ES2281077T3 - Sondas de acidos nucleicos y oligonucleotidos de amplificacion para detectar especies de neisseria. - Google Patents
Sondas de acidos nucleicos y oligonucleotidos de amplificacion para detectar especies de neisseria. Download PDFInfo
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION REVELA SONDAS DE ENSAYO DE HIBRIDIZACION, INICIADORES DE AMPLIFICACION, COMPOSICIONES DE ACIDO NUCLEICO Y METODOS UTILES PARA DETECTAR ACIDOS NUCLEICOS DE NEISSERIA.SE REVELAN SONDAS DE ENSAYO DE HIBRIDACION E INICIADORAS DE AMPLIFICACION QUE DETECTAN SELECTIVAMENTE NEISSERIA MENINGITIDIS Y DISTINGUEN ESAS NEISSERIA MENINGITIDIS DE NEISSERIA GONORROHOEAE.TAMBIEN SE DESCRIBEN OTRAS SONDAS DE HIBRIDACION QUE DETECTAN SELECTIVAMENTE NEISSERIA GONORROHOEAE Y NO NEISSERIA MENINGITIDIS.
Description
Sondas de ácidos nucleicos y oligonucleótidos de
amplificación para detectar especies de Neisseria.
Las invenciones descritas y reivindicadas en la
presente se refieren al diseño y empleo de oligonucleótidos de
amplificación y sondas de ácido nucleico para la Neisseria
gonorrhoeae, que permitan la detección de este organismo en las
muestras de ensayo.
El género Neisseria comprende dos
especies gram-negativas de cocos piogénicos que son
patogénicos para el hombre, y que no tienen ningún otro reservorio
conocido: el meningococcus (Neisseria meningitidis) y el
gonococcus (Neisseria gonorrhoeae). Un número de especies no
patogénicas habitan también el tracto respiratorio superior de los
humanos y pueden fácilmente confundirse con los meningococci. La
meningitis meningocócica fue reconocida como una enfermedad
contagiosa tempranamente en el siglo 19 y es especialmente frecuente
entre el personal militar. El agente causante de la meningitis
meningocócica es la Neisseria meningitidis.
La Neisseria gonorrhoeae es una de las
principales causas de enfermedad epidémica sexualmente transmitida,
y es frecuente en los Estados Unidos. La infección con Neisseria
gonorrhoeae ocasiona muchos síntomas corrientes que incluyen la
uretritis, cervicitis y proctitis. Además, la infección crónica con
Neisseria gonorrhoeae puede ocasionar la enfermedad
inflamatoria pélvica.
Las Neisserias son cocos
gram-negativos que crecen en parejas y
ocasionalmente en tétradas o racimos. Muchos meningococos tiene
cápsulas que contienen polisacáridos. Los gonococos pueden poseer
también cápsulas, pero la exacta composición química de dicha
cápsula es desconocida, Además, tanto los gonococos como los
meningococos pueden tener filamentos, los cuales juegan un papel en
la virulencia.
Los meningococos y gonococos son difíciles de
cultivar y se necesitan técnicas especiales para hacer crecer los
organismos de los fluidos corporales. Además, se necesita un medio
de cultivo selectivo (por ejemplo, el medio
Thayer-Martin), debe cultivarse en una atmósfera con
el 3-10% de dióxido de carbono y aproximadamente a
35ºC, para maximizar el cultivo de los organismos.
Además del cultivo difícil, la detección del
gonococo y el meningococo por medio de un inmunoensayo, adolece de
falta de sensibilidad y especificidad. Esto parece ser debido a la
reacción cruzada que se produce entre varios otros microorganismos
patógenos y no-patogénicos encontrados a menudo en
el mismo espécimen clínico.
Los oligonucleótidos para la amplificación del
ácido nucleico para la detección de la Neisseria han sido
descritos. Bikenmeyer y Armstrong, J. Clin. Microbiol.
30:3089-3094 (1992), describen juegos de sondas para
emplear en la reacción en cadena de la ligasa dirigida a los genes
Opa y pilin de Neisseria gonorrhoeae. Kristiansen et
al., Lancet 340:1432-1434 (1992) describen
cebadores dirigidos a un elemento de inserción designado como
IS1106 para la amplificación y detección de Neisseria
meningitidis. McLaughlin et al., Mol. and Cell Probes
7:7-17 (1993) describe cebadores para emplear en la
reacción en cadena de la polimerasa dirigidos al espaciador
transcrito internamente del ARNr de 16S-23S, y un
juego de cebadores dirigidos a una subregión del ARNr de 16S de
Neisseria meningitidis. Sondas para la detección de
secuencias de ARNr ó ADNr de Neisseria gonnorhoeae y/o
Neisseria meningitidis han sido descritos por Granato y Franz
J. Clin. Microbiol. 28:944-948, (1990),
Wolf, patente U.S. 5.173.401 (22 Dic. 1992), Rossau y Van
Heuverswijn, publicación de la solicitud de patente europea nº 0
337 896, Hogan et al., PCT/US87/-03009, y Barns et
al., U.S. patente 5.217.862 (8 Junio 1993). La patente EP
318245 describe sondas que tienen como objetivo regiones
particulares del ácido nucleico ribosómico de 16S de la
Neisseria gonorrhoeae. La patente EP 552931 describe el
empleo de ácidos nucleicos ramificados para la detección de ARN
ribosómico de la Neisseria gonorrhoeae. La patente WO
90/14442 describe sondas para la unión al ácido nucleico ribosómico
de 16S y 23S, de la Neisseria gonorrhoeae.
La invención de referencia describe y reivindica
nuevos y útiles juegos de oligonucleótidos de amplificación, de
acuerdo con las reivindicaciones 1-16, un kit que
comprende oligonucleótidos auxiliares, y sondas para ensayos de
hibridación de oligonucleótidos, de acuerdo con las reivindicaciones
17-31, los cuales oligonucleótidos y sondas están
diseñados para ser complementarios con las regiones específicas del
ARNr (ARN ribosómico) ó ADNr (ADN ribosómico) secuencias de
nucleótidos de Neisseria gonorrhoeae u oligonucleótidos que
tienen una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente a una porción específica del RNAr de Neisseria
gonorrhoeae, o la secuencia de nucleótidos del ADNr o su
complemento. Debido a estos oligonucleótidos de amplificación, se
derivan oligonucleótidos auxiliares y sondas para ensayo de
hibridación, a partir del ARNr de Neisseria gonorrhoeae
patogénica, se obtiene un ensayo de detección superior debido al
nivel más alto de ARN expresado a partir de esos genes de ARNr y a
la falta de transferencia lateral de las secuencias de ARNr entre
organismos.
Los oligonucleótidos de amplificación y las
sondas para ensayo de hibridación de oligonucleótidos funcionan
mediante la hibridación a las secuencias génicas diana del ARNr y/o
ADNr de 16S y 23S de la Neisseria gonorrhoeae en condiciones
restrictivas del ensayo de hibridación. En versiones preferidas, las
sondas y los oligonucleótidos de amplificación descritos en la
presente, cuando se emplean juntos, pueden distinguir la
Neisseria gonorrhoeae de otros microorganismos encontrados
en muestras clínicas tales como sangre o tejidos. En consecuencia,
los oligonucleótidos de amplificación y las sondas para ensayo de
hibridación pueden emplearse en un ensayo para detectar
específicamente y/o amplificar los ácidos nucleicos derivados de la
Neisseria gonorrhoeae. En versiones preferidas, las sondas
para ensayo de hibridación descritas en la presente son capaces de
hibridar selectivamente con ácidos nucleicos de la Neisseria
gonorrhoeae y no con los derivados de la Neisseria
meningitidis en condiciones restrictivas de hibridación. En
algunas versiones de la presente invención, la sonda para ensayo de
hibridación comprende un oligonucleótido que contiene un grupo
informador tal como un éster de acridinio o un radioisótopo para
ayudar a la hibridación de identificación de la sonda con su
secuencia diana. En algunas versiones de la presente invención el
oligonucleótido de amplificación tiene opcionalmente una secuencia
de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa, o que potencia
la iniciación de la transcripción, mediante una ARN polimerasa.
La presente invención se refiere también a
sondas para ensayo de hibridación, útiles para la detección de los
ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae. De preferencia,
estas sondas para los ensayos de hibridación tienen una secuencia
de nucleótidos seleccionada de una de las siguientes secuencias de
nucleótidos:
De preferencia, los oligonucleótidos auxiliares
se emplean para facilitar la hibridación específica de la sonda de
ensayo con su ácido nucleico diana; los oligonucleótidos auxiliares
están descritos por Hogan y Milliman en la patente U.S. nº
5.030.557. Los oligonucleótidos empleados como sondas auxiliares en
esta invención incluyen las siguientes secuencias:
Otro aspecto de la presente invención comprende
las composiciones de acuerdo con las reivindicaciones
32-33, para la detección de la Neisseria
gonorrhoeae que son híbridos de ácido nucleico formados entre un
oligonucleótido de la presente invención y una región específica de
un polímero nucleótido de una Neisseria gonorrhoeae.
Generalmente el polímero de nucleótidos contiene una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a una secuencia de
oligonucleótidos de la presente invención o su complemento y se
deriva del ARNr ó el ADNr que codifica el ARN ribosómico de la
Neisseria gonorrhoeae. Los oligonucleótidos presentes en
estas composiciones pueden ser el juego de oligonucleótidos de
amplificación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y
dicha sonda del ensayo de hibridación de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 28. Estas composiciones podrían comprender
además un oligonucleótido auxiliar de una cualquiera de las
reivindicaciones 29 a 31.
Las composiciones de la presente invención que
contienen una sonda hibridada con su secuencia diana son útiles
para la detección de la presencia de una secuencia de ácido
nucleico. Las composiciones de la presente invención que contienen
un oligonucleótido auxiliar hibridado con su secuencia de ácido
nucleico diana, son de utilidad para construir una porción
particular del ácido nucleico diana capaz para la hibridación. Las
composiciones de la presente invención que contienen un cebador
oligonucleótido hibridado con su secuencia diana, son útiles para
la creación de un sitio de iniciación para una polimerasa en el
extremo 3' del cebador, y/o la provisión de un molde para la
extensión del extremo 3' de la secuencia diana.
La presente invención contempla además, métodos
para la detección de la presencia de la Neisseria gonorrhoeae
de acuerdo con las reivindicaciones 34-37. En estos
métodos, una muestra de ensayo se pone en contacto con una sonda
para ensayos de hibridación de ácido nucleico, en condiciones de
ensayo de hibridación restrictivas, en donde la sonda para ensayos
de hibridación del ácido nucleico es capaz de hibridar con las
secuencias de ácido nucleico diana de la Neisseria
gonorrhoeae, y no con las secuencias de ácido nucleico de la
Neisseria meningitidis. La presente invención contempla
también los oligonucleótidos y los equivalentes de los mismos
empleados en estos métodos que opcionalmente contienen una molécula
informadora que ayuda a la identificación de la hibridación de la
sonda con su secuencia diana. Esta invención es útil para la
detección de la presencia de los ácidos nucleicos de la
Neisseria gonorrhoeae en las muestras de ensayo de humanos,
tales como sangre, muestras derivadas de la sangre, tejidos,
muestras derivadas de tejidos, otros fluidos corporales y muestras
corporales.
La presente invención comprende también métodos
para la detección de la presencia de la Neisseria gonorrhoeae
en la cual el ácido nucleico se amplifica empleando por lo menos un
oligonucleótido de amplificación de la presente invención. En
versiones preferidas, dicha amplificación es seguida a continuación
por un paso de detección en el cual el ácido nucleico amplificado
se detecta empleando una sonda para ensayo de hibridación de
oligonucleótidos de la presente invención. Los métodos de la
presente invención comprenden también el empleo de oligonucleótidos
de amplificación que incluyen la secuencia de nucleótidos para un
promotor de ARN.
En otro aspecto, la invención se refiere a
oligonucleótidos de amplificación útiles para la detección de
organismos de la especie Neisseria gonorrhoeae por medio de
un ensayo de amplificación. Estos oligómeros de preferencia,
corresponden substancialmente a una de las siguientes secuencias de
nucleótidos:
en donde el oligómero puede estar
sin modificar o contiene una modificación tal como la adición de una
secuencia de ácido nucleico específico en el terminal 5' que es
reconocida mediante una ARN polimerasa, (incluyendo pero sin
limitarlo a la secuencia promotora para la T7, T3 ó SP6 ARN
polimerasa), y/o secuencias que potencian la iniciación de la
transcripción del ARN mediante una ARN polimerasa. Un ejemplo de una
secuencia promotora incluye la secuencia SEQ ID NO: 53
5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'.
Otros ejemplos de secuencias promotoras útiles están contenidas en
varios vectores comercialmente disponibles incluyendo por ejemplo
los vectores pBluescript® de Stratagene Cloning Systems (San Diego,
CA) ó los vectores pGEM® de Promega Corp. (Madison,
WI).
En otro aspecto de la presente invención, los
nucleótidos de amplificación se unen a, o causan un alargamiento a
través de las secuencias que substancialmente corresponden a las
siguientes secuencias:
Otro aspecto de la presente invención incluye
kits de acuerdo con las reivindicaciones 16-31, que
contienen uno o más de los oligonucleótidos de la presente
invención incluyendo los oligonucleótidos de amplificación, los
oligonucleótidos auxiliares y las sondas del ensayo de hibridación.
En versiones preferidas, un kit de la presente invención incluye
por lo menos un oligonucleótido de amplificación y una sonda de
ensayo de hibridación capaz de distinguir la Neisseria
gonorrhoeae de otros microorganismos.
Descripciones antecedentes del empleo de la
hibridación de ácido nucleico para detectar secuencias de ácido
nucleico particulares, vienen dadas en Kohne, U.S. patente nº
4.851.330 publicada el 25 Julio 1989 y por Hogan et al.,
solicitud de patente internacional nº PCT/US87/03009 titulada
"Nucleic Acid Probes for Detection and/or Quantitation of
Non-Viral Organisms" ("Sondas de ácido nucleico
para la detección y/o cuantificación de organismos no víricos").
Hogan et al., supra, describen métodos para la determinación
de la presencia de un organismo no vírico o un grupo de organismos
no víricos en una muestra (p. ej., un esputo, orina, sangre y
secciones de tejidos, alimentos, suelo y
agua).
agua).
En las versiones más preferidas, las
composiciones, sondas, cebadores de amplificación, oligonucleótidos
auxiliares y similares tienen una secuencia de nucleótidos que
consiste en la secuencia de ácido nucleico especificada, más bien
que los substancialmente correspondientes a la secuencia de ácido
nucleico. Estas versiones más preferidas emplean las secuencias
referidas en las reivindicaciones y relacionadas en el listado de
secuencias que forma parte de la presente descripción.
Los siguientes términos tienen los significados
indicados en la especificación a no ser que expresamente se indique
un significado distinto.
Por "ácido nucleico diana" se entiende un
ácido nucleico que tiene una secuencia diana de nucleótidos.
Por "oligonucleótido" se entiende un
polímero de nucleótidos monocatenarios construido con más de 2
subunidades de nucleótido covalentemente unidas entre sí. De
preferencia, se encuentran presentes entre 10 y 100 unidades de
nucleótido, y con más preferencia entre 12 y 50 unidades de
nucleótido están unidas entre sí. Los grupos azúcar de las
subunidades de nucleótido pueden ser ribosa, desoxirribosa o
derivados modificados de los mismos tales como la
2'-O-metil ribosa. Las subunidades
nucleótido de un oligonucleótido pueden unirse mediante uniones
fosfodiéster, uniones fosforotioato, uniones metil fosfonato o
mediante otras uniones raras o que no se encuentran en la
naturaleza, que no impiden la hibridación del oligonucleótido.
Además, un oligonucleótido puede tener nucleótidos no comunes o
grupos de no nucleótidos. Un oligonucleótido como se ha definido en
la presente es un ácido nucleico, preferiblemente de ADN pero puede
ser de ARN ó tener una combinación de ribo- y desoxirribonucleótidos
covalentemente unidos. Las sondas de oligonucleótidos y
oligonucleótidos de amplificación de una secuencia definida pueden
obtenerse por técnicas ya conocidas por los expertos en la
especialidad, como por ejemplo, mediante síntesis química o
bioquímica, y mediante la expresión in vitro o in vivo
de moléculas de ácido nucleico recombinantes, p. ej., vectores
bacterianos o retrovíricos. Como se ha pretendido en esta
descripción, un oligonucleótido no consiste en un ADN cromosómico
de tipo salvaje ó la transcripción in vivo de productos del
mismo. Un empleo de una sonda es como sonda para ensayos de
hibridación; las sondas pueden emplearse también como oligómeros
terapéuticos de amplificación in vivo o in vitro, o
agentes antisentido para bloquear o inhibir la transcripción de
genes, o la traducción en células enfermas, infectadas o
patogénicas.
Por "secuencia diana de ácidos nucleicos"
"secuencia de nucleótidos diana" ó "secuencia diana" se
entiende una secuencia específica de desoxirribonucleótidos o
ribonucleótidos, la cual comprende toda o parte de la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácido nucleico monocatenario, y la
secuencia complementaria de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos
del mismo.
La hibridación del ácido nucleico es el proceso
mediante el cual dos cadenas de ácido nucleico que tienen completa
o parcialmente las secuencias de nucleótidos complementarias, se
encuentran juntamente en predeterminadas condiciones de reacción
para formar un híbrido estable de doble cadena con puentes
específicos de hidrógeno. O bien la cadena de ácido nucleico puede
ser un ácido desoxirribonucleico (ADN) ó un ácido ribonucleico (ARN)
o un análogo de uno de estos ácidos nucleicos; así, la hibridación
puede implicar híbridos ARN:ARN, híbridos ADN:ADN, ó híbridos
ARN:ADN.
El término "hibridación" como se emplea en
esta solicitud, se refiere a la capacidad de dos cadenas simples de
ácido nucleico completa o parcialmente complementarias, de
encontrarse juntamente entre sí en una orientación antiparalela
para formar una estructura estable que tiene una región de doble
cadena. Las dos cadenas constituyentes de esta estructura
bicatenaria, a veces llamada un híbrido, se sostienen entre sí
mediante puentes de hidrógeno. Aunque estos puentes de hidrógeno se
forman más corrientemente entre nucleótidos que contienen las bases
adenina y timina o uracilo (A y T ó U) ó citosina y guanina (C y G)
sobre cadenas simples de ácido nucleico, se pueden formar pares de
bases entre bases que no son miembros de estos pares
"canónicos". Pares de base no-canónicos son
bien conocidos en la especialidad. Ver p. ej., The Biochemistry
of the Nucleic Acids (``Bioquímica de los ácidos nucleicos)
(Adams et al., eds., 1992).
Condiciones "restrictivas" del ensayo de
hibridación quiere decir condiciones en donde una sonda específica
del ensayo de hibridación es capaz de hibridar con ácidos nucleicos
diana (de preferencia ARNr ó ADNr de una Neisseria
gonorrhoeae) de preferencia a otros ácidos nucleicos presentes
en la muestra del ensayo, derivados bien sea de otros
microorganismos o de humanos. Debe tenerse en cuenta que estas
condiciones pueden variar en función de factores que incluyen el
contenido de GC y la longitud de la sonda, la temperatura de
hibridación, la composición del reactivo o solución de hibridación
y el grado de especificidad de hibridación buscado. Las condiciones
restrictivas específicas de hibridación se describen más
adelante.
Como ejemplo de condiciones restrictivas
específicas de hibridación útiles en la detección de la
Neisseria gonorrhoeae para las sondas del ensayo de
hibridación de esta invención, se empleó un conjunto de condiciones
restrictivas preferidas del ensayo de hibridación. Un conjunto
preferido comprende la hibridación del ácido nucleico diana y la
sonda de hibridación juntos en 100 \mul de succinato de litio 0,5
M (pH 5,0) LiCl 6 M, 1% (p/v) de lauril sulfato de litio, (L.L.S.)
10 mM de ácido etilen diamina tetracético (EDTA), 10 mM de
etilenglicol bis (beta-amino etil éter), ácido N,N,
N',N'-tetracético (EGTA) a 60ºC durante 15 minutos,
a continuación añadiendo 300 \mul de tetraborato de sodio 0,15 M
(pH 8,5), 1% (v/v) de TRITON® X-100 a 60ºC durante
5-7 minutos. Pueden determinarse otros conjuntos de
condiciones restrictivas de hibridacón adicionales después de la
lectura de la presente descripción por los normalmente expertos en
la técnica.
\newpage
Por "sonda" se entiende un oligonucleótido
monocatenario que tiene una secuencia parcial o completamente
complementaria a una secuencia de ácido nucleico que se busca para
ser detectada, de forma que se hibrida a la misma en condiciones
restrictivas de hibridación. El término "sonda" se entiende que
excluye los ácidos nucleicos que existen normalmente en la
naturaleza. Las sondas de oligonucleótidos purificadas pueden
obtenerse mediante técnicas ya conocidas en la especialidad tales
como síntesis química y mediante la expresión in vitro o
in vivo de moléculas recombinantes de ácido nucleico, p.
ej., vectores retrovíricos. De preferencia, las sondas tiene de
10 a 100 nucleótidos de longitud. Las sondas pueden tener o no,
regiones que no son complementarias con una secuencia diana, siempre
que dichas secuencias no afecten substancialmente la hibridación en
las condiciones restrictivas de hibridación. Si dichas regiones
existen, pueden contener una secuencia promotora 5' y/o un sitio de
unión para la transcripción de ARN, un sitio de reconocimiento de
la endonucleasa de restricción, o pueden contener secuencias que
pueden conferir una estructura secundaria o terciaria deseada,
tales como un sitio catalítico activo o una estructura de horquilla
de cabello sobre la sonda, sobre el ácido nucleico diana o ambos.
Una sonda puede marcarse con un grupo informador como p. ej., un
radioisótopo, un grupo fluorescente o quimioluminiscente, con una
enzima o ligando, el cual puede emplearse para la detección o
confirmación de que la sonda ha hibridado con la secuencia
diana.
Como se emplea en esta descripción, la frase
"una sonda (o un oligonucleótido) que tenga una secuencia de
ácido nucleico consistiendo esencialmente en una secuencia
seleccionada de" un grupo de secuencias específicas significa
que la sonda, como una característica básica y nueva, es capaz de
hibridar establemente con un ácido nucleico que tiene el
complemento exacto de una de las secuencias listadas del grupo del
ácido nucleico, en condiciones restrictivas de hibridación. Un
complemento exacto incluye la correspondiente secuencia de ADN ó
ARN.
La frase "substancialmente correspondiente a
una secuencia de ácido nucleico" significa que el ácido nucleico
al que se refiere, es suficientemente similar a la secuencia de
ácido nucleico para que el ácido nucleico de referencia tenga unas
propiedades similares de hibridación con la secuencia de ácido
nucleico en el que hibridaría con la misma secuencia de ácido
nucleico diana en condiciones restrictivas de hibridación.
Un experto en la técnica comprenderá que las
sondas y cebadores de la invención substancialmente
correspondientes, pueden variar con referencia a la secuencia y
todavía hibridar con la misma secuencia de ácido nucleico diana.
Esta variación del ácido nucleico puede establecerse en términos de
un porcentaje de bases idénticas dentro de la secuencia o el
porcentaje de bases perfectamente complementarias entre la sonda o
el cebador y su secuencia diana. Un experto en la técnica
comprenderá también que esta variación podría ser expresada como el
número de bases en una sonda o cebador o el número de bases
desajustadas de una sonda que no híbrida con la base
correspondiente de una secuencia del ácido nucleico diana. Las
sondas o cebadores de la presente invención corresponden
substancialmente a una secuencia de ácido nucleico si estos
porcentajes son del 100% al 80% ó de 0 desajustes de bases en una
secuencia diana de 10 nucleótidos a 2 desajustes de bases en una
secuencia diana de 10 nucleótidos.
En versiones preferidas, el porcentaje es del
100% al 85%. En versiones más preferidas, este porcentaje es del
90% al 100%; y en otras versiones preferidas, este porcentaje es del
95% al 100%. Un experto en la especialidad comprenderá las varias
modificaciones a las condiciones de hibridación que puede ser
necesario introducir en porcentajes varios de complementariedad,
para lograr la hibridación con una secuencia diana específica sin
causar un inaceptable nivel de hibridación no específica.
Por "híbrido de ácido nucleico" o
"híbrido" se entiende una estructura de ácido nucleico que
contiene una región de doble cadena unida con hidrógeno, de
preferencia entre 10 y 100 nucleótidos de longitud, con la mayor
preferencia entre aproximadamente 12 y 50 nucleótidos de longitud,
en donde cada cadena es complementaria a la otra y en donde la
región es suficientemente estable en las condiciones restrictivas de
hibridación, para ser detectada por medios que incluyen pero no
están limitados a la detección por luz de quimioluminiscencia o
fluorescencia, autorradiografía, o electroforesis sobre gel. Estos
híbridos pueden comprender moléculas dúplex ARN:ARN, ARN:ADN, ó
ADN:ADN o moléculas dúplex que contienen análogos de estos ácidos
nucleicos.
Por "complementario" se entiende que las
secuencias de nucleótidos de regiones similares de dos ácidos
nucleicos monocatenarios, o dos diferentes regiones del mismo ácido
nucleico monocatenario tienen una composición de bases nucleótidas
que permite que las cadenas simples hibriden juntamente en una
región estable de doble cadena unidas por hidrógenos en condiciones
restrictivas de hibridación. Cuando una secuencia contigua de
nucleótidos de una región monocatenaria es capaz de formar una
serie de pares de bases canónicas unidas por hidrógenos, con una
secuencia análoga de nucleótidos de la otra región monocatenaria de
manera que A se empareja con U ó T y C se empareja con G, las
secuencias de nucleótidos son "perfectamente"
complementarias.
Por "variantes conservadoramente
modificadas" se entienden ácidos nucleicos u oligonucleótidos que
tienen una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una
región de ácido nucleico de otro ácido nucleico, siendo a su vez
dicha región perfectamente complementaria con un ácido nucleico de
referencia. Estas variantes conservadoramente modificadas son
capaces de hibridar establemente con una región diana de ácido
nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la Neisseria
gonorrhoeae en condiciones restrictivas de hibridación.
Por "oligonucleótido de amplificación" se
entiende un oligonucleótido capaz de hibridar con una secuencia
diana de ácido nucleico y actuar como cebador para la síntesis de
ácido nucleico o como molde promotor (p. ej., para la
síntesis de una cadena complementaria, formando con ello una
secuencia promotora funcional), o ambos, para la iniciación de la
síntesis del ácido nucleico. Si el oligonucleótido de amplificación
se diseña para iniciar la síntesis del ARN, el oligonucleótido
puede contener secuencias de nucleótidos que son
no-complementarias respecto a la secuencia diana,
pero son reconocidas por una ARN-polimerasa (tal
como T7, T3 y SP6 ARN polimerasa). Un oligonucleótido de
amplificación puede tener o no, un termino 3' que se modifica para
evitar o disminuir la cantidad de extensión del cebador. Un
oligonucleótido de amplificación como se ha definido en la presente
tendrá de preferencia entre 10 y 100 nucleótidos de longitud, con
más preferencia, entre aproximadamente 12 y 50 nucleótidos de
longitud. Los olignucleótidos de amplificación de la presente
invención son químicamente sintetizados o derivados de un vector,
cuando dichos oligonucleótidos son ácidos nucleicos que no se
encuentran en la naturaleza.
Por "amplificación del ácido nucleico" o
"amplificación diana" se entiende el aumento del número de
moléculas de ácido nucleico que tienen por lo menos una secuencia
del ácido nucleico diana.
Por "antisentido" o "sentido negativo"
se entiende que tiene una secuencia nucleica complementaria a la de
una secuencia de ácido nucleico de referencia.
Por "sentido", "mismo sentido" ó
"sentido positivo" se entiende que tiene una secuencia de ácido
nucleico análoga a la de una secuencia de ácidos nucleicos de
referencia.
Por "oligonucleótido auxiliar" se entiende
una sonda de ácido nucleico diseñada para hibridar con el ácido
nucleico diana en diferentes locus que los de una sonda marcada, con
lo cual aumenta la velocidad de hibridación de la sonda marcada,
aumenta la temperatura de fusión (T_{m}) del híbrido diana:sonda
marcada, o ambas.
"Intimamente filogenéticamente relacionado"
significa que los organismos están estrechamente relacionados entre
sí en un sentido evolutivo y por lo tanto tendrían una mayor
homología total de la secuencia de ácido nucleico, que los
organismos que están más lejanamente relacionados. Los organismos
que ocupan posiciones adyacentes y posiciones próximas a las
adyacentes en el árbol filogenético están estrechamente
relacionados. Los organismos que ocupan posiciones más lejanas que
las adyacentes o próximas a las posiciones adyacentes en el árbol
filogenético estarán todavía estrechamente relacionadas si tienen
una significativa homología de la secuencia total del ácido
nucleico.
Las condiciones de la reacción de hibridación,
con mayor importancia la temperatura de hibridación y la
concentración de sal en la solución de hibridación, pueden
seleccionarse para permitir que los oligonucleótidos de
amplificación o las sondas de hibridación de la presente invención
hibriden de preferencia con los ácidos nucleicos que tienen una
secuencia diana de nucleótidos de Neisseria gonorrhoeae, y no
con otros ácidos nucleicos no diana que se sospecha están presentes
en la muestra de ensayo. A concentraciones decrecientes de sal y/o
temperaturas crecientes (a saber, una restrictividad creciente) la
extensión de la hibridación del ácido nucleico disminuye a medida
que los puentes de hidrógeno entre bases de nucleótidos aparejadas
en la molécula híbrida de doble cadena, se rompen; este proceso
recibe el nombre de "fusión".
Hablando en general, los híbridos más estables
son aquellos que tienen el mayor número de contiguos perfectamente
emparejados (es decir, pares de bases de nucleótidos unidas por
puentes de hidrógenos). Así, cabría esperar normalmente que dichos
híbridos fueran los últimos en fundir cuando la restrictividad de
las condiciones de hibridación aumente. Sin embargo, una región de
ácido nucleico de doble cadena que contenga un par o más de bases
desparejadas, "no canónicas", o imperfectas (dando como
resultado un par de bases débil o no existente en aquella posición
en la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico) puede ser
todavía lo suficientemente estable en las condiciones de una
restrictividad relativamente alta, para permitir que el híbrido de
ácido nucleico sea detectado en un ensayo de hibridación sin
reacción cruzada con otros ácidos nucleicos no seleccionados,
presentes en la muestra de ensayo.
Por lo tanto, en función del grado de
similaridad entre las secuencias de nucleótidos del ácido nucleico
diana y aquellos ácidos nucleicos no diana pertenecientes al
organismo filogenéticamente diferente, pero estrechamente
relacionado, por un lado, y el grado de complementariedad entre las
secuencias de nucleótidos de un particular oligonucleótido de
amplificación o sonda de hibridación y aquellos ácidos nucleico
diana y no-diana por otro lado, uno o más
desparejamientos no estorban necesariamente la capacidad del
oligonucleótido de hibridar con dicho ácido nucleico y no con los
ácidos nucleicos no-diana.
Las sondas para ensayo de hibridación de la
presente invención fueron escogidas, seleccionadas y/o diseñadas
para maximizar la diferencia entre las temperaturas de fusión del
híbrido sonda:diana (T_{m}, definida como la temperatura a la
cual la mitad de las moléculas potencialmente de doble cadena en una
mezcla de reacción dada, están en un estado desnaturalizado
monocatenario), y la T_{m} de un híbrido desparejado formado entre
la sonda y el ARNr ó ADNr del organismo filogenéticamente más
estrechamente relacionado, que se esperaba estuviera presente en la
muestra de ensayo, pero que no era buscado para su
detección.
Mientras los oligonucleótidos de amplificación
no marcados y los oligonucleótidos auxiliares no necesitan tener
este extremadamente alto grado de especificidad, como es el caso de
la sonda de ensayo de hibridación marcada para ser útil en la
presente invención, son diseñados de manera similar para hibridar de
preferencia con uno o más ácidos nucleicos diana más que con otros
ácidos nucleicos.
Se diseñaron sondas específicas para la
Neisseria meningitidis, empleando secuencias determinadas en
áreas prospectivas diana empleando cebadores complementarios a los
ARNr de 16S de cepas de Neisseria incluyendo la
Neisseria gonorrhoeae (ATCC nº 19424), Neisseria meningitidis serogrupo A (ATCC nº 13077), serogrupo C (ATCC nº 23248) y serogrupo L (ATCC nº 43828), aislados clínicos de Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica (ATCC NO. 29193), Neisseria cinerea (ATCC NO. 14685), Neisseria mucosa (ATCC NO. 19696, Neisseria sicca (ATCC NO. 29193) y Kingella kingae (ATCC No. 23330). La secuencia de ácido nucleico de vecinos filogenéticamente próximos, incluyendo la secuencia publicada de Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375, Rossau et al., Nuc. Acids Res. 16:6227 se emplearon también como comparaciones con las secuencias de ácido nucleico de Neisseria meningitidis para determinar las regiones variables.
Neisseria gonorrhoeae (ATCC nº 19424), Neisseria meningitidis serogrupo A (ATCC nº 13077), serogrupo C (ATCC nº 23248) y serogrupo L (ATCC nº 43828), aislados clínicos de Neisseria meningitidis, Neisseria lactamica (ATCC NO. 29193), Neisseria cinerea (ATCC NO. 14685), Neisseria mucosa (ATCC NO. 19696, Neisseria sicca (ATCC NO. 29193) y Kingella kingae (ATCC No. 23330). La secuencia de ácido nucleico de vecinos filogenéticamente próximos, incluyendo la secuencia publicada de Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375, Rossau et al., Nuc. Acids Res. 16:6227 se emplearon también como comparaciones con las secuencias de ácido nucleico de Neisseria meningitidis para determinar las regiones variables.
Para facilitar la identificación de las
secuencias de ácido nucleico para emplear como sondas y
oligonucleótidos de amplificación, las secuencias de nucleótidos de
diferentes especies de organismos fueron alineadas en primer lugar
para maximizar la homología. Dentro de la molécula de ARNr existe
una estrecha relación entre la estructura global y la función. Esto
impone restricciones sobre los cambios evolutivos en la secuencia
primaria de manera que la estructura secundaria se mantiene. Por
ejemplo, si se cambia una base en un lado de la hélice, puede
producirse evolutivamente un cambio compensatorio en el otro lado
para preservar la complementariedad (lo cual recibe el nombre de
co-variancia). Esto permite que dos secuencias muy
diferentes se alineen empleando la secuencia primaria conservada y
también los elementos de la estructura secundaria conservada, como
puntos de referencia. Se identificaron las secuencias diana
potenciales para las sondas de hibridación mediante las variaciones
registradas en la homología de las secuencias alineadas en ciertas
regiones discretas (regiones variables) de las secuencias de ARNr y
ADNr.
La evolución de la secuencia en cada una de las
regiones variables es en su mayor parte, divergente. A causa de la
divergencia, las especies filogenéticamente relacionadas más
distantes de Neisseria meningitidis ó Neisseria
gonorrhoeae tienden a mostrar una variabilidad mayor en una
región variable dada, más que en las especies filogenéticamente
relacionadas más próximas. La suficiente variación observada entre
las especies de Neisseria meningitidis y la Neisseria
gonorrhoeae, se ha empleado para identificar sitios diana
preferidos y sondas de diseño útiles.
Hemos identificado secuencias que varían entre
Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, entre
éstas y otras especies de Neisseria, y entre miembros del
género Neisseria y otros organismos mediante análisis
comparativo de las secuencias de ARNr publicadas en la literatura o
determinadas en el laboratorio. Los ordenadores y los programas de
ordenador que pueden emplearse o adaptarse para la finalidad
descrita, están comercialmente disponibles. Hemos visto la
suficiente diferencia entre los organismos diana y el organismo
filogenéticamente más estrechamente relacionado, con probabilidad
de ser encontrado en la misma muestra para diseñar las actuales
sondas. Las cepas de Neisseria meningitidis han sido
clasificadas en tres grupos de secuencias en la región de la sonda
representada por los serogrupos A, C y L.
La mera identificación de las secuencias de
nucleótidos diana supuestamente único potencial, no garantiza que
pueda obtenerse una sonda de ensayo de hibridación funcionalmente
específica de una especie para hibridar con el ARNr ó ADNr de
Neisseria que comprende dicha secuencia. Otros varios
factores determinarán la idoneidad de un locus de ácido nucleico
como un sitio diana para sondas específicas de una especie. A causa
de que la extensión y especificidad de las reacciones de
hibridación tales como las descritas en la presente, están
afectadas por un número de factores, la manipulación de uno o más de
estos factores determinará la exacta sensibilidad y especificidad
de un particular oligonucleótido, bien sea perfectamente
complementario a su diana o no. La importancia y efecto de varias
condiciones del ensayo son ya conocidos por los expertos en la
técnica como se describe en Hogan et al., PCT/US87/03009, y
Hogan y Hammond, patente U.S. nº 5.216.143, y Kohne, patente U.S.
nº 4.851.330 las cuales comparten la misma asignación que la
presente solicitud.
La temperatura deseada de hibridación y la
composición de la solución de hibridación (tal como concentración
de sal, detergentes y otros solutos) pueden también afectar
grandemente la estabilidad de los híbridos de doble cadena. Las
condiciones tales como la fuerza iónica y la temperatura a la cual
la sonda podrá hibridar con la diana debe tenerse en cuenta en la
construcción de una sonda específica de un grupo o de una especie.
La estabilidad térmica de los ácidos nucleicos del híbrido aumenta
generalmente con la fuerza iónica de la mezcla de reacción. Por
otro lado, los reactivos químicos que rompen los puentes de
hidrógeno, tales como la formamida, urea, dimetil sulfóxido y
alcoholes, pueden reducir grandemente la estabilidad térmica de los
híbridos.
Para maximizar la especificidad de una sonda
para su diana, las sondas objeto de la presente invención fueron
diseñadas para hibridar con sus dianas en condiciones de alta
restrictividad. En dichas condiciones, solamente hibridarán entre
sí, las cadenas simples de ácido nucleico con un alto grado de
complementariedad, y las cadenas simples de ácido nucleico sin este
alto grado de complementariedad no formarán híbridos. En
consecuencia la restrictividad de las condiciones del ensayo
determina la cantidad de complementariedad que debería existir
entre dos cadenas de ácido nucleico con el fin de formar un híbrido.
La restrictividad se escoge para maximizar la diferencia de
estabilidad entre el híbrido formado entre la sonda y el ácido
nucleico diana y los híbridos potenciales entre la sonda y
cualesquiera ácidos nucleicos no diana, presentes.
La especificidad apropiada puede lograrse
minimizando la longitud de la sonda que tiene una perfecta
complementariedad con las secuencia de organismos no diana,
evitando las regiones ricas en G y C de homología con secuencias no
diana, y construyendo la sonda de forma que tenga tantos
desapareamientos desestabilizantes con secuencias no diana como sea
posible. El que una secuencia de sonda sea útil para detectar
solamente un tipo específico de organismo, depende en gran manera
de la diferencia de estabilidad térmica entre los híbridos
sonda:diana frente a potenciales híbridos sonda:no diana. En sondas
de diseño, las diferencias en los valores T_{m} entre estos
híbridos deberían ser tan grandes como fuera posible (de preferencia
aproximadamente 5ºC ó más). La manipulación de la T_{m} puede
lograrse mediante cambios de la longitud de la sonda y de la
composición de la sonda (contenido GC frente a contenido AT).
En general, la temperatura de hibridación óptima
para sondas de oligonucleótidos de aproximadamente
10-50 nucleótidos de longitud es aproximadamente
5ºC por debajo de la temperatura de fusión de un dúplex dado. La
incubación a temperaturas por debajo de la temperatura óptima puede
permitir que secuencias de bases desparejadas hibriden y por lo
tanto pueda decrecer la especificidad. Cuanto más larga es la sonda
más puentes de hidrógeno entre pares de bases y, en general, una
T_{m} más alto. Aumentando el porcentaje de G y C aumenta también
la T_{m} debido a que el par de bases G-C presenta
un puente de hidrógeno adicional y por lo tanto mayor estabilidad
térmica que los pares de bases A-T.
Un método preferido para determinar la T_{m}
consiste en medir la hibridación empleando un Ensayo de Protección
de la Hibridación (HPA) de acuerdo con Arnold et al., patente
U.S. Nº 5.283.174, la cual disfruta la propiedad exclusiva junto
con la presente aplicación. La T_{m} puede medirse empleando el
HPA de la siguiente manera. Se forma un híbrido sonda:diana en
solución tamponada de succinato de litio (tampón de succinato de
litio 0,1 M, pH 5,0, ácido etilendiamin-tetracético
(EDTA) 2 mM, de ácido
etilenglicol-bis(\beta-amino-etil-éter)-N,N,N',N'-tetracético
(EGTA), 10% (p/v) de laurilsulfato de litio) empleando una cantidad
en exceso de diana. A continuación se diluyen alícuotas del híbrido
en la solución tamponada de succinato de litio y se incuba durante
cinco minutos a varias temperaturas partiendo por debajo de la
T_{m} anticipada, por ejemplo 55ºC, e incrementando en
incrementos de 2-5ºC. Esta solución se diluye a
continuación, con una solución de tampón de borato alcalino suave
(tetraborato de sodio 0,15 M, pH 7,6, 5% (p/v) de TRITON®
X-100) y se incuba a una temperatura inferior (por
ejemplo 50ºC) durante diez minutos. En estas condiciones el éster de
acridinio unido a la sonda monocatenaria se hidroliza mientras el
éster de acridinio unido a la sonda hibridada está relativamente
protegido de la hidrólisis. Así la cantidad de éster de acridinio
que permanece es proporcional a la cantidad de híbrido y puede
medirse por la quimioluminiscencia producida por el éster de
acridinio después de la adición de peróxido de hidrógeno seguido de
álcali. La quimioluminiscencia puede medirse en un luminómetro (p.
ej., GenProbe LEADER® I ó LEADER® 50). Los datos resultantes se
representan en una gráfica como tanto por ciento de la señal máxima
(habitualmente de la temperatura más baja) frente a la temperatura.
La T_{m} se define como la temperatura a la cual se mantiene el
50% de la señal máxima. Además del método de más arriba, la T_{m}
puede
determinarse mediante métodos isotópicos ya bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., Hogan et al., supra).
determinarse mediante métodos isotópicos ya bien conocidos por los expertos en la técnica (p. ej., Hogan et al., supra).
Debe tenerse en cuenta, que la T_{m} para un
híbrido dado, varía en función de la solución de hibridación dada.
Factores como la concentración de sal, detergentes, y otros solutos
pueden afectar la estabilidad del híbrido durante la
desnaturalización térmica (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis,
2 Molecular Cloning ("Clonación molecular"), ch. 11 (2ª
ed. 1989)). En la construcción de una sonda deben tenerse en cuenta
las condiciones tales como la fuerza iónica y la temperatura de
incubación, bajo las cuales la sonda se empleará para hibridar con
la diana. Por otro lado, los reactivos químicos que rompen los
puentes de hidrógeno tales como la formamida, urea,
dimetilsulfóxido y alcoholes, pueden reducir en gran manera la
estabilidad térmica de los híbridos.
Para asegurar que la sonda es específica para su
diana, es deseable tener sondas que hibriden solamente en
condiciones de alta restrictividad. En condiciones de alta
restrictividad solamente se formarán híbridos de ácido nucleico
altamente complementarios; híbridos sin un suficiente grado de
complementariedad no se formarán. En consecuencia, la
restrictividad de las condiciones del ensayo determina la cantidad
de complementariedad necesaria entre dos cadenas de ácidos
nucleicos para formar un híbrido. La restrictividad se escoge para
maximizar la diferencia en estabilidad entre el híbrido formado con
la diana y otras secuencias de ácido nucleico.
La longitud de la secuencia del ácido nucleico
diana y en consecuencia, la longitud de la secuencia de la sonda
puede también ser importante. En algunos casos pueden ser varias
secuencias de una región particular, por ejemplo, una región
variable que varía en posición y longitud, lo cual produce sondas
con las características de hibridación deseada. En otros casos, una
sonda puede ser significativamente mejor que otra sonda con una
secuencia de nucleótidos que difiere en una única base. Cuando es
posible que los ácidos nucleicos que no son perfectamente
complementarios, hibriden, el tramo más largo de secuencias de bases
perfectamente homólogas, determinará generalmente la estabilidad
del híbrido, jugando también un papel la composición de los pares de
bases.
Las regiones de ARNr que forman fuertes
estructuras internas que inhiben la hibridación son regiones diana
menos preferidas por lo menos en ensayos en los cuales no se emplean
sondas auxiliares. De manera similar, los diseños de sondas que dan
por resultado una extensa autocomplementariedad deben ser evitados.
Si una de las dos cadenas está completamente o parcialmente
implicada en un híbrido intramolecular o intermolecular, será menos
capaz de participar en la formación de un nuevo híbrido
intermolecular sonda:diana. Las moléculas de ARN ribosómico son
conocidas por formar hélices intramoleculares muy estables y
estructuras secundarias mediante puentes de hidrógeno. En el diseño
de un ensayo de hibridación, una porción substancial de la secuencia
escogida como diana permanece en estado monocatenario hasta que la
hibridación con la sonda, la velocidad y extensión de la
hibridación entre la sonda y la diana puede ser aumentada en gran
manera. Una manera en la que esto puede lograrse es escogiendo como
secuencia de nucleótidos diana, una secuencia que no esté
relativamente implicada con puentes de hidrógeno intramoleculares.
Alternativa o adicionalmente, la sonda del ensayo de hibridación
puede emplearse en una mezcla de sondas con oligonucleótidos
auxiliares, lo cual puede hacer que el sitio de la sonda sea más
accesible para la hibridación con la sonda del ensayo de
hibridación.
Una diana de ADN tiene lugar en la naturaleza en
forma de doble cadena como producto de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Estas dianas de doble cadena son naturalmente
inhibidoras a la hibridación con una sonda y necesitan una
desnaturalización antes de la hibridación. Las condiciones
apropiadas de desnaturalización e hibridación son ya conocidas en
la técnica (p. ej., E. M. Southern, J. Mol. Biol.
98:503 (1975)).
Se dispone de un cierto número de fórmulas que
proporcionan una estimación de la temperatura de fusión para
emparejar perfectamente los oligonucleótidos con sus ácidos
nucleicos diana.
Una de dichas fórmulas,
T_{m} = 81,5
+ 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(fracción
G+C) –
(600/N)
(en donde N = longitud del
oligonucleótido en número de nucleótidos), proporciona una buena
estimación de la T_{m} para oligonucleótidos entre 14 y 60 ó 70
nucleótidos de longitud. A partir de dichos cálculos, la
subsiguiente verificación empírica o "fine tuning" (ajuste
fino) de la T_{m} puede hacerse empleando técnicas de screening
ya bien conocidas en la especialidad. Para más información sobre la
hibridación y sondas de oligonucleótidos véase p. ej.,
Sambrook et al., 2 Molecular Cloning: A Laboratory Manual
("Clonación molecular: un Manual de Laboratorio") (Cold
Springs Harbor Laboratory Press 1989) (en el capítulo 11). Esta
referencia, entre otras ya bien conocidas en la especialidad,
proporciona también estimaciones del efecto de los emparejamientos
sobre la T_{m} de un híbrido. Así, a partir de la secuencia de
nucleótidos conocida de una región dada del ARN ribosómico (ó ADNr)
de dos o más organismos, pueden diseñarse oligonucleótidos que
distinguirán estos organismos unos de
otros.
De preferencia, los oligonucleótidos de
amplificación de la presente invención, son oligodesoxinucleótidos
y son lo suficientemente largos para ser empleados como substrato
para la síntesis de productos de extensión mediante una polimerasa
de ácido nucleico. La longitud óptima de los cebadores debe tener en
cuenta varios factores, incluyendo la temperatura de reacción, la
estructura y composición de las bases del cebador, y cómo debe
emplearse el cebador. Por ejemplo, para la especificidad óptima el
cebador de oligonucleótidos generalmente debe contener por lo menos
aproximadamente 12 nucleótidos en función de la complejidad de la
secuencia del ácido nucleico diana. Si dicha especificidad no es
esencial, pueden emplearse cebadores más cortos; en este caso,
puede ser deseable efectuar la reacción a temperaturas más bajas con
el fin de formar complejos híbridos estables con el ácido nucleico
del molde.
Se describen en la presente pautas útiles para
el diseño de oligonucleótidos de amplificación y sondas con las
deseadas características. Nuestras mejores regiones diana de la
modalidad contienen por lo menos dos y de preferencia, tres
regiones conservadas de ácido nucleico de Neisseria
gonorrhoeae. Estas regiones tienen aproximadamente
15-350 nucleótidos de longitud, de preferencia
15-150.
El grado de amplificación observado con un juego
de cebadores o cebadores promotores depende de varios factores,
incluyendo la capacidad de los oligonucleótidos de hibridar con sus
secuencias complementarias y su capacidad de ser extendidos o
copiados enzimáticamente. Aunque pueden emplearse oligonucleótidos
de diferentes longitudes y composición de las bases, los
oligonucleótidos preferidos en esta invención tienen regiones diana
de unión de 18-40 bases con un T_{m} previsto con
la diana de aproximadamente 65ºC.
Los parámetros que afectan a la hibridación de
una sonda, tales como la T_{m}, la complementariedad y la
estructura secundaria de la secuencia diana afectan también la
hibridación del cebador y por lo tanto el rendimiento. El grado de
extensión no específica (cebador-dímero o copia no
diana) puede también afectar la eficiencia de la amplificación, por
lo tanto los cebadores se seleccionan para que tengan una baja
autocomplementariedad o complementariedad cruzada, particularmente
en los extremos 3' de la secuencia. Se evitan los tramos
homopolímeros largos y un alto contenido de GC para reducir la
falsa extensión del cebador. Existen programas de ordenador
disponibles para ayudar en este aspecto del diseño.
Una polimerasa de ácido nucleico empleada
conjuntamente con los oligonucleótidos de amplificación de la
presente invención, se refiere a un agente químico, físico o
biológico que incorpora o bien ribo o bien desoxirribonucleótidos,
o ambos, en un polímero de ácido nucleico, o una cadena, de una
manera dependiente del molde. Ejemplos de polimerasas de ácido
nucleico incluyen las ADN polimerasas dirigidas al ADN, ADN
polimerasas dirigidas al ARN, y ARN polimerasas dirigidas al ARN.
Las ADN polimerasas inducen la síntesis del ácido nucleico de manera
dependiente del molde y en una dirección 5' a 3'. Debido a la
orientación antiparalela de las dos cadenas en un ácido nucleico de
doble cadena, esta dirección es desde una región 3' del molde a una
región 5' del molde. Ejemplos de ADN polimerasas dirigidas al ADN
incluyen la ADN polimerasa I de E. coli, la ADN polimerasa
termoestable del Thermus aquaticus (Taq), y el fragmento
grande de la ADN polimerasa I del Bacillus stearothermophilus
(Bst). Ejemplos de ADN polimerasas dirigidas al ARN incluyen varias
transcriptasas inversas retrovíricas, tales como la transcriptasa
inversa del virus de la leucemia del ratón Moloney (MMLV), o la
transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis de las aves
(AMV).
Durante la mayor parte de reacciones de
amplificación del ácido nucleico, una polimerasa de ácido nucleico
añade radicales de nucleótido al extremo 3' del cebador empleando el
ácido nucleico diana como un molde, sintetizando así una segunda
cadena de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos parcial o
completamente complementaria a una región del ácido nucleico diana.
En muchas reacciones de amplificación de ácido nucleico, las dos
cadenas que comprenden la estructura bicatenaria resultante deben
separarse por medios químicos o físicos con el fin de permitir que
la reacción de amplificación tenga lugar. Alternativamente, la
cadena del molde recién sintetizada puede estar construida de
manera que esté disponible para la hibridación con un segundo
cebador o promotor-cebador mediante otros medios,
p. ej., a través de un desplazamiento o el empleo de una enzima
nucleolítica que digiere parte o toda la cadena de la diana
original. De esta manera, el proceso puede repetirse durante un
número de ciclos, dando por resultado un gran aumento del número de
moléculas de ácido nucleico que poseen la secuencia de nucleótidos
diana.
Tanto el primero como el segundo oligonucleótido
de amplificación, o ambos, pueden ser un
cebador-promotor. Dicho
cebador-promotor contiene normalmente secuencias de
nucleótidos que no son complementarias a las de la molécula de
ácido nucleico diana, o producto(s) de extensión del cebador.
Por ejemplo, Kacian y Fultz, patente U.S. nº 5.399.491 describe
varios de dichos oligonucleótidos. Estas secuencias no
complementarias pueden estar localizadas en 5' en las secuencias
complementarias del oligonucleótido de amplificación, y pueden
proporcionar un locus para la iniciación de la síntesis de ARN
cuando se efectúa en doble cadena a través de la acción de una
polimerasa de ácido nucleico. El promotor así proporcionado puede
permitir la transcripción in vitro de múltiples copias de
ARN de la secuencia de ácido nucleico diana. Se apreciará que cuando
en esta especificación se hace referencia a un cebador, se pretende
que dicha referencia incluya el aspecto de cebador de un
promotor-cebador, a no ser que el contexto de la
referencia indique claramente otra cosa.
En algunos sistemas de amplificación, por
ejemplo, el método de amplificación de Dattagupta et al.,
supra, los oligonucleótidos de amplificación puedan contener
nucleótidos no-complementarios 5', los cuales ayudan
al desplazamiento de la cadena. Además, cuando se emplea
conjuntamente con una polimerasa de ácido nucleico que tiene
actividad exonucleasa 5', los oligonucleótidos de amplificación
pueden tener modificaciones en su extremo 5' para evitar la
digestión enzimática. Alternativamente, la polimerasa de ácido
nucleico puede modificarse para eliminar la actividad 5'
exonucleasa, como p. ej., mediante tratamiento con una proteasa que
genera un fragmento de polimerasa activa sin dicha actividad de
nucleasa. En tal caso, los oligonucleótidos no necesitan ser
modificados en su extremo 5'.
Todos los oligonucleótidos de amplificación de
la presente invención pueden ser fácilmente preparados por métodos
ya conocidos en la técnica. De preferencia, los cebadores se
sintetizan empleando métodos en fase sólida. Por ejemplo,
Caruthers, et al., describe el empleo de la química estándar
en fase sólida de la fosforamidita para unir nucleótidos mediante
enlaces fosfodiéster. La síntesis química en fase sólida
automatizada empleando precursores de cianoetil fosforamidita ha
sido descrita por Barone et al., Nucleic Acids Research
("Investigación de ácidos nucleicos"), 12:405 (1984).
(Methods in Enzymology ("Métodos de Enzimología"),
volumen 143, pg. 287 (1987)). Igualmente, Bhatt describe un
procedimiento para la síntesis de oligonucleótidos conteniendo
enlaces fosforotioato. (WO92/04358, titulado "Method and Reagent
for Sulphurization of Organophosphorous Compounds" ("Método y
reactivo para la sulfurización de compuestos órganofosforados"),
el cual disfruta de la propiedad común con la presente invención).
También Klem et al., titulado "Improved Process for the
Synthesis of Oligomers" ("Procedimiento perfeccionado para la
síntesis de oligómeros"), PCT WO 92/07864, describe la síntesis
de oligonucleótidos conteniendo diferentes enlaces incluyendo
enlaces metilfosfonato. Además, los métodos para la síntesis
orgánica de oligonucleótidos son ya conocidos por los expertos en
la técnica, y están descritos en Sambrook, et al., supra.
Después de la síntesis y purificación de un
oligonucleótido particular, pueden emplearse varios diferentes
procedimientos para purificar y controlar la calidad del
oligonucleótido. Procedimientos adecuados incluyen la
electroforesis sobre gel de poliacrilamida o cromatografía líquida
de alta presión. Ambos procedimientos son ya bien conocidos por los
expertos en la técnica.
Todos los oligonucleótidos de la presente
invención, bien sean sondas de ensayo de hibridación,
oligonucleótidos de amplificación, u oligonucleótidos auxiliares,
pueden ser modificados con grupos químicos para potenciar su
rendimiento o para facilitar la caracterización de los productos de
amplificación. Por ejemplo, los oligonucleótidos modificados en su
estructura tales como los que tienen grupos fosforotioato o
metilfosfonato, los cuales convierten a los oligonucleótidos en
resistentes a la actividad nucleolítica de ciertas polimerasas o las
enzimas de nucleasa, pueden permitir el empleo de dichas enzimas en
una reacción de amplificación u otra. Otro ejemplo de modificación
implica el empleo de engarces no-nucleótidos (p.
ej., Arnold et al., "Non-Nucleotide Linking
Reagents for Nucleotide Probes" ("Reactivos
no-nucleótidos de engarce para sondas
nucleótidas"), EP 0 313 219, incorporados entre nucleótidos en
la cadena de ácido nucleico los cuales no interfieren con la
hibridación o el alargamiento del cebador. Los oligonucleótidos de
amplificación pueden contener también mezclas de los nucleótidos
deseados modificados y los nucleótidos naturales.
El extremo 3' de un oligonucleótido de
amplificación puede estar bloqueado para evitar la iniciación de la
síntesisd del ADN, como describe McDonough et al., en el
trabajo titulado "Nucleic Acid Sequence Amplification"
("Amplificación de la secuencia de un ácido nucleico"), patente
WO94/03472, la cual disfruta de la propiedad común con la presente
invención. Una mezcla de diferentes oligonucleótidos de
amplificación bloqueados en 3' ó de oligonucleótidos bloqueados y
no bloqueados en 3', puede aumentar la eficiencia de la
amplificación del ácido nucleico, como se ha descrito en la
presente.
Como se ha descrito más arriba, el extremo 5' de
los oligonucleótidos puede ser modificado para que sea resistente a
la actividad de la 5'-exonucleasa presente en
algunas polimerasas de ácido nucleico. Estas modificaciones pueden
efectuarse añadiendo un grupo no nucleótido al nucleótido terminal
5' del cebador, empleando técnicas como las descritas por Arnold,
et al., supra, en el trabajo titulado
"Non-Nucleotide Linking Reagents for Nucleotide
Probes" ("Reactivos no-nucleótidos de engarce
para sondas de nucleótidos").
Una vez sintetizadas, las sondas de
oligonucleótidos seleccionadas pueden ser marcadas por cualquiera de
los métodos ya bien conocidos (p. ej., J. Sambrook,
supra). Las marcas útiles incluyen los radioisótopos así como
también grupos informadores no-radioactivos. Las
marcas isotópicas incluyen H^{3}, S^{35}, P^{32}, I^{125},
Co^{57} y C^{14}. Las marcas isotópicas pueden introducirse en
los oligonucleótidos mediante técnicas ya conocidas en la
especialidad tales como el desplazamiento de la mella, marcado del
extremo, síntesis de la segunda cadena, el empleo de la
transcripción inversa, y mediante métodos químicos. Cuando se
emplean sondas radiomarcadas, la hibridación puede detectarse
mediante autorradiografía, contaje por centelleo, o contaje gamma.
El método de detección seleccionado dependerá del radioisótopo
particular empleado para el marcado.
Los materiales no isotópicos pueden también
emplearse para el marcado, y pueden introducirse internamente en la
secuencia del ácido nucleico o en el extremo de la secuencia del
ácido nucleico. Los nucleótidos modificados pueden ser incorporados
enzimáticamente o químicamente. Las modificaciones químicas de la
sonda pueden ser efectuadas durante o después de la síntesis de la
sonda, por ejemplo, a través del empleo de grupos de engarce
no-nucleótidos como ha descrito Arnold et al.,
supra "Non-Nucleotide Linking Reagents for
Nucleotide Probes" ("Reactivos de engarce
no-nucleótidos para sondas de nucleótidos").
Marcas no-isotópicas incluyen moléculas
fluorescentes, moléculas quimioluminiscentes, enzimas, cofactores,
substratos de enzimas, haptenos u otros ligandos.
De preferencia, las sondas se marcan con un
éster de acridinio. El marcado con éster de acridinio puede
realizarse como ha descrito Arnold et al., patente U.S. nº
5.185.439, titulada "Acridinium Ester Labeling and Purification
of Nucleotide Probes" ("Marcado con éster de acridinio y
purificación de las sondas de nucleótidos") publicada el 9
Febrero 1993.
Los oligonucleótidos de amplificación de la
presente invención están dirigidos particularmente a las secuencias
de nucleótidos del ARNr de 16S de Neisseria gonorrhoeae, o
sus contrapartidas de ADNr. Estos oligonucleótidos de amplificación
pueden flanquear, solapar o estar contenidos dentro de por lo menos
una de las secuencias diana de nucleótidos empleadas como una sonda
de ensayo de hibridación para detectar la presencia de Neisseria
gonorrhoeae en un ensayo de amplificación de ácido nucleico. Los
oligonucleótidos de amplificación descritos y reivindicados en la
presente comprenden dos juegos de oligonucleótidos de amplificación.
Los miembros del juego de oligonucleótidos de amplificación de la
presente invención son capaces de hibridar con una secuencia de
ácido nucleico diana que consiste en la secuencia de SEQ ID NO:
19,20,49,51 mientras otros oligonucleótidos descritos en la
presente son capaces de hibridar con un ácido nucleico que tiene o
que substancialmente corresponde a una de las siguientes secuencias
de nucleótidos:
En versiones preferidas estos nucleótidos de
amplificación de la presente invención comprenden la secuencia de
SEQ ID NO: 7,9,43 y 45 mientras otros oligonucleótidos de
amplificación descritos en la presente tienen, o substancialmente
corresponden a las siguientes secuencias:
Estos oligonucleótidos pueden también tener
bases adicionales no complementarias en su extremo 5' comprendiendo
una secuencia promotora capaz de unir una ARN polimerasa y dirigir
la transcripción de ARN empleando el ácido nucleico diana como un
molde. Por ejemplo, puede emplearse el promotor
| SEQ ID NO: 53 | AATTTAATAC | GACTCACTAT | AGGGAGA. |
Todos los oligonucleótidos de amplificación de
la presente invención pueden tener secuencias que no contienen
modificaciones o adiciones a estas secuencias. Los oligonucleótidos
de amplificación pueden tener también o tener alternativamente,
términos bloqueados como los términos 3' y/ó 5', ó adiciones
incluyendo pero no limitadas a la adición de una secuencia
nucleótida específica que es reconocida por una ARN polimerasa (p.
ej., la secuencia promotora para T7, T3, ó SP6 ARN polimerasa),
adición de secuencias las cuales potencian la iniciación o
alargamiento de la transcripción del ARN mediante una ARN
polimerasa, o secuencias que pueden proporcionar el emparejamiento
de bases intramoleculares y estimular la formación de estructuras
secundarias o terciarias de ácido nucleico.
Los oligonucleótidos de amplificación se emplean
en un procedimiento de amplificación de ácido nucleico tal como la
reacción en cadena de la polimerasa o una reacción de amplificación
empleando la ARN polimerasa, ADN polimerasa y ARNasa H ó su
equivalente, como describe Kacian y Fultz supra, Dattagupta
et al., supra y por Sninsky et al., patente U.S. nº
5.079.351; los dos primeros de los cuales disfrutan de la propiedad
común con la presente invención.
Una amplia variedad de métodos están disponibles
para detectar una secuencia diana amplificada. Por ejemplo, los
substratos de nucleótido o los cebadores pueden incluir una marca
detectable la cual se incorpora en el ADN recién sintetizado. El
producto de amplificación marcado resultante se separa a
continuación de los nucleótidos o cebadores marcados que no han
intervenido, y la marca se detecta en la fracción de producto
separado.
Las substancias que pueden servir como marcas
detectables útiles son ya bien conocidas en la técnica e incluyen
isótopos radiactivos, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, cromóforos, así como también ligandos tales
como la biotina y haptenos, los cuales cuando no son directamente
detectables, pueden ser fácilmente detectables mediante una
reacción con formas marcadas de sus compañeros de unión específicos,
p. ej., avidina y anticuerpos, respectivamente.
Otro método consiste en detectar el producto de
amplificación mediante la hibridación con una sonda de ácido
nucleico marcado detectablemente y midiendo los híbridos resultantes
con cualquiera de las maneras convencionales. En particular, el
producto puede ser ensayado mediante hibridación de una sonda de
ácido nucleico marcada con éster de acridinio quimioluminiscente,
con la secuencia diana, hidrolizando selectivamente el éster de
acridinio presente en la sonda sin hibridar, y midiendo la
quimioluminiscencia producida a partir del éster de acridinio
remanente, en un luminómetro (ver p. ej., Arnold, et al.,
supra, patente U.S. nº 5.283.174, y Nelson et al.,
"Non-Isotopic DNA Probe Technologies"
("Tecnologías con sondas de ADN no isotópicas"), Academic
Press, San Diego (Kricka, ed. 1992).
Las sondas de ensayo de hibridación de
oligonucleótidos descritas en la presente son capaces de hibridar
con ácidos nucleicos diana de ARNr de Neisseria meningitidis
o secuencias nucleótidas de ADNr sobre ácidos nucleicos de especies
bacterianas filogenéticamente estrechamente relacionadas. Estas
sondas de ensayo de hibridación fueron diseñadas, seleccionadas y/o
escogidas tomando como base la comparación de las secuencias de
nucleótidos de las correspondientes regiones del ARN ribosómico de
la Neisseria meningitidis y dichas especies filogenéticamente
estrechamente relacionadas. En versiones preferidas estas sondas
hibridan selectivamente con los ácidos nucleicos de la Neisseria
meningitidis por encima de los ácidos nucleicos de la
Neisseria gonorrhoeae.
Se describen sondas de hibridación de
oligonucleótidos que hibridan selectivamente con los ácidos
nucleicos de la Neisseria meningitidis y no con los ácidos
nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae e incluyen secuencias
de ácidos nucleicos de Neisseria meningitidis que tienen o
que corresponden substancialmente a las siguiente secuencias de
ácido nucleico:
Un número de sondas de ensayo de hibridación de
oligonucleótidos de la presente invención hibridan de preferencia
con los ácidos nucleicos diana que contienen el ARNr de la
Neisseria gonorrhoeae, o con secuencias de nucleótidos de
ADNr, más que con los ácidos nucleicos de otras especies bacterianas
filogenéticamente estrechamente relacionadas. En versiones
preferidas, estas sondas de ensayo de hibridación pueden distinguir
los ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae de los de la
Neisseria meningitidis.
Las sondas de hibridación de la presente
invención que hibridan selectivamente con los ácidos nucleicos
derivados de la Neisseria gonorrhoeae y no con los ácidos
nucleicos de la Neisseria meningitidis están descritos en
las reivindicaciones 17-27, mientras que otras
sondas de hibridación descritas en la presente tienen o
substancialmente corresponden a las siguientes secuencias de
nucleótidos:
Las sondas de ensayo de hibridación de
oligonucleótidos de la presente invención están de preferencia
marcadas con un grupo informador como p. ej., un grupo
radioisótopo, un fluorescente o quimioluminiscente, con una enzima
u otro ligando, que puede emplearse para la detección o confirmación
de que la sonda ha hibridado con la secuencia diana. El solicitante
prefiere más el empleo de los ésteres de acridinio como marcas.
Ver p. ej., Arnold et al., patente U.S. nº 5.185.439.
La sonda de ensayo se mezcla con una muestra, la cual se sospecha
que contiene un ácido nucleico que tiene una secuencia diana, en
condiciones de hibridación adecuadas para permitir la reasociación
de las dos cadenas mediante puentes de hidrógeno en la región de
complementariedad.
La sonda debe también combinarse con uno o más
oligonucleótidos auxiliares sin marcar para facilitar la unión al
ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos diana de la
Neisseria meningitidis ó Neisseria gonorrhoeae. La
sonda hibrida a continuación con un ácido nucleico diana presente en
la muestra; el duplex híbrido resultante puede separarse y
detectarse mediante varias técnicas ya bien conocidas en la
especialidad, tales como la adsorción de hidroxiapatita y
monotorización radiactiva. También están incluidas entre estas
técnicas, aquellas que implican la degradación selectivamente de la
marca presente sobre la sonda sin hibridar y a continuación
midiendo la cantidad de marca asociada con la sonda hibridada
restante, como describe Arnold et al., patente U.S. nº
5.283.174, la cual disfruta de la común propiedad con la presente
solicitud. Esta última técnica se prefiere actualmente por los
solicitantes.
Se emplearon oligonucleótidos auxiliares
específicos para facilitar la hibridación de las sondas del ensayo
de hibridación con el ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos
auxiliares están descritos en Hogan y Milliman, patente U.S. nº
5.030.557 titulada Means and Method for Enhancing Nucleic Acid
Hybridization ("Medios y método para potenciar la hibridación
del ácido nucleico"), la cual disfruta de la común propiedad con
la presente solicitud.
Se seleccionan sondas auxiliares para hibridar
con secuencias de ácido nucleico situadas cerca de la región
clasificada como diana mediante la sonda de ensayo de hibridación.
La hibridación de la sonda auxiliar altera la estructura secundaria
y terciaria del ácido nucleico diana, facilitando la hibridación de
la sonda con el ácido nucleico diana.
Los oligonucleótidos auxiliares específicos para
facilitar la detección específica de los ácidos nucleicos de
la
Neisseria meningitidis, tienen o substancialmente corresponden a una de estas secuencias de nucleótidos:
Neisseria meningitidis, tienen o substancialmente corresponden a una de estas secuencias de nucleótidos:
Las sondas de hibridación dirigidas a los ácidos
nucleicos de la Neisseria meningitidis corresponden
substancialmente a las SEQ ID NOS: 11, 12, 25 ó 26 empleadas en una
mezcla de sondas juntamente con un oligonucleótido auxiliar que
tiene o corresponde substancialmente a la secuencia de nucleótidos
de:
SEQ ID NOS: 13, 14, 35 y 36
Otra sonda de ensayo de hibridación dirigida a
los ácidos nucleicos de la Neisseria meningitidis que
corresponde substancialmente a
SEQ ID NOS: 15, 16, 27 ó 28
se utiliza en una mezcla de sondas juntamente
con un oligonucleótido auxiliar que tiene o corresponde
substancialmente a la secuencia de nucleótidos de:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 y 38
Otra sonda de hibridación dirigida al ácido
nucleico ribosómico de la Neisseria gonorrhoeae que
corresponde substancialmente a
SEQ ID NOS: 1 ó 31
se utiliza en una mezcla juntamente con un
oligonucleótido auxiliar que tiene o corresponde substancialmente a
la secuencia de nucleótidos de:
SEQ ID NOS: 2 ó 39
En versiones preferidas, una sonda de
hibridación dirigida a los ácidos nucleicos de la Neisseria
gonorrhoeae que corresponde substancialmente a
SEQ ID NOS: 3 ó 32
se utiliza en una mezcla de sondas juntamente
con un oligonucleótido auxiliar que tiene o corresponde
substancialmente a la secuencia de nucleótidos de:
SEQ ID NOS: 4 ó 40
Los oligonucleótidos auxiliares pueden emplearse
generalmente en condiciones restrictivas de hibridación, pero no son
necesariamente específicas de especies.
En otro aspecto relacionado, la invención se
refiere a composiciones como se describen en las reivindicaciones
32 y 33. Esta composiciones comprenden un híbrido de ácido nucleico
entre una sonda de ensayo de hibridación y una secuencia de ácido
nucleico substancialmente complementaria a la misma (sonda:diana).
Un empleo para el híbrido formado entre sonda y diana es para
detectar la presencia de una secuencia diana. Por ejemplo, el éster
de acridinio ("AE") presente en híbridos es resistente a la
hidrólisis en solución alcalina mientras que el AE presente en
ácido nucleico monocatenario se hidroliza en solución alcalina
(Arnold et al., con el título "Homogenous Protection
Assay" ("Ensayo homogéneo de protección"), solicitud EPO
número 88308767.8, publicación número 309230, y patente U.S. nº
5.238.174. De acuerdo con ello, puede detectarse la presencia de
ácidos nucleicos diana después de la hidrólisis de la sonda marcada
con AE, no unida, midiendo la quimioluminiscencia del éster de
acridinio restante asociado con el híbrido de ácido nucleico.
La presente invención comprende también
composiciones que comprenden un híbrido de ácido nucleico entre un
oligonucleótido de amplificación y una secuencia de ácido nucleico
substancialmente complementaria al mismo (cebador:diana). Un empleo
del híbrido de ácido nucleico formado entre el cebador y la diana es
el proporcionar un sitio de iniciación para una polimerasa de ácido
nucleico en el extremo 3' del oligonucleótido de amplificación. Por
ejemplo, los híbridos pueden formar un sitio de iniciación para
transcriptasa inversa, ADN polimerasas tales como la Taq polimerasa
o la T4 ADN polimerasa y ARN polimerasas tales como la T7
polimerasa, SP6 polimerasa, T3 polimerasas y similares.
La presente invención se refiere también a
composiciones que comprenden híbridos de ácido nucleico entre un
oligonucleótido auxiliar y una secuencia de ácido nucleico
substancialmente complementaria al mismo (oligonucleótido
auxiliar:diana). Un empleo del híbrido entre el oligonucleótido
auxiliar y la diana es poder disponer de una secuencia particular
de ácido nucleico para la hibridación. Por ejemplo, un híbrido entre
un oligonucleótido auxiliar y su diana puede hacer que una
secuencia de ácido nucleico sea capaz de hibridar con una secuencia
diana disponible para la hibridación con una sonda de hibridación.
Una descripción completa del empleo de oligonucleótidos auxiliares
viene dada en Hogan y Milliman, patente U.S. nº 5.030.557.
Las composiciones descritas en la presente
incluyen composiciones para la detección del ácido nucleico
de
Neisseria meningitidis que comprenden un híbrido de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente correspondiente por lo menos a una de las secuencias de ácido nucleico que siguen:
Neisseria meningitidis que comprenden un híbrido de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente correspondiente por lo menos a una de las secuencias de ácido nucleico que siguen:
Otras composiciones descritas en la presente
incluyen composiciones para la detección de la Neisseria
meningitidis que comprenden un híbrido de ácido nucleico
formado entre un ácido nucleico derivado de la Neisseria
meningitidis y un oligonucleótido que tiene una secuencia de
ácido nucleico substancialmente correspondiente por lo menos a una
de las secuencias de ácido nucleico que siguen:
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un híbrido
de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la
Neisseria meningitidis y una sonda de ensayo de hibridación
que tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente a:
SEQ ID NO: 11 ó SEQ ID NO: 25;
y la cual puede contener también opcionalmente
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente a una de las siguientes secuencias de ácido
nucleico:
SEQ ID NOS: 13, 14, 35 ó 36.
Se han descrito además composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un híbrido
de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la
Neisseria meningitidis y una sonda de ensayo de hibridación
que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 12 ó SEQ ID NO: 26;
y el cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente con una de las secuencias de ácido nucleico
siguientes:
SEQ ID NOS: 13, 14, 35 ó 36.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un híbrido
de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la
Neisseria meningitidis y una sonda de ensayo de hibridación
que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 15 ó SEQ ID NO: 27;
y el cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente con una de las secuencias de ácido nucleico
siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un híbrido
de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la
Neisseria meningitidis y una sonda de ensayo de hibridación
que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 16 ó SEQ ID NO: 28;
y el cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente con una de las secuencias de ácido nucleico
siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria gonorrhoeae que tienen un híbrido
de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado de la
Neisseria gonorrhoeae y una sonda de ensayo de hibridación
que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 1 ó SEQ ID NO: 31;
y el cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente con una de las secuencias de ácido nucleico
siguientes:
SEQ ID NOS: 2 ó 39.
La presente invención contempla composiciones
para la detección de la Neisseria gonorrhoeae que tienen un
híbrido de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico derivado
de la Neisseria gonorrhoeae y una sonda de ensayo de
hibridación que tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a:
SEQ ID NO: 3 ó SEQ ID NO: 32;
y el cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar hibridado con dicho ácido nucleico el
cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente con una de las secuencias de ácido nucleico
siguientes:
SEQ ID NOS: 4 ó 40.
\newpage
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico
substancialmente correspondiente a:
SEQ ID NOS: 7 ó 43
y/o un oligonucleótido que tiene una secuencia
de ácido nucleico que corresponde substancialmente con por lo menos
una secuencia de ácido nucleico de las siguientes:
SEQ ID NOS: 9 ó 45
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con el ácido nucleico de Neisseria
meningitidis, y la cual tiene una secuencia de ácido nucleico
que corresponde substancialmente con una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 11, 15, 25 ó 27
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 13, 14, 35 ó 36.
También se han descrito composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 7 ó 43
y/o la cual tiene también un oligonucleótido que
tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una secuencia de ácido nucleico
como sigue:
SEQ ID NOS: 9 ó 45
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con loa ácidos nucleicos de la
Neisseria meningitidis y la cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las siguientes secuencias de ácido nucleico:
Neisseria meningitidis y la cual tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las siguientes secuencias de ácido nucleico:
SEQ ID NOS: 12, 16, 26 ó 28
y la cual puede contener también opcionalmente
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una de las siguientes
secuencias de ácido nucleico:
SEQ ID NOS: 13, 14, 35 ó 36.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 7 ó 43
y/o el cual tiene también un oligonucleótido que
tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una secuencia de ácido nucleico de
las siguientes:
SEQ ID NOS: 9 ó 45
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con el ácido nucleico de Neisseria
meningitidis la cual tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 15, 11, 27 ó 25
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
\newpage
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 7 ó 43
y/o el cual tiene también un oligonucleótido que
tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una secuencia de ácido nucleico
como sigue:
SEQ ID NOS: 9 ó 45
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con un ácido nucleico de la
Neisseria meningitidis y la cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una de las siguientes
secuencias de ácido nucleico:
SEQ ID NOS: 16, 12, 28 ó 20
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 8 ó 44
y/o el cual tiene también un oligonucleótido que
tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una secuencia de ácido nucleico de
las siguientes:
SEQ ID NOS: 10 ó 46
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con un ácido nucleico de Neisseria
meningitidis la cual tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 15, 11, 27 ó 25
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria meningitidis que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria meningitidis y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 8 ó 44
y/o el cual tiene también un oligonucleótido que
tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una secuencia de ácido nucleico de
las siguientes:
SEQ ID NOS: 10 ó 46
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con un ácido nucleico de Neisseria
meningitidis el cual tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 16, 12, 28 ó 26
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 17, 18, 37 ó 38.
Composiciones preferidas de la presente
invención están descritas en las reivindicaciones 32 y 33 mientras
otras composiciones descritas en la presente incluyen composiciones
para la detección de la Neisseria gonorrhoeae que comprenden
un híbrido de ácido nucleico formado entre un ácido nucleico
derivado de la Neisseria gonorrhoeae y un oligonucleótido
que tiene una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente por lo menos a una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otras composiciones descritas en la presente
incluyen composiciones para la detección de la Neisseria
gonorrhoeae que comprenden un híbrido de ácido nucleico formado
entre un ácido nucleico derivado de la Neisseria
gonorrhoeae y un oligonucleótido que tiene una secuencia de
ácido nucleico substancialmente correspondiente por lo menos a una
de las secuencias de ácido nucleico siguientes:
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria gonorrhoeae que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria gonorrhoeae y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 5 ó 41
y/o el cual tiene también opcionalmente un
oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente por lo menos con una secuencia de
ácido nucleico de las siguientes:
SEQ ID NOS: 6 ó 42
\newpage
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con un ácido nucleico de Neisseria
gonorrhoeae y el cual tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 1, 29, 31 ó 33
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 2 ó 39
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria gonorrhoeae que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria gonorrhoeae y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NO: 7 ó 42
y/o el cual tiene opcionalmente una secuencia de
ácido nucleico de oligonucleótido que corresponde substancialmente
por lo menos con una secuencia de ácido nucleico de las
siguientes:
SEQ ID NOS: 9 ó 45
y la cual opcionalmente tiene una sonda de
ensayo de hibridación capaz de hibridar con un ácido nucleico de
Neisseria gonorrhoeae y el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una de las secuencias de
ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 3, 30, 32 ó 34
y la cual puede contener también opcionalmente,
un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente con una de las secuencias
de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 4 ó 40
y la cual tiene también opcionalmente un
oligonucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente por lo menos a una secuencia de ácido
nucleico como las que siguen:
SEQ ID NOS: 8 ó 44
Se han descrito también composiciones para la
detección de la Neisseria gonorrhoeae que tienen un ácido
nucleico derivado de la Neisseria gonorrhoeae y un
oligonucleótido con una secuencia de ácido nucleico substancialmente
correspondiente a:
SEQ ID NOS: 10 ó 46
y opcionalmente tiene una sonda de ensayo de
hibridación capaz de hibridar con los ácidos nucleicos de
Neisseria gonorrhoeae y la cual tiene una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una de las secuencias de
ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 3, 30, 32 ó 34
y/o la cual puede contener también
opcionalmente, un oligonucleótido auxiliar el cual tiene una
secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente con
una de las secuencias de ácido nucleico siguientes:
SEQ ID NOS: 4 ó 40
También se describen híbridos de ácido nucleico
que comprenden sondas y también por lo menos un oligonucleótido
auxiliar que tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente por lo menos con una de las secuencias de ácido
nucleico siguientes:
Se han descrito también composiciones para la
amplificación de los ácidos nucleicos de Neisseria que
contienen un híbrido de ácido nucleico formado entre un ácido
nucleico de Neisseria y un oligonucleótido que tiene una
secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una
secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado por:
La presente invención contempla varios métodos
para el ensayo de detección de la presencia de ácido nucleico de
Neisseria gonorrhoeae dentro de una muestra. Un experto en la
técnica comprende que las condiciones exactas de ensayo, las sondas
o cebadores empleados variarán en función del formato particular de
ensayo empleado y la fuente de la muestra.
También se describen métodos para la detección
de la presencia de Neisseria meningitidis mediante el
contacto de una muestra de ensayo en condiciones restrictivas de
hibridación con una sonda de ensayo de hibridación de ácido
nucleico capaz de hibridar preferentemente en condiciones
restrictivas de ensayo de hibridación con un ácido nucleico diana
de Neisseria meningitidis ignorando los ácidos nucleicos de
Neisseria gonorrhoeae, teniendo dicho ácido nucleico diana
una secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente a
las secuencias seleccionadas del grupo formado por:
Otros métodos para la detección de la presencia
de Neisseria meningitidis incluyen el paso de poner en
contacto una muestra de ensayo en condiciones restrictivas del
ensayo de hibridación, con una sonda de ensayo de hibridación de
ácido nucleico capaz de hibridar de preferencia en condiciones
restrictivas de hibridación con una secuencia diana de ácido
nucleico de Neisseria meningitidis ignorando las secuencias
de ácido nucleico de Neisseria gonorrhoeae, correspondiendo
substancialmente dicha secuencia diana de ácido nucleico con una
secuencia seleccionada del grupo formado por
Los métodos de la presente invención para la
detección de la presencia de la Neisseria gonorrhoeae están
descritos en las reivindicaciones 34-37. Otros
métodos descritos en la presente incluyen el paso de poner en
contacto una muestra de ensayo en condiciones restrictivas de
hibridación con una sonda de ensayo de hibridación de ácido
nucleico capaz de hibridar preferentemente en condiciones
restrictivas de ensayo de hibridación, con una secuencia de ácido
nucleico diana de Neisseria gonorrhoeae ignorando una
secuencia de ácido nucleico de Neisseria meningitidis,
correspondiendo substancialmente dicha secuencia diana de ácido
nucleico a una secuencia seleccionada del grupo formado por
Se han descrito también métodos para la
detección de la presencia de microorganismos de Neisseria
gonorrhoeae poniendo en contacto una muestra de ensayo en
condiciones restrictivas de hibridación con una sonda de ensayo de
hibridación de ácido nucleico capaz de hibridar preferentemente en
condiciones restrictivas de ensayo de hibridación, con una
secuencia de ácido nucleico de Neisseria gonorrhoeae
ignorando las secuencias de ácido nucleico de Neisseria
meningitidis, correspondiendo substancialmente dichas secuencias
diana de ácido nucleico a una secuencia seleccionada del grupo
formado por:
\newpage
Se describen también métodos de detección de
Neisseria amplificando en primer lugar una porción de ácido
nucleico de Neisseria y a continuación empleando
opcionalmente una sonda de ensayo de hibridación para detectar la
presencia de un ácido nucleico específico derivado de
Neisseria amplificado mediante cebadores. El ácido nucleico
amplificado puede detectarse mediante un número de métodos
incluyendo la electroforesis sobre gel.
Se han descrito también métodos de detección de
ácido nucleico derivado de Neisseria, amplificando en primer
lugar dicho ácido nucleico con por lo menos un oligonucleótido de
amplificación que unirá a, o causará un alargamiento mediante una o
más de las siguientes secuencias:
en donde dicho oligonucleótido de amplificación
tiene opcionalmente una secuencia de ácido nucleico reconocida por
una ARN polimerasa o la cual potencia la iniciación del alargamiento
por una ARN polimerasa.
Este primer paso del método es seguido a
continuación opcionalmente por la detección del ácido nucleico
amplificado en el paso de amplificación con una sonda de ensayo de
hibridación de oligonucleótidos capaz de hibridar específicamente
con ácidos nucleicos derivados de Neisseria species, Neisseria
cinerea, Neisseria meningitidis ó
Neisseria gonorrhoeae en condiciones restrictivas de hibridación.
Neisseria gonorrhoeae en condiciones restrictivas de hibridación.
El oligonucleótido de amplificación empleado en
los métodos de la presente invención puede tener opcionalmente una
secuencia de ácido nucleico por ejemplo, una secuencia promotora,
reconocida por una ARN polimerasa o la cual potencia la iniciación
mediante una ARN polimerasa.
También se describe un método para la
amplificación de los ácidos nucleicos de Neisseria en una
muestra de ensayo mediante la amplificación del ácido nucleico con
uno o más oligonucleótidos de amplificación que se unirán o
causarán un alargamiento a través de la secuencia de ácido nucleico
que corresponde substancialmente a las siguientes secuencias de
nucleótidos:
SEQ ID NOS: 19 ó 49,
SEQ ID NOS: 21 ó 50, ó
con un segundo oligonucleótido de amplificación
que se unirá o causará un alargamiento a través de una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las
siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 20 ó 51,
SEQ ID NOS: 22 ó 52, ó ambos dichos
oligonucleótidos de amplificación, en donde por lo menos uno de
dichos oligonucleótidos de amplificación tiene opcionalmente una
secuencia de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa o el
cual potencia la iniciación o alargamiento mediante una ARN
polimerasa.
En otras versiones más preferidas, la presente
invención contempla un método para la amplificación de los ácidos
nucleicos derivados de la Neisseria gonorrhoeae en una
muestra de ensayo que comprende la amplificación de dicho ácido
nucleico con uno o más oligonucleótidos de amplificación que se
unirán a, o causarán el alargamiento a través de una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente con una de las
siguientes secuencias de nucleótidos:
SEQ ID NOS: 19 ó 49, ó
con un segundo oligonucleótido de amplificación
que se unirá a, o causará el alargamiento a través de una secuencia
de ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias:
\newpage
SEQ ID NOS: 20 ó 51, o ambos dichos
oligonucleótidos de amplificación, en donde por lo menos uno de
dichos oligonucleótidos de amplificación tiene opcionalmente una
secuencia de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa, o la
cual potencia la iniciación o alargamiento mediante una ARN
polimerasa.
Se describe también un método para aumentar el
número de secuencias de ácido nucleico derivado de Neisseria
en una muestra de ensayo que comprende la amplificación de dicho
ácido nucleico con uno o más oligonucleótidos de amplificación que
se unirán a, o causarán el alargamiento a través de una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias de nucleótidos:
SEQ ID NOS: 21 ó 50
o con un segundo oligonucleótido de
amplificación que se unirá a, o causará el alargamiento a través de
una secuencia de ácido nucleico que corresponde substancialmente a
las siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 22 ó 52, ó ambos dichos
oligonucleótidos de amplificación, en donde por lo menos uno de
dichos oligonucleótidos de amplificación tiene opcionalmente una
secuencia de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa, o la
cual potencia la iniciación o alargamiento mediante una ARN
polimerasa.
Los métodos de más arriba pueden incluir también
otro paso de detección del ácido nucleico amplificado con una sonda
de ensayo de hibridación de oligonucleótidos capaz de hibridar
específicamente con los ácidos nucleicos de la Neisseria
meningitidis en condiciones restrictivas de hibridación.
Específicamente, los métodos pueden detectar la
Neisseria meningitidis empleando sondas de ensayo de
hibridación de oligonucleótidos los cuales hibridarán en
condiciones restrictivas de hibridación con una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una secuencia
seleccionada del grupo formado por:
Se han descrito también métodos para aumentar el
número de ácidos nucleicos derivados de Neisseria gonorrhoeae
en una muestra de ensayo mediante la amplificación de dicho ácido
nucleico con uno o más oligonucleótidos de amplificación que se
unirán a, o causarán el alargamiento a través de una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a una o más de las
siguientes secuencias de nucleótidos:
SEQ ID NOS: 23 ó 47
SEQ ID NOS: 24 ó 48
y en donde el oligonucleótido de amplificación
tiene opcionalmente una secuencia de ácido nucleico reconocida por
una ARN polimerasa, o la cual potencia la iniciación o alargamiento
mediante una ARN polimerasa.
También se describen métodos adicionales para la
amplificación de los ácidos nucleicos derivados de la Neisseria
gonorrhoeae en una muestra de ensayo con un primer
oligonucleótido de amplificación que se unirá a, o causará el
alargamiento a través de una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente a una de las siguientes secuencias de
nucleótidos
SEQ ID NOS: 23 ó 47 ó
con un segundo oligonucleótido de amplificación
que se unirá a, o causará el alargamiento a través de una secuencia
de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las
siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 24 ó 48, ó
tanto con el primero como con el segundo
oligonucleótido de amplificación, en donde uno de los
oligonucleótidos de amplificación tiene opcionalmente una secuencia
de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa, o la cual
potencia la iniciación o alargamiento mediante una ARN
polimerasa.
Estos métodos de amplificación del ácido
nucleico derivado de la Neisseria gonorrhoeae pueden ir
seguidos por el paso de detección del ácido nucleico amplificado
con una sonda de ensayo de hibridación de oligonucleótidos capaz de
hibridar específicamente con los ácidos nucleicos de la Neisseria
gonorrhoeae en condiciones restrictivas de hibridación.
De preferencia, la sonda de ensayo de
hibridación de oligonucleótidos tiene una secuencia de ácido
nucleico substancialmente correspondiente con una secuencia
seleccionada del grupo formado por:
SEQ ID NOS: 1, 29, 31, y 33.
La detección del ácido nucleico de Neisseria
gonorrhoeae puede incluir el empleo de un oligonucleótido
auxiliar que tiene una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente a una secuencia de ácido nucleico seleccionada del
grupo formado por:
SEQ ID NO: 2, y
SEQ ID NO: 39
Otros métodos de detección del ácido nucleico de
la Neisseria gonorrhoeae son contemplados en la presente
invención mediante el aumento del número de ácidos nucleicos
derivados de la Neisseria gonorrhoeae en una muestra de
ensayo, mediante la amplificación de dicho ácido nucleico con uno o
más oligonucleótidos de amplificación que se unirán a, o causarán
el alargamiento a través de una secuencia de ácido nucleico
substancialmente correspondiente a una o más de las siguientes
secuencias de nucleótidos: SEQ ID NOS: 19 ó 49, SEQ ID NOS: 20 ó 51,
y en donde el oligonucleótido de amplificación tiene opcionalmente
una secuencia de ácido nucleico reconocida por una ARN polimerasa,
o la cual potencia la iniciación o alargamiento por una ARN
polimerasa.
Otros métodos para la amplificación de los
ácidos nucleicos de Neisseria en una muestra de ensayo
descritos en la presente incluyen la amplificación del ácido
nucleico con uno o más oligonucleótidos de amplificación que se
unirán a, o causarán el alargamiento a través de una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las
secuencias de nucleótidos siguientes:
SEQ ID NOS: 19 ó 49, ó
con un segundo oligonucleótido de amplificación
que se unirá a, o causará el alargamiento a través de una secuencia
de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las
siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 20 ó 51, ó
tanto con el primero como con el segundo
oligonucleótido de amplificación.
Alternativamente, se describe además la
amplificación de los ácidos nucleicos de Neisseria en una
muestra de ensayo que comprende la amplificación del ácido nucleico
con uno o más oligonucleótidos de amplificación que se unirán a, o
causarán el alargamiento a través de una secuencia de ácido nucleico
que corresponde substancialmente a una de las siguientes secuencias
de nucleótidos:
SEQ ID NOS: 21 ó 50, ó
con un segundo oligonucleótido de amplificación
que se unirá a, o causará el alargamiento a través de una secuencia
de ácido nucleico que corresponde substancialmente a una de las
siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 22 ó 52, ó
con ambos dichos primero y segundo
oligonucleótidos de amplificación.
La amplificación del ácido nucleico de
Neisseria va seguida de preferencia por la detección del
ácido nucleico amplificado con una sonda de ensayo de hibridación
de oligonucleótidos capaz de hibridar específicamente con los
ácidos nucleicos de la Neisseria gonorrhoeae en condiciones
restrictivas de hibridación. La sonda de ensayo de hibridación de
oligonucleótidos empleada de preferencia tiene una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente con una secuencia
seleccionada del grupo formado por:
SEQ ID NOS: 3, 32, 30, 34
La presente invención contempla también los
sistemas de diagnóstico en forma de kit, como se reivindica en las
reivindicaciones 16-31. Un sistema de diagnóstico de
la presente invención puede incluir un kit que contiene, en una
cantidad suficiente para por lo menos un ensayo, los cebadores de
amplificación y/o las sondas de ensayo de hibridación de la
presente invención en un material de envase. Típicamente los kits
incluirían instrucciones para el empleo de los cebadores y/o sondas
envasados.
Los varios componentes del sistema de
diagnóstico pueden suministrarse en diferentes formas. Por ejemplo,
las enzimas, los nucleótido trifosfatos, los cebadores y las sondas
necesarias pueden proporcionarse en forma de un reactivo
liofilizado. Estos reactivos liofilizado pueden ser mezclados
previamente antes de la liofilización, de forma que cuando se
reconstituyen forman una mezcla completa, con la proporción exacta
de cada uno de los componentes, lista para ser usada en el ensayo.
Además, los sistemas de diagnóstico de la presente invención pueden
contener un reactivo de reconstitución para la reconstitución de los
reactivos liofilizados del kit. En los kits preferidos, las
enzimas, los nucleótidos, los trifosfatos y los cofactores
necesarios para las enzimas se suministran como un reactivo
liofilizado único que cuando se reconstituye forma un reactivo
adecuado para emplear en los presentes métodos. En estos kits
preferidos, también puede suministrarse un agente cebador
liofilizado. En otros kits preferidos, se suministran reactivos
sonda liofilizados.
Los materiales de envase típicos incluyen
matrices sólidas como p. ej., vidrio, plástico, papel, láminas,
micropartículas y similares, capaces de soportar dentro de límites
fijos la sonda de ensayo de hibridación o el cebador de
amplificación de la presente invención. Así por ejemplo, un envase
obtenido a partir de materiales de envasado puede ser un vial de
vidrio empleado para contener cantidades de submiligramos (es decir,
picogramos, nanogramos, etc) de un cebador dado o de una sonda de
ensayo de hibridación, o puede ser un pocillo de una placa de
microtitulación al cual las sondas y/o los cebadores han sido
operativamente fijados, es decir, unidos de forma que son capaces
de participar en un método de detección de la presente
invención.
Las instrucciones de empleo incluyen típicamente
una exposición suficiente describiendo los varios reactivos y/o
concentraciones de los reactivos y por lo menos un parámetro del
método de ensayo el cual por ejemplo podría ser las cantidades
relativas de reactivos a emplear por cantidad de muestra. Además,
pueden también incluirse especificaciones como mantenimiento,
períodos de tiempo, temperatura y condiciones tampón.
La presente invención contempla sistemas de
diagnóstico o kits que contienen los oligonucleótidos de una
composición de la presente invención. La presente invención
contempla también sistemas de diagnóstico o kits que contienen los
oligonucleótidos necesarios para efectuar un método de la presente
invención.
Este método emplea también de preferencia un
oligonucleótido auxiliar que tiene una secuencia de ácido nucleico
que corresponde substancialmente a una secuencia de ácido nucleico
seleccionada del grupo formado por:
SEQ ID NO. 4: y
SEQ ID NO. 40:
La presente invención contempla sistemas de
diagnóstico o un kit como se describe en las reivindicaciones
16-31. Otros sistemas de diagnóstico o un kit
contiene(n) por lo menos un oligonucleótido que tiene una
secuencia de ácido nucleico que substancialmente corresponde con
una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo formado
por:
SEQ ID NOS: 1, 11, 12, 15, 16, 29, 33, 27, 28,
25, 26.
La presente invención contempla sistemas de
diagnóstico o un kit que tiene una sonda de ensayo de hibridación
de nucleótidos que tiene por lo menos una sonda auxiliar como se
describe en las reivindicaciones 29-31. Otras
sondas auxiliares tienen una secuencia de ácido nucleico que
corresponde substancialmente con la secuencia seleccionada del grupo
formado por:
SEQ ID NOS: 2 ó 39
cuando dicho oligonucleótido corresponde
substancialmente a
SEQ ID NOS: 1 ó 31;
ó
SEQ ID NOS: 13 ó 35, ó
SEQ ID NOS: 14 ó 36,
\newpage
cuando dicho oligonucleótido corresponde
substancialmente a
SEQ ID NOS: 11 ó 25, ó
SEQ ID NOS: 12 ó 26,
ó
SEQ ID NOS: 17 ó 37,
SEQ ID NOS: 18 ó 38,
\vskip1.000000\baselineskip
cuando dicho oligonucleótido corresponde
substancialmente a
SEQ ID NOS: 15 ó 27, ó
SEQ ID NOS: 16 ó 28.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención contempla sistemas de
diagnóstico o un kit, como se describe en las reivindicaciones
16-31. Otros sistemas de diagnóstico o el kit
contienen dos oligonucleótidos que tienen una secuencia de ácido
nucleico que corresponde substancialmente a una secuencia de ácido
nucleico seleccionada del grupo formado por:
\vskip1.000000\baselineskip
conteniendo opcionalmente una
secuencia 5' reconocida mediante una ARN polimerasa o la cual
potencia la iniciación o alargamiento mediante una ARN
polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención contempla sistemas de
diagnóstico o kits como se describe en las reivindicaciones
16-31. Otros métodos de diagnóstico o kits
descritos en la presente contiene(n) oligonucleótidos que
tienen una secuencia de ácido nucleico que corresponde
substancialmente a las siguientes secuencias:
SEQ ID NOS: 7 ó 43,
SEQID NOS: 9 ó 45,
SEQID NOS: 11 ó 25,
SEQ ID NOS: 13 ó 35,
SEQ ID NOS: 14 ó 36.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen también sistemas de diagnóstico o
kits que contienen oligonucleótidos que tienen una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias:
SEQ ID NOS: 15 ó 27,
SEQID NOS: 16 ó 26,
SEQ IDNOS: 17 ó 37,
SEQ ID NOS: 18 ó 38.
\newpage
Se describen también sistemas de diagnóstico o
un kit conteniendo oligonucleótidos que tienen una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias:
SEQ ID NOS: 7 ó 43,
SEQ ID NOS: 9 ó 45,
SEQ ID NOS: 15 ó 27,
SEQ ID NOS: 16 ó 28,
SEQ ID NOS: 17 ó 37,
SEQ ID NOS: 18 ó 38.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describen también, sistemas de diagnóstico o
un kit que contienen oligonucleótidos que tienen una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias:
SEQ ID NOS: 5 ó 41,
SEQ ID NOS: 6 ó 42,
SEQ ID NOS: 2 ó 39,
SEQ ID NOS: 1 ó 31.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe también un sistema de diagnóstico o
un kit que contienen oligonucleótidos que tienen una secuencia de
ácido nucleico que corresponde substancialmente a las siguientes
secuencias:
SEQ ID NOS: 5 ó 41,
SEQ ID NOS: 2 ó 39,
SEQ ID NOS: 1 ó 31.
A continuación se describen unos ejemplos para
ilustrar diferentes aspectos y versiones de la presente invención.
Estos ejemplos no pretenden de ninguna manera limitar la invención
descrita, la cual está limitada solamente por las
reivindicaciones.
Las sondas específicas para la Neisseria
meningitidis se diseñaron empleando secuencias determinadas en
áreas diana prospectivas empleando cebadores complementarios a los
ARNr de 16S de Neisseria gonorrhoeae (ATCC NO. 19424),
Neisseria meningitidis serogrupo A (ATCC NOs 13077),
serogrupo C (ATCC No 23248) y serogrupo L (ATCC No. 43828), y
aislados clínicos, Neisseria lactamica (ATCC NO. 23970),
Neisseria cinerea (ATCC NO. 14685), Neisseria mucosa
(ATCC NO. 19696), Neisseria sicca (ATCC NO. 29193) y
Kingella kingae (ATCC NO. 23330). La secuencia de ácido
nucleico de los vecinos filogenéticamente próximos, incluyendo la
secuencia publicada de Neisseria gonorrhoeae NCTC 8375
Rossau et al., Nuc. Acids Res. 16:6227 fueron también
empleados como comparaciones con la secuencia nucleica de la
Neisseria meningitidis para determinar regiones
variables.
A continuación, se describe un ejemplo de dicho
alineamiento: una secuencia específica en la cual la Neisseria
meningitidis derivada de la E. coli y la Neisseria
gonorrhoeae se escogieron para el diseño de la sonda. Dos
diferentes sondas fueron diseñadas para la Neisseria
meningitidis (SEQ ID NO: 11) y (SEQ ID NO: 12). Las secuencias
de ARN se muestran a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las siguientes secuencias de sonda de ensayo de
hibridación figuran en los ejemplos que se describen más
adelante:
En este experimento, el ARNr de N.
gonorrhoeae, purificado (ATCC NO. 19424), se amplificó con
oligonucleótidos conteniendo secuencias complementarias al ARNr de
N. gonorrhoeae empleando las técnicas descritas en Kacian
et al., U.S. patente nº 5.399.491. Se sintetizaron dos
cebadores promotores conteniendo cada uno, una secuencia promotora
T7 ARN polimerasa
5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGA-3'
SEQ ID NO. 53 en el extremo 5', unida covalentemente a una
secuencia diana complementaria
5'-GTCCCCTGCTTTCCCTCTCAAGAC,3' (SEQ ID NO. 5) en el
extremo 3'. Se sintetizó un cebador promotor con un grupo libre 3'
OH, y se empleó con dos pmoles por reacción. El segundo cebador
promotor se sintetizó con un grupo alcano diol en el extremo 3' y se
empleó con 13 pmoles por reacción. El ácido nucleico diana y los
cebadores se calentaron a 95ºC durante 15 minutos y se enfriaron a
42ºC. Se añadieron transcriptasa inversa del virus de la leucemia
del ratón Moloney (MMLV RT), 900 unidades, y 400 unidades de T7 ARN
polimerasa. La mezcla de amplificación final contenía 50 mM de Tris
HCl (pH 8,5), 35 mM de cloruro de potasio, 4 mM de GTP, 4 mM de
ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de
dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MgCl_{2}, 20 mM de
N-acetil-L-cisteína,
y 5% (p/v) de glicerina. Después de dos horas de incubación a 42ºC,
se ensayó la reacción completa de amplificación de un centenar de
\mul, mediante hibridación con una sonda marcada con éster de
acridinio, con la secuencia
5'-GAACGTACCGGGTAGCGG-3' (SEQ. ID.
NO. 1) y una sonda auxiliar sin marcar, de secuencia
5'-GGGATAACTGATCGAAAGATCAGCTAATACCGCA
TACG-3' (SEQ. ID. NO. 2). La hibridación se efectuó en 200 \mul de una solución que contenía 0,05 M de succinato de litio (pH 5), 0,6 M de LiCl, 1% (w/v) de laurilsulfato de litio, 10 mM de EDTA, 10 mM de EGTA, a 60ºC durante 10 minutos, seguido de la adición de 300 \mul de tetraborato de sodio 0,15 M, pH 8,5, 1% de TRITON® X-100. Esta mezcla se incubó a 60ºC durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se determinó la quimioluminiscencia que quedó en cada tubo con un luminómetro Gen-Probe LEADER® I equipado con inyección automática de ácido nítrico 1 mM y 0,1% (v/v) de peróxido de hidrógeno seguido de la inyección de una solución conteniendo hidróxido de sodio 1 N. Los
resultados se dieron en Unidades Relativas de Luz (RLU), una medida de los fotones detectados por el luminómetro.
TACG-3' (SEQ. ID. NO. 2). La hibridación se efectuó en 200 \mul de una solución que contenía 0,05 M de succinato de litio (pH 5), 0,6 M de LiCl, 1% (w/v) de laurilsulfato de litio, 10 mM de EDTA, 10 mM de EGTA, a 60ºC durante 10 minutos, seguido de la adición de 300 \mul de tetraborato de sodio 0,15 M, pH 8,5, 1% de TRITON® X-100. Esta mezcla se incubó a 60ºC durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se determinó la quimioluminiscencia que quedó en cada tubo con un luminómetro Gen-Probe LEADER® I equipado con inyección automática de ácido nítrico 1 mM y 0,1% (v/v) de peróxido de hidrógeno seguido de la inyección de una solución conteniendo hidróxido de sodio 1 N. Los
resultados se dieron en Unidades Relativas de Luz (RLU), una medida de los fotones detectados por el luminómetro.
Este experimento demuestre la amplificación del
ARNr de N. gonorrhoeae con dos cebadores de sentido opuesto.
El cebador promotor descrito en el ejemplo 1 que contiene una
secuencia promotora de T7 ARN polimerasa y una región 3' de
hibridación diana de secuencia
5'-GTCCCCTGCTTTCCCTCTCAAGAC-3' (SEQ.
ID. NO. 5) se empleó con 15 pmoles por reacción y un cebador
conteniendo una secuencia del mismo sentido que el ARNr de la N.
gonorrhoeae,
5'-GGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACATA-3'
(SEQ. ID. NO. 6) se empleó con 15 pmoles por reacción. Las
reacciones se efectuaron por triplicado. Las condiciones de
reacción fueron las descritas en el ejemplo 1, y las muestras se
calentaron a 95ºC durante 5 minutos y a continuación se enfriaron a
42ºC. Se añadieron las enzimas y después de dos horas de incubación
a 42ºC, se ensayaron 20 \mul de la reacción de amplificación
mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio
sintetizada con la secuencia SEQ. ID. NO. 1 y una sonda auxiliar
sin marcar sintetizada con la secuencia SEQ ID. NO. 2. Los cebadores
amplificaron el ARN de la N. gonorrhoeae y permitieron la
detección de menos de 100 copias de la diana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, se usaron de nuevo, dos
cebadores promotores de idéntica secuencia. Cada cebador promotor
se sintetizó con una secuencia promotora de 5' T7 ARN polimerasa, la
5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGGA
GA-3' SEQ ID NO: 53 en el extremo 5' y una región 5'-GCTGCTGCACGTAGT-TAGCCGGTGCTTATTCTT
CAG-3' (SEQ ID NO. 7) en el extremo 3'. Los cebadores promotores fueron sintetizados o bien con un grupo 3'-hidroxilo y empleando 2 pmoles por reacción, o bien con un> 3'-alcanodiol empleando 13 pmoles por reacción. Se calentaron muestras a 95ºC durante 5 minutos y se enfriaron a 42ºC antes de la adición de la enzima. Las condiciones de amplificación fueron las que se han descrito en el ejemplo 1. Después de dos horas de incubación a 42ºC, se ensayaron 100 \mul de la reacción de amplificación mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar, con la secuencia 5'-ACGGTACCTGGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO. 4) empleando las condiciones descritas en el ejemplo 1.
GA-3' SEQ ID NO: 53 en el extremo 5' y una región 5'-GCTGCTGCACGTAGT-TAGCCGGTGCTTATTCTT
CAG-3' (SEQ ID NO. 7) en el extremo 3'. Los cebadores promotores fueron sintetizados o bien con un grupo 3'-hidroxilo y empleando 2 pmoles por reacción, o bien con un> 3'-alcanodiol empleando 13 pmoles por reacción. Se calentaron muestras a 95ºC durante 5 minutos y se enfriaron a 42ºC antes de la adición de la enzima. Las condiciones de amplificación fueron las que se han descrito en el ejemplo 1. Después de dos horas de incubación a 42ºC, se ensayaron 100 \mul de la reacción de amplificación mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar, con la secuencia 5'-ACGGTACCTGGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ ID NO. 4) empleando las condiciones descritas en el ejemplo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
En este experimento, se amplificó el ARNr de
N. gonorrhoeae con una mezcla de dos oligonucleótidos, uno de
ellos un cebador promotor complementario de ARNr de N.
gonorrhoeae, y el otro un cebador del mismo sentido que el ARNr
de N. gonorrhoeae. El cebador promotor contenía una secuencia
promotora T7 ARN polimerasa en el extremo 5' y una región de
hibridación diana
5'-GCTGCTGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAG-3'
(SEQ. ID. NO. 7) en el extremo 3' y se empleó con un cebador de
secuencia
5'-CGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGG
GAAGAAAAGGCCGTT-3' (SEQ. ID. NO. 9) con 30 pmoles por reacción. Alternativamente, se empleó un cebador promotor conteniendo una región de hibridación diana, de secuencia 5'-GTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAGG
TACCGTCATCG-3' (SEQ. ID. NO. 8), con 15 pmoles por reacción con el cebador promotor con una secuencia de 5'-GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGAC-3' (SEQ ID NO. 10), con 15 pmoles por reacción. Las condiciones de la amplificación fueron como las descritas en el ejemplo 1. Se ensayaron veinte \mul del producto mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCG
ATG-3' (SEQ. ID. NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar sintetizada con la secuencia 5'-ACGGTACCTGAAGAA
TAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ. ID. NO. 4) como se describe en el ejemplo 1.
GAAGAAAAGGCCGTT-3' (SEQ. ID. NO. 9) con 30 pmoles por reacción. Alternativamente, se empleó un cebador promotor conteniendo una región de hibridación diana, de secuencia 5'-GTTAGCCGGTGCTTATTCTTCAGG
TACCGTCATCG-3' (SEQ. ID. NO. 8), con 15 pmoles por reacción con el cebador promotor con una secuencia de 5'-GAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGGAC-3' (SEQ ID NO. 10), con 15 pmoles por reacción. Las condiciones de la amplificación fueron como las descritas en el ejemplo 1. Se ensayaron veinte \mul del producto mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCG
ATG-3' (SEQ. ID. NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar sintetizada con la secuencia 5'-ACGGTACCTGAAGAA
TAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ. ID. NO. 4) como se describe en el ejemplo 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demuestra la reactividad del ensayo
de amplificación y detección. Se suspendieron cultivos recién
preparados de trece cepas de N. gonorrhoeae en 0,9% de
cloruro de sodio a una densidad de aproximadamente 10^{10}
células/ml y se lisaron en una solución conteniendo 3% (p/v) de
lauril sulfato de litio, 30 mM de fosfato de sodio pH 6,8, 1 mM de
EDTA y 1 mM de EGTA. La liberación del ácido nucleico se confirmó
mediante hibridación con una sonda dirigida a la región conservada
del ARN ribosómico de todas las bacterias. Los lisados de células
se diluyeron a continuación en agua y se añadieron a las reacciones
de amplificación conteniendo 30 pmoles de un
cebador-promotor conteniendo un promotor de 5' T7
ARN de secuencia SEQ ID NO: 53
5'-AATTTAATACGACTCACTATAGGG
AGA-3' y una secuencia de unión diana que comprende SEQ. ID. NO. 7, y 30 pmoles del cebador que comprende la secuencia SEQ. ID. NO. 9. Se efectuaron reacciones duplicadas conteniendo el lisado de por lo menos 10^{5} células empleando una mezcla de amplificación conteniendo 50 mM de Tris HCl (pH 8,5), 35 mM de cloruro de potasio, 4 mM de GTP, 4 mM de ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MCl_{2}, 20 mM de N-acetil-L-cisteína, 5% (v/v) de glicerina y los cebadores oligonucleótidos descritos más arriba. La mezcla se calentó a 95ºC durante 5 minutos, se enfrió a 42ºC y se añadieron 900 unidades de MMLV transcriptasa inversa y 400 unidades de T7 ARN polimerasa. Después de una hora de incubación a 42ºC, se ensayaron 20 \mul de reacción de amplificación mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ. ID. NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar conteniendo la secuencia 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ. ID. NO. 4).
AGA-3' y una secuencia de unión diana que comprende SEQ. ID. NO. 7, y 30 pmoles del cebador que comprende la secuencia SEQ. ID. NO. 9. Se efectuaron reacciones duplicadas conteniendo el lisado de por lo menos 10^{5} células empleando una mezcla de amplificación conteniendo 50 mM de Tris HCl (pH 8,5), 35 mM de cloruro de potasio, 4 mM de GTP, 4 mM de ATP, 4 mM de UTP, 4 mM de CTP, 1 mM de dATP, 1 mM de dTTP, 1 mM de dCTP, 1 mM de dGTP, 20 mM de MCl_{2}, 20 mM de N-acetil-L-cisteína, 5% (v/v) de glicerina y los cebadores oligonucleótidos descritos más arriba. La mezcla se calentó a 95ºC durante 5 minutos, se enfrió a 42ºC y se añadieron 900 unidades de MMLV transcriptasa inversa y 400 unidades de T7 ARN polimerasa. Después de una hora de incubación a 42ºC, se ensayaron 20 \mul de reacción de amplificación mediante hibridación con una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia 5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ. ID. NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar conteniendo la secuencia 5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3' (SEQ. ID. NO. 4).
El análisis de la secuencia de otras especies de
Neisseria indicó que los oligonucleótidos de amplificación
de esta invención podían amplificar ácidos nucleicos de otras
especies. Este ejemplo demuestra la utilidad de los
oligonucleótidos de amplificación de esta invención para amplificar
el ácido nucleico de otras especies de Neisseria, N.
meningitidis. En el curso del desarrollo de una sonda específica
para la N. meningitidis se vio claramente que los miembros
de las especies N. meningitidis no eran homogéneos en la
región de la sonda seleccionada. Se determinaron las secuencias de
ARNr de 16S de las especies representativas de N.
meningitidis que mostraron una baja reactividad a la sonda
inicial, y se diseñó una segunda sonda. Estos datos demuestran la
diferencia de reactividad de las tres especies de N.
meningitidis a las dos sondas. En este ejemplo, se amplificó
ARN purificado de Neisseria gonorrhoeae (ATCC nº 19424), ó
lisados de Neisseria meningitidis serogrupo A (ATCC nº
13077), serogrupo C (ATCC nº 13102) y serogrupo L (ATCC nº 43828),
representando aproximadamente 1.000 células, con un
cebador-promotor y el cebador descrito en el ejemplo
5 en las condiciones descritas en el ejemplo 5. Se ensayaron
muestras de diez \mul de los 100 \mul de las reacciones de
amplificación, mediante hibridación con una sonda marcada con éster
de acridinio sintetizada con la secuencia
5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID
NO. 3 y una sonda auxiliar sin marcar sintetizada con la secuencia
5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3,
(SEQ ID NO. 4), ó una sonda marcada con éster de acridinio
sintetizada con la secuencia
5'-GGCTGTTGCTAATATCAGCG-3' (SEQ ID
NO. 11) y dos sondas auxiliares sin marcar, una sintetizada con la
secuencia
5'-GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGA
AAA-3' (SEQ ID NO. 13) y la otra sintetizada con la secuencia 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAG
CACCGGC-3' (SEQ ID NO. 14), ó una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia
5'-GGCTGTTGCTAATACCAGCG-3' (SEQ ID NO. 12) con sondas auxiliares sin marcar SEQ ID NO: 13 Y 14 ó con una combinació de sondas marcadas SEQ ID NO: 11 Y 12 empleadas con sondas auxiliares sin marcar SEQ ID NO: 13 Y 14. El análisis de las secuencias indicó que las otras cepas de Neisseria amplificarán también con estos cebadores.
AAA-3' (SEQ ID NO. 13) y la otra sintetizada con la secuencia 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAG
CACCGGC-3' (SEQ ID NO. 14), ó una sonda marcada con éster de acridinio sintetizada con la secuencia
5'-GGCTGTTGCTAATACCAGCG-3' (SEQ ID NO. 12) con sondas auxiliares sin marcar SEQ ID NO: 13 Y 14 ó con una combinació de sondas marcadas SEQ ID NO: 11 Y 12 empleadas con sondas auxiliares sin marcar SEQ ID NO: 13 Y 14. El análisis de las secuencias indicó que las otras cepas de Neisseria amplificarán también con estos cebadores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos muestran que las cepas de N.
meningitidis y N. gonorrhoeae pueden ser amplificadas
empleando cebadores que comprenden las SEQ ID Nos. 7 y 9, y
detectadas con las sondas de SEQ ID Nos. 3, 11 y 12.
\newpage
En este experimento, se demostró la sensibilidad
de la amplificación y del ensayo de detección para la N.
meningitidis. En este ejemplo, se cultivaron células de la
Neisseria meningitidis serogrupo C, y se suspendieron en
0,9% de cloruro de sodio a una densidad de aproximadamente 10^{9}
células por ml. Las células se lisaron siguiendo la adición de un
volumen igual de una solución conteniendo 3% (p/v) de lauril sulfato
de litio, 30 mM de fosfato de sodio (pH 6,8), 1 mM de EDTA, 1 mM de
EGTA y se diluyeron con agua antes de la adición a las reacciones
de amplificación. Las amplificaciones de efectuaron como se ha
descrito en el ejemplo 5 empleando el cebador promotor y el cebador
descrito en el ejemplo 5 (SEQ ID Nos. 7 y 9, respectivamente). Se
analizaron veinte \mul de la reacción mediante hibridación en el
formato HPA empleando una sonda marcada con éster de acridinio
sintetizada con la secuencia
5'-GGCTGTTGC
TAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO. 11) y dos sondas auxiliares sin marcar, una de ellas sintetizada con la secuencia 5'-GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAA-3' (SEQ ID NO. 13) y la otra sintetizada con la secuencia 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGC-3' (SEQ ID NO. 14).
TAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO. 11) y dos sondas auxiliares sin marcar, una de ellas sintetizada con la secuencia 5'-GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTCAGGGAAGAAAA-3' (SEQ ID NO. 13) y la otra sintetizada con la secuencia 5'-GCTGATGACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGC-3' (SEQ ID NO. 14).
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar la reactividad y especificidad de
las sondas dirigidas al ARNr 16S de la N. meningitidis, una
mezcla de sondas que contienen oligonucleótidos marcados con éster
de acridinio, sintetizada con la secuencia
5'-CGCTGA
TATTAGCAACAGCC-3', (SEQ ID NO. 15) ó la secuencia 5'-CGCTGGTATTAGCAACAGCC-3', SEQ ID NO. 16), y sondas auxiliares sin marcar sintetizadas con la secuencia 5'-TTTTCTTCCCTGACAAAAGTCCTTTACAACCC
GAAGGC-3' (SEQ ID NO. 17 y 5'-GCCGGTGCTTATTCTTCAGGTACCGTCATCAG-3' (SEQ ID NO. 18), fueron hibridadas con ácido nucleico en lisados preparados a partir de cultivos frescos de Nisseria especies relacionados más adelante. Cada lisado se analizó con una sonda dirigida a la región conservada de ARNr 23S para confirmar la lisis del organismo y la integridad del ARNr.
TATTAGCAACAGCC-3', (SEQ ID NO. 15) ó la secuencia 5'-CGCTGGTATTAGCAACAGCC-3', SEQ ID NO. 16), y sondas auxiliares sin marcar sintetizadas con la secuencia 5'-TTTTCTTCCCTGACAAAAGTCCTTTACAACCC
GAAGGC-3' (SEQ ID NO. 17 y 5'-GCCGGTGCTTATTCTTCAGGTACCGTCATCAG-3' (SEQ ID NO. 18), fueron hibridadas con ácido nucleico en lisados preparados a partir de cultivos frescos de Nisseria especies relacionados más adelante. Cada lisado se analizó con una sonda dirigida a la región conservada de ARNr 23S para confirmar la lisis del organismo y la integridad del ARNr.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
* \begin{minipage}[t]{150mm} la mezcla de sondas contenía
sondas marcadas con éster de acridinio sintetizadas con las
secuencias SEQ ID NO. 15 y SEQ ID NO. 16 y sondas auxiliares sin
marcar sintetizadas con las secuencias SEQ ID NO. 17 y SEQ ID NO.
18.\end{minipage} \cr}
Los datos muestran que la mezcla de sondas
permitió la detección de todas las cepas de N. meningitidis
analizadas. La mezcla de sondas mostró una reacción cruzada con la
N. cinerea, un organismo improbable de ser encontrado en las
mismas muestras clínicas que la N. meningitidis. El
tratamiento de pacientes con infecciones de N. cirenea sería
el mismo que para los pacientes infectados con N.
meningitidis.
Este ejemplo demuestra la especificidad del
ensayo de amplificación y detección. Treinta pmoles del
cebador-promotor comprendiendo la SEQ. ID. NO. 7 y
30 pmoles del cebador comprendiendo la SEQ. ID. NO. 9 se emplearon
en el ensayo con once especies diferentes de Neisseria. Los
lisados celulares se prepararon como se ha descrito en el ejemplo 5
y se amplificaron y analizaron mediante hibridación empleando las
condiciones descritas en el ejemplo 1. Veinte microlitros de las
reacciones de amplificación se hibridaron con una sonda marcada con
éster de acridinio sintetizada con la secuencia
5'-GCCAATATCGGCGGCCGATG-3' (SEQ ID
NO. 3) y una sonda auxiliar sin marcar sintetizada con la secuencia
5'-ACGGTACCTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG-3'
(SEQ ID NO. 4), ó una sonda marcada con éster de acridinio
sintetizada con la secuencia
5'GGCTGTTGCTAATATCAGCG-3' (SEQ ID NO. 11) en
presencia de sondas auxiliares sin marcar sintetizadas con
secuencias comprendiendo SEQ ID NOs. 13 y 14, ó una sonda marcada
con éster de acridinio sintetizada con la secuencia
5'-GGCTGTTGCTAATACCAGCG-3' (SEQ ID
NO. 12) en presencia de las sondas auxiliares sin marcar SEQ ID NOs.
13 y 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos mostrados en los ejemplos descritos
más arriba confirman que los nuevos oligonucleótidos de
amplificación descritos en la presente son capaces de amplificar el
ácido nucleico de Neisseria y pueden emplearse en un
análisis para distinguir entre sí la Neisseria meningitidis y
la Neisseria gonorrhoeae, los vecinos filogenéticamente más
próximos conocidos. Ninguno de los ejemplos descritos en la presente
pretende limitar la presente invención a las versiones de esta
descripción, estando limitada dicha invención exclusivamente por las
reivindicaciones de más adelante.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: GEN-PROBE INCORPORATED
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 9880 Campus Point Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Diego
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CODIGO POSTAL (ZIP): 92121
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCION: SONDAS DE ACIDO NUCLEICO Y AMPLIFICACION DE OLIGONUCLEOTIDOS PARA ESPECIES DE NEISSERIA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 56
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- SOPORTE DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0,
\hskip5cmVersión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAACGTACCG GGTAGCGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGATAACTG ATCGAAAGAT CAGCTAATAC CGCATACG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAATATCG GCGGCCGATG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGTACCTG AAGAATAAGC ACCGGCTAAC TACGTG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCCCTGCT TTCCCTCTCA AGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGAGTGGC GAACGGGTGA GTAACATA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGCTGCAC GTAGTTAGCC GGTGCTTATT CTTCAG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTAGCCGGT GCTTATTCTT CAGGTACCGT CATCG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGTTGTAA AGGACTTTTG TCAGGGAAGA AAAGGCCGTT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGCCTTC GGGTTGTAAA GGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGTTGCT AATATCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGTTGCT AATACCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCTTCGGGT TGTAAAGGAC TTTTGTCAGG GAAGAAAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGATGACG GTACCTGAAG AATAAGCACC GGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTGATATT AGCAACAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCTGGTATT AGCAACAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTCTTCCC TGACAAAAGT CCTTTACAAC CCGAAGGC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGGTGCTT ATTCTTCAGG TACCGTCATC AGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGAAGAATA AGCACCGGCT AACTACGTGC AGCAGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGGCCTTT TCTTCCCTGA CAAAAGTCCT TTACAACCCG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGATGACGGT ACCTGAAGAA TAAGCACCGG CTAAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCTTTACA ACCCGAAGGC CTTC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTTGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATGTTACTC ACCCGTTCGC CACTCGCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCUGUUGCU AAUACCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUGAUAUU AGCAACAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCUGGUAUU AGCAACAGCC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCTACCCG GTACGTTC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATCGGCCGC CGATATTGGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAACGUACCG GGUAGCGG
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCAAUAUCG GCGGCCGAUG
\hfill20
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGCUACCCG GUACGUUC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAUCGGCCGC CGAUAUUGGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCUUCGGGU UGUAAAGGAC UUUUGUCAGG GAAGAAAA
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCUGAUGACG GUACCUGAAG AAUAAGCACC GGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUUUUCUUCCC UGACAAAAGU CCUUUACAAC CCGAAGGC
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGGUGCUU AUUCUUCAGG UACCGUCAUC AGC
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAUAACUG AUCGAAAGAU CAGCUAAUAC CGCAUACG
\hfill38
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACGGUACCUG AAGAAUAAGC ACCGGCUAAC UACGUC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGUCCCCUGCU UUCCCUCUCA AGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGAGUGGC GAACGGGUGA GUAACAUA
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCUGCUGCAC GUAGUUAGCC GGUGCUUAUU CUUCAG
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGUUAGCCGGU GCUUAUUCUU CAGGUACCGU CAUCG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGUUGUAA AGGACUUUUG UCAGGGAAGA AAAGGCCGUU
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAAGGCCUUC GGGUUGUAAA GGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGUCUUGAGAG GGAAAGCAGG GGAC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipUAUGUUACUC ACCCGUUCGC CACUCGCC
\hfill28
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCUGAAGAAUA AGCACCGGCU AACUACGUGC AGCAGC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAUGACGGU ACCUGAAGAA UAAGCACCGG CUAAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGGCCUUU UCUUCCCUGA CAAAAGUCCU UUACAACCCG
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGUCCUUUUACA ACCCGAAGGC CUUC
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTTAATAC GACTCACTAT AGGGAGA
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGUAAAGUU AAUACCUUUG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCUGUUGCU AAUAUCAGCG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGIA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCUGUUGCC AAUAUCGGGG
\hfill20
Claims (37)
1. Un juego de oligonucleótidos de amplificación
útil para la determinación de la presencia de la Neisseria
gonorrhoeae en una muestra de ensayo, el cual juego de
oligonucleótidos de amplificación comprende:
un primer oligonucleótido de amplificación de
hasta 100 nucleótidos de longitud, que comprende una primera
secuencia la cual tiene una región de por lo menos 10 nucleótidos
que tiene el 100% de identidad de las bases con por lo menos una
región de 10 nucleótidos de la secuencia de SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID
NO: 43, siendo capaz dicho primer oligonucleótido de amplificación
de hibridar con una secuencia de ácido nucleico diana que consiste
en la secuencia SEQ ID NO: 19 ó SEQ ID NO: 49 en condiciones que
permiten que dicho primer oligonucleótido de amplificación actúe
como un cebador para la síntesis del ácido nucleico; y
un segundo oligonucleótido de amplificación de
hasta 100 bases de longitud, que comprende una primera secuencia que
tiene una región de por lo menos 10 nucleótidos que tiene el 100% de
identidad con las bases de una región de por lo menos 10 nucleótidos
de la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45, siendo capaz dicho
segundo oligonucleótido de amplificación de hibridar con una
secuencia de ácido nucleico diana que consiste en la secuencia de
SEQ ID NO: 20 ó SEQ ID NO: 51 en condiciones que permiten que dicho
segundo oligonucleótido de amplificación actúe como un cebador para
la síntesis del ácido nucleico.
2. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1, en donde cada uno de dichos primer y segundo
oligonucleótidos de amplificación tiene de 12 a 50 nucleótidos de
longitud.
3. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1 ó 2, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación comprende la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO:
43;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación comprende la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO:
45.
4. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1, en donde por lo menos uno de dichos primero
y segundo oligonucleótidos de amplificación incluye una secuencia
promotora reconocida por una ARN polimerasa o la cual potencia la
iniciación o alargamiento mediante una ARN polimerasa.
5. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 4, en donde dicha ARN polimerasa es la T7, T3 ó
la SP6 ARN polimerasa.
6. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 5, en donde dicha secuencia promotora consiste
en la secuencia SEQ ID NO: 53.
7. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
80% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y, opcionalmente, una secuencia promotora;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
80% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y, opcionalmente, una secuencia promotora; y
dicha secuencia promotora es reconocida mediante
una ARN polimerasa o potencia la iniciación o alargamiento mediante
una ARN polimerasa.
8. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
85% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y, opcionalmente, una secuencia promo-
tora;
tora;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
85% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y, opcionalmente, una secuencia promo-
tora; y
tora; y
dicha secuencia promotora es reconocida mediante
una ARN polimerasa o potencia la iniciación o alargamiento mediante
una ARN polimerasa.
\newpage
9. El juego de oligonucleótidos de amplificación
de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
90% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y, opcionalmente, una secuencia promotora;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
90% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y, opcionalmente, una secuencia promotora; y
dicha secuencia promotora es reconocida mediante
una ARN polimerasa o potencia la iniciación o alargamiento mediante
una ARN polimerasa.
10. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
95% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y, opcionalmente, una secuencia promotora;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en una secuencia que tiene por lo menos el
95% de bases idénticas a la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y, opcionalmente, una secuencia promotora; y
dicha secuencia promotora es reconocida mediante
una ARN polimerasa o potencia la iniciación o alargamiento mediante
una ARN polimerasa.
11. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de la reivindicación 1, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y, opcionalmente, una secuencia promotora;
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y, opcionalmente, una secuencia promotora; y
dicha secuencia promotora es reconocida mediante
una ARN polimerasa o potencia la iniciación o alargamiento mediante
una ARN polimerasa.
12. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de la reivindicación 11, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43
y dicha secuencia promotora; y
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO:
45.
13. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de la reivindicación 11, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43;
y
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO: 45
y dicha secuencia promotora.
14. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de la reivindicación 11, en donde:
la secuencia de dicho primer oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 7 ó SEQ ID NO: 43;
y
la secuencia de dicho segundo oligonucleótido de
amplificación consiste en la secuencia SEQ ID NO: 9 ó SEQ ID NO:
45.
15. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en
donde uno de dichos oligonucleótidos de amplificación tiene un
terminal 3' el cual está modificado para prevenir o disminuir la
cantidad de extensión del cebador de dicho oligonucleótido de
amplificación.
16. El juego de oligonucleótidos de
amplificación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15,
envasado en forma de un kit.
17. El kit de la reivindicación 16, que incluye
además una sonda para ensayo de hibridación de hasta 100 nucleótidos
de longitud que comprende un oligonucleótido que tiene por lo menos
una región de 10 nucleótidos que tiene el 100% de bases idénticas
con por lo menos una región de 10 nucleótidos en la secuencia SEQ ID
NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, ó SEQ ID NO: 34, en donde dicha
sonda hibrida con el ácido nucleico derivado de la Neisseria
gonorrhoeae y no con el ácido nucleico derivado de la
Neisseria meningitidis en condiciones restrictivas del ensayo
de hibridación.
18. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicho oligonucleótido tiene por lo menos el 80% de
bases idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
19. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicho oligonucleótido tiene por lo menos el 85% de
bases idéntica con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
20. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicho oligonucleótido tiene por lo menos el 90% de
bases idéntica con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
21. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicho oligonucleótido tiene por lo menos el 95% de
bases idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
22. El kit de la reivindicación 17, en donde
dicha sonda comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ
ID NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
23. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicha sonda tiene por lo menos el 80% de bases
idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:
32 ó la SEQ ID NO: 34.
24. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicha sonda tiene por lo menos el 85% de bases
idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:
32 ó la SEQ ID NO: 34.
25. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicha sonda tiene por lo menos el 90% de bases
idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:
32 ó la SEQ ID NO: 34.
26. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicha sonda tiene por lo menos el 95% de bases
idénticas con la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:
32 ó la SEQ ID NO: 34.
27. El kit de la reivindicación 17, en donde la
secuencia de dicha sonda consiste en la secuencia SEQ ID NO: 3, SEQ
ID NO: 30, SEQ ID NO: 32 ó la SEQ ID NO: 34.
28. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 27, en donde dicha sonda incluye una
marca.
29. El kit de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 28, que incluye además un oligonucleótido
auxiliar hasta 100 nucleótidos de longitud y comprende por lo menos
una región de 10 nucleótidos que tiene por lo menos el 80% de bases
idénticas con por lo menos una región de 10 nucleótidos de la
secuencia SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 40.
30. El kit de la reivindicación 29, en donde
dicho oligonucleótido auxiliar comprende la secuencia SEQ ID NO: 4 ó
SEQ ID NO: 40.
31. El kit de la reivindicación 29, en donde la
secuencia de dicho oligonucleótido auxiliar consiste en la secuencia
SEQ ID NO: 4 ó SEQ ID NO: 40.
32. Una composición que comprende dicho juego de
oligonucleótidos de amplificación de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, y dicha sonda de ensayo de hibridación de
una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 28.
33. La composición de la reivindicación 32, que
comprende además dicho oligonucleótido auxiliar de una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 31.
34. Un método para la amplificación de una
secuencia diana presente en el ácido nucleico derivado de la
Neisseria gonorrhoeae en una muestra de ensayo, comprendiendo
dicho método:
a) puesta en contacto de dicha muestra con dicho
juego de oligonucleótidos de amplificación de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15; y
b) exposición de dicha muestra en las
condiciones que permitan que dicha secuencia diana sea amplificada
en presencia de dicho juego de oligonucleótidos de
amplificación.
35. Un método para la determinación de la
presencia de una secuencia diana presente en el ácido nucleico
derivado de la Neisseria gonorrhoeae en una muestra de
ensayo, comprendiendo dicho método:
a) puesta en contacto de dicha muestra con dicho
juego de oligonucleótidos de amplificación de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15;
b) exposición de dicha muestra en las
condiciones que permitan que dicha secuencia diana sea amplificada
en presencia de dicho juego de oligonucleótidos de amplificación;
y
c) determinación de si dicha secuencia diana, o
un amplicón de la misma, está presente en dicha muestra como
indicación de la presencia de Neisseria gonorrhoeae en dicha
muestra.
36. El método de la reivindicación 35, en donde
dicho paso de determinación comprende el proporcionar a dicha
muestra, dicha sonda de ensayo de hibridación de una cualquiera de
las reivindicaciones 17 a 28.
37. El método de la reivindicación 36, que
incluye además dicho oligonucleótido auxiliar de una cualquiera de
las reivindicaciones 29 a 31.
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