ES2280562T3 - Procedimiento para detectar dna originario de diferentes individuos. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para diferenciar especies de DNA originarias de diferentes individuos, en el que las especies de DNA están presentes en una muestra biológica obtenida de los individuos, procedimiento que comprende la etapa de detectar una diferencia de metilación entre las especies de DNA de los diferentes individuos.
Description
Procedimientos para detectar DNA originario de
diferentes individuos.
La presencia de DNA originario de diferentes
individuos en los fluidos del cuerpo es un fenómeno biológico bien
conocido en muchos escenarios clínicos y biológicos. Por ejemplo,
después de un trasplante de médula ósea, el sistema hemopoiético del
receptor del trasplante estará constituido por proporciones
variables de células del donante y el receptor. La estimación de la
cantidad de células del donante o el receptor se ha realizado por
detección de diferencias genéticas entre el donante y el receptor,
incluidos polimorfismos de género (Mangioni y otros, Bone Marrow
Transplant 20:969-73(1997)) y DNA (Roux y
otros, Blood 79:2775-83 (1992)). El corolario de
este enfoque es que, si la región analizada no presenta una
diferencia genética entre el donante y el receptor, no será posible
el análisis por el enfoque actual.
En otro ejemplo, durante el embarazo, se ha
demostrado anteriormente la detección de DNA fetal en plasma y suero
maternos (Lo y otros, Lancet 350:9072:485-7 (1997)).
Esta tecnología ha demostrado que el DNA fetal aislado de plasma y
suero maternos se puede usar para el diagnóstico prenatal no
invasivo (Lo y otros, N. Eng. J. Med.
339(24):1734-8 (1998); Faas y otros, Lancet
352(9135):1196 (1998); Amicucci y otros, Clin Chem
46(2):301 (2000); Chen y otros, Prenat Diagn
20(4):355-7 (2000); Saito y otros, Lancet
356:1170 (2000)). La aplicación clínica de este fenómeno ha sido
ayudada por las concentraciones absolutas y relativas relativamente
altas de tal DNA fetal circulante en plasma y suero materno (Lo y
otros, Am. J. Hum Genet 62:768-775 (1998)). Usando
este enfoque, se ha conseguido la detección prenatal no invasiva en
diferentes afecciones, incluidas el estado D de rhesus fetal (LO y
otros, New Eng. J. Med 339:1734-1738 (1998)),
distrofia miotónica (Amicucci y otros, Clin Chem
46:301-302 (2000), acondroplasia (Saito y otros,
Lancet 356:1170 (2000)) y ciertas translocaciones cromosómicas
(Chen y otros, Prenat Diag 20:335-357 (2000); Chen y
otros, Clin Chem 47:937-939 (2001)). Todos estos
enfoques actuales han utilizado la detección de las secuencias de
DNA heredadas del padre y que son genéticamente distinguibles de las
de la madre (Bianchi, Am. J. Hum. Genet 62(4):763 (1998)).
Específicamente, se ha creído que es imposible la detección del DNA
que ha heredado el feto de la madre en el plasma o suero. Se han
descrito también limitaciones similares para la detección de células
fetales nucleadas de la fracción celular de sangre materna (Lo y
otros, Ann NY Acad Sci 731:204 (1994)).
Otros investigadores han detectado DNA metilado
aberrantemente de pacientes de cáncer. De esto se ha dado cuenta en
pacientes con una variedad de cánceres, incluidos cáncer de pulmón
(Esteller y otros, Cancer Res 59(1):67 (1999)) y cáncer de
hígado (Wong y otros, Cancer Res 59(1):71 (1999)).
Recientemente se ha prestado un gran interés a
la biología de fenómenos epigenéticos, esto es, procesos que alteran
el fenotipo pero que no están asociados con cambios en la secuencia
de DNA (Wolffe, Science 286:481-486 (199)). Uno de
los procesos epigenéticos mejor caracterizados es la metilación de
DNA (Wolffe y otros, Curr Biol. 10:R463-R465
(1999)). Sería muy valioso un procedimiento para discriminar
especies de DNA originarias de diferentes individuos en fluidos
biológicos usando diferencias epigenéticas más bien que genéticas
entre las especies de DNA. Por ejemplo, la detección epigenética de
DNA fetal en una muestra materna proporcionaría un avance
significativo que permitiría procedimientos adicionales de
exploración y diagnósticos.
En un primer aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para diferenciar especies de DNA originarias
de diferentes individuos en una muestra preferida. En realizaciones
preferentes, los procedimientos de la presente invención se usan
para diferenciar o detectar DNA fetal en una muestra materna o para
diferenciar DNA de un donante de órgano de DNA de un receptor de un
órgano.
Los expertos en la técnica apreciarán que la
muestra biológica obtenida de un individuo se puede tomar de
cualquier muestra de fluido o células, aunque en realizaciones
preferentes, el fluido del cuerpo es suero o plasma. En
realizaciones preferentes, las especies de DNA se diferencian por
observación de diferencias epigenéticas en las especies de DNA,
tales como diferencias en la metilación de DNA. Por ejemplo, en
situaciones en las que una especie de DNA procede de un varón y una
especie de DNA procede de una mujer, el marcador epigenético puede
ser el cromosoma X inactivado de la mujer. En tales realizaciones,
para detectar el DNA originario de la mujer individual se pueden
usar secuencias del cromosoma X inactivado. En algunas
realizaciones, las diferencias epigenéticas se pueden analizar
dentro de las células. Además, en algunas realizaciones, las
diferencias epigenéticas se pueden analizar usando in situ
la reacción en cadena de polimerasa específica a metilación. Además,
en algunas realizaciones, las diferencias epigenéticas se pueden
usar para seleccionar o aislar células de los respectivos
individuos o para purificar DNA de los individuos respectivos. Los
procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden llevarse
a la práctica midiendo o sin medir las concentraciones de las
especies de DNA, aunque, en realizaciones preferentes, se miden las
concentraciones de las especies de DNA con las respectivas
diferencias epigenéticas. Esta medida de concentraciones implica
medir las diferencias de metilación de DNA respectivas en
realizaciones en las que las diferencias de metilación son el
marcador epigenético. En realizaciones especialmente preferentes, a
la muestra biológica o la especie de DNA se añade directamente
bisulfito sódico para detectar las diferencias de metilación de DNA.
Sin embargo, en otras realizaciones, para detectar las diferencias
de metilación de DNA se puede usar una reacción en cadena de
polimerasa específica para metilación como es bien conocido por los
expertos en la técnica. En otras realizaciones, para detectar
diferencias de metilación se puede usar la secuenciación de DNA o la
extensión del cebador.
En un segundo aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para detectar anormalidades en un feto
detectando DNA fetal en una muestra biológica obtenida de una madre.
Los procedimientos de acuerdo con la presente invención
proporcionan la detección de DNA fetal en una muestra de la madre
diferenciando el DNA fetal del DNA materno basándose en marcadores
epigenéticos tales como diferencias en la metilación de DNA.
Empleando tales procedimientos, se puede identificar un DNA fetal
que pronostica una anomalía genética o una enfermedad basada en la
genética, con lo que se proporcionan procedimientos para diagnosis
prenatal. Estos procedimientos son aplicables a cualquiera de las
afecciones asociadas al embarazo para las que se identifican los
cambios de la metilación asociados con un estado de enfermedad.
Entre los ejemplos de enfermedades que se pueden diagnosticar están
incluidos preeclampsia, una aneuploidía cromosómica, incluidas, pero
no únicamente, trisomía 21, síndrome de
Prader-Willi y síndrome de Angelman.
Como con los procedimientos de diferenciación
más extensa del primer aspecto de la invención, preferiblemente, la
muestra biológica obtenida de la madre es plasma o suero. La
diferenciación entre DNA fetal y materno se puede realizar
cuantificando o sin cuantificar la concentración de DNA fetal en el
plasma o suero materno. En realizaciones en las que se cuantifica
el DNA fetal, se puede usar la concentración medida para predecir,
controlar, o diagnosticar o pronosticar un trastorno asociado con el
embarazo. En realizaciones preferentes, la marca epigenética
particular derivada del feto está asociada con un trastorno fetal y,
en algunas realizaciones, como marcador específico del feto en
plasma o suero materno se usa una característica epigenética de las
células fetales en la placenta.
En un tercer aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para diferenciar una especie de DNA originaria
de un donante de órgano de la de un receptor del órgano. Como con
los procedimientos de diferenciación más extensa del primer aspecto
de la invención, preferiblemente, la muestra biológica obtenida es
plasma o suero. La diferenciación entre DNA del donante del órgano
y el receptor del órgano, o potencial donante del órgano y
potencial receptor del órgano, se puede realizar cuantificando o sin
cuantificar la concentración de DNA en la muestra biológica. Esta
realización es particularmente útil en casos en los que el
trasplante es un trasplante de médula ósea. Tales medidas se pueden
usar para predecir el progreso clínico del receptor del trasplante,
en especial en lo referente a rechazo del órgano.
En un cuarto aspecto, la presente invención
ofrece kits para diferenciar especies de DNA originarias de
diferentes individuos en una muestra biológica. Tales kits son
útiles para, por ejemplo, diferenciar o detectar la presencia de
DNA fetal en una muestra de material biológico o para diferenciar
DNA de un donante de un órgano, o un potencial donante de un
órgano, del DNA de un receptor de un órgano o potencial receptor de
un órgano. Los kits de acuerdo con la presente invención comprenden
uno o más reactivos para estimar el estado de metilación del DNA
materno, tales como bisulfito sódico, y uno o más reactivos para
detectar la presencia de DNA, tales como un gel. Adicionalmente,
tales kits pueden incluir uno o varios reactivos para amplificar la
cantidad de DNA presente en la muestra, tales como un reactivo o
varios reactivos para realizar la amplificación por reacción en
cadena de la polimerasa. Tales reactivos son bien conocidos por los
expertos en la técnica. Además, los kits pueden incluir uno o más
aparatos para obtener una muestra de DNA materno. Tales aparatos son
bien conocidos por los expertos en la técnica. En particular, los
kits de acuerdo con la invención se pueden usar para diagnosticar
una enfermedad causada totalmente o en parte por una anomalía
genética tal como una mutación, sustitución o supresión total o
parcial de una secuencia de DNA presente en un feto. Entre los
ejemplos de enfermedad que se pueden diagnosticar están incluidas
preeclampsia, una aneuploidía cromosómica, incluidos, pero no
únicamente, trisomía 21, síndrome de Prader-Willi y
síndrome de Angelman.
La Figura 1 presenta los resultados de un ensayo
que detecta secuencias de DNA metilado y no metilado del gen de
receptor andrógeno. En total se reclutaron 6 varones sanos y 5
mujeres sanas. De todos los sujetos de control masculinos sólo se
detectó en estas muestras el gen receptor andrógeno no metilado,
como era de esperar (Fig. 1A). A diferencia, en los sujetos de
control femeninos se observaron secuencias de DNA del gen receptor
andrógeno tanto no metilado como metilado (Fig. 1A). Los grados de
detección de genes de receptor andrógenos metilado y no metilado en
estos sujetos femeninos fueron 100% y 82%, respectivamente. Cuando
en el ensayo se omitieron muestras de DNA, no se observó señal
positiva (Fig. 1A). Es interesante que en todos los receptores de
trasplante de médula ósea con donantes femeninos se observaron
señales positivas para secuencias de DNA metilado y no metilado, lo
que indica que en la sangre en circulación de receptores varones
existen células de donante femenino.
La Fig. 2 proporciona una representación
esquemática de la región metilada diferencialmente (DMR) de la
región IGF2-H19 humana. Se muestran las dos
unidades de 450-bp repetidas (A1 y A2) y siete de
400-bp repetidas (B1-B7). Los
sitios potenciales de metilación del DNA de la cadena superior de la
región estudiada se representan por círculos abiertos. El sitio de
polimorfismo de nucleótido individual (SNP) (A/G) se indica con una
caja abierta. Las flechas abiertas representan la posición de los
cebadores de avance (for) e inverso (rev) en reacciones PCR
específicas para alelos metilados (M) y no metilados (U),
respectivamente. Se presentan las secuencias de estos cebadores
MSP. Las diferencias de secuencia entre DNA tratado con bisulfito y
DNA no tratado se destacan en cursivas en negrita y las diferencias
entre DNA metilado (heredado del padre) y no metilado (heredado de
la madre) se subrayan en negritas.
\newpage
La Figura 3 representa la detección de DNA
metilado (paterno) en el tercer trimestre (A) y plasma materno en
el segundo trimestre (B). Se representan la secuencia de DNA de
alelos metilados en muestras de revestimiento anteado materno
(panel 1), revestimiento anteado o fluido amniótico (panel 2),
plasma materno prenatal (panel 3) y plasma materno posnatal (panel
4). La presencia de DNA fetal metilado en la muestra de plasma
materno prenatal se indica con *. El sitio polimórfico se indica en
letras rojas.
La Fig. 4 representa la detección de DNA fetal
no metilado (heredado de la madre) en plasma materno. (a) Se
detectaron secuencias de DNA no metilado en revestimiento antelado
materno (panel 1) y una muestra materna del tercer trimestre (panel
2) usando secuenciación directa. La presencia de DNA fetal no
metilado en la muestra de plasma materno prenatal se indica con *.
(b) Se detectó DNA fetal no metilado (flecha) en dos muestras de
plasma materno del tercer trimestre usando el ensayo de extensión de
cebador. (c) Se detectó DNA fetal no metilado (flecha) en una
muestra de plasma materna del segundo trimestre usando el ensayo de
extensión de cebador. Se muestran productos de las reacciones de
control que contenían sólo cebador, alelo G no metilado o alelo A
no metilado. Los tamaños (nt) de los productos de reacción se
presentan en la base. \bullet cebador no usado; \Box alelo
detectado.
En un primer aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para diferenciar especies de DNA originarias
de diferentes individuos en una muestra biológica. En realizaciones
preferentes, los procedimientos de la presente invención se usan
para diferenciar o detectar DNA fetal en una muestra materna o para
diferenciar DNA de un donante de un órgano del DNA de un receptor
de un órgano.
Los expertos en la técnica apreciarán que la
muestra biológica de un individuo se puede tomar de una muestra
cualquiera de un fluido o células, aunque en realizaciones
preferentes, el fluido corporal es plasma o suero. En realizaciones
preferentes, las especies de DNA se diferencian por observación de
diferencias epigenéticas en las especies de DNA, tales como
diferencias de metilación. Por ejemplo, en situaciones en las que
una especie de DNA viene de un varón y una especie de DNA viene de
una mujer, el marcador epigenético puede ser el cromosoma X
inactivado de la mujer. En tales realizaciones, para detectar el DNA
originario de la mujer se pueden usar secuencias de DNA metilado en
el cromosoma X inactivado. En algunas realizaciones, se pueden
analizar diferencias epigenéticas dentro de las células. Además, en
algunas realizaciones, las diferencias epigenéticas se pueden
analizar usando reacción en cadena de polimerasa específica para la
metilación in situ. Adicionalmente, las diferencias
epigenéticas se pueden usar para escoger o aislar células de los
respectivos individuos o para purificar DNA de los respectivos
individuos. Los procedimientos de acuerdo con la presente invención
se pueden practicar midiendo o sin medir las concentraciones de las
especies de DNA, aunque en realizaciones preferentes se miden las
concentraciones de las especies de DNA con las respectivas
diferencias epigenéticas. Esta medida de las concentraciones
implica medir las respectivas diferencias de metilación del DNA en
realizaciones en las que las diferencias de metilación del DNA son
el marcador epigenético. En realizaciones especialmente
preferentes, a la muestra biológica o la especie de DNA se añade
directamente bisulfito sódico para detectar diferencias de la
metilación de DNA. En otras realizaciones, sin embargo, para
detectar diferencias de metilación se puede usar una reacción en
cadena de polimerasa específica para metilación, que es bien
conocida por los expertos en la técnica. En otras realizaciones
más, para detectar diferencias de metilación se puede usar la
secuenciación de DNA o la extensión de cebador.
Tal como en esta memoria, el término "muestra
biológica" abarca cualquier muestra de flujo o celular, o mezcla
de ellos, obtenida de un organismo vivo. Específicamente, el término
incluye muestras de biopsias de tejidos, suero, plasma o fluido
amniótico.
Tal como se usa en esta memoria, el término
"diferencia epigenética" abarca cualquier diferencia molecular
o estructural que no sea la secuencia primaria de nucleótido. Por
ejemplo, esto puede incluir diferencias en metilación.
Tal como se usa en esta memoria, el término
"DNA" abarca cualquier secuencia de más de un nucleótido, tal
como secuencias de polinucleótidos, fragmentos de gen y genes
completos. Tal como se usa en esta memoria, el término "PCR
específica para metilación" se usa para describir un
procedimiento en el que el DNA se trata con bisulfito sódico y
luego se somete a amplificación por PCR. Esta técnica está basada en
el principio de que el tratamiento con bisulfito da por resultado
la conversión de restos de citosina no metilada en uracilo. Los
restos de citosina no metilada, por otra parte, permanecen intactos.
Así, las secuencias de DNA de regiones genómicas metiladas y no
metiladas que siguen a la conversión con bisulfito son diferentes y
distinguibles por cebadores de PCR específicos para las
secuencias.
La presente invención utiliza el fenómeno de
impresión genómica para eludir las limitaciones de la técnica
anterior. En la impresión genómica, las secuencias de DNA se
modifican bioquímicamente sin alterar la secuencia de DNA. Si este
proceso da por resultado la modificación diferencial del DNA fetal y
el materno, esta diferencia se puede aprovechar para la
discriminación del DNA fetal y el materno en plasma y suero materno.
Este fenómeno se puede usar también para la discriminación de
células fetales de células maternas en la fracción celular de
sangre materna. Además, este principio se puede usar también para
detectar células maternas o DNA que ha entrado en el cuerpo del
feto (Lo y otros, Bood 88(11: 4390-5 (1996);
Lo y otros, Clin. Chem. 46(9):1301-9 (2000);
Maloney y otros, J. Clin Invest. 104(1):41-7
(1999)). Este fenómeno se puede usar también en muchos otros
escenarios en los que se encuentra que están presentes células o
secuencias de DNA dentro del cuerpo de un individuo, como es el
caso después de un trasplante de médula ósea (Lo y otros, Br J
Haematol 89(3):645-9 (1995)) o trasplante de
un órgano sólido (Starzl y otros, Curr Opin Nephrol Hypertens
6(3):292-8 (1197); Lo y otros, Lancet
351(9112):1329-30 (1998); Zhang, Clin Chem
45(10):1741-6 (1999)).
La presente invención permite el desarrollo de
un marcador para DNA fetal en plasma/suero materno independiente
del género e independiente del polimorfismo. Para desarrollar un
marcador fetal independiente del género e independiente del
polimorfismo se pueden usar secuencias de DNA que son metiladas
preferente y específicamente en los trofoblastos (Ohgane y otros,
Dev Genet. 22(2):132:40 (1998)). Este elude la limitación
actual que sólo puede detectar fácilmente la presencia de DNA de un
feto masculino en el plasma/suero de la madre (usando como diana el
cromosoma Y) (Lo y otros, Am. J Hum Genet, 62(4):768 (1998)).
Proporciona procedimientos de detección separados de los basados en
diferencias de secuencias en DNA fetal y materno para hacer tal
distinción (Tang y otros, Clin Chem
45(11):2033-5 (1999); Pertl y otros, Hum
Genet 106:45-49 (2000)).
El desarrollo de procedimientos moleculares de
detección tales como PCR ha proporcionado herramientas poderosas
para controlar el quimerismo que sigue al trasplante de médula ósea
(BMT). Uno de los ensayos basados en PCR más ampliamente utilizados
para la detección del quimerismo después de BMT en casos de
desajuste de sexo es la PCR para secuencias en el cromosoma Y (Lo y
otros, Br J Haematol 89:645-9 (1995)). La limitación
de esta estrategia es que sólo se puede usar en los casos en que el
donante es un varón y el receptor es una mujer. La presente
invención proporciona un sistema que se puede aplicar a situaciones
en las que el donante es una mujer y el receptor es un hombre. El
hecho de que el fenómeno de la lionización sólo se da en hembras se
puede explotar para desarrollar un marcador específico para la
mujer. En este fenómeno, uno de los dos cromosomas X de una mujer
se inactiva al azar, habiendo metilación de genes inactivados. Esto
permite por tanto un ensayo para detectar DNA de mujer en un exceso
de DNA de hombre y que se puede aplicar a BMT con donantes mujer y
receptores hombre.
En un segundo aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para detectar anomalías en un feto detectando
DNA fetal en una muestra biológica obtenida de una madre. Los
procedimientos de acuerdo con la presente invención permiten
detectar DNA fetal en una muestra materna diferenciando el DNA fetal
del DNA materno basándose en marcadores epigenéticos tales como
diferencias en la metilación de DNA. Empleando tales procedimientos,
se puede identificar DNA fetal que pronostica una anomalía o una
enfermedad, lo que proporciona procedimientos para el diagnóstico
prenatal. Estos procedimientos son aplicables a cualquiera de y a
todas las afecciones para las que se identifican cambios asociados
a un estado de enfermedad. Son ejemplos de enfermedades que se
pueden identificar, preeclampsia, aneuploidía cromosómica, incluida,
aunque no únicamente, trisomia 21, el síndrome de
Prader-Willi y el síndrome de Angelman.
Como los procedimientos de amplia diferenciación
del primer aspecto de la invención, la muestra biológica obtenida
de la madre preferiblemente es plasma o suero. La diferenciación
entre DNA fetal y DNA materno se puede realizar cuantificando o sin
cuantificar la concentración de DNA fetal en el plasma o suero
materno. En realizaciones en las que se cuantifica DNA fetal, se
puede usar la concentración medida para predecir, controlar o
diagnosticar un trastorno asociado con el embarazo. En realizaciones
preferentes, la marca epigenética particular derivada del feto se
asocia con un trastorno fetal y, en algunas realizaciones, una
característica epigenética fetal en células fetales de la placenta
se usa como marcador específico del feto en plasma o suero
materno.
La presente invención utiliza secuencias de DNA
fetal metilado diferencialmente, que no es necesario que sean
distinguibles en cuanto a la secuencia de DNA del DNA materno, como
marcadores para diagnóstico prenatal no invasivo. Este nuevo
enfoque puede convertir pares feto-madre que no son
informativos en el enfoque convencional, en informativos para
diagnóstico prenatal. Así, la presente invención proporciona una
plataforma sobre la cual se puede construir una nueva generación de
ensayos prenatales no invasivos.
Los procedimientos de la presente invención
están basados en la detección de DNA metilado diferencialmente de
origen fetal del plasma o suero de mujeres embarazadas. Las
secuencias de DNA metilado diferencialmente, que pueden contener
polimorfismo de un nucleótido individual, se detectan
preferiblemente por reacción en cadena de polimerasa (PCR)
específica para metilación; pero, en principio, se puede usar
cualquier procedimiento de detección para metilar DNA
diferencialmente. Este enfoque permite el uso de marcadores
convencionales que no informan sobre DNA para diagnósticos
prenatales.
La presente invención permite detectar o
predecir la presencia de cualesquier trastornos del feto o de la
madre que están asociados con un cambio en el estado de metilación
de una secuencia de DNA. Entre los ejemplos están incluidos
trastornos tales como el síndrome de Prader-Wili
(Kubota y otros, Nat. Genet 16(1):16-7
(1997)). La presente invención proporciona un nuevo tipo de ensayo
para la preeclampsia que ha sido sugerido que es un trastorno de
impresión (Graves, Reprod Fértil Dev
10(1):23-9 (1998)). La presente invención
proporciona además un nuevo tipo de ensayo para aneuploidias
cromosómicas, incluido el síndrome de Down (trisomía 21), que se
puede asociar con cambios de metilación (Yu y otros, Proc Natl Acad
Sci USA 94(13).6862-7 (1997)).
La presente invención ofrece diferencias de
metilación de DNA entre la madre y el feto superando así las
limitaciones de la técnica anterior en la detección de DNA fetal en
plasma materno.
En un tercer aspecto, la presente invención
ofrece procedimientos para diferenciar la especie de DNA originaria
de un donante de un órgano y la de un receptor de un órgano. Como
con los procedimientos de amplia diferenciación del primer aspecto
de la invención, preferiblemente, la muestra biológica se obtiene de
plasma o suero. La diferenciación entre el DNA del órgano del
donante y el del receptor del órgano, o del potencial donante y del
potencial receptor, puede realizarse cuantificando o sin cuantificar
la concentración de DNA en la muestra biológica. Esta realización
es particularmente útil en casos de trasplante de médula ósea. Se
pueden usar tales medidas para predecir el progreso clínico del
receptor del trasplante, en especial en cuanto al rechazo del
órgano aplicado.
En un cuarto aspecto, la presente invención
ofrece kits para diferencias especies de DNA originarias de
diferentes individuos en una muestra biológica. Tales kits son
útiles, por ejemplo, para diferenciar o detectar la presencia de
DNA fetal en una muestra biológica materna, o para diferenciar DNA
de un donante, o potencial donante de un órgano, del de un receptor
o potencial receptor de un órgano. Los kits de acuerdo con la
invención comprenden un reactivo o varios reactivos para comprobar
el estado de metilación del DNA materno, tales como bisulfito
sódico, y un reactivo o varios para detectar la presencia de DNA,
tales como un gel. Adicionalmente, tales kits pueden incluir un
reactivo o varios para amplificar la cantidad de DNA presente en la
muestra, tales como un reactivo o varios para realizar la
amplificación por reacción en cadena de polimerasa. Tales reactivos
son bien conocidos por los expertos en la técnica. Además, tales
kits pueden incluir un aparato o varios para obtener una muestra de
DNA materno. Tales aparatos son bien conocidos por los expertos en
la técnica. En particular, los kits de acuerdo con la invención se
pueden usar para diagnosticar una enfermedad causada total o
parcialmente por una anomalía genética tal como una mutación,
sustitución o supresión o duplicación en la totalidad o en parte de
una secuencia de DNA presente en un feto. Entre los ejemplos de
enfermedades que se pueden diagnosticar están incluidas, aunque no
únicamente, preeclampsia, una aneuploidía cromosómica, en la que
está incluida trisotomía 21, síndrome de
Prader-Willi y síndrome de Angelman y otros.
Ejemplo
1
En este estudio se reclutaron cuatro hombres
receptores de trasplante de médula, que recibieron el trasplante de
donantes femeninas, y 17 sujetos de salud normal. Se cosechó
revestimiento antelado (BC) de todas las muestras de
sangre-EDTA reclutadas y se almacenaron a -20ºC como
se ha descrito (Lo y otros, Am J. Hum Genet
62:768-75 (1998)).
Se extrajo DNA del BC usando un kit de
extracción de DNA Nucleon (Scotlabs) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
La modificación de muestras de DNA con bisulfito
se realizó usando un kit de modificación de DNA CpGenome (Intergen)
conforme a las instrucciones del fabricante. Con la conversión con
bisulfito, los restos no metilados de citosina se convierten en
uracilo mientras que los restos no metilados de uracina permanecen
sin cambiar (Herman y otros, Proc Natl Acad Sci USA
93:9821-6 (1996)). La diferencia de secuencias entre
DNA metilado y no metilado después de la conversión se distingue
usando diferentes cebadores de PCR. Se usó 1 \mug de BC DNA en
una reacción de conversión con bisulfito.
Se modificaron los ensayos de MSP del protocolo
según lo describen Herman y otros, véase supra. Se diseñaron
los cebadores M para
(5'-GCGAGCGTAGTATTTTTCGGC-3') y
M-rev
(5'-AACCAAATAACCTATAAAACCTC
TACG-3') para la secuencia metilada, mientras que los cebadores U-for (5-GTTGTGAGTGTAGTATTTTTTGGT-3') y U-rev (5'-CAAATAACCTATAAAACCTCTACA-3') se diseñaron para la secuencia no metilada. Se añadieron 5 \mul de DNA tratado con bisulfito a 50 \mul de mezcla de reacción de PCR que contenía 5 \mul de tampón 10x TaqMan A (PE Applied Biosystemes), MgCl_{2} 2 mM, 10 pmol de dNTPs, 20 pmol de cada uno de los correspondientes cebadores de MSP y 1,5 U de polimerqasa de DNA AmpliTaq2 Gold (PE Applied Biosystems). Las mezclas de reacción fueron sometidas a 45 ciclos térmicos (alelo metilado: 95ºC durante 45 s, 58ºC durante 30 s, 72ºC durante 20 s; alelo no metilado: 95ºC durante 45s, 50ºC durante 30 s, 72ºC durante 20 s), con una etapa inicial de desnaturalización de 8 min a 95ºC. Los productoras de PCR es analizaron luego por electroforesis en gel de agarosa.
TACG-3') para la secuencia metilada, mientras que los cebadores U-for (5-GTTGTGAGTGTAGTATTTTTTGGT-3') y U-rev (5'-CAAATAACCTATAAAACCTCTACA-3') se diseñaron para la secuencia no metilada. Se añadieron 5 \mul de DNA tratado con bisulfito a 50 \mul de mezcla de reacción de PCR que contenía 5 \mul de tampón 10x TaqMan A (PE Applied Biosystemes), MgCl_{2} 2 mM, 10 pmol de dNTPs, 20 pmol de cada uno de los correspondientes cebadores de MSP y 1,5 U de polimerqasa de DNA AmpliTaq2 Gold (PE Applied Biosystems). Las mezclas de reacción fueron sometidas a 45 ciclos térmicos (alelo metilado: 95ºC durante 45 s, 58ºC durante 30 s, 72ºC durante 20 s; alelo no metilado: 95ºC durante 45s, 50ºC durante 30 s, 72ºC durante 20 s), con una etapa inicial de desnaturalización de 8 min a 95ºC. Los productoras de PCR es analizaron luego por electroforesis en gel de agarosa.
Este experimento proporciona un ensayo de MSP
para detectar secuencias de DNA metiladas y no metiladas del gen
receptor andrógeno. En total se reclutaron 6 sujetos masculinos y 11
femeninos. De todos los sujetos de control masculinos, sólo se
detectó en estas muestras el gen de receptor andrógeno metilado como
era de esperar (Fig. 1A). A diferencia, en sujetos de control
femeninos se observaron secuencias de DNA de gen receptor de
andrógeno tanto no metiladas y como metiladas (Fig. 1). Los grados
de detección de genes de receptor de andrógeno metilados y no
metilados fueron de 100% y 82% respectivamente. Cuando en el ensayo
de MSP se omitieron muestras de DNA, no se observó señal positiva
(Fig. 1A). Es interesante que se observaron señales positivas para
secuencias de DNA metiladas y no metiladas en todos los receptores
masculinos receptores de trasplantes de médula ósea de sexo mal
emparejado (100%), lo que indica que existían células de donante
femenino en la sangre en circulación de receptores masculinos.
Estos resultados demuestran por vez primera que
se pueden usar genes metilados en el cromosoma X inactivado de
individuos femeninos como marcador específico en investigación del
quimerismo. Este ensayo también es aplicable al estudio de otros
tipos de quimerismo postrasplante que implican mezcla de células
masculinas y femenina o DNA. Entre los ejemplos están incluidos el
quimerismo celular después de trasplante de un órgano sólido
(Starzl y otros, Curr Opin Nephrol Hypertens 6:292-8
(1997)), quimerismo de DNA de plasma postrasplante (Lo y otros,
Lancet 351:1329-30 (1998)) y quimerismo urinario de
DNA (Zhang y otros, Clin Chem 45:1741.-6 (1995)). Además,
recientemente hay también mucho interés en el paso de células de DNA
de la madre al feto durante el embarazo (Lo y otros, Blood
88:4390-5, (1996); Maloney y otros, J Clin Invest
104:41-7 (1999); Lo y otros, Clin Chem
46:1301-9 (2000)). Los marcadores epigenéticos
desarrollados también son de uso en el quimerismo del origen
materno de vástagos masculinos.
El ensayo actual se puede desarrollar en formato
cuantitativo usando, por ejemplo, tecnología de PCR a tiempo real
(Lo y otros, Cancer Res 59:3899-903 (1999)). Tal
desarrollo permitiría controlar los niveles de quimerismo en una
persona particular. Clínicamente, tal ensayo puede tener un papel en
el control de la aceptación de un injerto en BMT. En el caso de
quimerismo de DNA urinario de plasma, tal ensayo se podría usar
también para controlar el rechazo del injerto.
Ejemplo
2
El presente experimento demuestra que usando una
región metilada diferencialmente del locus humano
IGF2-H19 como marcador epigenético en plasma
materno, es posible la detección de un alelo que el feto ha heredado
de la madre. Estos resultados extienden ampliamente las
posibilidades de diagnóstico natal de DNA fetal en plasma materno,
permitiendo el desarrollo de un marcador fetal específico
independiente del género y el polimorfismo y nuevas estrategias
para el diagnóstico prenatal de imprimir trastornos y ciertas
aneuploidías cromosómicas.
Se tomaron muestras de mujeres embarazadas con
consentimiento informado. En total se reclutaron para este estudio
21 mujeres en el segundo trimestre (17-21 semanas)
de gestación y 18 mujeres en el tercer trimestre
(37-42 semanas) de gestación. Ninguna de las mujeres
reclutadas tenía preeclampsia ni manifestaciones prematuras en el
embarazo en curso. De los casos del segundo trimestre de embarazo se
recogieron muestras de sangre materna-EDTA y de
fluido aminótico fetal como se ha descrito previamente (Lo y otros,
Am J Hum Genet 62:768-775 (1998)). En los casos de
tercera semana de embarazo, se recogieron muestras de sangre materna
EDTA 2 o 3 horas antes de suministro vaginal normal. También se
recogieron inmediatamente antes del suministro muestras de sangre
del cordón fetal como se ha descrito (Lo y otros, Clin Chem
46:1903-1906 (2000)). Se cosecharon plasma y
revestimiento antelado de todas las muestras de sangre tomadas y se
almacenaron a –20ºC como se ha descrito (Lo y otros, Am J Hum Gente
62:768-775 (1998)), excepto que las muestras de
plasma se recentrifugaron a 16.000 g. Las muestras de fluido
amniótico se almacenaron a 4ºC.
Se extrajo DNA de muestras de plasma y fluido
amniótico usando un kit QIAmp Blood (Qiagen). Típicamente, para la
extracción de DNA se usaron 800 \mul de plasma o fluido amniótico
por columna. Se usó un volumen de elución de 50-110
\mul. Se extrajo DNA del revestimiento antelado usando un kit
Nucleon DNA Extraction (Scotlabs) de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante.
La DMR en el locus humano
IGF2-H19 contiene dos unidades repetidas de 450 bp y
siete repetidas de 400 bp (Nakagawa y otros, Proc Natl Acad Sci USA
98:591-596 (2001)) (Fig 2). En la investigación se
selecciono como marcador un SNP A/G dentro de la DMR (Nakagawa y
otros, supra) (Fig. 2). Se usó reacción en cadena de
polimerasa (PCR) para amplificar SNP tanto en la muestra de DNA
materno como en la fetal. Los cebadores se diseñaron usando la
secuencia del gen H19 de Homo sapiens (nº de acceso a Genbank
AF125183). Típicamente, se añadieron 2-5 \mul de
DNA eluido, purificado de revestimiento antelado materno,
revestimiento antelado del cordón o fluido aminiótico a una mezcla
de reacción de PCR que contenía 2,5 \mul de tampón 10x TaqMan A
(PE Applied Biosystems), MgCl_{2} 3 mM, 6,26 pmol de dNTPs, 5 pmol
de cebadores (de avance:
5'-ggACGGAATTGGTTGTAGTT-3'; inverso:
5'-A-GGCAATTGTCAGTTCAGTAA-3')
y 5 U de AmpliTaq Gold DNA polimerasa (PE Applied Biosystems) (95ºC
durante 8 min seguido de 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 56ºC
durante 20 s, 72ºC durante 20 s). Para el cebador de avance, los
nucleótidos de la caja superior correspondían a las posiciones 7927
a 7944 para la secuencia H19 (nº. de acceso del Genbank AF125183).
Para el cebador inverso, los nucleótidos eran complementarios a las
posiciones 8309 a 8329 de la secuencia de H19. Los productos de PCR
se analizaron luego por electroforesis en gel de agarosa y
secuenciación de DNA.
La modificación con bisulfito de muestras de DNA
se realizó usando un kit CpGenome DNA Modification (Intergen) según
las instrucciones del fabricante. Con la conversión con bisulfito,
los restos de citosina no metilados se convertirían en uracilo,
mientras que los restos de citosina metilados permanecerían
inalterados (Herman y otros, Proc Natl Acad Sci USA
93:9821-9826 (1996)). La diferencia de secuencia
entre DNA metilado y no metilado después de la conversión con
bisulfito podría distinguirse luego usan diferentes cebadores de
PCR. Por lo general, en una reacción de conversión con bisulfito se
usó 1 \mug de DNA de revestimiento antelado de sangre materna o
de cordón, o 93 \mul de DNA purificado de plasma materno o fluido
aminiótico. El DNA tratado con bisulfito se eluyó luego en
25-50 \mul de Tris-EDTA 1
\mu.
Los ensayos de MSP se modificaron respecto al
protocolo como se ha descrito (Herman y otros, 1996). Se añadieron
5 \mul de DNA tratado con bisulfito a una mezcla de 50 \mul de
reacción de PCR que contenía 5 \mul de tampón 10x TaqMan A (PE
Applied Biosystems), MgCl_{2} 2,5 mM, 10 pmol de dNTPs, 20 pmol de
cada uno de los correspondientes cebadores MSP (Fig. 2) y 1,25 U de
AmpliTaq Gold DNA polimerasa (PE Applied Biosystems). Los cebadores
M-for y M-rev (Fig. 2) se diseñaron
para la secuencia no metilada. Las mezclas de reacción se
sometieron a ciclos térmicos (alelo metilado: 95ºC durante 45 s,
55ºC durante 20 s, 72ºC durante 20 s; alelo no metilado: 95ºC
durante 45s, 49ºC durante 20 s, 72ºC durante 20 s) para 50 ciclos
(DNA de revestimiento antelado y líquido amniótico) o 56 ciclos
(DNA de plasma), con una etapa inicial de desnaturalización durante
8 min a 95ºC. Los productos de PCR es analizaron luego por
electroforesis en gel de agarosa. Los productos de reacción se
purificaron usando columnas Microspin S-300 HR
(Amersham Pharmacia) para secuenciación de DNA o ensayo de
extensión de cebador.
Se secuenciaron productos de PCR purificados
usando un kit ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction (PE Applied Biosystems) y los correspondientes
cebadores de los productos de PCR. Los productos de secuenciación
se analizaron usando un analizador genético ABI Prism 310 (PE
Applied Biosystems).
Se añadieron 2 \mul del producto de MSP
purificado a 25 \mul de una mezcla de reacción que contenía ddATP
50 \muM (2',3'-trifosfato de didesoxiadenina),
dGTP 50 \muM, dTTP 50 \muM, 0,2 pmol de cebador
Cys-5- marcado
(5'-GGGTTATTTGGGAATAGGATATTTA-3'), 4
U de Termo Sequenasa (Amersham Pharmacia) y 1,43 \mul de tampón
concentrado. Las mezclas de reacción se sometieron a ciclos térmicos
durante 40 ciclos (95ºC durante 30 s, 51ºC durante 20 s, 72ºC
durante 20 s). El cebador marcado Cys-5 tenía una
longitud de 25 nucleótidos (nt) y el sitio polimórfico estaba 2 nt
distante del extremo 3' del cebador. Para el alelo A, la
incorporación del ddATP en este sitio polimórfico producirá la
terminación de la cadena, lo que daría por resultado un producto de
extensión de 27 nt (esto es, 25+2 nt). Para el alelo G, la
continuación de la cadena seguiría hasta el siguiente resto A que
estaba 5 nt distante del extremo 3' del cebador, lo que daría por
resultado un producto de extensión de 30 nt (esto es, 25+5 nt). Los
productos de reacción se sometieron a electroforación usando gel de
poliacrilamida desnaturalizante al 14% y se analizaron usando un
secuenciador ALF Express (Amersham Pharmacia). Los datos se
analizaron por el programa AlleleLinks (Amersham Pharmacia).
Se reclutaron para este estudio 39 mujeres
embarazadas. El genotipo materno en SNP dentro de la DMR (Fig. 2) se
determinó por secuenciación directa de productos de PCR del DNA del
revestimiento antelado. El número de mujeres embarazadas con cada
uno de los posibles genotipos era de 17 (GG, 43,6%), 16 (AG, 41,0%)
y 6 (AA, 15,4%).
Se seleccionaron para más examen las 16 mujeres
que eran heterozigóticas (esto es, AG) para el SNP. Puesto que éste
es un polimorfismo bialélico, estas mujeres no serían consideradas
informativas en este punto para la detección de DNA fetal en plasma
materno según criterios previos (Lo y otros, Ann N Y Acad Sci
731:204-213 (1994); Bianchi Am J Hum Genet
62:763-764 (1998)). Para demostrar que la metilación
diferencial en esta región genómica permitiría eludir esta
limitación, se trató con bisulfito DNA materno y se amplificó por
MSP usando los cebadores presentados en la Fig. 2. Análogamente,
DNA fetal aislado de fluido amniótico (muestras del 2º trimestre) o
revestimiento antelado de sangre del cordón (muestras del 3^{er}
trimestre) se sometieron a PCR y MSP para determinar el estado de
impresión de los alelos fetales.
Entre los 16 casos seleccionados, los alelos
metilados (esto es, heredados del padre) de cuatro muestras fetales
del 3^{er} trimestre y siete del 2º trimestre eran diferentes de
los alelos metilados de las respectivas madres (Fig. 3a, b;
compárense los paneles 1 y 2). Para ensayar si esta metilación
diferencial entre el feto y la madre permitiría detectar los alelos
fetales del plasma materno, DNA de plasma materno de estos casos se
sometió a conversión con bisulfito y seguidamente a MSP. Fue
interesante que los alelos fetales metilados heredados del padre
pudieron detectarse en dos muestras de plasma materno del 3^{er}
trimestre y en 4 del 2º trimestre (Fig 3a,b; paneles 3). Para
excluir la posibilidad de que estas observaciones fueran debidas
simplemente a existencia de DNA materno metilado aberrantemente en
plasma materno, se recogió una muestra de plasma materno posnatal
(\approx3,5 años después del suministro) de uno de los casos
positivos para examen adicional. No se observó el alelo metilado
adicional en esta muestra posnatal (Fig, 3a, panel 4), lo que
indicaba que el alelo metilado adicional de la muestra materna
durante el embarazo era de origen fetal. Además, no se observó
señal positiva alguna en los plasmas de casos no informativos (n=4,
datos no representados), lo que a su vez demostraba la especifidad
de este ensayo de MSP. En conjunto, estos datos indican que el uso
de la metilación diferencial entre la madre y el feto permite
detectar DNA fetal en plasma materno, incluso en los casos en que
no se consideran informativos de conformidad con criterios
existentes.
Se ensayó luego si el uso de la metilación
diferencial entre madre y feto permitiría detectar un alelo que el
feto hubiera heredado de la madre. Anteriormente se había creído que
este tipo de análisis era imposible (Lo y otros, Ann N Y Acad Sci
731:204-213 (1994); Bianchi, Am J Hum Genet
62:763-764 (1998)). Como el alelo heredado de la
madre era no metilado, se usaron los cebadores U-for
y U-rev (Fig. 2) para amplificar los alelos no
metilados por conversión con bisulfito. Entre los 16 casos
analizados, tres muestras del 3^{er} trimestre y cinco del 2º
trimestre eran informativas. En estos casos, el feto poseía un alelo
no metilado que era diferente del alelo no metilado de la madre.
Los resultados implicaban que, en estos casos, la madre tenía un
alelo originario de su padre que luego pasó al feto. De estos ocho
casos informativos, sólo se observó una señal débil en una de las
muestras del 3^{er} trimestre en secuenciación directa (Fig. 4a,
compárense paneles 1 y 2).
Los autores de la invención pensaron que esta
débil señal en este único caso positivo y el bajo grado de detección
del alelo fetal no metilado de plasma materno podían deberse a la
baja sensibilidad del procedimiento de secuenciación directa. Para
aumentar la sensibilidad de detección, se empleó un ensayo más
sensible de detección de cebador con el fin de detectar el alelo no
metilado fetal de los productos de reacción de MRP. Como SNP era un
polimorfismo A/G, se usó ddATP como sustrato de reacción en el
ensayo de extensión de cebador. Los productos de la reacción de
extensión de los alelos A y G tenían una longitud de 27 y 30 nt,
respectivamente. No estaba presente producto de reacción fetal
específico alguno en las correspondientes muestras de revestimiento
anteado materno (Fig. 4b; BC materno). Sorprendentemente, se
observaron productos de extensión específicos fetales en dos
muestras de plasma materno del 3^{er} trimestre (Fig. 4b, flecha)
y una del 2º trimestre (Fig. 4c, flecha), lo que indicaba la
presencia de DNA fetal no metilado en plasma materno. Como
controles, ninguno de los casos no informativos ensayados fue
positivo en este ensayo (n=5, datos no representados). Estos
resultados demuestran, por vez primera, la viabilidad de usar
marcadores epigenéticos para detectar una secuencia de DNA heredada
de la madre, derivada del feto, de plasma materno.
Estos resultados demuestran que el uso de
marcadores epigenéticos elude las limitaciones convencionales para
detectar DNA en plasma materno. Es posible detectar un alelo fetal
heredado del padre que es indistinguible genéticamente de un alelo
materno del plasma materno usando diferencias epigenéticas entre la
madre y el feto. Análogamente, es posible detectar un alelo fetal
del plasma materno heredado de la madre. Este nuevo enfoque
epigenético extenderá, por tanto, el repertorio de trastornos en los
que se puede usar DNA fetal en plasma materno.
Incluso usando procedimientos relativamente poco
sensibles tales como la secuenciación directa y la extensión de
cebador, los resultados presentes demuestran que se posible detectar
secuencias de DNA metilado diferencialmente de plasma materno.
Había una sensibilidad menor en la detección de DNA fetal no
metilado en plasma materno (Fig. 4) en comparación con el ensayo
análogo para el alelo metilado (Fig. 3). Usando sistemas de
detección más sensibles, tal PCR específico para el alelo (Newton y
otros, Nucleic Acids Res 17:2503-2516 (1989)) y PCR
específica para metilación en tiempo real (Lo y otros, Cancer Res
59:3899-3903 (1999); Eads y otros, Nucleic Acids
Res 28:E32 (2000)) se puede aumentar la sensibilidad para análisis
epigenético basado en plasma. El desarrollo de la PCR específica
para metilación en tiempo real es particularmente interesante ya que
abre la posibilidad de cuantificar la metilación fetal específica
en plasma materno, como se ha logrado ya para la detección de DNA
en circulación de un tumor (Kawakami y otros, J Natl Cancer Inst
92:1805-1811 (2000)).
La posible introducción de DNA en plasma materno
como herramienta rutinaria de diagnóstico prenatal ha suscitado
cuestiones en cuanto a la necesidad de un marcador genérico para DNA
fetal circulante (Lo y otros, Am J Hum Genet
62:768-775 (1998); Avent y otros, Vox Sang
78:155-162 (2000)). La mayoría de propuestas de tal
marcador se ha enfocado al uso de polimorfismos genéticos entre la
madre y el feto (Tang y otros, Clin Chem
45:2033-2035 (1999); Pertl y otros, Hum Genet
106:45-49 (2000)). La presente demostración de la
viabilidad de marcadores epigenéticos para la detección de DNA
fetal en plasma materno abre un nuevo enfoque para el desarrollo de
un marcador fetal independiente del género e independiente del
polimorfismo en plasma materno. Una manera de lograr esto es
explotar el fenómeno de la metilación específica para el tejido
(Grunau y otros, Hum Mol Genet 9:2651-2663 (2000)).
Puesto que se ha sugerido que el trofoblasto es la población celular
más importante para liberar DNA fetal en plasma materno, la
elucidación de las configuraciones de metilación específicas de
trofoblastos permite el desarrollo de un marcador epigenético fetal
genérico en plasma materno. Biológicamente, el uso de marcadores de
metilación específicos para el tejido puede permitir también uno
para responder directamente de la cuestión de qué tipos de células
son responsables de la liberación de DNA fetal en plasma
materno.
El análisis epigenético de plasma materno tiene
aplicaciones obvias en enfermedades asociadas con la impresión
genómica, tales como el síndrome de Prader-Willi
(Pfeifer, Lancet 356:1819-1820 (2000). Esta
estrategia puede tener también potencial diagnóstico para
trastornos tales como preeclampsia, sobre las que se ha supuesto
que genes impresos desempeñan un papel (Graves, Reprod Fértil Dev
10:23-29 (1998)).
La posible aplicación de DNA fetal en plasma
materno para la detección prenatal de aneuploidía cromosómica es
una cuestión que se ha discutido vivamente desde el descubrimiento
del fenómeno (Lo y otros, Lancet 350:485-487
(1997); Bianchi, Am, J Hum Genet 62:763-764 (1998)).
El hallazgo de diferencias cuantitativas entre los niveles de DNA
fetal circulante en embarazos aneuploides, comparados con embarazos
euploides (Lo y otros, Clin Chem 45:1747-1751
(1999), Zhong y otros, Prenat Diagn 20:795-798
(2000)) ofrece un procedimiento para estimar el riesgo de
aneuploidías cromosómicas fetales de plasma materno. El
descubrimiento reciente de células apoptóticas fetales ("células
derivadas de plasma") (Van Wijk y otros, Clin Chem
46:729-731 (2000)) ofrece aún otro enfoque para la
detección de aneuploidía de plasma materno (Poon y otros, Lancet
356:1819-1820 (2000)). Es interesante que los datos
presentes abren otro enfoque potencial más para la detección de
aneuploidías cromosómicas. Éste está basado en la observación de
que las configuraciones de metilación de DNA aberrantes pueden
asociarse con aneuploidía cromosómica (Kuromitsu y otros, Mol Cell
Viol 17:707-712 (1997), Yu y otros, Proc Natl Acad
Sci USA 94:6682-6867 (1997)). A partir de esto es
posible desarrollar marcadores epigenéticos para detectar tales
secuencias de DNA fetal metiladas aberrantemente de plasma materno.
Tales marcadores proporcionan especifidad en comparación con una
simple cuantificación de DNA fetal en plasma materno (Lo y otros,
Clin Chem 45:1747-1751 (1999); Zhong y otros,
Prenat Diagn 20:795-798 (2000)) y una adecuación
mejor para aplicación a gran escala en comparación con
procedimientos basados en "células derivadas de plasma" (Poon y
otros, Lancet 356:1819-1820 (2000)).
Los marcadores epigenéticos fetales se pueden
utilizar también en el análisis de aislados de células fetales de
la fracción celular de sangre materna. Esto se beneficia de datos
recientes que revelan que el análisis de la metilación se podría
realizar de manera in situ (Nuovo y otros, Proc Natl Acad Sci
USA 96:12754-12759 (1999)).
Con el conocimiento reciente de que la
circulación fetomaterna es un proceso bidireccional (Lo y otros,
Blood 88:4390-4395 (1996); Maloney y otros, J. Clin
Invest 104:41-47 (1999)), los marcadores
epigenéticos se pueden usar también para investigar la
transferencia celular y de DNA de la madre al feto. Un enfoque así
puede tener también aplicaciones en la investigación de otros tipos
de quimerismo, tales como el quimerismo hemopoiético postrasplante
(Starlz y otros, Curr Opin Nephrol Hypertens
6:292-298 (1997)) y quimerismo de DNA urinario
(Zhang y otros, Clin Chem 45:1741-1746 (1999)).
Con la mayor comprensión del genoma humano y el
desarrollo de tecnologías de alto rendimiento basadas en flechas
para el análisis de la metilación (Yan y otros, Clin Cancer Res
6:1432-1438 (2000)), los autores de la invención
esperan que en los próximos pocos años aumentará el número de
marcadores epigenéticos utilizables. Este desarrollo proporcionará
un conjunto clínicamente importante de marcadores epigenéticos que
se puedan usar de manera sinérgica con marcadores genéticos
convencionales en plasma materno.
<110> The Chinese University of Hong
Kong
\hskip1cmLo,Yuk Ming Dennis
\hskip1cmPoon, Lit Man
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimientos para detectar DNA
originario de diferentes individuos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> CMD/FP6090815
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/GB02/03941
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-08-30
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/944.951
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2001-08-31
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia metilada de gen de receptor andrógeno PCR
específica para metilación (MSP) cebador M-for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgagcgtag tatttttcgg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia metilada de gen de receptor andrógeno PCR
específica para metilación (MSP) cebador M-rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaccaaataa cctataaaac ctctacg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia metilada de gen de receptor andrógeno PCR
específica para metilación (MSP) cebador U-for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipgttgtgagtg tagtattttt tggt
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia metilada de gen de receptor andrógeno PCR
específica para metilación (MSP) cebador U-rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipcaaataacct ataaaacctc taca
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 20
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polimorfismo de nucleótido singular (SNP) dentro de una
región metilada diferencialmente (DMR) de la región
IGF2-H19 humana PCR de amplificación cebador de
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipavance
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggacggaatt ggttgtagtt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 6
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<211> 21
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: polimorfismo de nucleótido singular (SNP) dentro de la
región metilada diferencialmente (DMR) de la región
IGF2-H19 humana PCR de amplificación cebador
inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
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\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sitio de polimorfismo de nucleótido singular (SNP)
dentro de la región metilada diferencialmente (DMR) de alelo
metilado de la región IGF2-H19 humana PCR
específico para metilación (MSP) cebador de avance
M-for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttaattgggg ttcgttcg
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
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<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sitio de polimorfismo de nucleótido singular (SNP)
dentro de la región metilada diferencialmente de alelo metilado de
la región IGF2-H19 humana PCR específica para
metilación (MSP) cebador inverso M-rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccgacctaa aaatctaata cga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sitio de polimorfismo de nucleótido singular (SNP)
dentro de la región metilada diferencialmente de alelo no metilado
de la región IGF2-H19 humana PCR específica para
metilación (MSP) cebador de avance U-for
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtttgtttg tggaaatgtt tt
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: sitio de polimorfismo de nucleótido singular (SNP)
dentro de la región metilada diferencialmente de alelo no metilado
de la región IGF2-H19 humana PCR específica para
metilación (MSP) cebador inverso U-rev
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcccaacctaa aaatctaata caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: ensayo de extensión de cebador cebador marcado
Cys-5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgggttatttg ggaataggat attta
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Un procedimiento para diferenciar especies de
DNA originarias de diferentes individuos, en el que las especies de
DNA están presentes en una muestra biológica obtenida de los
individuos, procedimiento que comprende la etapa de detectar una
diferencia de metilación entre las especies de DNA de los diferentes
individuos.
2. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra biológica es una muestra de
fluido o celular, o una mezcla de ambos.
3. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra biológica es plasma o
suero.
4. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la muestra biológica es sangre.
5. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que uno de los individuos es una mujer
embarazada y el otro individuo es un feto no nacido.
6. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que uno de los individuos es un receptor de
un trasplante y el otro individuo es un donante de un órgano.
7. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que el trasplante es un trasplante de
médula ósea.
8. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende la etapa de medir la
concentración de las especies de DNA.
9. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende la etapa de añadir bisulfito
sódico a la muestra biológica o a la especie de DNA.
10. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende la etapa de realizar una
reacción en cadena de polimerasa específica para metilación.
11. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende las etapas de amplificar la
especie de DNA para generar un producto de PCR y secuenciar el
producto de PCR.
12. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende la etapa de realizar la
extensión del cebador.
13. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la muestra biológica es plasma o suero
materno.
14. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 13, que además comprende la etapa de medir la
concentración de DNA fetal en plasma o suero materno.
15. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que la concentración de DNA fetal medida
se usa para predecir, controlar o diagnosticar o pronosticar un
trastorno.
16. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la diferencia de metilación se asocia
con un trastorno fetal o materno.
17. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el trastorno es aneuploidía
cromosómica.
18. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 17, en el que la aneuploidía cromosómica es trisomía
21 (síndrome de Down).
19. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el trastorno se selecciona entre el
grupo de preeclampsia, trastorno de impresión, síndrome de
Prader-Willi y síndrome de Angelman.
20. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 14, en el que la diferencia de metilación detectada
en células fetales se usa como marcador específico del feto.
21. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, que además comprende la etapa de medir la
concentración de DNA del donante del órgano y el receptor del
trasplante.
22. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 21, en el que la concentración de DNA del donante
del órgano y el receptor del trasplante se usa para predecir el
progreso clínico del receptor del trasplante.
23. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que uno de los individuos es un hombre y el
otro individuo es una mujer.
24. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 23, en el que la diferencia de metilación se detecta
en un cromosoma X inactivado de la mujer.
25. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 24, en el que se usa una secuencia de DNA metilada
en el cromosoma X inactivado para detectar DNA originario de la
mujer.
26. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la diferencia de metilación se analiza
dentro de las células.
27. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 26, en el que la diferencia de metilación se analiza
usando reacción en cadena de polimerasa específica para metilación
in situ.
28. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la diferencia de metilación se usa para
clasificar o aislar células aisladas de los individuos o se usa para
purificar DNA de los individuos.
29. Un procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5, en el que la diferencia de metilación se detecta
en células fetales de la placenta.
30. Uso de un kit para diferenciar especies de
DNA originarias de diferentes individuos, en el que las especies de
DNA están presentes en una muestra biológica obtenida de uno de los
individuos, comprendiendo el kit uno o más reactivos para averiguar
el estado de metilación de una especie de DNA.
31. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, en
el que el reactivo para averiguar el estado de metilación es
bisulfito sódico.
32. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, que
además comprende uno o más reactivos para detectar la presencia de
DNA.
33. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, que
además comprende uno o más reactivos para amplificar el DNA
presente en la muestra biológica.
34. Uso de acuerdo con la reivindicación 30, que
además comprende uno o más aparatos para obtener una muestra de
DNA.
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