ES2280812T3 - Metodo de determinacion del numero de copias de una secuencia de nucleotidos. - Google Patents
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Abstract
Sistema analítico para analizar y controlar un proceso de producción para productos de vidrio, proceso de producción comprendiendo un proceso de conformación y un proceso de enfriamiento y sistema analítico comprendiendo un sistema de medición sensible a los infrarrojos y un procesador de comunicación con éste, el sistema de medición sensible a los infrarrojos estando equipado para medir una radiación infrarroja procedente de productos de vidrio calientes inmediatamente después del proceso de conformación para los productos de vidrio y el procesador estando dispuesto para determinar una distribución de calor en los productos de vidrio en base a la información determinada por el sistema de medición, dicho sistema de medición sensible a los infrarrojos (30) siendo sensible sólo a la radiación en la región de casi infrarrojo (NIR), procedente del interior de una pared de los productos de vidrio, caracterizado por el hecho de que el procesador (38) está configurado para efectuar las etapas siguientes: (a) subdividir una imagen de los productos de vidrio (18) en al menos dos regiones de medición (40, 41, 42, 43, 44); (b) determinar valores de intensidad medios para las diferentes regiones de medición para productos de vidrio consecutivos (18); (c) determinar, para al menos dos regiones de medición, un valor medio actual de los valores de intensidad medios determinados para varios productos de vidrio formados consecutivamente (18) en el tiempo; (d) registrar, para cada una de al menos dos regiones de medición, cualquier desviación entre la intensidad actual o la intensidad media actual y un valor de referencia; (e) comparar cualquier diferencia entre al menos dos regiones de medición; (f) generar una señal de error en caso de cualquier desviación.
Description
Método de determinación del número de copias de
una secuencia de nucleótidos.
La presente invención se refiere a un método de
determinación del número de copias de una secuencia de nucleótidos
I en una muestra que usa una técnica de amplificación,
comprendiendo dicho método los pasos de
1. \bullet 1) adición de nucleótidos,
cebadores, polimerasa y otros reactivos cualesquiera, si los
hubiera, requeridos para la técnica de amplificación usada para la
muestra,
2. \bullet 2) realización de uno o más ciclos
de amplificación para amplificar la secuencia de nucleótidos I para
la cual ha de ser determinado el número de copias;
donde la muestra contiene una segunda secuencia
cromosómica de nucleótidos II, y
1. \bullet a) la primera secuencia de
nucleótidos I es amplificada,
2. \bullet b) la segunda secuencia de
nucleótidos II es amplificada,
3. \bullet c) una tercera secuencia de
nucleótidos I' correspondiente a la primera secuencia de
nucleótidos I y presente en una muestra de control es amplificada a
varias diluciones, y
4. \bullet d) una cuarta secuencia de
nucleótidos II' correspondiente a la segunda secuencia de
nucleótidos II y presente en una muestra de control es amplificada
a varias diluciones,
donde la proporción de las concentraciones de
secuencia de nucleótidos I' y II' es conocida
donde las amplificaciones de las secuencias de
nucleótidos tercera y cuarta I y II' a varias diluciones permite
que se hagan curvas estándar SC_{i} con i siendo I o II, las
concentraciones de I y II son determinadas mediante el uso de la
curva estándar respectiva SC_{i}, y las concentraciones relativas
permiten que se determine el número relativo de copias CN de la
secuencia I (contra la secuencia de nucleótidos II) usándose la
fórmula
CN =
\frac{[I]_{SCI'}}{[II]_{SCII'}}
donde
CN es el número relativo de copias de I sobre II
en la muestra;
[I]_{SCI'} es la concentración de I
determinada usándose la curva estándar SC_{I'}; y
1) [II]_{SCII'} es la concentración de
II determinada usándose la curva estándar SC_{II'}.
La mayoría de las células eucariotas diploides
contienen dos copias de un único gen; una en cada cromosoma de un
par de cromosomas. Los cromosomas de un par de cromosomas que
deriven de cada genitor, los genes pueden ser diferentes y, por
ejemplo, uno de ellos puede tener como resultado una proteína
anormal. Así, el número de genes funcionales no es necesariamente
dos en un eucariota, y puede ser uno o incluso cero. Mientras que a
menudo están presentes genes en una copia por cromosoma de un par
particular de cromosomas, algunos genes están presentes en múltiples
copias, por ejemplo en secuencias de repetición en tándem. Otra
excepción a la regla general de dos copias por célula es el ADN
mitocondrial. Una célula contiene muchas mitocondrias, siendo el
número dependiente del tipo de célula. Pero incluso para un tipo de
célula particular, el número de mitocondrias puede variar. Números
típicos se encuentran entre cien y mil mitocondrias por célula, y
cada mitocondria contiene varias copias de ADN mitocondrial. Además,
el número de copias habitual no es necesariamente igual o mayor que
dos por célula. Algunas secuencias de nucleótidos son muy raras
entre células (a pesar de ser de uno y el mismo sujeto, tal como un
ser humano). Esto es, por ejemplo, después de la redisposición de
los genes. Éste es, por ejemplo, el caso con anticuerpos que
producen células (linfocitos B) o linfocitos T portadores de
receptores. De un gran número de linfocitos, sólo algunos
contendrán una secuencia de nucleótidos particular que defina la
región variable de un anticuerpo particular (o del receptor de
células T), capaz de reconocer un antigen particular. En la técnica
existe la necesidad de determinar de manera fiable el número de
copias de una secuencia de nucleótidos, la cual puede comprender la
secuencia de nucleótidos de un gen o parte de la misma. Un método
conforme al preámbulo es conocido en la técnica.
La EP-A-0 959
140 expone un método para determinar una cantidad de una secuencia
de ácidos nucleicos en una muestra, el cual comprende los pasos de
formación de una pluralidad de muestras estándar (II), cada una de
las cuales contiene una cantidad inicial conocida de una secuencia
de control de ácidos nucleicos (II') y una cantidad inicial
conocida de una secuencia objetivo de ácidos nucleicos en las mismas
(I'); la formación de una muestra de prueba que contenga una
cantidad inicial conocida de la secuencia de control de ácidos
nucleicos y una cantidad inicial desconocida de la secuencia
objetivo de ácidos nucleicos (I); la amplificación de las
cantidades de las secuencias objetivo y de control de ácidos
nucleicos en cada una de las muestras estándar y la muestra de
prueba, durante un intervalo de tiempo de amplificación; la
medición de los indicios de las cantidades amplificadas de las
secuencias objetivo y de control de ácidos nucleicos en cada una de
las muestras estándar y la muestra de prueba; la determinación de
una proporción de amplificación a partir de los indicios medidos de
las cantidades amplificadas de las secuencias objetivo y de control
de ácidos nucleicos en las muestras estándar; y la determinación de
una magnitud de la cantidad inicial de la secuencia objetivo de
ácidos nucleicos en la muestra de prueba a partir de la proporción
de amplificación y los indicios medidos de las cantidades
amplificadas de las secuencias objetivo y de control de ácidos
nucleicos en la muestra de prueba. No obstante, las diferentes
secuencias estándar no residen en el mismo vector.
La EP-A-1 138
783 expone un método para la cuantificación de un ácido nucleico
objetivo en una muestra, el cual comprende los pasos siguientes: a)
determinación de la eficiencia de amplificación del ácido nucleico
objetivo bajo condiciones de amplificación definidas; b)
amplificación del ácido nucleico objetivo contenido en la muestra
bajo las mismas condiciones de reacción definidas; c) medición de
la amplificación en tiempo real: d) cuantificación de la cantidad
original de ácido nucleico objetivo en la muestra mediante la
corrección de la cantidad original derivada del paso c) con la ayuda
de la eficiencia de amplificación determinada. No obstante, las
diferentes secuencias estándar no residen en el mismo vector.
Un método conforme al preámbulo se conoce
expuesto por Kwok et al en la US 5.389.512.
El objetivo de la presente invención es mejorar
este método para determinar de manera fiable el número de copias de
una secuencia de nucleótidos incluso si está presente en cantidades
extremas, tales como lotes de copias por célula o sólo algunas
copias por muchas células. Además, un objetivo de la presente
invención es proporcionar un método que haya reducido la
sensibilidad a la eficiencia con el cual el ADN fue extraído de las
células que contienen una secuencia de nucleótidos I para la cual el
número de copias ha de ser determinado.
Con este fin, el método según la presente
invención se caracteriza por el hecho de que
al menos un par de reacciones de amplificación
escogidas de i), a) y b), e ii), c) y d) es realizado en un único
contenedor y controlado espectrofotométricamente durante la
amplificación, y
la tercera secuencia de nucleótidos I' y la
cuarta secuencia de nucleótidos II' reside en un único vector.
Esto permite una medición más exacta de números
de copias absolutos o relativos de la secuencia de nucleótidos I.
En la técnica se conocen métodos espectrofotométricos apropiados.
De manera más específica, tales métodos se basan en pruebas
internas para mediciones en tiempo real, por ejemplo, RCP en tiempo
real. En la técnica se conocen pruebas internas, y son expuestas
por, por ejemplo, Winer et al (Anal. Biochem 270, pág.
41-49 (1999)). Las mediciones pueden hacerse de
forma continua, o tras la finalización de un ciclo de
amplificación. Mientras que se hace referencia específica a curvas
estándar, no es necesario decir que esto se puede hacer usando
métodos computacionales sin que se haga un gráfico real. Por lo
tanto, en la solicitud presente la frase "hacer una curva
estándar" se refiere a cualquier método que use al menos dos
puntos de referencia para determinar una concentración (relativa).
Por lo general, todas las amplificaciones se llevarán a cabo
esencialmente a la vez. Mediante la realización de amplificaciones
múltiples en un contenedor, se reduce el margen para errores. El
método conforme a la invención no es sólo muy preciso, sino que
también es muy eficaz si se realiza para múltiples muestras. Esto
es, para cada secuencia de nucleótidos 1 para la cual se desea
determinar el número de copias, sólo ha de hacerse una única curva
estándar SC_{II'}. Con respecto al término "correspondiente"
como se usa en la presente invención conjuntamente con secuencias
de nucleótidos, se pretende que signifique que las secuencias de
nucleótidos I y I' (y II y II') o, de forma más específica, la
secuencia de nucleótidos de una y la secuencia complementaria de la
otra, puedan hibridar bajo condiciones severas. Si las secuencias I
y I' (y II y II') no tienen la misma longitud, la más corta de las
dos es preferiblemente como máximo el 50% más corta, más
preferiblemente como máximo el 30% más corta.
La tercera secuencia de nucleótidos I' y la
cuarta secuencia de nucleótidos II' que residan en el mismo vector
permiten que su proporción sea constante y conocida de manera
exacta (por ejemplo 1:1). Este permite las mediciones con la mayor
exactitud posible. Es posible someter al vector que contiene ambas
secuencias de nucleótidos I y II' a una digestión usando una o más
enzimas de restricción, de manera opcional seguida de la
purificación, para obtener una molécula lineal que contenga tanto
la secuencia de nucleótidos I' como la II', y usando esta molécula
para las amplificaciones necesarias para las curvas estándar.
En la presente solicitud, se entiende que un
vector es cualquier secuencia de nucleótidos compuesta por o que
contenga la(s) secuencia(s) de nucleótidos que ha de
ser amplificada. Cuando está presente en un vector que puede ser
replicado in vitro o in vivo, es fácil obtener esa
secuencia de nucleótidos particular en cantidades deseadas. También
es muy fácil determinar la concentración de ADN y, por lo tanto, el
número de copias de la secuencia de nucleótidos por volumen. Un
vector que puede ser replicado o que es replicado puede ser
cualquier vector de este tipo conocido en la técnica, tal como un
plásmido, un cósmido, un virus, etc. Si, de acuerdo con una forma
de realización ventajosa, la tercera secuencia de nucleótidos I'
reside en un primer vector y la cuarta secuencia de nucleótidos II'
reside en un segundo vector, los vectores pueden ser usados (o
mezclados) en cualquier proporción deseada para alojar diferencias
esperadas en números de copias de las muestras.
Douek et Al (Nature 396, pág.
690-695 (1998)) describen un método para detectar
los productos de las redisposiciones de receptores de células T
(TREC) usando un ensayo semicuantitativo. Para determinar la
cantidad de TREC en una muestra dada, se prepara una cantidad
conocida de un competidor de ADN. Entonces, se añade al tubo una
cantidad de ADN de muestra que contiene la secuencia de nucleótidos
que ha de ser determinada. Una reacción de amplificación de RCP es
realizada en la presencia de deoxinucleotido radioetiquetado.
Posteriormente, los productos de amplificación resultantes son
colocados sobre un gel para separar el producto de RCP de ADN de
muestra del producto de ADN competidor. Después de la
autorradiografía, la cantidad de secuencia de nucleótidos que ha de
ser determinada es calculada usando análisis densitométrico a
partir de la proporción entre una banda de ADN competidor y una
banda del ADN de muestra. El resultado se expresa como el número de
copias de TREC por microgramo del ADN total. Para conseguir una
exactitud aceptable, se usan cuatro tubos que contengan cantidades
escalares de ADN competidor, a las cuales se añaden cantidades
fijas de ADN de muestra. La desventaja de este método es que cuando
se extrae ADN de células, debe presumirse que éste es todo el ADN
presente en las células. Es decir, se presume que ninguna célula se
libró de la lisis y que todo el ADN presente en las células fue
extraído y aislado. Éste no es necesariamente el caso. Otra
desventaja de este método es que es sensible a diferencias en la
eficiencia de amplificación.
La publicación de patente europea EP 0 959 140
expone un método y aparato para determinar cantidades de secuencias
de ácido nucleico en muestras usando curvas estándar y cálculos de
la proporción de amplificación. Una pluralidad de muestras estándar
conteniendo cada una una cantidad conocida de una secuencia de
control de ácido nucleico, y una muestra de prueba que contenga una
cantidad conocida de la secuencia de control de ácido nucleico más
una secuencia de ácido nucleico en una concentración desconocida,
son sometidas a una reacción de amplificación. Se determina la
concentración del ácido nucleico presente en una concentración
desconocida en la muestra de prueba.
La publicación de la patente europea EP 1 138
783 expone un método para la cuantificación de un ácido nucleico en
una muestra de prueba, mediante la determinación de la eficiencia
de amplificación bajo condiciones definidas, y la realización de la
cuantificación de dicho ácido nucleico bajo las mismas condiciones
definidas, permitiendo la corrección de la concentración
determinada para dicho ácido nucleico.
Según una forma de realización preferida, el
número absoluto de copias es determinado multiplicando el número de
copias CN por el número absoluto de copias de la secuencia II por
célula.
Para varias secuencias de nucleótidos II, se
conoce el número de copias por célula. Un ejemplo es, por ejemplo,
la codificación del gen para la proteína de choque térmico 70, o el
ligando Fas (CD178), las cuales se sabe que están presentes con dos
copias por célula (es decir, el número absoluto de copias de pct 70
= 2). Muchas secuencias de nucleótidos de genes son muy adecuadas,
puesto que por lo general están presentes en un número conocido de
copias en cada célula de las especies de las cuales deriva el ADN.
La eficiencia con la cual el material de ADN es extraído de las
células no es importante (aunque, en el caso de la secuencia de
nucleótidos I está en una molécula diferente a la secuencia de
nucleótidos II, es importante que se extraigan con la misma
eficiencia). Por lo tanto, esta forma de realización permite la
determinación del número absoluto de copias de la secuencia de
nucleótidos I por célula.
Según una forma de realización preferida, al
menos dos secuencias de nucleótidos terceras I' diferentes para la
medición de un número correspondiente de secuencias de nucleótidos
primeras I diferentes residen en un único vector.
En otras palabras, un único vector, el cual
necesita que su concentración sea determinada sólo una vez, puede
portar múltiples secuencias de nucleótidos terceras I', lo que
permite, por ejemplo, que se determinen los números de copias de
muchos genes diferentes.
Preferiblemente, la secuencia de la primera
secuencia de nucleótidos I es la misma que la secuencia de
nucleótidos tercera I'.
Esto reduce en gran medida errores debidos a
diferencias en las eficiencias de amplificación entre I y I'. No
obstante, por lo general se permiten pequeñas diferencias en la
secuencia de nucleótidos, aunque lo mejor es que se eviten cambios
en los lugares donde el tubo es usado para detectar la
concentración de la secuencia de nucleótidos. En otras palabras, se
prefiere especialmente si el tubo coincide a la perfección para la
secuencia donde se pretende que enlace.
De forma similar, se prefiere que la secuencia
de la segunda secuencia de nucleótidos II sea la misma que la
cuarta secuencia de nucleótidos II'.
Mientras que la presente invención es descrita
con referencia al ADN, la presente invención también se aplica a la
determinación del número de secuencias de ARN presentes en una
célula. Se pueden usar métodos conocidos en la técnica para
multiplicar ARN, por ejemplo preparando ADNc. Esta solicitud no
pretende enseñar a un lego interesado cómo convertirse en un experto
en la materia, por lo que al lego se le hace referencia a libros de
texto generales y, en particular, a una universidad adecuada para
aprender las técnicas necesarias que un experto en la materia
conoce sobre cómo aplicar estas técnicas para realizar la presente
invención.
La presente invención será ilustrada ahora con
referencia a los dibujos donde
Figura 1 representa una curva estándar para una
secuencia de ADNmt I' (círculos) más datos para la secuencia de
nucleótidos I (cuadrados);
Figura 2 representa una curva estándar para una
secuencia de ADN nuclear II' (círculos) más datos para la secuencia
de nucleótidos II (cuadrados);
Figura 3 representa una curva estándar para una
secuencia de ADN nuclear I' (círculos) más datos para la secuencia
de nucleótidos I (cuadrados);
Figura 4 representa una curva estándar para una
secuencia de ADN nuclear II' (FasL) (círculos) más datos para
secuencia de nucleótidos II (cuadrados); y
Figura 5 muestra el efecto de la edad en los
números de copias de TREC en linfocitos periféricos (porcentaje de
células de linfocitos que expresan TREC).
El método según la invención será ilustrado
usando dos ejemplos. El primero se refiere al análisis cuantitativo
de ADN mitocondrial (ADNmt) y muestra la técnica para determinar
múltiples copias por célula. El segundo ejemplo muestra la
determinación cuantitativa de un número fraccional de copias de una
secuencia de nucleótidos particular por célula.
La secuencia de nucleótidos I (ADNmt) era una
extensión con una longitud de 102 nucleótidos, y se corresponde con
parte de la enzima NADH deshidrogenasa como está codificada por
ADNmt. La amplificación de la secuencia de nucleótidos I fue
realizada usando un grupo de cebadores, cada uno con una longitud
de 21 nucleótidos y sintetizados usando procedimientos estándar. Se
revisaron las secuencias de ambos cebadores para que fueran únicas
para el ADNmt humano usando software Blast, a través del sitio NCBI
en NIH (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast /).
La secuencia de nucleótidos II (ADN nuclear) que
sirve como referencia, fue una extensión con una longitud de 104
nucleótidos y parte del gen FasL, el cual viene con dos copias por
célula humana. La amplificación de la secuencia de nucleótidos II
fue realizada usando un grupo de cebadores, cada uno con una
longitud de 21 y 24 nucleótidos respectivamente.
Para controlar el progreso de la amplificación,
se usó una sonda para la secuencia de nucleótidos I, teniendo la
sonda una longitud de 23 nucleótidos, con una sonda fluorescente
FAM (carboxifluoresceína) en el extremo 5' y un grupo BlackHole
Quencher1^{TM} en el extremo 3'. Esta sonda, y todas las otras en
esta solicitud, fue encargada comercialmente a MWG, Ebersberg,
Alemania. La secuencia de la sonda fue revisada para que fuera
única para el ADNmt usando software Blast, a través del sitio NCBI
como se ha mencionado arriba.
La sonda usada para los nucleótidos II tenía una
longitud de 22 nucleótidos y contenía TexasRed como etiqueta
fluorescente y un grupo BlackHole Quencher2^{TM} en el extremo
3'(MWG).
Se aisló ADN de HL60, una línea celular de
leucemia promielocítica, usando un kit de aislamiento de ADN de
Qiagen, Hilden, Alemania, de conformidad con las instrucciones del
fabricante.
Se construyó un vector, usando
pGEM-11Z (Promega) que contenía las secuencias I' y
II' del principio al final, usando técnicas de ingeniería genética
estándar, como resulta todo demasiado familiar a través de Sambrook
et al. (Molecular cloning. A lab manual. (1989)) en E.
coli. Las secuencias de nucleótidos I' y II' eran idénticas a
sus respectivos duplicados I y II, y estaban presentes en una
proporción muy definida 1:1.
La concentración absoluta de los controles se
hizo usando ensayos de dilución limitativos (Sambrook).
La amplificación se realizó usando un ciclador
térmico iCycler (BioRad, Hercules, CA, EEUU) usando procedimientos
estándar. La amplificación es realizada en placas con 96 pozos.
Este instrumento permite el control de la fluorescencia en hasta
cuatro canales diferentes. En resumen, se realizó un ciclo de
desnaturalización (95°C durante seis minutos), seguido de 45 ciclos
de amplificación (94°C durante 30 segundos, 60°C durante 60
segundos). La amplificación se llevó a cabo en una mezcla que se
componía de: tampón 1X de RCP de Promega (Promega, Madison, WI,
EEUU), 3'0 mM de MgCI2, 400 pmol de cebadores para ADNmt, 0'2 mM de
dNTP y 2 U de polimerasa Taq (Promega). De conformidad con la
invención, la amplificación para ambas secuencias de nucleótidos I
y II se realizó en un único pozo, y lo mismo es aplicable para las
secuencias de nucleótidos I' y II' (para determinar las curvas
estándar). Los datos fueron analizados usando el software del
iCycler.
Las curvas estándar fueron realizadas
introduciendo un número conocido de copias de vector por pozo.
Se realizaron experimentos de amplificación por
triplicado.
La figura 1 muestra la curva estándar para la
secuencia de nucleótidos I' y la figura 2 muestra la curva estándar
para la secuencia de nucleótidos II' basada en FasL. Observe los
excelentes coeficientes de correlación de 0'995 y 0'996
respectivamente, que ponen de relieve la gran exactitud del método
según la invención. Usando estas curvas, se determinó la
concentración de las secuencias de nucleótidos I y II (mostrada
como cuadros en las figuras 1 y 2). Puesto que se sabe que la
secuencia de nucleótidos para FasL (y, más específicamente, para la
sonda para el nucleótido II/II') está presente con dos copias por
célula, el número de copias de la secuencia de nucleótidos 1 por
célula es dos veces mayor, es decir, 160.
Básicamente, se usó el mismo método que el
descrito en el ejemplo 1, salvo en que la secuencia de nucleótidos
I se correspondía con parte de la secuencia del locus delta del
receptor de células T. El método se usó para determinar el número
de copias de TREC por célula, en particular linfocitos periféricos
en sangre, en tres grupos de edad (humanos saludables de 20, 60 o
100 años). El número de personas fue respectivamente 16 (10), 17
(10), y 21 (17), con el número de mujeres entre paréntesis.
Las curvas estándar para las secuencias de
nucleótidos I' y II' se muestran en las figuras 3 y 4
respectivamente. Los siguientes coeficientes de correlación
obtenidos fueron: 0'999 y 0'998.
La figura 5 muestra que el número de copias de
TREC disminuye con la edad (medias por grupo de edad mostradas como
línea horizontal) desde aproximadamente 3'2 hasta 0'1 por 100
células.
Mientras que particularmente beneficioso para el
método conforme a la presente invención en vista del hecho que los
métodos espectrofotométricos permiten la detección simultánea de
etiquetas múltiples, es posible realizar una reacción de
amplificación usando cualquier técnica de amplificación conocida,
donde la tercera secuencia de nucleótidos I' y la cuarta secuencia
de nucleótidos II' residen en un único vector y las amplificaciones
de cada una de I' y II' son realizadas en recipientes separados,
tales como pozos separados. La solicitud también cubre esta
posibilidad. Tales técnicas de amplificación comprenden, aparte de
las mencionadas arriba, CP (reacción de sonda cíclica), ADNb
(amplificación de ADN ramificado), SSR (replicación automantenida de
secuencia), ADC (amplificación por desplazamiento de cadena), QBR
(replicasa q-beta), Re-AMP
(anteriormente RAMP), NASBA (amplificación basada en la secuencia
de ácidos nucleicos), RCR (reacción en cadena de reparación), LCR
(reacción en cadena de la ligasa), TAS (sistema de amplificación
basada en la transcripción), y HCS (amplifica el ARN
ribosómico).
Claims (5)
1. Método de determinación del número de copias
de una secuencia de nucleótidos I en una muestra usando una técnica
de amplificación, comprendiendo dicho método los pasos de
1) adición de nucleótidos, cebadores, polimerasa
y cualesquiera otros reactivos, si los hay, necesarios para la
técnica de amplificación usada para la muestra,
2) realización de uno o más ciclos de
amplificación para amplificar la secuencia de nucleótidos I para la
cual el número de copias debe ser determinado; donde la muestra
contiene una segunda secuencia cromosómica de nucleótidos II, y
- a)
- la primera secuencia de nucleótidos I es amplificada,
- b)
- la segunda secuencia de nucleótidos II es amplificada,
- c)
- una tercera secuencia de nucleótidos I' correspondiente a la primera secuencia de nucleótidos I y presente en una muestra de control es amplificada a varias diluciones, y
- d)
- una cuarta secuencia de nucleótidos II' correspondiente a la segunda secuencia de nucleótidos II y presente en una muestra de control es amplificada a varias diluciones,
- donde se conoce la proporción de las concentraciones de las secuencias de nucleótidos I' y II'
- donde las amplificaciones de las secuencias de nucleótidos tercera y cuarta I' y II' a varias diluciones permiten que se realicen las curvas estándar SCi con i siendo I o II, las concentraciones de I y II son determinadas usando la curva estándar respectiva SCi, y las concentraciones relativas permiten que se determine el número relativo de copias CN de la secuencia I (contra la secuencia de nucleótidos II) usando la fórmula
CN =
\frac{[I]_{SCI'}}{[II]_{SCII'}}
donde
CN es el número relativo de copias de I sobre II
en la muestra;
[I]_{SCI'} es la concentración de I
determinada usando la curva estándar SC_{I'}; y
[II]_{SCII'} es la concentración de II
determinada usando la curva estándar SC_{II'} donde
al menos un par de reacciones de amplificación
elegidas de i) a) y b), y ii) c) y d) es realizado en un único
recipiente y vigilado espectrofotométricamente durante la
amplificación, y
la tercera secuencia de nucleótidos I' y la
cuarta secuencia de nucleótidos II' residen en un único vector.
2. Método según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el número absoluto de
copias es determinado multiplicando el número de copias CN por el
número absoluto de copias de la secuencia II por célula.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado por el hecho de que al menos dos y también más
terceras secuencias de nucleótidos I' diferentes para la medición
de un número correspondiente de primeras secuencias de nucleótidos
I diferentes residen en un único vector.
4. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que la secuencia de la primera secuencia de nucleótidos I es la
misma que la tercera secuencia de nucleótidos I'.
5. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado por el hecho de
que la secuencia de la segunda secuencia de nucleótidos II es la
misma que la cuarta secuencia de nucleótidos II'.
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