrofurano. La adición de cuprato de
metilo se efectúa inicialmente a una temperatura entre -30ºC y la
temperatura ambiente, de preferencia a -4ºC y a continuación se
prosigue a temperatura ambiente. Cuando se dictamina que la
reacción se ha completado (p. ej., mediante análisis CCF o HPLC) se
enfría a continuación a una temperatura entre -100ºC y -40ºC, de
preferencia a aproximadamente -78ºC, después de lo cual se añade
una solución de un agente halogenante, de preferencia
N-bromosuccinimida en un disolvente inerte, por
ejemplo, tetrahidrofurano. A continuación se deja que la reacción
prosiga a una temperatura entre 0ºC y la temperatura ambiente, de
preferencia a temperatura ambiente, para dar, después de aislarlo,
el bromuro 106. El bromuro se desplaza a continuación mediante el
ión azida con una inversión concomitante de la configuración. Esta
transformación se efectúa mediante la reacción del bromuro 106 con
la azida de tetrabutilamonio en presencia de un exceso de azida de
sodio en un disolvente inerte, por ejemplo, acetonitrilo para dar
la azida 107. La reacción se efectúa convenientemente a una
temperatura entre 80ºC y la temperatura ambiente, de preferencia a
temperatura ambiente. El tratamiento de 107 y un hidróxido de metal
alcalino o por ejemplo hidróxido de sodio, potasio o litio, de
preferencia hidróxido de litio en presencia de peróxido de
hidrógeno dio como resultado la hidrólisis del auxiliar quiral para
dar el ácido azido 108. La reacción de hidrólisis se efectúa en un
disolvente inerte, de preferencia agua, a una temperatura entre 0ºC
y la temperatura ambiente, de preferencia aproximadamente 0ºC. La
hidrogenación del ácido \alpha-azido 108 da el
\beta-metil(nin-mes)triptófano
el cual se convierte inmediatamente en el correspondiente
N(\alpha)-Fmoc-\beta-metil(nin-mes)triptófano
109. La hidrogenación del 108 se efectúa con un catalizador de
metal noble, de preferencia Pd 10%/C en un disolvente inerte, por
ejemplo, un alcanol inferior, de preferencia metanol a baja presión
(< 2 atmósferas) y a temperatura ambiente. Después de eliminar
el catalizador por filtración, se eliminaron los volátiles y el
producto se disolvió en un disolvente inerte, por ejemplo,
tetrahidrofurano o agua, de preferencia una mezcla de los mismos, y
se trató con una base inorgánica suave, por ejemplo, un bicarbonato
de metal alcalino, de preferencia bicarbonato de sodio, y un
reactivo formador del grupo Fmoc N-protector, por
ejemplo el
9-fluorenilmetil-cloroformiato
(Fmoc-Cl) ó el
9-fluorenilmetil-N-succinimidil
carbonato (Fmoc-OSu), de preferencia el
Fmoc-Osu para dar el 109. La reacción se efectúa
convenientemente a una temperatura entre 0ºC y la temperatura
ambiente, de preferencia a temperatura ambiente. El compuesto de
fórmula 109 es una especie de aminoácido de estructura 5 en el
esquema de reacción A.
La presente invención se refiere también a un
procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula:
en donde R^{1} a R^{12}, m, p,
Q, X, Y y Z son como se ha definido más arriba mediante la formación
de un enlace lactama o un enlace disulfuro en la posición Z de los
péptidos lineales
precursores.
La presente invención se refiere también a
composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos como se han
definido más arriba y una carga terapéuticamente inerte.
Los compuestos de fórmula I y I así como el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH_{2};
y penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)beta
metil-Trp-Lys-NH_{2},
preparados de acuerdo con esta invención pueden ser preparados en
composiciones farmacéutica adecuadas para la administración o
inhalación con una carga o vehículo adecuado, mediante métodos ya
conocidos en la especialidad.
Los compuestos como se han descrito más arriba
pueden emplearse como medicamentos, p. ej., en forma de
preparaciones farmacéuticas, p. ej., para administración
parenteral. Pueden administrarse por ejemplo, parenteralmente, p.
ej., en forma de soluciones para inyección o soluciones para
infusión.
La producción de preparaciones farmacéuticas
puede efectuarse de una manera que es familiar a cualquier persona
experta en la especialidad, convirtiendo los compuestos que se han
descrito más arriba, opcionalmente en combinación con otras
substancias terapéuticamente valiosas, en una forma de
administración juntamente con materiales de carga adecuados no
tóxicos, inertes, terapéuticamente compatibles, sólidos o líquidos
y, si se desea, con excipientes farmacéuticos habituales.
Materiales de carga adecuados no son solamente
materiales de carga inorgánicos, sino también materiales de carga
orgánicos.
Entran en consideración como excipientes
farmacéuticos, estabilizantes, conservantes, agentes humectantes y
emulsionantes, agentes para aumentar la consistencia, agentes para
aumentar el sabor, sales para variar la presión osmótica,
substancias tampón, solubilizantes, colorantes y agentes
enmascarantes y antioxidantes.
La dosificación de los compuestos descritos más
arriba puede variar entre amplios límites, en función de la
enfermedad que debe controlarse, la edad y la condición individual
del paciente, y el modo de administración, y se ajustará por
supuesto, a los requisitos individuales de cada caso particular.
Para los pacientes adultos una dosificación diaria de
aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 1000 mg, especialmente
desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 500 mg, entra en
consideración. En función de la dosificación es conveniente
administrar la dosificación diaria en varias unidades de
dosificación.
Las preparaciones farmacéuticas contienen
convenientemente aproximadamente 1-500 mg, de
preferencia 5-200 mg de un compuesto como se ha
descrito más arriba.
Los compuestos preparados de acuerdo con esta
invención presentan una actividad selectiva agonista del receptor
de la MC-4 in vitro. Es sabido que los
agonistas de la actividad MC4-R ocasionan una
reducción de la ingestión de alimento en un modelo de ratón de la
obesidad humana. Por lo tanto la administración de estos compuestos
estimula la actividad MC4-R, lo cual es importante
en la regulación del peso corporal. La composición farmacéutica que
contiene los compuestos de esta invención puede ser formulada a una
concentración efectiva para la administración por varios medios a
un paciente humano o animal que experimenta una indeseable elevación
del peso corporal, bien solo o como parte de una condición médica
adversa o enfermedad, tal como la diabetes mellitus tipo II. Pueden
emplearse una gran variedad de técnicas de administración. Las
cantidades medias del compuesto activo pueden variar y en
particular deben estar basadas sobre las recomendaciones y
prescripción de un médico o veterinario cualificado.
En consecuencia, la presente invención se
refiere también al empleo de compuestos como se han definido más
arriba, para la preparación de medicamentos para el tratamiento y/o
profilaxis de enfermedades que están asociadas con la actividad del
receptor de la melanocortina-4. Los compuestos son
especialmente de utilidad para el tratamiento y/o profilaxis de la
obesidad. La invención se refiere también a un compuesto como se ha
definido más arriba, cuando se obtiene mediante un procedimiento
como se ha descrito más arriba. Además, la invención se refiere a
compuestos como se han definido más arriba para emplear como
substancias activas terapéuticas, particularmente como substancias
activas terapéuticas para el tratamiento y/o profilaxis de
enfermedades que están asociadas con el receptor de la
melanocortina-4, p. ej., la obesidad.
Esta invención se comprenderá mejor con
referencia a los siguientes ejemplos, los cuales ilustran pero no
limitan la invención descrita hasta aquí, En las estructuras de
compuestos específicos que aparecen en la sección de ejemplos, los
hidrógenos han sido generalmente omitidos por comodidad.
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-fenilciclohexanona (10,0 g, 57,5 mmol) en etanol
(100 ml) y agua (33 ml) en una botella de vidrio de presión, se
adicionó carbonato amónico (33 g, 344 mmol, 6 equivalentes) y
cianuro potásico (5,6 g, 86,2 mmol, 1,5 equivalentes). Se calentó
la mezcla a 80-90ºC durante 24 horas. Se adicionó
la mezcla reaccional enfriada a agua helada (400 ml) y se agitó
vigorosamente durante 30 minutos. Se filtró por succión el
precipitado resultante, se lavó a fondo de agua y se secó, lo que
dió la hidantoina A en forma de un sólido blanco (14,0 g,
rendimiento del 100%) ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}):
8,63 (s, 1H), 7,23-7,36 (m, 4), 7,15 (m, 1), 2,50
(m, 1H), 2,10 (m, 1H), 1,85 (d, 1H) y 1,55-1,80 (m,
6H).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió la hidantoina A (10,0 g) en NaOH
acuoso (6N, 350 ml) y se calentó a 130ºC durante 2-3
días. Después de completada la hidrólisis se neutralizó la mezcla
reaccional con HCl concentrado hasta ligera acidez (pH \sim6).
Se filtró la suspensión resultante, se lavó con agua y se secó, lo
que dió ácido
1-amino-4-fenil-ciclohexan
carboxílico (APC) en forma de un sólido blanco (25 g, rendimiento
>100%, contaminado con sal inorgánica) que se utilizó
directamente para la etapa siguiente. Se purificó una pequeña
porción del producto crudo sobre HPLC. ^{1}HRMN
(DMSO-d_{6}): 7,23\sim7,7,35 (m, 2),
7,10-7,19 (m, 3H), 2,45 (m, 1H),
1,92-2,18 (m, 3H), 1,56-1,78 (m, 4H)
y 1,20 (m, 1H); LRMS) (electropulverización) m/e 220
(M+1)^{+}, Calculado para C_{13}H_{17}NO_{2},
219.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido
1-amino-4-fenilciclohexan
carboxílico crudo (APC) de la última etapa (25 g) se suspendió en
dioxano (300 ml) y Na_{2}CO_{3} al 10% acuoso (150 ml) y se
agitó vigorosamente durante la noche. Se concentró la mezcla
reaccional para separar el dioxano, se neutralizó con HCl 6N hasta
ligeramente acídico (pH 5-6) y se extrajo con
EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se lavaron con salmuera y
se secó sobre Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el
producto crudo que luego se purificó sobre cromatografía flash
(hexano/EtOAc a CH_{2}Cl_{2}/MeOH), para dar
Fmoc-cis-APC puro (18,2 g, rendimiento global del 72% para
dos etapas) y Fmoc-trans-APC (2,1 g, 8%).
Fmoc-cis-APC, ^{1}H RMN(CD_{3}OD), 7,79 (d, 2H),
7,72 (d, 2H), 7,37 (t,2), 7,24-7,32 (m, 4),
7,14-7,23 (m, 3), 4,37 (d, 2H), 4,24 (t, 1H), 2,55
(m, 1H), 2,28 (m, 2H), 1,84-1,96 (m, 2H) y
1,64-1,73 (m, 4H).
\newpage
Etapa
1
Una solución de
4-(4-hidroxifenil)ciclohexanona (5,0 g, 26,3
mmol) en acetona (100 ml) se trató con K_{2}CO_{3} (14,5 g, 105
mmol, 4 equiv.) y yodometano (4,9 ml, 11,2 g, 78,6 mmol, 3 equiv.).
Se calentó la reacción a 65ºC durante la noche. Después se separó
el disolvente, se trató el residuo con H_{2}O y se extrajo con
EtOAc. Se combinaron los extractos orgánicos y se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en vacío,
lo que dió la
4-(4-metoxifenil)-ciclohexanona
espectroscópicamente pura (5,34 g, 100%). ^{1}H RMN (CDCl_{3})
7,16 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 3,78 (s, 3H), 2,99 (tt, 1H),
2,47-2,53 (m, 4H), 2,20 (m, 2H) y
1,83-1,98 (m, 2H); MS(electropulverización)
m/e, 205 (M+1)^{+}, Calculado para
C_{13}H_{16}O_{2}, 204.
Etapa
2
A una solución de
4-(4-metoxifenil)-ciclohexanona
(3,86 g, 18,9 mmol) en etanol (50 ml) y agua (15 ml) en una botella
de presión de vidrio, se adicionó carbonato amónico (14,5 g, 151
mmol, 8 equiv.) y cianuro potásico (2,0 g, 30,7 mmol, 1,6 equiv.).
Se calentó la mezcla a 80-90ºC durante 24 horas. Se
adicionó la mezcla reaccional enfriada a agua helada (300 ml) y se
agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se filtró por succión el
precipitado resultante, se lavó a fondo con agua y se secó, lo que
dió la hidantoina B en forma de un sólido blanco (4,75 g,
rendimiento del 91%). MS (electropulverización) m/e 273
(M-H), Calculado para
C_{15}H_{18}N_{2}O_{3}, 274.
Etapa
3
A una suspensión de la hidantoina B (18,7 g,
68,25 mmol) en THF seco (450 ml) se adicionó di-ter-butil
dicarbonato (37,2 g, 170,5 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (10,5
ml, 7,59 g, 75,0 mmol, 1,1 equiv.) y DMAP (460 mg, 3,65 mmol) en
sucesión. Alrededor de 15 minutos después de la adición la reacción
viro a una solución amarillo claro y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. Se concentró la mezcla reaccional bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que luego se recogió en
EtOAc (800 ml), se lavó con HCl 1N (3 x 50 ml), Na_{2}CO_{3}
acuoso saturado (2 x 50 ml) y salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo presión reducida. El
producto amarillo claro crudo se purificó mediante cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 70/30), lo que dió la
bis-Boc hidantoina C pura en forma de un sólido
blanco (27,6 g, 87%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,28 (dt, 2H), 6,88
(dt, 2H), 3,79 (s, 3H), 2,14-2,24 (m, 2H), 1,59 (s,
9H) y 1,38 (s, 9H); (electropulverización m/e 538
(M+MeCN+Na)^{+}, Calculado para
C_{25}H_{34}N_{2}O_{7}, 474.
Etapa
4
La bis-Boc hidantoina C (15,08
g, 31,78 mmol) se disolvió en DME (500 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (290 ml, 290 mmol) y
se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
1-amino-4-(4-metoxifenil)ciclohexano
(4-MeOAPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. A esta solución (\sim300 ml) se adicionó
DME (300 ml) y una solución de Fmoc-OSu (16,7 g,
49,42 mmol) en DME (200 ml) y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente la mezcla reaccional. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar DME, se acidificó con
HCl 3N, extraído con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos
combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y
se concentró. El producto crudo se purificó a través de
cromatografía flash (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 98/2 \rightarrow
90/10), lo que dió el producto puro
Fmoc-4-MeOAPC en forma de un sólido
blanco (12,4 g, rendimiento del 83% a partir de la
bis-Boc hidantoina C). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,76 (d, 2H), 7,40
(t,2H), 7,30 (t, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,85 (d, 2H), 3,71 (s, 3H); MS
(electropulverización) m/e 470 (M-H),
Calculado para C_{29}H_{29}NO_{5}, 471.
Etapa
1
Una solución de
4-(4-hidroxifenil)ciclohexanona (5,0 g, 26,3
mmol) en acetona (100 ml) se trató con K_{2}CO_{3} (14,5 g, 105
mmol, 5 equiv.) y yodoetano (10,5 ml, 20,5 g, 131 mmol, 3 equiv.).
Se calentó la reacción a 65ºC durante la noche. Después se separó
el disolvente, se trató el residuo con H_{2}O y se extrajo con
EtOAc. Se combinaron los extractos orgánicos y se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en vacío,
lo que dió la
4-(4-metoxifenil)-ciclohexanona
espectroscópicamente pura (5,74 g, 100%). ^{1}H RMN (CDCl_{3})
7,15 (dt, 2H), 6,86 (dt, 2H), 4,02 (q, 2H), 2,99 (tt, 1H),
2,46-2,54 (m, 4H), 2,16-2,24 (m,
2H) y 1,83-2,00 (m, 2H) y 1,41 (t, 3H);
MS(electropulverización) m/e, 219 (M+1)^{+},
Calculado para C_{14}H_{168}O_{2}, 218.
Etapa
2
A una solución de
4-(4-metoxifenil)-ciclohexanona
(4,15 g, 19,01 mmol) en etanol (50 ml) y agua (15 ml) en una
botella de presión de vidrio, se adicionó carbonato amónico (14,5 g,
151 mmol, 8 equiv.) y cianuro potásico (2,05 g, 31,42 mmol, 1,6
equiv.). Se calentó la mezcla a 80-90ºC durante 24
horas. Se adicionó la mezcla reaccional enfriada a agua helada
(300 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se filtró por
succión el precipitado resultante, se lavó a fondo con agua y se
secó, lo que dió la hidantoina D en forma de un sólido blanco (5,17
g, rendimiento del 94%). MS (electropulverización) m/e 287
(M-H), Calculado para
C_{16}H_{20}N_{2}O_{3}, 288.
Etapa
3
A una suspensión de la hidantoina D (4,22 g,
14,65 mmol) en THF seco (100 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (7,98 g,
36,60 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (2,3 ml, 1,63 g, 16,11 mmol,
1,1 equiv.) y DMAP (89,4 mg, 0,73 mmol) en sucesión. Alrededor de
15 minutos después de la adición la reacción viro a una solución
amarillo claro y se agitó durante la noche a temperatura ambiente.
Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida, lo que dió
un sólido que luego se recogió en EtOAc (300 ml), se lavó con HCl 1N
(3 x 20 ml), Na_{2}CO_{3} acuoso saturado (2 x 20 ml) y
salmuera (2 x 20 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró bajo presión reducida. El producto amarillo claro crudo
se purificó mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10
\rightarrow 70/30), lo que dió la bis-Boc
hidantoina E pura en forma de un sólido blanco (7,01 g, 98%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02 (q,
2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) y 1,38 (s, 9H); MS
(electropulverización m/e 999 (2M+Na)^{+}, Calculado
para C_{26}H_{36}N_{2}O_{7}, 488.
Etapa
4
La bis-Boc hidantoina E (6,58 g,
13,46 mmol) se disolvió en DME (200 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (121 ml, 121 mmol) y
se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
1-amino-4-(4-metoxifenil)-ciclohexano
(4-MeOAPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. A esta solución (\sim130 ml) se adicionó
DME (100 ml) y una solución de Fmoc-OSu (6,83 g,
20,24 mmol) en DME (30 ml) y se agitó durante la noche a temperatura
ambiente la mezcla reaccional. Se concentró la mezcla reaccional
bajo presión reducida para separar DME, se acidificó con HCl 3N,
extraído con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos combinados
con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró. El producto crudo se purificó a través de cromatografía
flash (CH_{2}Cl_{2}/MeOH, 98/2 \rightarrow 90/10), lo que
dió el producto puro Fmoc-4-MeOAPC
en forma de un sólido blanco (5,56 g, rendimiento del 85% a partir
de la bis-Boc hidantoina E). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40
(td,2H), 7,30 (td, 2H), 7,11 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 3,97 (q, 2H) y
1,29 (t, 3H); MS (electropulverización) m/e 484
(M-H), Calculado para C_{30}H_{31}NO_{5},
485.
Etapa
1
A una solución de
4-(4-hidroxifenil)ciclohexanona (2,00 g,
10,52 mmol) en etanol (30 ml) y agua (10 ml) en una botella de
vidrio de presión, se adicionó carbonato amónico (6,17 g, 64,2 mmol,
6 equivalentes) y cianuro potásico (1,07 g, 15,8 mmol, 1,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante la noche. Se adicionó la mezcla reaccional enfriada a agua
helada (200 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resultante, se lavó a fondo de
agua y se secó, lo que dió la hidantoina F en forma de un sólido
blanco (2,56 g, rendimiento del 94%). MS (electropulverización
m/e 261 (M+H)^{+}, Calculado para
C_{14}H_{16}N_{2}O_{3}, 260.
Etapa
2
Se suspendió la hidantoina F (2,10 g, 8,06 mmol)
en NaOH acuoso (6N, 100 ml) y se calentó a 130ºC durante
2-3 días. Después de completada la hidrólisis se
neutralizó la mezcla reaccional con HCl concentrado hasta ligera
acidez (pH \sim6). Se filtró la suspensión resultante, se lavó
con agua y se secó, lo que dió ácido
1-amino-4-(4-hidroxifenil)ciclohexan
carboxílico (4-HOAPC) en forma de un sólido blanco
(rendimiento 3,1 g, >100%, contaminado con sal inorgánica). MS
(electropulverización m/e 236 (M+H)^{+}, Calculado
para C_{13}H_{17}NO_{3}, 235.
Etapa
3
El ácido
1-amino-4-(4-hidroxifenil)ciclohexan
carboxílico crudo (4-HOAPC) de la última etapa (3,1
g) se suspendió en dioxano (100 ml) y Na_{2}CO_{3} al 10%
acuoso (50 ml) y se agitó vigorosamente durante la noche. Se
concentró la mezcla reaccional para separar el dioxano, se
neutralizó con HCl 6N hasta ligeramente acídico (pH
5-6) y se extrajo con EtOAc. Los extractos
orgánicos combinados se lavaron con salmuera y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el producto
crudo que luego se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc
a CH_{2}Cl_{2}/MeOH), para dar
Fmoc-4-HOAPC (rendimiento global
2,76 g, 75% para dos etapas). ^{1}H RMN(CD_{3}OD), 7,78
(d, 2H), 7,72 (d, 2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,04 (d, 2H),
6,72 (dt, 2H), 4,38 (d, 2H), 4,25 (t, 1H), 2,46 (m, 1H),
2,24-2,34 (m, 2H) y 1,81-1,92 (m,
6H); MS (electropulverización) m/e 456
(M-H), Calculado para C_{28}H_{27}NO_{5},
457.
Etapa
1
Una solución de
4-(4-hidroxifenil)ciclohexanona (65,0 g, 31,6
mmol) en DMF (90 ml) se trató con K_{2}CO_{3} (21 g, 158 mmol,
5 equiv.) y 2-yodopropano (15 ml, 26,8 g, 158 mmol,
5 equiv.). Se calentó la reacción a 100ºC durante la noche.
Después se separó el disolvente, se trató el residuo con H_{2}O y
se extrajo con EtOAc. Se combinaron los extractos orgánicos y se
lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en
vacío, lo que dió la
4-(4-isopropoxifenil)ciclohexanona
espectroscópicamente pura (7,02 g, 95%). ^{1}H RMN (CDCl_{3})
7,14 (dt, 2H), 6,84 (dt, 2H), 4,3 (septete, 1H), 2,97 (tt, 1H),
2,46-2,52 (m, 4H), 2,16-2,24 (m,
2H), 1,83-1,98 (m, 2H) y 1,33 (d, 6H).
Etapa
2
A una solución de
4-(4-isopropoxifenil)-ciclohexanona
(5,1 g, 21,98 mmol) en etanol (90 ml) y agua (30 ml) en una botella
de presión de vidrio, se adicionó carbonato amónico (12,6 g, 131
mmol, 6 equiv.) y cianuro potásico (2,14 g, 32,9 mmol, 1,5 equiv.).
Se calentó la mezcla a 80-90ºC durante 24 horas.
Se adicionó la mezcla reaccional enfriada a agua helada (300 ml) y
se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se filtró por succión
el precipitado resultante, se lavó a fondo con agua y se secó, lo
que dió la hidantoina G en forma de un sólido blanco (6,60 g,
rendimiento del 99%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}):
10,60 (s, 1H), 8,65 (s, 1H), 7,18 (d, 2H), 6,80 (d, 2H), 4,52
(septete, 1H), 2,43 (m, 1H), 1,85-2,15 (m, 2H),
1,56-1,80 (m, 6H) y 1,22 (d, 6H); MS
(electropulverización) m/e 301 (M-H),
Calculado para C_{17}H_{22}N_{2}O_{3}, 302.
Etapa
3
A una suspensión de la hidantoina G (5,8 g,
19,20 mmol) en THF seco (180 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (10,46 g,
48,0 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (2,9 ml, 2,13 g, 21,12 mmol,
1,1 equiv.) y DMAP (140 mg, 1,15 mmol) en sucesión. Alrededor de
15 minutos después de la adición la reacción viro a una solución
amarillo claro y se agitó durante la noche a temperatura ambiente.
Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida, lo que dió
un sólido que luego se recogió en EtOAc (600 ml), se lavó con HCl 1N
(3 x 40 ml), Na_{2}CO_{3} acuoso saturado (2 x 40 ml) y
salmuera (2 x 40 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró bajo presión reducida. El producto amarillo claro crudo
se purificó mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10
\rightarrow 80/20), lo que dió la bis-Boc
hidantoina H pura en forma de un sólido blanco (9,4 g, 98%).
^{1}H RMN(CDCl_{3}): 7,27 (dt, 2H), 6,87 (dt, 2H), 4,02
(q, 2H), 2,98 (t, 1H), 2,26-2,56 (m, 4H),
2,14-2,24 (m, 2H), 1,76-1,86 (m,
2H), 1,59 (s, 9H), 1,43 (t, 3H) y 1,38 (s, 9H); MS
(electropulverización) m/e 999 (2M+Na)^{+},
Calculado para C_{26}H_{36}N_{2}O_{7}, 488.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
La bis-Boc hidantoina E (4,34 g,
8,64 mmol) se disolvió en DME (100 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (78 ml, 78 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
4-(4-isopropoxi-fenil)ciclohexan
carboxílico (4-iPrOAPC) con HCl 6N para ajustar el
pH a 11-12. A esta solución (\sim90 ml) se
adicionó DME (120 ml) y una solución de Fmoc-OSu
(3,49 g, 10,34 mmol, 1,2 equiv.)) en DME (20 ml) y se agitó la
reacción durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la
mezcla reaccional bajo presión reducida para separar DME, se
acidificó con HCl 3N, extraído con EtOAc. Se lavaron los extractos
orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}
anhidro y se concentró. El producto crudo se purificó a través de
cromatografía flash (hexano/EtOac \rightarrow
CH_{2}Cl_{2}/MeOH), lo que dió el producto puro
Fmoc-4-iPrOAPC en forma de un
sólido blanco (rendimiento 3,23, 75% a partir de la
bis-Boc hidantoina H). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,76 (d, 2H), 7,60 (d, 2H), 7,39
(t,2H), 7,31 (t, 2H), 7,08 (d, 2H), 6,84 (d, 2H), 4,24 (m, 1H) y
1,34 (d, 6H); MS (electropulverización) m/e 498
(M-H), Calculado para C_{31}H_{33}NO_{5},
499.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 4-yodotolueno
(10,9 g, 50,0 mmol) en THF seco (180 ml) a -78ºC se adicionó una
solución de n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50 mmol) en
hexano durante 20 minutos. Se agitó la reacción durante otros 20
minutos antes de adicionarse a gotas una solución de
1,4-ciclohexandiona mono-etilen
cetal (6,0 g, 38,46 mmol) en THF seco (100 ml). Después se agitó
durante 2 horas a -78ºC, se enfrió la reacción con NH_{4}Cl acuoso
y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos
combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se
concentró en vacío, lo que dió el producto I espectroscópicamente
puro en forma de un sólido blanco (rendimiento 9,34 g, 98%). ^{1}H
RMN (CDCl_{3}): 7,41 (m, 2H), 7,16 (d, 2H), 3,98 (m, 4H), 2,34
(s, 3H); MS (EI) m/e 248 (M^{+}), Calculado para
C_{15}H_{20}O_{3}, 248.
\newpage
Etapa
2
A una solución del alcohol I (9,10 g, 36,65
mmol) en benceno seco (200 ml) en un matraz equipado con un
separador Dean-Stark, se adicionó monohidrato de
ácido p-toluensulfónico (650 mg) y se calentó la
reacción a 100ºC durante 3 horas. Se enfrió la reacción hasta
temperatura ambiente, diluyó con EtOAc (500 ml) y se lavó con
Na_{2}CO_{3} acuoso (50 ml), salmuera (3 x 50 ml), se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró bajo presión reducida, lo que
dió el producto espectroscópicamente puro J (rendimiento 8,36 g,
100%), que se utilizó para la etapa siguiente sin purificación. MS
(EI) m/e 230 (M^{+}), 190
(M-OCH_{2}CH_{2}O), Calculado para
C_{15}H_{18}O_{2}, 230.
Etapa
3
A una solución de la olefina J (7,49 g) en EtOAc
(180 ml) se adicionó Pd/C (5% en peso sobre carbón, 800 mg) y se
llevó la reacción bajo 40 psi de hidrógeno durante 3 horas a
temperatura ambiente. Se separó por filtración el catalizador y se
concentró el filtrado, lo que dió el producto K espectroscópicamente
puro en forma de un aceite incoloro (rendimiento 7,40 g, 100%). MS
(EI) m/e 232 (M^{+}), 188
(M-OCH_{2}CH_{2}), Calculado para
C_{15}H_{20}O_{2} 232.
Etapa
4
Una solución del cetal K (6,90 g) en acetona
(140 ml) se trató con HCl 4N (60 ml) y se calentó a 65ºC durante 4
horas. Se separó el disolvente y se diluyó el residuo con EtOAc y
neutralizó con HCl 4N. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó y
se concentró. La
4-(4-metilfenil)ciclohexanona cruda
resultante se utilizó para la etapa siguiente sin purificación (5,57
g, rendimiento cuantitativo). MS (EI) m/e 188 (M^{+}),
Calculado para C_{13}H_{16}O, 188.
Etapa
5
A una solución de
4-(4-metilfenil)ciclohexanona (5,32 g, 28,3
mmol) en etanol (90 ml) y agua (30 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (16,3 g, 169,8 mmol, 6 equiv.)
y cianuro potásico (3,68 g, 56,5 mmol, 2 equiv.). Se calentó la
mezcla a 80-90ºC durante la noche. Se adicionó la
mezcla reaccional a agua helada (400 ml) y se agitó vigorosamente
durante 30 minutos. Se filtró por succión el precipitado
resultante, se lavó a fondo con agua y se secó para dar la
hidantoina L en forma de un sólido blanco (rendimiento 6,3 g, 86%).
MS (electropulverización) m/e 517 (2M+H), Calculado para
C_{15}H_{18}ClN_{2}O_{2}, 258.
Etapa
6
A una suspensión de la hidantoina L (5,82 g,
22,5 mmol) en THF seco (250 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (12,3 g,
56,4 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (3,5 ml, 2,5 g, 24,7 mmol, 1,1
equiv.) y DMAP (275 mg, 2,25 mmol) en sucesión. La reacción viro a
una solución amarillo claro y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. Se concentró la mezcla reaccional bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que luego se recogió en
EtOAc (500 ml), se lavó con HCl 1N (3 x 50 ml), Na_{2}CO_{3}
acuoso saturado (2 x 50 ml) y salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo presión reducida. El
producto amarillo claro crudo se purificó mediante cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 80/20), lo que dió la
bis-Boc hidantoina M pura en forma de un sólido
blanco (rendimiento 10,03 g, 100%). ^{1}H RMN(CDCl_{3}):
7,26 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,00 (m, 1H), 2,32 (s, 3H), 1,59 (s,
9H) y 1,37 (s, 9H).
Etapa
7
La bis-Boc hidantoina M (6,40 g,
13,97 mmol) se disolvió en DME (200 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (120 ml, 120 mmol) y
se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
1-amino-4-(4-isometil-fenil)ciclohexan
carboxílico (4-MeAPC) con HCl 6N para ajustar el pH
a 11-12. A esta solución (\sim140 ml) se adicionó
DME (240 ml) y una solución de Fmoc-OSu (5,10 g,
15,13 mmol, 1,1 equiv.) en DME (40 ml) y se agitó la reacción
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar DME, se acidificó con
HCl 3N, extraído con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos
combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y
se concentró. El producto crudo se purificó a través de
cromatografía flash (hexano/EtOac \rightarrow
Ch_{2}Cl_{2}/MeOH), lo que dió el producto puro
Fmoc-4-MeAPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento 4,35, 69% a partir de la
bis-Boc hidantoina M). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H),
7,24-7,43 (m, 4H), 7,02-7,14 (m,
4H), 4,25 (m, 3H), 2,24 (s, 3H).
Etapa
1
A una solución de
4-clorofenilbromuro (7,5 g, 39,2 mmol) en THF seco
(180 ml) se enfrió a -78ºC y se trató a gotas con una solución de
n-BuLi (1,6 M, 25 ml, 40 mmol) en hexano durante 20
minutos. Se agitó la reacción durante otros 30 minutos antes de
adicionarse a gotas una solución de
1,4-ciclohexandiona mono-etilen
cetal (6,0 g, 38,46 mmol) en THF seco (100 ml). Después se agitó
durante 1 horas a -78ºC, se enfrió la reacción con NH_{4}Cl
acuoso y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos
combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4}, se
concentró en vacío, lo que dió el producto N espectroscópicamente
puro en forma de un sólido blanco (rendimiento de 9,40 g, 98%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,45(m, 2H), 7,31 (m, 2H), 3,99
(m, 4H), 2,02-2,20 (m, 4H),
1,75-1,82 (m, 2H), 1,66-1,73 (m,
2H), 1,54 (s, 1H); MS (EI) m/e 268 (M-OH),
250 (M-H_{2}O), Calculado para
C_{14}H_{17}O_{3}, 268.
Etapa
2
A una solución del alcohol N (6,78 g, 25,30
mmol) en benceno seco (120 ml) en un matraz equipado con un
separador Dean-Stark, se adicionó monohidrato de
ácido p-toluensulfónico (960 mg) y se calentó la
reacción en reflujo durante 3 horas. Se enfrió la reacción hasta
temperatura ambiente, diluyó con EtOAc (500 ml) y se lavó con
Na_{2}CO_{3} acuoso (50 ml), salmuera (3 x 50 ml), se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró bajo presión reducida, lo que
dió el producto espectroscópicamente puro O (rendimiento 6,30 g,
100%), que se utilizó para la etapa siguiente sin purificación. MS
(EI) m/e 250 (M^{+}), 190
(M-OCH_{2}CH_{2}O), Calculado para
C_{14}H_{15}O_{2}, 250.
Etapa
3
A una solución de la olefina O (6,11 g) en EtOAc
(120 ml) se adicionó Pd/C (5% en peso sobre carbón, 600 mg) y se
llevó la reacción bajo 5 psi de hidrógeno durante 3 horas a
temperatura ambiente. Se separó por filtración el catalizador y se
concentró el filtrado, lo que dió el producto P espectroscópicamente
puro en forma de un aceite incoloro (rendimiento 6,10 g, 100%). MS
(EI) m/e 252 (M^{+}), Calculado para
C_{14}H_{17}ClO_{2} 252.
Etapa
4
Una solución del cetal P (5,81 g, 23,06 mmol) en
acetona (200 ml) se trató con monohidrato de ácido
p-toluensulfónico (876 mg) y se calentó a 60ºC
durante la noche. Se separó el disolvente y se recogió el residuo
en EtOAc, se lavó con solución de Na_{2}CO_{3} acuosa,
salmuera, se secó y se concentró, lo que dió el producto crudo en
forma de un aceite amarillo (rendimiento de 5,38 g, >100%). La
purificación mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc 80/20
\rightarrow 60/40 dió
4-(4-clorofenil)ciclohexanona en forma de un
aceite amarillo claro (4,54 g, rendimiento del 95%). EM (EI)
m/e 208 (M^{+}), Calculado para C_{12}H_{13}ClO_{2},
208.
Etapa
5
A una solución de
4-(4-clorofenil)ciclohexanona (4,26 g, 20,48
mmol) en etanol (90 ml) y agua (30 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (13,8 g, 144 mmol, 7 equiv.) y
cianuro potásico (3,56 g, 54,77 mmol, 2,5 equiv.). Se calentó la
mezcla a 80-90ºC durante la noche. Se adicionó la
mezcla reaccional a agua helada (400 ml) y se agitó vigorosamente
durante 30 minutos. Se filtró por succión el precipitado
resultante, se lavó a fondo con agua y se secó para dar la
hidantoina Q en forma de un sólido blanco (rendimiento 5,58 g,
98%). MS (electropulverización) m/e 277
(M-H), Calculado para
C_{14}H_{15}ClN_{2}O_{2}, 278.
Etapa
6
A una suspensión de la hidantoina Q (5,15 g,
18,5 mmol) en THF seco (250 ml) se adicionó di-ter-butil
dicarbonato (10,1 g, 46,3 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (2,8 ml,
2,07 g, 20,45 mmol, 1,1 equiv.) y DMAP (226 mg, 1,85 mmol) en
sucesión. La reacción viro a una solución amarillo claro y se agitó
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida, lo que dió un sólido que luego se
recogió en EtOAc (500 ml), se lavó con HCl 1N (3 x 50 ml),
Na_{2}CO_{3} acuoso saturado (2 x 50 ml) y salmuera (2 x 50
ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo
presión reducida. El producto amarillo claro crudo se purificó
mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow
80/20), lo que dió la bis-Boc hidantoina R pura en
forma de un sólido blanco (rendimiento 8,05 g, 91%). MS
(electropulverización) m/e 542 (M+Ma+MeCN), Calculado para
C_{24}H_{31}ClN_{2}O_{6}, 478
Etapa
7
La bis-Boc hidantoina R (6,41 g,
13,97 mmol) se disolvió en DME (200 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (120 ml, 120 mmol) y
se agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
1-amino-4-(4-clorofenil)ciclo-hexan
carboxílico (4-ClAPC) con HCl 6N para ajustar el pH
a 11-12. A esta solución (\sim180 ml) se adicionó
DME (240 ml) y una solución de Fmoc-OSu (5,31 g,
15,74 mmol, 1,1 equiv.)) en DME (40 ml) y se agitó la reacción
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar DME, se acidificó con
HCl 3N, se extrajo con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos
combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y
se concentró. El producto crudo se purificó a través de
cromatografía flash (CH_{2}Cl_{2}(MeOH, 98/2
\rightarrow 90/10), lo que dió el producto puro
Fmoc-4-ClAPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento 5,04, 76% a partir de la
bis-Boc hidantoina). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d, 2H),
7,19-7,42 (m,8H), 4,20-4,31 (m, 3H);
MS (electropulverización) m/e 474 (M-H),
Calculado para C_{28}H_{26}CnNO_{4}, 475.
Etapa
1
A una solución de 3-yodoanisol
(11,7, 50,0 mmol, 1,3 equiv.) en THF seco (180 ml) a -78ºC se
adicionó una solución de n-BuLi (1,6 M, 31,0 ml, 50
mmol, 1,3 equiv) en hexano durante 25 minutos. Se agitó la reacción
durante otros 30 minutos antes de adicionarse a gotas una solución
de 1,4-ciclohexandiona mono-etilen
cetal (6,0 g, 38,46 mmol) en THF seco (100 ml). Después de
agitación durante 2 horas a -78ºC se enfrió la reacción con
NH_{4}Cl acuoso y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los extractos
orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre Na_{2}So_{4},
se concentró en vacío, lo que dió el producto S espectroscópicamente
puro en forma de un sólido blanco (rendimiento 9,34 g, 98%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,26 (dd, 1H, 7,06-7,11
(m, 2H), 6,79 (dd, 1H), 3,98 (m, 4H), 3,81 (s, 3H).
Etapa
2
A una solución agitada del alcohol S (5,6 g,
21,21 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (200 ml) bajo una atmósfera de
nitrógeno a temperatura de baño de sal-hielo, se
adicionó en sucesión trietilsilano (10,2 ml, 7,4 g, 63,63 mmol, 3
equivalentes) y trifluoruro de boro etereato (21,5 ml, 24,1 g, 169,7
mmol, 8 equivalentes). Luego se dejó calentar la mezcla reaccional
hasta temperatura ambiente y se agitó durante 3 horas antes de
lavarse con solución de K_{2}CO_{3} acuoso al 10% y H_{2}O,
se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en vació, lo que dió
el compuesto de desoxigenación en forma de un aceite (4,91 g), que
fue suficientemente puro para uso directo. El intermedio crudo se
disolvió en acetona (130 ml) y se trató con HCl 4N (60 ml) y se
calentó a 65ºC durante 4 horas. Se separó el disolvente bajo
presión reducida y se diluyó el residuo con EtOAc y neutralizó con
solución de NaOH 4N. Se extrajo la fase acuosa con EtOAc y se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó y
se concentró. Se purificó el residuo resultante mediante
cromatografía flash sobre gel de sílice (80/20 \rightarrow
60/40), lo que dió
4-(3-metoxifenil)ciclohexanona (rendimiento
global 3,67 g, 85%) en forma de un aceite amarillo. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}): 7,25 (dt, 1H), 6,75-6,86 (m, 3H),
3,81 (s, 3H)), 300 (tt, 1H); MS (EI) m/e 204 (M+). Calculado
para C_{13}H_{16}O_{2}. 204.
Etapa
3
A una solución de
4-(3-metoxifenil)ciclohexanona (3,10 g, 15,20
mmol) en etanol (60 ml) y agua (20 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (8,75 g, 91,20 mmol, 6
equivalentes) y cianuro potásico (1,98 g, 30,40 mmol, 2
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante la noche. Se adicionó la mezcla reaccional enfriada a agua
helada (300 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resultante, se lavó mediante agua
y se secó, lo que dió la hidantoina T en forma de un sólido blanco
(rendimiento 4,08 g, 98%). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): 7,11 (d, 1H),
6,70-6,94 (m, 3H), 3,72 (s, 3H); MS
(electropulverización) m/e 316 (M+MeCN+H), Calculado para
C_{15}H_{18}N_{2}O_{3}, 274.
Etapa
4
A una suspensión de la hidantoina T (5,29 g,
19,30 mmol) en THF seco (250 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (10,5 g,
48,16 mmol; 2,5 equiv.), trietilamina (3,0 ml, 2,17 g, 21,52 mmol,
1,1 equiv.) y DMAP (235 mg, 1,92 mmol) en sucesión. La reacción
viro a una solución amarillo claro y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. Se concentró la mezcla reaccional bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que luego se recogió en
EtOAc (500 ml), se lavó con HCl 1N (3 x 50 ml), Na_{2}CO_{3}
acuoso saturado (2 x 50 ml) y salmuera (2 x 50 ml), se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró bajo presión reducida. El
producto amarillo claro crudo se purificó mediante cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 80/20 \rightarrow 60/40), lo que dió la
bis-Boc hidantoina U pura en forma de un sólido
blanco (rendimiento 8,70 g, 95%). MS (electropulverización)
m/e 538 (M+MeCN+Na), Calculado para
C_{25}H_{34}N_{2}O_{7}, 474.
Etapa
5
La bis-Boc hidantoina U (2,30 g,
4,84 mmol) se disolvió en DME (200 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (44 ml, 44 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, dando
una mezcla ligeramente turbia. La HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
1-amino-4-(3-metoxifenil)-ciclohexan
carboxílico (3-MeOAPC) con HCl 6N para ajustar el
pH a 11-12. A esta solución (\sim40 ml) se
adicionó dioxano (80 ml) y Fmoc-Cl (1,73 g, 6,76
mmol, 1,4 equiv.) y se agitó la reacción durante la noche a
temperatura ambiente. Se concentró la mezcla reaccional bajo
presión reducida para separar DME, se acidificó con HCl 3N y se
extrajo con EtOAc. Se lavaron los extractos orgánicos combinados
con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se
concentró. El producto crudo se purificó a través de cromatografía
flash sobre gel de sílice (CH_{2}Cl_{2}(MeOH, 98/2
\rightarrow 90/10), lo que dió el producto puro
Fmoc-4-MeOAPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento 1,98, 87% a partir de la
bis-Boc hidantoina U). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,75 (d, 2H), 7,40
(td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,21 (m, 1H), 6,71-6,80 (m,
3H), 3,72 (s, 3H); MS (electropulverización) m/e 474 (M+Na),
Calculado para C_{29}H_{29}NO_{5}, 471.
Etapa
1
Una mezcla de ácido
3-(2-bromofenil)propanoico (preparado en 2
etapas a partir de bromuro de 2-bromobencilo, 2,0
g, 8,73 mmol), cloruro de oxalilo (1,14 ml, 13,1 mmol) y cloruro de
metileno (20 ml) se enfrió en un baño de hielo y se adicionó
N,N-dimetilformaida (34 \mul, 0,44 mmol). Se
agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 3 horas. La
concentración en vacío dió cloruro de
3-(2-bromofenil)propanol que se recogió en
cloruro de metileno y se utilizó en la etapa siguiente como un
crudo.
Etapa
2
Una solución del cloruro ácido anterior (crudo,
8,73 mmol) en cloruro de metileno se adicionó lentamente una
solución de diazometano (generado a partir de 5,70 g de
1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina)
en éter (40 ml) enfriado en un baño de hielo. Luego se calentó la
mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se
concentró la mezcla en vacío y se purificó mediante cromatografía de
columna (10 \rightarrow 20% acetato de etilo/hexanos), lo que
dió
1-diazo-4-(2-bromofenil)butan-2-ona
(1,88 g, 85% sobre 2 etapas). ^{1}H RMN (CDCl_{3} delta 7,50
(1H, d, fenilo), 7,24 (2H, m, fenilo), 7,06 (1H, fenilo), 5,21 (1H,
s ancho, diazo), 3,05 (2H, t, bencílico), 2,62 (2H, m).
Etapa
3
A una mezcla de acetato de rodio (II) dímero (15
mg, 0,068 mmol) en cloruro de metileno (120 ml) bajo reflujo se
adicionó lentamente una solución de
1-diazo-4-(2-bromofenil)butan-2-ona
(1,74 g, 6,85 mmol) en cloruro de metileno (30 ml). Después de
completada la adición se sometió a reflujo la mezcla durante veinte
minutos mas. Se enfrió la mezcla a temperatura ambiente, se
adicionó ácido trifluoroacético (1,5 ml) y se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante una hora. Se enfrió la reacción con
solución saturada de bicarbonato sódico. Se separaron las fases y
se lavó la fase de cloruro de metileno una vez mas con solución
saturada de bicarbonato sódico. Se reextrajeron las fases acuosas
combinadas con cloruro de metileno. Se secaron las fases orgánicas
combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtró y se concentró en
vacío, lo que dió un aceite pardo. La purificación mediante
cromatografía de columna (10 \rightarrow 15% acetato de
etilo/hexanos) dió
5-bromo-beta-tetralona
(1,18 g, rendimiento del 77%) en forma de un aceite incoloro.
^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 7,46 (1H, t, fenilo),
7,05-7,09 (2H, m, fenilo), 3,58 (2H, s, bencílico),
3,22 (2H, t-bencílico), 2,54 (2H, t).
Etapa
4
Una mezcla de
5-bromo-beta-tetralona
(1,18 g, 5,24 mmol), cianuro potásico (512 mg, 7,86 mmol), carbonato
amónico (3,0 g, 31,22 mmol), etanol (25 ml y agua (5 ml) en un
matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de
aceite de 80ºC durante 4 días. Después de enfriamiento a
temperatura ambiente se virtió la suspensión blanca en
agua-hielo y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. La filtración seguida de secado por aire dió
hidantoina V (1,31 g, 85%). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) delta 10,71 (1H, ancho, NH), 8,28
(1H, ancho s, NH), 7,0-7,5 (3H, m, fenilo). LRMS
(electropulverización): C_{12}H_{11}brN_{2}O_{2}, Calculado
294; observado: 293 (M-H), 295
(M-H).
Etapa
5
Una mezcla de hidantoina V (1,287 g, 4,36 mmol),
Ba(OH)_{2}.H_{2}O (4,20 g, 22,2 mmol) en agua (25
ml) en un matraz de presión de gruesa pared sellado, se calentó en
un baño de aceite de 125ºC durante 4 días. Se enfrió la mezcla
reaccional a temperatura ambiente, acidificó a \simpH 3 utilizando
ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba vigorosamente. Se agitó la
suspensión en un baño de agua hirviente durante una hora y se
enfrió a temperatura ambiente. Se filtró la suspensión y se lavó
los precipitados con agua. Se concentraron el filtrado y lavazas
combinados en vacío a \sim20 ml. La neutralización con hidróxido
amónico concentrado dió un precipitado blanco que se filtró, lavó
con agua y se secó en vacío durante la noche, lo que dió ácido
5-bromo-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 893 mg, 76%). LRMS (Electropulverización):
C_{11}H_{12}BrNO_{2}, Calculado: 269; observado: 270 (M+H),
272 (M+H), 268 (M-H), 270
(M-H).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
5-bromo-2-aminotetralin-2-carboxílico
(882 mg, 3,27 mmol),trietilamina (0,60 ml, 4,30 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 1,32 g, 3,91 mmol) en acetonitrilo (30
ml) y agua (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la
noche. El análisis de TLC de la reacción al día siguiente indicó
la presencia de material de partida aminoácido. Se adicionó
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato (0,25 g),
trietilamina (0,6 ml) y acetonitrilo (5 ml) y se agitó la mezcla a
temperatura ambiente durante otro día. Se concentró la mezcla
reaccional en vacío para separar la mayor parte del acetonitrilo, se
acidificó hasta pH \sim3 con solución acuosa de ácido cítrico al
10%, y se extrajo la emulsión dos veces con cloruro de metileno.
Se lavaron los fases orgánicas combinadas con agua, salmuera, se
secó sobre sulfato de magnesio. La filtración y concentración
dieron un aceite crudo que se purificó mediante cromatografía de
columna (eluido con 2 \rightarrow 5 \rightarrow
metanol/cloruro de metileno al 10%), lo que dió ácido
Fmoc-5-bromo-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (1,09 g, 68%) en forma de un sólido blanco. HRMS (FAB):
C_{26}H_{22}BrNNaO_{4} (m+na) calculado: 514,0630; observado:
514,0643.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
3-(2-clorofenil)propanoico (5,0 g, 27,1
mmol), cloruro de tionilo (10,9 ml, 149 mmol) y tolueno (85 ml) se
sometió a reflujo durante dos horas. La concentración en vacío dió
cloruro de 3-(2-clorofenil)propanol que se
recogió en cloruro de metileno y se utilizó en la etapa siguiente
sin ulterior purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del cloruro de ácido anterior
(crudo, 27,1 mmol) en cloruro de metileno se adicionó lentamente a
una solución de diazometano (generado de 17,8 g de
1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina)
en éter (120 ml) enfriado en un baño de hielo. Luego se calentó la
mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se
concentró la mezcla en vacío, lo que dió
1-diazo-4-(2-clorofenil)butan-2-ona
(5,87 g, >100% sobre 2 etapas) en forma de un aceite amarillo
brillante. El compuesto se utilizó en la etapa siguiente sin
ulterior purificación. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta
7,05-7,32 (4H, m, fenilo), 5,13 (1H, s ancho,
diazo), 3,00 (2H, t, bencílico), 2,57 (2H, m).
\newpage
Etapa
3
A una mezcla de acetato de rodio (II) dímero (60
mg, 0,27 mmol) en cloruro de metileno (400 ml) bajo reflujo se
adicionó lentamente una solución de
1-diazo-4-(2-bromofenil)butan-2-ona
cruda (5,87 g, 27,1 mmol teórico) en cloruro de metileno (50 ml).
Después de completada la adición, se sometió a reflujo la mezcla
durante veinte minutos mas. Se enfrió la mezcla hasta temperatura
ambiente, se adicionó ácido trifluoroacético (6,0 ml) y se agitó la
mezcla a temperatura ambiente durante dos horas. Se enfrió la
reacción con solución saturada de bicarbonato sódico. Se separaron
las fases y se lavó la fase de cloruro de metileno una vez mas con
solución saturada de bicarbonato sódico. Se reextrajeron las fases
acuosas combinadas con cloruro de metileno. Se secaron las fases
orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtró y se
concentró en vacío, lo que dió un aceite pardo. La purificación
mediante cromatografía de columna (10 \rightarrow 15% acetato
de etilo/hexanos) dió
5-cloro-beta-tetralona
(rendimiento de 3,32 g, 68% para las etapas l a 3) en forma de un
aceite pardo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 7,30 (1H, m,
fenilo), 7,15 (1H, t, fenilo), 7,05 (1H, d, fenilo), 3,60 (2H, s,
bencílico), 3,22 (2H, t, bencílico), 2,56 (2H, t).
Etapa
4
Una mezcla de
5-cloro-beta-tetralona
(80 mg, 4,87 mmol), cianuro potásico (500 mg, 7,67 mmol), carbonato
amónico (2,85 g, 29,7 mmol), etanol (24 ml) y agua (6 ml) en un
matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de
aceite a 80ºC durante 66 horas. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se virtió la suspensión en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. Filtración seguido de secado al aire dió
hidantoina W (0,92 g, 75%) en forma de un sólido baige claro.
^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) delta 10,70 (1H, ancho,
NH), 8,25 (1H, s ancho, NH), 7,0-7,3 (3H, m,
fenilo). LRMS (Electropulverización):
C_{12}H_{11}ClN_{2}O_{2}, calculado: 250; observado: 249
(M-H), 251 (M-H).
Etapa
5
Una mezcla de hidantoina W (880 mg, 3,51 mmol),
Ba(OH)_{2}.H_{2}O (3,40 g, 18,0 mmol) en agua (50
ml, con dilución excesiva) en un matraz de presión de gruesa pared
sellado, se calentó en un baño de aceite de 125ºC durante 2 días.
Se enfrió la mezcla reaccional a temperatura ambiente, acidificó a
\simpH 3 utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba
vigorosamente. Se agitó la suspensión en un baño de agua hirviente
durante dos horas y se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró la
suspensión y se lavaron los precipitados con agua. Se concentraron
el filtrado y lavazas combinados en vacío a \sim50 ml. La
neutralización con hidróxido amónico concentrado dió un precipitado
blanco que se filtró, lavó con agua y se secó en vacío durante la
noche, lo que dió ácido
5-cloro-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 788 mg, 99%). LRMS (Electropulverización):
C_{11}H_{12}ClNO_{2}, Calculado: 225; observado: 226 (M+H),
228 (M+H), 224 (M-H), 226 (M-H).
\newpage
Etapa
6
Una mezcla de ácido
5-bromo-2-aminotetralin-2-carboxílico
(402 mg, 1,78 mmol),trietilamina (0,38 ml, 2,73 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 904 mg, 2,68 mmol) en acetonitrilo (20
ml) y agua (20 ml) se agitó a temperatura ambiente durante dos
días. El análisis de TLC de la reacción después de dos días indicó
la presencia de material de partida aminoácido. Se adicionó
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato (0,12 g) y
trietilamina (0,1 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante otro día. Se concentró la mezcla reaccional en vacío para
separar la mayor parte del acetonitrilo, se acidificó hasta pH
\sim3 con solución acuosa de ácido cítrico al 10%, y se extrajo la
emulsión dos veces con cloruro de metileno. Se lavaron los fases
orgánicas combinadas con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de
magnesio. La filtración y concentración dieron un aceite crudo que
se purificó mediante cromatografía de columna (eluido con 3
\rightarrow 6 \rightarrow metanol/cloruro de metileno al
10%), lo que dió ácido
Fmoc-5-cloro-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento de 540 mg, 68%) en forma de un sólido blanco.
HRMS (EI): C_{26}H_{22}ClNO_{4} (M) Calculado: 447,1237;
observado: 447,1234.
Etapa
1
Una mezcla de ácido
5-metoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (preparado de conformidad con Obrecht, D. et. al.
Helv. Chim Acta. 1992, 75, 1666) (802 mg, 3,62 mmol),
trietilamina (0,62 ml, 4,45 mmol), 9-fluorenilmetil
succinimidil carbonato (Fmoc-OSu, 1,47 g, 4,36 mmol)
en acetonitrilo (25 ml) y agua (25 ml) se agitó a temperatura
ambiente durante 30 horas. El análisis de TLC de la reacción indicó
la presencia de material de partida aminoácido. Se adicionó
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato (370 mg) y
trietilamina (0,6 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante otras 24 horas. Se concentró la mezcla reaccional en vacío
para separar la mayor parte del acetonitrilo, acidificó hasta pH
\sim3 con solución de ácido cítrico acuosa al 10%, y se extrajo
la emulsión blanca tres veces con acetato de etilo. Se lavaron las
fases orgánicas combinadas con agua, salmuera y se secó sobre
sulfato de magnesio. La filtración y concentración dió un aceite
crudo que se purificó mediante cromatografía de columna (eluido con
1 \rightarrow 3 \rightarrow 5 \rightarrow 10% metanol/cloruro
de metileno), lo que dió
Fmoc-5-metoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 1,14 g, 71%) en forma de un sólido desteñido.
HRMS (FAB): C_{27}H_{26}NO_{5} (M+H) calculado: 444,1812;
observado: 444,1814.
Etapa
1
Una mezcla de
1,6-dihidroxinaftaleno (5,02 g, 31,3 mmol),
carbonato potásico anhidro (52,0 g, 376 mmol),
N,N-dimetilformamida (50 ml) y yodoetano (15 ml,
188 mmol) se agitó en un baño de aceite a 35ºC durante 24 horas. Se
filtró la mezcla reaccional y se lavó el residuo sólido a fondo con
éter etílico. Se combino el filtrado y las lavazas y se concentró
en vacío para separar la mayor parte de los disolventes. Se
repartió el residuo pardo entre agua y éter y se separaron las
fases. Se lavó la fase etérea con agua. Se reextrajeron con éter
las fases acuosas combinadas. Se combinaron los extractos etéreos,
se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio. La
filtración y concentración dió un sólido pardo crudo (6,74 g,
rendimiento del 99%). La recristalización del producto crudo en
metanol caliente dió 1,6-dietoxinaftaleno
(rendimiento 4,36 g, 64%, primera cosecha) en forma de un sólido
pardo claro. ^{1}J RMN (CDCl_{3}) delta 8,20 (1H, d, fenil),
7,06-7,36 (4H, m, fenil), 6,66 (1H, dd, fenilo),
4,10-4,23 (4H, 2 juegos de q, CH_{2}),
1,45-1,56 (6H, 2 juegos de t, 2 CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución en reflujo de
1,6-dietoxinaftaleno (4,15 g, 19,2 mmol) en etanol
absoluto (100 ml) se adicionó cuidadosamente pequeños trozos de
metal de sodio (6,8 g, 296 mmol) durante 60 minutos. Se sometió a
reflujo la mezcla durante otros 90 minutos. TLC indicó la
presencia de material de partida sin reaccionar. Se adicionó metal
de sodio extra (1,0 g, 43,5 mmol) y se sometió a reflujo la mezcla
reaccional durante otros 60 minutos. Se enfrió la reacción hasta
temperatura ambiente, se templó con agua y acidificó con ácido
clorhídrico concentrado. Se concentró la mezcla en vacío para
separar la mayor parte del etanol. Se extrajo la mezcla acuosa tres
veces con éter. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua
y se secó sobre sulfato sódico. La filtración y concentración dió
un sólido pardo que se disolvió en etanol/agua 1:1 (200 ml), luego
se adicionó ácido p-toluensulfónico (400 mg). Se sometió la
mezcla a reflujo durante 210 minutos. Se adicionó ácido
p-toluensulfónico extra (100 mg) y se sometió a reflujo la
mezcla durante otros 60 minutos. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se separó la mayor parte del etanol bajo
presión reducida. Se extrajo la mezcla acuosa tres veces con éter
y se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua, solución
saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato sódico. La
filtración y concentración dió un aceite pardo que se purificó
mediante cromatografía de columna (7% de acetato de etilo/hexanos),
lo que dió
5-etoxi-beta-tetralona
(rendimiento 2,43 g, 67%) en forma de un aceite amarillo claro.
^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 7,15 (1H, t, fenilo), 6,76 (1H, d,
fenilo), 6,72 (1H, d, fenilo), 4,05 (2H, q, CH_{2}), 3,56 (2H, s,
bencílico), 3,10 (2H, t-bencílico), 2,53 (2H, t),
1,44 (3H, t, CH_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de
5-etoxi-beta-tetralona
(2,23 g, 11,7 mmol), cianuro potásico (1,20 g, 18,4 mmol), carbonato
amónico (6,75 g, 70,2 mmol), etanol (80 ml) y agua (20 ml) en un
matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de
aceite a 80ºC durante 3 días. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se virtió la suspensión en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. La filtración seguido de secado por aire dió
hidantoina X (2,69 g, 88%) en forma de un sólido beige. ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) delta 10,65 (1H, s ancho, NH), 7,06
(1H, t, fenilo), 6,75 (1H, d, fenilo), 6,65 (1H, d, fenilo), 3,98
(2H, q, Ch_{2}), 1,32 (3H, t, Ch_{3}). LRMS
(electropulverización): C_{14}H_{16}N_{2}O_{3}, calculado:
259; observado: 258 (M-H).
\newpage
Etapa
4
Una mezcla de hidantoina X (2,57 g, 9,87 mmol),
Ba(OH)_{2}.H_{2}O (9,40 g, 49,6 mmol) en agua (200
ml, con dilución excesiva) en un matraz de presión de gruesa pared
sellado, se calentó en un baño de aceite a 105ºC durante 39 horas.
Se adicionó Ba(OH)_{2}.H_{2}O extra (9,40 g, 49,6
mmol) y se calentó la mezcla en un baño de aceite a 125ºC durante
21 horas mas. Se enfrió la mezcla reaccional a temperatura
ambiente, acidificó a \simpH 3 utilizando ácido sulfúrico 4N
mientras se agitaba vigorosamente. Se agitó la suspensión en un
baño de agua hirviente durante una hora y se enfrió a temperatura
ambiente. Se filtró la suspensión blanca y se lavaron los
precipitados con agua. Se concentraron el filtrado y lavazas
combinados en vacío a \sim75 ml. La neutralización con solución
concentrada de hidróxido amónico dió un precipitado blanco que se
filtró, lavó con agua y se secó en vacío durante la noche, lo que
dió ácido
5-etoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento cuantitativo 2,34 g) en forma de un sólido
beige claro. LRMS (Electropulverización): C_{13}H_{17}NO_{3},
Calculado: 235; observado: 236 (M+H), 234
(M-H).
Etapa
5
Una mezcla de ácido
5-etoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
(2,22 mg, 9,44 mmol), trietilamina (2,00 ml, 14,3 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 4,81 mg, 14,3 mmol) en acetonitrilo (75
ml) y agua (75 ml) se agitó a temperatura ambiente durante dos
días. El análisis de TLC de la reacción después de dos días indicó
la presencia de material de partida aminoácido. Se adicionó
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato (645 mg) y
trietilamina (1,0 ml) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante otro día. Se concentró la mezcla reaccional en vacío para
separar la mayor parte del acetonitrilo, se acidificó hasta pH
\sim3 con solución acuosa de ácido cítrico al 10%, y se extrajo la
emulsión blanca tres veces con acetato de etilo. Se lavaron los
fases orgánicas combinadas con agua, salmuera, se secó sobre sulfato
de magnesio. La filtración y concentración dieron un aceite crudo
que se purificó mediante cromatografía de columna (eluido con 3
\rightarrow 5 \rightarrow 10% metanol/cloruro de metileno),
lo que dió ácido
Fmoc-5-etoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 540 >cuantitativo) en forma de un sólido
blanco. HRMS (FAB): C_{28}H_{28}NO_{5} (m+H) calculado:
458,1967; observado: 458,1985.
Etapa
1
Una mezcla de
6-metoxi-1-tetralona
(5,07 g, 28,8 mmol), Pd/C al 10% (3,53 g, 3,32 mmol) en
p-cimeno seco (250 ml) se calentó hasta reflujo bajo argón
durante 38 horas. Se enfrió la mezcla reaccional hasta temperatura
ambiente, se filtró sobre celite y se lavó el residuo a fondo con
p-cimeno. Se combinó el filtrado y las lavazas y se extrajo
dos veces con solución de ácido clorhídrico 1N (2 x 70 ml). Se
acidificaron los extractos acuosos combinados con ácido clorhídrico
6N hasta pH \sim3 y se extrajo tres veces con éter. Se lavaron
las fases orgánicas combinadas con agua, se secó sobre sulfato
sódico anhidro. La filtración y concentración dió
5-hidroxi-6-metoxinaftaleno
crudo (rendimiento 2,31 g, 46%) en forma de un sólido pardo que se
utilizó en la etapa siguiente sin ulterior purificación. LRMS
(Electropulverización: C_{11}H_{10}O_{2}, calculado: 174;
observado: 173 (M-H).
Etapa
2
Una mezcla de
5-hidroxi-6-metoxinaftaleno
(2,10 g, 12,1 mmol), carbonato de cesio (19,7 g, 60,5 mmol),
N,N-dimetilformamida (12 ml) y
2-bromopropano (3,50 ml, 36,9 mmol) se agitó en un
baño de aceite a 40ºC durante la noche. Se filtró la mezcla
reaccional y se lavó el residuo sólido a fondo con éter etílico. Se
combinó el filtrado y las lavazas y se concentró en vacío para
separar la mayor parte de los disolventes. Se repartió el residuo
pardo entre agua y éter y se separaron las fases. Se lavó la fase
etérea con agua. Se reextrajeron con éter las fases acuosas
combinadas. Se combinaron los extractos etéreos, se lavaron con
salmuera y se secó sobre sulfato sódico. La filtración y
concentración dió un producto crudo que se purificó mediante
cromatografía de columna (2,5 \rightarrow 5% acetato de
etilo/hexanos), lo que dió
isopropoxi-6-metoxinaftaleno
(rendimiento 2,23 g, 86%) en forma de un aceite pardo claro.
^{1}H RMN (CDCl_{3} delta 8,17 (1H, d, fenilo),
7,05-7,38 (4H, m, fenilo), 6,72 (1H, dd, fenilo),
4,73 (1H, m, CH de iPr), 3,92 (3H, s, OCH_{3}), 1,42 (6H, d, 2
CH_{3} de iPr).
Etapa
3
A una solución en reflujo de
1-isopropoxi-6-metoxinaftaleno
(2,23 g, 10,3 mmol) en etanol absoluto (50 ml) se adicionaron
cuidadosamente pequeños trozos de metal de sodio (3,6 g, 157 mmol)
durante 45 minutos. Se sometió a reflujo la mezcla durante otros
120 minutos. Se enfrió la reacción hasta temperatura ambiente,
se templó con agua y acidificó con ácido clorhídrico concentrado.
Se concentró la mezcla en vacío para separar la mayor parte del
etanol. Se extrajo la mezcla acuosa tres veces con éter. Se
lavaron las fases orgánicas combinadas con agua y se secó sobre
sulfato sódico. La filtración y concentración dió un aceite rojizo
que se disolvió en etanol/agua 1:1 (90 ml), luego se adicionó ácido
p-toluensulfónico (200 mg). Se sometió la mezcla a
reflujo durante 60 minutos. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se separó la mayor parte del etanol bajo
presión reducida. Se extrajo la mezcla acuosa dos veces con éter y
se lavaron las fases orgánicas combinadas con agua, solución
saturada de cloruro sódico y se secó sobre sulfato sódico. La
filtración y concentración dió un aceite rojizo que se purificó
mediante cromatografía de columna (8 \rightarrow 15% acetato de
etilo/hexanos), lo que dió
5-etoxi-beta-tetralona
(rendimiento 1,37 g, 65%) en forma de un aceite incoloro. ^{1}H
RMN (CDCl_{3}) delta 7,16 (1H, t, fenilo), 6,78 (1H, d, fenilo),
6,71 (1H, d, fenilo), 4,53 (1H, m, CH de iPr), 3,56 (2H, s,
bencílico), 3,08 (2H, t-bencílico), 2,50 (2H, t),
1,37 (6H, d,2 CH_{3} de iPr).
Etapa
4
Una mezcla de
5-isopropoxi-beta-tetralona
(1,37 g, 6,71 mmol), cianuro potásico (660 mg, 10,1 mmol), carbonato
amónico (3,87 g, 40,3 mmol), etanol (44 ml) y agua (9 ml) en un
matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de
aceite a 80ºC durante 42 horas. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se virtió la suspensión en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. La filtración seguido de secado al aire dió
hidantoina Y (1,64 g, 89%).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de hidantoina Y (1,64 g, 5,98 mmol),
Ba(OH)_{2}.H_{2}O (5,66 g, 29,9 mmol) en agua (25
ml) en un matraz de presión de gruesa pared sellado, se calentó en
un baño de aceite a 100ºC durante 70 horas. Se enfrió la mezcla
reaccional a temperatura ambiente, neutralizó hasta \simpH 7
utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba vigorosamente.
Se agitó la suspensión en un baño de agua hirviente durante una
hora y se enfrió a temperatura ambiente. Se basificó con solución
de hidróxido sódico 1N y se filtró la suspensión blanca y se lavó
los precipitados con agua. Se concentraron el filtrado y
lava-zas combinados en vacío a \sim75 ml. La
neutralización con solución de ácido clorhídrico concentrado dió un
precipitado blanco que se filtró, lavó con agua y se secó al aire,
lo que dió ácido
5-isopropoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento >cuantitativo 3,48 g, húmedo y conteniendo
sal inorgánica). LRMS (Electropulverización):
C_{14}H_{19}NO_{3}, Calculado: 249; observado: 248
(M-H).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
5-isopropoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
(3,48 g, 5,98 mmol teórico), trietilamina (1,10 ml, 7,89 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 2,62 g, 7,77 mmol) en acetonitrilo (30
ml) y agua (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante un día.
El análisis de TLC de la reacción indicó la presencia de material
de partida aminoácido. Se adicionó 9-fluorenilmetil
succinimidil carbonato (500 mg) y se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante otro día. Se concentró la mezcla reaccional en
vacío para separar la mayor parte del acetonitrilo, se acidificó
hasta pH \sim3 con solución acuosa de ácido cítrico al 10%, y se
extrajo la emulsión tres veces con cloruro de metileno. Se lavaron
los fases orgánicas combinadas con agua, salmuera, se secó sobre
sulfato de magnesio. La filtración y concentración dieron un
aceite crudo que se purificó mediante cromatografía de columna
(eluido con 1 \rightarrow 2 \rightarrow 5 \rightarrow
8% metanol/cloruro de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-5-isopropoxi-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 0,50 g,18% sobre dos etapas) en forma de un
sólido blanco. HRMS (FAB): C_{29}H_{30}NO_{5} (m+H)
calculado: 472,2124; observado: 472,2117.
\newpage
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
2-metilhidrocinámico (3,0 g, 18,3 mmol), cloruro de
oxalilo (3,19 ml, 36,6 mmol) y cloruro de metileno (30 ml) se
enfrió en un baño de hielo y se adicionó a gotas
N,N-dimetilformamida (0,14 ml, 1,81 mmol). Se
agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. La
concentración en vacío dió cloruro de
3-(2-metilfenil)propanoilo que se recogió en
cloruro de metileno y se utilizó en la etapa siguiente en forma de
un crudo.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución del cloruro de ácido anterior
(crudo, 18,3 mmol) en cloruro de metileno se adicionó lentamente a
una solución de diazometano (generado a partir de 11,9 g de
1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina)
en éter (80 ml) enfriado en un baño de hielo. Luego se calentó la
mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se
concentró la mezcla en vacío y purificó mediante cromatografía de
columna (10 \rightarrow 20% acetato de etilo/hexanos), lo que
dió
1-diazo-4-(2-metilfenil)butan-2-ona
(2,08 g, 60% sobre 2 etapas) en forma de un aceite amarillo
brillante.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla de acetato de rodio (II) dímero (24
mg, 0,109 mmol) en cloruro de metileno (200 ml) bajo reflujo se
adicionó lentamente una solución de
1-diazo-4-(2-metilfenil)butan-2-ona
(2,08 g, 11,1 mmol) en cloruro de metileno (50 ml) durante 180
minutos. Después de completada la adición, se sometió a reflujo la
mezcla durante veinte minutos mas. Se enfrió la mezcla hasta
temperatura ambiente, se adicionó ácido trifluoroacético (2,40 ml)
y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Se
enfrió la reacción con solución saturada de bicarbonato sódico. Se
separaron las fases y se lavó la fase de cloruro de metileno una vez
mas con solución saturada de bicarbonato sódico. Se reextrajeron
las fases acuosas combinadas con cloruro de metileno. Se secaron
las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtró
y se concentró en vacío, lo que dió un aceite pardo crudo. La
purificación mediante cromatografía de columna (15% acetato de
etilo/hexanos) dió
5-metil-beta-tetralona
(rendimiento de 1,48 g, 84%) en forma de un aceite pardo claro.
^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 6,90-7,20 (3H, m,
fenilo), 3,58 (2H, t, bencílico), 2,55 (2H, t), 2,34 (3H, s,
CH_{3}).
\newpage
Etapa
4
Una mezcla de
5-metil-beta-tetralona
(1,48 g, 9,24 mmol), cianuro potásico (902 mg, 13,9 mmol), carbonato
amónico (5,33 g, 55,5 mmol), etanol (45 ml) y agua (9 ml) en un
matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de
aceite a 80ºC durante 3 días. Después de enfriamiento hasta
temperatura ambiente se virtió la suspensión en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. Filtración seguido de secado al aire dió
hidantoina Z cruda (rendimiento 1,81 g, 85%) en forma de un sólido
beige claro. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) delta 10,66
(1H, s ancho, NH), 8,22 (1H, s ancho, NH),
6,85-7,05 (3H, m, fenilo), 2,17 (3H, s,
CH_{3}).
Etapa
5
Una mezcla de hidantoina Z (1,80 g, 7,82 mmol),
Ba(OH)_{2}.H_{2}O (7,40 g, 39,1 mmol) en agua (28
ml, con dilución excesiva) en un matraz de presión de gruesa pared
sellado, se calentó en un baño de aceite de 125ºC durante 88 horas.
Se enfrió la mezcla reaccional a temperatura ambiente, acidificó a
\simpH 3 utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba
vigorosamente. Se agitó la suspensión en un baño de agua hirviente
durante una hora y se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró la
suspensión y se lavó los precipitados con agua. Se concentraron el
filtrado y lavazas combinados en vacío a \sim50 ml. La
neutralización con hidróxido amónico concentrado dió un precipitado
blanco que se filtró, lavó con agua y se secó en el aire, lo que
dió ácido
5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 1,05 g, 65%) en forma de un sólido beige.
LRMS (Electropulverización): C_{12}H_{15}NO_{2}, Calculado:
205; observado: 206 (M+H).
Etapa
6
Una mezcla de ácido
5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
(1,05 g, 5,12 mmol), trietilamina (0,93 ml, 6,67 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 2,24 g, 6,64 mmol) en acetonitrilo (30
ml) y agua (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante dos
días. El análisis de TLC de la reacción después de dos días indicó
la presencia de material de partida aminoácido. Se adicionó
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato (520 mg) y
se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante otras 24 horas. Se
concentró la mezcla reaccional en vacío para separar la mayor parte
del acetonitrilo, se acidificó hasta pH \sim3 con solución acuosa
de ácido cítrico al 10%, y se extrajo la emulsión dos veces con
cloruro de metileno. Se lavaron los fases orgánicas combinadas con
agua, salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio. La filtración y
concentración dieron un aceite crudo que se purificó mediante
cromatografía de columna (eluido con 2 \rightarrow 5
\rightarrow 8% metanol/cloruro de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 1,62 g, 74%) en forma de un sólido pardo
claro. HRMS (FAB): C_{27}H_{26}NO_{4} (m+H) calculado:
428,1862; observado: 428,1844.
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
3-(2-etilfenil)propanoico (preparado en 3
etapas a partir de
1-etil-2-yodobenceno,
4,24 g, 23,8 mmol), cloruro de tionilo (9,50 ml, 130 mmol) y
tolueno (100 ml) se sometió a reflujo durante 2 horas. La
concentración en vacío dió cloruro de
3-(2-etilfenil)propanoilo que se recogió en
cloruro de metileno y se utilizó en la etapa siguiente como un
crudo.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de cloruro de
3-(2-etilfenil)propanol (crudo, 23,8 mmol) en
cloruro de metileno se adicionó lentamente a una solución de
diazometano (generado a partir de 15,6 g de
1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina)
en éter (100 ml) enfriado en un baño de hielo. Luego se calentó la
mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se
concentró la mezcla en vacío y se purificó mediante cromatografía de
columna (10 \rightarrow 20% acetato de etilo/hexanos), lo que
dió
1-diazo-4-(2-etilfenil)butan-2-ona
(3,47 g, 72% sobre 2 etapas). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta
7,1-7,25 (4H, m, fenilo), 5,21 (1H, s ancho, diazo),
2,97 (2H, m, CH_{2} de etilo), 1,20 (3H, t, Ch_{3}).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla de acetato de rodio (II) dímero (38
mg, 0,172 mmol) en cloruro de metileno (300 ml) bajo reflujo se
adicionó lentamente una solución de
1-diazo-4-(2-etilfenil)butan-2-ona
(3,47 g, 1,72 mmol) en cloruro de metileno (50 ml) durante 90
minutos. Después de completada la adición, se sometió a reflujo la
mezcla durante veinte minutos mas. Se enfrió la mezcla hasta
temperatura ambiente, se adicionó ácido trifluoroacético (3,75 ml)
y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante una hora. Se
enfrió la reacción con solución saturada de bicarbonato sódico. Se
separaron las fases y se lavó la fase de cloruro de metileno una vez
mas con solución saturada de bicarbonato sódico. Se reextrajeron
las fases acuosas combinadas con cloruro de metileno. Se secaron
las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtró
y se concentró en vacío, lo que dió
5-etil-beta-tetralona
(3,09 g, rendimiento >cuantitativo) en forma de un aceite pardo
rojizo. El compuesto se utilizó en la etapa siguiente sin ulterior
purificación. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 6,9-7,2
(3H, m, fenilo), 3,58 (2H, s, bencílico), 3,08 (2H, s, bencílico),
2,70 (2H, q, CH_{2} de etilo), 2,52 (2H, t, bencílico), 1,20 (3H,
t, CH_{3} de etilo).
\newpage
Etapa
4
Una mezcla de
5-etil-beta-tetralona
(3,09 g, 17,7 mmol), cianuro potásico (1,73 mg, 26,6 mmol),
carbonato amónico (10,2 g, 106 mmol), etanol (80 ml) y agua (16 ml)
en un matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó en un
baño de aceite a 80ºC durante 48 horas. Después de enfriamiento
hasta temperatura ambiente se virtió la suspensión blanca en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. Filtración seguido de secado al aire dió
hidantoina AA (rendimiento 3,85 g, 92% sobre 2 etapas) en forma de
un sólido beige claro. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6})
delta 10,66 (1H, s ancho, NH), 8,26 (1H, s ancho, NH),
6,8-7,1 (3H, m, fenilo), 1,13 (3H, t, CH_{3}).
LRMS (Electropulverización): C_{14}H_{16}N_{2}O_{2},
Calculado: 244; observado: 243 (M-H).
Etapa
5
Una mezcla de hidantoina AA (1,00 g, 4,09
mmol), Ba(OH)_{2}.H_{2}O (4,00 g, 21,1 mmol) en
agua (20 ml) en un matraz de presión de gruesa pared sellado, se
calentó en un baño de aceite a 125ºC durante 48 horas. Se enfrió la
mezcla reaccional a temperatura ambiente, acidificó a \simpH 3
utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba vigorosamente.
Se agitó la suspensión en un baño de agua hirviente durante dos
horas y se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró la suspensión
blanca y se enjuagaron los precipitados con agua. Se concentraron
el filtrado y lavazas combinados en vacío a \sim50 ml. La
neutralización con hidróxido amónico concentrado dió un precipitado
blanco que se filtró, lavó con agua y se secó vacío durante la
noche, lo que dió ácido
5-etil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 796 mg, 89%). LRMS (Electropulverización):
C_{13}H_{17}NO_{2}, Calculado: 219; observado: 220 (M+H).
Etapa
6
Una mezcla de ácido
5-etil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (1,0 g, 7,17 mmol), 9-fluorenilmetil
succinimidil carbonato (Fmoc-OSu, 1,79 g, 5,31
mmol) en acetonitrilo (40 ml) y agua (40 ml) se agitó a temperatura
ambiente durante dos días. Se concentró la mezcla reaccional en
vacío para separar la mayor parte del acetonitrilo, se acidificó
hasta pH \sim3 con solución acuosa de ácido cítrico al 10% y se
extrajo la emulsión blanca dos veces con cloruro de metileno, dos
veces con acetato de etilo. Se lavaron los extractos de cloruro de
metileno con agua, salmuera y se secó sobre sulfato de magnesio.
Se lavaron los extractos de acetato de etilo con agua, salmuera, se
secó sobre sulfato de magnesio. La filtración y concentración
dieron un aceite crudo que se purificó mediante cromatografía de
columna (eluido con 2 \rightarrow 5 \rightarrow 8%
metanol/cloruro de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 330 g, 21%) en forma de un sólido blanco.
HRMS (FAB): C_{28}H_{28}NO_{4} (m+H) calculado: 442,2018;
observado: 442,2010.
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de ácido
3-(2-isopropilfenil)-propanoico
(preparado en 3 etapas a partir de
1-isopropil-2-yodobenceno,
2,01 g, 10,5 mmol), cloruro de tionilo (4,30 ml, 59,0 mmol) y
tolueno (40 ml) se sometió a reflujo durante 2 horas. La
concentración en vacío dió cloruro de
3-(2-isopropilfenil)propanol que se recogió
en cloruro de metileno y se utilizó en la etapa siguiente como un
crudo.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
Una solución de cloruro de
3-(2-isopropilfenil)propanoilo (crudo, 10,5
mmol) en cloruro de metileno se adicionó lentamente a una solución
de diazometano (generado a partir de 6,95 g de
1-metil-3-nitro-1-nitrosoguanidina)
en éter (50 ml) enfriado en un baño de hielo. Luego se calentó la
mezcla hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se
concentró la mezcla en vacío y purificó mediante cromatografía de
columna (20% acetato de etilo/hexanos), lo que dió
1-diazo-4-(2-isopropilfenil)butan-2-ona
(1,87 g, 82% sobre 2 etapas) en forma de un aceite amarillo
brillante. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 7,10-7,30
(4H, m, fenilo), 5,21 (1H, s ancho, diazo), 3,15 (1H, m, CH de
iPr), 3,00 (2H, t, bencílico), 2,57 (2H, m), 1,24 (6H, d, 2 Ch_{3}
de iPr).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
A una mezcla de acetato de rodio (II) dímero (20
mg, 0,091 mmol) en cloruro de metileno (160 ml) bajo reflujo se
adicionó lentamente una solución de
1-diazo-4-(2-bromo-fenil)butan-2-ona
(1,87 g, 8,65 mmol) en cloruro de metileno (25 ml) durante 60
minutos. Después de completada la adición, se sometió a reflujo la
mezcla durante quince minutos mas. Se enfrió la mezcla hasta
temperatura ambiente, se adicionó ácido trifluoroacético (1,90 ml)
y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 45 minutos. Se
enfrió la reacción con solución saturada de bicarbonato sódico. Se
separaron las fases y se lavó la fase de cloruro de metileno una vez
mas con solución saturada de bicarbonato sódico. Se reextrajeron
las fases acuosas combinadas con cloruro de metileno. Se secaron
las fases orgánicas combinadas sobre sulfato de magnesio, se filtró
y se concentró en vacío, lo que dió un aceite pardo crudo. La
purificación mediante cromatografía de columna (5% acetato de
etilo/hexanos) dió
5-isopropil-beta-tetralona
(rendimiento 1,57 g, 96%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta
6,93-7,22 (3H, m, fenilo), 3,59 (2H, s, bencílico),
3,24 (1H, m, CH de iPr), 3,12 (2H, t, bencílico), 2,52 (2H, t),
1,27 (6H, d, 2 CH_{3} de iPr).
\newpage
Etapa
4
Una mezcla de
5-isopropil-beta-tetralona
(1,57 g, 8,34 mmol), carbonato amónico (4,81 g, 50,1 mmol), etanol
(40 ml) y agua (10 ml) en un matraz de presión de gruesa pared
sellado se calentó en un baño de aceite a 80ºC durante 48 horas.
Después de enfriamiento hasta temperatura ambiente se virtió la
suspensión parda en hielo-agua y se agitó a
temperatura ambiente durante un par de horas. Filtración seguido de
secado al aire dió hidantoina BB en forma de un sólido beige que
se utilizó en la etapa siguiente sin ulterior purificación. ^{1}H
RMN (DMSO-d_{6}) delta 10,69 (1H, s ancho, NH),
8,30 (1H, s ancho, NH), 6,85-7,32 (3H, m, fenilo),
1,15 (6H, t, CH_{3}). LRMS (Electropulverización):
C_{15}H_{18}N_{2}O_{2}, Calculado: 258; observado: 539
(2M+Na).
Etapa
5
Una mezcla de hidantoina BB (crudo, 8,34 mmol,
teórico), Ba(OH)_{2}.H_{2}O (7,90 g, 41,7 mmol) en
agua (40 ml) en un matraz de presión de gruesa pared sellado, se
calentó en un baño de aceite a 125ºC durante 38 horas. Se enfrió
la mezcla reaccional a temperatura ambiente, acidificó a \simpH 3
utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba vigorosamente.
Se agitó la suspensión en un baño de agua hirviente durante dos
horas y se enfrió a temperatura ambiente. Se filtró la suspensión
blanca y se enjuagaron los precipitados con agua. Se concentraron
el filtrado y lavazas combinados en vacío a \sim50 ml. La
neutralización con hidróxido amónico concentrado dió un precipitado
blanco que se filtró, lavó con agua y se secó vacío durante la
noche, lo que dió ácido
5-isopropil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 1,23 g, 63% sobre 2 etapas) en forma de un
sólido beige. LRMS (Electropulverización): C_{14}H_{19}NO_{2},
Calculado: 233; observado: 232 (M-H).
Etapa
6
Una mezcla de ácido
5-isopropil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (250 mg, 1,07 mmol), trietilamina (1,2 ml, 8,61 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 2,70 g, 8,00 mmol) en acetonitrilo (30
ml) y agua (30 ml) se agitó a temperatura ambiente durante dos días.
Se concentró la mezcla reaccional en vacío para separar la mayor
parte del acetonitrilo, se acidificó hasta pH \sim3 con solución
acuosa de ácido cítrico al 10% y se extrajo la emulsión blanca con
acetato de etilo. Se lavó la fase orgánico con agua, salmuera, se
secó sobre sulfato sódico. La filtración y concentración dieron un
aceite crudo que se purificó mediante cromatografía de columna
(eluido con 2 \rightarrow 5 \rightarrow 8% metanol/cloruro
de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-5-metil-2-aminotetralin-2-carboxílico
racémico (rendimiento 208 g, 43%) en forma de una espuma desteñida.
HRMS (FAB): C_{29}H_{30}NO_{4} (m+H) calculado: 456,2175;
observado: 456,2184.
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de yodobenceno (6,37 g, 3,5 ml,
31,2 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro
[4,5]decano (10,32 g, 9,3 ml, 72,2 mmol, 2,3 equivalentes) y
ter-butóxido sódico (8,0 g, 83,3 mmol, 2,7
equivalentes) en dioxano seco (120 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0) (91 mg,
0,1 mmol) y tri-o-tolilfosfina (180
mg, 0,591 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas.
Se concentró la reacción resultante para separar el disolvente. Se
trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc. Se combinaron los
extractos orgánicos combinados, se lavó con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió un aceite pardo. Este
producto crudo se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc,
95/5 a 75/25) para proporcionar el producto puro CC en forma de un
sólido ligeramente amarillo (6,08 g, 89%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}),
7,25 (ddt, 2H), 6,95 (dd, 2H), 6,84 (t, 1H), 4,00 (s, 4H), 3,32 (t,
4H) y 1,84 (t, 4H); MS (electropulverización) m/e 220 (M+H),
Calculado para C_{13}H_{17}NO_{2}, 219.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del cetal CC (3,22 g, 15,16 mmol)
en acetona (100 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (50 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
mezcla reaccional para separar el disolvente. Se recogió el residuo
en EtOAc y se neutralizó con solución NaOH 6N. Se separaron las
fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró. Se purificó el producto crudo
sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 80/20 \rightarrow
60/40) lo que dió el producto DD en forma de un aceite amarillo
(2,58 g, 97%). MS (electropulverización) m/e 176 (M+H),
Calculado para C_{11}H_{13}NO, 175.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de la cetona DD (2,53 g, 14,46
mmol) en etanol (75 ml) y agua (25 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (12,9 g, 134,3 mmol, 9
equivalentes) y cianuro potásico (2,11 g, 32,5 mmol, 2
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. Se concentró la mezcla reaccional enfriada en
vacío y se trató el residuo con agua, se extrajo con EtOAc (4x). Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con agua, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró, lo que dió la hidantoina EE
espectroscópicamente pura en forma de un sólido blanco (rendimiento
3,36 g, 95%). MS (electropulverización) m/e 246 (M+H),
Calculado para C_{13}H_{15}N_{3}O_{2}, 245.
\newpage
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió la hidantoina EE (3,36 g) en NaOH
acuoso (6N, 100 ml) y se calentó a 130ºC durante 2-3
días. Después de completado de la hidrólisis (mediante HPLC), se
neutralizó la mezcla reaccional con HCl concentrado hasta
ligeramente acídico (pH\sim6). Se filtró la suspensión resultante,
se lavó con agua y se secó, lo que dió ácido
4-amino-1-fenilpiperidin-4-carboxílico
(APPC) en forma de un sólido blanco (rendimiento 5,26 g, >100%,
húmedo y contaminado con sal inorgánica), que mostró un pico simple
con HPLC y se utilizó directamente para la etapa siguiente. MS
(electropulverización m/e 221 (M+H), Calculado para
C_{12}H_{16}N_{2}O_{2}, 220.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió el ácido
4-amino-1-fenilpiperidin-4-carboxílico
crudo (APPC) a partir de la última etapa en dioxano (80 ml) y
Na_{2}CO_{3} acuoso al 10% (40 ml), se trató con
Fmoc-Cl (5,3 g, 20,57 mmol, 1,5 equiv.) y se agitó
vigorosamente durante la noche. Luego se concentró la mezcla
reaccional para separar el dioxano, se neutralizó con HCl 6N hasta
ligeramente acídico (pH 6) y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el producto
crudo que se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc a
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar Fmoc-APPC puro
(rendimiento global para dos etapas 4,91 g, 81%). ^{1}H
RMN(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,74 (d,
2H), 7,19-7,42 (m, 8H), 4,20-4,31
(m, 3H); HRMS m/z 465,1788, Calculado para
C_{27}H_{26}N_{2}O_{4}Na, 465,1791.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 4-yodotolueno
(2,12 g, 9,7 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(2,8 ml, 3,12 g, 21,82 mmol, 2,2 equiva.) y
ter-butóxido sódico (2,6 g, 27,08 mmol, 2,8 equiv.)
en dioxano seco (40 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (44,4 mg,
0,0485 mmol) y tri-o-tolilfosfina
(59,0 mg, 0,194 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26
horas. Se concentró la mezcla reaccional resultante para separar
el disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc.
Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió
aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto
puro FF en forma de un sólido ligeramente amarillo (1,937 g, 85%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}), 7,06 (d, 2H), 6,87 (d, 2H), 3,99 (s, 4H),
3,26 (t, 4H), 2,26 (s, 3H) y 1,85 (t, 4H).
\newpage
Etapa
2
A una solución del cetal FF (1,58 g, 6,79 mmol)
en acetona (50 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (25 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
mezcla reaccional para separar el disolvente. Se recogió el residuo
en EtOAc y se neutralizó con solución acuosa de NaOH 6N. Se
separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. Se purificó el producto
crudo sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow
60/40) lo que dió el producto GG en forma de un aceite amarillo
(1,27 g, 98%). MS (electropulverización) m/e 190 (M+H),
Calculado para C_{12}H_{15}NO, 189.
Etapa
3
A una solución de la cetona GG (1,17 g, 6,18
mmol) en etanol (60 ml) y agua (20 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (4,74 g, 49,44 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (1,01 g, 15,54 mmol, 2,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 90ºC durante 22 horas. Se
concentró la mezcla reaccional enfriada en vacío y se trató el
residuo con agua, se extrajo con EtOAc (4x). Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con agua, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró, lo que dió la hidantoina HH
espectroscópicamente pura en forma de un sólido blanco (rendimiento
1,554 g, 97%). MS (electropulverización) m/e 260 (M+H),
Calculado para C_{14}H_{17}N_{3}O_{2}, 259.
Etapa
4
Se suspendió la hidantoina HH (1,502 g) en NaOH
acuoso (6N, 40 ml) y se calentó a 130ºC durante 4 días. Después de
completado de la hidrólisis (mediante HPLC), se neutralizó la mezcla
reaccional con HCl concentrado hasta ligeramente acídico
(pH\sim6). Se filtró la suspensión resultante, se lavó con agua y
se secó, lo que dió ácido
4-amino-1-(4-metilfenil)piperidin-4-carboxílico
(MeAPPC) en forma de un sólido blanco (rendimiento 2,10 g,
>100%, húmedo y contaminado con sal inorgánica), que mostró un
pico simple con HPLC y se utilizó directamente para la etapa
siguiente. MS (electropulverización m/e 235 (M+H), Calculado
para C_{13}H_{18}N_{2}O_{2}, 234.
Etapa
5
Se suspendió el ácido
4-amino-1-(4-metilfenil)-piperidin-4-carboxílico
crudo (MeAPPC) a partir de la última etapa en dioxano (80 ml) y
Na_{2}CO_{3} acuoso al 10% (40 ml), se trató con
Fmoc-Cl (2,2 g, 8,59 mmol, 1,5 equiv.) y se agitó
vigorosamente durante la noche. Luego se concentró la mezcla
reaccional para separar el dioxano, se neutralizó con HCl 6N hasta
ligeramente acídico (pH 6) y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el producto
crudo que se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc a
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar
Fmoc-4-MeAPPC puro (rendimiento
global para dos etapas 2,16 g, 82%). ^{1}H
RMN(DMSO-d_{6}), 7,88 (d, 2H), 7,72 (d,
2H), 7,39 (t, 2H), (t, 2H), 7,30 (td, 2H), 6,99 (d, 2H), 6,82 (d,
2H), 2,18 (s, 3H); MS (electropulverización m/e 457 (M+H),
calculado para C_{28}H_{28}N_{2}O_{4}, 456.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-cloro-4-yodobenceno
(2,38 g, 10,0 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(3,1 ml, 3,44 g, 24,0 mmol, 2,4 equiva.) y
ter-butóxido sódico (2,68 g, 28,0 mmol, 2,8 equiv.)
en dioxano seco (40 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (45,5 mg,
0,0497 mmol) y tri-o-tolilfosfina
(61 mg, 0,20 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 926 horas.
Se concentró la mezcla reaccional resultante para separar el
disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc.
Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió
aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto
puro II en forma de un sólido ligeramente amarillo (2,17 g, 86%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}), 7,18 (dt, 2H), 6,85 (dt, 2H), 3,98 (s,
4H), 3,28 (t, 4H) y 1,82 (t, 4H).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución del cetal II (2,123 g, 8,39 mmol)
en acetona (75 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (25 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
mezcla reaccional para separar el disolvente. Se recogió el residuo
en EtOAc y se neutralizó con solución acuosa de NaOH 6N. Se
separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. Se purificó el producto
crudo sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 95/5 \rightarrow
70/30) lo que dió el producto II en forma de un sólido amarillo
(1,515 g, 86%). MS (electropulverización) m/e 210 (M+H),
Calculado para C_{11}H_{12}ClNO, 209.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de la cetona JJ (1,465 g, 6,986
mmol) en etanol (75 ml) y agua (25 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (5,36 g, 55,88 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (1,135 g, 17,46 mmol, 2,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. Se concentró la mezcla reaccional enfriada en
vacío y se trató el residuo con agua, se extrajo con EtOAc (4x). Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con agua, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró, lo que dió la hidantoina
KK espectroscópicamente pura en forma de un sólido blanco
(rendimiento 1,817 g, 93%). MS (electropulverización) m/e
280 (M+H), Calculado para C_{13}H_{14}N_{3}O_{2}, 279.
\newpage
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió la hidantoina KK (1,768 g) en NaOH
acuoso (6N, 50 ml) y se calentó a 130ºC durante 4 días. Después de
completado de la hidrólisis (mediante HPLC), se neutralizó la mezcla
reaccional con HCl concentrado hasta ligeramente acídico
(pH\sim6). Se filtró la suspensión resultante, se lavó con agua y
se secó, lo que dió ácido
4-amino-1-(4-clorofenil)piperidin-4-carboxílico
(ClAPPC) en forma de un sólido blanco (rendimiento 2,05 g,
>100%, húmedo y contaminado con sal inorgánica), que mostró un
pico simple con HPLC y se utilizó directamente para la etapa
siguiente. MS (electropulverización m/e 253
(M-H), Calculado para
C_{12}H_{15}N_{2}O_{2}, 254.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendió el ácido
4-amino-1-(4-clorofenil)-piperidin-4-carboxílico
crudo (ClAPPC) a partir de la última etapa en dioxano (100 ml) y
Na_{2}CO_{3} acuoso al 10% (50 ml), se trató con
Fmoc-Cl (2,0 g, 7,75 mmol, 1,2 equiv.) y se agitó
vigorosamente durante la noche. Luego se concentró la mezcla
reaccional para separar el dioxano, se neutralizó con HCl 6N hasta
ligeramente acídico (pH 6) y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el producto
crudo que se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc a
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar
Fmoc-4-ClAPPC puro (rendimiento
global para dos etapas 1,18 g, 81%). ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}): 7,87 (t, 2H), 7,71 (d, 2H), 7,39
(td, 2H), 7,30 (td, 2H), 7,20 (d, 2H), 6,92 (d, 2H), 3,44 (d, 2H),
2,93 (t, 2H); MS (electropulverización m/e 477 (M+H),
calculado para C_{27}H_{25}N_{2}O_{4}, 476.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de
4-fenoxibenceno (3,15 g, 10,6 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(3,3 ml, 3,66 g, 25,6 mmol, 2,4 equiva.) y
ter-butóxido sódico (2,85 g, 29,7 mmol, 2,8 equiv.)
en dioxano seco (40 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (48,5 mg, 0,053
mmol) y tri-o-tolilfosfina (64 g,
0,4 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 9 horas. Se
concentró la mezcla reaccional resultante para separar el
disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc.
Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió
aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 80/20) para proporcionar el producto
puro LL en forma de un sólido ligeramente amarillo (2,805 g, 85%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}), 7,26-7,32 (d, 2H), 7,03
(t, 1H), 6,92-6,97 (m, 6H), 4,00 (s, 4H), 3,26 (t,
4H) y 1,86 (t, 4H).
\newpage
Etapa
2
A una solución del cetal LL (2,755 g, 8,86 mmol)
en acetona (90 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (45 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
mezcla reaccional para separar el disolvente. Se recogió el residuo
en EtOAc y se neutralizó con solución acuosa de NaOH 6N. Se
separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró para dar el producto crudo
que se purificó el producto crudo que se purificó sobre
cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 70/30) lo
que dió el producto MM en forma de un aceite amarillo (2,21 g,
93%). MS (electropulverización) m/e 268 (M+H), Calculado para
C_{17}H_{17}ClNO_{2}, 267.
Etapa
3
A una solución de la cetona MM (2,01 g, 7,52
mmol) en etanol (80 ml) y agua (25 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (5,78 g, 60,0 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (1,22 g, 18,80 mmol, 2,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. Se concentró la mezcla reaccional enfriada en
vacío y se trató el residuo con agua, se extrajo con EtOAc (4x). Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con agua, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró, lo que dió la hidantoina NN
espectroscópicamente pura en forma de un sólido blanco (rendimiento
2,34 g, 95%). MS (electropulverización) m/e 338(M+H),
Calculado para C_{19}H_{19}N_{3}O_{3}, 337.
Etapa
4
Se suspendió la hidantoina NN (2,28 g, 6,76
mmol) en NaOH acuoso (6N, 60 ml) y se calentó a 130ºC durante 4
días. Después de completado de la hidrólisis (mediante HPLC), se
neutralizó la mezcla reaccional con HCl concentrado hasta
ligeramente acídico (pH\sim6). Se filtró la suspensión resultante,
se lavó con agua y se secó, lo que dió ácido
4-amino-1-(4-fenoxifenil)piperidin-4-carboxílico
(4-PhOAPPC) en forma de un sólido blanco
(rendimiento 2,53 g, >100%, húmedo y contaminado con sal
inorgánica), que mostró un pico simple con HPLC y se utilizó
directamente para la etapa siguiente. MS (electropulverización
m/e 313 (M+H), Calculado para
C_{18}H_{20}N_{2}O_{3}, 312.
Etapa
5
Se suspendió el ácido
1-(4-fenoxifenil)piperidin-4-carboxílico
crudo (4-PhOAPPC) a partir de la última etapa en
dioxano (50 ml) y Na_{2}CO_{3} acuoso al 10% (50 ml), se trató
con Fmoc-Cl (2,2 g, 8,59 mmol, 1,5 equiv.) y se
agitó vigorosamente durante la noche. Luego se concentró la mezcla
reaccional para separar el dioxano, se neutralizó con HCl 6N hasta
ligeramente acídico (pH 6) y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera y se secó sobre
Na_{2}SO_{4}. La separación del disolvente dió el producto
crudo que se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc a
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar
Fmoc-4-PhOAPPC puro (rendimiento
global para dos etapas 2,18 g, 60%). ^{1}H
RMN(DMSO-d_{6}), 7,87 (d, 2H), 7,72 (d,
2H), 7,38 (t, 2H), 7,30 (td, 4H), 7,02 (dt, 1H),
6,86-6,96 (m, 6H), 3,35 (m, 2H); 2,94 (t, 2H); MS
(electropulverización m/e 535 (M+H), calculado para
C_{33}H_{30}N_{2}O_{5}, 534.
Etapa
1
A una solución de 2-yodotolueno
(4,356 g, 2,5 ml, 20,0 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(6,88 ml, 6,2 g, 48,1 mmol, 2,4 equiva.) y
ter-butóxido sódico (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 equiv.)
en dioxano seco (80 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (91 mg, 0,1
mmol) y tri-o-tolilfosfina (122 g,
0,4 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas. Se
concentró la mezcla reaccional resultante para separar el
disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc.
Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió
aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto
puro OO en forma de un sólido ligeramente amarillo (2,66 g, 57%).
^{1}H RMN (CDCl_{3}), 7,12-7,18 (m, 2H),
6,94-7,06 (m, 2H), 4,01 (s, 4H), 2,98 (t, 4H) y 1,88
(t, 4H).
Etapa
2
A una solución del cetal OO (2,64 g, 11,4 mmol)
en acetona (770 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (35 ml) y se
calentó la reacción a 85ºC durante la noche. Se concentró la
reacción resultante para separar el disolvente. Se recogió el
residuo en EtOAc y se neutralizó con solución acuosa de NaOH 6N. Se
separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El producto crudo se
purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10 a 70/30)
lo que dió el producto PP en forma de un aceite amarillo (2,04 g,
95%). MS (electropulverización) m/e 190 (M+H), Calculado
para C_{12}H_{15}NO, 189.
Etapa
3
\newpage
A una solución de la cetona PP (1,54 g, 8,15
mmol) en etanol (60 ml) y agua (20 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (4,69 g, 48,9 mmol, 6
equivalentes) y cianuro potásico (800 g, 12,2 mmol, 1,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. La mezcla reaccional enfriada se adicionó a agua
helada (300 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resutante, se lavó a fondo con
agua y se secó, lo que dió la hidantoina QQ en forma de un sólido
blanco (rendimiento 2,01 g, 95%). MS (electropulverización)
m/e 260 (M+H), Calculado para C_{14}H_{17}N_{3}O_{2},
259.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
A una suspensión de la hidantoina QQ (1,07 g,
4,13 mmol) en THF (25 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (2,25 g,
10,32 mmol, 1,5 equivalentes), trietilamina (0,63 ml, 460 mg, 4,54
mmol, 1,1 equiv.) y DMAP (36 mg, 0,29 mmol) en sucesión. Al cabo de
unos 15 minutos de la adición la reacción viró a una solución
amarillo clara y se agitó durante la noche a temperatura ambiente.
La mezcla reaccional se concentró bajo presión reducida, lo que dió
un sólido que que se recogió en EtOAc (300 ml), se lavó con HCl 1N
(3 x 30 ml), Na_{2}CO_{3} acuoso saturado (2, 30 ml) y salmuera
(2, 30 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró
bajo presión reducida. El producto amarillo claro crudo se purificó
mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow
80/20) lo que dió la bis-Boc hidantoina pura RR en
forma de un sólido blanco (1,71 g, 90%). MS (electropulverización
m/e 460 (M+H), Calculado para
C_{24}H_{33}N_{3}O_{6},
459.
459.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
5
\vskip1.000000\baselineskip
La bis-Boc hidantoina RR (1,71
g, 3,72 mmol) se disolvió en DME (23 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (33 ml, 33 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, lo que
dió una mezcla bastante límpida. HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
4-amino-1-(2-metilfenil)-piperidin-4-carboxílico
(2-MeAPPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. Luego se diluyó esta solución (30 ml) con
1,4-dioxano (30 ml) y se trató con
Fmoc-Cl (1,28 g, 4,96 mmol, 1,3 equiv.) y se agitó
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar el dioxano, se
neutralizó con HCl 1N y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró. Se purificó el producto
crudo mediante cromatografía instantánea (hexano/EtOAc
\rightarrow CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar el producto puro
Fmoc-2-MeAPPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento a partir de bis-Boc hidantoina
RR 1,09 g, 64%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): 7,87
(d, 2H), 7,74 (d, 2H), 7,40 (td, 2H), 7,31 (td, 2H), 7,12 (m, 2H),
6,97 (d, 1H), 6,92 (td, 1H), 2,72-2,88 (m, 4H) y
2,22 (s, 3H); MS (electropulverización) m/e 457 (M+H),
Calculado para C_{28}H_{28}O_{4}, 456.
\newpage
Etapa
1
A una solución de
1-yodo-2-iso-propilbenceno
(10,0 g, 40,7 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(12,0 ml, 13,3 g, 93,0 mmol, 2,3 equiva.) y
ter-butóxido sódico (10,0 g, 104,2 mmol, 2,6 equiv.)
en dioxano seco (160 ml) se adicionó
tris(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (180 mg, 0,197
mmol) y tri-o-tolilfosfina (244 g,
0,80 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas. Se
concentró la mezcla reaccional resultante para separar el
disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc.
Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con
salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió
aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto
puro SS en forma de un sólido ligeramente amarillo (3,61 g, 35%)
(rendimiento 3,61 g, 35%). MS m/z 262 (M+H), Calculado para
C_{16}H_{23}NO_{2}, 261.
Etapa
2
A una solución del cetal SS (3,24 g, 12,4 mmol)
en acetona (90 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (45 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
reacción resultante para separar el disolvente. y se diluyó el
residuo con EtOAc, se neutralizó con solución acuosa de NaOH (6N).
Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El producto crudo se
purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10
\rightarrow 70/30) lo que dió el producto TT en forma de un
aceite amarillo (2,42 g, 89%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,72 (m,
1H), 7,04-7,19 (m, 3H), 3,58 (m, 1H), 3,20 (t, 4H),
2,60 (t, 4H) y 1,25 (d, 6H); MS m/z 218 (M+H), Calculado
para C_{14}H_{19}NO, 217.
Etapa
3
A una solución de la cetona TT (2,30 g, 10,6
mmol) en etanol (90 ml) y agua (20 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (8,1 g, 84,3 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (1,72 g, 26,5 mmol, 2,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. La mezcla reaccional enfriada se adicionó a agua
helada (400 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resutante, se lavó a fondo con
agua y se secó, lo que dió la hidantoina UU en forma de un sólido
blanco (rendimiento 2,78 g, 91%). MS m/z 288 (M+H),
Calculado para C_{16}H_{21}N_{3}O_{2}, 287.
Etapa
4
A una suspensión de la hidantoina UU (2,74 g,
9,54 mmol) en THF seco (100 ml) se adicionó di-ter-butil
dicarbonato (5,2 g, 24,24 mmol, 2,5 equivalentes), trietilamina
(1,5 ml, 1,07 g, 10,5 mmol, 1,1 equiv.) y DMAP (46 mg, 0,29 mmol)
en sucesión. Al cabo de unos 15 minutos de la adición la reacción
viró a una solución amarillo clara y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La mezcla reaccional se concentró bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que que se recogió en EtOAc
(300 ml), se lavó con salmuera (3 x 30 ml), Na_{2}CO_{3}
anhidro y se concentró bajo presión reducida. El producto amarillo
claro crudo se purificó mediante cromatografía flash
(hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 80/20) lo que dió la
bis-Boc hidantoina pura VV en forma de un sólido
blanco (4,39 g, 94%). MS m/z 488 (M+H), Calculado para
C_{26}H_{37}N_{3}O_{6}, 487.
Etapa
5
La bis-Boc hidantoina VV (2,34
g, 4,8 mmol) se disolvió en DME (30 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (45 ml, 45 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, lo que
dió una mezcla bastante límpida. HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
4-amino-1-(2-isopropilfenil)piperidin-4-carboxílico
(2-iPrAPPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. Luego se diluyó esta solución (\sim45 ml)
con 1,4-dioxano (45 ml) y se trató con
Fmoc-Cl (1,78 g, 6,89 mmol, 1,5 equiv.) y se agitó
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar el dioxano, se
neutralizó con HCl 1N y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró. Se purificó el producto
crudo mediante cromatografía instantánea (hexano/EtOAc
\rightarrow CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar el producto puro
Fmoc-2-iPrAPPC en forma de un
sólido blanco (rendimiento a partir de bis-Boc
hidantoina 1,46 g, 63%). HRMS m/z 507,2263, Calculado
para C_{30}H_{32}N_{2}O_{4}Na, 507,2260.
Etapa
1
A una solución de 3-yodotolueno
(4,36 g, 2,6 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(6,88 ml, 48,1 mmol, 2,4 equiva.) y ter-butóxido
sódico (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 equiv.) en dioxano seco (80 ml) se
adicionó tris-(dibencilidenace-
tona)dipaladio (0) (91 mg, 0,1 mmol) y tri-o-tolilfosfina (122 g, 0,4 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas. Se concentró la mezcla reaccional resultante para separar el disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc. Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto puro WW en forma de un sólido ligeramente amarillo (3,21 g, 69%).
tona)dipaladio (0) (91 mg, 0,1 mmol) y tri-o-tolilfosfina (122 g, 0,4 mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas. Se concentró la mezcla reaccional resultante para separar el disolvente. Se trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc. Se combinaron los extractos orgánicos combinados, se lavó con salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió aceite pardo. Este producto crudo se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 95/5 a 75/25) para proporcionar el producto puro WW en forma de un sólido ligeramente amarillo (3,21 g, 69%).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
A una solución del cetal WW (1,25 g, 5,36 mmol)
en acetona (20 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (10 ml) y se
calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
reacción resultante para separar el disolvente. y se diluyó el
residuo con EtOAc, se neutralizó con solución acuosa de NaOH (6N).
Se separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El producto crudo se
purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10
\rightarrow 70/30) lo que dió el producto XX en forma de un
aceite amarillo (rendimiento 843 g, 83%). MS m/z 190 (M+H),
Calculado para C_{12}H_{15}NO, 189.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
A una solución de la cetona XX (763 g, 4,03
mmol) en etanol (45 ml) y agua (15 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (3,09 g, 32,21 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (6,75 g, 10,38 mmol, 2,5
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. La mezcla reaccional enfriada se adicionó a agua
helada (200 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resultante, se lavó a fondo con
agua y se secó, lo que dió la hidantoina YY en forma de un sólido
blanco (rendimiento 9,30 g, 89%). MS m/z 260 (M+H),
Calculado para C_{14}H_{17}N_{3}O_{2}, 259.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
A una suspensión de la hidantoina YY (780 mg,
3,012 mmol) en THF seco (22 ml) se adicionó
di-ter-butil dicarbonato (1,64 g,
7,52 mmol, 2,5 equivalentes), tri-etilamina (0,42
ml, 305 mg, 3,01 mmol, 1,0 equiv.) y DMAP (20 mg, 0,164 mmol) en
sucesión. Al cabo de unos 5 minutos de la adición la reacción viró a
una solución amarillo claro y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La mezcla reaccional se concentró bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que que se recogió en EtOAc
(300 ml), se lavó con salmuera (3 x 30 ml), se secó sobre
Na_{2}CO_{3} anhidro y se concentró bajo presión reducida. El
producto amarillo claro crudo se purificó mediante cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 80/20) lo que dió la
bis-Boc hidantoina pura ZZ en forma de un sólido
blanco (1,37 g, cuantitativo). HRMS m/z 482,2261 (M+Na),
Calculado para C_{24}H_{33}N_{3}O_{6}, 482.2267.
Etapa
5
La bis-Boc hidantoina ZZ (1,29
g, 2,818 mmol) se disolvió en DME (20 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (25 ml, 25 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, lo que
dió una mezcla bastante límpida. HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
4-amino-1-(3-metilfenil)piperidin-4-carboxílico
(3-MeAPPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. Luego se diluyó esta solución (30 ml) con
1,4-dioxano (30 ml) y se trató con
Fmoc-Cl (1,46 g, 5,65 mmol, 2,0 equiv.) y se agitó
durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la mezcla
reaccional bajo presión reducida para separar el dioxano, se
neutralizó con HCl 1N y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró. Se purificó el producto
crudo mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc \rightarrow
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar el producto puro
Fmoc-2-MeAPPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento a partir de bis-Boc hidantoina
1,002 g, 78%). HRMS m/z 479,1940 (M+Na), Calculado para
C_{28}H_{28}N_{2}O_{4}Na, 479,1947.
Etapa
1
A una solución de 3-yodoanisol
(4,68 g, 2,4 ml, 20,0 mmol),
1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decano
(6,2 ml, 6,88 g, 48,1 mmol, 2,4 equiva.) y
ter-butóxido sódico (5,3 g, 55,2 mmol, 2,8 equiv.)
en dioxano seco (80 ml) se adicionó
tris-(dibencilidenacetona)dipaladio (0) (91 mg, 0,1 mmol) y
tri-o-tolilfosfina (122 g, 0,4
mmol). Se calentó la reacción a 90ºC durante 26 horas. Se concentró
la mezcla reaccional resultante para separar el disolvente y se
trató el residuo con agua y se extrajo con EtOAc. Se combinaron los
extractos orgánicos combinados, se lavó con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró, lo que dió aceite pardo. Este
producto crudo se purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc,
95/5 a 75/25) para proporcionar el producto puro AAA en forma de un
sólido ligeramente amarillo (3,10 g, 62%). MS m/z (M+H), 250
(M+H), Calculado para C_{14}H_{19}NO_{3}, 249.
Etapa
2
A una solución del cetal AAA (3,10 g, 12,45
mmol) en acetona (90 ml) se adicionó ácido clorhídrico 6N (45 ml) y
se calentó la reacción en reflujo durante la noche. Se concentró la
reacción resultante para separar el disolvente. Se diluyó el
residuo con EtOAc, se neutralizó con NaOH acuoso (6N). Se
separaron las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se
lavaron los extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó
sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró. El producto crudo se
purificó sobre cromatografía flash (hexano/EtOAc, 90/10
\rightarrow 70/30) lo que dió el producto BBB en forma de un
aceite amarillo (rendimiento 2,53 g, 99%). ^{1}H RMN
(CDCl_{3}): 7,20 (m, 1H), 6,58 (d, 1H), 6,39-6,56
(m, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,59 (m, 4H) y 2,58 (m, 4H).
Etapa
3
A una solución de la cetona BBB (181 g, 8,82
mmol) en etanol (60 ml) y agua (20 ml) en una botella de presión de
vidrio, se adicionó carbonato amónico (6,77 g, 70,52 mmol, 8
equivalentes) y cianuro potásico (1,14 g, 17,6 mmol, 2,0
equivalentes). Se calentó la mezcla a 80-90ºC
durante 18 horas. La mezcla reaccional enfriada se adicionó a agua
helada (200 ml) y se agitó vigorosamente durante 30 minutos. Se
filtró por succión el precipitado resultante, se lavó a fondo con
agua y se secó, lo que dió la hidantoina CCC en forma de un sólido
blanco (rendimiento 2,23 g, 92%). MS m/z 276 (M+H),
Calculado para C_{14}H_{17}N_{3}O_{3}, 275.
Etapa
4
A una suspensión de la hidantoina CCC (1,10 mg,
4,00 mmol) en THF seco (50 ml) se adicionó di-ter-butil
dicarbonato (2,18 g, 10,0 mmol, 2,5 equivalentes), trietilamina
(0,62 ml, 445 mg, 4,4 mmol, 1,1 equiv.) y DMAP (20 mg, 0,164 mmol)
en sucesión. Al cabo de unos 5 minutos de la adición la reacción
viró a una solución amarillo claro y se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La mezcla reaccional se concentró bajo
presión reducida, lo que dió un sólido que que se recogió en EtOAc
(300 ml), se lavó con salmuera (3 x 30 ml), se secó sobre
Na_{2}CO_{3} anhidro y se concentró bajo presión reducida. El
producto amarillo claro crudo se purificó mediante cromatografía
flash (hexano/EtOAc, 90/10 \rightarrow 80/20) lo que dió la
bis-Boc hidantoina pura DDD en forma de un sólido
blanco (1,90 g, cuantitativo). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,16 (t,
1H), 6,57 (d, 1H), 6,24 (s, 1H), 6,19 (d, 1H), 3,77 (s, 3H), 1,58
(s, 9H), 1,42 (s, 9H); MS m/z 476 (M+H), Calculado para
C_{24}H_{33}N_{3}O_{7}, 475.
Etapa
5
La bis-Boc hidantoina DDD (1,06
g, 2,23 mmol) se disolvió en DME (20 ml), lo que dió una solución
límpida. A esta solución se adicionó NaOH 1N (20 ml, 20 mmol) y se
agitó la reacción durante la noche a temperatura ambiente, lo que
dió una mezcla bastante límpida. HPLC mostró el completado de la
reacción. Se concentró la mezcla reaccional bajo presión reducida
para separar DME y se extrajo con Et_{2}O. Sin purificación se
trató la fase acuosa resultante conteniendo ácido
4-amino-1-(3-metoxifenil)piperidin-4-carboxílico
(3-MeOAPPC) con HCl 6N para ajustar el pH a
11-12. Luego se diluyó esta solución (35 ml) con
1,4-dioxano (35 ml) y se trató con
Fmoc-Cl (1,46 g, 755 mmol, 2,93 mmol, 1,3 equiv.) y
se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se concentró la
mezcla reaccional bajo presión reducida para separar el dioxano, se
neutralizó con HCl 1N y se extrajo con EtOAc. Se lavaron los
extractos orgánicos combinados con salmuera, se secó sobre
Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró. Se purificó el producto
crudo mediante cromatografía flash (hexano/EtOAc \rightarrow
CH_{2}Cl_{2}/MeOH) para dar el producto puro
Fmoc-2-MeAPPC en forma de un sólido
blanco (rendimiento a partir de bis-Boc hidantoina
DDD 668 g, 63%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 7,83 (d, 2H), 7,72 (d,
2H), 7,41 (td, 2H), 7,34 (dt, 2H), 7,16 (t, 1H), 6,52 (d, 1H), 6,42
(s, 1H), 6,36 (d, 1H), 4,25 (m, 3H), 3,68 (s, 3H),
3,23-3,40 (m, 2H), 2,96 (t, 2H) y
1,86-2,18 (m, 4H). HRMS m/z 495,1901 (M+Na),
Calculado para C_{28}H_{28}N_{2}Na, 495,1896.
Etapa
1
Una mezcla de
4-ciclohexilciclohexanona (3,00 g, 16,6 mmol),
cianuro potásico(1,63 g, 25,0 mmol), carbonato amónico (9,59
g, 99,8 mmol), etanol (75 ml) y agua (15 ml) en un matraz de presión
de gruesa pared sellado se calentó en un baño de aceite a 80ºC
durante 15 horas. Después de enfriamiento hasta temperatura
ambiente se virtió la suspensión blanca en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. La filtración y secado al aire dió hidantoina EEE
(rendimiento 6,10, todavía húmeda, >100%) en forma de un sólido
blanco ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}) delta 10,52 (1H,
ancho, NH), 8,43 (1H, s ancho, NH), 0,80-1,80 (20H,
m). LRMS (APCI): C_{14}H_{22}N_{2}O_{2}, calculado 250;
observado: 249 (M-H), 251 (M+H).
Etapa
2
Una mezcla de hidantoina EEE (1,39 g, 5,55 mmol)
y solución de hidróxido sódico 6N (50 ml) en un matraz de presión
de gruesa pared sellado se calentó en un baño de aceite a 130ºC
durante 2 días. Se enfrió la mezcla reaccional en un baño de
hielo, se neutralizó hasta \simpH7 utilizando ácido clorhídrico
concentrado. Se filtró la suspensión blanca y se lavaron los
precipitados con agua, lo que dió ácido
1-amino-4-ciclohexilciclohexan-1-carboxílico
crudo (rendimiento 48,3 g, húmedo y conteniendo sales inorgánicas,
>100%). LRMS (Electropulverización): C_{13}H_{23}NO_{2},
calculado: 225; observado: 226 (M+H).
Etapa
3
Una mezcla de ácido
1-amino-4-ciclohexilciclohexan-1-carboxílico
crudo (teórico 48,3 g, 5,55 mmol), trietilamina (1,0 ml, 7,17
mmol), 9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 2,43 g, 7,20 mol) en acetonitrilo (75
ml) y agua (85 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas.
Se concentró la mezcla reaccional en vacío para separar la mayor
parte del acetonitrilo, se acidificó hasta pH \sim3 con solución
acuosa de ácido cítrico al 10%, y se extrajo la emulsión blanca tres
veces con cloruro de metileno. Se lavaron las fases orgánicas
combinadas con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio.
La filtración y concentración dió un aceite crudo que se purificó
mediante cromatografía de columna (eluido con 1 \rightarrow 5
\rightarrow 8% metanol/cloruro de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-1-amino-4-trans-ciclohexilciclohexan-1-carboxílico
(rendimiento 250 mg, 100% para dos etapas). HRMS (FAB):
C_{28}H_{34}NO_{4} (M+H) Calculado: 448,2488; observado:
448,2497.
Etapa
1
Una mezcla de
4,4-difenilclohexanona (preparado mediante
hidrogenación de 4,4-difenilciclohexenona según los
procedimientos de Freeman, P.K. et. al. J. Org. Chem.
1989, 54, 782-789) (1,55 g, 6,19 mmol) cianuro
potásico (0,65 g, 9,97 mmol), carbonato amónico (3,60 g, 37,5
mmol), etanol (48 ml) y agua (12 ml) en un matraz de presión de
gruesa pared sellado se calentó en un baño de aceite a 80ºC durante
24 horas. Después de enfriamiento hasta temperatura ambiente se
virtió la suspensión blanca en hielo-agua y se agitó
a temperatura ambiente durante un par de horas. La filtración y
secado al aire dió hidantoina FFF (rendimiento 1,89, todavía húmeda,
>95%) en forma de un sólido blanco ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) delta 10,57 (1H, ancho, NH), 8,59
(1H, s ancho, NH), 7,00-7,50 (10H, m, fenilo). LRMS
(Electropulverización): C_{20}H_{20}N_{2}O_{2}, calculado
320; observado: 319 (M-H).
Etapa
2
Una mezcla de hidantoina FFF (1,88 g, 5,87
mmol), hidróxido de bario monohidrato (5,60 g, 29,6 mmol) y agua
(100 ml, excesivamente diluido) en un matraz de presión de gruesa
pared sellado se calentó en un baño de aceite a 105ºC durante 2
días. Se adicionó mas hidróxido de bario monohidrato (5,60 g, 29,6
mmol) y se calentó la mezcla en un baño de aceite a 105ºC durante
otras 24 horas. Se enfrió la mezcla reaccional hasta temperatura
ambiente, se acidificó hasta \simpH3 utilizando ácido sulfúrico 4N
mientras se agitaba vigorosamente. Se agitó la suspensión en un
baño de agua hirviente durante dos horas y se enfrió a temperatura
ambiente. Se filtró la suspensión blanca y se lavaron los
precipitados con agua. Se concentró el filtrado combinado y lavazas
en vacío hasta \sim30 ml. La neutralización con solución
concentrada de hidróxido amónico dió precipitados blancos que se
filtraron lavaron con agua y secaron en vacío durante la noche lo
que dió ácido
1-amino-4,4-difenilciclohexan-1-carboxílico
crudo (rendimiento 0,52 g, 30%) en forma de un sólido blanco. LRMS
(Electropulverización): C_{19}H_{21}NO_{2}, calculado: 295;
observado: 294 (M-H), 296 (M+H).
Etapa
3
\newpage
Una mezcla de ácido
1-amino-4,4-difenilciclohexan-1-carboxílico
crudo (510 mg, 1,73 mmol), trietilamina (0,37 ml, 2,65 mmol),
9-fluorenilmetil succinimidil carbonato
(Fmoc-OSu, 880 mg, 2,61 mol) en acetonitrilo (25 ml)
y agua (25 ml) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El
análisis de TLC de la reacción indicó la presencia de material de
partida aminoácido. Se adicionó 9-fluorenilmetil
succinimidil carbonato (200 mg) y acetonitrilo (5 ml) y se agitó la
mezcla a temperatura ambiente durante otras 24 horas. Se concentró
la mezcla reaccional en vacío para separar la mayor parte del
acetonitrilo, se acidificó hasta pH \sim3 con solución acuosa de
ácido cítrico al 10%, y se extrajo la emulsión blanca tres veces con
acetato de etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con
agua, salmuera, se secó sobre sulfato de magnesio. La filtración y
concentración dió un aceite crudo que se purificó mediante
cromatografía de columna (eluido con 1 \rightarrow 4
\rightarrow 8% metanol/cloruro de metileno), lo que dió ácido
Fmoc-1-amino-4,4-trans-difenilciclohexan-1-carboxílico
(rendimiento 350 mg, 39%) en forma de un sólido blanco. HRMS
(FAB): C_{34}H_{32}NO_{4} (M+H) Calculado: 518,2331;
observado: 518,231.
Etapa
1
Una mezcla de
4-t-butilciclohexanona (2,00 g, 13,0
mmol), cianuro potásico (1,27 g, 19,5 mmol), carbonato amónico
(7,48 g, 77,8 mmol), etanol (60 ml) y agua (12 ml) en un matraz de
presión de gruesa pared sellado se calentó en un baño de aceite a
80ºC durante 15 horas. Después de enfriamiento hasta temperatura
ambiente se virtió la suspensión blanca en
hielo-agua y se agitó a temperatura ambiente durante
un par de horas. La filtración dió hidantoina GGG (rendimiento
2,78, 96%) en forma de un sólido blanco ^{1}H RMN
(DMSO-d_{6}) delta 10,52 (1H, ancho, NH), 8,50
(1H, s ancho, NH), 0,81 (9H, s, t-Bu).
Etapa
2
Una mezcla de hidantoina GGG (2,78 g, 12,4
mmol), hidróxido de bario monohidrato (11,74 g, 62,0 mmol) y agua
(50 ml) en un matraz de presión de gruesa pared sellado se calentó
en un baño de aceite a 120ºC durante 2 días. Se enfrió la mezcla
reaccional hasta temperatura ambiente, se acidificó hasta \simpH3
utilizando ácido sulfúrico 4N mientras se agitaba vigorosamente. Se
agitó la suspensión en un baño de agua hirviente durante una hora y
se enfrió hasta temperatura ambiente. Se filtró la suspensión blanca
y se lavaron los precipitados con agua. Se concentró el filtrado y
lavazadas combinados en vacío hasta \sim30 ml. La neutralización
con solución concentrada de hidróxido amónico dió precipitados
blancos que se filtraron, lavaron con agua y secaron en vacío
durante la noche, lo que dió ácido
1-amino-4-trans-t-butilciclohexan-1-carboxílico
(rendimiento 2,10 g, 85%)en forma de un sólido blanco.
Etapa
3
Una mezcla de ácido
1-amino-4-trans-t-butilciclohexil-1-carboxílico
crudo (2,10 g, 10,54 mmol), 9-fluorenilmetil
succinimidil carbonato (Fmoc-OSu, 6,33 g, 7,20 mol)
en dioxano (150 ml) y solución de carbonato sódico al 10% (120 ml)
se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Se concentró la
mezcla reaccional en vacío para separar la mayor parte del dioxano,
se acidificó hasta pH \sim3 con HCl 3N%, y se extrajo la emulsión
blanca dos veces con cloruro de metileno. Se lavaron las fases
orgánicas combinadas con agua, salmuera, se secó sobre sulfato de
magnesio. La filtración y concentración dió un aceite crudo que se
purificó mediante cromatografía de columna (eluido con 1
\rightarrow 4 \rightarrow 5% metanol/cloruro de metileno),
lo que dió ácido
Fmoc-1-amino-4-trans-t-butilciclohexan-1-carboxílico
(rendimiento 1,42 g, 32%). HRMS (FAB): C_{26}H_{32}NO_{4}
(M+H) Calculado: 422,2331; observado: 422,23.
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
trans-3-indolearílico (15,0 g, 0,08
mol) en 350 ml de THF seco a -78ºC se adicionó lentamente 125 ml de
n-BuLi 1,6 M en hexano. Se agitó la suspensión
resultante a -78ºC durante 1 hora. Luego se adicionó lentamente
una solución de cloruro de 2-mesitilensulfonilo
(21,9 g, 0,1 mol) en 50 ml de THF seco. Se calentó la la mezcla a
temperatura ambiente y se agitó durante la noche. Se virtió la
mezcla a una solución acuosa saturada de NH_{4}Cl. Se separaron
las fases y se extrajo la fase acuosa con EtOAc. Se secó la fase
orgánica combinada sobre sulfato sódico. La separación de
disolventes dió 14,1 g de producto crudo HHH que se utilizó para la
etapa siguiente sin ulterior purificación. El análisis ^{1}H RMN
indica que contiene 2,8 g de ácido
2-mesitilensulfónico- ^{1}H RMN (CD_{3}OD) delta
7,57 (s, 1H), 7,42 (d, 1H), 7,15-7,30 (m, 3H), 7,02
(s, 2H), 6,54 (d, 1H), 6,36 (d, 1H), 2,52 (s, 9H), 2,30 (s,
3H).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de ácido
N-2-mesitilensulfonil-trans-3-indolarílico
(3,26 g, 8,8 mmol) en 140 ml de THF seco a -78ºC se adicionaron 3,7
ml (3 equivalentes) de trietilamina y 2,17 ml (2 equivalentes) de
Me_{3}CCOCl. Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante 15
minutos, y a 0ºC durante l hora y media. Se enfrió la mezcla hasta
-78ºC, a la que se adicionaron 5,5 ml de n-BuLi 1,6
M en hexano, luego se adicionó una mezcla de
(R)-4-fenil-2-oxoazolidinona
y n-BuLi en THF (preparado mediante la adición de
11 ml de n-BuLi 1,6 M en hexano a una solución de
(R)-4-fenil-2-oxazolidinona
(2,87 g, 17,6 mmol) en 70 ml de THF seco a -78ºC) a través de una
cánula. Se agitó la mezcla resultante a -78ºC durante 2 horas, y a
temperatura ambiente durante la noche. Se enfrió la reacción
mediante solución acuosa de NH_{4}Cl (100 ml). Después de la
separación de los disolventes orgánicos en vacío se extrajo el
residuo acuoso con EtOAc. Se secó la fase orgánica combinada sobre
sulfato sódico. La filtración y concentración dió un producto
crudo que se purificó mediante cromatografía flash (EtOAc/hexano,
1:4), lo que dió el producto III en forma de una goma parda clara
con rendimiento del 63% (2,86 g).
LR-Electropulverización:
C_{29}H_{26}N_{2}O_{5}S, Calculado: 514; observado: m/z 515
(M+H).
\newpage
Etapa
3
A una mezcla de CuBr.Me_{2}S (0,84 g, 4,08
mmol) y 5 ml de sulfuro de dimetilo en 10 ml de THF seco a -4ºC se
adicionó 1,36 ml de CH_{3}MgBr 3M en éter. Después de agitación
durante 10 minutos se adicionó el producto anterior (1,4 g, 2,72
mmol) en 8 ml de THF seco. Se agitó la mezcla resultante a -4ºC
durante 1 hora y a temperatura ambiente durante 6 horas. Después
de enfriamiento a -78ºC, se adicionó a la mezcla 1,45 g (8,16 mmol)
de N-bromosuccinimida en 15 ml de THF seco. Se
agitó la mezcla a -78ºC durante 30 minutos y a temperatura ambiente
durante la noche. Se virtió la mezcla a 100 ml de salmuera, y se
extrajo con EtOAc (2 x 100 ml). Se seco la fase orgánica sobre
sulfato sódico. La filtración y concentración dió un producto crudo
que se purificó mediante cromatografía flash (EtOAc/hexano, 1:4),
lo que dió el producto JJJ en forma de una goma parda clara con
rendimiento del 46% (0,77 g). ^{1}H RMN (CDCl_{3}) delta 7,63
(d, 1H), 7,47 (s, 1H), 7,20-7,37 (m, 8H), 6,98 (s,
2H), 6,16 (d, 1H), 5,13 (dd, 1H), 4,49 (t, 1H), 4,17 (dd, 1H), 3,75
(dt, 1H), 2,54 (s, 9H), 2,31 (s, 3H), 1,59 (d, 3H).
Etapa
4
Se mezcló el bromuro anterior JJJ (0,72 g, 1,18
mmol) con azida de
tetra-n-butilamonio (1,68 g, 59
mmol) y azida sódica (77 mg, 1,18 mmol) en 10 ml de acetonitrilo y
se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. Se virtió la
mezcla a 100 ml de solución acuosa de NH_{4}Cl y se extrajo con
EtOAc (2 x 100 ml). Se secó la fase orgánica sobre sulfato sódico.
La filtración y concentración dió un producto crudo que se purificó
mediante una cromatografía flash (EtOAc/CH_{2}Cl_{2}/hexano,
1:2:5), lo que dió el producto KKK en forma de una goma parda con
rendimiento del 82% (0,55 g). ^{1}H RMN (CDCl_{2}) delta 7,65
(d, 1H), 7,59 (s, 1H), 7,18-7,29 (m, 8H), 6,90 (s,
2H), 5,54 (d, 1H), 5,50 (dd, 1H), 4,78 (t, 1H), 4,35 (dd, 1H), 3,62
(quinteto, 1H), 2,43 (s, 9H), 2,28 (s, 3H), 1,28 (d, 3H).
Etapa
5
A una mezcla de la azida anterior KKK (0,55 g,
0,96 mmol), agua (4 ml) y THF (12 ml) a 0ºC se adicionó 0,65 ml de
H_{2}O_{2} al 30%, luego se adicionaron 48 mg (2 equivalentes)
de LiOH en 1 ml de agua. Se agitó la mezcla resultante a 0ºC
durante 2 horas. Se enfrió la reacción con Na_{2}So_{3} (1 g)
en 6 ml de agua. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante
30 minutos mas. Después de la separación del disolvente orgánico
se diluyó la solución acuosa con 10 ml de solución saturada de
NaHCO_{3} y se extrajo con EtOAc (2 x 30 ml). La filtración y
concentración dió un producto crudo que se purificó mediante
cromatografía flash (HOAc/MeOH/EtOAc, 1:10:100), lo que dió el
producto LLL en forma de un sólido desteñido con rendimiento del
83% (0,34 g). LR-Electropulverización:
C_{21}N_{4}O_{4}S,calculado: 426; observado: m/z 425
(M-H).
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió el ácido azido anterior LLL (0,34 g,
0,8 mmol) en 20 ml de metanol. A la solución se adicionó 170 mg de
Pd sobre carbón al 10%. Se agitó la mezcla resultante a temperatura
ambiente bajo H_{2} (balón) durante 3 horas. Después de
filtración y concentración se disolvió el crudo en un disolvente
mixto de THF (12 ml) y agua (4 ml). Se adicionó a la mezcla
NaHCO_{3} (254 mg, 3 mmol) y Fmoc-Osu (540 mg,
1,6 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente
durante 18 horas. Se diluyó con 30 ml de solución saturada de
NH_{4}Cl y se extrajo con EtOAc (2 x 30 ml). La filtración y
concentración dió un producto crudo que se purificó mediante
cromatografía flash (HOAc/MeOH/EtOAc, 1:10:100), lo que dió el
producto 3S,2S-Fmoc-(L)-beta meti
(Nin-Mes) triptofano en forma de un sólido desteñido
con rendimiento del 50% (0,25 g).
LR-Electropulverización:
C_{36}H_{34}N_{2}O_{6}S, Calculado: 622; observado: m/z 621
(M-H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se entumeció resina de benzhidrilamina
copoliestireno-divinilbenceno al 1% reticulado (10,0
g, 9,3 mequiv, 100-200 mallas ASTM, Avanced
CheTech) en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}, se filtró y se lavó
sucesivamente con 100 ml cada uno de CH_{2}Cl_{2},
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% (dos veces), Ch_{2}Cl_{2} (dos
veces). Se trató la resina con ácido
p-[(R,S)-alfa-[1-(9H-fluoren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibencil]-fenoxi-acético
(Fmoc-Linder) (7,01 g, 13,0 mmol),
N-hidroxi-benzotriazol (2,16 g, 16,0
mmol), y diisopropilcarbodiimida (2,04 ml, 13,0 mmol) en 100 ml,
DMF/Ch_{2}Cl_{2} al 25% durante 24 horas a temperatura ambiente.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 100 ml cada uno de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol (dos veces), DMF, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Un análisis de ninhidrina Kaiser
resultó negativo. Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 16,12 g
de resina Fmoc-Linker-BHA. Una
porción de esta resina (3,5 mg) se sometió a desprotección de Fmoc
y el análisis de UV cuantitativo indicó una carga de 0,56
mmol/g.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 se sometió a síntesis de fase sólida
utilizando el Protocolo 1 descrito antes. Todas las copulaciones
se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF como el agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se llevaron a cabo
siete ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-His (Trt) (600 mg 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut)(500
mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Nle
(430, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Se llevó a cabo la
resina peptídica a través de las etapas 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 1 ml de anhídrido acétrico en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6%
durante 30 minutos. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente
con 50 ml cada uno de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo
que dió 1,2 g de resina Ac-heptapeptídica. La
resina Ac-heptapeptídica se trató con 100 \mul de
etanditio, 100 \mul de sulfuro de metileno, 250 \mul de anisol
y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 250 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvieron 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 250 ml de DMF, se adicionaron 600 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 300 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionaron 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó DMF en vacío, y se purificó la
mezcla reaccional resultante con HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 60 mg
(15%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{50}H_{69}N_{15}O_{9}; Calculado: 1024: observado: m/z
(1025 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Se llevó
a cabo la resina peptídica a través de las etapas
1-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se filtró la
resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada uno de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,0 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 220 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación. Se
disolvió 220 mg de los péptidos lineales crudos en 220 ml de DMF, se
adicionó 500 \mul de N-metil morfolina para tener
un pH aparente de 8,0. Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló
la ciclización mediante HPLC. Típicamente la ciclización se
completó dentro de 18-24 horas. Se adicionó 10 ml
de agua para detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se
purificó la mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 53 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{72}N_{12}O_{8}; Calculado: 1017: observado: m/z
(1018 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmol, Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Se llevó a cabo la resina
peptídica a través de las etapas 1-5 del protocolo
1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de
anhídrido valérico en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30
minutos. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada
uno de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo
que dió 1,1 g de resina Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 220 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 240 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(14%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{56}H_{73}N_{11}O_{8}; Calculado: 1028: observado: m/z
(1029 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo dos ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-(2)Nal (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol).
Después de la separación de Fmoc del residuo
2_nal, se convirtió la amina resultante a su derivado de
2-nitrobencen sulfonilo utilizando cloruro de
2-nitrobencensulfonilo (5 eq., 426 mg, 1,93 mmol) y
DIPEA (5 eq.) como la base en DMF. Se llevaron a cabo los lavados
utilizando DMF (6 x 30 ml) seguido de Ch_{2}Cl_{2} (3 x 30 ml)
y se secó la resina bajo vacío. La sulfonamida obtenida se sometió
a metilación utilizando trifenilfosfina (5 eq., 505 mg, 1,93 mmol),
N,N-dietilazodi-carboxilato (5 eq.,
303 \mul, 193 mmol) y metanol (10 eq. 156 \mul, 3,85 mmol) en
THF. Se llevaron a cabo los lavados utilizando THF (6 x 30 ml)
seguido de CH_{2}Cl_{2} (5 x 30 ml) y se secó la resina bajo
vacío. Luego se separó el grupo de 2-nitrobencen
sulfonilo utilizando
1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
(3 eq., 173 \mul, 1,16 mmol), 2-mercaptoetanol (5
eq. 135 \mul, 1,93 mmol) en DMF. Los lavados se llevaron a cabo
utilizando DMF (3 x 30 ml), isopropanol (3 x 30 ml) seguido de éter
etílico (3 x 30 ml) y se secó la resina bajo vacío. Se sometió el
residuo de
N-Me-2-Nal
resultante a cuatro ciclos de acoplamiento, un ciclo cada uno con
Fmoc-arg(Pmc)(800 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Se llevó a cabo la resina
peptídica a través de las etapas 1 - 5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se
filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,2 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina, se lavó con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los
filtrados en éter etílico enfriado. Se centrifugaron los
precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el
producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 235 mg de un sólido
desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 235 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 43 mg
(10%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{57}H_{75}N_{11}O_{8}; Calculado: 1042: observado: m/z
(1043 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido succínico (600 mg, 6
mmol) en DMF con 1,1 ml de DIPEA.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con
50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,1 g de resina Pentil-hexapeptídica. La resina
Pentil-hexapeptídica se trató con 100 \mul de
etanditiol, 100 SYMBOL 109 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul
de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 220 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 220 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 40 mg
(11%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{49}H_{63}N_{11}O_{7}; Calculado: 918: observado: m/z
(919 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido maleico (600 mg, 6
mmol) en DMF con 1,1 ml de HOBT (800 mg, 6 mmol), sin DIPEA. Se
filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,0 g de resina
Pentapeptídica. La resina Pentapeptídica se trató con 100
\mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul
de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con
\sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico
enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase
etérea. Se lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y
se recentrifugó y se secó el producto crudo bajo vacío, lo que dió
230 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin
purificación.
purificación.
Se disolvió 230 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 38 mg
(11%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{49}H_{61}N_{11}O_{7}; Calculado: 916: observado: m/z
(917 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido ftálico (600 mg, 6
mmol) en DMF con 1,1 ml de DIPEA.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con
50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,0 g de resina Pentapeptídica. La resina Pentapeptídica se
trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 220 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 220 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 35 mg
(10%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{53}H_{63}N_{11}O_{7}; Calculado: 966: observado: m/z
(967 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-OHApc (565 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol),Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). Se filtró la resina y se lavó
sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces),
isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina
bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 225 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 225 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{72}N_{12}O_{9}; Calculado: 1033: observado: m/z
(1034 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se lavó
con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido valérico
2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se filtró
la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica. La resina
Pentil-hexapeptídica se trató con 100 \mul de
etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de anisol
y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante
180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de
TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 235 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 235 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 49 mg
(12%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{55}H_{74}N_{12}O_{9}; Calculado: 1047: observado: m/z
(1048 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-EtOApc (640 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo con las etapas 1 - 5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se
filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,2 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 235 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 235 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 60 mg
(14%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{56}H_{76}N_{12}O_{9}; Calculado: 1061: observado: m/z
(1062 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-iPrOApc (660 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se lavó
con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido valérico
2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se filtró
la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,2 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 235 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 260 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 63 mg
(15%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{57}H_{78}N_{12}O_{9}; Calculado: 1075: observado: m/z
(1076 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-3-MeOApc (600 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se lavó
con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido valérico
2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se filtró
la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica. La resina
Pentil-hexapeptídica se trató con 100 \mul de
etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de anisol
y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante
180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de
TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 235 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 235 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 49 mg
(12%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{55}H_{74}N_{12}O_{9}; Calculado: 1047: observado: m/z
(1048 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-ClApc (560 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,0 g de resina
Pentil-hexapeptídica. La resina
Pentil-hexapeptídica se trató con 100 \mul de
etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de anisol
y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante
180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de
TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 230 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 230 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 49 mg
(12%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{71}N_{12}O_{9}; Calculado: 1051: observado: m/z
(1052 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-4-MeApc (590 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,2 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 240 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 240 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(14%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{71}N_{12}O_{8}; Calculado: 1031: observado: m/z
(1032 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Glu
(OBut) (510 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina
peptídica se llevó a cabo con las etapas 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con anhídrido valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante
30 minutos. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,1 g de resina Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 255 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 255 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 60 mg
(15%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{55}H_{74}N_{12}O_{9}; Calculado: 1031: observado: m/z
(1032 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Orn (Boc) (550 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,15 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 240 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 240 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 53 mg
(12%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{53}H_{70}N_{12}O_{8}; Calculado: 1003: observado: m/z
(1004 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dbr(Boc) (540 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,10 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 220 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 220 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 35 mg
(9%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{52}H_{68}N_{12}O_{8}; Calculado: 989; observado: m/z
(990 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 200 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 200 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 30 mg
(8%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{51}H_{66}N_{12}O_{8}; Calculado: 975: observado: m/z
(976 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Asp (OBut)
(500 mg, 1,2 mmol) y HBTu (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se
llevó a cabo con las etapas 1-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido
valérico 2 ml en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos.
Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Acetil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 200 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 210 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 28 mg
(8%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{48}H_{60}N_{12}O_{8}; Calculado: 933: observado: m/z
(934 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido ftálico (660
mg, 6 mmol) en DMF con 1,1 ml de DIPEA. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,0 g de resina Pentapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 220 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 220 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 30 mg
(8%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{50}H_{57}N_{11}O_{7}; Calculado: 924; observado: m/z
(925 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido succínico
(600 mg, 6 mmol) en DMF con 1,1 ml de DIPEA. Se filtró la resina y
se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,0 g de resina Pentapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 220 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 220 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 30 mg
(8%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{46}H_{57}N_{11}O_{7}; Calculado: 876; observado: m/z
(877 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Dpr (Boc) (530 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), anhídrido maleico (600
mg, 6 mmol) en DMF con la adición de HOBT (800 mg, 6 mmol),
sin DIPEA. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con
50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,0 g de resina Pentapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 230 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 230 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 30 mg
(8%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{46}H_{55}N_{11}O_{7}; Calculado: 874; observado: m/z
(875 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol)
y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo mediante las etapas l-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de
anhídrido valérico en 6% de DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30
minutos. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada
vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,3 g de resina Pentil-hexapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 300 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 300 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 80 mg
(20%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{71}N_{11}O_{9}; Calculado: 1018; observado: m/z
(1019 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Ala (380 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmol)
y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a
cabo mediante las etapas l-5 del protocolo 1, se
lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de
anhídrido valérico en 6% de DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30
minutos. Se filtró la resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada
vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que
dió 1,4 g de resina Pentil-hexapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 330 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Se disolvió 330 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 80 mg
(20%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{51}H_{65}N_{9}O_{8}; Calculado: 932; observado: m/z (933
M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Apc (550 mg,
1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol), Fmoc-Cys (Trt)
(710 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-Nle (430, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol.
La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 1 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,2 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentapeptídica se trató con 100 \mul
de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de dimetilo, 250 \mul de
anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente
durante 180 minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2
ml de TFA y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado.
Se centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se
lavó el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que
dió 250 mg de un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a
ciclización sin purificación.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 45 mg
de péptido lineal purificado.
El péptido lineal purificado se disolvió en 2 ml
de DMSO, se diluyó con 500 ml de agua y se ajustó el pH a 8,0 con
NH_{4}OH. Se insufló O_{2} en la solución y se controló la
ciclización mediante HPLC. Típicamente la ciclización se completó
dentro de 24-48 horas. Se liofilizó la solución y
se disolvió el material en CH_{3}COOH y se sometió a HPLC
preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se eluyó
con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A: 0,1%
de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90 minutos,
caudal de flujo 8 ml/min, detección 280 nm. Se cortó el pico
principal mediante análisis de HPLC analítico de las fracciones
recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 20 mg (4,7%) de
péptido cíclico purificado. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{53}H_{70}N_{12}O_{8}S_{2} Calculado: 1067; observado:
m/z (1068 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-(D,L)-Atc (510 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 0,6 mmol), Fmoc-Asp (OBut) (500 mg, 1,2 mmol) y
HBTU (452, 1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo con las
etapas 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con anhídrido valérico 2 ml
en DIPEA/CH_{2}Cl_{2} al 6% durante 30 minutos. Se filtró la
resina y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). Se secó la resina bajo vacío, lo que dió 1,15 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina Pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. Se separó por filtración
la resina con \sim2 ml de TFA y se precipitaron los filtrados en
éter etílico enfriado. Se centrifugaron los precipitados y se
decantó la fase etérea. Se lavó el residuo con dos o tres
volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y se secó el producto
lineal crudo bajo vacío, lo que dió 245 mg de un sólido desteñido.
Se sometió el péptido crudo a ciclización sin purificación.
Se disolvió 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(14%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{52}H_{68}N_{12}O_{8}; Calculado: 989; observado: m/z
(990 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Br-(D,L)Atc
(620 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 240 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 240 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 26 mg
(6%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{52}H_{67}N_{12}O_{8}; Calculado: 1068: observado: m/z
(1069 M+H).
\newpage
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Br-(D,L)Atc
(620 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 240 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 240 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El
segundo pico principal se cortó mediante análisis de HPLC
analítico de las fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron,
lo que dió 24 mg (5%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto
resultó homogéneo mediante HPLC.
LR-Electropulverización
C_{52}H_{67}N_{12}O_{8}; Calculado: 1068: observado: m/z
(1069 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Cl(D,L)Atc
(560 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 250 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 24 mg
(6%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{52}H_{67}N_{12}O_{8}; Calculado: 1024: observado: m/z
(1025 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Cl(D,L)Atc
(560 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 250 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El segundo
pico principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 20 mg
(4%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{52}H_{67}N_{12}O_{8}; Calculado: 1024: observado: m/z
(1025 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-MeO-(D,L)Atc
(600 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 250 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{53}H_{70}N_{12}O_{9}; Calculado: 1019; observado: m/z
(1020 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-EtO-(D,L)Atc
(620 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 260 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 260 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 58 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{72}N_{12}O_{9}; Calculado: 1033; observado: m/z
(1034 M+H).
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-iPrO-(D,L)Atc
(620 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 250 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 250 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 58 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{55}H_{74}N_{12}O_{9}; Calculado: 1047; observado: m/z
(1048 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Me-(D,L)Atc
(620 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 260 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 260 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 62 mg
(13%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{53}H_{70}N_{12}O_{8}; Calculado: 1003; observado: m/z
(1004 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometió la resina engarce
Fmoc-BHA (720 mg, 0,4 mmol) del ejemplo 29 a
síntesis de fase sólida utilizando el protocolo 1 descrito antes.
Todas las copulaciones se llevaron a cabo utilizando HBTU en DMF
como el agente de copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base.
Se llevaron a cabo seis ciclos de copulación de un ciclo cada uno
con Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452
mg, 1,2 mmol), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmol) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmol) y HBTU (452 mg, 1,2 mmol),
Fmoc-5-Et-(D,L)Atc
(600 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg, 0,6 mmol),
Fmoc-Asp (OBut)(500 mg, 1,2 mmol) y HBTU (452 mg,
1,2 mmol). La resina peptídica se llevó a cabo mediante las etapas
l-5 del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2}
(tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido valérico en 6% de
DIPEA/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. Se filtró la resina y se
lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos
veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres veces). Se secó la
resina bajo vacío, lo que dió 1,1 g de resina
Pentil-hexapeptídica.
La resina pentil-hexapeptídica
se trató con 100 \mul de etanditiol, 240 \mul de anisol y 10 ml
de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 180
minutos. Se separó por filtración la resina con \sim2 ml de TFA
y se precipitaron los filtrados en éter etílico enfriado. Se
centrifugaron los precipitados y se decantó la fase etérea. Se lavó
el residuo con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó
y se secó el producto lineal crudo bajo vacío, lo que dió 245 mg de
un sólido desteñido. Se sometió el péptido crudo a ciclización sin
purificación.
Se disolvió 245 mg de los péptidos lineales
crudos en 220 ml de DMF, se adicionó 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se adicionaron 280 mg de BOP y se controló la ciclización mediante
HPLC. Típicamente la ciclización se completó dentro de
18-24 horas. Se adicionó 10 ml de agua para
detener la reacción, se evaporó el DMF en vacío y se purificó la
mezcla reaccional resultante mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna de C18 Vydac (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, caudal de flujo 8 ml/minuto, detección 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis de HPLC analítico de las
fracciones recogidas, se agruparon y liofilizaron, lo que dió 55 mg
(12%) de un polvo amorfo blanco. Este compuesto resultó homogéneo
mediante HPLC. LR-Electropulverización
C_{54}H_{72}N_{12}O_{8}; Calculado: 10177; observado: m/z
(1018 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles)) del ejemplo 29, fue sometida a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc) (800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-iPr-(D,L)Atc (600 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp
(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mg, 1,2 mmoles). La
resina del péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5
del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se
trató con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2}
durante 30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con
50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina de
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 245 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a ciclación sin previa
purificación.
245 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C-18 (2,5 x
20 cm) y se eluyó con un gradiente lineal de 20-60%
B (tampón A: 0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN)
en 90 minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm.
El pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 54 mg
(13%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{55}H_{74}N_{12}O_{8} calculado: 1031, observado: m/z
(1032 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, fue sometida a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp
(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina
del péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina de
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 240 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 260 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a ciclación sin previa
purificación.
240 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C-18 (2,5 x
20 cm) y se eluyó con un gradiente lineal de 20-60%
B (tampón A: 0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN)
en 90 minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm.
El primer pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica
de las fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose
24 mg (5,6%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{52}H_{66}N_{11}O_{9}Br calculado: 1069, observado: m/z
(1070 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-Br-(D,L)Atc (620 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp
(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mg, 1,2 mmoles). La
resina del péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5
del protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se
trató con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2}
durante 30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con
50 ml cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,1 g de resina de
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 240 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 240 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a ciclación sin previa
purificación.
240 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El
segundo pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de
las fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 22
mg (4,8%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{52}H_{66}N_{11}O_{9}Br calculado: 1069, observado: m/z
(1070 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp
(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina
del péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina de
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 245 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a ciclación sin previa
purificación.
245 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C-18 (2,5 x
20 cm) y se eluyó con un gradiente lineal de 20-60%
B (tampón A: 0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN)
en 90 minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm.
El primer pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica
de las fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose
22 mg (5,8%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{52}H_{66}N_{11}O_{9}Cl calculado: 1024, observado: m/z
(1025 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Cit (480 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-Cl-(D,L)Atc (560 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp
(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina
del péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina de
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 250 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a ciclación sin previa
purificación.
250 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El
segundo pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de
las fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 20
mg (5,4%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{52}H_{66}N_{11}O_{9}Cl calculado: 1024, observado: m/z
(1025 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron siete
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg(Pmc)(800 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D,L)Atc (550
mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles),
Fmoc-Cys(Trt) (710 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Nle (430 mg, 1,2 mmoles),
y HBTU (452 mg,1,2 mmoles). La resina del péptido se obtuvo
mediante los pasos 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 1 ml de anhídrido
acético en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La resina
se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). La resina se secó al vacío obteniéndose 1,0 g de resina de
Ac-heptapéptido.
La resina acetil-heptapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 240 mg de un sólido de
color blancuzco.
Este péptido lineal crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 55 mg
del péptido lineal purificado.
El péptido lineal purificado se disolvió en 2 ml
de DMSO diluido con 500 ml de agua, y el pH se ajustó a pH 8,0 con
NH_{4}OH. Se borboteó O_{2} a través de la solución y la
ciclación se monitorizó mediante HPLC. Típicamente la ciclación se
completó al cabo de 24-48 horas. La solución se
liofilizó y el material disuelto en CH_{3}COOH se sometió a la
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón
A: 0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El
pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 20 mg
(5,0%) del péptido cíclico purificado. Este compuesto fue homogéneo
por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{51}H_{66}N_{12}O_{8}S_{2} calculado: 1039, observado:
m/z (1040 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron siete
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Cys (Trt) (710 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-5-BrAtc (620 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Cys(Trt)
(710 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 1 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,1 g de resina Ac-heptapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 240 mg de un sólido de
color blancuzco.
Este péptido lineal crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 50 mg
del péptido lineal purificado.
El péptido lineal purificado se disolvió en 2 ml
de DMSO diluido con 500 ml de agua, y el pH se ajustó a pH 8,0 con
NH_{4}OH. Se borboteó O_{2} a través de la solución y la
ciclación se monitorizó mediante HPLC. Típicamente la ciclación se
completó al cabo de 24-48 horas. La solución se
liofilizó y el material disuelto en CH_{3}COOH se sometió a la
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón
A: 0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El
pico principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 22 mg
(5,2%) del péptido cíclico purificado. Este compuesto fue homogéneo
por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{48}H_{60}N_{11}O_{7}S_{2}Br calculado: 1047,
observado: m/z (1048 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Appc
(550 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles),
Fmoc-Asp(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles). La resina del péptido se obtuvo mediante los
pasos 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La resina
se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). La resina se secó al vacío obteniéndose 1,2 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 245 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
245 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 54 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{55}H_{71}N_{13}O_{8} calculado: 1018, observado: m/z
(1019 M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-2-MeAppc (570 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 250 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
250 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 61 mg
(15%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{54}H_{73}N_{13}O_{8} calculado: 1032, observado: m/z
(1033 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-2-iPrAppc (600 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 245 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
245 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 52 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{56}H_{77}N_{13}O_{8} calculado: 1060, observado: m/z
(1061 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-3-MeAppc (570 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 248 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
248 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 54 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{54}H_{73}N_{13}O_{8} calculado: 1032, observado: m/z
(1033 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-4-MeAppc (570 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 254 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
254 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 57 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{54}H_{73}N_{13}O_{8} calculado: 1032, observado: m/z
(1033 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-4-ClAppc (580 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 250 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
250 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 55 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{53}H_{70}N_{13}O_{8}Cl calculado: 1032, observado: m/z
(1033 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-4-PhOAppc (650 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 270 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
270 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 58 mg
(13%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{59}H_{75}N_{13}O_{9} calculado: 1110, observado: m/z
(1111 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-3-MeOAppc (580 mg, 1,2 mmoles)
y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,2 g de resina pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 250 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
250 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción, se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 54 mg
(13%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{54}H_{73}N_{13}O_{9} calculado: 1048, observado: m/z
(1049 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Adpc
(620 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles),
Fmoc-Asp(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles). La resina del péptido se obtuvo mediante los
pasos 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La resina
se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). La resina se secó al vacío obteniéndose 1,1 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 242 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
242 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 48 mg
(11%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{60}H_{76}N_{12}O_{8} calculado: 1093, observado: m/z
(1094 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Achc
(560 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles),
Fmoc-Asp(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles). La resina del péptido se obtuvo mediante los
pasos 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La resina
se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). La resina se secó al vacío obteniéndose 1,1 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 250 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
250 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 52 mg
(13%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray:
C_{54}H_{78}N_{12}O_{8} calculado: 1023, observado: m/z
(1024 M+H).
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-Trp (520 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2
mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg,
1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Abc
(530 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 0,6 mmoles),
Fmoc-Asp(OBut) (500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU
(452 mg, 1,2 mmoles). La resina del péptido se obtuvo mediante los
pasos 1-5 del protocolo 1, se lavó con
CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató con 2 ml de anhídrido
valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante 30 minutos. La resina
se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml cada vez de
CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y CH_{2}Cl_{2} (tres
veces). La resina se secó al vacío obteniéndose 13 g de resina
pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de ácido trifluoroacético a
temperatura ambiente durante 180 minutos. La resina se separó por
filtración, se lavó con \sim2 ml de TFA y los filtrados se
precipitaron en éter etílico enfriado. Los precipitados se
centrifugaron y la capa de éter se decantó. El residuo se lavó con
dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se recentrifugó y el producto
lineal crudo se secó al vacío obteniéndose 255 mg de un sólido de
color blancuzco. El péptido crudo se sometió a la ciclación sin
previa purificación.
255 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 58 mg
(14%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{52}H_{76}N_{12}O_{8} calculado: 997, observado: m/z (998
M+H).
\vskip1.000000\baselineskip
La resina engarce Fmoc-BHA (720
mg, 0,4 mmoles) del ejemplo 29, se sometió a la síntesis en fase
sólida usando el protocolo 1 descrito más arriba. Todas las
copulaciones se efectuaron empleando HBTU en DMF como agente de
copulación y DIPEA (3 equivalentes) como base. Se efectuaron seis
ciclos de copulación de un ciclo cada uno con
Fmoc-Lys (Boc) (565 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-(2S,3S)beta metil (nMes)Trp (616
mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles),
Fmoc-Arg (Pmc)(800 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg,
1,2 mmoles), Fmoc-(D)Phe (480 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452
mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Apc (550 mg, 1,2 mmoles) y
HBTU (452 mg, 1,2 mmoles), Fmoc-Asp(OBut)
(500 mg, 1,2 mmoles) y HBTU (452 mg, 1,2 mmoles). La resina del
péptido se obtuvo mediante los pasos 1-5 del
protocolo 1, se lavó con CH_{2}Cl_{2} (tres veces) y se trató
con 2 ml de anhídrido valérico en DIPEA 6%/CH_{2}Cl_{2} durante
30 minutos. La resina se filtró y se lavó sucesivamente con 50 ml
cada vez de CH_{2}Cl_{2} (dos veces), isopropanol, y
CH_{2}Cl_{2} (tres veces). La resina se secó al vacío
obteniéndose 1,0 g de resina pentil-hexapéptido.
La resina pentil-hexapéptido se
trató con 100 \mul de etanoditiol, 100 \mul de sulfuro de
dimetilo, 250 \mul de anisol, y 10 ml de HF a 0ºC durante 60
minutos. El HF se evaporó y la resina se lavó con acetato de etilo,
se separó por filtración, se lavó con \sim 5 ml de TFA y los
filtrados se precipitaron en éter etílico enfriado. Los
precipitados se centrifugaron y la capa de éter se decantó. El
residuo se lavó con dos o tres volúmenes de Et_{2}O y se
recentrifugó y el producto lineal crudo se secó al vacío
obteniéndose 180 mg de un sólido de color blancuzco. El péptido
crudo se sometió a la ciclación sin previa purificación.
180 mg de los péptidos lineales crudos se
disolvieron en 220 ml de DMF, se añadieron 500 \mul de
N-metil morfolina para tener un pH aparente de 8,0.
Se añadieron 280 mg de BOP y la ciclación se monitorizó mediante
HPLC. Típicamente la ciclación se completó al cabo de
18-24 horas. Se añadieron 10 ml de agua para
interrumpir la reacción. Se evaporó el DMF al vacío, y la mezcla de
reacción resultante se purificó mediante HPLC.
Este material cíclico crudo se purificó mediante
HPLC preparativa sobre una columna Vydac C18 (2,5 x 20 cm) y se
eluyó con un gradiente lineal de 20-60% B (tampón A:
0,1% de TFA/H_{2}O, tampón B: 0,1% de TFA/CH_{3}CN) en 90
minutos, velocidad de flujo 8 ml/minuto, detección a 280 nm. El pico
principal se cortó mediante análisis HPLC analítica de las
fracciones recogidas, se juntaron y liofilizaron obteniéndose 40 mg
(10%) de un polvo amorfo de color blanco. Este compuesto fue
homogéneo por análisis HPLC. LR-Electrospray
C_{55}H_{74}N_{12}O_{8} calculado: 1031, observado: m/z
(1032 M+H).
Descripción: Se hicieron crecer células
HEK 293 transfectadas bien con el receptor MC-4, ó
bien con el receptor MC-1, en placas de 96
pocillos. Las células fueron estimuladas bien con 100 nM de
NDP-\alphaMSH ó compuestos seleccionados. El AMP
cíclico se extrajo de las células y se determinaron las
concentraciones empleando un ensayo Biotrak-cAMP
SPA. Los agonistas fueron identificados como aquellos compuestos que
causaron un aumento del cAMP.
Cultivo de células: Se cultivaron células
HEK 293 transfectadas bien con el receptor MC-4, o
bien con el receptor MC-1, en frascos de 75
cm^{2} en D-MEM suplementado con 10% de FCS y 500
\mug/ml de G418. Las células se tripsinizaron y se dividieron 1:3
en placas de 96 pocillos, de fondo plano, tratadas con cultivos de
tejidos. Las células se estimularon hasta la confluencia (días 2 -
4).
Respuesta cAMP: Compuestos diluídos en
serie en DMSO 100% se diluyeron de nuevo 1:200 (2,5 \mul de la
dilución del compuesto + 500 \mul del medio) en
D-MEM conteniendo 10% de FBS y 0,1 mM de IBMX. Para
las células sin estimular, se añadieron 2,5 \mul de DMSO a 500
\mul del medio. Para las células estimuladas con
NDP-\alphaMSH, se añadieron 2,5 \mul de 20
\muM NDP-\alphaMSH en DMSO 100%, a 500 \mul
del medio (concentración final 100 nM). La concentración final del
DMSO en todos los pocillos fue del 0,5%.
Nota: Cada muestra se preparó por duplicado en
placas separadas
Medio de cultivo: se eliminó de las
placas de cultivo confluyentes de 96 pocillos, y se reemplazó con
200 \mul de las diluciones anteriores en los pocillos apropiados.
Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. El
medio se eliminó, y las placas se lavaron 1x con 200 \mul por
pocillo, de PBS. El CAMP se extrajo mediante la adición de 60
\mul de etanol 70% (guardado en el refrigerador). Después de un
período de extracción de 30 minutos, se transfirieron 10 \mul del
extracto con etanol, a la placa de ensayo cAMP ó se guardaron las
muestras a -20ºC hasta que se realizó el ensayo cAMP.
Ensayo cAMP: Las muestras extraídas y
todos los reactivos incluidos en el kit se pusieron a temperatura
ambiente. A una Optiplaca de 96 pocillos, se añadieron 10 \mul de
extracto con etano, 40 \mul de tampón de ensayo, 50 \mul de
[125I]cAMP, 50 \mul de antisuero y 50 \mul de perlas SPA.
El volumen total del pocillo después de la adición fueron 200
\mul. Las placas fueron selladas y se incubaron durante
15-20 horas a temperatura ambiente. La unión del
[125I]cAMP a las perlas de SPA se determinó contando cada
placa durante 2 minutos en un Packar TopCount^{TM}.
Nota: Cada placa contenía muestras de controles
de células no estimuladas y células estimuladas con
NDP-\alphaMSH.
Los resultados se muestran en la siguiente tabla
I.
Las soluciones para inyección pueden tener la
siguiente composición:
| Compuesto de fórmula I | 3,0 mg | |
| Gelatina | 150,0 mg | |
| Fenol | 4,7 mg | |
| Agua para soluciones para inyecciones | hasta 1,0 ml |
Claims (48)
1. Un compuesto de fórmula:
en
donde
R^{1} y R^{12} juntamente con X e Y forman
un anillo de fenilo, y X es C e Y es C; ó
R^{1} es hidrógeno,
y
R^{12} es hidrógeno; siendo X e Y cada uno C,
y el enlace entre X e Y, un doble enlace, o bien siendo X e Y cada
uno CH, y el enlace entre X e Y, un enlace simple;
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos
de carbono;
R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono;
n es 0 ó 1; y
Q es
en donde R^{3}, R^{4} y R^{5}
son independientemente entre sí, hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, hidroxilo o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono,
en donde cuando R^{4} no es hidrógeno, R^{3} y R^{5} son
ambos hidrógeno;
y
R^{6} es hidrógeno, alquilo de 1 a 3 átomos de
carbono, alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono, fenoxilo, o halo;
R^{11} y R^{13} son cada uno
independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo de 3 ó 4 átomos de
carbono, cicloalquilo de 5 ó 6 átomos de carbono, ó R^{11} y
R^{13} son ambos fenilo;
R^{7} es O ó NH;
R^{8} es hidrógeno o metilo;
R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{10} es hidrógeno o metilo;
p es 0 ó 1;
m es 0, 1, 2 ó 3; y
Z es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
2. Un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R^{1} y R^{12} juntamente con X e Y forman
un anillo de fenilo y X es C e Y es C, ó
R^{1} es hidrógeno,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
y
R^{12} es hidrógeno; siendo X e Y cada uno C,
y el enlace entre X e Y, un doble enlace, o bien siendo X e Y cada
uno CH, y el enlace entre X e Y, un enlace simple;
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos
de carbono;
R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono;
n es 0 ó 1;
R^{3}, R^{4} y R^{5} son
independientemente entre sí, hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 4
átomos de carbono, hidroxilo o alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono;
en donde cuando R^{4} no es hidrógeno, R^{3} y R^{5} son
ambos hidrógeno;
R^{7} es O ó NH;
R^{8} es hidrógeno o metilo;
R^{9} es
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{10} es hidrógeno o metilo;
p es 0 ó 1;
m es 0, 1, 2 ó 3; y
Z es
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior
y sales farmacéuticamente aceptables de los
mismos.
\newpage
3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde
X e Y son cada uno CH, y el enlace entre X e Y es un simple enlace;
Z es
R^{7} es O;
R^{1} es
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono;
y
R^{10} y R^{12} son ambos hidrógeno.
4. El compuesto de la reivindicación 3,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2}.
5. El compuesto de la reivindicación 2, en donde
Z es
R^{7} es NH;
R^{1} es hidrógeno,
R^{2} es alquilo; y
R^{10} y R^{12} son ambos, hidrógeno; y n y
R^{14} son como se ha definido en la reivindicación 2.
6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde
X e Y son cada uno, CH, y el enlace entre X e Y es un simple
enlace; n es 0; y R^{9} es
7. El compuesto de la reivindicación 6,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2)Nal-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-N-metil(2)Nal-Lys-NH_{2}.
\newpage
8. El compuesto de la reivindicación 5, en donde
Z es
R^{7} es NH; R^{1} es
R^{2} es alquilo; y R^{10} y R^{12} son
ambos, hidrógeno;R^{9} es
y R^{17} es como se ha definido
en la reivindicación
2.
9. El compuesto de la reivindicación 5, en donde
X e Y son cada uno, CH, y el enlace entre X e Y es un simple
enlace; y uno de R^{3}, R^{4} y R^{5} es hidrógeno, halo o
alquilo, y los restantes son hidrógeno.
10. El compuesto de la reivindicación 9,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2,}
penta-ciclo(Glu-Lys)-Glu-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Orn)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Orn-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Dbr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dbr-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2}, ó Ac-ciclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-
NH_{2}.
penta-ciclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2}, ó Ac-ciclo(Asp-Dpr)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-
NH_{2}.
11. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde X e Y son cada uno CH, y el enlace entre X e Y es un simple
enlace; y R^{1} es
uno de R^{3}, R^{4} y R^{5}
es alcoxilo, y los restantes son hidrógeno; y n es
0.
12. El compuesto de la reivindicación 11,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-EtOApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo-(Asp-Lys)-Asp-4-iPrOApc-(D)Phe-Arg-Trp-
Lys-NH_{2}; penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeoApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; ó penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
Lys-NH_{2}; penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeoApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-OHApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; ó penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-ClApc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
13. El compuesto de la reivindicación 8, en
donde cada uno de R^{1}, R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{8} y
R^{10} es hidrógeno; R^{7} es NH;
R^{9} es
p es 0; y R^{17} es como se ha
definido en la reivindicación
2.
14. El compuesto de la reivindicación 13,
ciclo(ácido succínico-Lys)-ácido
succínico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ciclo(ácido maleico-Lys)-ácido
maleico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ciclo(ácido succínico-Dpr)-ácido
succínico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2},
ó ciclo(ácido maleico-Dpr)-ácido
maleico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2.}
15. El compuesto de la reivindicación 2, en
donde R^{1} y R^{12} juntamente con X e Y forman un anillo de
fenilo.
16. El compuesto de la reivindicación 15,
ciclo(ácido ftálico-Lys)-ácido
ftálico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ciclo-(ácido ftálico-Dpr)-ácido
ftálico-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Dpr-NH_{2},
ó
Ac-Nle-ciclo(Cys-Cys)-Cys-Apc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2}.
17. Un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en
donde
R^{1} es hidrógeno,
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, o alquinilo de 2 a 5 átomos
de carbono;
R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono;
n es 0 ó 1;
R^{6} es hidrógeno, alquilo de 1 a 3 carbonos,
alcoxilo de 1 a 3 carbonos, fenoxilo o halo;
R^{7} es O ó NH;
R^{8} es hidrógeno o metilo.
\newpage
R^{9} es
R^{10} es hidrógeno o metilo;
p es 0 ó 1;
m es 0, 1, 2 ó 3; y
Z es
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, y las
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
18. El compuesto de la reivindicación 17, en
donde Z es
R^{7} es NH;
R^{1} es
R^{2} es alquilo;
R^{8} y R^{10} son cada uno, hidrógeno;
y
R^{9} es
y
R^{17} es como se ha definido en la
reivindicación 2.
19. El compuesto de la reivindicación 18, en
donde R^{6} es hidrógeno o alquilo.
20. El compuesto de la reivindicación 19,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-2-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-2-iPrAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-
NH_{2}; penta-ciclo (Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; ó penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
NH_{2}; penta-ciclo (Asp-Lys)-Asp-3-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}; ó penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-MeAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
21. El compuesto de la reivindicación 19, en
donde R^{6} es halo.
22. El compuesto de la reivindicación 21,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-4-ClAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
23. El compuesto de la reivindicación 20, en
donde R^{6} es alcoxilo o fenoxilo.
24. El compuesto de la reivindicación 23, el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-4-PhOAppc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}
ó el
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-3-MeO-Appc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
25. Un compuesto de fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en donde R^{1} es
hidrógeno
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono o alquinilo de 2 a 5 átomos de
carbono;
R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono;
n es 0 ó 1;
R^{11} y R^{13} son cada uno
independientemente entre sí, hidrógeno, alquilo de 3 ó 4 átomos de
carbono, o cicloalquilo de 5 ó 6 átomos de carbono ó R^{11} y
R^{13} son ambos fenilo;
R^{7} es O ó NH;
R^{8} es hidrógeno o metilo;
\newpage
R^{9} es
R^{10} es hidrógeno o metilo;
p es 0 ó 1;
m es 0, 1, 2 ó 3; y
Z es
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, y
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
26. El compuesto de la reivindicación 25, en
donde Z es
R^{7} es NH;
R^{1} es
R^{2} es alquilo;
R^{8} y R^{10} son cada uno, hidrógeno;
y
R^{9} es
y R^{17} es hidrógeno o alquilo
inferior.
27. El compuesto de la reivindicación 26, en
donde uno de R^{11} y R^{13} es alquilo o cicloalquilo y el
otro es hidrógeno.
28. El compuesto de la reivindicación 27,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Achc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2,}
ó penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-Abc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
29. El compuesto de la reivindicación 26, en
donde R^{11} y R^{13} es fenilo y el otro es hidrógeno o
fenilo.
30. El compuesto de la reivindicación 29,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-4-Adpc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
31. Un compuesto de fórmula
en
donde
R^{1} es hidrógeno,
R^{2} es alquilo de 1 a 5 átomos de carbono,
alquenilo de 2 a 5 átomos de carbono, ó alquinilo de 2 a 5 átomos
de carbono;
R^{14} es alquilo de 1 a 5 átomos de
carbono;
n es 0 ó 1;
uno de R^{3}, R^{4}, R^{5} y R^{6} es
hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 3 átomos de carbono, ó alcoxilo de
1 a 3 átomos de carbono, y los restantes son hidrógeno;
R^{7} es O ó NH;
R^{8} es hidrógeno o metilo;
R^{9} es
R^{10} es hidrógeno o metilo;
p es 0 ó 1;
m es 0, 1, 2 ó 3; y
Z es
y
R^{17} es hidrógeno o alquilo inferior, y
sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
32. El compuesto de la reivindicación 31, en
donde Z es
R^{1} es
R^{2} es alquilo;
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{8} y R^{10}
son cada uno, hidrógeno;
R^{6} es hidrógeno, halo, alquilo de 1 a 3
átomos de carbono, ó alcoxilo de 1 a 3 átomos de carbono; y
R^{9} es
y R^{17} es como se ha definido
en la reivindicación
31.
33. El compuesto de la reivindicación 32, en
donde R^{7} es NH.
34. El compuesto de la reivindicación 32, en
donde R^{6} es hidrógeno o alquilo.
35. El compuesto de la reivindicación 34,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-(D,L)-Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-Me-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2};
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-Et-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-iPr-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
36. El compuesto de las reivindicaciones 31 a
33, en donde R^{6} es halo.
37. El compuesto de la reivindicación 36,
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
38. El compuesto de las reivindicaciones 31 a
33, en donde R^{6} es alcoxilo.
39. El compuesto de la reivindicación 38,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-5-MeO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-EtO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-iPrO-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Lys-NH_{2}.
40. El compuesto de las reivindicaciones 31 ó
32, en donde R^{7} es 0 y R^{6} es halo.
41. El compuesto de la reivindicación 40,
penta-ciclo
(Asp-Lys)-Asp-5-BrAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-5-ClAtc-(D)Phe-Cit-Trp-Lys-NH_{2}.
42. El compuesto de la reivindicación 31, en
donde Z es -S-S-;
R^{1} es
\vskip1.000000\baselineskip
R^{3}, R^{4}, R^{5}, R^{8} y R^{10}
son hidrógeno;
R^{6} es hidrógeno o halo;
R^{7} es NH;
R^{9} es
en donde R^{17} es como más
arriba.
43. El compuesto de la reivindicación 44,
Ac-Nle-ciclo(Cys-Cys)-Cys-(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2},
penta-ciclo(Cys-Cys)-Cys-5-Br(D,L)Atc-(D)Phe-Arg-Trp-Cys-NH_{2},
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Ala-Trp-Lys-NH_{2},
ó
penta-ciclo(Asp-Lys)-Asp-Apc-(D)Phe-Arg-(2S,3S)beta
metil-Trp-Lys-NH_{2}.
44. Un procedimiento para la preparación de un
compuesto de fórmula:
en
donde
R^{1} a R^{12}, m, p, Q, X, Y, y Z son como
se ha definido en las reivindicaciones 1 a 43 mediante la formación
de un enlace lactama o un enlace disulfuro en la posición Z de los
péptidos lineales precursores.
45. Una composición farmacéutica que contiene
los compuestos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1-43 y una carga terapéuticamente inerte.
46. Empleo de los compuestos de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 43, para la elaboración de
medicamentos para el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades que
están asociadas con la actividad del receptor de la
melanocortina-4.
47. El uso de la reivindicación 46
caracterizado por el hecho que la enfermedad es obesidad.
48. Compuestos de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 43, para el empleo como substancias
terapéuticamente activas, en particular como substancias
terapéuticamente activas para el tratamiento y/o profilaxis de
enferme-dades que están asociadas con el receptor de
la melanocortina-4.
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