ES2281078T3 - Procedimiento de tratamiento de tejidos que contienen celulosa usando composiciones de la enzima celulolasa truncada. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS MEJORADOS DE TRATAMIENTO DE TEJIDOS QUE CONTIENEN CELULOSA, CON CELULASA, LOS CUALES CONSISTEN EN PONER EN CONTACTO LOS TEJIDOS DE CELULOSA, CON ENZIMA CELULASA TRUNCADA. SE DESCRIBE EL TRATAMIENTO DE TEJIDOS QUE CONTIENEN CELULOSA, CON DOMINIOS DEL NUCLEO DE LA CELULASA, LOS CUALES PRESENTAN VENTAJAS ESPECIFICAS DE REDEPOSICION DEL COLORANTE REDUCIDA E INCREMENTO DEL ASPECTO USADO.

Description

Procedimiento de tratamiento de tejidos que contienen celulosa usando composiciones de la enzima celulolasa truncada.

La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado para tratar con celulasa tejidos que contienen algodón y tejidos con celulosa que no contienen algodón. En particular, el procedimiento de la presente invención se refiere a poner en contacto tejidos que contienen algodón y tejidos que no contienen algodón con una composición que contiene una composición de celulasa que comprende uno o más enzimas celulasa truncados.

Estado de la técnica

Durante su fabricación o poco después, los tejidos que contienen algodón pueden tratarse con celulasa para proporcionar al tejido propiedades deseables. Por ejemplo, en la industria textil, la celulasa ha sido utilizada para mejorar el tacto y/o la apariencia de tejidos que contienen algodón, para eliminar fibras superficiales de los tejidos que contienen algodón, para proporcionar la apariencia de lavado a la piedra a tejanos y similares que contienen algodón.

En particular, las solicitudes de patente japonesas 58-36217 y 58-54032 así como también Ohishi et al., "Reformation of Cotton Fabric by Cellulase" y el artículo de JTN en Diciembre de 1988 "What’s New - Weight Loss Treatment to Soften the Touch of Cotton Fabric" describen que el tratamiento con celulasa de telas que contienen algodón proporciona un tacto mejorado a la tela. Generalmente se cree que este tratamiento con celulasa elimina la borrilla y/o las fibras superficiales del algodón reduciendo el peso de la tela. La combinación de estos efectos proporciona un tacto mejorado a la tela.

Adicionalmente, en el campo de la técnica era conocido el tratamiento de telas con una solución de celulasa, bajo condiciones de agitación y en cascada, por ejemplo mediante la utilización de un chorro, con el propósito de eliminar las fibras e hilos rotos habituales en estas telas tejidas.

Las prendas de vestir confeccionadas con telas de celulosa, como los tejanos de algodón, tienen una textura rígida debido a la presencia de composiciones de apresto utilizadas para facilitar la fabricación, el manejo y el conjuntado de artículos de confección y normalmente la apariencia es de un teñido reciente e intenso. Una característica deseable de la ropa tejana teñida con índigo es la modificación de los hilos teñidos con hilos blancos, lo que proporciona al tejano una apariencia de blanco sobre azul.

Después de un periodo largo de uso y lavado, en los artículos de confección, en particular los tejanos, se pueden desarrollar variaciones en la profundidad o la densidad del color, en forma de aclarado, localizadas en las piezas y las costuras de la prenda de vestir. Adicionalmente, a menudo puede aparecer un desgaste general de las prendas de vestir, así como fruncidos y algunas arrugas en las piezas de tela. Adicionalmente, después del lavado, se elimina sustancialmente el apresto de la tela resultando en una sensación más suave. En los últimos años, la apariencia de usado o "lavado a la piedra" se ha convertido en muy deseable para una parte sustancial del público.

Los procedimientos anteriores para proporcionar esa apariencia de usado incluían el lavado a la piedra de una pieza de vestir en un baño de grandes dimensiones con piedras piedra pómez con un tamaño de partícula de aproximadamente 1 a 10 pulgadas y con partículas de piedra pómez más pequeñas generadas por la naturaleza abrasiva del procedimiento. Normalmente, la prenda de vestir se voltea con la piedra pómez mientras está húmeda durante un periodo suficiente como para que la piedra pómez desgaste la tela para provocar zonas desgastadas de color más claro localizadas en las piezas de tela y zonas más claras similares en las costuras. Adicionalmente la piedra pómez suaviza la tela y provoca una superficie con pelusa parecida a la producida por el uso y el lavado de la tela durante un periodo largo. Este procedimiento genera el efecto deseado de contraste de blanco sobre azul descrito arriba.

El uso de las piedras pómez tiene varias desventajas, incluyendo los daños por sobrecarga de los motores de las máquinas, el daño mecánico en los mecanismos de transporte y en los tambores de lavado, problemas con la eliminación al medio de la arena que se produce y gastos elevados de costura asociados con la eliminación manual de las piedras que quedan en los bolsillos de las prendas.

En vista de los problemas asociados con las piedras pómez en el lavado a la piedra, se utilizan las soluciones de celulasa como un sustituto de las piedras pómez bajo condiciones de agitación y en cascada, es decir, en una máquina de lavado de tambor rotatorio, para generar una apariencia de "lavado a la piedra" a los tejanos (Patente US 4832864). El documento EP-A-0307564 también describe el uso de la celulosa para proporcionar una apariencia de tela lavada a la piedra.

Las celulasas son enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces \beta-1,4-D-glucano) y proporcionan glucosa, celobiosa, celooligosacáridos, y similares como productos principales. Las celulasas las producen varios microorganismos y comprenden varias clasificaciones enzimáticas diferentes que incluyen aquellas identificadas como exo-celobiohidrolasas (en inglés exo-cellobiohydrolases, CBH), endoglucanasas (EG) y \beta-glucosidasas (BG) (Schulein, M, 1988 Methods in Enzymology 160: 235-242).

\newpage

Los enzimas incluidos en estas clases pueden separarse en componentes individuales. Por ejemplo, la celulosa producida por los hongos filamentosos, Trichoderma longibrachiatum, en adelante T. longibrachiatum, consiste en al menos dos componentes CBH, es decir CBHI y CBHII, y al menos cuatro componentes EG, es decir, los componentes EGI, EGII, EGIII y EGV (Saloheimo, A. et al. 1993 in Proceedings of the second TRICEL symposium on Trichoderma reesei Cellulases and Other Hydrolases, Espoo, Finland, ed. por P. Suominen & T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8:139-146), y al menos una \beta-glucosidasa. Los genes que codifican estos componentes se denominan cbh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, y egl5 respectivamente.

El sistema completo de celulasa que comprende los componentes CBH, EG y BG actúa sinérgicamente en la conversión de celulosa cristalina a glucosa. Las dos exo-celobiohidrolasas y las cuatro endoglucanasas conocidas actúan conjuntamente para hidrolizar la celulosa a celo-oligosacáridos pequeños. Los oligosacáridos (principalmente celobiosas) se hidrolizan a glucosa mediante las principales \beta-glucosidasas (con una hidrólisis adicional de componentes menores de las \beta-glucosidasas).

Un problema con el uso de composiciones completas de celulasa de microorganismos Trichoderma sp. y de otras fuentes fúngicas para el lavado a la piedra de la ropa tejana teñida es la eliminación incompleta del colorante provocada por la redeposición o el reteñido de parte del tinte que vuelve a teñir la ropa durante el procedimiento de lavado a la piedra. En el caso de telas tejanas, esto causa la recoloración de los hilos azules y la coloración de los hilos blancos, resultando en menos contraste entre los hilo azules y los blancos y los puntos de abrasión (es decir, una apariencia de azul sobre azul en vez del blanco sobre azul preferido). Ver, American Dyestuff Reporter, Sept. 1990, pp. 24-28. Esta redeposición es inaceptable para parte de los usuarios.

Son preferidas las celulasas de Trichoderma a causa de su actividad superior sobre las telas tejanas, incluso aunque provoquen el reteñido. Adicionalmente, las celulasas con un alto nivel de pureza pueden ser beneficiosas en la presente invención. La alta actividad específica o un alto nivel de pureza resultan en un nivel de abrasión más elevado con un procesamiento significativamente más corto y por lo tanto es preferible para los fabricantes de ropa tejana.

Los intentos de reducir la cantidad del tinte que se redeposita incluyen la adición de productos químicos adicionales, como surfactantes, proteasas u otros agentes, en el lavado de celulasa para ayudar a dispersar el tinte desprendido. Adicionalmente, los fabricantes utilizan una celulasa completa menos activa, conjuntamente con lavados extra. Aún así, esto resulta en costes adicionales y en tiempos de procesado mayores. Otro procedimiento incluye el uso de un agente suave del tipo lejía o un agente para la eliminación del tinte. Este procedimiento afecta al tono final de la prenda e incrementa el tiempo de procesamiento. Finalmente, para el fabricante la utilización conjunta de enzimas y piedras comporta todos los problemas que causa la utilización sólo de piedras. Por lo tanto, es deseable encontrar un procedimiento para prevenir la redeposición del colorante durante el lavado a la piedra con celulasas.

El análisis de proteínas de las celobiohidrolasas (CBHI y CBHII) y de las principales endoglucanasas (EGI y EGII) de T. longibrachiatum muestra que existe una organización bifuncional en forma de un dominio del centro catalítico y un dominio de unión para celulosa más pequeño separados por un conector o una región bisagra flexible de aminoácidos rica en prolina y hidroxiaminoácidos. A partir de T. longibrachiatum se han aislado genes para las dos celobiohidrolasas, CBHI y CBHII (Shoemaker, S et al 1983 Bio/Technology 1, 691-696, Teeri, T et al 1983, Bio/Technology 1, 696-699 y Teeri, T. et al, 1987, Gene 51, 43-52) y para dos de las endoglucanasas principales, EGI y EGII (Penttila, M. et al 1986, Gene 45, 253-263, Van Arsdell, J.N/ et al 1987 Bio/Technology 5, 60-64 y Saloheimo, M. et al 1988, Gene 63, 11-21) y se ha confirmado la estructura del dominio proteico.

En las celulasas bacterianas se encuentra una organización bifuncional de enzimas celulasa similar. Se han estudiado extensivamente el dominio de unión celulasa (CBD) y el centro catalítico de la endoglucanasa A de Cellulomonas fimi (C. fimi Cen A) (Ong E. et al 1989, Trends Biotechnol. 7:239-243, Pilz et al 1990, Biochem J. 271:277-280 y Warren et al 1987, Proteins 1:335-341). Se han clonado los fragmentos génicos que codifican el CBD y el CBD con el conector, expresado en E. coli y han demostrado tener nuevos efectos sobre las fibras de celulosa (Gilkes, N.R. et al 1991, Microbiol. Rev. 55:305-315 y Din, N et al 1991, Bio/Technology 9:1096-1099). Por ejemplo, el CBD aislado a partir de C. fimi Cen A expresado genéticamente en E. coli rompe la estructura de las fibras de celulosa y libera pequeñas partículas pero no tiene una actividad hidrolítica detectable. El CBD además tiene un amplio espectro de aplicaciones en la purificación de proteínas y en la inmovilización enzimática. Por otro lado, el dominio catalítico de C. fimi Cen A aislado a partir de la celulasa escindida por proteasa no rompe la estructura fibrosa de la celulosa y en vez de ello suaviza la superficie de la fibra.

Utilizando este procedimiento bioquímico se han separado proteolíticamente y se han purificado los dominios del centro CBHI de Trichoderma longibrachiatum obteniendo solamente cantidades del orden de miligramos (Offord D., et al 1991, Applied Biochem. and Biotech. 28/29:377-386). Se han llevado a cabo estudios similares para el análisis de los dominios de centro y de unión de CBHI, CBHII, EGI y EGII aislados a partir de T. longibrachiatum después de proteólisis bioquímica, pero sólo se recuperó proteína suficiente para un análisis estructural y funcional (Tomme, P et al, 1988, Eur.J. Biochem 170:575-581 y Ajo, S, 1991 FEBS 291:45-49). Por lo tanto, en el estado de la técnica no se han reconocido las posibles mejoras en el procesado textil que proporciona el uso de regiones de dominios de centros celulasa o de unión de celulasa.

Resumen de la invención

Uno de los objetos de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el tratamiento de telas que contienen celulosa que tiene como resultado una redeposición reducida y un nivel equivalente de abrasión de la tela tratada en comparación con los procedimientos conocidos en la técnica anterior.

De acuerdo con la presente invención se proporciona un procedimiento como el definido en la reivindicación 1 para el tratamiento de telas que contienen celulosa con una composición de celulasa. La composición de celulasa comprende un enzima truncado que comprende un centro catalítico de tipo CBH que carece de un dominio de unión celulasa. Preferiblemente, el centro truncado de celulasa comprende un centro CBHI o CBHII. Más preferiblemente, la concentración de celulasa es de aproximadamente 0,1 a 1000 ppm, más preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 250 ppm.

A causa de la actividad de redeposición sorprendentemente reducida de las composiciones de enzima celulasa truncada de acuerdo con la presente invención, las telas que contienen celulosa podrían mejorarse de una manera sorprendente en cuanto al lavado a la piedra con una composición apropiada que contenga el enzima truncado.

Una ventaja de la presente invención es que se emplea una composición de celulasa que comprende un enzima con centro truncado de celulasa en combinación con una celulasa no truncada del tipo EG que comprende un dominio de unión a celulosa y un centro catalítico, que le otorgan características deseables a las telas que contienen celulosa.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1(a)-1(b) muestra el ADN genómico y la secuencia de aminoácidos del CBHI derivado a partir de Trichoderma longibrachiatum. La secuencia de señalización comienza en el par de bases 210 y acaba en el par de bases 260 (Seq ID No. 25). El dominio del centro catalítico comienza en el par de bases 261 hasta el par de bases 671 del primer exón, el par de bases 739 hasta el par de bases 1434 del segundo exón, y el par de bases 1498 hasta el par de bases 713 del tercer exón (Seq ID No. 9). La secuencia del conector comienza en el par de bases 714 y acaba en el par de bases 1785 (Seq ID No. 17). El dominio de unión comienza en el par de bases 1786 y acaba en el par de bases 1888 (Seq ID No. 1). Las secuencias Seq ID Nos. 26, 10, 18 y 2 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señalización CBHI, el dominio del centro catalítico, la región del conector y el dominio de unión, respectivamente.

La figura 2(a)-2(b) muestra el ADN genómico y la secuencia de aminoácidos del CBHII derivado a partir de Trichoderma longibrachiatum. La secuencia de señalización comienza en el par de bases 614 y acaba en el par de bases 685 (Seq ID No. 27). El dominio de unión de celulosa comienza en el par de bases 686 hasta el par de bases 707 del exón número uno, el par de bases 755 hasta el par de bases 851 del exón número dos (Seq ID No. 3). La secuencia del conector comienza en el par de bases 852 y acaba en el par de bases 980 (Seq ID No. 19). El dominio del centro catalítico comienza en el par de bases 981 hasta el par 1141 del exón número dos, el par de bases 1199 hasta el par de bases 1445 del exón número tres, y el par de bases 1536 hasta el par de bases 2221 del exón número cuatro (Seq ID No. 11). Las secuencias Seq ID Nos. 28, 4, 20 y 12 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señalización CBHII, el dominio de unión, la región del conector y el dominio del centro catalítico, respectivamente.

La figura 3 muestra el ADN genómico y la secuencia de aminoácidos del EGI. La secuencia de señalización comienza en el par de bases 113 y acaba en el par de bases 178 (Seq ID No. 29). El dominio del centro catalítico comienza en el par de bases 179 hasta el par de bases 882 del primer exón, y el par de bases 963 hasta el par de bases 1379 del segundo exón (Seq ID No. 13). La secuencia del conector comienza en el par de bases 1380 y acaba en el par de bases 1460 (Seq ID No. 21). El dominio de unión de la celulosa comienza en el par de bases 1461 y acaba en el par de bases 1616 (Seq ID No. 5). Las secuencias Seq ID Nos. 30, 14, 22 y 6 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señalización EGI, el dominio del centro catalítico, la región del conector y el dominio de unión, respectivamente.

La figura 4 muestra el ADN genómico y la secuencia de aminoácidos del EGII. La secuencia de señalización comienza en el par de bases 262 y acaba en el par de bases 324 (Seq ID No. 31). El dominio de unión de celulosa comienza en el par de bases 325 y acaba en el par de bases 432 (Seq ID No. 7). La secuencia del conector comienza en el par de bases 433 y acaba en el par de bases 534 (Seq No. 23). El dominio del centro catalítico comienza en el par de bases 535 hasta el par 590 del exón número uno, el par de bases 765 hasta el par de bases 1689 del exón número dos (Seq ID No. 15). Las secuencias Seq ID Nos. 32, 8, 24 y 16 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señalización EGI, el dominio de unión, la región del conector y el dominio del centro catalítico, respectivamente.

La figura 5 muestra el ADN genómico y la secuencia de aminoácidos del EGIII. La secuencia de señalización comienza en el par de bases 151 y acaba en el par de bases 198 (Seq No. 35). El dominio del centro catalítico comienza en el par de bases 199 hasta el par 557 del exón número uno, el par de bases 613 hasta el par de bases 833 del exón número dos y el par de bases 900 hasta el par de bases 973 del exón número tres (Seq ID No. 33). Las secuencias Seq ID Nos. 36 y 34 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señalización EGIII y el dominio del centro catalítico, respectivamente.

La Figura 6 ilustra la construcción del vector de expresión del dominio del centro EGI (Seq ID No. 37).

La Figura 7 ilustra la construcción del plásmido de expresión pTEX (Seq ID No. 39-41).

La Figura 8 ilustra la construcción del vector de expresión del dominio del centro CBHI (Seq ID No. 38).

La Figura 9 ilustra la construcción del vector de expresión del dominio del centro CBHII (Seq ID No. 39).

La Figura 10 ilustra los resultados de abrasión/redeposición que se obtienen y compara el centro EGI con EGI y el centro EGII con EGII.

La Figura 11 ilustra la mejora en los resultados de abrasión/redeposición de ropa tejana tratada con EGIII añadiendo CBHI.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

"Tela que contiene algodón" significa telas cosidas o sin coser hechas con algodón puro o mezclas de algodón que incluyen telas de algodón tejidas, telas de algodón de punto, telas de algodón tejanas, hilos de algodón y similares. Cuando se emplean mezclas de algodón, la cantidad de algodón en la tela debería ser de aproximadamente al menos el 40 por ciento en peso de algodón; preferiblemente, más de aproximadamente el 60 por ciento en peso de algodón; y más preferiblemente, más de aproximadamente el 75 por ciento en peso de algodón. Cuando se emplea en forma de mezclas, el otro material que se emplea en la tela puede incluir una o más fibras distintas al algodón incluyendo fibras sintéticas como las fibras de poliamida (por ejemplo nylon 6 y nylon 66), fibras acrílicas (por ejemplo, fibras de poliacrilonitrilo), y fibras de poliéster (por ejemplo, tereftalato de polietileno), fibras de alcohol polivinílico (por ejemplo, Vinylon), fibras de cloruro de polivinilo, fibras de cloruro de polivinilideno, fibras de poliuretano, fibras de poliurea y fibras de aramida.

"Tela que contiene celulosa" significa cualquier tela celulósica que contiene o no contiene algodón o mezcla que contiene o no contiene algodón incluyendo celulósicos naturales y celulósicos fabricados por el hombre (como yute, lino, ramié, rayón, TENCEL^{TM}). Entre las telas del título fabricadas por el hombre que contienen celulosa se incluyen telas regeneradas que son conocidas en la técnica anterior como el rayón. Otras telas fabricadas por el hombre que contienen celulosa incluyen fibras de celulosa modificadas químicamente (por ejemplo, celulosa derivada con acetato) y fibras de celulosa hilada en solvente (por ejemplo, lyocell). Por supuesto, la definición de tela que contiene celulosa incluye cualquier prenda o hilo hecho con tales materiales. De manera similar, "tela que contiene celulosa" incluye fibras textiles fabricadas de tales materiales.

"Composición de lavado a la piedra" significa una formulación para uso en telas lavadas a la piedra que contienen celulosa. Las composiciones de lavado a la piedra se utilizan para modificar las telas que contienen celulosa antes de ponerlas para la venta al público, es decir, durante el proceso de fabricación, a diferencia de las composiciones detergentes que se suponen para el lavado de prendas sucias.

"Lavado a la piedra" se refiere al tratamiento de una tela de color que contiene celulasa con una solución de celulasa en condiciones de agitación y en cascada, es decir, en una máquina de lavado de tambor rotatorio, que aporta una apariencia de "lavado a la piedra" a la ropa tejana. En la patente US 4832864 se describen procedimientos para proporcionar una apariencia de tela lavada a la piedra. Generalmente, las técnicas de lavado a la piedra se aplican a la ropa tejana teñida.

"Celulasa de redeposición" se refiere a las celulasas que, al utilizarlas en el lavado a la piedra enzimático o en otros tratamientos de telas que contienen celulosa que utilizan soluciones de celulasa, provocan la redeposición del tinte sobre el sustrato. Este efecto a menudo se denomina "backstaining". Dicho "backstaining" de la tela conlleva un lavado a la piedra incompleto debido a que en vez del contraste de azul sobre blanco deseado, la redeposición provoca una coloración azul sobre azul. Las celulasas de redeposición incluyen aquellas derivadas de microorganismos tales como el microorganismo fúngico Trichoderma sp. y similares. En particular, EGI, EGII, CGHI y CBHII son conocidos por mostrar un comportamiento de redeposición significativo en su estado no truncado.

"Agente activo de superficie o surfactante" se refiere a surfactantes aniónicos, no iónicos y amfolíticos conocidos por su uso en composiciones detergentes.

"Medio de lavado" se refiere a una solución acuosa de lavado preparada mediante la adición al agua de la cantidad necesaria de una composición detergente. El medio de lavado generalmente contiene una cantidad de detergente efectiva para la limpieza.

"Enzimas celulolíticos" o "Enzimas celulasa" se refieren a exoglucanasas fúngicas o exo-celobiohidrolasas, endoglucanasas, y \beta-glucosidasas. Estos tres tipos diferentes de enzimas celulasa actúan sinérgicamente para convertir celulosa y sus derivados en glucosa. El análisis de los genes que codifican CBHI, CBHII, EGI, EGII y EGV en Trichoderma longibrachiatum muestran una estructura del dominio que comprende una región o dominio de centro catalítico (CCD), una región bisagra o conector (utilizado de manera equivalente en el presente documento) y una región o dominio de unión de celulosa (CBD).

En el presente documento, a una composición de celulasa producida por una fuente natural y que comprende uno o más tipos de celobiohidrolasa y endoglucanasas donde cada uno de estos componentes se encuentra en la proporción producida por la fuente, se le denomina ocasionalmente como "Sistema completo de celulasa" o como "composición completa de celulasa" para distinguirla de las clasificaciones y los componentes de la celulasa aislados a partir de ella, de las composiciones incompletas de celulasa producidas por bacterias y algunos hongos, de una composición de celulasa que se obtiene a partir de un microorganismo genéticamente modificado de tal manera que se potencie la producción, que se disminuya la producción, o que no produzca uno o más de los tipos de celobiohidrolasa y/o tipos de endoglucanasa que son componentes de la celulasa, o de una composición enzimática de celulasa truncada, como se define en el presente documento.

La presente invención contempla específicamente la aplicabilidad de las celulasas que contienen regiones de dominios de centro y de unión como se define en las reivindicaciones. Por ejemplo, las celulasas bacterianas de Thermonospora sp., Cellulomonas sp., Bacillus sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp. son conocidas por tener región de dominio de unión y región del centro.

Para el uso en la presente invención se prefieren las celulasas fúngicas. Más preferiblemente, las celulasas fúngicas derivan de Trichoderma sp., incluyendo Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Penicillium sp., Humicola. sp., incluyendo Humicola insolens, Aspergillus sp., y Fumarium sp. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." se refiere a cualquier cepa que haya sido clasificada previamente como Trichoderma o que esté clasificada como Trichoderma. Más preferiblemente, la celulasa deriva de Trichoderma longibrachiatum o Trichoderma viride.

"Celulasa fúngica" se refiere a una composición enzimática que proviene de fuentes fúngicas o de microorganismos genéticamente modificados para incorporar o expresar todo o parte de los genes celulasa obtenidos de una fuente fúngica. Los hongos capaces de producir celulasas útiles en la preparación de las composiciones de celulasa descritas en el presente documento se describen en la patente GB 2094826A.

Generalmente, la mayoría de las celulasas fúngicas presentan su actividad óptima a pH ácido o neutro, aunque se conocen algunas celulasas fúngicas que poseen una actividad significativa en condiciones neutras o ligeramente alcalinas, es decir, por ejemplo, la celulasa derivada a partir de Humicola Insolens es conocida por ser activa en condiciones de neutras a ligeramente alcalinas.

Se conoce que las celulasas fúngicas están comprendidas en varias clasificaciones enzimáticas con diferente especificidad respecto al sustrato, diferentes patrones de acción enzimática, y similares. Adicionalmente, los componentes enzimáticos de cada clasificación pueden mostrar diferentes pesos moleculares, diferentes grados de glicosilación, diferentes puntos isoeléctricos, diferente especificidad respecto al sustrato, etc. Por ejemplo, las celulasas fúngicas pueden contener clasificaciones de celulasa que incluyan componentes tipo endoglucanasa (en adelante "Tipo EG"), componentes tipo exo-celobiohidrolasa (en adelante "Tipo CBH"), componentes tipo \beta-glucosidasa (en adelante "Tipo BG"), etc. Por otro lado, mientras que en la literatura se afirma que las celulasas bacterianas contienen poco o ningún componente del tipo CBH, hay unos pocos casos en los que se ha descrito que los componentes del tipo CBH derivados de las celulasas bacterianas poseen actividad exo-celobiohidrolasa.

En la técnica se conocen los procedimientos de fermentación para el cultivo de hongos y para la producción de celulasa. Por ejemplo, los sistemas de celulasa se pueden producir tanto mediante cultivo sólido como por cultivo sumergido, incluyendo procedimientos discontinuos, alimentados ("fed-batch"), y continuos. La recolección y la purificación de los sistemas de celulasa a partir del caldo de cultivo también pueden llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos en la técnica.

"Componentes del tipo endoglucanasa" o "tipo EG" se refiere a componentes de la celulasa fúngica o una combinación de componentes que muestran propiedades activas en el textil parecidas a los componentes endoglucanasa de Trichoderma longibrachiatum (anteriormente clasificada como Trichoderma reesei). A este respecto, los componentes endoglucanasa de Trichoderma longibrachiatum (por ejemplo, EGI, EGII, EGIII, y EGV, tanto solos como en combinación) son conocidos por proporcionar un tacto y apariencia mejorados, más suavidad, mejora en el color, y/o una apariencia de lavado a la piedra a las telas tejanas (en comparación con las características de la tela previas al tratamiento) cuando se añaden estos componentes al medio de tratamiento textil y la tela se trata con dicho medio.

De acuerdo con lo anterior, los componentes del tipo endoglucanasa son aquellos componentes celulasa que proporcionan mejoras específicas a las telas que contienen celulosa, tales como un tacto y apariencia mejoradas, más suavidad, mejora en el color, y/o una apariencia de lavado a la piedra (en comparación con la tela antes del tratamiento) cuando estos componentes se añaden a un medio utilizado para tratar las telas. Ciertos componentes del tipo EG, incluyendo EGI, EGII y EGIII, pueden proporcionar una menor pérdida de resistencia a las telas tejanas en comparación con la pérdida de resistencia propia del tratamiento con composiciones similares de celulasa que adicionalmente contienen componentes del tipo CBH I.

Tal como se definen en el presente documento, los componentes del tipo endoglucanasa pueden no incluir a los componentes clasificados tradicionalmente como endoglucanasas utilizando pruebas de actividad tales como la capacidad del componente (a) para hidrolizar derivados solubles de celulosa tales como la carboximetilcelulosa (CMC), por tanto reduciendo la viscosidad de las soluciones que contienen CMC, (b) para hidrolizar fácilmente formas hidratadas de celulosa tales como celulosa hinchada con ácido fosfórico (por ejemplo, celulosa Walseth) e hidrolizar menos fácilmente las formas de celulosa más cristalinas (por ejemplo, Avicel, Solkafloc, etc.). Por otro lado, se cree que no todos los componentes endoglucanasa, tal como se definen mediante dichas pruebas de actividad, proporcionarán una o más de las mejoras a las telas que contienen celulosa, incluyendo la reducción de la pérdida de resistencia. Consecuentemente, para los objetivos del presente documento, es apropiado definir los componentes del tipo endoglucanasa como aquellos componentes de celulasa fúngica que poseen propiedades de modificación de textiles similares a los componentes endoglucanasa de Trichoderma longibrachiatum.

Generalmente, los diferentes componentes tienen diferentes propiedades, tales como el punto isoeléctrico, el peso molecular, el grado de glicosilación, la especificidad de sustrato y los patrones de acción enzimática. Los diferentes puntos isoeléctricos de los componentes permiten su separación mediante técnicas tales como la cromatografía de intercambio iónico. De hecho, en la técnica se conoce el aislamiento de componentes de diferentes fuentes. Ver, por ejemplo, Bjork et al., patente US 5120463; Schulein et al., solicitud internacional WO 89/09259; Wood et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, pp. 31-52 (1988); Wood et al., Carbohydrate Research, Vol. 190, pp. 279-297 (1989); Schulein, Methods in Enzymology, Vol. 160, pp. 234-242 (1988); y similares.

El término "EGI" se refiere a un componente del tipo endoglucanasa normalmente derivado de, o que incorpora las características identificativas de aquellos que derivan de EGI de Trichoderma sp. Así, EGI se refiere a una endoglucanasa derivada de Trichoderma sp. caracterizada por un pH óptimo de aproximadamente 4,0 a 6,0, un punto isoeléctrico (pI) a partir de aproximadamente 4,5 a 4,7, y un peso molecular de aproximadamente 47 a 49 Kdaltons. Preferiblemente, EGI deriva de Trichoderma longibrachiatum o de Trichoderma viride. El EGI que deriva de Trichoderma longibrachiatum tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0, un punto isoeléctrico (pI) de aproximadamente 4,7 y un peso molecular de aproximadamente 47 a 49 Kdaltons. La celulasa EGI derivada de Trichoderma viride tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,0, un punto isoeléctrico (pI) de aproximadamente 5,3 y un peso molecular de aproximadamente 50 Kdaltons.

El término "EGII", tal como se define en el presente documento, se refiere a un componente del tipo endoglucanasa normalmente derivado de, o que incorpora las características identificativas de aquellos que derivan de EGII de Trichoderma sp. A modo de aclaración, se indica que algunos autores habían utilizado la nomenclatura "EGIII" para referirse a EGII, aunque la nomenclatura actual utiliza el término EGII. En cualquier caso, la proteína EGII definida en el presente documento es sustancialmente diferente a la proteína EGIII en su peso molecular y en sus pI y pH óptimos. El término "celulasa EGII" se refiere a un componente endoglucanasa derivado de Trichoderma spp. caracterizado por un pH óptimo de aproximadamente 4,0 a 6,0, un punto isoeléctrico (pI) a partir de aproximadamente 5,5, y un peso molecular de aproximadamente 48 Kdaltons. Preferiblemente, la celulasa EGII deriva de Trichoderma longibrachiatum o de Trichoderma viride.

El término "celulasa EGIII", tal como se define en el presente documento, se refiere a un componente del tipo endoglucanasa normalmente derivado de, o que incorpora las características identificativas de aquellos que derivan de EGIII de Trichoderma sp. Así, EGIII se refiere a una endoglucanasa derivada de Trichoderma spp. caracterizada por un pH óptimo de aproximadamente 5,0 a 7,0, un punto isoeléctrico (pI) a partir de aproximadamente 7,2 a 8,0, y un peso molecular de aproximadamente 23 a 28 Kdaltons. Preferiblemente, la celulasa EGIII deriva de Trichoderma longibrachiatum o de Trichoderma viride. Así, la celulasa EGIII derivada de Trichoderma sp. tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,5 a 6,0, un punto isoeléctrico (pI) de aproximadamente 7,4, y un peso molecular de aproximadamente 25 a 28 Kdaltons. La celulasa EGIII derivada de Trichoderma viride tiene un pH óptimo de aproximadamente 5,5, un punto isoeléctrico (pI) de aproximadamente 7,7, y un peso molecular de aproximadamente 23,5 Kdaltons.

El término "celulasa EGV", tal como se define en el presente documento, se refiere a un componente del tipo endoglucanasa, normalmente derivado de, o que incorpora las características identificativas de aquellos que derivan de la EGV de Trichoderma sp. Así, EGV se refiere al componente endoglucanasa derivado de Trichoderma spp. caracterizado por Saloheimo et al., Molecular Microbiology 13(2):219-228 (1994); y Proceedings of the Second TRICEL Symposium on Trichoderma reesei Cellulases and other Hydrolases, Esppo Finland 1993, ed. P. Suominen & J.T. Reinikainen. Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research 8, pp. 139-146 (1993).

"Componentes del tipo exocelobiohidrolasa" o "tipo CBH" son componentes de celulasa fúngica que muestran propiedades textiles activas parecidas a las de los componentes celulasa CBH I y/o CBH II de Trichoderma longibrachiatum. A este respecto, cuando los componentes CBH I y CBH II de Trichoderma longibrachiatum se utilizan en ausencia de componentes celulasa de tipo EG (como se define arriba), no proporcionan ninguna mejora en el tacto, apariencia, suavidad, mejora del color y/o apariencia de lavado a la piedra de las telas tejanas. Adicionalmente, cuando se usan en combinación con algunos componentes del tipo EG, en una proporción de aproximadamente 2,5:1 de CBH I respecto a los componentes EG, el componente CBH I de Trichoderma longibrachiatum proporciona una pérdida de resistencia mejorada a las telas tejanas.

En consecuencia, los componentes de tipo CBH I y los componentes de tipo CBH II se refieren a componentes de celulasa fúngica que muestran propiedades de actividad textil similares a las de los componentes CBH I y CBH II de Trichoderma longibrachiatum, respectivamente. Como se muestra arriba, para los componentes del tipo CBH I, esto incluye la propiedad de incrementar la pérdida de resistencia en telas tejanas tratadas con CBH I en presencia de componentes del tipo EG.

Los componentes del tipo Exo-celobiohidrolasa que se definen en el presente documento pueden no incluir componentes tradicionalmente clasificados como exo-celobiohidrolasas utilizando pruebas de actividad como las utilizadas para caracterizar CBH I y CBH II de Trichoderma longibrachiatum. Por ejemplo, los componentes del tipo exo-celobiohidrolasa (a) se inhiben competitivamente por la celobiosa (Ki aproximadamente 1 mM); (b) son incapaces de hidrolizar celulosas sustituidas a cualquier nivel significativo, tal como carboximetilcelulosa, y (c) hidroliza celulosa hinchada con ácido fosfórico y en menor medida celulosa altamente cristalina. Por otro lado, se cree que algunos componentes de la celulasa que se han caracterizado como componentes del tipo CBH mediante estos ensayos de actividad, cuando se utilizan solos en la composición de celulasa proporcionarán un tacto, apariencia, suavidad, color, y/o una apariencia de lavado a la piedra mejorados a las telas que contienen celulosa. En consecuencia, para finalidad de la presente invención, se cree más apropiado definir tales celobiohidrolasas como componentes del tipo EG ya que estos componentes poseen propiedades funcionales en usos textiles similares a aquellas que poseen los componentes endoglucanasa de Trichoderma longibrachiatum.

En general, las composiciones de celulasa que comprenden la variedad de componentes de una composición completa de celulasa ("celulasa completa") pueden obtenerse mediante técnicas de purificación basadas en sus características y propiedades conocidas. Específicamente, los componentes sustancialmente puros pueden purificarse a partir de la celulasa completa mediante técnicas de separación reconocidas presentes en el estado de la técnica, incluyendo cromatografía de intercambio iónico a un pH apropiado, cromatografía de afinidad, de exclusión por tamaños y similares. Por ejemplo, en la cromatografía de intercambio iónico (normalmente cromatografía de intercambio aniónico), es posible separar los componentes de la celulasa mediante la elución con gradiente de pH, o con un gradiente de sal, o con ambos gradientes de pH y sal. Después de la purificación, la cantidad que se precisa de los componentes deseados puede recombinarse.

El término "celulasa truncada", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una proteína que comprende un centro catalítico truncado de celulasa o un dominio de unión truncado para celulosa de exo-celobiohidrolasa o de endoglucanasa, por ejemplo, del tipo EGI, EGII, EGV, CBHI, CBHII, o sus derivados. Tal como se indica arriba, se cree que muchos enzimas celulasa son bifuncionales ya que contienen dominios que están dirigidos a la actividad catalítica o a la hidrolítica respecto al sustrato de celulosa, y también a la actividad no catalítica de unión a celulosa. Así, una celulasa truncada es una celulasa que, en su forma intacta, contiene un centro y un dominio de unión pero que se trata de manera que carezca de uno u otro de los dominios.

Se cree que el centro catalítico y el dominio de unión para celulosa de un enzima celulasa actúan juntos de forma sinérgica para provocar la hidrólisis efectiva y a menudo perjudicial de las fibras de celulosa en una tela que contiene celulosa. Además, se cree que la actividad catalítica de la celulasa y la actividad de unión con celulosa son específicas de dominios estructurales distintos. Por ejemplo, tal como se indica arriba, es sabido que muchos de los enzimas celulasa, incluyendo celulasas de, por ejemplo, T. longibrachiatum y Humicola insolens, incorporan una subunidad de dominio del centro catalítico que está unida a través de una región de un conector a una subunidad de dominio de unión de celulosa.

Un "derivado truncado de celulasa" incluye un centro de celulasa truncada o un dominio de unión truncado de celulosa, tal como se define en el presente documento, donde puede haber una adición o deleción de uno o más aminoácidos en uno o en ambos de los extremos C y N-terminales de la celulasa truncada, o una sustitución, inserto o deleción de uno o más aminoácidos en uno o más de sitios a lo largo de la celulasa truncada. Los derivados incluyen mutantes que preservan su carácter de centro truncado de celulasa o de dominio de unión truncado de celulosa, tal como se define a continuación. El término "derivado de una celulasa truncada" incluye dominios de centros o de unión de los enzimas exoglucanasa o endoglucanasa que tienen unidos uno o más aminoácidos de la región del conector.

Un derivado truncado de celulasa también se refiere a una proteína sustancialmente similar en su estructura y en su actividad biológica a un centro de celulasa truncada o una proteína de dominio truncado de unión de celulosa, pero que ha sido genéticamente modificado para contener una secuencia de aminoácidos modificada. Así, dado que las dos proteínas tienen una actividad sustancialmente similar, se consideran "derivados" incluso si la estructura primaria de una de las proteínas no tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la que se encuentra en la otra.

Se contempla que un derivado truncado de celulasa puede derivar de un fragmento de ADN que codifica un centro catalítico truncado o un dominio truncado de unión de celulosa que además contiene una adición de uno o más nucleótidos, internamente o en el extremo 5' o 3' del fragmento de ADN, la deleción de uno o más nucleótidos, internamente o en el extremo 5' o 3' del fragmento de ADN o la sustitución de uno o más nucleótidos, internamente o en el extremo 5' o 3' del fragmento de ADN donde que mantiene la actividad funcional del dominio truncado de unión de celulosa o del dominio del centro catalítico (derivado de celulasa truncada). Un fragmento de ADN que codifica un centro catalítico de celulasa o un dominio de unión de celulosa además puede incluir una secuencia de ADN conector o bisagra o uno de sus fragmentos unido al extremo 5' o 3' de la secuencia de ADN del centro catalítico o del dominio de unión, manteniendo la actividad funcional del dominio truncado de unión de celulosa o del dominio del centro celulasa (derivado de celulasa truncada) codificados.

El término "centro celulasa truncado" o "región celulasa truncado" en el presente documento se refiere a un péptido que comprende el dominio de centro catalítico de exo-celobiohidrolasa o endoglucanasa, por ejemplo, del tipo EGI, del tipo EGII, del tipo EGV, del tipo CBHI, del tipo CBHII, o uno de sus derivados que es capaz de escindir enzimáticamente polímeros de celulosa, incluyendo, pero estar limitado a, la pulpa o a la celulosa hinchada con ácido fosfórico. Sin embargo, un centro truncado de celulasa no presentará una actividad de unión de celulosa atribuible a un dominio de unión de celulosa. Un centro truncado de celulasa se distingue de una celulasa no truncada que presenta, en su forma intacta, una baja actividad de unión con celulosa. Un centro truncado de celulasa puede incluir otros elementos que no presenten actividad de unión con celulosa atribuible a un dominio de unión de celulosa. Por ejemplo, específicamente se contempla la presencia de un conector o bisagra. De manera similar, también se contempla específicamente la unión covalente de otra entidad enzimática al centro truncado de celulasa.

La capacidad (o actividad) de una proteína que contiene un centro catalítico truncado o sus derivados puede determinarse mediante los procedimientos conocidos en la técnica. (Ver, Wood, T.M. et al en Methods in Enzymology, Vol. 160, Editores: Wood, W.A. and Kellogg, S.T., Academic Press, pp. 87-116, 1988). Por ejemplo, tales actividades pueden determinarse mediante la hidrólisis de celulosa hinchada con ácido fosfórico y/o oligosacáridos solubles seguidos de la cuantificación de los azucares reductores liberados. En este caso, los productos de tipo azúcar soluble, liberados por la acción de los dominios de los centros celulasa CBH o EG o sus derivados, pueden detectarse mediante el análisis HPLC o mediante la utilización de ensayos colorimétricos para la medición de azúcares reductores. Se espera que estos dominios catalíticos o sus derivados mantengan al menos un 10% de la actividad mostrada por el enzima intacto cuando se ensaya cada uno de ellos bajo condiciones similares y se dosifican en base a cantidades similares de proteína de dominio catalítico.

El término "dominio truncado de unión de celulosa" en el presente documento se refiere a un péptido o un grupo de péptidos relacionados que presentan actividad de unión con celulosa de una exo-celobiohidrolasa o una endoglucanasa, por ejemplo, del tipo EGI, del tipo EGII, del tipo EGV, del tipo CBHI, o del tipo CBHII, o sus derivados que se enlazan no covalentemente a un polisacárido, por ejemplo la celulosa. Se cree que los dominios de unión celulosa unen el enzima a la celulosa y funcionan independientemente del centro catalítico del enzima celulasa. Un dominio truncado de unión a celulosa no presentará la actividad hidrolítica significativa atribuible a un centro catalítico. Un dominio de unión truncado de celulosa se distingue de una celulasa no truncada en que, en su forma intacta, no tiene un centro catalítico celulasa. Un dominio truncado de unión de celulosa puede incluir otros elementos que no incluyan actividad de escisión de celulosa atribuible a un centro catalítico celulasa. Por ejemplo, se contempla específicamente la presencia de un conector o una bisagra. De manera similar, también se contempla específicamente la unión covalente de otro elemento enzimático al dominio de unión truncado de celulosa.

La capacidad (o actividad) de un dominio truncado de unión de celulosa o sus derivados como se describen en la presente invención pueden determinarse mediante ensayos de unión de celulosa utilizando sustratos de celulosa como por ejemplo avicel, pulpa o algodón. Se espera que estos nuevos dominios truncados de unión de celulosa o sus derivados mantengan al menos un 10% de la afinidad de enlace en comparación con la mostrada por el enzima no truncado cuando se ensaya cada uno de ellos en condiciones similares y se dosifican en base a cantidades similares de proteína de dominio de unión. La cantidad de dominio de unión no enlazado puede cuantificarse mediante análisis directo de proteínas, mediante procedimientos cromatográficos, o posiblemente mediante procedimientos inmunológicos.

También pueden ser apropiados para la presente invención otros procedimientos conocidos en la técnica que miden la actividad catalítica y/o de unión de la celulasa mediante las propiedades físicas o químicas de sustancias concretas tratadas. Por ejemplo, en los procedimientos que miden las propiedades físicas de un sustrato tratado, se analiza el sustrato por la modificación de la forma, textura, superficie, o propiedades estructurales, por la modificación de la capacidad de mojado, por ejemplo por la capacidad del sustrato de absorber agua, o por la modificación de la hinchado. Otros parámetros que pueden determinar la actividad incluyen la medida del cambio de las propiedades químicas de sustratos sólidos tratados. Por ejemplo, las propiedades de difusión de tintes o productos químicos pueden examinarse después del tratamiento de un sustrato sólido con la proteína truncada de unión de celulasa o con sus derivados descritos en la presente invención. Los sustratos apropiados para la evaluación de la actividad incluyen Avicel, rayón, fibras de pulpa, algodón o fibras de ramie, papel, kraft o pulpa de madera molida. (ver también, Wood, T.M. et al en "Methods in Enzymology", Vol. 160, Editores: Wood, W.A. and Kellogg, S.T., Academic Press, pp. 87-116, (1988)).

Además del centro truncado de celulasa, las celulasas naturales que carecen del dominio de unión poseen las ventajas de los centros catalíticos truncados descritos en el presente documento. Por ejemplo, se cree que la celulasa bacteriana que deriva de Erwinia carotovora no tiene dominio de unión, (Ver, por ejemplo, Saarilahti, et al. Gene, Vol. 90, pp. 9-14 (1990)). De manera similar, se cree que la celulasa bacteriana que deriva de Clostridium thermocellum tampoco tiene dominio de unión, (Ver, por ejemplo, Gilkes, et al., Microbiological Reviews, pp. 303-315 (1991)). Así, la utilización de las celulasas de origen natural sin dominios de unión a niveles equivalentes de abrasión respecto a las celulasas conocidas proporcionará un reteñido reducido.

"Componentes B-Glucosidasa (BG)" se refiere a componentes de una composición completa de celulasa que muestran actividad BG; tanto es así que tales componentes actuarán en el extremo no reductor de la celobiosa y otros celooligosacáridos solubles ("celobiosa") y dan glucosa como único producto. Los componentes BG no se absorben ni reaccionan con polímeros de celulosa. Además, tales componentes BG se inhiben competitivamente por la glucosa (Ki aproximadamente 1 mM). Mientras que en un sentido estricto, los componentes BG exactamente no son celulasas debido a que no degradan celulosa, tales componentes BG se incluyen en la definición del sistema celulasa ya que estos enzimas facilitan la degradación general de la celulosa mediante la degradación adicional de los productos inhibidores de la degradación de la celulosa (particularmente celobiosa) producidos por la acción combinada de los componentes de tipo CBH y de tipo EG.

Los procedimientos para incrementar o reducir la cantidad de los componentes BG en las composiciones de celulasa se describen en WO92/10581, la cual se incorpora en su totalidad por referencia al presente documento.

"Región de conector o bisagra" se refiere a una región peptídica corta que une distintos centros catalíticos y dominios de unión de celulosa estructuralmente diferentes de una celulasa. Por ejemplo, en las celulasas de T. longibrachiatum estos dominios se enlazan mediante un péptido rico en Ser, Thr y Pro.

"Secuencia de señalización" se refiere a una secuencia de aminoácidos unida al fragmento N-terminal de una proteína que facilita la secreción de la forma madura de la proteína fuera de la célula. Esta definición de una secuencia de señalización es una definición funcional. La forma madura de la proteína extracelular carece de la secuencia de señalización que se escinde durante el proceso de secreción.

"Célula hospedadora" se refiere a una célula que actúa como hospedador para un vector recombinante de ADN según la presente invención.

"Constructo de ADN o vector" (utilizado indistintamente en el presente documento) se refiere a una secuencia de nucleótido que comprende uno o más fragmentos de ADN o fragmentos variantes de ADN que codifican cualquiera de las nuevas celulasas truncadas o sus derivados descritos arriba.

"Funcionalmente unido a" significa que una región reguladora, como es un promotor, un terminador, una señal de secreción o una región de potenciador está unida a un gen estructural y controla la expresión de dicho gen.

"Tampón" se refiere a los reactivos ácido/base conocidos en la técnica por estabilizar las soluciones de celulasa contra cambios de pH no deseados durante el tratamiento con celulasa de la tela que contiene celulosa. En relación a esto, en la técnica se conoce que la actividad de la celulasa es dependiente del pH. Por ejemplo, una composición de celulasa específica que muestra actividad celulolítica en un intervalo definido de pH, con una actividad celulolítica óptima que se encuentra generalmente en una pequeña porción de este intervalo definido. El intervalo de pH específico para la actividad celulolítica variará para cada composición de celulasa. Como se indica arriba, mientras la mayoría de las celulasas mostrarán actividad celulolítica en un pH entre ácido y neutro, hay algunas composiciones de celulasa que muestran actividad celulolítica en un medio de pH alcalino.

Durante el tratamiento con celulasa de la tela que contiene celulosa, es posible que el pH de la solución inicial de celulasa pueda estar fuera del intervalo necesario para la actividad celulasa. Además es posible que el pH cambie durante el tratamiento de la tela que contiene celulosa, por ejemplo, mediante la generación de un producto de reacción que altera el pH de la solución. En ambas situaciones, el pH una solución de celulasa sin tamponar puede estar fuera del intervalo necesario para la actividad celulolítica. Cuando esto ocurre, también se da una reducción o un cese de la actividad celulolítica en la solución de celulasa.

En vista de lo anterior, el pH de la solución de celulasa debería mantenerse dentro del intervalo necesario para la actividad celulolítica. Uno de las medios de cumplir esto es simplemente mediante la monitorización del pH del sistema y el ajuste del pH cuando sea necesario añadiendo un ácido o una base. Sin embargo, en una realización preferida, el pH del sistema preferiblemente se mantiene en el intervalo de pH deseado mediante la utilización de un tampón en la solución celulasa. En general, se emplea una cantidad suficiente de tampón para mantener el pH de la solución en el intervalo donde la celulasa utilizada muestra actividad. En la medida en que las diferentes composiciones de celulasa tienen diferentes intervalos de pH en los que muestran actividad celulasa, el tampón específico que se utiliza se selecciona en relación con la composición de celulasa específica que se utiliza. El tampón o los tampones seleccionados para su utilización con la composición celulasa empleada pueden determinarse fácilmente por el experto en la materia teniendo en cuenta el intervalo de pH y el pH óptimo para la composición de celulasa empleada así como el pH de la solución de celulasa. Preferiblemente, el tampón utilizado es uno que sea compatible con la composición de celulasa y que mantendrá el pH de la solución de celulasa entre el intervalo de pH necesario para una actividad óptima. Los tampones apropiados incluyen citrato sódico, acetato de amonio, acetato de sodio, fosfato de disodio, y cualquier otro tampón conocido en la técnica.

II. Preparación de enzimas celulasa truncados

La presente invención se refiere a la utilización de celulasas truncadas y derivados de celulasas truncadas. Estos enzimas están preparados preferiblemente mediante procedimientos recombinantes. Adicionalmente, las proteínas celulasa truncadas para la utilización en la presente invención pueden obtenerse por otros medios conocidos en la técnica como por ejemplo la escisión química o la proteolísis de la proteína celulasa completa.

Un procedimiento preferido para la preparación de celulasa truncada de acuerdo con la presente invención comprende obtener una célula hospedadora Trichoderma sp. modificada en la que se han perdido una o varias de las actividades celulasa. La célula modificada Trichoderma sp. se transforma con un constructo de ADN que comprende al menos un fragmento de ADN que codifica una porción o toda la región del centro o de unión de una exo-celobiohidrolasa o una endoglucanasa, por ejemplo, EGI, EGII, EGV, CBHI o CBHII unidas funcionalmente a un promotor. A continuación, la célula hospedadora transformada se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión de la proteína deseada. A continuación, el producto proteico deseado se purifica hasta una homogeneidad sustancial.

Preferiblemente, el microorganismo que se transforma comprende una cepa derivada de Trichoderma sp. Más preferiblemente, la cepa comprende una cepa de T. longibrachiatum que sobreproduce celulasa. Por ejemplo, se conoce que RL-P37, descrita por Sheir-Neiss et al. en Appl. Microbiol. Biotechnology, 20 (1984) pp. 46-53, secreta cantidades elevadas de enzimas celulasa. Los equivalentes funcionales de RL-P37 incluyen la cepa RUT-C30 de Trichoderma longibrachiatum (depositada bajo el número de deposito ATCC No. 56765) y los números de depósito ATCC 58351, 58352, y 58353.

Aún más preferiblemente, a las cepas de Trichoderma de células hospedadoras se les ha delecionado uno o más genes celulasa antes de la introducción de un constructo de ADN o un plásmido que contiene el fragmento de ADN que codifica la proteína truncada de celulasa. Tales cepas pueden prepararse mediante el procedimiento descrito en la patente US 5246853 y WO 92/06209. Los procedimientos de identificación y de la subsiguiente purificación se simplifican mediante la expresión de una celulasa truncada en un microorganismo hospedador que ha perdido uno o más de los genes celulasa. Cualquiera de los genes de Trichoderma sp. clonados pueden ser delecionados, por ejemplo, los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl3.

La deleción de los genes puede realizarse mediante la inserción de una forma del gen que se desea delecionar o destruir en un plásmido, mediante procedimientos conocidos en la técnica. Un plásmido de deleción apropiado en general tendrá un único sitio de restricción enzimático para permitir que pueda eliminarse el fragmento de ADN homólogo de Trichoderma sp. en forma de un único fragmento lineal. A continuación se corta el plásmido de deleción en un(os) sitio(s) de restricción enzimática apropiados, internamente a la región de codificación, y se reemplaza la secuencia de codificación del gen o una de sus partes con un marcador selectivo. Las secuencias de ADN adyacentes al locus del gen a delecionar o destruir, preferiblemente entre aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 kb, permanecen a cada lado del gen marcador selectivo.

Un marcador selectivo puede escogerse de manera que se permita la detección del hongo transformado. Será apropiado cualquier gen marcador que se exprese en el microorganismo seleccionado. Por ejemplo, con Trichoderma sp., el marcador selectivo se escoge de manera que la presencia del marcador selectivo en los transformantes no afecte significativamente a sus propiedades. Tal marcador selectivo puede ser un gen que codifica un producto que pueda ensayarse. Por ejemplo, puede utilizarse una copia funcional de un gen de Trichoderma sp. si el hecho de carecer de él lleva a la cepa hospedadora a mostrar un fenotipo auxotrófico.

En una realización preferida, se transforma una cepa pyr4^{\pm} derivada de Trichodenna sp. de manera que uno o más genes celulasa se reemplazan por genes pyr4, proporcionando así un marcador selectivo. Puede obtenerse una cepa derivada de pyr4^{\pm} sometiendo cepas de Trichoderma sp. a ácido fluoroorótico (FOA). El gen pyr4 codifica la oritidina-5'-monofosfato decarboxilasa, un enzima necesario para la biosíntesis de la uridina. Las cepas con el gen pyr4 intacto crecen en un medio sin uridina pero son sensibles al ácido fluoroorotico. Es posible seleccionar cepas derivadas de pyr4^{\pm} que carezcan del enzima funcional de la oritidina-5'-monofosfato decarboxilasa y que requieran uridina para el crecimiento mediante la selección de la resistencia al FOA. Utilizando la técnica de selección FOA también es posible obtener cepas que precisen uridina y que carezcan de la orotato pirofosforibosil transferasa funcional. Es posible transformar estas células con una copia funcional del gen que codifica este enzima (Berges y Barreau, 1991, Curr. Genet. 19 pp.359-365). La selección de las cepas derivadas se lleva a cabo con facilidad mediante la utilización de la técnica de la resistencia a FOA comentada arriba, y así, se prefiere la utilización del gen pyr4 como marcador selectivo.

Para transformar el pyr4 de Trichoderma sp. de manera que carezca de la capacidad de expresar uno o más genes celulasa, a continuación se aísla del plásmido de deleción un solo fragmento de ADN que comprende un gen celulasa delecionado o destruido y se usa para transformar un hospedador pvr^{-} Trichoderma apropiado. A continuación, se identifican y se seleccionan los transformantes en base a su capacidad de expresar el producto del gen pyr4 y así cumplir con la auxotrofia de uridina de la cepa hospedadora. A continuación se llevan a cabo análisis de transferencia Sourthern sobre los transformantes resultantes para identificar y confirmar una situación de doble cruce sobre el acontecimiento de integración que sustituye con los marcadores selectivos pyr4 a una parte o a toda la región de codificación del gen a delecionar.

Aunque los vectores plásmidos específicos descritos arriba están relacionados con la preparación de transformantes pyr^{-}, la presente invención no está limitada a estos vectores. Varios genes se pueden delecionar y sustituirse en la cepa Trichoderma sp. utilizando las técnicas de arriba. Adicionalmente, puede utilizarse cualquier marcador selectivo disponible, tal como se describe arriba. De hecho, cualquiera de los genes de Trichoderma sp. que ha sido clonado e identificado puede delecionarse del genoma utilizando la estrategia descrita arriba.

Como se indica arriba, las cepas hospedadoras utilizadas son derivados de Trichoderma sp. que carecen del gen o genes o tienen un gen o genes no funcionales correspondientes al marcador selectivo escogido. Por ejemplo, si se elige el marcador selectivo de pyr4, en el procedimiento de transformación se utiliza un derivado de la cepa específica de pyr como recipiente. De manera similar, pueden utilizarse los marcadores selectivos que comprenden los genes Trichoderma sp. equivalentes a los genes argB^{\pm}, trpC^{\pm}, niaD^{\pm} de Aspergillus nidulans. En tal caso la correspondiente cepa recipiente debe ser un derivado de la cepa como por ejemplo argB^{\pm}, trpC^{\pm}, niaD^{\pm}, respectivamente.

A continuación se prepara el ADN que codifica la proteína celulasa truncada para la inserción en el organismo apropiado. Según la presente invención, el ADN que codifica un enzima celulasa truncado comprende ADN que codifica una proteína que corresponde a la región del centro catalítico del enzima celulasa. Por lo tanto, el ADN puede derivar de cualquier fuente microbiana que sea conocida por producir celulasa, en la que el gen sea identificado y aislado. En una realización preferida, el ADN codifica una proteína celulasa truncada derivada de Trichoderma sp., y más preferiblemente de Trichoderma longibrachiatum. Así, el ADN puede codificar una proteína del centro EGI, EGII, CBHI o CBHII. Preferiblemente, el fragmento de ADN del gen o la variante del fragmento de ADN codifica los dominios del centro o de unión de una celulasa Trichoderma sp. o sus derivados que adicionalmente mantiene la actividad funcional del dominio truncado del centro o de unión, respectivamente. Además, el fragmento de ADN o su variante que comprende la secuencia de las regiones de los dominios del centro o de unión puede tener unido un conector, o una secuencia de ADN de una región bisagra o uno de sus fragmentos donde la celulasa truncada codificada aún conserva el centro celulasa y la actividad del dominio de unión, respectivamente.

El fragmento de ADN o la variante del fragmento de ADN que codifica la celulasa truncada o su derivado puede estar unida funcionalmente a una secuencia promotor fúngica, por ejemplo, el promotor del gen cbhI o egl1. También se contempla que en la cepa pueda recombinarse más de una copia de ADN que codifica una celulasa trunca-
da.

El ADN que codifica la proteína celulasa truncada puede prepararse mediante la construcción de un vector de expresión que porta el ADN que codifica la celulasa truncada. El vector de expresión que porta insertado el fragmento de ADN que codifica la celulasa truncada puede ser cualquier vector con la capacidad de replicarse de manera autónoma en un organismo hospedador dado, generalmente un plásmido. En realizaciones preferidas de la invención, se contemplan dos tipos de vectores de expresión para obtener la expresión de los genes o sus truncamientos. Los primeros contienen secuencias de ADN en las que el promotor, la región de codificación del gen, y la secuencia de terminación provienen del gen a expresar. El truncamiento del gen se obtiene mediante la deleción de las secuencias de ADN no deseadas (que codifican dominios no deseados) para dejar el dominio a expresar bajo el control de su propias secuencias reguladoras de transcripción y traducción. El vector también contiene un marcador selectivo que permite la selección de la integración en el hospedador de múltiples copias de las nuevas secuencias génicas.

Por ejemplo, el pEGI\Delta3’pyr contiene el dominio del centro celulasa EGI bajo el control del promotor, terminador y secuencias de señalización de EGI. Se ha delecionado el extremo 3' de la región de codificación de EGI que contiene el dominio de unión de celulosa. El plásmido también contiene el gen pyr4 para la selección.

El segundo tipo de vectores de expresión está preensamblado y contiene secuencias necesarias para la transcripción de alto nivel y un marcador selectivo. La invención contempla que la región de codificación para un gen o una de sus partes puede insertarse en este vector de expresión de uso general de manera que esté bajo el control transcripcional de las secuencias del promotor y del terminador de los casetes de expresión.

Por ejemplo, el PTEX es un vector de expresión de uso general. Los genes o una de sus partes pueden insertarse en el sentido 3' ("Downstream") del promotor fuerte CBHI. Los ejemplos que se describen en el presente documento se incluyen entre los que muestran que el dominio del centro catalítico celulasa y el dominio de unión se expresan mediante este sistema.

En el vector, la secuencia de ADN que codifica la celulasa truncada o otra de las nuevas proteínas de la presente invención puede estar unida operativamente a secuencias de transcripción o traducción, es decir, a una secuencia de promotor y señalización apropiada en marco de lectura con el gen estructural. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN que muestra actividad transcripcional en la célula hospedadora y que puede derivar de genes que codifican proteínas homologas o heterólogas en la célula hospedadora. El péptido de señalización permite la expresión extracelular de la celulasa truncada o sus derivados. Preferiblemente, la secuencia de señalización de ADN es la secuencia de señalización asociada naturalmente con el gen truncado a expresar, sin embargo la señal de señalización de cualquier exocelobiohidrolasa o endoglucanasa está incluida en la presente invención.

Los procedimientos utilizados para unir las secuencias de ADN que codifican las celulasas truncadas, sus derivados u otras nuevas celulasas de la presente invención con el promotor, y la inserción en los vectores apropiados que contienen la información necesaria para la replicación en la célula hospedadora son conocidos en la técnica.

El vector de ADN o constructo descrito arriba puede introducirse en la célula hospedadora de acuerdo con técnicas conocidas tales como la transformación, la transfección, la microinyección, la microporación, el bombardeo con partículas ("biolistic bombardment") y similares.

En la técnica de transformación preferida se debe tener en cuenta que la permeabilidad de la pared celular de Trichoderma sp. es muy baja. Por lo tanto, la captación de la secuencia de ADN deseada, del gen o del fragmento del gen en el mejor de los casos es mínima. Hay varios procedimientos para incrementar la permeabilidad de la pared celular de las cepas derivadas de Trichoderma sp. (es decir, que carecen de un gen que corresponde al marcador selectivo utilizado) previamente al proceso de transformación.

El procedimiento preferido en la presente invención para preparar Trichoderma sp. para la transformación implica la preparación de protoplastos a partir de micelio fúngico. El micelio puede obtenerse a partir de esporas vegetales germinadas. El micelio se trata con un enzima que digiere la pared celular obteniendo protoplastos. A continuación, los protoplastos se protegen mediante la presencia de un estabilizante osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizantes incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Normalmente la concentración de estos estabilizantes varia entre 0,8 M y 1,2 M. Preferiblemente se utiliza una solución 1,2 M de sorbitol en el medio de suspensión.

La captación del ADN en la cepa hospedadora de Trichoderma sp. es dependiente de la concentración del ión calcio. Generalmente, en la solución de captación se utilizan entre aproximadamente 10 mM de CaCl_{2} y 50 mM de CaCl_{2}. A parte de la necesidad del ion calcio en la solución de captación, en el sistema tampón generalmente se incluyen otros elementos como son tampón TE (Tris 10 Mm, pH 7,4; EDTA 1 Mm) o MOPS 10 Mm, tampón pH 6,0 (ácido morfolinopropanosulfónico) y polietilenglicol (PEG). Se cree que el polietilenglicol actúa fusionando las membranas celulares permitiendo así que el contenido del medio se libere en el citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. y el plásmido de ADN se transfiera al núcleo. Frecuentemente, esta fusión deja múltiples copias del ADN plásmido integradas conjuntamente en el cromosoma hospedador.

Generalmente, en la transformación se utiliza una suspensión que contiene los protoplastos de Trichoderma sp. o las células que se ha sometido a un tratamiento de permeabilidad con una densidad de 10^{8} a 10^{9}/ml, preferiblemente 2 x 10^{8}/ml. Estos protoplastos o células se añaden a la solución de recogida, junto con el marcador selectivo que contiene regiones adyacentes sustancialmente homologas a cada lado de dicho marcador para formar una mezcla de transformación. Generalmente, a la solución de recogida se le añade una concentración alta de PEG. En la suspensión de protoplastos se puede añadir de 0,1 a 1 volumen de PEG 4000 al 25%. Sin embargo, es preferible añadir aproximadamente 0,25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. Los aditivos como, por ejemplo, dimetilsulfóxido, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares también pueden añadirse a la solución de recogida y contribuir a la transformación.

Generalmente, a continuación se incuba la mezcla a aproximadamente 0ºC durante un periodo entre 10 y 30 minutos. A continuación, se añade PEG adicional a la mezcla para mejorar más la recogida del gen o secuencia de ADN deseada. El PEG 4000 al 25% generalmente se añade en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, también pueden ser apropiados otros volúmenes mayores y menores. Preferiblemente el PEG 4000 al 25% es alrededor de 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se añada el PEG, la mezcla de transformación se incuba a temperatura ambiente antes de la adición de una solución de sorbitol y CaCl_{2}. A continuación, la solución de protoplasto se añade a alícuotas licuadas de un medio de crecimiento. Este medio de crecimiento sólo permite el crecimiento de transformantes. En la presente invención puede utilizarse cualquier medio de crecimiento que sea apropiado para el crecimiento de los transformantes deseados. Sin embargo, si se seleccionan los transformantes Pyr, es preferible utilizar un medio de crecimiento que no contenga uridina. Las subsecuentes colonias se transfieren y purifican en un medio de crecimiento empobrecido en uridina.

En esta fase, los transformantes estables se distinguieron de los transformantes inestables por su crecimiento más rápido y por la formación de colonias circulares con un contorno suave, en vez de irregular, en medio de cultivo sólido sin uridina. Adicionalmente, en algunos casos además se realizó un ensayo de estabilidad mediante el cultivo de los transformantes en un medio sólido no selectivo (es decir, que contiene uridina), recogiendo las esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que germinarán y crecerán en el medio selectivo que carece de uridina.

En una realización particular del procedimiento descrito arriba, las celulasas truncadas o sus derivados se recuperan de la célula hospedadora en su forma activa como resultado del adecuado procesamiento post traduccional de la nueva celulasa truncada o su derivado.

Las celulasas truncadas se recuperan del medio mediante técnicas convencionales que incluyen separaciones de las células del medio mediante centrifugación, filtración, y precipitación de proteínas en el sobrenadante o el filtrado con una sal, por ejemplo, sulfato de amonio. Adicionalmente, pueden utilizarse procedimientos de cromatografía tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad. Como alternativa, se puede aislar el producto proteico secretado y purificarse mediante la unión con un sustrato de polisacárido o una matriz de anticuerpos. Los anticuerpos (monoclonales o policlonales) pueden modificarse contra los péptidos del centro celulasa o del dominio de unión, o se pueden preparar péptidos sintéticos a partir de porciones del dominio de centro o del dominio de unión y utilizarlos para preparar anticuerpos policlonales.

El ADN transformado en la célula hospedadora puede comprender realizaciones adicionales. Por ejemplo, se contemplan enzimas celulasa que combinan una región de un centro derivado de una fuente microbiana homóloga o heteróloga.

III. Procedimientos De Tratamiento De Telas Que Contienen Celulosa Utilizando Los Enzimas Celulasa Truncados

Tal como se indica arriba, la presente invención está relacionada con procedimientos de tratamiento de telas que contienen celulosa con un enzima celulasa truncado. El uso de la celulasa truncada de la presente invención proporciona el resultado nuevo y sorprendente de producir un nivel relativamente bajo de redeposición del tinte mientras mantiene un nivel equivalente de abrasión comparado con el tratamiento con celulasa conocido en el estado de la técnica. Debido a que el nivel de abrasión actúa como indicador de la calidad y efectividad de las técnicas particulares de tratamiento con celulasa, por ejemplo, el lavado a la piedra o la lavandería, el uso de la presente invención proporciona una composición de tratamiento textil de calidad sorprendentemente alta. En el contexto de la lavandería, por abrasión se toma como el aclarado del color, eliminación de borrilla o biopulido.

La presente invención específicamente contempla el uso de centros celulasa truncados, solos o en combinación con componentes celulasa adicionales, para conseguir una abrasión excelente con una redeposición reducida en comparación con la celulasa no truncada. Adicionalmente, los enzimas celulasa naturales que carecen de dominio de unión se incluyen en el alcance de la protección. También se contempla que los procedimientos de la presente invención proporcionarán mejoras adicionales a las telas tratadas que contienen celulosa, incluyendo mejoras en el tacto y/o apariencia de la tela.

A. Metodología para el lavado a la piedra con composiciones de celulasa truncada

Según la presente invención, la composición de celulasa truncada se utiliza como se define en la reivindicación 1 como una composición para lavado a la piedra. Preferiblemente, la composición para el lavado a la piedra comprende una solución acuosa que contiene una cantidad efectiva de una celulosa truncada junto con otros ingredientes opcionales que incluyen, por ejemplo, un tampón, un surfactante, y un agente de erosión.

Una cantidad efectiva de composición de enzima celulasa truncado es una concentración de enzima celulasa truncado suficiente para el objeto al que se la destina. Así, una "cantidad efectiva" de celulasa truncada en la composición de lavado a la piedra según la presente invención es aquella cantidad que proporciona el tratamiento deseado, por ejemplo el lavado a la piedra. La cantidad de celulasa truncada empleada también es dependiente del equipo empleado, los parámetros del proceso utilizados (la temperatura de la solución de tratamiento de celulasa truncada, el tiempo de exposición a la solución de celulasa, y similares), y la actividad celulasa (por ejemplo, una solución particular requerirá una menor concentración de celulasa cuando se utilice una composición más activa de celulasa que cuando se utilice una composición menos activa de celulasa). El experto en la materia puede determinar fácilmente la concentración exacta de celulasa truncada basándose en los factores indicados arriba y en el resultado deseado. Preferiblemente, la composición de celulasa truncada está presente en una concentración de 1-1000 ppm, más preferiblemente 10-400 ppm y más preferiblemente 20-100 ppm de proteína total.

Opcionalmente, en la composición para el lavado a la piedra se utiliza un tampón de manera que la concentración del tampón es tal que es suficiente para mantener el pH de la solución dentro del intervalo donde la celulasa truncada utilizada muestra su actividad que, a su vez, depende de la naturaleza de la celulasa truncada que se utiliza. La concentración de tampón exacta que se utiliza dependerá de varios factores que el experto en la materia tendrá en cuenta fácilmente. Por ejemplo, en una realización preferida, tanto el tampón como la concentración de tampón se seleccionan de manera que se mantenga el pH de la solución final de celulasa truncada dentro del intervalo de pH necesario para la actividad óptima de la celulasa. Preferiblemente, la concentración del tampón es aproximadamente 0,001 N o mayor. Los tampones apropiados incluyen, por ejemplo, citrato y acetato.

Además de la celulasa truncada y el tampón, la composición para el lavado a la piedra opcionalmente puede incluir un surfactante. Preferiblemente, el surfactante está presente en los medios de lavado diluidos en una concentración mayor que 100 ppm, preferiblemente entre aproximadamente 200-15.000 ppm. Los surfactantes apropiados incluyen cualquier surfactante compatible con la celulasa y la tela, por ejemplo surfactantes aniónicos, no iónicos y amfolíticos. Los emulsionantes aniónicos apropiados para su utilización en la presente invención incluyen sulfonatos de alquilbenceno; sulfatos de alquilo o éter de alquenilo con grupos alquilo o alquenilo lineales o ramificados; sulfatos de alquilo o alquenilo; sulfonatos de oleofina; alcanosulfonatos y similares. Los contraiones apropiados para los surfactantes aniónicos incluyen iones metálicos alcalinos como el sodio y el potasio; iones metálicos alcalinotérreos como el calcio y el magnesio; el ion amonio; y alcanolaminas con 1 a 3 grupos alcanol de 2 ó 3 carbonos. Los surfactantes amfolíticos incluyen sulfonatos de sales de amonio cuaternarias, y surfactantes amfolíticos de tipo betaína. Tales surfactantes amfolíticos tienen grupos cargados positiva y negativamente en la misma molécula. Los surfactantes no iónicos generalmente comprenden tanto éteres de polioxialquileno como alcanolamidas de ácidos grasos superiores o sus aductos de oxido de alquileno, y monoésteres de glicerina y ácidos grasos. Como es conocido en la técnica, también pueden utilizarse mezclas de surfactantes.

En una realización preferida, una composición para el lavado a la piedra concentrada puede prepararse para su utilización en los procedimientos descritos en la presente invención. Tales concentrados contendrían cantidades concentradas de la composición de celulasa truncada descrita arriba, tampón y surfactante, preferiblemente en solución acuosa. Cuando se formula de esta manera, el concentrado para el lavado a la piedra puede diluirse fácilmente con agua de manera que se preparan composiciones para el lavado a la piedra según la presente invención rápidamente y con precisión y que tienen la concentración necesaria de estos aditivos. Preferiblemente, tales concentrados comprenderán de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 50 por ciento en peso de una composición fúngica de celulasa descrita arriba (proteína); de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 80% en peso de tampón; de aproximadamente 0 a aproximadamente 50% en peso de surfactante; completado con agua. Cuando se formulan concentrados acuosos, estos concentrados pueden estar diluidos para llegar a la concentración necesaria de los componentes en la solución de celulasa truncada tal como se indica arriba. Como resulta fácilmente evidente, tales concentrados para el lavado a la piedra permitirán tanto la formulación sencilla de las soluciones de celulasa truncada como el transporte de la concentración al lugar donde se utilizará. El concentrado para el lavado a la piedra puede estar en cualquiera de las formas reconocidas en la técnica, por ejemplo, líquido, emulsión, gel, o pasta. Tales formas son conocidas por el experto en la materia.

Cuando se utiliza un concentrado sólido para el lavado a la piedra, la composición de celulasa puede ser gránulos, polvo, aglomerado o un disco sólido. Cuando se utilizan gránulos, los gránulos preferiblemente se formulan de manera que contengan un agente protector de la celulasa. Ver, por ejemplo WO91/17235 titulada "GRANULES AND AN ENZYME PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING SUCH GRANULES". De la misma manera, los gránulos pueden formularse de manera que contengan materiales para reducir la velocidad de disolución de los gránulos en el medio de lavado. Tales materiales y gránulos se describen en la patente US 5254283.

Con la composición para el lavado a la piedra de la presente invención pueden añadirse o utilizarse otros materiales según se desee, incluyendo piedras, piedra pómez, agentes de relleno, disolventes, activadores enzimáticos, y otros agentes anti-redeposición.

La tela que contiene celulosa se pone en contacto con la composición para el lavado a la piedra que contiene una cantidad efectiva de la composición del enzima celulasa truncado mediante la mezcla de la composición de tratamiento con la composición de lavado a la piedra, y de esta manera se pone en contacto la tela con enzima celulasa truncado. Por ejemplo, si la composición de tratamiento es una solución acuosa, la tela se puede empapar directamente en la solución. De manera similar, cuando la composición es un concentrado, el concentrado se diluye en un baño de agua con la tela que contiene celulosa. Cuando la composición para el lavado a la piedra está en forma sólida, por ejemplo en un gel de prelavado o en una barra sólida, la composición para el lavado a la piedra puede ponerse en contacto mediante la aplicación directa de la composición a la tela o a la solución de lavado.

La tela que contiene celulosa se incuba en la solución para el lavado a la piedra en condiciones efectivas para permitir la acción enzimática y proporcionar una apariencia de lavado a la piedra a la tela que contiene celulosa. Por ejemplo, durante el lavado a la piedra, el pH, la relación de disolución de lavado, la temperatura y el tiempo de reacción pueden ajustarse para optimizar las condiciones en las cuales actúa la composición para el lavado a la piedra. "Condiciones efectivas" se refiere necesariamente al pH, la relación de disolución de lavado, y la temperatura que permiten al enzima celulasa truncado reaccionar eficientemente con la tela que contiene celulosa. Las condiciones de reacción para el centro truncado de celulasa, y por tanto las condiciones efectivas para las composiciones para el lavado a la piedra, son sustancialmente similares a procedimientos conocidos en la técnica que se utilizan con las correspondientes celulasas no truncadas. Por lo tanto, las condiciones efectivas para el tratamiento de telas que contienen celulosa con una composición para el lavado a la piedra que comprende centros del tipo CBHI son sustancialmente similares a aquellas conocidas en el estado de la técnica anterior que utilizan composiciones de celulasa CBHI natural. Por lo tanto, optimizar las condiciones para el uso de composiciones para el lavado a la piedra se encuentra entre los conocimientos del experto en la materia.

Las proporciones de la solución de lavado durante el lavado a la piedra, es decir, la proporción en peso de la solución de la composición para el lavado a la piedra (es decir, la solución de lavado) respecto al peso de la tela utilizado en la presente invención, generalmente es una cantidad suficiente para conseguir el efecto de lavado a la piedra deseado en la tela tejana y es depende del procedimiento utilizado. Preferiblemente, las proporciones del licor son aproximadamente 4:1 a aproximadamente 50:1, más preferiblemente de 5:1 a aproximadamente 20:1, y más preferiblemente de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 15:1.

Las temperaturas de reacción durante el lavado a la piedra con las presentes composiciones para el lavado a la piedra se rigen mediante dos factores en competición. Primero, las temperaturas altas generalmente corresponden a cinéticas de reacción mejoradas, es decir, a reacciones más rápidas, que permiten unos tiempos de reacción reducidos en comparación con los tiempos de reacción necesarios a temperaturas inferiores. Por lo tanto, las temperaturas de reacción generalmente son al menos de aproximadamente 10ºC o superiores. Segundo, la celulasa es una proteína que pierde su actividad por encima de una temperatura dada la cual depende de la naturaleza de la celulosa utilizada. Así, si se permite que la temperatura de reacción aumente demasiado, entonces se pierde la actividad celulolítica como resultado de la desnaturalización de la celulasa. Como resultado, generalmente las temperaturas máximas de reacción utilizadas en la presente invención son aproximadamente 65ºC. En vista de lo anterior, las temperaturas de reacción generalmente son de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 65ºC; preferiblemente, de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 60ºC; y más preferiblemente, de aproximadamente 35ºC a aproximadamente 55ºC.

Los tiempos de reacción son dependientes de las condiciones específicas en las que se lleva a cabo el lavado a la piedra. Por ejemplo, el pH, la temperatura y la concentración de la celulasa truncada afectarán al tiempo óptimo de reacción. Generalmente, los tiempos de reacción son de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 5 horas, y preferiblemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 3 horas y, más preferiblemente, de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 1 hora.

Las telas que contienen celulosa tratadas con el procedimiento del lavado a la piedra definido en la reivindicación 1 que utiliza composiciones de celulasa muestra una redeposición del tinte reducida en comparación con las mismas telas que contienen celulosa tratadas de la misma manera con una composición de celulasa no truncada.

Los siguientes ejemplos específicos se proporcionan con el objetivo de ilustrar adicionalmente la presente invención y sus ventajas y no con la intención de que supongan ningún tipo de limitación del alcance de la protección.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y Expresión de los dominios del centro EG1 utilizando su propio promotor, terminador y secuencia de señalización

Parte 1

Clonación

El gen egl1 completo utilizado en la construcción del plásmido de expresión del dominio del centro EG1,
PEG1\Delta3'pyr, se preparó a partir del plásmido PUC218:: EG1. (ver Fig. 6) La región de terminación 3' de egl1 se unió en PUC218 (Korman, D. et al Curr Genet 17:203-212, 1990) en forma de un fragmento BsmI-EcoRI de 300 pb con un conector sintético diseñado para reemplazar el intrón 3' y el dominio de unión celulosa por un codón de parada y continúa con las secuencias del terminador egl1. El plásmido resultante, PEG1T, se digirió con HindIII y BsmI y se aisló el fragmento del vector del producto digerido mediante electroforesis en gel de agarosa seguido de electroelución. De PUC218::EG1 se aislaron la secuencia del promotor del gen egl1 y el dominio del centro de eg1 en forma de un fragmento HindIII-SstI de 2,3 kb y se unió al mismo fragmento conector sintético y el PEG1T digerido en HindIII-BsmI para formar el PEG1\Delta3'.

El resultado neto de estas operaciones es el reemplazo del intrón 3' y del dominio de unión de celulosa de egl1 por los nucleótidos sintéticos de 53 y 55 pb. Éstos colocan un codón TAG de stop después de la serina 415 y después continúa con el terminador egl1 hasta el sitio BsmI.

A continuación, el marcador selectivo de T. longibrachiatum, pyr4, se preparó a partir de un clon previo de p219M (Smith et al 1991), en forma de un fragmento EcoRI-HindIII de 1,6 kb. Éste se incorporó en el plásmido de expresión final, PEG1\Delta3'pyr, en una ligación de tipo "three way" con el plásmido PUC18 digerido con EcoRI y desfosforilado utilizando fosfatasa alcalina de ternero y un fragmento HindIII-EcoRI que contiene el dominio del centro egI de PEGI\Delta3'.

Parte 2

Transformación y Expresión

Se realizó una preparación a gran escala de ADN de PEG1\Delta3’pyr y de ésta se aisló el fragmento de EcoRI que contiene el dominio del centro egl1 y el gen pyr4 mediante electroforesis preparativa en gel. El fragmento aislado se transformó en la versión auxotrofa respecto uridina de la cadena tetradelecionada, 1A52 pyr13 (descrita en EP-A-0 580 719), y se identificaron los transformantes estables.

Para seleccionar cuales de los transformantes expresaban el dominio del centro egl1, se cultivaron en frascos de agitación en las condiciones que favorecen la inducción de los genes celulasa (Vogels + 1% lactosa). Después de 4-5 días de cultivo, se concentró la proteína de los sobrenadantes y 1) se hicieron correr en geles SDS poliacrilamida previamente a la detección del dominio del centro egl1 mediante análisis Western utilizando anticuerpos policlonales EGI o 2) los sobrenadantes concentrados se ensayaron directamente utilizando carboximetilcelulosa RBB como sustrato específico para endoglucanasa y se compararon los resultados con la cepa parental 1A52 como control. Los transformantes candidatos se identificaron por la posibilidad de producir una proteína con el dominio del centro EGI truncado. Se aisló el ADN genómico y el ARNm total de estas cepas continuando el cultivo en Vogels + lactosa 1% y se llevaron a cabo experimentos de transferencia Northern y Southern utilizando un fragmento aislado de ADN que solo contenía el dominio del centro egl1. Estos experimentos demostraron que los transformantes pueden aislarse con una copia del casete de expresión del dominio del centro egl1 integrado en el genoma de 1A52 y que estos mismos transformantes produjeron ARNm del dominio del centro egl1.

A continuación se cultivó un transformante utilizando un medio apropiado, conocido en el estado de la técnica, para la producción de celulasa en Trichoderma que se suplementó con lactosa (Warzymoda, M. et al 1984 Patente FR 2555603) en un fermentador de 14L. Se concentró el caldo resultante y las proteínas que contenía se separaron mediante electroforesis en gel de SDS poliacrilamida y la proteína del dominio del centro Egl1 se identificó mediante análisis Western. (ver Ejemplo 3). A continuación se estimó que la concentración de proteína del sobrenadante de la fermentación era de aproximadamente 5-6 g/L de los cuales aproximadamente el 1,7-4,4 g/L eran dominios del centro EGI basándose en la actividad CMCasa. Este valor está basado en la media de las varias fermentaciones del centro EGI que se llevaron a cabo.

Cualquier otro dominio de celulasa o sus derivados puede prepararse de manera similar mediante procedimientos similares a los descritos arriba.

Ejemplo 2 Purificación de los centros catalíticos EGI y EGII

Parte 1

Centro catalítico EGI

El centro EGI se purificó de la siguiente manera. El caldo concentrado (UF) se diluyó a 14 mg/ml en acetato de Na 23 mM pH 5,0. Se añadieron doscientos gramos de gel de celulosa avicel (FMC Bioproducts, Tipo PH-101) al caldo de centro EGI diluido y se mezclaron a temperatura ambiente durante cuarenta y cinco minutos. El avicel se eliminó del caldo mediante centrifugación, resultando en una solución enriquecida de centros EGI. A esta solución se le cambió el tampón por TES 10 mM pH 7,5 mediante un concentrador celular con agitación Amicon con una membrana PM 10 (membranas de ultrafiltración diaflo, Amicon Cat # 13132MEM 5468A). A continuación, se cargó la muestra de centro EGI en una columna de intercambio aniónico (Q-Sefarosa fast flow, Pharmacia Cat # 17-0510-01) y se eluyó en un gradiente de sal de 0 a 0,5 M en NaCl en TES 10 mM a pH 7,5. Las fracciones que contienen el centro EGI se combinaron y se concentraron utilizando el concentrador celular con agitación Amicon mencionado arriba.

Parte 2

Centro catalítico EGII

El centro EGII se purificó de la siguiente manera. El caldo concentrado (UF) se filtró utilizando tierra de diatomeas. Se añadió sulfato de amonio al caldo hasta una concentración final de 1M (NH_{4})_{2}SO_{4} y a continuación esta mezcla se cargó en una columna hidrofóbica (fenil-sefarosa fast flow, Pharmacia, Cat # 17-0965-01). La columna se lavó con sulfato de amonio 0,75 M antes de la elución del centro EGII con sulfato de amonio 0,5 M. Las fracciones que contienen el centro se juntaron y se concentraron utilizando una membrana de ultrafiltración de flujo tangencial (Filtron Minisette Ultrafiltration System, cat #FS018K01) con una membrana Omega 10K Membrane (Filtron, cat# FS010K75). Se añadieron 100 gramos de gel de celulosa avicel (FMC Bioproducts, Tipo PH-101) por cada gramo de centro concentrado EGII y se mezcló durante 40 minutos. El avicel se eliminó mediante centrifugación resultando en una solución enriquecida de centro EGII.

Ejemplo 3 Clonación y Expresión de los dominios del centro CBHII utilizando el promotor, terminador y secuencia de señalización de CBHI a partir de CBHII

Parte 1

Construcción del plásmido de expresión PTEX de T. longibrachiatum de función general

El plásmido PTEX se construyó según los procedimientos de Sambrook et al. (1989), supra, y se ilustra en la Fig. 7. Este plásmido se ha designado como un vector de expresión multiuso para su utilización en el hongo filamentoso Trichoderma longibrachiatum. El casete de expresión tiene varias características únicas que lo hacen útil para esta función. La transcripción está regulada utilizando el promotor fuerte del gen CBH I y las secuencias de terminación para T. longibrachiatum. Entre el promotor CBHI y el terminador están las dianas de restricción PmeI y SstI que se utilizan para insertar el gen a expresar. El gen marcador selectivo de T. longibranchiatum pyr4 se insertó en el terminador CBHI y se puede escindir todo el casete de expresión (promotor CBHI -sitios de inserción-terminador CBHI-gen pyr4-terminador CBHI) utilizando la diana de restricción única NotI o las dianas de restricción únicas NotI y NheI.

Este vector se basa en el vector bacteriano, pSL1180 (Pharmacia Inc., Piscataway, Nueva Jersey), que es un vector del tipo PUC con un sitio amplio de clonación múltiple. El experto en la materia será capaz de construir este vector basándose en el diagrama de flujo ilustrado en la Fig.7 (ver también US-A-5650322 para la construcción del plásmido de expresión PTEX).

Podría ser posible construir plásmidos similares a las celulasas truncadas PTEX o a sus derivados descritos en la presente invención que contengan cualquier otro trozo de secuencia de ADN reemplazando el gen de celulasa truncada.

Parte 2

Clonación

El gen completo cbh2 utilizado en la construcción del plásmido de expresión del dominio del centro CBHII, el centro PTEX CBHII, se obtuvo a partir del plásmido PUC219::CBHII (Korman, D. et al, 1990, Curr Genet 17:203-212). El dominio de unión a celulosa, localizado en el extremo 5' del gen cbh2, está dispuesto convenientemente entre una diana de restricción XbaI y una SnaBI. Para utilizar la diana XbaI se destruyó una diana XbaI adicional en el policonector. El PUC219::CBHII se digirió parcialmente con XbaI de tal manera que la mayoría del producto fue lineal. Las terminaciones XbaI se complementaron utilizando ADN polimerasa T4 y se unieron entre ellas en condiciones que favorecían la unión del plásmido con él mismo. Esto tuvo el efecto de destruir el sitio truncado, que en el 50% de los plásmidos correspondía a la diana XbaI en el policonector. Dicho plásmido se identificó y se digirió con XbaI y SnaBI para liberar el dominio de unión para celulosa. Se aisló el vector-dominio del centro CBHII y se unió con los siguientes oligonucleótidos sintéticos diseñados para unirse al sitio XbaI con el sitio SnaBI en el sitio de señalización de la escisión peptidasa y el punto de escisión de papaína en el dominio del conector.

1

El plásmido resultante, pUCDCBD CBHII, se digirió con NheI y se incubó con ADN polimerasa T4 y dNTPs para conseguir los extremos romos. A continuación el ADN plásmido romo lineal se digirió con BgIII y se aisló el fragmento BgIII Nhe (romo) que contenía la secuencia de señalización CBHII y el dominio del centro.

El plásmido final de expresión se modificó mediante la digestión del plásmido de expresión de uso general, pTEX (descrito en US-A-5650322, y en la parte 3 a continuación), con SstII y PmeI y uniendo el fragmento CBHII NheI (romo)-BaIII de pUCDCBD CBHII en el sentido 3' del promotor cbh1 utilizando un oligonucleótido sintético con la secuencia CGTAG para complementar el extremo BgIII con el extremo SstII. La construcción del vector de expresión pTEC del centro CBHII resultante se ilustra en la Fig. 9.

El plásmido de expresión del centro pTEX-CBHI se preparó de manera similar al del centro pTEX-CBHII descrito arriba. Su construcción se ejemplifica en la Fig. 8.

Parte 3

Transformación y Expresión

Se realizó una preparación a gran escala de ADN de centro Ptex CBHII y de ésta se aisló el fragmento NotI que contiene el dominio del centro CBHII bajo el control de los elementos transcripcionales cbh1 y se aisló el gen pyr4 mediante electroforesis preparativa en gel. El fragmento aislado se transformó en la versión auxotrofa respecto uridina de la cadena tetradelecionada, 1A52 pyr13, y se identificaron los transformantes estables.

Para seleccionar cuales de los transformantes expresaban el dominio del centro cbh2, se aisló el ADN genómico de las cepas continuando el crecimiento en Vogels + glucosa 1% y se realizaron experimentos de transferencia Southern utilizando un fragmento aislado de ADN que sólo contenía el dominio del centro cbh2. Se aislaron los transformantes que tenían una copia del casete de expresión del dominio del centro cbh2 integrada en el genoma de 1A52. El ARNm total se aisló a partir de dos cepas continuando su cultivo 1 día en Vogels + lactosa 1%. El ARNm se sometió a análisis Northern utilizando la región de codificación de cbh2 como sonda. Se identificaron los transformantes que expresan el ARNm del dominio del centro cbh2.

Se cultivaron dos transformantes en fermentadores 14L en las mismas condiciones descritas arriba, en el Ejemplo 1. El caldo resultante se concentró y las proteínas que contenía se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y se identificó la proteína del dominio del centro CBHII mediante análisis Western. Uno de los transformantes, #15, produjo una proteína con el tamaño y la reactividad correspondiente a los anticuerpos policlonales CBHII.

A continuación se estimó que, después de la purificación, la concentración de proteína del sobrenadante de la fermentación era de 10 g/L de los cuales aproximadamente el 30-50% eran dominios del centro CBHII (Ver Ejemplo 4).

Cualquier nueva proteína del dominio del centro truncado de celulasa o sus derivados se puede obtener utilizando los procedimientos descritos arriba.

Ejemplo 4 Purificación de los centros catalíticos CBHI y CBHII

Parte 1

Centro catalítico CBHI

El centro CBHI se purificó de la siguiente manera a partir del caldo de cultivo. El caldo de cultivo concentrado y ultrafiltrado (UF) de los centros CBHI se filtró utilizando tierra de diatomeas y se diluyó en TES 10 mM pH 6,8 hasta una conductividad de 1,5 mOhm. A continuación, los centros CBHI diluidos se cargaron en una columna de intercambio aniónico (Q-Sefarosa fast flow, Pharmacia cat # 17-0510-01), equilibrada en TES 10 mM pH 6,8. El centro CBHI se separó de la mayoría de las otras proteínas del caldo de cultivo utilizando un gradiente de elución de 0 a 1M NaCl en TES 10 mM pH 6,8. A continuación, las fracciones que contenían el centro CBHI se concentraron en un concentrador celular con agitación Amicon con una membrana PM 10 (membranas de ultrafiltración diaflo, Amicon Cat # 13132MEM 5468A). En esta etapa se concentró el centro, y adicionalmente se provocó la separación del centro y las proteínas de menor peso molecular. La pureza del centro CBHI fue de más del 85% en las fracciones resultantes. Se comprobó la secuencia de la fracción más pura para comprobar que correspondía al centro CBHI.

Parte 2

Centro catalítico CBHII

Se espera que el centro catalítico CBHII se purifique de manera similar a la de la celulasa CBHII ya que poseen propiedades bioquímicas similares. El pI teórico del centro CBHII está menos de media unidad de pH por debajo del de CBHII. Adicionalmente, el peso molecular del centro catalítico CBHII es aproximadamente el 80% del peso molecular de CBHII. Por lo tanto, el protocolo de purificación propuesto a continuación se basa en el procedimiento de purificación utilizado para CBHII. El caldo de cultivo del centro CBHII, ultrafiltrado (UF) y tratado con tierra de diatomeas, se diluye en TES 10 mM pH 6,8 hasta una conductividad de <0,7 mOhm. A continuación se carga el centro CBHII diluido en una columna de intercambio aniónico (Q-Sefarosa fast flow, Pharmacia, cat # 17 0510-01), equilibrada con TES 10 mM pH 6,8. Para eluir el centro CBHII a través de la columna se utiliza un gradiente salino de 0 a 1 M de NaCl en TES 10 mM a pH 6,8.

A continuación, se cambia el tampón de las fracciones que contienen el centro CBHII a un tampón de succinato de sodio 2 mM y se cargan en una columna de intercambio catiónico (SP-Sephadex C-50). A continuación, el centro CBHII se eluye con un gradiente salino de 0 a 100 mM de NaCl.

Ejemplo 5 Lavado a la piedra con enzima celulasa truncado

Este ejemplo demuestra que el uso de los centros catalíticos truncados de celulasa, y en particular con centros catalíticos endoglucanasa truncados, resulta sorprendentemente en una redeposición del tinte reducida en la tela que contiene celulosa (tejana) durante el lavado a la piedra con un nivel de abrasión equivalente a la celulasa no truncada. Adicionalmente, la combinación de centros catalíticos truncados del tipo CBH y de celulasa no truncada de tipo EG ha resultado en unas características de reteñido mejoradas en comparación con combinaciones no truncadas con niveles de abrasión equivalentes. La ropa tejana es ropa de algodón teñida. Los procedimientos para proporcionar una apariencia de lavado a la piedra a las telas tejanas se describen en la patente US 4832864 y US-A-5650322.

Los centros catalíticos truncados de celulasa y los componentes de celulasa se purificaron para su utilización en este ejemplo como se indica a continuación:

a) El componente EGIII de celulasa se purificó según el procedimiento descrito en la patente US 5328841.

b) El centro catalítico truncado EGI de celulasa se purificó mediante el procedimiento del Ejemplo 2.

c) El centro catalítico EGII truncado de celulasa se purificó mediante el procedimiento del Ejemplo 2.

d) El centro catalítico truncado CBHI de celulasa se preparó según el procedimiento del Ejemplo 4.

e) El componente EGI de celulasa se purificó para su utilización en aplicaciones relacionadas con el lavado a la piedra de la siguiente manera. El caldo de cultivo concentrado (UF) se diluyó en tampón de acetato de sodio 25 mM pH 5,0 hasta una concentración de proteína de 7 mg/ml. Se añadieron 450 gramos de gel de celulosa avicel (FMC Bioproducts, Tipo PH-101) al caldo diluido y se mezclaron a temperatura ambiente durante treinta minutos. El avicel se eliminó del caldo de cultivo mediante centrifugación resultando en un centro catalítico EGI enriquecido.

f) El componente EGII de celulasa se purificó para su utilización en aplicaciones relacionadas con el lavado a la piedra de la siguiente manera. El caldo concentrado (UF) se filtró a través de tierra de diatomeas y se le cambió el tampón a tampón citrato-fosfato pH 7,0, 0,4 mOhm mediante una unidad de ultrafiltración (Filtron Minisette Ultrafiltration System, cat # FS018K01) con una membrana Omega 10K Membrane (Filtron, cat# FS010K75). A continuación, este material se cargó en una columna de intercambio aniónico (Q-Sepharosa fast flow, Pharmacia, cat. #17-0510-01) equilibradas en el tampón de citrato-fosfato de arriba. El EGII se recogió a la salida de la columna y se sometió a intercambio de resinas en citrato de sodio a pH 3,25, 0,5 mOhms utilizando la unidad de ultrafiltración mencionada arriba. A continuación este material se cargó en una columna de intercambio catiónico (SP-Spherodex LS, IBF Biotechnics, cat #262041). A continuación se eluyó el EGII a través de la columna con un gradiente lineal de pH 3,25 a 5,4. Las fracciones que contenían EGII se juntaron y se utilizaron en las aplicaciones para el lavado a la
piedra.

a) el componente CBH I de celulasa se purifico según el procedimiento descrito en el Ejemplo 15 de la solicitud de patente US 07/954113.

Se probó la capacidad de estos dominios truncados de centro catalítico celulasa y de los componentes celulasa, solos o en combinación, para proporcionar una apariencia de lavado a la piedra a la ropa tejana tejida. Específicamente, las telas tejanas lavadas a la piedra se prepararon mediante una lavadora y una secadora industriales en las siguientes condiciones:

\vskip1.000000\baselineskip

Tampón Citrato/fosfato a pH 5

Volumen total 38 L

120-135º F

Seis pares de pantalones tejanos con un peso equivalente de grava, 1 hora de tiempo de programa, 15-30 ppm de EGI, EGII, EGIII; 50 ppm de CBHI y de centro catalítico CBHI; y 30-70 ppm de centro catalítico EGI y de centro catalítico EGII.

\vskip1.000000\baselineskip

Un post-lavado con detergente incluyó 90 gramos de detergente AATCC sin abrillantador en el caso de CBHI, centro catalítico CBHI, EGIII más CBHI y EGIII más centro catalítico CBHI.

Las telas se evaluaron por su apariencia de lavado a la piedra (abrasión) y también por la redeposición del tinte en la tela mediante cinco piezas de tela de prueba. Las telas se ordenaron utilizando una escala que consiste en cintas de tela tejana que presentan incrementos en los niveles de abrasión o redeposición. Las escalas se numeran de 1-10; 1 representa los tejanos con la menor cantidad de abrasión o redeposición (tejano "desize"), y 10 representa un tejano muy desgastado o reteñido. La apariencia de los tejanos tratados se comparó directamente con las cintas de tela tejana de la escala y se les dio un número en función de la cinta de la escala que mejor les correspondía. Los resultados de la evaluación se muestran en las Figs. 10 y 11.

Como se muestra en la Fig.10, el centro catalítico truncado EGI y el centro catalítico EGII truncado proporcionan ventajas significativas en abrasión y redeposición reducida sobre sus homólogos en estado natural no modificados.

Como se muestra en la Fig. 11, la adición del componente CBHI de celulasa a EGIII resultó en una ligera mejora del lavado a la piedra pero en un gran incremento del reteñido (redeposición) del tinte en la tela. Sin embargo, la adición de centros catalíticos truncados CBHI a la solución de EGIII mejoró los resultados, con un incremento en la abrasión y un descenso en la redeposición. Así, la adición de centros catalíticos CBHI truncados a la celulasa EGIII disminuyó la redeposición a un nivel inferior al de EGIII en solitario.

Estos resultados son inesperados y sorprendentes.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: GENENCOR INTERNATIONAL. INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos enzimas celulasa y sistemas para su expresión

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Genencor International

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 180 Kimball Way

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: South San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: CA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 94080

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE PARA ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

MEDIO: Disco magnético

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible IBM PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Patentin Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

INFORMACIÓN AGENTE/ABOGADO

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Christopher L. Stone

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36,696

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CASO/EXPEDIENTE: GC226-2.PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (415) 742.7555

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (415) 742-7217

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 96 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..96

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 1

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser}

\sac{Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 166 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: unir (1..20. 70..166)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ala Cys Ser Ser Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Asn Trp Ser}

\sac{Gly Pro Thr Cys Cys Ala Ser Gly Ser Thr Cys Val Tyr Ser Asn Asp}

\sac{Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: unir (1..82. 140..159)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 5

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Cys Lys Thr Cys}

\sac{Thr Ser Gly Thr Thr Cys Gln Tyr Ser Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys}

\sac{Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 108 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: (1..108)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 7

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 36 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Thr Val Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Ser Gly Pro}

\sac{Thr Asn Cys Ala Pro Gly Ser Ala Cys Ser Thr Leu Asn Pro Tyr Tyr}

\sac{Ala Gln Cys Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 9

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1453 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: (1..410, 478..1174, 1238..1453)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 9

6

7

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 441 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 10

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1244 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: unir (1..161, 218..465, 556..1244)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 12

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 365 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 12

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 13

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1201 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: unir (1..704, 775..1201)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 13

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 377 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 14

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1158 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: unir (1..56, 231..1158)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 15

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 14

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 327 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 16

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 17

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: (1..72)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 17

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser}

\sac{Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 129 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: (1..129)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 19

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Thr Arg Ala Ala Ser Thr Thr Ser}

\sac{Arg Val Ser Pro Thr Thr Ser Arg Ser Ser Ser Ala Thr Pro Pro Pro}

\sac{Gly Ser Thr Thr Thr Arg Val Pro Pro Val Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 21

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 81 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..81

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 21

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 22

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Pro Pro Ala Ser Ser Thr Thr Phe Ser Thr Thr Pro Arg Ser Ser}

\sac{Thr Thr Ser Ser Ser Pro Ser Cys Thr Gln Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 102 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..102

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 23

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 24

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Gly Ala Thr Thr Ile Thr Thr Ser Thr Arg Pro Pro Ser Gly Pro}

\sac{Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Ser Thr Ser Ser Ser Thr Pro Pro Thr}

\sac{Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 25

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 51 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..51

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 25

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 26

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..72

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 27

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ile Val Gly Ile Leu Thr Thr Leu Ala Thr Leu Ala Thr Leu Ala}

\sac{Ala Ser Val Pro Leu Glu Glu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 66 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..66

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 29

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 30

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala Pro Ser Val Thr Leu Pro Leu Thr Thr Ala Ile Leu Ala Ile}

\sac{Ala Arg Leu Val Ala Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 31

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

POSICIÓN: 1..63

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 31

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 32

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Asn Lys Ser Val Ala Pro Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ile Leu Tyr}

\sac{Gly Gly Ala Val Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 777 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 33

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 34

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 218 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 34

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 35

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGAAGTTCC TTCAAGTCCT CCCTGCCCTC ATACCGGCCG CCCTGGCCC

\hfill

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 36

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lys Phe Leu Gln Val Leu Pro Ala Leu Ile Pro Ala Ala Leu Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 37

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCGTAGA GCGTTGACTT GCCTGTGGTC TGTCCAGACG GGGGACGATA GAATGCG

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 38

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 48 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCACCTTCT CCAACATCAA GTTCGGACCC ATTGGCAGCA CCGGCTAA

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 39

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTTTAAA CCCGCGGGGA TT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 40

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGCCGAGG CCTCC

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 41

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTTGAGAT CTGAAGCT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 42

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGAGGAGC GGTCGGGAAC CGCTAC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO: 43

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERIZACIÓN DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: Única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO. 43

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Glu Arg Ser Gly Thr Ala Thr}

Claims (13)

1. Procedimiento para proporcionar apariencia de lavado a la piedra a telas teñidas que contienen celulosa utilizando celulasa, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha tela que contiene celulosa con una composición de tratamiento que comprende celulasa no truncada del tipo EG que comprende un dominio de unión a celulasa y un centro catalítico, y una celulasa truncada que comprende un centro catalítico truncado de tipo CBH que carece de un dominio de unión a celulasa; y

(b) incubar dicha tela que contiene celulosa en contacto con dicha composición de tratamiento en las condiciones que confieran dicha apariencia de lavada a la piedra a dicha tela.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde dicho centro catalítico truncado del tipo CBH es un centro del tipo CBHI.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde la celulasa no truncada de tipo EG es EGIII.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha tela teñida que contiene celulosa comprende una tela que contiene algodón.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, donde dicha tela que contiene algodón comprende tela tejana teñida.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha composición de tratamiento comprende la celulasa truncada en una concentración de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1000 ppm de proteína total.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, donde dicha composición de tratamiento comprende la celulasa truncada en una concentración de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 500 ppm.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha celulasa truncada deriva de un microorganismo que es un hongo o una bacteria.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde dicho hongo es Trichoderma sp.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde dicho Trichoderma sp. es Trichoderma longibrachiatum.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de tratar dicha tela con piedra pómez previamente, posteriormente o simultáneamente a dicha etapa de tratamiento.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, donde dicho centro catalítico truncado de tipo CBH está presente en una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 400 ppm de proteína total.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, donde dicho centro catalítico de tipo CBH está presente en una concentración de aproximadamente 20 a aproximadamente 100 ppm de proteína total.