ES2281183T3 - Expresion de genes de tolerancia a herbicida en plastidios vegetales. - Google Patents
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Abstract
Un constructo que comprende los componentes siguientes en la dirección 5'' a 3'' de la transcripción: a) una secuencia promotora del operón del ARN ribosómico 16S (Prrn) funcional en un plastidio vegetal; b) un sitio de unión al ribosoma de la secuencia líder del gen 10 de la polimerasa del bacteriófago T7 unido al dicho componente promotor (a); c) una secuencia de ADN que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) de la cepa CP4 de Agrobacterium que es capaz de conferir tolerancia en una célula vegetal a al menos el compuesto herbicida glifosato cuando dicha secuencia de ADN se transcribe en plastidios de dicha célula vegetal; y d) una región de terminación de la transcripción.
Description
Expresión de genes de tolerancia a herbicida en
plastidios vegetales.
Esta invención se refiere a la aplicación de
técnicas de ingeniería genética a plantas. Específicamente, la
invención se refiere a composiciones y procedimientos para potencias
la expresión de proteínas en plastidios vegetales.
Los plastidios de las plantas superiores son
atractivos objetivos de la ingeniería genética. Los plastidios
vegetales (cloroplastos, amiloplastos, elaioplastos, etioplastos,
cromoplastos, etc.) son los principales centros biosintéticos que,
además de la fotosíntesis, son responsables de la producción de
compuestos industrialmente importantes tales como aminoácidos,
hidratos de carbono complejos, ácidos grasos y pigmentos. Los
plastidios derivan de un precursor común conocido como un
proplastidio y, por tanto, todos los plastidios presentes en una
especie vegetal diana poseen el mismo contenido genético. Las
células vegetales contienen 500-10.000 copias de un
pequeño genoma circular de 120160 kilobases, cada molécula del cual
posee una gran repetición invertida (de aproximadamente 25 kb). Por
tanto, es posible someter a ingeniería las células vegetales para
que contengan hasta 20.000 copias de un gen concreto de interés que
potencialmente podría tener como resultado elevados niveles de
expresión génica extraña. Además, los plastidios de la mayoría de
las plantas se heredan de la madre. En consecuencia, al contrario
que los genes heterólogos expresados en el núcleo, los genes
heterólogos que se expresan en plastidios no son diseminados por el
polen, por tanto, un rasgo introducido en un plastidio vegetal no
se transmitirá a los parientes salvajes.
Sigue existiendo la necesidad de mejores
elementos reguladores para la expresión de genes en un plastidio
vegetal. Hasta la fecha, las señales de expresión utilizadas de
forma rutinaria para la expresión de transgenes de plastidios
derivan de genes de plastidios endógenos. Las señales de expresión
de plastidios normalmente derivan de regiones promotoras de genes
de plastidios altamente expresados, tales como las regiones
promotoras del operón de ARN ribosómico 16S (Prrn), el gen
psbA (PpsbA) o el gen rbcL (PrbcL). Los genes psbA y rbcL se
transcriben mucho, pero su traducción está controlada por factores
específicos de tejido y regulados por luz, lo que limita su
utilidad. En el caso del Prrn, para dirigir la traducción
normalmente se usa un sitio de unión del ribosoma sintético (RBS)
con patrón similar a la secuencia líder del gen rbcl de plastidio.
Sin embargo, este Prrn/RBS se traduce de forma ineficaz
debido a la mala unión al ribosoma.
Para expresar genes de plastidio se ha usado un
sistema de expresión totalmente heterólogo (documento USPN
5.576.198). Este sistema es un sistema de dos componentes. El primer
componente es un transgén de plastidio dirigido por T7
promotor/secuencia líder del gen 10 del bacteriófago. El segundo
componente es un gen nuclear que codifica la polimerasa T7 que está
dirigida al compartimento del plastidio. La limitación de este
sistema es la necesidad de crear líneas transformadas nucleares que
expresan la polimerasa T7 de formas preferidas.
Los plastidios de las plantas superiores suponen
una atractiva diana para la ingeniería genética. Como se ha
mencionado anteriormente, los plastidios de las plantas superiores
se heredan a través de la madre. Esto ofrece una ventaja para la
ingeniería genética de las plantas para conferir tolerancia o
resistencia a condiciones naturales o químicas, tal como tolerancia
a herbicidas, ya que estos rasgos no se transmitirán a parientes
salvajes. Además, el alto nivel de expresión de genes extraños es
atractivo para los rasgos sometidos a ingeniería tales como la
producción de proteínas farmacéuticamente importantes.
La expresión de secuencias de ácidos nucleicos
que codifican enzimas que proporcionan tolerancia a herbicidas así
como proteínas farmacéuticas del genoma de plastidios vegetales
ofrece una atractiva alternativa a la expresión del genoma nuclear
de la planta.
La presente invención proporciona secuencias de
ácido nucleico útiles en la potenciación de la expresión de genes
EPSPS concretos en plastidios vegetales.
Además, se proporcionan constructor de expresión
de plastidios que son útiles para la ingeniería genética de células
vegetales y que proporcionan una expresión aumentada de la proteína
EPSP sintasa en plastidios de células vegetales. Los plastidios
transformados deben ser plastidios metabólicamente activos y
preferentemente se mantienen a un número de copias elevado en el
tejido vegetal de interés, más preferentemente los cloroplastos se
encuentran en tejidos de plantas vegetales, tales como hojas o
cotiledones.
Los constructos de expresión de plastidios para
usar en esta invención incluyen una secuencia promotora del
plastidio del operón de ARN ribosómico 16S (Prrn) capaz de
proporcionar una expresión aumentada de una secuencia de ADN que
codifica la proteína EPSPS y una región de terminación de la
transcripción capaz de terminar la transcripción en un plastidio
vegetal.
La región promotora del plastidio de la presente
invención está unida a un sitio de unión al ribosoma de la
secuencia líder del gen 10 de la polimerasa del bacteriófago T7, que
proporciona una traducción aumentada de los transcritos de ARNm en
un plastidio vegetal.
El constructo de expresión de plastidio de esta
invención está preferentemente unido a un constructo que posee una
secuencia de ADN que codifica un marcador de selección que se puede
expresar en un plastidio vegetal. La expresión del marcador de
selección permite la identificación de células vegetales que
comprendan un plastidio que exprese el marcador.
En una forma de realización preferida, los
vectores para transferir el constructo a una célula vegetal incluyen
medios para insertar los constructos de expresión y selección en el
genoma del plastidio. Esto comprende, preferentemente, regiones de
homología con el genoma del plastidio diana que flanquea los
constructos.
Los constructos de la presente invención
comprenden una secuencia promotora como se ha definido anteriormente
unida a un sitio de unión del ribosoma como se ha definido
anteriormente capaz de potenciar la traducción de transcritos de
ARNm en el plastidio vegetal.
De particular interés en la presente invención
es el elevado nivel de expresión de determinadas secuencias del
ácido nucleico de EPSP en plastidios vegetales.
Los constructos de la presente invención
comprenden, preferentemente, una secuencia de ADN que codifica una
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (USPN 5.633.435).
En la invención también se contemplan los
plastidios de células vegetales que contienen los constructos, como
plantas, semillas de plantas o progenie de las mismas que contienen
plastidios que comprenden el constructo.
La presente invención también incluye
procedimientos para aumentar la expresión de secuencias de AND en
plastidios vegetales.
La invención también incluye un procedimiento
para aumentar la expresión de una enzima que confiere tolerancia a
herbicidas en una célula vegetal, expresando la EPSPS de CP4 de la
cepa de Agrobacterium tumefaciens sp en plastidios de la
célula vegetal.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
gen quimérico que contiene una determinada secuencia codificadora
de tolerancia a herbicida, un vector de expresión en plastidio
vegetal que contiene un promotor Prrn unido operablemente a un
sitio de unión al ribosoma del gen 10 de la polimerasa del
bacteriófago T7 capaz de aumentar la expresión en un plastidio
vegetal unido operablemente a un gen codificador de tolerancia a
herbicida o farmacéutico, un vector de transformación vegetal en el
que se ha insertado un determinado gen de tolerancia a herbicida
expresado a partir de un promotor plastidial unido al sitio de unión
al ribosoma del gen 10 de la polimerasa del bacteriófago T7,
células vegetales transformadas usando tales vectores y plantas
regeneradas de las mismas que exhiben un grado considerable de
expresión de secuencias de ácido nucleico y proteínas y
procedimientos para producir tales plantas y tales plantas.
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del sitio de unión al ribosoma de G10L.
La figura 2 proporciona una secuencia de
aminoácidos que codifica aprotinina.
La figura 3 proporciona los resultados del
análisis RP-HPLC para la caracterización de la
proteína hGH expresada en el plastidio. El pico I (pico más alto)
indica el tiempo de retención previsto para la GP2000 nativa de 22
kDa adecuadamente plegada.
La figura 4 proporciona un análisis de
espectrometría de masas (EM) con ionización por electronebulización
usando un espectrómetro de masas de mediante electronebulización con
análisis del tiempo de vuelo Micromass Q-T- En
particular, se proporciona una serie de iones correspondientes a
la(s) especie(s) presente(s) en la muestra con
un número variable de protones unidos. Los ejes del espectro son
intensidad frente a la proporción entre la masa y la carga de
la(s) especie(s) presente(s).
La figura 5 proporciona una representación
gráfica de la bioactividad de hGH expresada a partir de un plastidio
vegetal. Las muestras representadas en el gráfico son prolactina
bovina (bPL), hGH expresada de E. coli
(Ala-hGH) y un transgénico nulo contaminado con
prolactina bovina (SPFF Null Spike) como controles positivos, un
transgénico nulo (SPFF Null) como control negativo y muestras
transgénicas de una columna de sefarosa (muestra SPFF, muestra
SPFF) y una muestra transgénica eluida de la columna de sefarosa a
pH 3,5 (SPFF pH 3,5 Eln).
La figura 6 proporciona la secuencia de ácidos
nucleicos del promotor Prrn/G10L/híbrido RBS. El promotor Prrn
contiene los elementos promotores consenso -35 y -10 del plastidio
(subrayados) y los sitios de inicio de la transcripción (GC en
negrita) para la ARN polimerasa codificada en el plastidio (PEP). La
secuencia líder del gen 10 (G10L) contiene un sitio de unión al
ribosoma del plastidio perfecto (RBS, nucleótidos en negrita).
La figura 7 proporciona la secuencia de ácido
nucleico para la fusión Prrn/NEP/G10L::14aaGFP. La región promotor
NEP está subrayada (A en negrita es el sitio de inicio de la
transcripción). La región promotora NEP usada se extiende más allá
de la secuencia consenso en dirección tanto 3' como 5' del promotor.
El ATG inicial, el iniciador metionina no se cuenta en los 14
aminoácidos de GFP.
De acuerdo con la invención sujeto, se
proporcionan constructor de la expresión en plastidios que, en
general, comprenden un promotor funcional en un plastidio vegetal,
y sitio de unión al ribosoma derivado de la secuencia líder del gen
10 de la polimerasa T7 del bacteriófago, una secuencia de ADN que
codifica una EPSPS concreta y una región de terminación de la
transcripción capaz de terminar la transcripción en un plastidio
vegetal. Estos elementos se proporcionan como componentes
operablemente unidos en la dirección 5' a 3' de la
transcripción.
Además, los constructos de la presente invención
también pueden incluir una secuencia de ácido nucleico que codifica
un péptido capaz de dirigir a dicha secuencia de ADN que codifica
una proteína del lumen tilacoidal dentro del cloroplasto.
De particular interés en la presente invención
es el uso de los constructos de expresión en plastidios para
dirigir la transcripción y traducción (Expresión) de nivel elevado
de las secuencias de ácido nucleico. Tales constructos de expresión
en plastidio son útiles para dirigir la expresión de alto nivel de
secuencias de ADN que codifican enzimas EPSPS concretas implicadas
en la tolerancia a herbicidas.
De más particular interés en la presente
invención es el uso de los constructos de expresión en plastidios
para dirigir la traducción de elevado nivel de ARN mensajero
transcrito.
La secuencia de ADN y los datos bioquímicos
revelan una similitud de las maquinarias transcripcionales y
traduccionales de los orgánulos del plastidio con las observadas en
los sistemas procariotas. De hecho, se ha comunicado que las
secuencias promotoras derivadas de plastidios dirigen la expresión
de genes indicadores en células procariotas. Además, los genes de
plastidios a menudo están organizados en operones policistrónicos
como lo están en los procariotas.
A pesar de las aparentes similitudes entre
plastidios y procariotas, existen diferencias fundamentales en los
procedimientos usados para controlar la expresión génica en
plastidios y procariotas. Al contrario que los mecanismos del
control transcripcional que normalmente se observan en procariotas,
la expresión génica en plastidios está controlada principalmente a
nivel de la traducción y la estabilidad del ARNm a través de
proteínas de trans-acción codificadas en el
núcleo.
La traducción es un proceso de múltiples etapas
que primero implica la unión del ARN mensajero (ARNm) a los
ribosomas. Comenzando en el codón de inicio de la traducción, los
codones del ARNm se leen secuencialmente a medida que los ribosomas
se desplazan a lo largo de la molécula de ARNm. A continuación, los
aminoácidos especificados se añaden secuencialmente a la cadena
polipeptídica en crecimiento para dar la proteína o polipéptido
codificada en el ARNm.
Como se ha mencionado, la primera etapa en el
proceso de la traducción es la unión de la molécula de ARNm al
ribosoma. La naturaleza de esta interacción (es decir, unión) sólo
se ha aclarado parcialmente. El análisis de oligonucleótidos
resistentes a la ARNasa aislados de complejos de iniciación de la
traducción bacteriana indica que un fragmento de ARN de
aproximadamente 30 a 40 nucleótidos de longitud comprende el sitio
de unión al ribosoma inicial (RBS). Por tanto, en lo sucesivo se
entiende que un RBS una secuencia de ARNm que rodea al codón de
inicio de la traducción que es responsable de la unión del ribosoma
y del inicio de la traducción.
Recientemente se han identificado sitios de
unión al ribosoma capaces de dirigir la traducción en procariotas.
Por ejemplo, un sitio de unión al ribosoma derivado de la secuencia
líder del gen 10 del bacteriófago T7. Se ha identificado el G10L
(USPN 5.232.840), que potencia la expresión de secuencias de ácidos
nucleicos en procariotas.
Herbicidas tales como
N-fosfonometilglicina, hidroxibenzonitrilos
halogenados y norflurazón han sido objeto de una gran cantidad de
investigación.
El N-fosfonometilglicina,
normalmente denominado glifosato, inhibe la vía del ácido shikímico
que conduce a la biosíntesis de compuestos aromáticos, incluidos
aminoácidos, hormonas vegetales y vitaminas. Específicamente, el
glifosato impide la conversión del ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y
el ácido 3-fosfoshikímico en ácido
5-enolpiruvil-3-fosfoshikímico
inhibiendo la enzima
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (en lo sucesivo denominada EPSP sintasa o EPSPS).
Se han producido plantas que toleran el
glifosato mediante transformación de varios genes de la EPSP sintasa
en el genoma nuclear de una planta. Se ha clonado un gen para la
EPSP sintasa a partir de la cepa CP4 de Agrobacterium
tumefaciens (USPN 5.633.435) y confiere un elevado nivel de
tolerancia al glifosato en plantas. Además, se han alcanzado
niveles elevados de tolerancia a glifosato en una serie de plantas
cultivadas mediante la fusión de EPSPS a un péptido de tránsito al
cloroplasto (CTP) para la expresión dirigida en plastidios. Además,
se han aislado variantes de la enzima EPSPS salvaje que son
tolerantes al glifosato como resultado de alteraciones en la
secuencia aminoacídica que codifica la EPSPS (Kishore y Shah,
Ann. Rev. Biochem. (1988) 57: 627-663;
Shulze y col., Arch. Microbiol. (1984) 137:
121-123; Kishore et al., Fed. Proc.
(1986) 45: 1506). Estas variantes normalmente poseen una K_{i}
para el glifosato mayor que la de la enzima EPSPS salvaje, que
confiere el fenotipo de resistencia al glifosato, pero estas
variantes también se caracterizan por una elevada K_{m} para PEP,
lo que convierte a la enzima en cinéticamente menos eficaz (Kishore
y Shah, Ann. Rev. Biochem. (1988) 57:
627-663; Sost y col., FEBS Lett. (1984) 173:
238-241; Shulze y col., Arch. Microbiol.
(1984) 137: 121-123; Kishore et al., Fed.
Proc. (1986) 45: 1506; Sost y Amrhein, Arch. Biochem.
Biophys. (1990) 282: 433-436).
Aunque las plantas transformadas para expresar
secuencias de ácido nucleico que codifican tales enzimas del genoma
nuclear han encontrado utilidad en la ingeniería de plantas
tolerantes al herbicida, sería cada vez más beneficioso obtener
plantas tolerantes al herbicida a través de la expresión en
plastidios.
En los ejemplos que se proporcionan en la
presente memoria descriptiva, las secuencias de ADN que codifican
enzimas implicadas en la tolerancia a herbicida se usan como
constructos para dirigir la expresión de las secuencias del
plastidio vegetal. Las secuencias de ADN que codifican la
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) se usan en los constructos de expresión de la
presente invención para dirigir la expresión de dichas secuencias
nucleotídicas de tolerancia al herbicida en el plastidio
vegetal.
Se identifican plantas de tabaco
transplastómicas que son homoplásmicas para las secuencias de ADN de
interés que codifican dichos genes de tolerancia a herbicida. Las
plantas homoplásmicas demuestran un elevado nivel de expresión
proteica en el plastidio. Además, las plantas homoplásmicas
demuestran un nivel elevado de tolerancia para el herbicida
respectivo. Por ejemplo, como se ha descrito con mayor detalle en el
ejemplo siguiente, las plantas transformadas para que expresen
EPSPS en el plastidio demuestran un elevado nivel de tolerancia al
herbicida glifosato.
Al desarrollar los constructor, los diversos
fragmentos que comprenden las regiones reguladoras y el marco de
lectura abierto pueden estar sometidas a diferentes condiciones de
procesamiento, tales como unión, digestión mediante enzimas de
restricción, PCR, mutagénesis in vitro, adición de elementos
de unión y adaptadores y similares. Por tanto se pueden realizar
transiciones, transversiones, inserciones o depleciones de
nucleótidos en el ADN que se emplea en las regiones reguladoras o
las secuencias de ADN de interés para la expresión en los
plastidios. Los procedimientos para la digestión de restricción,
tratamientos de extremos romos Klenow, ligaduras y similares son
bien conocidos para los expertos en la técnica y son descritos, por
ejemplo, por Maniatis y col. (en Molecular cloning: a laboratory
manual (1989) cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY).
Durante la preparación de los constructos, los
diversos fragmentos de ADN se clonarán a menudo en un vector de
clonación adecuado, que permite la amplificación del ADN, la
modificación del ADN o la manipulación del ADN uniendo o eliminando
secuencias, elementos de unión o similares. Preferentemente, los
vectores serán capaces de replicarse a, al menos, un número de
copias relativamente elevado en E. coli. Una serie de
vectores están fácilmente disponibles para clonación, incluidos
vectores tales como pBR322, vectores de la serie pUC, vectores de
la serie M13 y vectores pBluescript (Stratagene; La Jolla, CA).
Con el fin de proporcionar un medio para
seleccionar las células vegetales deseadas, los vectores para la
transformación en plastidios normalmente contienen un constructo que
proporciona la expresión de un gen marcador de selección. Los genes
marcadores son secuencias de ADN vegetal que se puede expresar, que
expresan un polipéptido que resiste a inhibición natural; atenúa o
inactiva una sustancia selectiva, es decir un antibiótico, un
herbicida.
Como alternativa, un gen marcador puede
proporcionar alguna otra respuesta visiblemente reactiva, es decir
puede causar un aspecto distintivo o patrón de crecimiento relativo
a las plantas o a las células vegetales que no expresan el gen
marcador de selección en presencia de alguna sustancia, bien
aplicada directamente a la planta o a las células vegetales o
presente en el medio de cultivo de la planta o célula vegetal.
En cualquier caso, las plantas o células
vegetales que contienen tales genes marcadores de selección tendrán
un fenotipo distintivo para propósitos identificativos, es decir se
podrán distinguir de las células no transformadas. El fenotipo
característico permite la identificación de células, grupos de
células, tejidos, órganos, partes de plantas o plantas enteras que
contienen el constructo.
La detección del fenotipo marcador hace posible
la selección de células que poseen un segundo gen al que el gen
marcador se ha unido. Este segundo gen normalmente comprende un
fenotipo deseable que no se puede identificar con facilidad en las
células transformadas, pero que está presente cuando la célula
vegetal o derivada de la misma se cultiva hasta la madurez, incluso
en condiciones en las que el propio fenotipo marcador de selección
no es evidente.
El uso de tal marcador para la identificación de
células vegetales que contienen un constructo del plastidio ha sido
descrito por Svab y col. (1993, ant.). En los ejemplos
que se proporcionan más adelante, un gen bacteriano aadA se
expresa como marcador bajo el control regulador de las regiones
promotora 5' del cloroplasto y de terminación de la transcripción
en 3', específicamente las regiones reguladoras del gen psbA
(descritas en Staub y col., EMBO J. (1993) 12 (2):
601-606). También se pueden usar numerosas regiones
promotoras adicionales para dirigir la expresión del gen marcador
de selección, incluidos varios promotores del plastidio y promotores
bacterianos que se ha demostrado que funcionan en plastidios
vegetales.
La expresión del gen aadA confiere
resistencia a la espectinomicina y la estreptomicina y, por tanto,
permite la identificación de células vegetales que expresan este
marcador. El producto del gen aadA permite el crecimiento
continuado y el crecimiento de células cuyos cloroplastos comprenden
el producto del gen marcador de selección. Las células que no
contienen el producto del gen marcador de selección se decoloran. La
selección del marcador génico aadA se basa en la
identificación de células vegetales que no se han decolorado por la
presencia de estreptomicina o, más preferentemente, de
espectinomicina, en el medio de crecimiento de la planta.
Se ha desarrollado una serie de marcadores para
usar con células vegetales, tales como resistencia a cloranfenicol,
el aminoglucósido G418 o higromicina. Otros genes que codifican un
producto implicado en el metabolismo de los cloroplastos también se
pueden usar como marcadores de selección. Por ejemplo, genes que
proporcionan resistencia a herbicidas vegetales tales como
glifosato, bromoxinil o imidazolinona pueden encontrar un uso
concreto. Tales genes se han publicado (Stalker y col., J. Biol.
Chem. (1985) 260: 4724-4728 (EPSPS resistente a
glifosato); Stalker y col., J. Biol. Chem. (1985) 263:
6310-6314 (gen de nitrilasa resistente a
bromoxinil); y Sathasivan y col., Nucl. Acids Res. (1990)
18: 2188 (gen AHAS de resistencia a imidazolinona)).
Se ha publicado la transformación estable de los
genomas del plastidio de tabaco mediante bombardeo de partículas
(Svab y col. (1990), ant.) y Svab y col.
(1993), ant.). Los procedimientos descritos en ellos se
pueden emplear para obtener plantas homoplásmicas para constructor
de expresión en plastidios.
Generalmente, el tejido bombardeado se cultiva
durante aproximadamente 2 días en un medio de estimulación de la
división celular, tras los cuales el tejido de la planta se
transfiere a un medio selectivo que contiene una cantidad
inhibidora del agente selectivo concreto, así como las hormonas
concretas y otras sustancias necesarias para obtener la
regeneración por dicha especie vegetal concreta. A continuación, los
brotes se subcultivan en el mismo medio selectivo para garantizar
la producción y la selección de brotes homoplásmicos.
Las plantas de tabaco transplastómicos se
analizan para una población pura de genomas de plastidio
transformados (líneas homoplásmicas). La homoplasmia se verifica
usando análisis Southern empleando sondas de ácido nucleico
cruzando una región del transgén y el genoma del cloroplasto (es
decir, la región de inserción). Las plantas transplastómicas que
son heteroplásticas (es decir, que contienen una mezcla de genomas
de plastidio que contienen y carecen del transgén) se caracterizan
por un patrón de hibridación de bandas salvajes y transgénicas. Las
plantas homoplásmicas muestran un patrón de hibridación que carecen
de la banda salvaje.
Como alternativa, la homoplasmia se puede
verificar usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se
utilizan cebadores de PCR que están destinados a amplificar las
secuencias desde la región de inserción. Por ejemplo, en una
reacción de PCR se puede utilizan un par de cebadores. Un cebador
amplifica una región desde el transgén, mientras que el segundo
cebador amplifica desde una región proximal a la región de inserción
hacia la región de inserción. Una segunda reacción de PCR se lleva
a cabo usando cebadores destinados a amplificar la región de
inserción.
Las líneas transplastómicas identificadas como
homoplásmicas producen el fragmento del tamaño predicho en la
primera reacción, mientras que no producen el fragmento del tamaño
predicho en la segunda reacción.
Cuando los procedimientos de transformación y
regeneración se han adaptado para una especie vegetal dada, bien
mediante transformación mediada por Agrobacterium, bien por
bombardeo o algún otro procedimiento, las técnicas establecidas se
pueden modificar para usar en los procedimientos de selección y
regeneración para producir plantas transformadas en los plastidios.
Por ejemplo, los procedimientos descritos en la presente memoria
descriptiva para la planta de tabaco son fácilmente adaptables a
otras especies solanáceas, tales como el tomate, la petunia y la
patata.
Para la transformación de la soja se han
descrito protocolos de bombardeo de partículas así como
transformación nuclear y regeneración mediadas por
Agrobacterium (Hinchee y col. USPN 5.416.011 y
Christou y col. USPN 5.015.580). El experto en la técnica
reconocerá que se pueden los protocolos descritos para la
transformación de la soja.
En Brassica, los protocolos de
transformación y de regeneración mediadas por Agrobacterium
generalmente implican el uso de tejido de hipocotilo, un tejido no
verde que podría contener un bajo contenido en plastidios. Por
tanto, para Brassica, los tejidos diana preferidos incluirían
tejidos de hipocotilo o cotiledóneos derivados de microsporas (que
son verdes y, por tanto, contienen numerosos plastidios) o explantes
de tejidos de hojas. Aunque los índices de regeneración de tales
tejidos pueden ser bajos, no se esperan efectos de posición, tales
como los observados con transformación mediada por
Agrobacterium, por lo que no sería necesario realizar una
detección selectiva de numerosas plantas transformadas con éxito con
el fin de obtener un fenotipo deseado.
Para el algodón. La transformación de
cotiledones de Gossypium hirsutum L. mediante
co-cultivo con Agrobacterium tumefaciens ha
sido descrita por Firoozabady y col., Plant Mol. Bio. (1987)
10:105-116 y Umbeck y col., Bio/Technology
(1987) 5: 263-266. De nuevo, como ocurre con
Brassica, este tejido puede contener insuficiente contenido
en plastidios para la transformación del cloroplasto. Por tanto,
como ocurre con Brassica, puede ser deseable un
procedimiento alternativo para la transformación y regeneración del
tejido diana alternativo que contiene cloroplastos, por ejemplo
dirigido al tejido embrionario verde.
\newpage
Otras especies vegetales pueden transformarse de
forma similar usando técnicas relacionadas. Como alternativa,
también se pueden usar procedimientos de bombardeo con
microproyectiles, tales como el descrito por Klein t col.
(Bio/Technology 10:286-291) para obtener plantas
transformadas nucleares que comprendan constructos de expresión de
la subunidad sencilla de la ARN polimerasa viral descrita en la
presente memoria descriptiva. La transformación de algodón mediante
bombardeo de partículas se comunica en el documento WO 92/15675,
publicado el 17 de septiembre de 1992. Entre las plantas adecuadas
para la práctica de la presente invención se incluyen, entre otras,
soja, algodón, alfalfa, planta de colza, Lino, tomate, remolacha
azucarera, girasol, patata, tabaco, maíz, trigo, arroz y
lechuga.
Los vectores para usar en la transformación de
plastidios preferentemente incluyen medios para proporcionar una
transferencia estable del constructo de expresión en plastidios y el
constructo marcador de selección en el genoma del plastidio. Esto
se proporciona de un modo más cómodo mediante regiones de homología
con el genoma del plastidio diana. Las regiones de homología
flanquean al constructo que se va a transferir y mantienen la
transferencia al genoma del plastidio mediante recombinación
homóloga a través de un doble sobrecruzamiento en el genoma. Se ha
comunicado la secuencia de ADN completa del genoma del plastidio del
tabaco (Shinozaki y col., EMBO J. (1986) %.
2043-2049). También se han comunicado las secuencias
completas de ADN de los genomas del plastidio de agrimonia (Ohyama
y col., Nature (1986) 322: 572-574) y de
arroz (Hiratsuka y col., Mol. Gen. Genet. (1989) 217:
185-194).
Cuando las regiones de homología están presentes
en las regiones de repetición invertidas del genoma del plastidio
(conocidas como IRA e IRB), cabe esperar que se produzcan dos copias
del transgén por plastidio transformado. Cuando las regiones de
homología están presentes fuera de las regiones de repetición
invertidas del genoma del plastidio (conocidas como IRA e IRB),
cabe esperar que se produzca una copia del transgén por plastidio
transformado. Las regiones de homología dentro del genoma del
plastidio tienen un tamaño de aproximadamente 1 kb. También se
pueden usar regiones de homología más pequeñas, y tan pequeñas como
de 100 pb pueden proporcionar la recombinación homóloga en el
genoma del plastidio. No obstante, la frecuencia de recombinación y,
por tanto, la frecuencia de obtención de plantas con plastidios
transformados disminuye al disminuir el tamaño de las regiones de
homología.
Ejemplos de constructor con regiones de
homología en el genoma del plastidio se describen en Svab y
col. (1990, ant.), Svab y col. (1993,
ant.) y Zoubenko y col. (Nuc Acid Res (1994) 22
(19): 3819-3824).
Como se describe con más detalle en los
siguientes ejemplos, se describen constructor que proporcionan una
expresión aumentada de secuencias de ADN en plastidios vegetales.
Las secuencias promotoras del sitio de unión al ribosoma se emplean
para dirigir la expresión en plastidios vegetales son secuencias
promotoras del operón de ARN ribosomal 16s (Prrn) que están
unidas a un sitio de unión al ribosoma (RBS) derivado de la
secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7 (G10L). Las
secuencias de ADN expresadas bajo el control regulador de la
secuencia de Prrn/G10L muestran un nivel significativamente
mayor de expresión de proteínas que los niveles obtenidos bajo el
control de otras combinaciones promotor/RBS, aunque la expresión del
ARNm puede o no ser mayor en estas plantas.
En los siguientes ejemplos, las secuencias de
ácido nucleico que codifican la EPSPS sintasa de CP4 (USPN
5.633.435) se introducen en constructos de expresión para la
expresión de la enzima EPSP sintasa del plastidio vegetal. Los
constructos preparados utilizan un sitio de unión al ribosoma
diseñado tras la secuencia líder del gen 10 del bacteriófago T7
(G10L) para incrementar la expresión de las secuencias de ácido
nucleico en el plastidio vegetal.
Los constructos de expresión en plastidios que
codifican la expresión de EPSPS se introducen a través de un vector
de transformación cloroplástica.
Las líneas de tabaco que contienen la secuencia
codificadora nativa de la enzima EPSPS expresada en plastidios bajo
el control del promotor Prrn/G10L/sitio de unión al ribosoma
de muestran un nivel significativamente mayor de expresión proteica
que los niveles obtenidos de la EPSPS expresada bajo el control de
la secuencia Prrn/rbcl RBS. No obstante, el ARNm de la EPSPS se
expresa a un nivel superior en plantas que expresan EPSPS de CP4
del plastidio bajo el control de Prrn/rbcl (RBS). Estos
resultados indican que la traducción de los transcritos que
contienen el sitio de unión al ribosoma del gen 10 del bacteriófago
T7 es más eficaz. Además, los niveles de expresión proteica de la
EPSPS obtenida de las líneas de tabaco transplastómicas que expresan
EPSPS bajo el control de Prrn/G10L RBS proporciona un nivel
elevado de tolerancia al glifosato.
Además, las líneas de tabaco transplastómicas
transformados para expresar hGH bajo en control del promotor
Prrn/G10L/secuencia del sitio de unión al ribosoma demuestran un
nivel significativamente mayor de expresión de proteínas que los
niveles obtenidos de hGH expresado bajo el control del promotor
PpsbA/secuencia del RBS.
Incrementos en los niveles de expresión de
proteínas al menos aproximadamente 200 veces mayor pueden obtenerse
a partir de los constructos utilizando Prrn/sitio de unión al
ribosoma de G10L para la expresión de la EPSPS por encima de los
niveles de expresión obtenidos de otras combinaciones promotor/RBS
para la expresión en plastidios. Además, los niveles de proteínas
obtenidos de los constructos de expresión en plastidios que utilizan
el promotor Prrn/G10L/secuencia de RBS se pueden acumular niveles
50 a 3500 veces mayores que los constructos de expresión nuclear.
Por tanto, la inclusión del sitio de unión al ribosoma del G10L en
los constructos de expresión en plastidios pueden ser útiles para
incrementar los niveles de expresión proteica a partir de plastidios
vegetales.
Además, los constructos de la presente invención
también pueden incluir secuencias frente a la proteína expresada a
una región suborganular concreta, por ejemplo el lumen tilacoidal de
los cloroplastos. Por ejemplo, como se describe en los ejemplos
siguientes, una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido del
citocromo f del genoma del plastidio está dirigida a la proteína
aprotinina expresada para la membrana tilacoidal. Tal objetivo de
las proteínas expresadas puede proporcionar una
compartimentalización de la proteína y permitir mayor estabilidad
oxidativa y un adecuado plegamiento de la proteína.
Por tanto, los constructos y los procedimientos
de la presente invención proporcionan un medio para obtener plantas
transplastómicas con un elevado nivel de tolerancia de herbicidas.
Los niveles elevados de tolerancia incluyen tolerancia de tejido
vegetal cuando se aplican cantidades superiores a aproximadamente
454 g (aproximadamente 16 onzas)/acre de glifosato, preferentemente
superiores a aproximadamente 907 g (aproximadamente 32 onzas)/acre,
más preferentemente superiores a aproximadamente 1,81 kg
(aproximadamente 64 onzas)/acre, más preferentemente superiores a
aproximadamente 3,63 kg (aproximadamente 128 onzas)/acre.
Además, niveles elevados de tolerancia también
pueden incluir tolerancia de tejidos reproductivos cuando se
aplican cantidades superiores a aproximadamente 454 g
(Aproximadamente 16 onzas)/acre de glifosato, preferentemente
superiores a aproximadamente 907 g (aproximadamente 32 onzas)/acre,
más preferentemente superiores a aproximadamente 1,81 kg
(aproximadamente 64 onzas)/acre.
La invención que se está describiendo en general
se entenderá con más facilidad haciendo referencia a los siguientes
ejemplos.
Ejemplo
1
Los constructos y procedimientos para usar en la
transformación de plastidios de plantas superiores se describen en
Zoubenko y col. (Nuc Acid Res (1994) 22 (19):
3819-3824), Svab y col. (Proc. Natl. Acad.
Sci. (1990) 87: 8526-8530 y Proc. Natl.
Acad. Sci (1993) 90: 913-917) y Staub y
col. (EMBO J (1993) 12: 601-606). Los
constructos y procedimientos para usar en la transformación de
plastidios de plantas superiores para expresar secuencias de ADN
bajo el control de una polimerasa de T7 dirigida al plastidio y
codificada en el núcleo se describen en la patente de EE.UU. número
5.576.198. Las secuencias completas de ADN del genoma plastidial del
tabaco son comunicados por Shinozaki y col. (EMBO J (1986)
5: 2043-2049). Todas las referencias a ADN
plastidial en la siguiente descripción se refieren al número de
nucleótido del tabaco.
La secuencia nucleotídica completa que codifica
el citocromo f del tabaco (petA) se describen en Bassham y
col. (1991) J. Biol Chem 266:
23606-23610 y Konishi y col. (1993) Plant Cell
Physiol 34: 1081-1087.
La región promotora del operón de ARN ribosómico
16S plastidial (Prrn) está unida a un sitio de unión al ribosoma
(RBS) sintético con patrón en la secuencia líder del gen rbcl del
plastidio para crear el fragmento Prrn/rbclLRBS. La secuencia de
Prrn/rbclLRBS es como se describe en Svab y col. (1993, ant.)
para el fragmento Prrn/rbclL(S).
La región promotora de las secuencias promotor
psbA del plastidio (PpsbA) y de terminación (TpsbA) se describen en
Staub y col. (1993, EMBO J. 12,
601-606).
La secuencia de Prrn/G10L se construyó
hibridando dos secuencias de oligonucleótidos, T7lead1 y T7lead2
(Tabla 1) para crear el sitio de unión al ribosoma del plastidio de
G10L (Figura 1). La secuencia de G10L se ligó al extremo 3' de la
secuencia promotora como un fragmento de EcoRI/NcoI para
crear la secuencia de Prrn/G10L.
Los genes quiméricos se insertan,
preferentemente, en el vector de expresión para dirigir su
transcripción desde el promotor Prrn. Por tanto, en el
genoma del plastidio, los genes quiméricos se transcriben a partir
del promotor Prrn/RBS o del promotor Prrn/G10L en el
plastidio vegetal. La secuencia de ácido nucleico de la fusión
Prrn/G10L se proporciona en la figura 6.
A partir de un vector precursor pPRV111b se
construye un vector de expresión en plastidio pMON30117 (Zoubenko
y col., 1994 ant., nº de registro en el banco génico
U12813). El vector pMON30117 porta un sitio de clonación múltiple
para la inserción de un gen pasajero en un casete de expresión
Prnn/rbcLRBS/Trps 16. La secuencia de Prnn/rbcLRBS se
clona en el vector pPRV111b en forma de un fragmento de
EcoRI/NcoI y la región de terminación del gen rps 16
del plastidio (Trps16) se clona en 3' del promotor Prrn como
fragmento de HindIII/NcoI. El fragmento Trps16
comprende la región reguladora en 3' del gen rps 16 desde el
nucleótido 5.087 al 4.939 en el ADN del plásmido de tabaco.
La estructura pPRV111b del vector pMON30117
contiene un gen marcador, aadA, para la selección de espectinomicina
y estreptomicina, y rps 7/12 para la integración, mediante
recombinación homóloga, del ADN pasajero en la región intergénica
trnV-rps7/12.
Se preparó un constructo de expresión nuclear,
pMON10154, como control de la integración en plantas mediante
transformación mediada por Agrobacterium. En este constructo, el gen
nativo de CP4 se expresa a partir del promotor constitutivo del
virus del mosaico de la higuera y la secuencia líder HSP70 de la
petunia, y tiene la región terminadora E9. La orientación hacia los
plastidios se realiza mediante el péptido de tránsito del
cloroplasto de la EPSPS de la petunia fusionado traduccionalmente al
extremo N del gen de CP4.
El constructo de expresión plastidial pMON30118
se preparó mediante clonación del gen nativo de la EPSPS de CP4
fusionado con los cinco (5) aminoácidos del extremo N del gen
plastidial rbcl (descrito en Svab y col., 1993,
ant.) como fragmento NcoI/SmaI en el sitio de
clonación múltiple del vector pMON30117.
El constructo de expresión plastidial pMON30123
es esencialmente el mismo que pMON30118 con la excepción de la
deleción de los cinco (5) aminoácidos del extremo N rbcl
plastidial.
El constructo de expresión plastidial pMON30130
se creó sustituyendo la EPSPS nativa de CP4 de pMON30123 con un gen
de CP4 sintético. Este constructo también carece de los 5
aminoácidos del extremo N de fusión con el gen rbcl plastidial.
El constructo de expresión plastidial pMON38773
se construyó sustituyendo la secuencia de Prrn/RBS de
pMON30123 con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente. La secuencia de ADN de EPSPS de pMON38773 también carece de los 5 aminoácidos del extremo N de fusión del gen rbcl plastidial.
pMON30123 con la secuencia promotora Prrn/G10L descrita anteriormente. La secuencia de ADN de EPSPS de pMON38773 también carece de los 5 aminoácidos del extremo N de fusión del gen rbcl plastidial.
Un constructo de expresión plastidial pMON38766
se construyó usando el promotor del gen 10 del fago T7
(P-T7), incluido el G10L, la región codificadora
del gen de CP4 (nativo) y la secuencia terminadora del gen rps 16
plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON38797
se construyó usando el promotor del gen 10 del fago T7
(P-T7), incluido el G10L, la región codificadora
del gen de CP4 (Sintético), la secuencia terminadora del gen rps 16
plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON38798
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn), el
G10L, la región codificadora del gen de CP4 (sintético), la
secuencia terminadora del gen rps 16 plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON38793
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn), un
sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético con patrón en el gen rbcL
plastidial, el gen de la EPSPS sintasa de petunia tolerante a
glifosato (P-EPSPS, Padgette y col., (1987)
Arch. Biochem. Biophys. 258: 564-574) que
porta la mutación glicina a alanina en el aminoácido de la posición
101, región terminadora del gen rps16 plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON38796
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn), un
sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético con patrón en el gen rbcL
plastidial, el gen de la EPSPS sintasa de Achromobacter (Cepa LBAA)
tolerante a glifosato (patente de EE.UU. número 5.627.061, cuya
totalidad se incorpora en la presente memoria descriptiva mediante
referencia) que porta la mutación de glicina a alanina en el
aminoácido de la posición 100 (G100A), región terminadora del gen
rps16 plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON45204
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn) con
el G10L, un gen de la EPSPS sintasa de Pseudomonas tolerante a
glifosato (cepa LBAA) que porta la mutación de glicina a alanina en
el aminoácido de la posición 100, región terminadora del gen rps16
plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON45201
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn), un
sitio de unión al ribosoma (RBS) sintético con patrón en el gen rbcL
plastidial, el gen aroE de Bacillus subtilis salvaje
tolerante a glifosato (EPSPS) (patente de EE.UU. número 5.627.061,
región terminadora del gen rps16 plastidial (Trps 16).
Un constructo de expresión plastidial pMON45259
se construyó usando el promotor del operón de ADN 16Sr (Prrn) con
la secuencia de G10L funcionalmente asociada con la secuencia de
ácido nucleico que codifica la proteína sintética CP4 que posee una
secuencia adicional en el extremo N que codifica los primeros 14
aminoácidos de la proteína fluorescente verde (GFP)
(GKGEELFTGVVPSM). La secuencia que codifica la fusión de 14
aminoácidos de GFP comienza en la glicina en la segunda posición de
la proteína. El constructo también contiene la región terminadora
rps16.
Otro constructo de expresión plastidial
pMON49218 se construyó para expresar la secuencia de CP4 sintética
con la fusión de 14 aminoácidos de GFP desde la región promotora del
operón 16SrDNA que posee codificada en el núcleo la región de la
ARN polimerasa (PrrnPEP + NEP) y la región terminadora del gen rps16
plastidial La secuencia de ADN de la fusión Prrn/NEP/G10L::14aaGFP
se proporciona en la figura 7.
Ejemplo
2
Las plantas de tabaco transformadas para
expresar los constructos pWRG4744 y pWRG4747 en el núcleo de una
célula vegetal se pueden obtener como describen Horsch y col.
(Science (1985) 227: 1229:1232).
Los plastidios de tabaco se transforman mediante
dispensación con disparador de partículas de microproyectiles como
describen Svab y Maliga (Proc. Natl. Acad. Sci. (1993)
90:913-917) y como se describen en el presente
documento.
Se cortan hojas redondas de color verde oscuro,
preferentemente del medio de los brotes, de Nicotiana tabacum
cv. Havanna de 3-6 semanas que se han mantenido
in vitro en medio MS sin hormonas (Murashige y Skoog (1962)
Physiol Plant. 15, 473-497) suplementado con
vitaminas B5 en fitobandejas o copas sundae con y fotoperiodo de 16
horas a 24ºC. Cada hoja cortada se coloca a continuación hacia
arriba en posición abaxial en papel de filtro estéril sobre medio
de regeneración de brotes de tabaco (medio TS0: sales MS, 1 mg/l de
N^{6}-benciladenina, 0,1 mg/l de ácido
1-naftalenoacético, 1 mg/l de tiamina, 100 mg/l de
inositol, 7 g/l de agar a pH 5,8 y 30 g/l de sacarosa).
Preferentemente, las hojas se colocan en el centro de la placa con
tanto contacto con el medio como sea posible. Preferentemente, las
placas se preparan inmediatamente antes de usar, pero pueden
prepararse hasta un día antes de la transformación mediante
bombardeo de partículas envolviéndolas en bolsas de plástico y
almacenándolas a 24ºC durante la noche.
Partículas de tungsteno o de oro se esterilizan
para usar como microportadores en experimentos de bombardeo. Las
partículas (50 mg) se esterilizan con 1 mg de etanol al 100% y se
almacenan a -20ºC o a -80ºC. Inmediatamente antes de usar, las
partículas se sedimentan mediante centrifugación, se lavan con de 2
a 3 lavados de 1 ml de agua destilada desionizada, se agitan en
vórtex y se centrifugan entre cada lavado. Las partículas lavadas
se resuspenden en 500 \mul de glicerol al 50%.
Las partículas esterilizadas se recubren con ADN
para transformación. A un tubo de microfuga de 1,5 ml se añaden
alícuotas de veinticinco microlitros de partículas esterilizadas y
se añaden 5 \mug de ADN de interés y se mezclan mediante golpeo.
A la mezcla de partículas/ADN se añaden treinta y cinco microlitros
de una solución recién preparada de CaCl_{2} 1,8M y espermidina
30 mM, se mezclan suavemente y se incuban a temperatura ambiente
durante 20 minutos. Las partículas recubiertas se sedimentan
mediante centrifugación breve. Las partículas se lavan dos veces
mediante la adición de 200 \mul de etanol al 70%, se mezclan
suavemente y se centrifugan brevemente. Las partículas recubiertas
se resuspenden en 50 \mul de etanol al 100% y se mezclan
suavemente. Para cada bombardeo se usan de cinco a diez microlitros
de partículas recubiertas.
La transformación mediante bombardeo de
partículas se lleva a cabo usando el disparador de helio PDS 1000
(Bio Rad, Richmond, CA) usando un protocolo modificado descrito por
el fabricante.
Las placas que contienen las muestras de hoja se
colocan en la segunda balda contando desde la parte inferior de la
cámara de vacío y se bombardean usando el disco de ruptura de 7,579
MPa (1100 psi). Tras el bombardeo, las placas petri que contienen
las muestras de hoja se envuelven en bolsas de plástico y se incuban
a 24ºC durante 48 horas.
Tras la incubación, las hojas bombardeadas se
cortan en piezas de aproximadamente 0,5 cm^{2} y se colocan hacia
arriba en posición abaxial en medio TSO suplementado con 500
\mug/ml de espectinomicina.
Tras 3-4 semanas en el medio de
selección, los brotes pequeños, verdes resistentes a espectinomicina
aparecerán en el tejido de la hoja. Estos brotes continuarán
creciendo en medio con espectinomicina y se denominan transformantes
putativos primarios.
Cuando los transformantes putativos primarios
han desarrollado de 2 a 3 hojas se cortan 2 piezas pequeñas (de
aproximadamente 0,5 cm^{2}) de cada hoja y se usan para selección
o para una segunda ronda de regeneración de brotes. Una pieza se
coloca hacia arriba en posición abaxial en placas que contienen
medio TSO suplementado con 500 \mug/ml de espectinomicina y la
otra pieza se coloca hacia arriba en posición abaxial en medio TSO
suplementado con 500 \mug/ml de cada una, espectinomicina y
estreptomicina. Los transformantes positivos se identifican como
los brotes que forman callos verdes en el medio TSO que contiene
espectinomicina y estreptomicina.
Tras 3-4 semanas, el tejido
colocado en medio TSO que sólo contiene espectinomicina, que se ha
identificado como positivo en el medio TSO con espectinomicina y
estreptomicina, desarrollará brotes verdes. De dos a cuatro brotes
de cada transformante positivo se seleccionan y transfieren a medio
TSO suplementado con 500 \mug/ml de espectinomicina para la
generación de raíces. Se realiza un análisis Southern en 2 brotes
para confirmar la homoplasmia como se describe más adelante. Los
brotes de sucesos homoplásmicos se transfieren al invernadero para
la producción de semillas, mientras que los transformantes que no
son homoplásmicos se envían a una segunda ronda o regeneración en
medio TSO con 500 \mug/ml de espectinomicina para alcanzar la
homoplasmia.
Ejemplo
3
Las plantas transformadas seleccionadas para la
expresión del gen marcador aadA marcador se analizan para
determinar si se ha transformado todo el contenido plastidial de la
planta (transformantes homoplásmicos). Normalmente, después de dos
rondas de formación de brotes y selección con espectinomicina,
aproximadamente el 50% de las plántulas transgénicas que se
analizan son homoplásmicas, como determina el análisis de
transferencia tipo Southern del ADN plastidial. Las plántulas
homoplásmicas se seleccionan para su posterior cultivo. El ADN
genómico se aísla de las plantas de tabaco transformada, se somete a
electroforesis y se transfiere a filtros tal y como se describe en
Svab y col. ((1993), Proc. Natl. Acad. Sci., 90:
913-917).
Las plantas de tabaco homoplásmicas
transformadas para expresar EPSPS de CP4 en plastidios se
identificaron usando una sonda preparada a partir de un fragmento
de 2,4 kb de EcoRI/EcoRV del vector pOVZ2 (similar al pOVZ15
descrito en Zoubenko y col. 1994, ant.). El fragmento
sonda de 2,4 kb abarca parte de la secuencia hacia la que se
apunta.
Los resultados de las hibridaciones Southern
identificaron 3 líneas homoplásmicas de tabaco transformadas con
los constructos pMON30123 y pMON30130 y 1 línea de tabaco
transformada con pMON38773 para su posterior análisis.
Las desaparición completa del fragmento de
tabaco de BamHI nativo de 3,27 kb en las líneas
30123-19-1A,
30123-23-2A,
30123-18-1B,
30130-51-2A,
30130-51-2P,
30130-57-1P y
38773-6 con una sonda que cubre la región de
integración y la aparición de bandas del tamaño previsto para los
fragmentos de ADN insertados en dichos transformantes, 5,14 kb y
0,9 kb, establece que las plantas transformadas son homoplásmicas
para los constructos pretendidos.
Los resultados de las hibridaciones Southern
identificaron 3 líneas homoplásmicas de tabaco transformadas con
pCGN5177, líneas 74-1B-P,
74-2 y 74-7.
Las líneas de tabaco transplastómicas 5175 y
6144 se analizaron mediante hibridación Southern para determinar la
homoplasmia como se ha descrito antes. Los resultados de las
hibridaciones Southern identificaron 4 líneas homoplásmicas del
tabaco transformado con pCGN6114.
Los resultados de las hibridaciones de líneas de
tabaco transplastómicas 5175 identificaron una línea,
76-4A-F, como homoplásmicas, y una
segunda línea como homoplásmica al 95%.
Con el fin de determinar el nivel de
transcripción de la EPSPS, el ARNm expresado en las plantas de
tabaco transplastómicas, se realizaron hibridaciones de
transferencia tipo Northern con ARN total aislado de cada una de
las líneas identificadas. El ARN total se aisló usando reactivo
TRIzol (Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. El ARN total, 2
\mug, se separó en un gel de agarosa desnaturalizante y se
transfirió a una membrana de nylon (Maniatis y col., 1989,
ant.). Las sondas radiactivas para hibridación se prepararon
usando fragmentos de EPSPS de CP4 marcados con cebador aleatorio
(usando un kit de marcaje de Rand'' Primer de Boehringer Mannheim) y
las hibridaciones se llevaron a cabo en 2 x SSPE (Maniatis y
col., 1989, ant.) a 60ºC. Los filtros se separaron y
volvieron a sondar con una sonda del gen de ARN ribosomal 16s
plastidial (de pPRV112A, Zoubenko y col., 1994, ant.)
para confirmar la carga homogénea del ARN en el filtro.
Los resultados de las hibridaciones Northern
realizadas con sondas de EPSPS demuestran que las siete (7) líneas
estudiadas expresaban ARNm de EPSPS de CP4. Las hibridaciones
realizadas en la sonda del ribosoma 16S confirman que los geles
desnaturalizantes estaban cargados con cantidades similares de ARN
total para cada muestra. Además, las líneas de tabaco
transplastómicas que expresan EPSPS de los elementos reguladores
Prrn/rbcL(RBS) (pMON30123) expresan ARNm de EPSPS a niveles
superiores a los de las plantas de tabaco homoplásmicas para EPSPS
controlada por las secuencias de Prrn/G10L (pMON38773)
promotor/RBS.
Para determinar la expresión de EPSPS, se
realizó un análisis de transferencia de tipo Western con una única
línea de cada constructo, pMON3013, PMON30130 y pMON38773.
La proteína total soluble se extrajo de tejido
de hoja congelado moliendo 250 mg de tejido en 250 \mul de
tampón PBS (KH_{2}PO_{4} 1 mM, Na_{2}HPO_{4}, NaCl 0,137M,
KCl 2,7 mM pH 7,0) con inhibidores de proteasa. El homogeneizado se
centrifuga durante 5 minutos y el sobrenadante se transfiere a un
tubo fresco. La concentración de la proteína en el sobrenadante se
determina usando un ensayo de concentración de proteína (Bio Rad,
Richmond, CA).
La proteína total extraída se somete a
electroforesis en gel SDS-PAGE 4-20%
(Sigma, St. Louis, MO) y se transfiere a membrana de PVDF en tampón
1 x SDS-PAGE (Maniatis y col., 1989, Cold
Spring Harbor Press). Para cuantificar la expresión de la EPSPS de
CP4 como se expresa en el plastidio vegetal se usaron patrones de
proteína EPSPS de CP4 purificada.
Se realizan hibridaciones Western como se
describe en Staub y Maliga (1993) EMBO Journal, 12 (2)
601-606, excepto por el uso de anticuerpos formados
frente a EPSPS. Las membranas de PVDF que contenían la proteína
transferida sometida a electroforesis se incubaron en una solución
de bloqueo de tampón PBS que contenía 0,05% de
Tween-20 (PBS-T) y 5% de leche
durante la noche a 4ºC. A continuación las membranas se incuban en
una solución de PBS-T que contiene 1% de leche y un
anticuerpo primario producido en cabras frente a la EPSPS de CP4
durante 2 horas a temperatura ambiente. Las membranas se lavan tres
veces en una solución de PBS-T que contiene 0,1% de
leche, cada lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Después, las membranas se incuban en una solución de
PBS-T que contiene 1% de leche y anticuerpo de oveja
anti-cabra durante 1 hora a temperatura ambiente y
se lavan de nuevo en PBS-T que contiene 1% de leche,
tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. Antes de
desarrollar las membranas con un kit de detección no radiactivo
(ECL, Amersham) se realiza un lavado final usando sólo
PBS-T.
Los resultados indicados en la Tabla 2
demuestran que se pueden obtener incrementos significativos en el
nivel de proteína EPSPS de plantas transformadas para que expresen
EPSPS desde el promotor Prrn/G10L. Estos resultados
demuestran que la expresión de EPSPS dirigida por secuencias
reguladoras Prrn/rbcLRBS puede producir aproximadamente un
0,001% de la proteína total soluble como EPSPS, mientras que en
plantas que expresan EPSPS a partir de las secuencias reguladoras
Prrn/G10L se expresa un 0,2% de la proteína total soluble en
forma de EPSPS. Líneas posteriores han demostrado una cantidad de
proteína total soluble de aproximadamente un 1% de EPSPS cuando se
expresa a partir de las secuencias reguladoras Prrn/G10L.
Estos resultados, junto con los resultados obtenidos en las
hibridaciones Northern anteriores, indican que se puede obtener una
traducción más eficaz desde el sitio de unión al ribosoma de
G10L.
Además, los constructos de expresión en
plastidios que contienen los 14 aminoácidos en el extremo N de la
GFP mostraron niveles elevados de expresión proteica. Las líneas
transplastómicas que contienen pMON45259 o pMON49218 mostraron una
cantidad de proteína total soluble superior al 12% de EPSPS de
CP4.
La actividad enzimática de EPSPS en plantas de
tabaco transplastómicas que contienen el vector de expresión en
plastidios pMON38773 se determinó usando un ensayo de cromatografía
de líquidos de presión elevada (HPLC).
Padgette y col., (J. Biol. Chem.
(1988) 263: 1798-1802 y Arch. Biochem.
Biophys. (1987) 258: 564-573) y
Wibbenmeyer y col. (Biochem. Biophys. Res. Común (1988) 153: 760-766) describen procedimientos para el análisis de la actividad enzimática de EPSPS.
Wibbenmeyer y col. (Biochem. Biophys. Res. Común (1988) 153: 760-766) describen procedimientos para el análisis de la actividad enzimática de EPSPS.
\newpage
Los resultados se resumen en la Tabla 3
siguiente.
Estos resultados demuestran que la expresión de
EPSPS en plastidios produce enzima EPSPS activa.
Para determinar el nivel más elevado de
tolerancia a glifosato se analizó in vitro una línea de
tabaco transplastómica homoplásmica para el constructo pMON38773.
El tejido de explante se preparó a partir de trozos de hojas de la
planta de tabaco control no transgénica salvaje, Havanna, las
plantas y la línea de tabaco homoplásmica 38873-6 y
se cultivaron para la regeneración de brotes en medio TSO (descrito
anteriormente) suplementado con niveles de glifosato de 50 \muM,
75 \muM, 100 \muM, 150 \muM y 200 \muM. Los resultados se
resumen en la Tabla 4 a continuación. El número de explantes
productores de brotes se determinó a las 3 y 6 semanas de la
preparación del explante y del cultivo en el medio con
glifosato.
Los resultados anteriores demuestran que a todos
los niveles de glifosato analizados se regeneraron brotes a partir
de explantes preparados de una línea de tabaco homoplásmica para
pMON38773, mientras que no regeneraron brotes a partir de explantes
preparados a partir de plantas control no transformadas. Estos
resultados sugieren que las plantas de tabaco que expresan EPSPS en
plastidios muestran tolerancia a niveles de glifosato de al menos
200 \muM.
Líneas transplastómicas adicionales se
analizaron in vitro para determinar la tolerancia a glifosato
como se ha descrito antes. Los resultados se muestran en la Tabla
5.
Estos resultados demuestran que estas líneas
transplastómicas muestran tolerancia a glifosato. Los números entre
paréntesis son el número de brotes resistentes a la selección a
glifosato 1 mM. Por tanto, como se puede observar en la tabla 5, se
generan líneas de tabaco que son tolerantes a la selección a
glifosato 1 mM.
Con una cadena de pulverizadores se rocían
plantas de tabaco homoplásmicas de la línea 38773-6
con glifosato a concentraciones correspondientes a 0 onzas/acre,
454 g (16 onzas)/acre, 907 g (32 onzas)/acre y 1,81 kg (64
onzas)/acre para analizar la tolerancia de toda la planta. Se midió
la altura de la planta antes y después de rociarla con glifosato.
Los datos de daños vegetativos se recogieron dos semanas después de
rociar con glifosato, mientras que los datos de daños reproductivos
se recogieron al madurar la planta.
Los resultados iniciales indican que las líneas
de tabaco homoplásmicas rociadas toleran el glifosato a la
concentración 454 g (16 onzas)/acre como queda demostrado en los
daños tisulares vegetativos (Tabla 6). Como se puede ver en la
Tabla 5, se generaron líneas transplastómicas que muestran un buen
nivel de tolerancia a glifosato a 907 g (32 onzas)/acre. En
posteriores experimentos con líneas transformadas adicionales, las
líneas transplastómicas han mostrado tolerancia al glifosato a un
nivel de 1,81 kg (64 onzas)/acre.
La tolerancia se caracteriza por el continuo
crecimiento y verdeo de los tejidos rociados con glifosato. No
obstante, a medida que aumenta la concentración de glifosato
aplicada, se produjo un correspondiente incremento en el nivel de
daños vegetativos. En contraste con ello, las plantas control no
transformadas fueron altamente susceptibles a concentraciones de
glifosato tan bajas como 454 g (16 onzas)/acre.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Daños vegetativos: | ||
| 0= | planta normal | |
| 1= | ligera clorosis de las hojas nuevas y raquitismo | |
| 2= | \begin{minipage}[t]{138mm} clorosis intensa de las hojas nuevas, malformación de las hojas nuevas y raquitismo intenso planta moribunda 4= planta muerta \end{minipage} | |
| Índices de fertilidad: | ||
| 0= | fértil, no hay retraso de la madurez, muchas semillas | |
| 1= | algunos abortos, ligero retraso de la liberación de semillas, semillas | |
| 2= | \begin{minipage}[t]{138mm} abortos significativos, significativo retraso de la liberación de semillas, algunas semillas \end{minipage} | |
| 3= | Gran cantidad de abortos, macetas de semillas inmaduras, pocas semillas | |
| 4= | \begin{minipage}[t]{138mm} flores con malformaciones; si han florecido, retraso extremo de la floración y no se producen semillas 5= planta muerta \end{minipage} | |
| 16 onzas/A= 454 g/acre: 32 onzas/A= 907 g/acre, 64 onzas/A= 1,81 kg/acre. |
\vskip1.000000\baselineskip
Además, se analizaron otras líneas
transplastómicas para determinar la tolerancia al rociado con varios
niveles de glifosato como se ha descrito anteriormente. La
actividad específica se mide como la cantidad de fosfoenolpiruvato
(PEP) añadido exógenamente convertido en
shikimato-3-fosfato (S3P) por unidad
de proteína en el extracto de planta. La adición de glifosato
comprueba la sensibilidad de la enzima EPSPS al glifosato. Los
resultados se resumen en la tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
| \begin{minipage}[t]{145mm} 32 onzas/acre= 907 g/acre; 128 onzas/acre= 3,63 kg/acre; 64 onzas/acre= 1,8 kg/acre; 16 onzas/acre= 454 g/acre.\end{minipage} |
\newpage
Estos datos demuestran que se pueden obtener
niveles elevados de tolerancia al glifosato en plantas
transplastómicas que expresan varias secuencias de EPSPS. En
particular, las líneas pMON45204, pMON45259 y pMON49218 proporcionan
tolerancia al glifosato aplicado a niveles de al menos 3, 63
kg/acre (128 onzas/acre) sobre los tejidos vegetativos y al menos
1,81 kg/acre (64 onzas/acre) sobre los tejidos reproductivos.
Además, los constructos pMON45259 y pMON49218
proporcionan un elevado nivel de expresión de EPSPS de CP4 en
plastidios vegetales transformados con estos constructos. En
particular se obtienen niveles de expresión superiores a
aproximadamente un 12 por ciento de proteína total soluble en
constructor que emplean secuencias que codifican los primeros 14
aminoácidos de GFP fusionada en el extremo N de CP4.
<110> Calgene Inc
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Expresión de genes de tolerancia a
herbicida en plastidios vegetales
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 15336/00/WO
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US 99/15472
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-07-09
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/113,257
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEC para Windows, versión
4.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaattgtagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacc
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un constructo que comprende los componentes
siguientes en la dirección 5' a 3' de la transcripción:
a) una secuencia promotora del operón del ARN
ribosómico 16S (Prrn) funcional en un plastidio vegetal;
b) un sitio de unión al ribosoma de la secuencia
líder del gen 10 de la polimerasa del bacteriófago T7 unido al
dicho componente promotor (a);
c) una secuencia de ADN que codifica la
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato
sintasa (EPSPS) de la cepa CP4 de Agrobacterium que es capaz
de conferir tolerancia en una célula vegetal a al menos el compuesto
herbicida glifosato cuando dicha secuencia de ADN se transcribe en
plastidios de dicha célula vegetal; y
d) una región de terminación de la
transcripción.
2. El constructo de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que dicho constructo comprende (e) un gen
que codifica un marcador de selección para seleccionar células
vegetales que comprenden un plastidio que expresa dicho marcador y
(f) regiones de ADN de homología con el genoma de dicho plastidio,
en el que dichas regiones de homología en (f) los componentes
adyacentes (a), (b), (c), (d) y (e).
3. El constructo de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, que además comprende una secuencia que
codifica los 14 aminoácidos del extremo N de la GFP en el extremo N
de la proteína codificada por (c).
4. Un plastidio de célula vegetal que contiene
el constructo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 3.
5. Una planta, semilla de planta, célula vegetal
o progenie de la misma que contiene un plastidio vegetal de acuerdo
con la reivindicación 4.
6. Un procedimiento para producir tolerancia de
un herbicida en una célula vegetal, en el que dicho procedimiento
comprende transformar plastidios de dicha célula vegetal con un
constructo como se ha definido en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, y células vegetales en crecimiento que
comprenden dichos plastidios transformados en las condiciones en
las que dicha secuencia de ADN se transcribe de manera que las
células vegetales que contienen dichos plastidios vegetales se
convierten en tolerantes a las aplicaciones de glifosato.
7. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que dicho constructo además comprende una
segunda secuencia de ADN de interés.
8. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicha segunda secuencia de ADN
comprende un gen expresado desde un promotor independiente de dicho
promotor (a).
9. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicha segunda secuencia de ADN
comprende un gen expresado desde dicho promotor (a) como un mensaje
policistrónico con dicha secuencia de ADN en (c).
10. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicha segunda secuencia de ADN
comprende un gen distinto al gen capaz de conferir a una célula
vegetal tolerancia a dicho compuesto herbicida.
11. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que dicha segunda secuencia de ADN
comprende un gen capaz de conferir a una célula vegetal tolerancia a
un segundo compuesto herbicida.
12. Una célula vegetal tolerante al herbicida
obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 6.
13. Una planta, semilla vegetal o parte de una
plante que comprende una célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 12.
14. La célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 12, que comprende más de aproximadamente 0,01% de
proteínas totales solubles como proteína expresada de dicho gen de
tolerancia al herbicida.
15. La célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 12, que comprende más de 0,1%, preferentemente más
de aproximadamente 0,2% de proteínas totales solubles como proteína
expresada de dicho gen de tolerancia al herbicida.
16. La célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 12, que posee un constructo como se ha definido en
la reivindicación 3 y comprende un 1% o más, preferentemente un 12%
o más de proteínas totales solubles como proteína expresada de
dicho gen de tolerancia al herbicida.
17. Una planta, semilla vegetal o parte de una
planta que comprende una célula vegetal de acuerdo con la
reivindicación 16.
18. Un procedimiento en el que la tolerancia al
herbicida obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación
6 se usa para seleccionar células transformadas mediante dicho
constructo de células no transformadas.
19. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 18, en el que la selección de dicha tolerancia al
herbicida se realiza en medio que contiene glifosato a una
concentración desde al menos aproximadamente 50 \muM a
aproximadamente 200 \muM.
20. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 19, en el que la selección de dicha tolerancia al
herbicida se realiza en medio que contiene glifosato a una
concentración de aproximadamente 1 mM.
21. Una célula vegetal obtenible mediante el
procedimiento de la reivindicación 18.
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