ES2281354T3

ES2281354T3 - Deteccion de diferencias en acidos nucleicos mediante la inhibicion de la migracion espontanea de la ramificacion de adn.

Info

Publication number: ES2281354T3
Application number: ES00955585T
Authority: ES
Inventors: Alla Lishanski; Marc Taylor; Nurith Kurn
Original assignee: Dade Behring Inc
Current assignee: Dade Behring Inc
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-15
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2020-08-15
Also published as: WO2001012859A2; EP1210457B1; EP1210457A2; DE60033825T2; DE60033825D1; WO2001012859A3; JP2003507025A; US6232104B1

Abstract

Un procedimiento para detectar la presencia de una diferencia entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico de referencia, que comprende: (a) la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa, usando un cebador P2, un cebador P4 con una región 3'' capaz de hibridarse a la secuencia diana y una región T en la cola 5'' que no es complementaria a la secuencia diana, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia diana en una localización en dirección 3'' de la secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3'' del cebador P4; en el que bien: el cebador P2 es una mezcla del cebador P2 con un primer marcador y el cebador P2 con un segundo marcador, o bien el cebador P4 tiene un primer marcador y el cebador P5 tiene un segundo marcador; (b) la formación de un dúplex parcial diana con cola de la secuencia diana, dicho dúplex parcial que tiene uno de dicho primer marcador o dicho segundo marcador, y una cola de dos regiones no complementarias en la que una primera región es la secuencia P5 o su complemento y la segunda región es la secuencia T o su complemento; (c) la amplificación de la secuencia de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa, usando un cebador P2, un cebador P4 con una región 3'' capaz de hibridarse a la secuencia de referencia y una región T en la cola 5'' que no es complementaria a la secuencia de referencia, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia de referencia sustancialmente adyacente, en dirección 3'', a la secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3'' del cebador P4.

Description

Detección de diferencias en ácidos nucleicos mediante la inhibición de la migración espontánea de la ramificación de ADN.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la detección de diferencias entre secuencias de ácidos nucleicos incluyendo la detección de mutaciones y polimorfismos de un solo nucleótido. La presente invención es adecuada para su uso en pruebas medioambientales y de diagnóstico debido a la comodidad con la que se puede llevar a la práctica.

Antecedentes de la invención

La hibridación de ácidos nucleicos se ha empleado para investigar la identidad y establecer la presencia de ácidos nucleicos. La hibridación se basa en el apareamiento de bases complementarias. Cuando ácidos nucleicos complementarios de cadena sencilla se incuban juntos, las secuencias de bases complementarias se aparean para formar moléculas híbridas de doble cadena. La capacidad del ácido desoxirribonucleico de cadena sencilla (ADNss) o del ácido ribonucleico (ARN) de formar una estructura unida por puentes de hidrógeno con una secuencia de ácido nucleico complementaria se ha empleado como herramienta analítica en la investigación en biología molecular. La disponibilidad de nucleósido trifosfatos radioactivos de una alta actividad específica y el marcaje con ^{32}P del ADN con la polinucleótido quinasa de T4 ha hecho posible identificar, aislar, y caracterizar diversas secuencias de ácidos nucleicos de interés biológico.

La hibridación de ácidos nucleicos tiene un gran potencial en el diagnóstico de enfermedades asociadas a secuencias de ácidos nucleicos únicas. Estas secuencias de ácidos nucleicos únicas pueden ser el resultado de un cambio genético o ambiental en el ADN por inserciones, deleciones, mutaciones puntuales, o por la incorporación de ADN o ARN exógeno debido a infección por bacterias, mohos, hongos, y virus. La hibridación de ácidos nucleicos se ha empleado principalmente, hasta ahora, en laboratorios de biología molecular académicos e industriales. La aplicación de la hibridación de ácidos nucleicos como herramienta diagnóstica en medicina clínica es limitada debido a las concentraciones habitualmente muy bajas del ADN o ARN relacionado con las enfermedades presentes en el fluido corporal del paciente y la carencia de un procedimiento de análisis por hibridación de ácidos nucleicos suficientemente sensible.

Un procedimiento para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos generalmente supone la inmovilización del ácido nucleico diana sobre un soporte sólido tal como papel de nitrocelulosa, papel de celulosa, papel diazotizado, o una membrana de nailon. Después de que el ácido nucleico diana esté fijado sobre el soporte, el soporte se pone en contacto con un ácido nucleico sonda convenientemente marcado durante 2 a 48 horas aproximadamente. Después del periodo de tiempo anterior, el soporte sólido se lava varias veces a una temperatura controlada para retirar la sonda no hibridada. A continuación el soporte se seca y el material hibridado se somete a detección mediante autorradiografía o mediante procedimientos espectrométricos.

Cuando se tienen que detectar concentraciones muy bajas, el procedimiento anterior es lento y laborioso, y frecuentemente no son adecuados marcadores no isotópicos, que se detectan menos fácilmente que los radiomarcadores.

Se ha descrito un procedimiento para la amplificación enzimática de segmentos específicos de ADN conocido como procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Este procedimiento de amplificación in vitro se basa en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación del oligonucleótido cebador, y extensión del cebador mediante una polimerasa termófila, dando como resultado el incremento exponencial de las copias de la región flanqueada por los cebadores. Los cebadores de la PCR, que se hibridan a cadenas opuestas del ADN, están situados de manera que el producto de la extensión catalizada por la polimerasa de un cebador puede servir como cadena molde para el otro, dando lugar a la acumulación de un fragmento discreto cuya longitud está definida por la distancia entre los sitios de hibridación sobre la secuencia de ADN complementario a los extremos 5' de los oligonucleótidos cebadores.

Otros procedimientos para la amplificación de ácidos nucleicos son la amplificación con un solo cebador, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en la secuencia de los ácidos nucleicos (NASBA) y el procedimiento de la Q-beta-replicasa. Independientemente de la amplificación usada, el producto amplificado se tiene que detectar.

La recombinación genética supone el intercambio de cadenas de ADN entre dos dúplex de ADN relacionados. Se cree que el punto de ramificación entre dos dúplex de ADN que han intercambiado un par de cadenas es un intermedio importante en la recombinación homóloga. Este punto de ramificación también se denomina unión de Holliday. El movimiento de la unión de Holliday por la migración de la ramificación puede incrementar o disminuir la cantidad de información genética intercambiada entre los homólogos. El intercambio de cadenas in vivo está mediado por proteínas, a diferencia de la migración espontánea que se produce in vitro.

Hay una gran demanda de procedimientos simples universales de gran capacidad de producción para la detección de diferencias en secuencias de ácidos nucleicos relacionadas independientemente de la naturaleza exacta de la diferencia. Esta demanda se está volviendo cada vez más urgente debido al rápido descubrimiento en desarrollo de nuevas mutaciones relacionadas con enfermedades causado por el progreso del Proyecto del genoma humano. En el caso de enfermedades que se sabe que son el resultado de diversas mutaciones dentro de una secuencia dada es valioso un procedimiento de detección para mutaciones que no dependa de la localización exacta de la mutación. Además, tal procedimiento será útil para la verificación de la homología de la secuencia relacionada con diversas aplicaciones en biología molecular, medicina molecular y genética de poblaciones.

Algunos de los procedimientos actuales están dirigidos a grupos de mutaciones conocidas, tales como, por ejemplo, el procedimiento Dot Blot inverso, o suponen técnicas basadas en geles, tales como, por ejemplo, polimorfismo conformacional de cadena sencilla (SSCP), electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) o secuenciación directa así como una serie de procedimientos para la detección de heterodúplex. Por tanto, tales procedimientos son laboriosos y requieren tiempo.

En los últimos años se han desarrollado diversos procedimientos para la detección de mutaciones basados en la tecnología de amplificación. La detección de alteraciones de la secuencia se basa en uno de los siguientes principios: hibridación específica de alelos, modificación química de bases incorrectamente emparejadas con la subsiguiente escisión de la cadena, escisión por nucleasas de emparejamientos incorrectos, reconocimiento de emparejamientos incorrectos por proteínas de unión a ADN específicas, cambios en la movilidad electroforética de dúplex emparejados incorrectamente en gradientes de agentes desnaturalizantes, cambios inducidos en la conformación en la movilidad electroforética del ADN de cadena sencilla, a veces combinados con la escisión con una nucleasa específica de conformación. Algunos de estos procedimientos son demasiado laboriosos y requieren tiempo y muchos dependen de la naturaleza de la alteración de la base.

Es deseable tener un procedimiento sensible, simple y barato para detectar diferencias en los ácidos nucleicos tales como mutaciones, preferentemente, en un formato homogéneo. El procedimiento debe minimizar el número y la complejidad de las etapas y reactivos. Tal procedimiento sería adecuado para una selección de la población a gran escala.

Descripción de la técnica relacionada

Panyutin, y col., (1993) J. Mol. Biol., 230:413-424 describe la formación de un solo emparejamiento incorrecto de bases que impide la migración espontánea de la ramificación de ADN.

Panyutin, y col., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 2021-2025 describe la cinética de la migración espontánea de la ramificación de ADN.

Biswas y col. (1998) J. Mol. Biol., 279, 795-806 describe en profundidad el mecanismo de inhibición de la migración espontánea de la ramificación de ADN debido a emparejamientos incorrectos.

Lishanski y col. 1996, A homogenous mutation detection method based on inhibition of branch migration, Abstract of the 28th Annual Oakridge Conference on Advanced Analytical Concepts for the Clinical Laboratory, "Tomorrow's Technology Today", p. 15 describe la detección de estructuras cruciformes estables, que indican una alteración de la secuencia en la secuencia de prueba en relación a la secuencia de referencia, usando placas de microtitulación cubiertas con estreptavidina y un conjugado enzima-anticuerpo monoclonal anti-digoxina. En el documento WO 97/23646 se muestra la detección de alteraciones en la secuencia usando la inhibición de la migración de la ramificación en un formato de ensayo de canalización de oxígeno luminiscente (LOCI).

La solicitud de patente europea Nº 0 450 370 A1 (Wetmur, y col.) describe la migración de la ramificación de polinucleótidos.

La patente de EE.UU. Nº 4.766.062 (Diamond, y col.) describe un procedimiento de ensayo de desplazamiento de polinucleótidos y el reactivo del complejo de polinucleótido para el ensayo.

La solicitud PCT WO 94/06937 (Eadie, y col.) describe un ensayo de desplazamiento de la cadena y complejo útil para el ensayo.

La solicitud PCT WO 86/06412 (Fritsch, y col.) describe un procedimiento y la construcción de ácido nucleico para producir complejos reactivos útiles en la determinación de secuencias de nucleótidos diana.

En las patentes de EE.UU. Nº 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159, 4.965.188 y 5.008.182 se describe un procedimiento para la amplificación, detección y/o clonación de secuencias de ácidos nucleicos. Saiki, y col., (1986) Science, 230: 1350-1354 describe la polimerización de secuencias mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Saiki, y col., Science (1988) 239:487 describe la amplificación enzimática de ADN dirigida con un cebador con una polimerasa de ADN termoestable.

La patente de EE.UU. Nº 4.683.202 (Mullis) muestra un procedimiento de PCR por etapas en el que se usa un segundo grupo de cebadores para amplificar una secuencia de ADN más pequeña contenida dentro de la secuencia de ADN amplificada por un primer grupo de cebadores. Este procedimiento, habitualmente denominado PCR anidada, está reconocido como un procedimiento más sensible y específico. Véanse las patentes de EE.UU. Nº 5.556.773 (Yourno) y 5.340.728 (Grosz y col.) y Gyllensten U.B., y col., Generation of single-stranded DNA by the polymerase chain reaction and its application to direct sequencing of the HLA-DQA locus, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:7652-56 (1998); Yourno J, A Method of Nested PCR with Single Closed Reaction Tubes, PCR Methods and Applications, 2:60-65 (1992); Rimstad E. y col., Identification of a Double-Stranded RNA Virus by Using Polymerase Chain Reaction and Magnetic Separation of the Synthesized DNA Segments, J. Clin. Micro. 28:2275-78 (1990); Erlich H. A. y col., Recent Advances in Polymerase Chain Reaction, Science, 252:1643-50 (1991); Porter-Jordan y col., Nested Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection of Cytomegolovirus Overcomes False Positives Caused by Contamination with Fragmented DNA, J. Med. Vir., 30:85-91 (1990).

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico diana, o la presencia de una diferencia entre un ácido nucleico diana y un ácido nucleico de referencia, que minimiza el efecto de la unión en falso del cebador en las reacciones de amplificación de la presente invención. El procedimiento comprende la amplificación de las secuencias de los ácidos nucleicos diana y de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores P2, P4 y P5. El cebador P4 tiene una región Pa 3'-terminal capaz de hibridarse a la secuencia diana o de referencia y una región T 5'-terminal que no es complementaria a la secuencia diana o de referencia. El cebador P5 es capaz de hibridarse a la secuencia diana o de referencia en una localización en dirección 3' de la secuencia capaz de hibridarse a la región 3' del cebador P4. El cebador P2 es una mezcla de P2 con un primer marcador y P2 con un segundo marcador, o bien P4 tiene un primer marcador y P5 tiene un segundo marcador. Después de la amplificación, se forman dúplex parciales con cola de las secuencias de referencia y diana. Los dúplex parciales con cola tienen colas de cadenas no complementarias en las que la primera cadena es la secuencia de P5 o su complemento y la segunda cadena es T o su complemento. Mediante la hibridación de las colas complementarias sobre los dos dúplex parciales se forma un complejo tetramolecular en el que el complejo tiene al menos un par de cadenas no complementarias y cada una de las cadenas tiene un marcador. La detección de la asociación de los marcadores como parte del complejo está relacionada con la presencia de la diferencia entre las secuencias diana y de referencia.

La fracción 3' del cebador P4 se puede hibridar con la secuencia de ácido nucleico diana en una secuencia adyacente a la secuencia hibridable al cebador P5, pero tales secuencias no necesitan ser adyacentes. Las secuencias se pueden superponer parcialmente o estar separadas en secuencia por un espacio intermedio. La amplificación de las secuencias diana y de referencia puede tener lugar en los mismos o en diferentes reactores.

Otra forma de realización de la presente invención es un procedimiento para la preparación de dúplex parciales que tienen dos secuencias no complementarias predefinidas de cadena sencilla. El procedimiento incluye la combinación en un medio de una polimerasa, nucleósido trifosfatos y los cebadores P2, P4 y P5. El medio se somete a ciclos de temperatura para formar los dúplex parciales.

Otra forma de realización de la presente invención es un procedimiento de preparación de dúplex parciales con secuencias no complementarias predefinidas de cadena sencilla. El procedimiento incluye la combinación en un medio de una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico diana, una polimerasa, nucleótido trifosfatos y los cebadores P2 y P4, y la combinación en un segundo medio de una secuencia de ácido nucleico diana, una polimerasa, nucleótido trifosfatos, y los cebadores P2 y P5. Las combinaciones se someten a ciclos de temperatura. Los medios se combinan y la combinación se somete a condiciones que dan como resultado la desnaturalización y la reasociación de los productos de amplificación de cadena sencilla para formar los dúplex parciales.

Una forma de realización adicional de la presente invención es un complejo tetramolecular preparado mediante el procedimiento de amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una mutación y una secuencia de ácido nucleico de referencia usando los cebadores P2, P4 y P5. Las secuencias de la cola de los dúplex parciales con cola formados mediante la reacción de amplificación se hibridan para formar el complejo tetramolecular.

Otra forma de realización de la presente invención es un kit para la detección de una diferencia entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico de referencia, o la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico. Un kit según la presente invención comprende en una combinación envasada un cebador P2, un cebador P4 y un cebador P5 como se ha descrito anteriormente, y adicionalmente comprende una polimerasa, nucleótido trifosfatos, una secuencia de ácido nucleico de referencia y reactivos tamponantes suficientes para llevar a cabo la amplificación del ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Los cebadores pueden estar asociados a marcadores. Los cebadores pueden estar contenidos en paquetes separados en diversas combina-
ciones.

Breve descripción de los dibujos

Las fig. 1A y 1B son diagramas esquemáticos que representan la migración de la ramificación en el complejo tetramolecular de la presente invención.

Las fig. 2A y 2B son diagramas esquemáticos que representan la formación del complejo tetramolecular de la presente invención a partir de los dúplex parciales con cola de la presente invención.

La fig. 3 es un diagrama esquemático que representa la producción de los dúplex parciales con cola de la presente invención usando una forma de realización de un esquema de cebadores de la presente invención.

La fig. 4 es un diagrama esquemático que representa la producción de los dúplex parciales diana con cola de la presente invención usando una forma de realización de un esquema de cebadores de la presente invención después de una pre-amplificación de la secuencia diana o de referencia.

La fig. 5 es un diagrama esquemático de un procedimiento de adición de los sitios de unión del cebador a las secuencias diana o de referencia.

Las fig. 6A y 6B son diagramas esquemáticos que representan la detección de una diferencia entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico de referencia usando PCR.

La fig. 7 es un diagrama esquemático que representa un esquema de cebadores de la presente invención que reduce los efectos de la unión en falso del cebador en la reacción de amplificación de la presente invención.

La fig. 8 es un diagrama esquemático del complejo tetramolecular de la presente invención.

La fig. 9 es un diagrama esquemático que representa la amplificación de la secuencia de referencia y la secuencia diana usando los cebadores de la presente invención.

Descripción de las formas de realización específicas

La presente invención es universal y permite la detección de cualquier diferencia en dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, se conozca o no tal diferencia. Tales diferencias incluyen cualquier mutación incluyendo la sustitución, deleción o inserción de una sola base dentro de una secuencia que se puede definir por un par de cebadores para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa. El procedimiento puede ser homogéneo o heterogéneo, no radioactivo, rápido y susceptible de automatización. Idealmente es adecuado para la preselección rápida de mutaciones. La presente invención permite que la PCR y las etapas posteriores, tales como la detección de los productos de la PCR, se lleven a cabo sin la necesidad de sondas adicionales en un único contenedor sin una etapa de separación.

En un aspecto el presente procedimiento supone la formación de una estructura o complejo cruciforme de ADN de cuatro cadenas. La formación supone la producción de dúplex parciales por amplificación usando tres cebadores diferentes en la reacción en cadena de la polimerasa y permitiendo que los productos de amplificación se hibriden. El complejo se disocia en estructuras dúplex normales mediante el intercambio de cadenas por medio de la migración de la ramificación cuando las fracciones de doble cadena de cada dúplex parcial son idénticas. No obstante, cuando haya una diferencia entre las dos fracciones de doble cadena, el complejo no se disocia y se puede detectar como un indicio de la presencia de una diferencia entre los ácidos nucleicos.

Antes de proseguir con una descripción de las formas de realización específicas de la presente invención, se definirán una serie de términos.

Definiciones

Ácido nucleico: Un compuesto o composición que es un nucleótido o polinucleótido polimérico. Los ácidos nucleicos incluyen tanto ácidos nucleicos como sus fragmentos de cualquier procedencia, en forma purificada o no purificada incluyendo ADN (ADNds y ADNss) y ARN, incluyendo t-ARN, m-ARN, r-ARN, ADN y ARN mitocondrial, ARN y ARN de cloroplastos, híbridos de ADN-ARN, o sus mezclas, genes, cromosomas, plásmidos, genomas de materiales biológicos tales como microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, humanos, y similares. El ácido nucleico puede ser sólo una fracción menor de una mezcla compleja tal como una muestra biológica. El ácido nucleico se puede obtener a partir de una muestra biológica mediante procedimientos muy conocidos en la técnica. También se incluyen genes, tales como el gen de la hemoglobina para la anemia falciforme, el gen de la fibrosis cística, oncogenes, ADNc, y similares. Cuando el ácido nucleico es ARN, primero se convierte a ADNc por medio de un cebador y la transcriptasa inversa. La nucleótido polimerasa usada en la presente invención para llevar a cabo la amplificación y extensión de la cadena puede tener actividad transcriptasa inversa. Las secuencias de interés pueden estar insertadas en secuencias de cualquier longitud cromosoma, ADNc, plásmido, etc.

Muestra: El material sospechoso de contener el ácido nucleico. Tales muestras incluyen fluidos biológicos tales como la sangre, suero, plasma, esputo, fluido linfático, semen, moco vaginal, heces, orina, fluido espinal, y similares; tejidos biológicos tales como cabello y piel; etc. Otras muestras incluyen cultivos celulares y similares, plantas, alimentos, muestras forenses tales como papel, tejidos y raspaduras, agua, aguas residuales, medicinas, etc. Cuando sea necesario, la muestra se puede pretratar con reactivos para licuar la muestra y liberar a los ácidos nucleicos de sustancias unidas. Tales pretratamientos son muy conocidos en la técnica.

Amplificación de ácidos nucleicos: Cualquier procedimiento que dé como resultado la formación de una o más copias de un ácido nucleico. Uno de tales procedimientos para la amplificación enzimática de secuencias específicas de ADN es conocido como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), según describe Saiki, y col., supra. Este procedimiento de amplificación in vitro se basa en ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación del oligonucleótido cebador, y extensión del cebador mediante una polimerasa termófila que depende de un polinucleótido molde, que da como resultado el incremento exponencial en las copias de la secuencia deseada del ácido nucleico flanqueado por los cebadores. Los dos cebadores diferentes de la PCR están diseñados para hibridarse a cadenas opuestas del ADN en posiciones que permiten que el producto de la extensión catalizada por la polimerasa de un cebador sirva como cadena molde para el otro, dando lugar a la acumulación de un fragmento discreto de doble cadena cuya longitud está definida por la distancia entre los extremos 5' de los oligonucleótidos cebadores. La longitud del cebador puede variar entre 10 y 50 nucleótidos aproximadamente o más, y normalmente se seleccionan para que sean de al menos 15 nucleótidos aproximadamente para asegurar una especificidad elevada. El fragmento de doble cadena producido se denomina "amplicón" y su longitud puede variar desde sólo 30 nucleótidos aproximadamente a 10.000 o más.

Extensión de la cadena de ácidos nucleicos: Extensión del extremo 3' de un polinucleótido al cual se han agregado nucleótidos o bases adicionales. La extensión de la cadena pertinente para la presente invención depende de un molde, esto es, los nucleótidos agregados están determinados por la secuencia de un ácido nucleico molde al cual está hibridado la cadena a extender. La secuencia del producto de extensión de la cadena que se produce es complementaria a la secuencia molde. Normalmente, la extensión de la cadena está catalizada por enzimas, preferentemente, en la presente invención, por una ADN polimerasa termófila.

Secuencia de ácido nucleico diana: Una secuencia de nucleótidos que se va a estudiar en cuanto a la presencia de una diferencia con una secuencia relacionada o para la determinación de su presencia o ausencia. La secuencia de ácido nucleico diana puede ser de doble cadena o de cadena sencilla y procedente de una fuente natural o sintética. Cuando la secuencia de ácido nucleico diana es de cadena sencilla, el procedimiento de la presente invención produce un dúplex de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de ácido nucleico diana de cadena sencilla.

La secuencia diana normalmente se encuentra dentro de una fracción o es todo el ácido nucleico, cuya identidad se conoce hasta un grado suficiente para permitir la preparación de diversos cebadores necesarios para introducir uno o más sitios de unión del cebador que flanquean la secuencia diana o que dan lugar a una amplificación de la secuencia diana o a una extensión de la cadena de los productos de tal amplificación según la presente invención. Por consiguiente, aparte de los sitios a los cuales se unen los cebadores, la identidad de la secuencia de ácido nucleico diana puede ser conocida o no. En general, en la PCR, los cebadores se hibridan, y se extienden a lo largo (cadena extendida), al menos de la secuencia diana, y así, la secuencia diana actúa como molde. La secuencia diana normalmente contiene entre 30 y 20.000 nucleótidos aproximadamente o más, más frecuentemente, entre 100 y 10.000 nucleótidos, preferentemente, entre 50 y 1000 nucleótidos. La secuencia de ácido nucleico diana generalmente es una fracción de una molécula más grande o puede ser sustancialmente toda la molécula. Para asegurarse de que se pueda conseguir la determinación de una diferencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas según la presente invención se selecciona el número mínimo de nucleótidos en la secuencia diana.

Secuencia de ácido nucleico de referencia: Una secuencia de ácido nucleico que está relacionada con el ácido nucleico diana porque las dos secuencias son idénticas excepto por la presencia de una diferencia, tal como una mutación. Cuando se tenga que detectar una mutación, la secuencia de ácido nucleico de referencia normalmente contendrá la secuencia normal o "natural". En ciertas situaciones la secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser parte de la muestra como, por ejemplo, en muestras de tumores, la identificación de microorganismos mutados parcialmente, por la identificación de portadores heterocigóticos de una mutación. En consecuencia, ambas secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia se someten a las mismas condiciones de amplificación o similares. Al igual que con la secuencia de ácido nucleico diana, la identidad de la secuencia de ácido nucleico de referencia se debe conocer sólo hasta un grado suficiente para permitir la preparación de diversos cebadores necesarios para la introducción de uno o más sitios de unión del cebador que flanquean la secuencia de referencia o que dan lugar a una amplificación de la secuencia diana o a una extensión de la cadena de los productos de tal amplificación según la presente invención. Por consiguiente, aparte de los sitios a los cuales se unen los cebadores, la identidad de la secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser conocida o no. La secuencia de ácido nucleico de referencia puede ser un reactivo empleado en los procedimientos según la presente invención. Particularmente ésta es la situación en la que el presente procedimiento se usa en la amplificación por PCR para la detección de una secuencia de ácido nucleico diana. Dependiendo del procedimiento de preparación de este reactivo puede o no ser necesario conocer la identidad del ácido nucleico de referencia. El reactivo del ácido nucleico de referencia se puede obtener a partir de una fuente natural o se puede preparar mediante procedimientos conocidos, tales como aquellos descritos a continuación en la definición de oligonucleótidos.

Unión de Holliday: El punto de ramificación en una unión de cuatro direcciones en un complejo de dos secuencias de ácidos nucleicos idénticas y sus secuencias complementarias. La unión es capaz de experimentar la migración de la ramificación dando como resultado la disociación del complejo en dos secuencias de doble cadena en las que la identidad y complementariedad de la secuencia se extiende hasta los extremos de las cadenas.

Complejo: Un complejo de cuatro cadenas de ácidos nucleicos que contienen una unión de Holliday, que tiene inhibida la disociación en dos secuencias de doble cadena debido a la diferencia en las secuencias y sus complementos. Por consiguiente, el complejo es tetramolecular.

Secuencias de ácidos nucleicos relacionadas: Dos secuencias de ácidos nucleicos están relacionadas cuando contienen al menos 15 nucleótidos en cada extremo que son idénticos pero tienen longitudes diferentes o tienen secuencias intermedias que difieren en al menos un nucleótido. Frecuentemente, que las secuencias de ácidos nucleicos relacionadas difieren entre sí en un solo nucleótido. Tal diferencia se denomina en el presente documento como "diferencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas". Una diferencia se puede producir por la sustitución, deleción o inserción de cualquier nucleótido único o de una serie de nucleótidos dentro de una secuencia.

Mutación: Un cambio en la secuencia de nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico conservada normalmente que da como resultado la formación de un mutante diferenciado de la secuencia normal (inalterada) o natural. Generalmente las mutaciones se pueden dividir en dos clases generales, a saber, sustituciones de pares de bases y mutaciones por desplazamiento del marco de lectura. Esta última supone la inserción o deleción de uno o varios pares de nucleótidos. Una diferencia de un nucleótido puede ser importante en cuanto a la normalidad o anormalidad fenotípica como el caso de, por ejemplo, la anemia falciforme. Para los propósitos de esta solicitud, una mutación puede incluir un polimorfismo.

Polimorfismo: Una diferencia en la secuencia de ADN entre individuos. Para los propósitos de esta solicitud, una mutación como se ha definido en el presente documento puede representar un polimorfismo. Un polimorfismo de un solo nucleótido es una diferencia de un par de bases entre secuencias de ADN.

Dúplex parciales: Una secuencia de ácido nucleico de doble cadena completamente complementarias en la que uno de sus extremos tiene secuencias de oligonucleótidos no complementarias, una unida a cada cadena de la molécula de doble cadena, cada secuencia no complementaria a 8 a 60, preferentemente, 10 a 50, más preferentemente, 15 a 40, nucleótidos. Así, se dice que el dúplex parcial "tiene cola" debido a que cada cadena del dúplex tiene una cadena sencilla de oligonucleótidos unida a él.

Dúplex: Una secuencia de ácido nucleico de doble cadena en la que todos los nucleótidos en ella son sustancialmente complementarios.

Oligonucleótido: Un polinucleótido de cadena sencilla, normalmente un polinucleótido sintético. El oligonucleótido(s) normalmente está constituido por una secuencia de una longitud de 10 a 100 nucleótidos, preferentemente, de 20 a 80 nucleótidos, y más preferentemente, de 30 a 60 nucleótidos.

Se pueden emplear diversas técnicas para la preparación de un oligonucleótido utilizado en la presente invención. Tal oligonucleótido se puede obtener por síntesis biológica o por síntesis química. Para secuencias cortas (hasta 100 nucleótidos aproximadamente), frecuentemente la síntesis química será más económica comparada con la síntesis biológica. Además de la economía, la síntesis química proporciona una manera idónea de incorporar compuestos de bajo peso molecular y/o bases modificadas durante la etapa de síntesis. Además, la síntesis química es muy flexible en la elección de la longitud y la región de la secuencia de unión del polinucleótido diana. El oligonucleótido se puede sintetizar mediante procedimientos clásicos tales como aquellos usados en sintetizadores comerciales automatizados de ácidos nucleicos. La síntesis química de ADN sobre un vidrio o resina convenientemente modificado puede dar como resultado un ADN unido covalentemente a la superficie. Esto puede ofrecer ventajas en el lavado y manipulación de muestras. Para secuencias más largas se pueden usar procedimientos de replicación clásicos empleados en biología molecular tales como el uso de M13 para ADN de cadena sencilla como se describe por J. Messing (1983) Methods Enzymol, 101:20-78.

Otros procedimientos de síntesis de oligonucleótidos incluyen procedimientos con fosfotriéster y con fosfodiéster (Narang, y col. (1979) Meth. Enzymol 68:90) y síntesis sobre un soporte (Beaucage, y col. (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1862) así como la técnica del fosforamidato, Caruthers, M. H., y col., Methods in Enzymology, 154:287-314 (1988), y otras descritas en "Synthesis and Applications of DNA and RNA", S. A. Narang, editor, Academic Press, Nueva York, 1987, y las referencias allí contenidas.

Oligonucleótido(s) cebador(es): Un oligonucleótido que normalmente se emplea en la extensión de una cadena sobre un molde de polinucleótidos tal como en, por ejemplo, una amplificación de un ácido nucleico. El oligonucleótido cebador normalmente es un oligonucleótido sintético de cadena sencilla, que contiene una secuencia hibridable en su extremo 3' que es capaz de hibridarse con una secuencia definida del polinucleótido diana o de referencia. Normalmente, la secuencia hibridable del oligonucleótido cebador tiene una complementariedad de al menos el 90%, preferentemente del 95%, lo más preferentemente del 100%, a una secuencia definida o al sitio de unión del cebador. El número de nucleótidos en la secuencia hibridable de un oligonucleótido cebador debe ser tal que la rigurosidad de las condiciones usadas para hibridar el oligonucleótido cebador prevendrá la hibridación no específica aleatoria excesiva. Normalmente, el número de nucleótidos en la secuencia hibridable del oligonucleótido cebador será de al menos diez nucleótidos, preferentemente al menos 15 nucleótidos y, preferentemente de 20 a 50 nucleótidos. Además, el cebador puede tener una secuencia en su extremo 5' que no se hibrida con los polinucleótidos diana o de referencia que puede tener de 1 a 60 nucleótidos, preferentemente, de 8 a 30 polinucleótidos.

Nucleósido trifosfatos: Nucleósidos con un sustituyente 5'-trifosfato. Los nucleósidos son derivados del azúcar pentosa de bases nitrogenadas de purina o pirimidina, unidos covalentemente al carbono 1' del azúcar pentosa, que normalmente es desoxirribosa o ribosa. Las bases de purina comprenden adenina (A), guanina (G), inosina (I), y sus análogos y derivados. Las bases de pirimidina comprenden citosina (C), timina (T), uracilo (U), y sus análogos y derivados. Los nucleósido trifosfatos incluyen desoxirribonucleósido trifosfatos tales como los cuatro trifosfatos comunes dATP, dCTP, dGTP y dTTP y ribonucleósido trifosfatos tales como los cuatro trifosfatos comunes rATP, rCTP, rGTP y rUTP.

El término "nucleósido trifosfatos" también incluye sus análogos y derivados, que están ejemplificados por aquellos derivados que son reconocidos y se polimerizan de una manera similar a los nucleósido trifosfatos no derivados. Los ejemplos de tales análogos o derivados, a modo de ilustración y no de limitación, son aquellos que están biotinilados, modificados con amina, alquilados, y similares y también incluyen fosforotioato, fosfito, derivados modificados en los átomos anulares, y similares.

Nucleótido: Una combinación de base-azúcar-fosfato que es la unidad monomérica de los polímeros ácidos nucleicos, es decir, ADN y ARN.

Nucleósido: Es una combinación de base-azúcar o un nucleótido que carece del resto fosfato.

Nucleótido polimerasa: Un catalizador, normalmente una enzima, para formar una extensión de un polinucleótido a lo largo de un molde de ADN o ARN en el que la extensión es complementaria al molde. La nucleótido polimerasa es una polinucleótido polimerasa que depende del molde y utiliza nucleósido trifosfatos como bloques de construcción para extender el extremo 3' de un polinucleótido para proporcionar una secuencia complementaria al molde de polinucleótidos. Normalmente, los catalizadores son enzimas, tales como las ADN polimerasas, por ejemplo, la ADN polimerasa de procariotas (I, II, o III), la ADN polimerasa de T4, la ADN polimerasa de T7, el fragmento Klenow, y la transcriptasa inversa, y preferentemente son ADN polimerasas térmicamente estables tales como la ADN polimerasa Vent®, ADN polimerasa VentR®, ADN polimerasa Pfu®, polimerasa Pfu Turbo®, ADN polimerasa Taq®, y similares, procedentes de cualquier fuente tales como células, bacterias, tales como E. coli, plantas, animales, virus, bacterias termófilas, etc.

Completa o parcialmente de manera secuencial: Cuando la muestra y los diversos agentes utilizados en la presente invención se combinan de manera diferente a concomitantemente (simultáneamente), se pueden combinar uno o más con uno o más de los agentes restantes para formar una subcombinación. La subcombinación y los agentes restantes se pueden combinar a continuación y se pueden someter al presente procedimiento.

Hibridación (hibridar) y unión: En el contexto de las secuencias de nucleótidos estos términos se usan aquí de manera intercambiable. La capacidad de dos secuencias de nucleótidos para hibridarse entre sí está basada en el grado de complementariedad de las dos secuencias de nucleótidos, que a su vez está basada en la fracción de pares de nucleótidos complementarios emparejados. Cuantos más nucleótidos en una secuencia dada sean complementarios a otra secuencia, más rigurosas pueden ser las condiciones para la hibridación y más específica será la unión de las dos secuencias. Se consigue una mayor rigurosidad elevando la temperatura, incrementando la relación de co-disolventes, disminuyendo la concentración de sales, y similares.

Complementarias: Dos secuencias son complementarias cuando la secuencia de una se puede unir a la secuencia de la otra en sentido anti-paralelo en el que el extremo 3' de cada secuencia se une al extremo 5' de la otra secuencia y cada A, T(U), G, y C de una secuencia se alinea con una T(U), A, C, y G, respectivamente, de la otra secuen-
cia.

Copia: Significa una secuencia que es una copia idéntica directa de una secuencia de polinucleótidos de cadena sencilla diferenciada de una secuencia que es complementaria a la secuencia de tal polinucleótido de cadena sencilla.

Condiciones para la extensión de un cebador: Incluye una nucleótido polimerasa, nucleósido trifosfatos o sus análogos capaces de actuar como sustratos para la polimerasa y otros materiales y condiciones necesarias para la actividad enzimática tales como un ión metálico divalente (normalmente magnesio), pH, fuerza iónica, disolvente orgánico (tal como formamida), y similares.

Miembro de un par de unión específico ("miembro sbp"): Una de las dos moléculas diferentes, con un área sobre la superficie o en una cavidad que se une específicamente y así está definida como complementaria a una organización espacial y polar particular de la otra molécula. Los miembros del par de unión específico se denominan ligando y receptor (antiligando). Éstos pueden ser miembros de un par inmunológico tal como antígeno-anticuerpo, o pueden ser operador-represor, nucleasa-nucleótido, biotina-avidina, hormona-receptor de la hormona, IgG-proteína A, ADN-ADN, ADN-ARN, y similares.

Ligando: Cualquier compuesto para el cual existe un receptor natural, o se puede preparar.

Receptor ("antiligando"): Cualquier compuesto o composición capaz de reconocer una organización espacial y polar particular de una molécula, por ejemplo, el sitio epitópico o determinante. Los receptores ilustrativos incluyen receptores de origen natural y sintéticos, por ejemplo, tiroxina que une globulina, anticuerpos, enzimas, fragmentos F_{ab}, lectinas, ácidos nucleicos, represores, oligonucleótidos, proteína A, componente del complemento C1q, o proteínas de unión al ADN y similares.

Molécula orgánica pequeña: Un compuesto de un peso molecular inferior a 1500 aproximadamente, preferentemente de 100 a 1000, más preferentemente de 300 a 600 tal como biotina, digoxina, fluoresceína, rodamina y otros colorantes, tetraciclina y otras moléculas de unión a proteínas, y haptenos, etc. La molécula orgánica pequeña puede proporcionar un medio para la unión de una secuencia de nucleótidos a un marcador o a un soporte.

Soporte o superficie: Un material poroso o no poroso insoluble en agua. El soporte puede ser hidrófilo o capaz de transformarse en hidrófilo e incluye polvos inorgánicos tales como sílice, sulfato de magnesio, y alúmina; materiales poliméricos naturales, particularmente materiales celulósicos y materiales procedentes de la celulosa, tales como papeles que contienen fibra, por ejemplo, papel de filtro, papel cromatográfico, etc.; polímeros sintéticos o de origen natural modificados, tales como nitrocelulosa, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, dextrano entrecruzado, agarosa, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etilentereftalato), nailon, poli(vinilbutirato), etc.; usados como tal o junto con otros materiales, vidrio disponible como Bioglass, materiales cerámicos, metales, y similares. También se pueden emplear ensamblajes naturales o sintéticos tales como liposomas, vesículas de fosfolípidos, y células.

La unión de miembros sbp a un soporte o superficie se puede llevar a cabo mediante técnicas muy conocidas, disponibles habitualmente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, Nueva York (1978) y Cuatrecasas, J. Biol. Chem., 245:3059 (1970). La superficie puede tener cualquiera de una serie de formas, tal como cinta, barra, partícula, incluyendo cuentas, y similares.

Marcador: Un miembro de un sistema que produce señales. Los marcadores incluyen moléculas indicadoras que se pueden detectar directamente debido a que generan una señal, y miembros de pares de unión específicos que se pueden detectar indirectamente por la unión posterior a un cognado que contiene una molécula indicadora tal como secuencias de oligonucleótidos que pueden servir para unir una secuencia complementaria o una proteína específica de unión a ADN; moléculas orgánicas tales como la biotina o la digoxigenina que se pueden unir respectivamente a estreptavidina y a anticuerpos antidigoxina, respectivamente; polipéptidos; polisacáridos; y similares. En general, se puede usar cualquier molécula indicadora que sea detectable. La molécula indicadora puede ser isotópica o no isotópica, normalmente no isotópica, y puede ser un catalizador, tal como una enzima, un colorante, una molécula fluorescente, un quimioluminiscente, una coenzima, un sustrato enzimático, un grupo radioactivo, una partícula tal como una partícula de látex o carbono, un sol metálico, cristalita, un liposoma, una célula, etc. que se puede marcar posteriormente o no con un colorante, un catalizador u otro grupo detectable, y similares. El grupo indicador puede ser un grupo fluorescente tal como fluoresceína, un grupo quimioluminiscente tal como luminol, un quelante de terbio tal como ácido N-(hidroxietil)etilendiamintriacético que se puede detectar por fluorescencia retardada, y similares.

El marcador es un miembro de un sistema de producción de señales y puede generar una señal detectable solo o junto con otros miembros del sistema de producción de señales. Como se ha mencionado anteriormente, una molécula indicadora puede servir como marcador y se puede unir directamente a una secuencia de nucleótidos. Alternativamente, la molécula indicadora se puede unir a una secuencia de nucleótidos uniéndose a un miembro sbp complementario a un miembro sbp que comprende un marcador unido a una secuencia de nucleótidos. Ejemplos de marcadores particulares o moléculas indicadoras y su detección se pueden encontrar en la patente de EE.UU. Nº 5.595.891.

Sistema de producción de señales: El sistema de producción de señales puede tener uno o más componentes, con al menos un componente que es el marcador. El sistema de producción de señales genera una señal que se relaciona con la presencia de una diferencia entre la secuencia de polinucleótidos diana y la secuencia de polinucleótidos de referencia. El sistema de producción de señales incluye todos los reactivos necesarios para producir una señal medible. Cuando una molécula indicadora no está conjugada con una secuencia de nucleótidos, la molécula indicadora normalmente se une a un miembro sbp complementario a un miembro sbp que está unido a o es parte de una secuencia de nucleótidos. Otros componentes del sistema de producción de señales pueden incluir sustratos, potenciadores, activadores, compuestos quimioluminiscentes, cofactores, inhibidores, secuestradores, iones metálicos, sustancias de unión específica necesarias para la unión de sustancias que generan señales, coenzimas, sustancias que reaccionan con productos enzimáticos, enzimas y catalizadores, y similares. El sistema de producción de señales proporciona una señal detectable por medios externos, tal como mediante el uso de radiación electromagnética, detección electroquímica, y de manera deseable por detección espectrofotométrica. El sistema de producción de señales se describe con más profundidad en la patente de EE.UU. Nº 5.595.891.

Materiales auxiliares: Frecuentemente se emplearán diversos materiales auxiliares en los procedimientos y ensayos llevados a cabo según la presente invención. Por ejemplo, normalmente estarán presentes tampones en el medio de ensayo, así como estabilizantes para el medio de ensayo y los componentes del ensayo. Frecuentemente, además de estos aditivos, se pueden incluir proteínas, tales como albúminas, disolventes orgánicos tales como formamida, sales de amonio cuaternarias, policationes tales como dextranosulfato, tensioactivos, particularmente tensioactivos no iónicos, potenciadores de la unión, por ejemplo, polialquilenglicoles, o similares.

Formación de estructuras cruciformes de cuatro cadenas

Como se ha mencionado anteriormente, un aspecto de la presente invención se ocupa de un procedimiento para la detección de la presencia de una diferencia entre dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas (una secuencia de referencia y una secuencia diana). En el procedimiento, si hay una diferencia entre las dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas, se forma un complejo tetramolecular estable que comprende ambas secuencias de ácidos nucleicos en forma de doble cadena. Normalmente, el complejo comprende una unión de Holliday. Ambos miembros de al menos un par de cadenas no complementarias dentro del complejo tienen marcadores. La asociación de los marcadores como parte del complejo se determina como un indicio de la presencia de la diferencia entre las dos secuencias relacionadas. El procedimiento se puede emplear para detectar la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico diana o para detectar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana.

Un aspecto de la invención está representado en la Fig. 1A. El complejo tetramolecular C comprende el dúplex parcial A' y el dúplex parcial B'. Los dúplex parciales A' y B' están relacionados porque sus fracciones hibridadas son idénticas excepto por la mutación M en el dúplex parcial A'. Adicionalmente, el dúplex parcial A' tiene un marcador L1, que puede diferir o no del marcador L2 en el dúplex parcial B'. La cola de oligonucleótidos A1 del dúplex parcial A' se hibrida a la cola de oligonucleótidos B2 correspondiente del dúplex parcial B' y, de manera similar, la cola de oligonucleótidos A2 del dúplex parcial A' se hibrida a la cola de oligonucleótidos B1 del dúplex parcial B'. Por consiguiente, el complejo C es tetramolecular y contiene una unión H de cuatro direcciones. Debido a que las colas de oligonucleótidos A1 y B1 son diferentes, la migración de la ramificación sólo se puede producir lejos de estas colas y sólo hasta que se alcanza la mutación M, en cuyo punto se detiene la migración de la ramificación. Así, como se muestra en la Fig. 1A, cuando está presente una mutación, el complejo C es estable y se puede detectar determinando si ambos marcadores L1 y L2 se han asociado. La asociación de los marcadores indica la presencia del complejo C y, así, la presencia de la mutación M en la secuencia de ácido nucleico diana. Como se muestra en la Fig. 1B, si no está presente la mutación M, la migración de la ramificación continua hasta que se produce un intercambio completo de la cadena y sólo están presentes los dúplex D y E separados, con lo cual no se detecta el complejo C.

En las Fig. 2A y 2B se representan otra forma de realización según la presente invención. El procedimiento es para la detección de una mutación dentro de una secuencia de ácido nucleico diana A que contiene la mutación M. El procedimiento comprende la formación, a partir de la secuencia diana, de un dúplex parcial A' diana con cola constituido de un dúplex de la secuencia diana, un marcador L1 y, en un extremo del dúplex, dos oligonucleótidos no complementarios A1 y A2, uno unido a cada cadena del dúplex A'. Los oligonucleótidos A1 y A2 tienen entre 8 y 60 nucleótidos, preferentemente, entre 15 y 30 nucleótidos. El dúplex parcial diana con cola se suministra en combinación con un dúplex parcial B' de referencia con cola marcado que carece de la mutación M. El dúplex parcial B' de referencia con cola está constituido de dos cadenas de ácidos nucleicos que son idénticas a las cadenas en A' excepto por la mutación M. Por consiguiente, un extremo del dúplex parcial B’ de referencia con cola tiene, como parte terminal de cada cadena, una secuencia de nucleótidos no complementarios B1 y B2, que son complementarios a A2 y A1, respectivamente. Los marcadores L1 y L2 están presentes en cadenas no complementarias de los dúplex parciales diana con cola y de referencia con cola (A' y B'). L1 y L2 pueden ser iguales o diferentes.

Aún en referencia a la Fig. 2A, se forma un complejo C como se ha descrito anteriormente para la Fig. 1A. La cola de oligonucleótidos A1 de A' se hibrida a la cola de oligonucleótidos B2 correspondiente de B' y, de manera similar, la cola de oligonucleótidos A2 de A' se hibrida a la cola de oligonucleótidos B1 de B'. Debido a que las colas de los oligonucleótidos A1 y B1 son diferentes, la migración de la ramificación sólo se puede producir fuera de estas colas y sólo hasta que se alcanza la mutación M, en cuyo punto se detiene la migración de la ramificación. Así, cuando está presente una mutación, el complejo C es estable y se puede detectar determinando si ambos marcadores L1 y L2 se han asociado. La asociación de los marcadores indica la presencia del complejo C. La formación del complejo C está directamente relacionada con la presencia de la mutación. Ahora en referencia a la Fig. 2B, si la mutación M no está presente en el ácido nucleico diana A, la migración de la ramificación en el complejo continúa hasta que se produce un intercambio completo de la cadena y sólo están presentes los dúplex D y E separados. En este caso no se detecta el complejo C.

Producción de dúplex parciales diana con cola por PCR y extensión de la cadena

Amplificación de la secuencia diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

En la Fig. 3 se muestra otro aspecto de la presente invención, que representa, a modo de ejemplo y no de limitación, la producción de dúplex parciales A' diana con cola a partir del dúplex A de ácidos nucleicos diana con la mutación M, y la producción del dúplex parcial B' de referencia con cola a partir del dúplex B de ácidos nucleicos de referencia. En una forma de realización de la Fig. 3, A se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores P1 y P2 para producir un amplicón AA. El cebador P2 contiene un marcador L1 y el cebador P1 está constituido de una fracción Pa 3'-terminal que se puede hibridar con la secuencia diana y una fracción B1 5'-terminal que no se puede hibridar con la secuencia diana. La amplificación se lleva a cabo en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos usando ciclos de temperatura. El amplicón AA tiene dos cadenas, una cadena marcada procedente del cebador P2 y una cadena no marcada procedente del cebador P1. La cadena no marcada tiene una fracción B1 5'-terminal del cebador P1 y la cadena marcada tiene una fracción A2 3'-terminal correspondiente, que es el complemento de B1.

Extensión de la cadena del amplicón AA (secuencia diana)

De nuevo en referencia a la Fig. 3, a continuación se lleva a cabo una extensión de la cadena del cebador P3 a lo largo de la cadena marcada del amplicón AA para producir el dúplex parcial A' diana con cola. El cebador P3 está constituido de una fracción Pa 3'-terminal, que es idéntica a Pa del cebador P1 y que se une a la cadena marcada de AA. P3 tiene una fracción A1 5'-terminal que no es complementaria al amplicón AA. La extensión de la cadena se lleva a cabo en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos en las condiciones de temperatura apropiadas de manera que sólo se produce la cadena complementaria de la cadena marcada, y no una copia. En esta forma de realización particular esto se consigue eliminando los cebadores P2 y P1 antes de la extensión de P3 de la manera que se describe a continuación. La cadena complementaria no marcada del dúplex parcial A' diana con cola tiene una fracción A1 5'-terminal, que no es complementaria a la fracción A2 3'-terminal de la cadena marcada de A'. A menos que se lleve a cabo una reacción de PCR para producir un exceso de cadena marcada, también estará presente la cadena no marcada procedente de la amplificación. Esta cadena no sirve de molde durante la extensión de la cadena para formar el dúplex parcial A'.

Amplificación y extensión de la cadena de la secuencia de referencia

En la forma de realización de la Fig. 3, la secuencia B de ácidos nucleicos de referencia está en un medio aparte; el cebador P2 y el cebador P3 se emplean en la reacción en cadena de la polimerasa para producir el amplicón BB. La amplificación se lleva a cabo usando ciclos de temperatura en las condiciones descritas a continuación en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos. B está constituido de una secuencia idéntica a A excepto por la mutación M. Generalmente, el cebador P2 usado para esta amplificación contiene un marcador L2 que puede ser igual o diferente a L1. El amplicón BB tiene dos cadenas, una cadena marcada procedente del cebador P2 y una cadena no marcada procedente del cebador P3. La cadena no marcada tiene la fracción A1 terminal del cebador P1 y la cadena marcada tiene la fracción B2 terminal correspondiente, que es el complemento de A1.

Se lleva a cabo una extensión de la cadena del cebador P1 a lo largo de la cadena marcada del amplicón BB, en las condiciones mencionadas anteriormente para la extensión de la cadena del cebador P3 a lo largo de la cadena marcada en el dúplex AA, para producir un dúplex parcial B' de referencia con cola. Como se ha mencionado anteriormente, el cebador P1 está constituido de la fracción Pa, que se une a la cadena marcada de BB y la fracción B1 que no se une al amplicón BB. La extensión de la cadena se lleva cabo en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos en las condiciones de temperatura apropiadas de manera que sólo se produce el complemento de la cadena marcada, y no una copia. El cebador P1 extendido tiene una fracción B1 5'-terminal, que no es complementaria a la fracción B2 terminal de la cadena marcada de B'. Como se puede observar, A' y B' están relacionadas porque cada una de sus cadenas marcadas es complementaria, excepto por la mutación M, a la cadena no marcada de la otra.

Condiciones de reacción para la PCR y la extensión de la cadena

La amplificación anterior se lleva cabo mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando ciclos de temperatura para conseguir la desnaturalización de los dúplex, la hibridación del oligonucleótido cebador, y la extensión del cebador mediante la nucleótido polimerasa termófila dependiente del molde. En la realización de la amplificación de ácidos nucleicos por PCR, el medio se somete a ciclos entre 2 y 3 temperaturas. Las temperaturas en el presente procedimiento para la amplificación por PCR generalmente abarcan entre 50ºC y 100ºC aproximadamente, más habitualmente, entre 60ºC y 95ºC aproximadamente. Se emplean temperaturas relativamente bajas de entre 50ºC y 80ºC aproximadamente para las etapas de hibridación, mientras que la desnaturalización se lleva a cabo a una temperatura de entre 80ºC y 100ºC aproximadamente y la extensión se lleva a cabo a una temperatura de entre 70ºC y 80ºC aproximadamente, normalmente de 72ºC a 74ºC aproximadamente. La amplificación se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para conseguir un número deseado de copias para una determinación precisa de si dos ácidos nucleicos relacionados presentan una diferencia o no. Generalmente, el período de tiempo para la realización del procedimiento es entre 10 segundos y 10 minutos por ciclo aproximadamente y se puede usar cualquier número de ciclos desde 1 hasta 60 o más, normalmente de 10 a 50, frecuentemente, de 20 a 45. Por cuestiones de comodidad normalmente es deseable minimizar el período de tiempo y el número de ciclos. En general, el período de tiempo para un grado de amplificación dado se puede minimizar, por ejemplo, seleccionando concentraciones de nucleósido trifosfatos suficientes para saturar a la polinucleótido polimerasa, incrementando las concentraciones de polinucleótido polimerasa y el cebador de polinucleótidos, y usando un contenedor de reacción que proporcione un equilibrio térmico rápido. Generalmente, el período de tiempo para la realización de la amplificación en el procedimiento de la invención está entre 5 y 200 minutos aproximadamente.

En un ejemplo de un ciclo de temperaturas típico como el que se puede emplear, el medio se somete a múltiples ciclos de temperatura de calentamiento de 90ºC a 100ºC durante 2 segundos a 3 minutos y enfriamiento de 65ºC a 80ºC durante un periodo de 10 segundos a 3 minutos.

Las condiciones para llevar a cabo la extensión de la cadena según la presente invención son similares a aquellas para la amplificación descrita anteriormente. En general, el medio se calienta a una temperatura de 90ºC a 100ºC durante un periodo de 2 a 500 segundos y a continuación se enfría de 20ºC a 80ºC durante un periodo de 5 a 2000 segundos seguido del calentamiento de 40ºC a 80ºC durante un periodo de 5 a 2000 segundos. Preferentemente, el medio se somete a calentamiento de 90ºC a 100ºC durante un periodo de 10 segundos a 3 minutos, enfriamiento de 50ºC a 65ºC durante un periodo de 10 segundos a 2 minutos y calentamiento de 70ºC a 80ºC durante un periodo de 30 segundos a 5 minutos.

En la realización del presente procedimiento, se emplea un medio acuoso. También se pueden emplear otros codisolventes polares, normalmente disolventes orgánicos oxigenados de entre 1-6, más habitualmente entre 1-4, átomos de carbono, incluyendo alcoholes, éteres y similares. Normalmente estos codisolventes, si se usan, están presentes en menos del 70% en peso aproximadamente, más habitualmente en menos del 30% en peso aproximadamente.

El pH para el medio normalmente está en el intervalo de 4,5 a 9,5 aproximadamente, más habitualmente en el intervalo de 5,5-8,5 aproximadamente, y preferentemente en el intervalo de 6-8 aproximadamente, normalmente de 8 aproximadamente (a temperatura ambiente). En general para la amplificación, se escogen y se varían el pH y la temperatura, según las circunstancias, para provocar, simultánea o secuencialmente, la disociación de cualquier secuencia hibridada internamente, la hibridación del oligonucleótido cebador con la secuencia de ácido nucleico diana, la extensión del cebador, y la disociación del cebador extendido. Se pueden usar diversos tampones para conseguir el pH deseado y mantener el pH durante la determinación. Los tampones ilustrativos incluyen borato, fosfato, carbonato, Tris, barbital y similares. El tampón particular empleado no es crítico para esta invención pero en procedimientos individuales se puede preferir un tampón sobre otro. El tampón empleado en los presentes procedimientos normalmente contiene ión magnesio (Mg_{2}^{+}), que normalmente se usa con muchas polimerasas conocidas, aunque también se han usado otros iones metálicos tales como manganeso. Preferentemente, el ión magnesio se usa a una concentración de entre 1 y 20 mM, preferentemente, entre 1,5 y 10 mM aproximadamente, más preferentemente, 2-4 mM. El magnesio se puede proporcionar como una sal, por ejemplo, cloruro de magnesio y similares. La consideración principal es que el ión metálico permite la distinción entre diferentes ácidos nucleicos según la presente invención.

La concentración de la nucleótido polimerasa normalmente se determina de manera empírica. Preferentemente, se usa una concentración suficiente tal que un incremento adicional en la concentración no disminuye el tiempo para la amplificación por encima de 5 veces, preferentemente 2 veces. El factor limitante principal generalmente es el coste del reactivo.

La cantidad de las secuencias de ácidos nucleicos diana que se debe examinar según la presente invención puede ser tan baja como una o dos moléculas en una muestra. La especificidad de unión del cebador de los cebadores usados para la detección de una diferencia entre dos ácidos nucleicos relacionados y otros factores se considerarán en relación a la necesidad de llevar a cabo una amplificación inicial del ácido nucleico diana. Está dentro del ámbito de la presente invención para la detección de una mutación llevar a cabo una reacción de amplificación preliminar para incrementar, en un factor de 10^{2} o más, el número de moléculas de la secuencia de ácido nucleico diana. La amplificación se puede realizar mediante cualquier procedimiento conveniente tal como PCR, amplificación mediante un único cebador, NASBA, etc., pero preferentemente será mediante PCR como se describe a continuación.

La cantidad de la secuencia de ácido nucleico diana a someter a la amplificación posterior usando cebadores según la presente invención puede variar entre 1 y 10^{10} aproximadamente, más habitualmente entre 10^{3} y 10^{8} moléculas aproximadamente, preferentemente al menos 10^{-21} M en el medio y puede ser de 10^{-10} a 10^{-19} M, más habitualmente de 10^{-14} a 10^{-19} M.

Si se lleva a cabo una amplificación inicial de la secuencia de ácido nucleico diana para incrementar el número de moléculas, puede ser deseable, pero no necesario, eliminar, destruir o inactivar los cebadores usados en la amplificación inicial dependiendo de la naturaleza del protocolo utilizado. Por consiguiente, cuando el presente procedimiento se lleva a cabo usando una adición de reactivos paso a paso para cada reacción separada, tal como, por ejemplo, en la forma de realización de la Fig. 3, el cebador P1 se debe eliminar antes de la extensión del cebador P3. Por otra parte, por ejemplo, en la forma de realización descrita a continuación en la que las reacciones se llevan a cabo simultáneamente, no es necesario eliminar ninguno de los cebadores. Un ejemplo, a modo de ilustración y no de limitación, de una aproximación para destruir los cebadores es emplear una enzima que pueda digerir solamente el ADN de cadena sencilla. Por ejemplo, se puede emplear una enzima que tenga a la vez actividades exonucleasa 5' a 3' y 3' a 5', tal como, por ejemplo, exo VII. El medio se incuba a una temperatura y durante un periodo de tiempo suficientes para digerir los cebadores. Normalmente, la incubación de 20ºC a 40ºC durante un periodo de 10 a 60 minutos es suficiente para una enzima que tenga la actividad anterior. A continuación el medio se trata para inactivar la enzima, que se puede conseguir, por ejemplo, calentando durante un periodo de tiempo suficiente para llevar a cabo la inactivación. La inactivación de la enzima se puede realizar normalmente después del calentamiento del medio de 90ºC a 100ºC durante 0,5 a 30 minutos. Aquellos expertos en la materia sugerirán otros procedimientos de eliminación de los cebadores. No obstante, se ha encontrado que la eliminación de tales cebadores no es necesaria en la realización de los procedimientos de la invención.

La cantidad del oligonucleótido cebador(es) usada en la reacción de amplificación en la presente invención será al menos tan grande como el número de copias deseadas y normalmente será de 10^{-9} a 10^{-3} M, preferentemente, de 10^{-7} a 10^{-4} M. Preferentemente, la concentración del oligonucleótido cebador(es) está sustancialmente en exceso, preferentemente al menos 100 veces por encima, más preferentemente, al menos 1000 veces por encima, sobre la concentración de la secuencia de ácido nucleico diana. La concentración de los nucleósido trifosfatos en el medio puede variar ampliamente; preferentemente, estos reactivos están presentes en una cantidad en exceso tanto para la amplificación como para la extensión de la cadena. Los nucleósido trifosfatos normalmente están presentes de 10^{-6} a 10^{-2} M, preferentemente de 10^{-5} a 10^{-3} M.

Formación del complejo y detección de la inhibición de la migración de la ramificación

Como se muestra en la Fig. 3, después de la extensión de la cadena, las cadenas de los dúplex parciales A' y B' se dejan unirse y se someten a la migración de la ramificación combinando las mezclas que contienen los dúplex parciales A' y B' e incubando la combinación a una temperatura de 30ºC a 75ºC, preferentemente de 60ºC a 70ºC, durante al menos un minuto, preferentemente, de 20 a 120 minutos, en los que se forma del complejo C como se ha descrito anteriormente para las Fig 1 y 2. La cola de oligonucleótidos A1 de A' se hibrida con la cola de oligonucleótidos B2 correspondiente de B' y, de manera similar, la cola de oligonucleótidos A2 de A' se hibrida con la cola de oligonucleótidos B1 de B'. La migración de la ramificación dentro del complejo C prosigue bajo las anteriores condiciones de temperatura con la separación del complejo en los dúplex D y E a menos que esté presente una mutación M, con lo que se inhibe la migración de la ramificación y la disociación de la cadena. A continuación se detecta el complejo C, cuya presencia está directamente relacionada con la presencia de la mutación M.

En la forma de realización representada en la Fig. 3, los marcadores L1 y L2 se incorporan a los dúplex parciales que comprenden el complejo C y proporcionan un medio para la detección del complejo C. Esto es a modo de ilustración y no de limitación y se pueden emplear otros procedimientos convenientes para la detección del complejo C, tales como el uso de un receptor para el complejo. En esta aproximación sólo se requiere un marcador, L1 o L2, que comprende un miembro sbp o una molécula indicadora. Un receptor para el miembro sbp y un receptor que se puede unir al complejo C debido a una característica distinta de L1 o L2 se pueden unir ambos al complejo C y proporcionar un medio de detección.

Amplificación homogénea, extensión de la cadena, formación del complejo y detección

En la forma de realización de la Fig. 3, las reacciones se llevan a cabo independientemente para producir los dúplex parciales con cola A' y B', respectivamente. A continuación, las mezclas de reacción se pueden combinar para permitir que las respectivas cadenas de A' y B' se unan entre sí para formar el complejo C.

No obstante, sorprendentemente, se descubrió que las reacciones de la presente invención se pueden llevar a cabo en el mismo medio de reacción, y muchas o todas las reacciones se pueden llevar a cabo simultáneamente. Ésta es una característica particularmente atractiva de la presente invención. En esta aproximación se proporciona una combinación en un único medio. La combinación comprende (i) una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico diana sospechosa de tener una mutación, (ii) una secuencia de ácido nucleico de referencia, que se puede añadir por separado si no se sabe si está presente en la muestra y que corresponde al ácido nucleico diana que carece de la mutación, que como se ha explicado anteriormente puede ser el ácido nucleico natural, (iii) una nucleótido polimerasa, (iv) nucleósido trifosfatos, y (v) los cebadores P1, P2 y P3, en los que P2 puede incluir el cebador P2 marcado con L1 y el cebador P2 marcado con L2, o P2 puede estar sin marcar y los cebadores P1 y P3 pueden estar marcados respectivamente con L1 y L2. A continuación el medio se somete a múltiples ciclos de temperaturas de calentamiento y enfriamiento para llevar a cabo simultáneamente todas las reacciones de amplificación y extensión de la cadena descritas anteriormente para la Fig. 3 excepto que en esta forma de realización no se necesita evitar la realización de copias de cualquiera de los cebadores extendidos. Preferentemente, en esta forma de realización, cada ciclo incluye el calentamiento del medio de 90ºC a 100ºC durante 2 segundos a 3 minutos, el enfriamiento del medio de 60ºC a 70ºC durante un periodo de 8 segundos a 3 minutos, y el calentamiento del medio de 70ºC a 75ºC durante un periodo de 10 segundos a 3 minutos aunque pueden ser necesarias diferentes temperaturas dependiendo de las longitudes de las secuencias del cebador. Después de los ciclos de temperaturas anteriores el medio se somete a calentamiento durante un periodo de tiempo suficiente para desnaturalizar las moléculas de doble cadena, preferentemente, de 90ºC a 99ºC durante 10 segundos a 2 minutos, y se enfría de 40ºC a 80ºC, preferentemente de 60ºC a 70ºC, y se mantiene a esta temperatura durante al menos un minuto, preferentemente durante 20 minutos a 2
horas.

Después del enfriamiento del medio se forman todos los posibles dúplex parciales y completos que se pueden formar a partir de 1) cadenas sencillas que tienen cualquier combinación de secuencias de referencia o mutantes y los extremos 5' de A2 y B2, y 2) cadenas sencillas que tienen cualquier combinación de secuencias de referencia o mutantes y los extremos 5' de A1 o B1 en los que las cadenas además pueden estar marcadas con cualquiera de L1 o L2 cuando L1 y L2 son diferentes. Entre los dúplex parciales que se forman están los dúplex parciales con cola A' y B', que se pueden unir entre sí para formar el complejo C, que no se disocia en los dúplex D y E cuando está presente una mutación. A continuación se realiza una determinación de la presencia de tal complejo para establecer la presencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico diana. Cuando los cebadores P1 y P3 están marcados en lugar del cebador P2, los marcadores L1 y L2 en los dúplex parciales A' y B' están unidos a las colas A1 y B1, respectivamente, que aún proporciona la detección del complejo C cuando está presente una mutación.

Aunque todas las etapas de esta determinación preferentemente se llevan a cabo en el mismo medio que aquel usado para las reacciones anteriores, algunas o todas las etapas se pueden llevar a cabo total o parcialmente de manera secuencial en medios diferentes. Así, por ejemplo, la amplificación por PCR de la secuencia diana A y la secuencia de referencia B, cada una usando los cebadores P1, P2 y P3, se puede llevar a cabo en disoluciones separadas. A continuación las disoluciones se pueden combinar, se pueden calentar de 90ºC a 100ºC para desnaturalizar las cadenas y a continuación se pueden incubar como anteriormente de 40ºC a 80ºC para permitir la formación de dúplex y el complejo C cuando está presente una mutación. A continuación la detección del complejo C se lleva a cabo directamente en las disoluciones combinadas o añadiendo los reactivos necesarios para la detección o separando el complejo C, por ejemplo, sobre una superficie sólida, y detectando su presencia sobre la superficie.

Amplificación inicial de las secuencias diana o de referencia

Cuando se usa un único medio de reacción para detectar una diferencia entre un ácido nucleico diana y de referencia, puede ser necesario llevar a cabo una amplificación inicial para incrementar la concentración de las moléculas de los ácidos nucleicos diana y las moléculas de los ácidos nucleicos de referencia en relación a aquella de otros ácidos nucleicos que pueden estar presentes en la muestra. Ahora en referencia a la Fig. 4, tal amplificación inicial se puede llevar a cabo usando dos cebadores adicionales PX1 y PX2 que se unen a sitios sobre los ácidos nucleicos diana y de referencia, que están aguas arriba del sitio de unión de P2 y del sitio de unión de P1 y P3, respectivamente. Esta amplificación inicial se puede llevar a cabo en el mismo medio que las reacciones anteriores. Así, la secuencia diana TS, los cebadores PX1, PX2, P1, P2 y P3 se pueden combinar todos con las secuencias diana y de referencia antes de los ciclos de temperatura como se muestra en la Fig. 4. Se emplean dos cebadores PX1 y PX2 y se unen a sitios sobre TS que están aguas arriba de los sitios a los cuales se unen los cebadores P1 y P2, respectivamente. Estos sitios están indicados por Pa' y P2', respectivamente, en la Fig. 4. Los sitios a los cuales se unen los cebadores PX1 y PX2 generalmente están de 0 a 500 nucleótidos aproximadamente, preferentemente, de 0 a 200 nucleótidos aproximadamente alejados de Pa' y P2' y se pueden superponer parcial o completamente con Pa' y P2'. PX1 y PX2 se extienden a lo largo de sus respectivas cadenas. La amplificación produce múltiples copias de la secuencia de ácido nucleico diana A. Después de la desnaturalización apropiada, los cebadores P1 y P2 se dejan hibridarse y extenderse a lo largo de las respectivas cadenas de A para producir múltiples copias de AA. Lo anterior también ocurre para el ADN de referencia para producir múltiples copias del ácido nucleico de referencia B, que se amplifica adicionalmente con los cebadores P2 y P3 para producir múltiples copias de BB.

Preferentemente, cuando se lleva a cabo una amplificación inicial usando los cebadores PX1 y PX2, estos cebadores estarán diseñados para hibridarse a los ácidos nucleicos diana y de referencia a una mayor temperatura que para los cebadores P1, P2 y P3, respectivamente. Normalmente esto se consigue seleccionando secuencias de PX1 y PX2 que son más largas o más ricas en GC que P2 y la secuencia de unión Pa en P1 y P3. A continuación se lleva a cabo una amplificación inicial a temperaturas que sobrepasan la temperatura requerida para la unión de P1, P2 y P3 y las siguientes amplificaciones para formar AA y BB se llevan a cabo a temperaturas inferiores que permiten que P1, P2 y P3 se unan. A continuación es posible detectar la diferencia entre las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia combinando las secuencias, los cebadores PX1, PX2, P1, P2 y P3 en los que P2 o P1 y P3 están marcados, la polinucleótido polimerasa, nucleótido trifosfatos, y opcionalmente los reactivos necesarios para detectar el complejo C, todo en un medio. La amplificación inicial se lleva a cabo a temperaturas que permiten que PX1 y PX2, pero no P1, P2 y P3, se unan a la secuencia diana con lo que se forman las secuencias A y B. A continuación los ciclos de temperatura se llevan a cabo a una temperatura inferior a la que P1, P2 y P3 se pueden unir y extenderse. A continuación la mezcla se calienta de 90ºC a 100ºC para desnaturalizar los dúplex y se enfría para permitir la formación de dúplex parciales AA y BB y su hibridación para formar el complejo C. A continuación el complejo se puede detectar directamente si están presentes todos los reactivos necesarios o la detección se puede llevar a cabo en una etapa separada. La naturaleza de los cebadores PX1 y PX2, así como la temperatura apropiada para la unión de estos cebadores a la secuencia diana, generalmente se determina empíricamente en referencia a la composición de nucleótidos de los cebadores P1, P2 y P3.

El orden de combinación de los diversos reactivos puede variar. El ácido nucleico diana se puede combinar con una combinación de cebadores PX1, P2 sin marcar, P2 marcado, y P1 y P3, nucleósido trifosfatos y nucleótido polimerasa preparada previamente. Alternativamente, el ácido nucleico diana, se puede combinar, por ejemplo, solamente con los cebadores PX1 y P2 sin marcar junto con los nucleósido trifosfatos y la polimerasa. Después de que se lleven a cabo los ciclos de temperatura, la mezcla de reacción se puede combinar con los cebadores restantes P1 y P2 marcado.

Introducción de los sitios de unión del cebador P1, P2 y P3 en las secuencias diana y de referencia

En otra aproximación según la presente invención, los sitios de unión del cebador se pueden introducir en las secuencias diana y de referencia para los cebadores P1, P2 y P3, normalmente flanqueado la secuencia diana o de referencia. Se emplea una etapa de PCR utilizando cebadores adaptadores constituidos de dos regiones: una región 3'-proximal que se puede hibridar con un sitio de unión del cebador particular en la secuencia de ácido nucleico diana o de referencia y una región 5'-proximal que no se puede hibridar a la secuencia de ácido nucleico diana o de referencia y que tiene sustancialmente la misma secuencia que la región 3'-proximal de un cebador usado en las amplificaciones descritas anteriormente empleadas en la detección de diferencias entre dos ácidos nucleicos relacionados. Por "sustancialmente la misma secuencia" se quiere decir que un producto de extensión producido en una amplificación usando los cebadores adaptadores contiene un sitio de unión del cebador al cual se puede hibridar tal cebador usado en las amplificaciones descritas anteriormente empleadas en la detección de diferencias entre dos ácidos nucleicos relacionados. Tales cebadores adaptadores se usan para preparar secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia que tienen sitios de unión del cebador universales y específicos en ellas, que a su vez se usan como moldes para un grupo de cebadores universales en las amplificaciones descritas anteriormente según el presente procedimiento para la detección de diferencias entre dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas.

Ahora en referencia a la Fig. 5, se lleva a cabo una amplificación, antes de las amplificaciones para formar AA y BB, usando los cebadores PX1i y PX2i adicionales que se unen a sitios sobre los ácidos nucleicos diana y de referencia. Esta amplificación se puede llevar a cabo en contenedores de reacción iguales o diferentes o en un medio de reacción diferente de aquel en el que se llevan a cabo las amplificaciones para formar AA y BB. Por ejemplo, los cebadores PX1i y PX2i se combinan con las secuencias diana y de referencia, en el mismo medio de reacción o diferente, y se someten a ciclos de temperatura. La Fig. 5 muestra una amplificación inicial para un analito de ADN mutante TS y un ácido nucleico de referencia correspondiente RS. Se emplean dos cebadores PX1i y PX2i y se unen a los respectivos sitios de unión del cebador en TS y RS. PX1i tiene una fracción 3'-terminal que se puede hibridar con la secuencia diana y de referencia y una fracción Pa 5'-terminal que no se puede hibridar con la secuencia diana o de referencia. PX2i tiene una fracción 3'-terminal que se puede hibridar con la secuencia diana y de referencia y una fracción P2 5'-terminal que no se puede hibridar con la secuencia diana o de referencia. PX1i y PX2i se extienden a lo largo de sus respectivas cadenas. La amplificación produce múltiples copias de cebadores extendidos que comprenden la fracción pertinente de la secuencia de ácido nucleico diana y la secuencia de ácido nucleico de referencia flanqueadas por los sitios de unión del cebador Pa y P2, denominados A y B, respectivamente.

Los productos de reacción de esta amplificación inicial se combinan con los cebadores P1, P2 y P3 como se muestra en la Fig. 3. Los cebadores P1 y P2 se hibridan y se extienden a lo largo de las respectivas cadenas de A para producir múltiples copias de AA. Lo anterior también ocurre para el ADN de referencia para producir múltiples copias del ácido nucleico de referencia B, que se amplifica adicionalmente con los cebadores P2 y P3 para producir múltiples copias de BB. El resto de las reacciones que se producen son como se ha descrito anteriormente para dar A' y B', que a continuación pueden formar el complejo C.

La forma de realización de la Fig. 5 permite el uso de cebadores universales P1, P2 y P3. Esto significa que para llevar a cabo las reacciones se puede usar un grupo de cebadores para producir el complejo C para el análisis de un gran número de secuencias de ácidos nucleicos diana y las secuencias de ácidos nucleicos de referencia correspondientes. Tal aproximación supone el uso de los cebadores PX1i y PX2i, que están diseñados para introducir sitios de unión del cebador para los cebadores universales P1, P2 y P3 en las secuencias diana y de referencia. La relación de PX1i y PX2i es tal que cada uno contiene una fracción 5'-terminal que corresponde a la fracción de la secuencia de unión del cebador, es decir, la fracción de la secuencia diana a la cual se hibrida el cebador, en el extremo 3' de los cebadores P1, P2 y P3 según las circunstancias. En la forma de realización mostrada en la Fig. 5, PX1i contiene la fracción P2 5'-terminal, que resulta en la introducción del sitio de unión del cebador P2' en TS al cual se puede hibridar P2. El cebador PX2i contiene la fracción Pa 5'-terminal, que resulta en la introducción del sitio de unión del cebador Pa' en TS al cual se puede hibridar Pa de los cebadores P1 y P3.

Está dentro del ámbito de la presente invención utilizar, junto con la forma de realización de la Fig. 5, una amplificación inicial como se ha descrito anteriormente y se ejemplifica en la Fig. 4 para incrementar la concentración de las moléculas del ácido nucleico diana y las moléculas del ácido nucleico de referencia en relación a aquella de otros ácidos nucleicos que puedan estar presentes en la muestra.

El uso de cebadores universales permite llevar a cabo los procedimientos según la presente invención de forma más barata en algunas aplicaciones que un procedimiento que use un grupo diferente de tales cebadores para cada secuencia de ácido nucleico diana a analizar. La aproximación tiene una aplicación particular en la búsqueda de grandes tramos continuos (decenas o cientos de kilobases) de ADN genómico para una única alteración significativa de la secuencia que pueda estar presente o no. Tales áreas incluyen la comparación de fragmentos de ADN en los alrededores de un gen sospechoso tanto en individuos sanos como afectados, el desarrollo de marcadores polimórficos para la construcción de mapas genéticos de alta resolución, aplicaciones en investigación para la correlación de fenotipos particulares en diversos organismos modelo con alteraciones específicas en el ADN, estudios de diversidad dentro de una especie, etc.

Como se ha mencionado anteriormente, no se necesita conocer la identidad de la secuencia de ácido nucleico diana, excepto hasta el grado que permita la preparación de los cebadores necesarios para llevar a cabo las reacciones anteriores. La presente invención permite la determinación de la presencia o ausencia de una mutación en un ácido nucleico en una muestra sin la necesidad de identificar completamente la secuencia del ácido nucleico. Por consiguiente, uno es capaz de determinar la presencia de una mutación en un ácido nucleico entre dos secuencias de nucleótidos para las cuales se pueden preparar cebadores.

Detección del complejo tetramolecular detectando la asociación de los marcadores

En la presente invención un medio de detectar el complejo tetramolecular supone el uso de dos marcadores sobre cadenas no complementarias. Los marcadores se asocian debido a que ambos están presentes en el complejo tetramolecular si está presente una diferencia entre las secuencias relacionadas. La detección de los dos marcadores en el complejo proporciona la detección del complejo. Generalmente, se detecta la asociación de los marcadores dentro del complejo. Esta asociación se puede detectar de muchas formas. Por ejemplo, uno de los marcadores puede ser un miembro sbp y se proporciona un miembro sbp complementario unido a un soporte. Tras la unión de los miembros sbp complementarios entre sí, el complejo se une al soporte y se separa del medio de reacción. El otro marcador empleado es una molécula indicadora que entonces se detecta sobre el soporte. La presencia de la molécula indicadora sobre el soporte indica la presencia del complejo sobre el soporte, que a su vez indica la presencia de la mutación en la secuencia de ácido nucleico diana. Un ejemplo de un sistema como el que se ha descrito anteriormente es el ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), una descripción del mismo se encuentra en "Enzyme-Immunoassay", Edward T. Maggio, editor, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL. (1980) en el que, por ejemplo, el miembro sbp es biotina, el miembro sbp complementario es estreptavidina y la molécula indicadora es una enzima tal como fosfatasa
alcalina.

La detección de la señal dependerá de la naturaleza del sistema de producción de señales utilizado. Si la molécula indicadora es una enzima, miembros adicionales del sistema de producción de señales incluirán sustratos enzimáticos, etc. El producto de la reacción enzimática es preferentemente un producto luminiscente, o un colorante fluorescente o no fluorescente, cualquiera de ellos que se puede detectar espectrofotométricamente, o un producto que se puede detectar por otros medios espectrométricos o electrométricos. Si la molécula indicadora es una molécula fluorescente, el medio se puede irradiar y se puede determinar la fluorescencia. Cuando el marcador es un grupo radioactivo, el medio se puede someter a recuento para determinar las cuentas radioactivas.

La asociación de los marcadores dentro del complejo también se puede determinar usando marcadores que solamente proporcionan una señal si los marcadores se vuelven parte del complejo. Esta aproximación es particularmente atractiva cuando se desea llevar a cabo la presente invención de una manera homogénea. Tales sistemas incluyen inmunoensayo de canalización de enzimas, inmunoensayo de transferencia de energía por fluorescencia, ensayo de electroquimioluminiscencia, ensayo de luminiscencia inducida, aglutinación en látex y similares.

En un aspecto de la presente invención la detección del complejo se lleva a cabo empleando al menos una partícula que se puede suspender como soporte, que puede estar unida directamente a una cadena de ácidos nucleicos o puede estar unido a un miembro sbp que es complementario a un miembro sbp unido a una cadena de ácidos nucleicos. Tal partícula sirve como medio para segregar la secuencia de polinucleótidos diana unidos en la disolución en bruto, por ejemplo, por sedimentación, separación electroforética o separación magnética. Un segundo marcador, que se vuelve parte del complejo si está presente una mutación, es una parte del sistema de producción de señales que se separa o se concentra en una pequeña región de la disolución para facilitar la detección. Los marcadores típicos que se pueden usar en esta forma de realización particular son marcadores fluorescentes, partículas que contienen un sensibilizador o una olefina quimioluminiscente (véase patente de EE.UU. Nº 5.709.994), marcadores quimioluminiscentes y electroluminiscentes.

Preferentemente, la propia partícula puede servir como parte de un sistema de producción de señales que puede funcionar sin separación o segregación. El segundo marcador también es parte del sistema de producción de señales y puede producir una señal junto con la partícula para proporcionar un procedimiento de detección en un ensayo homogéneo. Se pueden usar una variedad de combinaciones de marcadores para este propósito. Cuando se añaden todos los reactivos al comienzo de la reacción, los marcadores están limitados a aquellos que son estables a las temperaturas elevadas usadas para la amplificación, la extensión de la cadena, y la migración de la ramificación. En ese aspecto es deseable emplear como marcadores polinucleótidos o análogos de polinucleótidos con 5 a 24 o más nucleótidos dependiendo de los nucleótidos usados y la naturaleza del análogo. Los análogos de polinucleótidos incluyen estructuras tales como polirribonucleótidos, polinucleósido fosfonatos, ácidos péptido-nucleicos, polinucleósido fosforotioatos, homo ADN y similares. En general, los análogos de ácidos nucleicos inalterados proporcionan una unión más fuerte y se pueden usar secuencias más cortas. En el medio de reacción están incluidos oligonucleótidos o análogos de polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que son complementarias. Uno de estos oligonucleótidos o análogos de oligonucleótidos está unido a, por ejemplo, una molécula indicadora o una partícula. El otro esta unido a un cebador, cualquiera del cebador P2 o el cebador P1 y/o P3 como marcador. Ni el oligonucleótido ni el análogo del polinucleótido debería servir como molde para una polinucleótido polimerasa. Esto se consigue usando un análogo del polinucleótido o un polinucleótido que esté conectado al cebador por un grupo abásico. El grupo abásico comprende una cadena de 1 a 20 o más átomos, preferentemente al menos 6 átomos, más preferentemente, de 6 a 12 átomos de tales como, por ejemplo, carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, azufre, y fósforo, que puede estar presente en forma de diversos grupos tales como polimetilenos, polimetilenéteres, polimetilenos hidroxilados, etc. El grupo abásico se puede introducir de manera conveniente en el cebador durante la síntesis en fase sólida mediante procedimientos clásicos.

A la temperatura de hibridación apropiada un oligonucleótido o análogo del polinucleótido unido a una molécula indicadora o partícula se puede unir a su análogo del polinucleótido u oligonucleótido complementario separado por un sitio abásico que se ha incorporado a los dúplex parciales A' y B' como marcadores durante la amplificación. Si los dúplex parciales se vuelven parte de un complejo tetramolecular, la molécula indicadora o partícula se vuelve parte del complejo. Usando diferentes secuencias de análogos de polinucleótidos o de oligonucleótidos para los marcadores, L1 y L2, dos moléculas indicadoras o partículas diferentes pueden convertirse en parte del complejo. Se pueden usar diversas combinaciones de partículas y moléculas indicadoras.

Las partículas, por ejemplo, pueden ser partículas de látex simples o pueden ser partículas que comprenden un sensibilizador, un quimioluminiscente, un fluorescente, un colorante, y similares. Los pares partícula/molécula indicadora típicos incluyen una cristalita colorante y un marcador fluorescente en el que la unión provoca la inactivación de la fluorescencia, o una molécula indicadora tritiada y una partícula que contiene un marcador de centelleo. Los pares de moléculas indicadoras típicas incluyen un donador de energía fluorescente y un colorante aceptor de la fluorescencia. Los pares de partículas típicos incluyen (1) dos partículas de látex, cuya asociación se detecta por dispersión de luz o turbidimetría, (2) una partícula capaz de absorber luz y una segunda partícula marcadora que emite fluorescencia después de aceptar energía de la primera, y (3) una partícula que incorpora un sensibilizador y una segunda partícula que incorpora un quimioluminiscente como se ha descrito para el inmunoensayo de luminiscencia inducida mencionado en la patente de EE.UU. Nº 5.340.716.

Resumiendo, la detección del complejo tetramolecular que usa el ensayo de luminiscencia inducida como se aplica en la presente invención supone el empleo de un fotosensibilizador como parte de un marcador y un compuesto quimioluminiscente como parte del otro marcador. Si el complejo está presente el fotosensibilizador y el compuesto quimioluminiscente se aproximan mucho. El fotosensibilizador genera oxígeno singlete y activa el compuesto quimioluminiscente cuando los dos marcadores están muy próximos. El compuesto quimioluminiscente activado posteriormente produce luz. La cantidad de luz producida está relacionada con la cantidad del complejo formado.

A modo de ilustración según se aplica a la presente invención, se emplea una partícula, que comprende un compuesto quimioluminiscente asociado a ella tal como por su incorporación en ella o su unión a ella. Las partículas tienen una secuencia de reconocimiento, normalmente un oligonucleótido o un análogo de polinucleótido, unida a ellas con una secuencia complementaria incorporada a una de las cadenas de ácidos nucleicos como marcador, L1. Se emplea otra partícula que tiene el fotosensibilizador asociado a ella. Estas partículas tienen una secuencia de reconocimiento unida a ellas, que es diferente de aquella unida a las partículas quimioluminiscentes. Se incorpora una secuencia complementaria como marcador L2 en la cadena de ácidos nucleicos en el complejo C que no es complementaria a la cadena de ácidos nucleicos que lleva el marcador L1. Una vez tratado el medio según la presente invención para formar un complejo C tetramolecular, el medio se irradia con luz para excitar el fotosensibilizador, que es capaz en su estado excitado de activar el oxígeno a un estado singlete. Debido a que el compuesto quimioluminiscente de uno de los grupos de partículas ahora está muy próximo al fotosensibilizador debido a la presencia del polinucleótido diana con una mutación, el compuesto quimioluminiscente se activa mediante el oxígeno singlete y emite luminiscencia. A continuación el medio se examina para la presencia y/o la cantidad de luminiscencia o luz emitida, cuya presencia se relaciona con la presencia del complejo C tetramolecular. La presencia de este último indica la presencia y/o cantidad del polinucleótido diana con una mutación o del propio polinucleótido diana. Alternativamente, a modo de ilustración según se lleva a la práctica en la presente invención, los marcadores L1 y L2 cada uno puede comprender un ligando y las partículas que generan señales cada una puede comprender un receptor correspondiente cada uno capaz de unir L1 y L2, respectivamente.

Detección de una secuencia diana usando PCR

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención también proporciona la detección de una secuencia diana usando PCR. Un ejemplo de esta forma de realización está representado en las Fig. 6A y 6B. Este procedimiento por PCR supone la formación de una estructura o complejo de cuatro cadenas como anteriormente para la detección de una mutación. No obstante, en la aproximación de las Fig. 6A y 6B, la secuencia de ácido nucleico diana A es la secuencia a detectar por PCR y la secuencia de ácido nucleico de referencia B se introduce como reactivo y contiene una diferencia Q con respecto a la secuencia de ácido nucleico diana. Esta diferencia es como se ha descrito anteriormente para dos secuencias de ácidos nucleicos relacionadas. Así, en esta forma de realización se conoce la identidad de la secuencia de ácido nucleico diana hasta el grado necesario para permitir la preparación de los cebadores y la secuencia de ácido nucleico de referencia. La formación de tal complejo supone la producción de dos dúplex parciales por amplificación usando tres cebadores diferentes en la reacción en cadena de la polimerasa y permitiendo que los productos amplificados se hibriden. En esta forma de realización particular la formación del complejo depende de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana. Si la secuencia de ácido nucleico diana no está presente, no se detecta el complejo. No obstante, cuando el ácido nucleico diana está presente, hay una diferencia entre las dos fracciones hibridadas del complejo. El complejo no se disocia y se puede detectar como un indicio de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.

Ahora referencia a las Fig. 6A y 6B, el ácido nucleico diana A, si está presente, se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los cebadores P1 y P2 para producir un amplicón AA. El cebador P2 contiene un marcador L1 y el cebador P1 está constituido de una fracción Pa 3'-terminal que se puede hibridar con la secuencia diana y la fracción B1 5'-terminal que no se puede hibridar con la secuencia diana. La amplificación se lleva a cabo en las condiciones de reacción empleadas en la PCR en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos usando ciclos de temperatura. El amplicón AA tiene dos cadenas, una cadena marcada procedente del cebador P2 y una cadena no marcada procedente del cebador P1. La cadena no marcada tiene una fracción B1 5'-terminal del cebador P1 y la cadena marcada tiene una fracción A2 3'-terminal correspondiente que es el complemento de
B1.

A continuación se lleva a cabo una extensión de la cadena del cebador P3 a lo largo de la cadena marcada del amplicón AA para producir un dúplex parcial A' diana con cola. El cebador P3 está constituido de una fracción Pa 3'-terminal, que es idéntica a Pa del cebador P1 y que se une a la cadena marcada de AA. P3 tiene una fracción A1 5'-terminal que no es complementaria al amplicón AA. La extensión de la cadena se lleva a cabo en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos en las condiciones de temperatura apropiadas de manera que sólo se produce la cadena complementaria de la cadena marcada, y no una copia. Esta cadena complementaria no marcada del dúplex parcial A' diana con cola tiene una fracción A1 5'-terminal, que no es complementaria a la fracción A2 3'-terminal de la cadena marcada de A'. A menos que la reacción de la PCR se lleve a cabo para producir un exceso de la cadena marcada, también estará presente la cadena no marcada de la amplificación. Esta cadena no sirve de molde durante la extensión de la cadena para formar el dúplex parcial A'.

En una forma de realización de las Fig. 6A y 6B, la secuencia de ácido nucleico de referencia B se amplifica en un medio aparte, usando el cebador P2 y el cebador P3, mediante la reacción en cadena de la polimerasa para producir el amplicón BB. La amplificación se lleva a cabo usando ciclos de temperatura en las condiciones descritas anteriormente en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos. B está constituida de una secuencia idéntica a A excepto por la diferencia Q. Generalmente, el cebador P2 usado para esta amplificación contiene un marcador L2 que puede ser igual o diferente a L1. El amplicón BB tiene dos cadenas, una cadena marcada procedente del cebador P2 y una cadena no marcada procedente del cebador P3. La cadena no marcada tiene una fracción A1 terminal del cebador P3 y la cadena marcada tiene la fracción B2 terminal correspondiente, que es el complemento de A1.

Se lleva a cabo una extensión de la cadena del cebador P1 a lo largo de la cadena marcada del amplicón BB, en las condiciones mencionadas anteriormente para la extensión de la cadena del cebador P3 a lo largo de la cadena marcada en el dúplex AA, para producir el dúplex parcial B' de referencia con cola. Como se ha mencionado anteriormente, el cebador P1 está constituido de la fracción Pa, que se une a la cadena marcada de BB y la fracción B1 que no se une al amplicón BB. La extensión de la cadena se lleva a cabo en presencia de una nucleótido polimerasa y nucleósido trifosfatos en las condiciones de temperatura apropiadas de manera que sólo se produce el complemento de la cadena marcada, y no una copia. El cebador P1 extendido tiene una fracción B1 5'-terminal, que no es complementaria a la fracción B2 terminal de la cadena marcada de B'. Como se puede observar, A' y B' están relacionadas porque cada una de sus cadenas marcadas es complementaria a la cadena no marcada de la otra excepto por la diferencia Q.

Las cadenas de los dúplex parciales A' y B' se dejan unir y se someten a la migración de la ramificación combinando las mezclas que contienen los dúplex parciales A' y B' e incubando la combinación en las condiciones descritas anteriormente para la detección de la mutación en la que se forma el complejo C si está presente la secuencia de ácido nucleico diana. La cola de oligonucleótidos A1 de A' se hibrida con la cola de oligonucleótidos B2 correspondiente de B' y, de manera similar, la cola de oligonucleótidos A2 de A' se hibrida con la cola de oligonucleótidos B1 de B'. La migración de la ramificación dentro del complejo C prosigue hasta que se alcanza la diferencia Q, en cuyo punto cesa la migración. En la forma de realización representada en la Fig. 8, se incorporan los marcadores L1 y L2 a los dúplex parciales que comprenden el complejo C.

En la forma de realización de las Fig. 6A y 6B, las reacciones se llevan a cabo independientemente para producir dúplex parciales A' y B' con cola, respectivamente. A continuación, las mezclas de reacción se pueden combinar para permitir que las cadenas respectivas de A' y B' se unan entre sí para formar el complejo C.

Es una característica particularmente atractiva de la presente invención que el procedimiento para el uso de la PCR en la detección de una secuencia de ácido nucleico diana se pueda llevar a cabo en un único contenedor de reacción sin una etapa de separación. En esta forma de realización, se proporciona una combinación en un único medio. La combinación comprende (i) una muestra sospechosa de contener una secuencia de ácido nucleico diana, (ii) una secuencia de ácido nucleico de referencia, relacionada pero diferente de la secuencia de ácido nucleico diana, (iii) una nucleótido polimerasa, (iv) nucleósido trifosfatos, y (v) los cebadores P1, P2 y P3, en los que P2 puede incluir el cebador P2 marcado con L1 y el cebador P2 marcado con L2, o P2 puede estar sin marcar y los cebadores P1 y P3 pueden estar marcados respectivamente con L1 y L2. A continuación el medio se somete a múltiples ciclos de temperatura de calentamiento y enfriamiento para llevar a cabo simultáneamente todas las reacciones de amplificación y extensión de la cadena descritas anteriormente para la Fig. 8A excepto que en esta forma de realización no se necesita evitar la realización de copias de cualquiera de los cebadores extendidos. El medio se somete a condiciones para llevar a cabo la PCR como se ha descrito anteriormente.

Cuando está presente el ácido nucleico diana, se forman todos los posibles dúplex parciales y completos que se pueden formar a partir de 1) cadenas sencillas que tienen cualquier combinación de secuencias de referencia o diana y los extremos 5' de A2 y B2, y 2) cadenas sencillas que tienen cualquier combinación de secuencias de referencia o mutantes y los extremos 5' de A1 o B1 en los que las cadenas además pueden estar marcadas con cualquiera de L1 o L2 cuando L1 y L2 son diferentes. Entre los dúplex parciales que se forman están los dúplex parciales con cola A' y B', que se pueden unir entre sí para formar el complejo C, que no se disocia. A continuación se realiza una determinación de la presencia de tal complejo para establecer la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana. Cuando los cebadores P1 y P3 están marcados en lugar del cebador P2, los marcadores L1 y L2 en los dúplex parciales A' y B' están unidos a las colas A1 y B1, respectivamente, que aún proporciona la detección del complejo C cuando está presente la secuencia de ácido nucleico diana.

Cuando la secuencia de ácido nucleico diana no está presente (es decir, la secuencia diana es idéntica a la de referencia, véase Fig. 6B), se forman dos dúplex debido a la amplificación de la secuencia de ácido nucleico de referencia en la que una puede llevar a cabo una amplificación inicial por PCR con ambos grupos de cebadores, a saber, P2 y P3 por una parte (representados por el dúplex BB en la Fig. 8B) y P2 y P1 por la otra (representados por el dúplex BB en la Fig. 8B). La extensión de la cadena del cebador P1 sobre el amplicón BB produce B', y la extensión de la cadena con el cebador P3 sobre el amplicón bb produce b'. Cualquier estructura de cuatro cadenas formada por la hibridación de las respectivas colas de B' y b' entre sí se disocia completamente debido a que no hay diferencia en ninguno de los dúplex para inhibir el intercambio completo de la cadena. En otras palabras, el complejo se disocia en estructuras en dúplex normales D' y E' mediante intercambio de cadenas por medio de la migración de la ramificación cuando las fracciones hibridadas de cada dúplex parcial son idénticas. En esta forma de realización en ausencia de secuencia de ácido nucleico diana, las fracciones hibridadas son idénticas en que cada cadena contiene la diferencia Q.

Reducción del ruido de fondo mediante el uso de cebadores alternativos (P4 y P5)

Otra forma de realización de la presente invención incluye una forma de reducir el ruido debido a uniones en falso de los cebadores en la PCR. En los procedimientos de detección homogéneos de la presente invención, las señales no específicas generadas por diversos productos debido a uniones en falso de los cebadores pueden añadir un ruido sustancial. Los procedimientos para minimizar las uniones en falso de los cebadores en la PCR se han descrito previamente, incluyendo, entre otros, un procedimiento de inicio en caliente mediado por una cera normal como se describe en Chou, Q., y col., Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications, Nucleic Acids Res. 20:1717-1723 (1992), y un procedimiento que utiliza cebadores de PCR 3'-eteno modificados, como se describe en el documento PCT WO 98/28443. El presente procedimiento de la invención proporciona medios para reducir el ruido de fondo debido a uniones en falso de los cebadores haciendo que los productos de las uniones en falso de los cebadores sean indetectables. Este procedimiento puede prevenir la formación de complejos que generan señales debido a la unión en falso de los cebadores cuando está disponible más de una región de unión del cebador sobre las cadenas diana o las cadenas de referencia.

Como se ha descrito anteriormente, la amplificación por PCR de las secuencias diana y de referencia, usando una combinación de los cebadores de la presente invención, produce dúplex marcados con colas con secuencias predeterminadas que no son complementarias a la secuencia diana o de referencia. Así, todos los productos producidos mediante amplificación por PCR con estos cebadores son capaces de formar dúplex parciales, que se pueden unir posteriormente entre sí por hibridación de las secuencias de las colas para formar complejos de ADN de cuatro cadenas. Cuando las fracciones de doble cadena de los dúplex parciales se diferencian entre sí por una mutación M, se previene el intercambio de la cadena en las estructuras de ADN de cuatro cadenas, dando como resultado la formación de un complejo tetramolecular estable. De una manera similar, los productos de amplificación no específicos que resultan de la unión en falso de los cebadores se marcan y comprenden secuencias de la cola en un extremo. Estos productos pueden formar dúplex parciales, que se pueden unir posteriormente a los dúplex parciales producidos mediante amplificación específica, así como a dúplex parciales producidos mediante amplificación no específica. Puesto que las fracciones de doble cadena relacionadas con la secuencia diana del complejo tetramolecular producido a partir de la combinación de dúplex parciales producidos mediante uniones específicas y no específicas de los cebadores son completamente diferentes, tales complejos no pueden intercambiar cadenas y disociarse en dúplex completos marcados. Los complejos tetramoleculares estables son detectables, y así generan una señal que está relacionada con la unión no específica de los cebadores pero no con la presencia de una mutación.

Para prevenir las señales que resultan de la unión en falso de los cebadores, una forma de realización de la presente invención usa un diseño de los cebadores alternativo. Ahora en referencia a la Fig. 7, el cebador P2 (marcado como se ha descrito previamente en el presente documento) se une a una primera cadena de la secuencia diana (A) con una mutación M y la secuencia de referencia (B). Los cebadores P4 y P5 son capaces de unirse a la segunda cadena de la secuencia diana A y la secuencia de referencia B. El cebador P4 comprende una región Pa 3'-terminal que es complementaria a la secuencia diana o de referencia, y una cola T 5'-terminal que no es complementaria a la secuencia diana o de referencia. La región Pa de P4 se une a la segunda cadena en una localización aguas arriba (en dirección 5') de la secuencia que une P5. Aunque la Fig. 7 muestra la unión de Pa a la segunda cadena inmediatamente adyacente a P5, son coherentes con la presente invención pequeñas separaciones o superposiciones parciales entre estas dos secuencias. La cantidad de separación o superposición se puede determinar experimentalmente (véanse los ejemplos) y la invención no está limitada a ningún número particular de bases. Asimismo, en la Fig. 7 y los ejemplos a continuación, T y P5 tienen la misma longitud pero esto no es necesario para poner en práctica la invención. Es deseable que la T_{m} de T esté próxima a la T_{m} de P5.

En referencia a la Fig. 7, la amplificación de las secuencias diana y de referencia por PCR usando los cebadores P2, P4 y P5, en las condiciones descritas previamente en el presente documento, produce dúplex que comprenden las secuencias diana y de referencia con bien la secuencia T y su complemento en un extremo (dúplex A1 y B1), o bien la secuencia P5 y su complemento en un extremo (dúplex A2 y B2). Después de la desnaturalización y rehibridación de la mezcla de amplificación, los productos de amplificación forman dúplex parciales con cola. Los dúplex parciales con cola comprenden secuencias diana y de referencia de doble cadena con cadenas sencillas no complementarias en el extremo de cada cadena del dúplex. Las secuencias de cadena sencilla no complementarias comprenden T, su secuencia complementaria T', y P5 y su complemento P5'.

En referencia a la Fig. 8, los dúplex parciales con cola se unen entre sí mediante la hibridación de las colas correspondientes para formar un complejo C de ADN de cuatro cadenas. Como se muestra en las Fig. 1A y 1B, la migración de la ramificación dentro del complejo C da como resultado la separación del complejo en dúplex a menos que esté presente una mutación M, con lo que se inhibe la migración de la ramificación y la disociación de la cadena. El complejo C se detecta debido a la asociación de los marcadores L1 y L2, cuya presencia está directamente relacionada con la presencia de la mutación M.

La amplificación de la secuencia diana y la secuencia de referencia se puede llevar a cabo por separado o, preferentemente, en el mismo medio de reacción. Esta combinación comprende (a) una muestra que contiene una secuencia de ácido nucleico diana sospechosa de tener una mutación, (b) una secuencia de ácido nucleico de referencia, que se puede añadir por separado si no se sabe si está presente en la muestra y que corresponde al ácido nucleico diana que carece de la mutación, que como se ha explicado anteriormente puede ser el ácido nucleico natural, (iii) una nucleótido polimerasa, (iv) nucleósido trifosfatos, y (v) los cebadores P2, P4 y P5. El cebador P2 puede estar marcado con L1 y aparte marcado con L2, o los cebadores P4 y P5 pueden estar marcados respectivamente con L1 y L2. A continuación el medio se somete a múltiples ciclos de temperaturas de calentamiento y enfriamiento para llevar a cabo simultáneamente todas las reacciones de amplificación y extensión de la cadena necesarias. Preferentemente, en esta forma de realización, cada ciclo incluye el calentamiento del medio de 90ºC a 100ºC durante 2 segundos a 3 minutos, el enfriamiento del medio de 50ºC a 70ºC durante un periodo de 8 segundos a 3 minutos, y el calentamiento del medio de 70ºC a 75ºC durante un periodo de 10 segundos a 3 minutos, aunque pueden ser necesarias temperaturas diferentes dependiendo de las longitudes de las secuencias del cebador. Después de los ciclos de temperatura anteriores el medio se somete a calentamiento durante un periodo de tiempo suficiente para desnaturalizar las moléculas de doble cadena. A continuación la mezcla de reacción se enfría para permitir (1) que las moléculas de cadena sencilla se rehibriden para formar dúplex parciales con cola, (2) la unión de los dúplex parciales con cola para formar complejos de cuatro cadenas, y (3) que los complejos experimenten el intercambio de cadenas mediante la migración de la ramificación. Preferentemente el medio se calienta de 90ºC a 99ºC durante 10 segundos a 2 minutos para la desnaturalización, y a continuación se enfría de 40ºC a 80ºC, preferentemente de 60ºC a 70ºC, y se mantiene a esta temperatura durante al menos un minuto, preferentemente durante 20 minutos a 2 horas, para la rehibridación y el intercambio de cadenas.

Ahora en referencia a la Fig. 8, entre los dúplex parciales formados después del enfriamiento del medio están los dúplex parciales con cola que se pueden unir entre sí para formar el complejo C. Tal y como se representa en las Fig. 1A y 2A el complejo no se disocia en los dúplex cuando está presente una mutación (los dúplex parciales de las Fig. 1A y 2A se generaron usando el esquema de cebadores descrito para esa forma de realización; no obstante, el principio del intercambio de cadenas en el complejo es el mismo independientemente del esquema de cebadores usado para generar los dúplex parciales). A continuación se hace una determinación de la presencia de tal complejo para establecer la presencia de una mutación en la secuencia de ácido nucleico diana. Cuando los cebadores P4 y P5 están marcados en lugar del cebador P2, los marcadores L1 y L2 en los dúplex parciales están unidos a las colas no complementarias que aún proporcionan la detección del complejo C cuando está presente una muta-
ción.

Como se ha descrito previamente en el presente documento, la migración de la ramificación dentro de los complejos de ADN de cuatro cadenas prosigue a menos que esté presente una mutación M. Véanse las Fig. 1 y 2. En los dúplex parciales se pueden incorporar marcadores como se ha descrito previamente y proporcionar un medio para la detección del complejo de cuatro cadenas. Véanse las Fig. 3 y 8. Si está presente una mutación, los marcadores se asocian debido a que ambos están presentes en el complejo. Como se ha descrito previamente en el presente documento, la detección de los marcadores proporciona la detección del complejo.

Ambos marcadores P4 y P5 pueden tener sitios de unión en falso del cebador en el ADN diana y de referencia, pero es muy improbable que estos sitios estén adyacentes entre sí. Así, los respectivos productos no específicos de la PCR no compartirán secuencias relacionadas con la diana complementarias y, por tanto, no pueden formar dúplex parciales que son capaces de unirse entre sí para formar un complejo C de cuatro cadenas. En consecuencia, los productos no específicos de la PCR que resultan de una unión del cebador no específica no contribuyen a la señal relacionada con la presencia de una mutación en la secuencia diana.

Cuando los cebadores P4 y P5 se combinan en la mezcla de amplificación, los dos cebadores pueden competir entre sí. Es decir, el producto de amplificación de los cebadores P2 y P5 comprende la secuencia Pa y su complemento que es un sitio de unión del cebador para el cebador P4, mientras que el producto de amplificación del par de cebadores P2 y P4 no contiene un sitio de unión del cebador para el cebador P5. Así, el cebador P4 se puede extender a lo largo de una cadena de uno cualquiera de los productos de amplificación, mientras que el cebador P5 se puede unir y sólo se puede extender a lo largo de una cadena del producto producido mediante amplificación usando los cebadores P2 y P5. Si el cebador P4 es tan eficiente o más eficiente que el cebador P5, es posible que el cebador P4 supere al cebador P5. En estas condiciones, la amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos diana o de referencia dará como resultado en un único producto de amplificación generado mediante los cebadores P2 y P4, y posteriormente dará como resultado la incapacidad para formar dúplex parciales. Por tanto, se debería considerar el funcionamiento equilibrado de los cebadores P4 y P5 en una mezcla, y puede depender de los parámetros termodinámicos relativos para la unión de cada uno de estos cebadores a la cadena de la secuencia de ácido nucleico diana y de referencia. Idealmente, para maximizar el rendimiento de las estructuras de cuatro cadenas que generan señales, las cantidades de los productos de amplificación generados mediante P4 y P5 deberían ser iguales. La eficacia de la unión equilibrada de los cebadores P4 y P5 se puede conseguir basándose en consideraciones termodinámicas o mediante la optimización de las relaciones de concentración de los dos cebadores así como la temperatura para la hibridación de los cebadores durante el procedimiento de amplificación.

En un experimento de optimización típico, se examinan varias relaciones diferentes a diversas temperaturas de hibridación (T_{a}) en el ciclo de la PCR. El valor absoluto de la señal medida en un ensayo de luminiscencia inducido (véase patente de EE.UU. Nº 5.595.891) es un buen criterio para optimizar la relación de las concentraciones de los cebadores P4 y P5. Como ejemplo, la ausencia de una señal obtenida cuando se sabe que la secuencia de ácido nucleico diana contiene una mutación (siempre que no falle la amplificación, valorada por electroforesis en gel) significa que la eficacia de la unión del cebador P4 usado para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana y de referencia supera con creces la del cebador P5, que da como resultado la generación de un solo producto de amplificación y la posterior incapacidad para producir dúplex parciales y el complejo C. Un ejemplo de tal experimento se muestra a continuación.

Ahora en referencia a la Fig. 9, la presente invención también se puede llevar a cabo mediante amplificación separada por PCR de las secuencias de ácidos nucleicos diana o de referencia mediante la combinación de los cebadores P2 y P4 en un vaso de reacción, y la combinación de los cebadores P2 y P5 en otro vaso de reacción. Después de la amplificación por PCR, las mezclas de reacción se combinan y la combinación se somete posteriormente a condiciones que dan lugar a la desnaturalización de los productos de doble cadena, a la hibridación de las cadenas sencillas, y a la formación de dúplex parciales que se unen entre sí mediante la hibridación de las secuencias de la cola para formar complejos C de ADN de cuatro cadenas. Este procedimiento elimina la necesidad de la eficacia de la unión equilibrada de los cebadores P4 y P5, como se ha descrito anteriormente. De manera similar, cuando se marca el cebador P2, es posible llevar a cabo la invención amplificando la secuencia de ácido nucleico diana usando el cebador P2 marcado con uno de los marcadores, y amplificando por separado la secuencia de referencia usando el cebador P2 marcado con el segundo marcador. Después de la amplificación por PCR, las mezclas de reacción se combinan y la combinación se somete a condiciones que dan lugar a la desnaturalización de los productos de doble cadena, la hibridación de las cadenas sencillas para formar dúplex parciales y la unión de los dúplex parciales entre sí mediante la hibridación de las secuencias de la cola para formar complejos de ADN de cuatro cadenas.

Como se ha mencionado anteriormente, está dentro del ámbito de la presente invención utilizar una amplificación inicial para incrementar la concentración de las moléculas del ácido nucleico diana y las moléculas del ácido nucleico de referencia en relación a aquella de otros ácidos nucleicos que puedan estar presentes en la muestra. Cuando se usa el procedimiento alternativo de la invención, que está dirigido a dar productos de amplificación no específicos indetectables, la amplificación inicial de las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia se puede llevar a cabo usando los cebadores PX1 y PX2 anteriormente mencionados. Alternativamente, la amplificación inicial se puede llevar a cabo usando los cebadores PX1 y P2 o PX2 y P5. Después de la amplificación inicial de las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia, la mezcla de reacción se combina con los cebadores P2, P4 y P5, como se ha descrito anteriormente, y la combinación se somete a condiciones de ciclos de temperatura adecuadas para la reacción en cadena de la polimerasa y la formación de dúplex parciales. Los dúplex parciales producidos a partir de las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia se combinan y se dejan hibridar entre sí para formar los complejos de ADN de cuatro cadenas. La formación del complejo C estable se detecta por la asociación de los marcadores según se ha mencionado anteriormente. La detección del complejo C estable es indicativa de la presencia de una mutación o una diferencia en la secuencia en la secuencia de ácido nucleico diana.

Kits para poner en práctica la invención

Por cuestiones de comodidad, se pueden proporcionar cantidades predeterminadas de los reactivos empleados en la presente invención en un kit en una combinación envasada. Un kit puede comprender en una combinación envasada (a) un cebador P2 extensible a lo largo de una de las cadenas de las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia, (b) un cebador P1 que comprende una fracción Pa 3'-terminal que se une y es extensible a lo largo de la otra cadena de las secuencias de los ácidos nucleicos diana y de referencia y una fracción B1 5'-terminal que no se une a las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia, y (c) un cebador P3 que comprende una fracción Pa 3'-terminal y una fracción A1 que es diferente de B1 y no se une a las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia. Preferentemente, el cebador P2 puede estar marcado, pero los cebadores P1 y P3 alternativamente se pueden marcar. El kit también puede incluir un ácido nucleico de referencia, que se corresponde con la secuencia de ácido nucleico diana excepto por la posible presencia de una diferencia tal como una mutación, y reactivos para llevar a cabo una amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana antes de someter a la secuencia de ácido nucleico diana a los procedimientos de la presente invención. El kit también puede incluir nucleósido trifosfatos y una nucleótido polimerasa. El kit además puede incluir dos oligonucleótidos cebadores PX1 y PX2 adicionales donde los cebadores están relacionados porque un producto de la extensión de uno a lo largo de la secuencia diana sirve como molde para la extensión del otro. El kit además puede incluir partículas como las descritas anteriormente capaces de unirse al marcador sobre al menos uno de los cebadores. El kit además puede incluir miembros de un sistema de producción de señales y también diversos medios tamponados, algunos de los cuales pueden contener uno o más de los reactivos anteriores. Preferentemente, los cebadores PX1, PX2, P1, P2 y P3 están envasados en un único contenedor. Más preferentemente, al menos todos los componentes anteriores aparte del tampón están envasados en un único contenedor.

El kit además puede incluir un par de cebadores adaptadores para la amplificación de los ácidos nucleicos diana y de referencia. Uno de los cebadores tiene una fracción 3'-terminal que es hibridable a los ácidos nucleicos diana y de referencia y una fracción 5' que no es hibridable a los ácidos nucleicos diana y de referencia y es sustancialmente idéntica al cebador P2. El otro de los cebadores tiene una fracción 3'-terminal que es hibridable a los ácidos nucleicos diana y de referencia y una fracción 5' que no es hibridable a los ácidos nucleicos diana y de referencia y es sustancialmente idéntica a la fracción Pa 3'-terminal de los cebadores P1 y P3. Normalmente los cebadores adaptadores están envasados en un contenedor aparte de los cebadores P1, P2 y P3.

Alternativamente, el kit también puede incluir (a) un cebador P2 extensible a lo largo de una de las cadenas de las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia, (b) un cebador P4 que comprende una fracción Pa 3'-terminal que se une y es extensible a lo largo de la otra cadena de las secuencias de los ácidos nucleicos diana y de referencia y una fracción 5'-terminal que no se une a las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia, y (c) un cebador P5 que se une a las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia en una localización aguas abajo, en dirección 3', de la fracción 3'-terminal del cebador P4. Preferentemente, el cebador P2 puede estar marcado, pero los cebadores P1 y P3 alternativamente se pueden marcar. El kit también puede incluir un ácido nucleico de referencia, que se corresponde con la secuencia de ácido nucleico diana excepto por la posible presencia de una diferencia tal como una mutación, y reactivos para llevar a cabo una amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana antes de someter a la secuencia de ácido nucleico diana a los procedimientos de la presente invención. El kit también puede incluir nucleósido trifosfatos y una nucleótido polimerasa. El kit además puede incluir partículas como las descritas anteriormente capaces de unirse al marcador sobre al menos uno de los cebadores. El kit además puede incluir miembros de un sistema de producción de señales y también diversos medios tamponados, algunos de los cuales pueden contener uno o más de los reactivos anteriores. Preferentemente, los cebadores, más preferentemente, al menos todos los componentes anteriores aparte del tampón están envasados en un único contenedor.

Las cantidades relativas de los diversos reactivos en los kits se pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones de reactivos, que sustancialmente optimicen las reacciones que es necesario que se produzcan durante el presente procedimiento y para sustancialmente optimizar más la sensibilidad del procedimiento en la detección de una mutación. En las circunstancias apropiadas uno o más de los reactivos del kit se pueden proporcionar como un polvo seco, normalmente liofilizado, incluyendo excipientes, que en disolución proporcionará una disolución reactiva con las concentraciones apropiadas para realizar un procedimiento o ensayo según la presente invención. Cada reactivo puede estar envasado en contenedores separados o algunos o todos los reactivos se pueden combinar en un contenedor cuando la reactividad cruzada y la estabilidad de almacenamiento lo permitan. En una forma de realización particular de un kit según la presente invención, los reactivos están envasados en un único contenedor. Los kits también pueden incluir una descripción por escrito de un procedimiento según la presente invención como se ha descrito anteriormente.

Ejemplos

La invención se demuestra en profundidad mediante los siguientes ejemplos ilustrativos. Las temperaturas están en grados centígrados (ºC) y las partes y porcentajes son en peso, a menos que se indique otra cosa. En el presente documento se usan las siguientes definiciones y abreviaturas:

Tris: - Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (una disolución 10\times) de BioWhittaker, Walkersville, {}\hskip0.1cm MD.

Acc-Ab_{Dig}: - cuentas aceptoras acopladas al anticuerpo anti-digoxina para su uso en un ensayo de {}\hskip0.1cm luminiscencia inducida

Sens-Sav: - cuentas sensibilizadoras acopladas a estreptavidina para su uso en un ensayo de luminis- {}\hskip0.1cm cencia inducida

BSA: - seroalbúmina bovina de Gibco BRL, Gaithersburg MD.

pb: - pares de bases

wt (+): - alelo natural

mut (-): - alelo mutante

+/+: - homocigótico con 2 alelos normales

-/-: - homocigótico con 2 alelos mutantes

+/-: - heterocigótico con 1 alelo normal y 1 alelo mutante

Muestra diana: - muestra de ADN a probar para la presencia de una mutación;

Muestra de referencia: - muestra de ADN homocigótico para la secuencia wt con la cual se prueban las muestras {}\hskip0.1cm diana.

sec: - segundos

hr: - horas

min: - minutos

Tampón A: - Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a temperatura ambiente), KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM, 200 \mug/ml {}\hskip0.1cm de BSA

Tampón B: - Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a temperatura ambiente), KCl 50 mM, MgCl_{2} 20 mM, 200 \mug/ml {}\hskip0.1cm de BSA

Tampón C: - Tris 0,1 M, NaCl 0,3 M, EDTA 25 mM, 0,1% de BSA, 0,1% de dextrano T-500, una {}\hskip0.1cm dilución 1:320 de IgG de ratón (HBR-1 de Scantibodies Laboratory Inc., Los Angeles, {}\hskip0.1cm CA), 0,05% de Kathon (Rohm and Haas, Philadelphia, PA), y 0,01% de sulfato de genta- {}\hskip0.1cm micina.

RLU: - unidades de luz relativas

nt: - nucleótidos

MAD: - maleimidilaminodextrano

Ab: - anticuerpo

Sav: - estreptavidina

MOPS: - ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico

hr: - hora

sulfo-SMCC: - 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo

NHS: - N-hidroxisuccinimida

EDAC: - clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida

DMSO: - dimetilsulfóxido

MES: - morfolinoetanosulfonato

rpm: - revoluciones por min

EDTA: - ácido etilendiamintetraacético

SATA: - S-acetiltioacetato de N-succinimidilo

BSA: - seroalbúmina bovina de Sigma Chemical Company, St. Louis MO

eq: - equivalentes

pb: - pares de bases

A_{280}: - absorbancia a una longitud de onda de 280 nanómetros

DexAl: - aldehído de dextrano

DPP: - 4,7-difenilfenantrolina

Eu(TTA)_{3}: - tri-3-(2-tienoil)-1,1,1-trifluoroacetonato de europio

L o l: - litro

exo VII: - exonucleasa VII de E. coli (de Amersham Life Science) (USB).

DMF: - dimetilformamida

THF: - tetrahidrofurano

MS: - espectroscopia de masas

RMN: - espectroscopia por resonancia magnética nuclear

TMSCl: - cloruro de tetrametilsililo

ELISA: - ensayo de inmunoabsorción enzimática como se describe en "Enzyme-Immunoassay", {}\hskip0.1cm Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL. (1980)

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Se produjeron anticuerpos monoclonales mediante tecnología de células híbridas normales. Resumiendo, el inmunógeno apropiado se inyectó en un hospedador, normalmente un ratón u otro animal adecuado, y después de un periodo de tiempo adecuado se obtuvieron células del bazo del hospedador. Alternativamente, células del hospedador sin sensibilizar se aislaron y se sensibilizaron directamente in vitro con el inmunógeno. Se formaron células híbridas fusionando las células anteriores con una línea celular de mieloma apropiada y cultivando las células fusionadas. Los anticuerpos producidos por las células híbridas cultivadas se seleccionaron por su afinidad de unión al antígeno particular, el conjugado dig-BSA. Se emplearon una serie de técnicas de selección tales como, por ejemplo, selecciones ELISA. A continuación las fusiones seleccionadas se volvieron a clonar.

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Preparación de cuentas para su uso en un ensayo de luminiscencia inducida

Acc-Ab_{Dig} - Cuentas aceptoras acopladas al anticuerpo anti-digoxina (con 377 moléculas de anticuerpo por cuenta) que contienen bien (1) Eu(TTA)_{3}DPP y Tioxeno C-28 (Cuentas de Eu) o bien (2) Tioxeno C-28, 1-C1-BPEA, y Rubreno (Cuentas de TAR) se usaron en los siguientes ejemplos. Los ejemplos 1-3 se llevaron a cabo con cuentas de Eu acopladas a anti-Dig. Los ejemplos restantes se llevaron a cabo con cuentas de TAR acopladas a anti-Dig. Estas cuentas se prepararon como sigue:

Preparación de tioxeno C-28

A una disolución de 4-bromoanilina (30 g, 174 mmol) en DMF seca (200 ml) se le añadió 1-bromotetradecano (89,3 ml, 366 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (62,2 ml, 357 mmol). La disolución de reacción se calentó a 90ºC durante 16 hr en argón antes de enfriarse a temperatura ambiente. A esta disolución de reacción se le añadió de nuevo 1-bromotetradecano (45 ml, 184 mmol) y N,N-diisopropiletilamina (31 ml, 178 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a 90ºC durante otras 15 hr. Después de enfriar, la disolución de reacción se concentró sobre vacío y el residuo se diluyó con CH_{2}Cl_{2} (400 ml). La disolución de CH_{2}Cl_{2} se lavó con NaOH acuoso 1 N (2\times), H_{2}O, y salmuera, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró sobre vacío para dar un aceite pardo oscuro (110 g aproximadamente). La cromatografía en columna preparativa en gel de sílice mediante un sistema Waters 500 Prep LC eluyendo con hexano dio un aceite amarillo que contenía principalmente el producto (4-bromo-N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilina) junto con un componente secundario 1-bromotetradecano. Este último compuesto se retiró de la mezcla por destilación sobre vacío (p.e. 105-110ºC, 0,6 mm) para dar 50,2 g (51%) del producto como un aceite pardo. A una mezcla de virutas de magnesio (9,60 g, 395 mmol) en THF seco (30 ml) en argón se le añadió gota a gota una disolución del producto anilina sustituido anterior (44,7 g, 79 mmol) en THF (250 ml). Se añadieron unos pocos cristales de yodo para iniciar la formación del reactivo de Grignard. Cuando la mezcla de reacción se puso caliente y alcanzó la temperatura de reflujo, la velocidad de adición se reguló para mantener un reflujo suave. Después de que la adición se hubo completado, la mezcla se calentó a temperatura de reflujo durante una hora más. La disolución sobrenadante fría se transfirió a través de una cánula a un embudo de adición y se añadió gota a gota (2,5 hr aproximadamente) a una disolución de fenilglioxal (11,7 g, 87 mmol) en THF (300 ml) a -30ºC en argón. La mezcla de reacción se calentó gradualmente hasta 0ºC en 1 hr y se agitó durante otros 30 min. La mezcla resultante se echó en una mezcla de agua helada (800 ml) y acetato de etilo (250 ml). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3\times). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H_{2}O (2\times), salmuera y se secaron sobre MgSO_{4}. La evaporación del disolvente dio 48,8 g del producto en bruto como un líquido oleoso verde oscuro. La cromatografía súbita en columna de este líquido (elución en gradiente con hexano, acetato de etilo:hexano 1,5:98,5, 3:97, 5:95) dio 24,7 g (50%) del producto benzoína (MS (C_{42}H_{69}NO_{2}): [M-H]^{+} 618,6, RMN ^{1}H (250 MHz, CDCl_{3}) era coherente con el producto benzoína esperado. A una disolución del producto benzoína anterior (24,7 g, 40 mmol) en tolueno seco (500 ml) se le añadió secuencialmente 2-mercaptoetanol (25 g, 320 mmol) y TMSCl (100 ml, 788 mmol). La disolución de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 23 hr en argón antes de enfriarse a temperatura ambiente. A ésta se le añadió TMSCl adicional (50 ml, 394 mmol); y la disolución de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante otras 3 hr. La disolución resultante se enfrió, se hizo básica con NaOH acuoso 2,5 N frío y se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3\times). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHCO_{3} acuoso saturado (2\times) y salmuera, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se concentraron sobre vacío para dar un líquido oleoso pardo. La cromatografía en columna preparativa en gel de sílice usando un sistema Waters 500 Prep LC (elución en gradiente con hexano, acetato de etilo:hexano 1:99, 2:98) dio 15,5 g (60%) del tioxeno C-28 como un aceite naranja amarillento (MS (C_{44}H_{71}NOS): [M-H]^{+} 661,6, RMN ^{1}H (250 MHz, CDCl_{3}) fue coherente con el producto tioxeno C-28 esperado, 2-(4-(N,N-di-(C_{14}H_{29})-anilino)-3-feniltioxeno.

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Preparación de cuentas aceptoras de carboxilo que contienen Eu(TTA)_{3}DPP y tioxeno C-28 (cuentas de Eu)

Las cuentas de partida eran de látex modificado con carboxilato adquiridas en Seradyn Particle Technology, Indianápolis, IN. Las cuentas contenían Eu(TTA)_{3}DPP preparado como sigue: DPP/Eu(TTA)_{3} se preparó combinando 8,69 g de Eu(TTA)_{3}·3H_{2}O (10 mmol, Kodak Chemical Company, Rochester N.Y.) y 1,8 g de 1,10-fenantrolina (10 mmol, Aldrich) en 50 ml de tolueno seco y calentando a 95ºC en un baño de aceite durante 1 hora. El tolueno se retiró a presión reducida. El sólido de color ceniza se cristalizó en 10 ml de tolueno para dar 10 gramos de DPP/Eu(TTA)_{3}. Espectro de absorción: 270 nm (20.000), 340 nm (60.000) (Tolueno) 1.R (KBr): cm^{-1}: 3440 (s), 1600 (s), 1540 (s), 1400 (s), 1300 (s). Cuatro ml de una suspensión al 20% (400 mg) de látex modificado con carboxilato lavado de 175 nm se diluyó con 3 ml de etoxietanol en un matraz de fondo redondo de 25 ml con un agitador magnético. A continuación el matraz de fondo redondo se puso en un baño de aceite a 105ºC y se agitó durante 10 minutos. A continuación, se añadió tioxeno C-28 3,3 mM y Eu(TTA)_{3}DPP 15,5 mM; las cuentas se agitaron durante 5 minutos más. En este punto se añadió lentamente 1,0 ml de NaOH 0,1 N en 5 minutos. Durante todas las adiciones, la temperatura del baño de aceite se mantuvo a 105ºC. La temperatura del baño de aceite se dejó caer lentamente hasta temperatura ambiente en 2 horas. Después de enfriar, la mezcla se diluyó con 20 ml de etanol y se centrifugó (12.500 rpm, 30 minutos). Los sobrenadantes se descartaron y los sedimentos se resuspendieron en etanol por sonicación. Se repitió la centrifugación, y los sedimentos se resuspendieron en agua; y se repitió la centrifugación. Los sedimentos se resuspendieron en 5 ml de etanol acuoso hasta un volumen final de 40 ml.

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Preparación de cuentas de TAR

Se empleó la siguiente composición colorante: 20% de tioxeno C-28 (preparado como se ha descrito anteriormente), 1,6% de 1-cloro-9,10-bis(feniletinil)antraceno (1-Cl-BPEA) (de Aldrich Chemical Company) y 2,7% de rubreno (de Aldrich Chemical Company). Las partículas eran partículas de látex (Seradyn Particle Technology, Indianápolis IN). La composición colorante (tioxeno C-28 240-250 mM, 1-Cl-BPEA 8-16 mM, y rubreno 20-30 mM) se incorporó a las cuentas de látex de una forma similar a aquella descrita en la patente de EE.UU. Nº 5.340.716 expedida el 23 de Agosto de 1994 (la patente `716), en la columna 48, líneas 24-45. El proceso de coloración supone la adición de las cuentas de látex (10% de sólidos) a una mezcla de etilenglicol (65,4%), 2-etoxietanol (32,2%) y NaOH 0,1 N (2,3%). Las cuentas se mezclaron y se calentaron durante 40 minutos a 95ºC con agitación continua. Mientras se calentaban las cuentas, los tres colorantes quimioluminiscentes se disolvieron en 2-etoxietanol calentándolos a 95ºC durante 30 minutos con agitación continua. Al final de ambas incubaciones, la disolución colorante se echó en la suspensión de cuentas y la mezcla resultante se incubó durante 20 minutos adicionales con agitación continua. Después de la incubación de 20 minutos, las cuentas se extrajeron del baño de aceite y se dejaron enfriar hasta 40ºC \pm 10ºC. A continuación las cuentas se pasaron a través de un filtro de poliéster con una red de 43 micrómetros y se lavaron. Las partículas coloreadas se lavaron usando un Microgon (Microgon Inc., Laguna Hills, CA). Las cuentas primero se lavaron con una mezcla disolvente compuesta de etilenglicol y 2-etoxietanol (70%/30%). Las cuentas se lavaron con 500 ml de la mezcla disolvente por gramo de cuentas. A esto le siguió el lavado con etanol acuoso al 10% (pH 10-11). El volumen de lavado fue de 400 ml por gramo de cuentas. A continuación las cuentas se recogieron y se probaron para el % de sólidos, el contenido en colorante, el tamaño de partícula, y la generación de señal y ruido.

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Preparación de cuentas aceptoras recubiertas con maleimidilaminodextrano (MAD)

Se preparó hidroxipropilaminodextrano (1 NH_{2}/7 glucosa) disolviendo Dextran T-500 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (50 g) en 150 ml de H_{2}O en un matraz de fondo redondo de 3 bocas equipado con un agitador mecánico y un embudo de adición. A la disolución anterior se le añadió 18,8 g de Zn(BF_{4})_{2} y la temperatura se llevó a 87ºC con un baño de agua caliente. Se añadió epiclorohidrina (350 ml) gota a gota con agitación en 30 min aproximadamente mientras la temperatura se mantenía a 87-88ºC. La mezcla se agitó durante 4 hr mientras la temperatura se mantenía entre 80ºC y 95ºC, y a continuación la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. El producto clorodextrano se precipitó echándolo lentamente en 3 L de metanol con agitación vigorosa, se recuperó por filtración y se secó durante toda la noche en un horno de vacío.

El producto clorodextrano se disolvió en 200 ml de agua y se añadió a 2 L de amoniaco acuoso concentrado (36%). Esta disolución se agitó durante 4 días a temperatura ambiente, a continuación se concentró hasta 190 ml aproximadamente en un evaporador rotatorio. El concentrado se dividió en dos lotes iguales, y cada lote se precipitó echándolo lentamente en 2 L de metanol en agitación rápida. El producto final se recuperó por filtración y se secó sobre vacío.

El hidroxipropilaminodextrano (1 NH_{2}/7 glucosa), preparado anteriormente, se disolvió en MOPS 50 mM, pH 7,2, a 12,5 mg/ml. La disolución se agitó durante 8 hr a temperatura ambiente, se almacenó con refrigeración y se centrifugó durante 45 min a 15.000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-5B inmediatamente antes de su uso para retirar las trazas de un material sólido. A 10 ml de esta disolución se le añadió 23 mg de Sulfo-SMCC en 1 ml de agua. Esta mezcla se incubó durante 1 hr a temperatura ambiente y se usó sin purificación adicional.

Se añadieron lentamente las cuentas aceptoras de carboxilo preparadas anteriormente (99 mg en 4,5 ml de agua) con el uso de un vórtex a 5,5 ml del MAD aminodextrano de antes, seguido por 1 ml de NHS a 200 mg/ml en MES 50 mM, pH 6, 1 ml de EDAC a 200 mg/ml en agua, y 450 \mul de HCl 1 M, pH final 6. La mezcla se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente en oscuridad, y a continuación se hizo reaccionar con 200 mg de anhídrido succínico en 0,5 ml de DMSO durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadió Surfact-Amps Tween-20 recién abierto (Pierce Chemical Company, Rockford, IL) y las cuentas se centrifugaron 30 min a 15.000 rpm en una centrífuga Sorvall RC-5B, se lavaron por centrifugación con tres fracciones de 10 ml de MOPS 50 mM, EDTA 50 mM, Surfact-Amps Tween-20 al 0,1% (Pierce Chemical Company), pH 7,2, y se resuspendieron en 3 ml del mismo.

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Acoplamiento de cuentas recubiertas con MAD a anticuerpo monoclonal anti-digoxina

Se purificó Ab monoclonal anti-digoxina (preparado como se ha descrito anteriormente) mediante resina ABx (Baker Chemical Company, Phillipsburg, N.J.) y se dializó en NaCl 0,15 M, Na_{2}HPO_{4} 5 mM, pH 7,4. El Ab anti-digoxina se tioló mezclando 622 \mul (4,28 mg) con 10,2 \mul de SATA (1,25 mg/ml en etanol, 2 eq.), incubando durante 1 hr a temperatura ambiente y dializando en frío frente a 2\times2 L de NaCl 150 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7. El anticuerpo tioacetilado se desacetiló añadiendo 62,2 \mul de hidroxilamina (H_{2}NOH 1 M, MOPS 50 mM, EDTA 25 mM, pH 7), burbujeando con argón e incubando durante 1 hr a temperatura ambiente. El producto se aplicó a una columna Pharmacia PD-10 (G-25) y se eluyó con MOPS 50 mM, EDTA 50 mM, pH 7,2, burbujeada con argón. Después de dejar correr 2,5 ml, se recogieron y se combinaron tres fracciones de 1 ml. La recuperación del anticuerpo fue de 3,66 mg o 86% por A_{280}. Se añadió Surfact-Amps Tween-20 (10%) para dar una concentración final del 0,2%.

Se añadió inmediatamente una alícuota de 1,4 ml del anticuerpo tiolado anterior (1,71 mg de anticuerpo) a 300 \mul (10 mg) de las cuentas maleimidadas preparadas anteriormente más Tween-20 al 10% suficiente para llevar la concentración final de la mezcla al 0,2%. El tubo se purgó con argón y se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente en oscuridad. A lo anterior se le añadió 3,4 \mul de HSCH_{2}COOH 1 M en agua. Después de 30 min a temperatura ambiente, se añadió 6,8 \mul de ICH_{2}COOH 1 M (en agua). Después de 30 min se añadió 3,5 ml de glicina 0,17 M, NaCl 0,1 M, Tween-20 al 0,1% (v/v), 10 mg/ml de BSA, pH 9,2 y las cuentas se centrifugaron (30 min a 15.000 rpm), se incubaron durante 3 hr en 5 ml del mismo tampón, se centrifugaron, se lavaron por centrifugación con tres fracciones de 5 ml de Tampón C, se resuspendieron en 5 ml de Tampón C y se almacenaron con refrigeración. El tamaño de las cuentas, determinado en Tampón C, era de 301 \pm 56 nm. La capacidad de unión se determinó con ^{125}I-digoxina y era equivalente a 377 moléculas de anticuerpo por cuenta.

Preparación de cuentas sensibilizadoras recubiertas con estreptavidina (Sens-Sav)

Se preparó tetra-t-butilftalocianina de silicio como sigue:

Se añadió sodio metálico, recién cortado (5,0 g, 208 mmol), a 300 ml de éter anhidro en un matraz de 3 bocas y 2 litros equipado con un agitador magnético, un condensador de reflujo, un tubo de secado y un burbujeador de gas. Después de que el sodio se hubo disuelto completamente, se añadió 4-t-butil-1,2-dicianobenceno (38,64 g, 210 mmol, de TCI Chemicals, Portland, OR) usando un embudo. La mezcla se volvió clara y la temperatura se incrementó hasta 50ºC aproximadamente. En este punto se introdujo una corriente continua de amoniaco gaseoso anhidro a través del burbujeador de vidrio en la mezcla de reacción durante 1 hr. A continuación la mezcla de reacción se calentó a temperatura de reflujo durante 4 hr mientras se proseguía con la corriente de amoniaco gaseoso. Durante el transcurso de la reacción, a medida que el sólido comenzaba a precipitar, la suspensión resultante se evaporó hasta sequedad (toma de vacío) y el residuo se suspendió en agua (400 ml) y se filtró. El sólido se secó (60ºC, toma de vacío, P_{2}O_{5}). El rendimiento del producto (1,3-diiminoisoindolina, 42,2 g) fue casi cuantitativo. Este material se usó durante la siguiente etapa sin purificación adicional. A un matraz de 3 bocas y 1 litro equipado con un condensador y un tubo de secado se le añadió el producto anterior (18 g, 89 mmol) y quinolina (200 ml, Aldrich Chemical Company, St. Louis, MO). Con una jeringa se añadió tetracloruro de silicio (11 ml, 95 mmol, Aldrich Chemical Company) a la disolución agitada en un periodo de 10 minutos. Después de que la adición se hubo completado, la mezcla de reacción se calentó a 180-185ºC en un baño de aceite durante 1 hr. La reacción se dejó enfriar a temperatura ambiente y se añadió HCl concentrado cuidadosamente para acidificar la mezcla de reacción (pH 5-6). La mezcla de reacción parda oscura se enfrió y se filtró. El sólido se lavó con 100 ml de agua y se secó (toma de vacío, 60ºC, P_{2}O_{5}). El material sólido se puso en un matraz de fondo redondo de 1 litro y se añadió ácido sulfúrico concentrado (500 ml) con agitación. La mezcla se agitó durante 4 hr a 60ºC y a continuación se diluyó cuidadosamente con hielo picado (2000 g). La mezcla resultante se filtró y el sólido se lavó con 100 ml de agua y se secó. El sólido azul oscuro se transfirió a un matraz de fondo redondo de 1 litro, se añadió amoniaco concentrado (500 ml), y la mezcla se calentó y se agitó a temperatura de reflujo durante 2 hr, se enfrió a temperatura ambiente y se filtró. El sólido se lavó con 50 ml de agua y se secó sobre vacío (toma de vacío, 60ºC, P_{2}O_{5}) para dar 12 g del producto tetra-t-butilftalocianina de silicio como un sólido azul oscuro. Se añadieron 3-picolina (12 g, de Aldrich Chemical Company), tri-n-butilamina (anhidra, 40 ml) y tri-n-hexilclorosilano (11,5 g) a 12 g del producto anterior en un matraz de 3 bocas y 1 litro, equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo. La mezcla se calentó a temperatura de reflujo durante 1,5 hr y a continuación se enfrió a temperatura ambiente. La picolina se destiló sobre alto vacío (bomba de aceite a 1 mm de Hg aproximadamente) hasta sequedad. El residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} y se purificó usando una columna de gel de sílice (hexano) para dar 10 g del producto di-(tri-n-hexilsilil)-tetra-t-butilftalocianina de silicio puro como un sólido azul oscuro. (MS: [M-H]^{+} 1364,2, espectro de absorción: metanol: 674 nm (\varepsilon 180.000): tolueno 678 nm, RMN ^{1}H (250 MHz, CDCl_{3}): \delta: -2,4 (m, 12H), -1,3 (m, 12H), 0,2-0,9 (m, 54H), 1,8 (s, 36H), 8,3 (d, 4H) y 9,6 (m, 8H) era coherente con el producto anterior esperado.

Cuentas sensibilizadoras acopladas a estreptavidina (2300 Sav/cuenta)

Las cuentas sensibilizadoras se prepararon poniendo 600 ml de cuentas modificadas con carboxilato (Seradyn) en un matraz de fondo redondo de 3 bocas equipado con un agitador mecánico, un tapón de vidrio con un termómetro sujeto a él en una boca, y un embudo en la boca opuesta. El matraz se había sumergido en baño de aceite mantenido a 94 \pm 1ºC. Las cuentas se añadieron al matraz a través del embudo en la boca y el contenedor de cuentas se enjuagó con 830 ml de etoxietanol, 1700 ml de etilenglicol y 60 ml de NaOH 0,1 N y el enjuague se añadió al matraz a través del embudo. El embudo se sustituyó por un tabique de caucho de 24-40. Las cuentas se agitaron a 765 rpm a una temperatura de 94 \pm 1ºC durante 40 minutos.

Se disolvió tetra-t-butilftalocianina de silicio (10,0 g, preparada como anteriormente) en 300 ml de alcohol bencílico a 60 \pm 5ºC y se añadió 85 ml al matraz de fondo redondo anterior a través del tabique por medio de una jeringa calentada a 120 \pm 10ºC a una velocidad de 3 ml por minuto. Los 85 ml restantes de la disolución de ftalocianina se añadieron a continuación como se ha descrito anteriormente. La jeringa y el matraz que originalmente contenía la ftalocianina se enjuagaron con 40 ml de alcohol bencílico y se transfirieron a un matraz de fondo redondo. Después de 15 minutos se añadió 900 ml de agua desionizada y 75 ml de NaOH gota a gota en 40 minutos. La temperatura del baño de aceite se dejó caer lentamente hasta 40 \pm 10ºC y se detuvo la agitación. A continuación las cuentas se filtraron a través de un filtro de poliéster de 43 micrómetros y se sometieron a un aparato de filtración de flujo tangencial Microgon (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) usando etanol:agua, 100:0 a 10:90, y a continuación se filtró a través de un filtro de poliéster de 43 micrómetros.

Se disolvió Sulfo-SMCC (11,55 mg) en 0,5 ml de agua destilada. Lentamente, durante 10 segundos, la disolución anterior se añadió a 5 ml de una disolución de aminodextrano en agitación (Molecular Probes, Eugene, OR) (12,5 mg/ml en MOPS 50 mM, pH 7,2). La mezcla se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.

A la disolución en agitación anterior se le añadió 5 ml de 20 mg/ml (100 mg) de las cuentas sensibilizadoras preparadas anteriormente en agua destilada. A continuación, 1 ml de NHS a 200 mg/ml (preparado fresco en MES 50 mM, pH ajustado a 6,0 con NaOH 6 N). Se disolvieron 200 mg de EDAC en 1 ml de agua destilada y esta disolución se añadió lentamente con agitación a las cuentas sensibilizadoras. El pH se ajustó a 6,0 mediante la adición de 450 \mul de HCl 1 N y la mezcla se incubó durante toda la noche en oscuridad. Se añadió una disolución de 100 mg de anhídrido succínico en 0,5 ml de DMSO a las cuentas sensibilizadoras y la mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente en oscuridad. A esta mezcla se le añadió 0,13 ml de Tween-20 al 10% llevando la concentración final de Tween-20 al 0,1%. Las cuentas se centrifugaron durante 45 min a 15.000 rpm como anteriormente. El sobrenadante se descartó y las cuentas se resuspendieron en 10 ml de tampón (MOPS 50 mM, EDTA 50 mM y Tween-20 al 0,1%, pH 7,2). La mezcla se sonicó para dispersar las cuentas. Las cuentas se centrifugaron durante 30 min como se ha descrito anteriormente, el sobrenadante se descartó y las cuentas se resuspendieron. Este procedimiento se repitió un total de tres veces. A continuación, las cuentas se resuspendieron a 40 mg/ml en 2,5 ml del tampón anterior, se saturaron con argón y se añadió Tween-20 hasta una concentración del 0 1%. Las cuentas se almacenaron a
4ºC.

La estreptavidina se unió a las cuentas anteriores usando 25 mg de estreptavidina para 100 mg de cuentas. Se disolvieron 25 mg de estreptavidina (50 mg de sólido Aaston de Aaston, Wellesley, MA) en 1 ml de EDTA 1 mM, pH 7,5, y se le añadió 77 \mul de SATA a 2,5 mg/ml en etanol. La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente. Se preparó una disolución de desacetilación que contenía hidroxilamina-HCl 1 M, Na_{2}PO_{4} 50 mM, EDTA 25 mM, pH 7,0. Se añadió 0,1 ml de esta disolución de desacetilación a la disolución anterior y se incubó durante 1 hr a temperatura ambiente. La estreptavidina tiolada resultante se purificó en una columna Pharmacia PD10 y se lavó con un tampón de columna que contenía MOPS 50 mM, EDTA 50 mM, pH 7,2. El volumen de la muestra se llevó a 2,5 ml añadiendo 1,5 ml del tampón de columna anterior. La muestra se cargó en la columna y se eluyó con 3,5 ml de tampón de columna. La estreptavidina tiolada se diluyó hasta 5 ml añadiendo 1,5 ml de MOPS 50 mM, EDTA 50 mM, Tween-20 al 0,1%, pH 7,2. Se añadió 5 ml de la disolución de estreptavidina tiolada a 5 ml de las cuentas sensibilizadoras, en argón, y se mezcló bien. Las cuentas se cubrieron con argón durante 1 min, el tubo se selló y la mezcla de reacción se incubó durante toda la noche a temperatura ambiente en oscuridad.

A las cuentas anteriores se le añadió 7,5 ml de MOPS 50 mM, EDTA 50 mM, Tween-20 al 0,1%, pH 7,2 para llevar las cuentas hasta 1 mg/ml. Las maleimidas restantes se encapsularon añadiendo ácido mercaptoacético a una concentración final de 2 mM. La mezcla se incubó en oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente. Los tioles restantes se encapsularon añadiendo ácido yodoacético a una concentración final de 10 mM y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 30 min en oscuridad. Las cuentas se centrifugaron durante 30 min a 15.000 rpm como anteriormente un total de tres veces.

Ejemplo 1

En este ejemplo se estudió una deleción de 3-pb, \DeltaF508, en el exón 10 (la mutación que se produce con más frecuencia) del gen humano de la fibrosis cística (CFTR).

Muestras de ADN genómico (50 ng) (de Roche Molecular Systems, Alameda CA, excepto para el homocigótico (-/-), \DeltaF508/\DeltaF508, que era del Coriell Institute for Medical Research, Camden N.J.) se amplificaron por PCR con los siguientes cebadores:

Cebador PX2:	5'-CAAGTGAATCCTGAGCGTGA-3'	(ID SEC Nº 1) y

Cebador PX1:	5'-CTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'	(ID SEC Nº 2).

Ambos cebadores eran de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR. La amplificación se llevó a cabo en un bloque de 96 pocillos de un termociclador UNO de Biometra, Tampa, FL, para generar un producto de la PCR de una longitud de 340-pb. Después de la etapa de desnaturalización inicial (95ºC durante 4 min), se realizaron 35 ciclos que consistieron en 94ºC durante 30 segundos, 64ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min.

Los amplicones resultantes se diluyeron 1:1000, y alícuotas de 1 \mul (por 50 \mul de volumen de reacción) de estas diluciones se amplificaron en una segunda ronda de PCR (20 ciclos en las mismas condiciones que en la etapa 1) usando una mezcla de cebadores P2B (o P2D), P1 y P3. Los productos resultantes de la PCR tienen una longitud de 220-pb.

P2:	5'-CTCAGTTTTCCTGGATTATGCC-3'	(ID SEC Nº 3)

P2D:	P2 marcado con digoxigenina de Genosys Biotechnologies, Inc., Woodlands, TX.

P2B:	P2 biotinilado de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR.

P1:	5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGCTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'	(ID SEC Nº 4)
	de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR.

P3:	5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTCTAACCGATTGAATATGGAGCC-3',	(ID SEC Nº 5)
	de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR.

Las secuencias subrayadas representan la cola B1 (para el cebador P1) y la cola A1 (para el cebador P3). Pa como parte de los cebadores P1 y P3 es idéntica a PX1.

La WT1 a continuación se usó como muestra de referencia y se amplificó con los cebadores P2D, P1 y P3.

Todas las muestras de prueba se amplificaron con los cebadores P2B, P1 y P3.

En la siguiente etapa (migración de la ramificación) se mezclaron volúmenes iguales de los amplicones de prueba y de referencia y la mezcla se cubrió con aceite mineral. La mezcla de reacción se calentó durante 1 min a 95ºC (desnaturalización) seguido de 30 min a 65ºC.

La detección se llevó a cabo como sigue:

Se titularon las cuentas Acc-Ab_{Dig} y Sens-Sav con cantidades variables de las mezclas de la reacción de migración de la ramificación con relaciones variables de muestra de prueba a muestra de referencia para asegurar una respuesta lineal. Las cantidades de los componentes fueron las siguientes.

Una alícuota de 2 \mul de la mezcla de la reacción de migración de la ramificación se combinó con 100 \mul de tampón B que contenía 5 \mul (10 \mug) de Sens-Sav y 5 \mul (10 \mug) de cuentas Acc-Ab_{Dig} y se incubó durante 5 min a 37ºC. A continuación la mezcla de reacción se irradió con una lámpara de xenón de 150 W durante 3 segundos (3 ciclos de 1 segundo de iluminación y 1 segundo de tiempo de espera) y a continuación se leyó la señal.

Los resultados se resumen en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 2 Detección de mutaciones en el exón 10 del gen de la fibrosis cística

En este ejemplo los productos de amplificación marcados y con cola para la migración de la ramificación se prepararon directamente a partir de ADN genómico.

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Las secuencias subrayadas son las fracciones 5'-terminal de los cebadores P1 y P3 que no son complementarias a las secuencias diana y de referencia o entre sí.

Las muestras de prueba se amplificaron con los cebadores P2B (o P2D), P1 y P3. Los productos resultantes de la PCR tienen una longitud de 220-pb.

La amplificación de la PCR se llevó a cabo como sigue: La amplificación se llevó a cabo en un bloque de 96 pocillos de un termociclador UNO de Biometra, Tampa FL. El volumen de reacción era de 50 \mul. Después de la etapa de desnaturalización inicial (95ºC durante 4 min), se realizaron 35 ciclos que consistieron en 94ºC durante 30 segundos, 64ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min.

La migración de la ramificación se llevó a cabo como sigue: Se combinaron 2 \mul de cada una de las mezclas de reacción (después de la amplificación por PCR) y se añadió 8 \mul de tampón A que contenía MgCl_{2} 28 mM (concentración final MgCl_{2} 20 mM). La mezcla de reacción se recubrió con 5 \mul de aceite mineral incubado a 94ºC durante 2 min para desnaturalizar el ADN y se incubó adicionalmente durante 30 min a 65ºC para la formación de los dúplex parciales y el intercambio de cadenas.

El siguiente protocolo se utilizó para la detección del complejo C tetramolecular:

Se titularon las cuentas Acc-Ab_{Dig} y Sens-Sav con cantidades variables de las mezclas de la reacción de migración de la ramificación con relaciones variables de muestra de prueba a muestra de referencia para asegurar una respuesta lineal. Las cantidades óptimas de los componentes fueron las siguientes.

Los resultados se resumen en la Tabla 2.

TABLA 2

2

Ejemplo 3

En este ejemplo el protocolo directo simplificado descrito en el Ejemplo 2 para la detección de la deleción de 3-pb en \DeltaF508 se aplicó a la detección de 4 mutaciones puntuales en el exón 11. Aquí se usó ADN genómico con las siguientes mutaciones puntuales dentro del exón 11 del gen de la CFTR:

ADN heterocigótico con un alelo natural (wt) y uno de los siguientes alelos mutantes:

: G542X (sustitución de G>T) de Roche Molecular Systems, Alameda, CA;

: G551D (sustitución de G>A) de Roche Molecular Systems, Alameda, CA;

: R553X (sustitución de C>T) de Roche Molecular Systems, Alameda, CA;

: R560T (sustitución de G>C) de Roche Molecular Systems, Alameda, CA.

: ADN homocigótico:

: G542X/G542X del Coriell Institute for Medical Research, Camden, N.J.

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Se usaron dos pares diferentes de cebadores marcados y con cola para preparar los productos de amplificación para la migración de la ramificación directamente a partir de ADN genómico:

Grupo de cebadores I:

Cebador P2:	5'-TAGAAGGAAGATGTGCCTTTCA-3'	(ID SEC Nº 6)

P2D y P2B:	P2 marcado con digoxigenina y biotina, respectivamente.

Cebador P1:	5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGTTCTTAACCCACTAGCCATAAA-3'	(ID SEC Nº 7)

Cebador P3:	5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTTTCTTAACCCACTAGCCATAAA-3'	(ID SEC Nº 8)

Grupo de cebadores II:

Cebador P2:	5'-TTACATTAGAAGGAAGATGTGCCT-3'	(ID SEC Nº 9)

P2D y P2B:	P2 marcado con digoxigenina y biotina, respectivamente.

Cebador P1:	5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGGTGATTCTTAACCCACTAGCCA-3'	(ID SEC Nº 10)

Cebador P3:	5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTGTGATTCTTAACCCACTAGCCA-3'	(ID SEC Nº 11)

Las secuencias subrayadas representan las fracciones 5'-terminal de los cebadores P1 y P3 que no son complementarias a las secuencias diana y de referencia o entre sí.

Todos los cebadores son de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR.

La PCR a partir de ADN genómico, la migración de la ramificación y la detección se llevaron a cabo exactamente como se descrito en el Ejemplo 2 (se realizaron 37 ciclos de PCR). Los productos resultantes de la PCR tenían una longitud de 333 pb y 343 pb, respectivamente.

La WT1 a continuación se usó como muestra de referencia y se amplificó con los cebadores P2D, P1 y P3 del grupo de cebadores I o del grupo de cebadores II, respectivamente (grupo de cebadores I y del grupo de cebadores II, respectivamente, en la Tabla 3 a continuación).

Todas las muestras de prueba se amplificaron con los cebadores P2B, P1 y P3 del grupo de cebadores I y grupo de cebadores II, respectivamente (Grupo I y Grupo II, respectivamente, en la Tabla 3 a continuación).

TABLA 3

3

En otro experimento, las muestras de ADN genómico de prueba y de referencia se co-amplificaron con una mezcla de cebadores P2B, P2D, P1 y P3 del grupo de cebadores I. Los resultados se resumen en la Tabla 4 continuación.

TABLA 4

4

Ejemplo 4

Para hacer indetectables los productos no específicos de la PCR, se empleó un esquema de cebadores alternativo para la detección de una mutación en el exón 10 del gen humano de la fibrosis cística. Aquí, el esquema de cebadores alternativo utiliza dos cebadores antisentido P4 y P5 en los que P4 tiene una fracción 3'-terminal que se une a una cadena de la secuencia diana o de referencia en una localización aguas arriba del cebador P5. En este ejemplo, el esquema de cebadores alternativo se compara con el esquema de cebadores del Ejemplo 2.

Los cebadores P2B, P2D, P1 y P3 para el esquema de cebadores original son iguales que en el Ejemplo 2. Los cebadores para el esquema alternativo son P2B, P2D, P4 y P5. Para una comparación imparcial entre los esquemas alternativo y original los cebadores sentido en ambos esquemas son iguales y P5 es idéntico a la fracción 3' de Pa de los cebadores P1 y P3.

P2B y P2D - cebadores sentido para el exón 10, biotinilado y marcado con digoxigenina en sus extremos 5', respectivamente, en las que P2 es la secuencia siguiente:

5'-CTCAGTTTTCCTGGATTATGCC-3'

(ID SEC Nº 3)

Los cebadores antisentido (P1), (P3), (P4) y (P5), tenían las secuencias siguientes:

P1:	5'-ACCATGCTCGAGATTACGAGCTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'	(ID SEC Nº 4)
	en el que la secuencia de la cola está subrayada.

P3:	5'-GATCCTAGGCCTCACGTATTCTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'	(ID SEC Nº 5)
	en el que la secuencia de la cola está subrayada.

Las colas son B1 y A1, respectivamente, como en la Fig. 3.

P4:	5'-AGCCTAATCGTCCACGATGTATAAATATATAATTTGGGTAGTGT-3'	(ID SEC Nº 12)
	en el que la secuencia de la cola está subrayada.

P5:	5'-CTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'	(ID SEC Nº 13)

La amplificación por PCR se llevó a cabo usando un termociclador TRIO de Biometra (Tampa, FL). Se realizaron 35 ciclos de amplificación, cada uno que consta de 30 segundos a 94ºC, 1 min a 54ºC y 1 min a 72ºC. Un volumen de reacción de 20 \mul contenía 0,5 U de polimerasa Pfu termoestable de Stratagene (San Diego, CA). El volumen de reacción total para la PCR con un inicio en caliente mediado por cera fue de 40 \mul. El tampón contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM y 200 \mug/ml de BSA (tampón A).

Los cebadores (125 nM cada uno) se usaron en la amplificación por PCR para generar un amplicón de una longitud de 220 pb. Las muestras de ADN genómico homocigótico natural (wt) y un compuesto heterocigótico \DeltaF508/R553X (mut) eran del Coriell Institute for Medical Research (Camden, N.J.). En cada reacción de PCR había presente 1 ng/\mul de ADN genómico.

Después de la PCR, las muestras se desnaturalizaron térmicamente y se dejaron rehibridar y se sometieron al intercambio de cadenas por la migración de la ramificación (2 min a 94ºC seguido de 30 min a 65ºC). Este último programa se conectó con el programa de la PCR de manera que la migración de la ramificación tuvo lugar inmediatamente después de la amplificación sin necesidad de abrir los tubos.

Alícuotas de 2 \mul se mezclaron con 50 \mul de la suspensión de cuentas para el ensayo de luminiscencia inducida (25 \mug de S-Sav y 12,5 \mug de CL-Mab_{Dig} por 1 ml de tampón). Después de 30 minutos de incubación a 37ºC, se leyeron las señales del ensayo de luminiscencia inducida usando un instrumento capaz de procesar tiras de 8 tubos PCR.

La Tabla 5 ilustra la ventaja de este esquema de cebadores alternativo sobre el esquema del Ejemplo 2. Las muestras naturales y mutantes se probaron por duplicado.

TABLA 5 Señal LOCI (RLU)

5

La columna 1 confirma nuestros conocimientos previos de que se prefiere la aplicación de un procedimiento con inicio en caliente para el ensayo de inhibición de la migración de la ramificación según el diseño de cebadores del Ejemplo 2. Esencialmente no hay discriminación entre las muestras de wt y las muestras mutantes debido a un ruido muy elevado. El uso de cuentas de cera como medio para llevar a cabo el inicio en caliente da como resultado una caída considerable del ruido de fondo (wt) para este esquema de cebadores (columna 3). No obstante, el ruido aún es 2-4 veces más alto de lo habitual. Esto es debido al hecho de que la PCR se realizó con una rigurosidad muy baja: la temperatura del ciclo de hibridación de 54ºC, que es 10ºC más baja que la temperatura óptima de 64ºC para este grupo de cebadores. Se escogió esta temperatura baja para el ciclo de hibridación debido a que la región específica de secuencia del cebador P4 da la casualidad que tiene una T_{m} debido a su alto contenido en
AT.

Se observa una mejora importante cuando los cebadores antisentido se alinean según el esquema de cebadores alternativo. Incluso sin un inicio en caliente, el ruido es tan bajo como es posible (la señal generada por las cuentas sin muestra añadida). Los datos de la columna 2 ilustran esta mejora. La aplicación de un inicio en caliente no genera mejoras adicionales para este esquema de cebadores alternativo (columna 4).

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Ejemplo 5 Esquema de cebadores alternativo para diversos amplicones del exón 11 del gen de la fibrosis cística

Las condiciones de la PCR fueron iguales que las descritas anteriormente para el Ejemplo 4. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo sin inicio en caliente. Se usaron las mismas muestras de ADN genómico que en el Ejemplo 4. Se usaron dos grupos de cebadores sentido (P2) y dos grupos de cebadores antisentido (P4 y P5) para la detección de mutaciones en el exón 11 usando el esquema alternativo diseñado para reducir las señales debidas a la amplificación no específica. El uso de diferentes combinaciones de un cebador sentido y cualquiera del primer grupo o del segundo grupo de cebadores P4 y P5 permite la producción de productos de amplificación de diversas longitudes. Todos los cebadores eran de Oligos Etc., Inc., Wilsonville, OR.

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El primer grupo de cebadores sentido incluía: P2B-1 y P2D-1 - cebadores sentido para el exón 11 (columnas 1 y 3 en la Tabla 6), biotinilado y marcado con digoxigenina en sus extremos 5', respectivamente, en la que P2-1 es la secuencia siguiente:

\hskip0.2cm 5'-GCCTTTCAAATTCAGATTGAGC-3'

(ID SEC Nº 14)

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El primer grupo de cebadores antisentido (Fig. 7), P4-1 y P5-1, tenía las secuencias siguientes:

\hskip0.2cm P5-1:	5'-GACATTTACAGCAAATGCTTGC-3'	(ID SEC Nº 15)

\hskip0.2cm P4-1:	5'-AGACGACGTCTAGTCATTGCAATAGACCAATAATTAGTTATTCA-3'	(ID SEC Nº 16)
\hskip0.2cm	en el que la secuencia de la cola está subrayada.

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P2B-2 y P2D-2 - el segundo grupo de cebadores sentido para el exón 11 (columnas 2 y 4 en la Tabla 6), biotinilado y marcado con digoxigenina en sus extremos 5', respectivamente, en la que P2-2 es la secuencia siguiente:

\hskip0.2cm 5'-CAACTGTGGTTAAAGCAATAGTGT-3'

(ID SEC Nº 17)

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El segundo grupo de cebadores antisentido P4-2 y P5-2, tenía las secuencias siguientes:

\hskip0.2cm P5-2:	5'-GCACAGATTCTGAGTAACCATAAT-3'	(ID SEC Nº 18)

\hskip0.2cm P4-2:	5'-ATGACTTGCTAAGTGCTATGACTCCTCTACCAAATCTGGATACTATAC-3'	(ID SEC Nº 19)
\hskip0.2cm	en el que la secuencia de la cola está subrayada.

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En este ejemplo, se llevaron a cabo dos reacciones de PCR separadas para cada cebador antisentido (5 \mul de cada reacción se mezclaron juntos y se sometieron a condiciones de BMI: 2 min a 94ºC seguido de 30 min a 64ºC). Los datos presentados en la Tabla 6 son los siguientes: los datos de la columna 1 se obtuvieron mediante amplificación por PCR usando las siguientes combinaciones de cebadores: P2B-1, P2D-1, P4-1 y P5-1. Los datos de la columna 2 se obtuvieron mediante amplificación por PCR usando las siguientes combinaciones de cebadores: P2B-2, P2D-2, P4-1 y P5-1. Los datos de la columna 3 se obtuvieron mediante amplificación por PCR usando las combinaciones de cebadores: P2B-1, P2D-1, P4-2 y P5-2. Los datos de la columna 4 se obtuvieron mediante amplificación por PCR usando las combinaciones de cebadores: P2B-2, P2D-2, P4-2 y P5-2.

Los resultados se resumen en la Tabla 6. Ruidos aceptablemente bajos demuestran que este esquema de cebadores alternativo es aplicable a 4 amplicones diferentes del exón 11 y es superior al esquema de cebadores original que usa los cebadores P2, P1 y P3 del Ejemplo 3, porque se comporta bien a una rigurosidad de la PCR baja (temperatura del ciclo de hibridación de 54ºC frente a los 64ºC usados normalmente para los respectivos cebadores del Ejemplo 3) y, al menos para estos amplicones particulares, no requiere un inicio en caliente.

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TABLA 6 LOCI Señal (RLU)

6

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Ejemplo 6 Optimización de la relación de los dos cebadores antisentido en el esquema de cebadores alternativo

Este ejemplo presenta el resultado de un estudio diseñado para la optimización de la relación de estos cebadores para la detección óptima de mutaciones en el exón 11 del gen de la fibrosis cística. Las muestras de ADN para este ejemplo son iguales que para el ejemplo previo, y los cebadores usados son los cebadores P2B-1, P2D-1, P4-1 y P5-1 de ese ejemplo.

Los cebadores P4 y P5 usados en el esquema de cebadores alternativo (Fig. 7) compiten entre sí en la PCR como se ha descrito anteriormente. Por tanto, se desea su comportamiento equilibrado en una mezcla y puede depender de sus parámetros termodinámicos relativos. Idealmente, para maximizar el rendimiento de las estructuras de cuatro cadenas que generan señales, las cantidades de los amplicones generados por el cebador sentido, P2, y cada uno de los dos cebadores antisentido, P4 y P5, deberían ser iguales. Por tanto, el valor absoluto de la señal en un ensayo de luminiscencia inducida es un buen criterio para optimizar la relación. Por ejemplo, la ausencia de señal para los mutantes (siempre que no falle la amplificación, valorada por electroforesis en gel) significa que uno de los cebadores antisentido se hace cargo completamente. En un experimento de optimización típico, se examinan varias relaciones de concentraciones diferentes de cebador P5 a cebador P4 a diversas temperaturas del ciclo de hibridación de la PCR (T_{a}).

Un ejemplo de tal experimento se muestra a continuación (Tabla 7) para la detección de mutaciones en el exón 11. Cada uno de los cebadores P2B-1 y P2D-1 estaba presente a 125 nM. La concentración total de los dos cebadores antisentido (P4-1 + P5-1) era de 250 nM.

TABLA 7

7

La Tabla 7 muestra que el cebador corto más externo, P5, debe estar presente a concentraciones superiores (3-20 veces) que el cebador largo más interno, P4, a pesar de una T_{m} superior y la estabilidad 3'-terminal de este último (estos parámetros difieren en 13ºC y -1,6 kcal/mol, respectivamente). A T_{a} superiores se alcanza el óptimo a relaciones inferiores. Experimentos similares con otros amplicones demuestran que normalmente se puede conseguir un comportamiento equilibrado de los dos cebadores antisentido variando sus concentraciones relativas.

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Ejemplo 7 Comportamiento del esquema de BMI alternativo para la detección de una mutación en el exón 10 del gen de la CFTR, usando cebadores antisentido no contiguos

Para demostrar que los pares de cebadores con cola/sin cola no necesitan ser contiguos para que el esquema alternativo funcione, se diseñaron tres cebadores antisentido con cola, P4: (1) P4-1 - que se une a un sitio contiguo al sitio unido por el cebador sin cola P5; (2) P4-2 - que se une a un sitio que está separado del sitio unido por el mismo cebador sin cola (una separación de 15 bases del sitio de unión del cebador P5); (3) P4-3 - que se une a un sitio que se superpone al sitio unido por el cebador sin cola (una superposición de 7 bases con el sitio de unión del cebador P5).

En este ejemplo particular, se usaron los cebadores sentido marcados P2B y P2D con cada cebador antisentido, con cola o sin cola, para amplificar por separado la secuencia deseada, una fracción del exón 10 del gen de la CFTR. Los amplicones producto se mezclaron para el análisis posterior por BMI como se describirá a continuación. Todos los cebadores eran de Oligos Etc. Inc., Wilsonville, OR.

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P2B y P2D - los cebadores sentido para el exón 10, biotinilado y marcado con digoxigenina en sus extremos 5', respectivamente, tienen la siguiente secuencia:

5'-CTCAGTTTTCCTGGATTATGCC-3'

(ID. SEC Nº. 3)

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Los cebadores antisentido con cola (P4-1), (P4-2), y (P4-3), tienen las siguientes secuencias:

P4-1 -	5'-AGCCTAATCGTCCACGATGTATAAATATATAATTTGGGTAGTGT-3'	(ID SEC Nº 20)
	en el que la cola está subrayada.

P4-2 -	5'-AGCCTAATCGTCCACGATGTATGTAGTGTGAAGGGTTCATA-3'	(ID SEC Nº 21)
	en el que la cola está subrayada.

P4-3 -	5'-AGCCTAATCGTCCACGATGTATTGGAGCCAAATATATAATT-3'	(ID SEC Nº 22)
	en el que la cola está subrayada.

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El cebador antisentido sin cola, P5, tiene la siguiente secuencia:

P5 -

5'-CTAACCGATTGAATATGGAGCC-3'

(ID SEC Nº 23).

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La amplificación por PCR se llevó a cabo usando un termociclador TRIO de Biometra (Tampa, FL). Se realizaron 35 ciclos de amplificación, cada uno que consta de 30 segundos a 94ºC, 1 min a 54ºC y 1 min a 72ºC. Un volumen de reacción de 20 \mul contenía 0,2 U de polimerasa Pfu termoestable de Stratagene (San Diego, CA). No se empleó el procedimiento de inicio en caliente. El tampón contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM y 200 \mug/ml de BSA (tampón A).

Se usó el par marcado P2B/P2D en la amplificación por PCR con P4-1, P4-2, P4-3, o P5 (todos los cebadores usados a 125 nM cada uno), para generar amplicones de 200, 184, 207, y 200 pb, respectivamente. Las muestras de ADN genómico homocigótico natural (wt) y un compuesto heterocigótico \DeltaF508/R553X (mut) se adquirieron en Coriell Institute for Medical Research (Camden, N.J.). En cada reacción de PCR había presente 20 ng de ADN genómico.

Después de la PCR, alícuotas de 5 \mul de cada reacción que contenía P5 se mezclaron con 5 \mul de la mezcla de reacción correspondiente que contenía P4-1. Asimismo, alícuotas de 5 \mul de cada reacción que contenía P5 se mezclaron con 5 \mul de la mezcla de reacción correspondiente que contenía P4-2, y alícuotas de 5 \mul de cada reacción que contenía P5 se mezclaron con 5 \mul de la mezcla de reacción correspondiente que contenía P4-3. Cada nueva mezcla de muestras se desnaturalizó térmicamente, se dejó rehibridar, y se sometió al intercambio de cadenas por migración de la ramificación (2 min a 94ºC seguido de 30 min a 65ºC).

Alícuotas de 2 \mul de cada mezcla de reacción se mezclaron con 50 \mul de la suspensión de cuentas para el ensayo de luminiscencia inducida (2,325 \mug de S-Sav y 1,125 \mug de CL-Acc-Ab_{Dig} cada uno). Después de 30 minutos de incubación a 37ºC, se leyeron las señales del ensayo de luminiscencia inducida usando un instrumento capaz de procesar tiras de 8 tubos PCR.

La Tabla 8 ilustra la eficacia del uso del esquema de cebadores alternativo con la amplificación separada de cebadores contiguos o no contiguos. Las muestras naturales y mutantes se probaron por triplicado:

TABLA 8

8

Las señales anteriores demuestran claramente que se puede usar la amplificación separada de pares de cebadores no contiguos en un esquema de cebadores alternativo. Como se puede observar, todos de los tres grupos de pares de cebadores dieron como resultado una buena discriminación entre las señales observadas con las muestras mutantes y aquellas observadas con las muestras naturales, con relaciones de 38,6, 27,0, y 21,6, para los cebadores contiguos, los cebadores separados, y los cebadores superpuestos, respectivamente.

Ejemplo 8 Optimización del comportamiento del esquema BMI alternativo para la detección de una mutación en el exón 10 del gen de la CFTR, usando cebadores antisentido no contiguos

El objetivo del presente ejemplo es demostrar que pares de cebadores no contiguos, P4 y P5 de la CFTR, pueden funcionar cuando se combinan en el mismo tubo de reacción. Cada uno de los cebadores P5/P4-1 (par contiguo), P5/P4-2 (par separado), y P5/P4-3 (par superpuesto) se usó en combinación con el par de cebadores sentido marcados, P2B/P2D, para amplificar la secuencia deseada, una fracción del exón 10 del gen de la CFTR. Para optimizar la co-amplificación usando los dos cebadores antisentido, se emplearon diversas relaciones de concentración de los pares de cebadores antisentido.

Las secuencias de los cebadores sentido marcados, P2B y P2D, y P4, los cebadores antisentido con cola, P4-1, P4-2, P4-3, y P5, el cebador antisentido sin cola, se listan y se describen en el Ejemplo 7.

La amplificación por PCR se llevó a cabo usando un termociclador T3 de Biometra (Tampa, FL). Se realizaron 38 ciclos de amplificación, cada uno que consta de 30 segundos a 94ºC, 1 min a 54ºC y 1 min a 72ºC. Un volumen de reacción de 18 \mul contenía 0,36 U de polimerasa Pfu termoestable de Stratagene (San Diego, CA). El volumen de reacción total para la PCR con un inicio en caliente mediado por cera fue de 36 \mul. El tampón contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM y 200 \mug/ml de BSA (tampón A).

Los cebadores P2B/P2D marcados (125 nM de cada cebador sentido) se usaron en la amplificación por PCR con relaciones variables del par P5/P4-1, del par P5/P4-2, y del par P5/P4-3 (todos los pares de cebadores antisentido se usaron a un total de 250 nM), para generar dos amplicones cada uno de 200 pb/200 pb, 184 pb/200 pb, y 207 pb/200 pb, respectivamente. Las relaciones del cebador sin cola (P5) al cebador con cola correspondiente (P4-1, P4-2, o P4-3) usadas en las reacciones de amplificación fueron de 1:3, 1:1, 3:1, y 9:1. Las muestras de ADN genómico homocigótico natural (wt) y un compuesto heterocigótico \DeltaF508/R553X (mut) se adquirieron en el Coriell Institute for Medical Research (Camden, N.J.). En cada una de las respectivas reacciones de PCR había presente 36 ng de cada una de las muestras de ADN genómico.

Después de la PCR, las muestras se desnaturalizaron térmicamente y se dejaron rehibridar y se sometieron al intercambio de cadenas por migración de la ramificación (2 min a 94ºC seguido de 30 min a 65ºC). Este último programa se conectó con el programa de la PCR permitiendo la migración de la ramificación inmediatamente después de la amplificación sin necesidad de abrir los tubos.

Alícuotas de 2 \mul de cada mezcla de reacción se mezclaron con 50 \mul de la suspensión de cuentas para el ensayo de luminiscencia inducida (2,325 \mug de Sens-Sav y 1,125 \mug de Acc-Ab_{Dig} cada uno). Después de 30 minutos de incubación a 37ºC, se leyeron las señales del ensayo de luminiscencia inducida usando un instrumento capaz de procesar tiras de 8 tubos PCR.

La Tabla 9 ilustra la optimización y la eficacia del uso del esquema de cebadores alternativo con la amplificación simultánea de pares de cebadores contiguos o no contiguos en el mismo tubo. Las muestras naturales y mutantes se probaron por duplicado:

TABLA 9

9

Las señales anteriores demuestran que se puede usar la amplificación simultánea de pares de cebadores contiguos y no contiguos en el mismo tubo en el esquema de cebadores alternativo. Como se puede observar, se optimizaron las relaciones de los tres pares de cebadores antisentido, dando como resultado la discriminación aceptable entre las señales observadas con muestras mutantes y aquellas observadas con muestras naturales para al menos una condición, cada uno. Esto es, con el par de cebadores contiguos, P5/P4-1, se observó una buena discriminación con una relación de P5 a P4-1 de 1:1, mientras que se observó una discriminación aceptable cuando se emplea una relación 3:1 de P5 a P4-2 para el par separado, o una relación 1:1 de P5 a P4-3 para el par superpuesto. Estos resultados demuestran la viabilidad del uso de pares de cebadores separados o superpuestos diseñados para este esquema alternativo.

La descripción anterior incluye ciertas teorías en lo que se refiere a los mecanismos involucrados en la presente invención. Estas teorías no se deben interpretar como una limitación de la presente invención de ninguna manera, puesto que se ha demostrado que la presente invención consigue los resultados descritos.

La descripción y ejemplos anteriores describen completamente la invención incluyendo sus formas de realización preferidas. Las modificaciones de los procedimientos descritos que son obvias para los expertos habituales en la materia tales como biología molecular y ciencias relacionadas está previsto que estén dentro del alcance de las reivindicaciones.

<110> Dade Behring Inc.

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<120> Detección de diferencias en ácidos nucleicos por inhibición de la migración espontánea de la ramificación de ADN

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<130> BEH-7419 PCT

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<140> PCT/USOO/

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<141> 08-15-2000

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<150> 09/376.097

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<151> 1999-08-17

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<160> 23

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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 20

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<212>ADN

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<213> Humano

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<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caagtgaatc ctgagcgtga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaccgatt gaatatggag cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcagttttc ctggattatg cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatgctcg agattacgag ctaaccgatt gaatatggag cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)... (42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctaggc ctcacgtatt ctaaccgatt gaatatggag cc

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagaaggaag atgtgccttt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)... (42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatgctcg agattacgag ttcttaaccc actagccata aa

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctaggc ctcacgtatt ttcttaaccc actagccata aa

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(24)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttacattaga aggaagatgt gcct

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatgctcg agattacgag gtgattctta acccactagc ca

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(42)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcctaggc ctcacgtatt gtgattctta acccactagc ca

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(44)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctaatcg tccacgatgt ataaatatat aatttgggta gtgt

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(22)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaccgatt gaatatggag cc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctttcaaa ttcagattga gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatttaca gcaaatgctt gc

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agacgacgtc tagtcattcg aatagaccaa taattagtta ttca

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(24)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactgtggt taaagcaata gtgt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacagattc tgagtaacca taat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgacttgct aagtgctatg actcctctac caaatctgga tactatac

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(44)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctaatcg tccacgatgt ataaatatat aatttgggta gtgt

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(41)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctaatcg tccacgatgt atgtagtgtg aagggttcat a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unión del cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(41)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctaatcg tccacgatgt attggagcca aatatataat t

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctaaccgatt gaatatggag cc

\hfill

22

Claims

1. Un procedimiento para detectar la presencia de una diferencia entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico de referencia, que comprende:

(a) la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana mediante la reacción en cadena de la polimerasa, usando un cebador P2, un cebador P4 con una región 3' capaz de hibridarse a la secuencia diana y una región T en la cola 5' que no es complementaria a la secuencia diana, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia diana en una localización en dirección 3' de la secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4;

en el que bien:

el cebador P2 es una mezcla del cebador P2 con un primer marcador y el cebador P2 con un segundo marcador, o

bien el cebador P4 tiene un primer marcador y el cebador P5 tiene un segundo marcador;

(b) la formación de un dúplex parcial diana con cola de la secuencia diana, dicho dúplex parcial que tiene uno de dicho primer marcador o dicho segundo marcador, y una cola de dos regiones no complementarias en la que una primera región es la secuencia P5 o su complemento y la segunda región es la secuencia T o su complemento;

(c) la amplificación de la secuencia de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa, usando un cebador P2, un cebador P4 con una región 3' capaz de hibridarse a la secuencia de referencia y una región T en la cola 5' que no es complementaria a la secuencia de referencia, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia de referencia sustancialmente adyacente, en dirección 3', a la secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4;

en el que bien:

(d) la formación de un dúplex parcial diana con cola de la secuencia de referencia, dicho dúplex parcial que tiene uno de dicho primer marcador o dicho segundo marcador, y una cola de dos cadenas no complementarias en la que una primera cadena es la secuencia P5 o su complemento y la segunda cadena es la secuencia T o su complemento;

(e) la formación de un complejo que comprende dicha secuencia diana con cola y dicha secuencia de referencia con cola en forma de doble cadena, en el que dicho complejo comprende al menos un par de dichas cadenas no complementarias y cada una de dicha secuencia diana con cola y dicha secuencia de referencia con cola tiene uno de dichos marcadores,

(f) la detección de la asociación de dichos marcadores como parte de dicho complejo, dicha asociación que se relaciona con la presencia de la diferencia.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dichos marcadores se seleccionan del grupo constituido por oligonucleótidos, enzimas, colorantes, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, coenzimas, sustratos enzimáticos, grupos radiactivos, moléculas orgánicas pequeñas y superficies sólidas.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia en la diana o la referencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4 está inmediatamente adyacente a una secuencia de la diana o la referencia capaz de hibridarse al cebador P5.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia en la diana o la referencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4 se superpone parcialmente con una secuencia de la diana o la referencia capaz de hibridarse al cebador P5.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia en la diana o la referencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4 no está adyacente a una secuencia de la diana o la referencia capaz de hibridarse al cebador P5.

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de amplificación (c) se lleva a cabo en el mismo medio de reacción que aquel usado para la etapa (a).

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer marcador es el mismo que el segundo marcador.

8. Un procedimiento de preparación de un dúplex parcial de ADN con una fracción en uno de sus extremos que tiene dos secuencias predefinidas no complementarias de cadena sencilla, el procedimiento que comprende:

combinar en una primera combinación un ácido nucleico, una polimerasa, nucleósido trifosfatos y los cebadores P2 y P5, en el que dicho cebador P2 es capaz de hibridarse y es extensible a lo largo de una primera cadena del ácido nucleico, y dicho cebador P5 es capaz de hibridarse y es extensible a lo largo de una segunda cadena del ácido nucleico,

combinar en una segunda combinación dicho ácido nucleico, dicha polimerasa, y dichos nucleósido trifosfatos, dicho cebador P2 y el cebador P4 con una fracción 3' capaz de hibridarse a dicha segunda cadena, y una fracción T en la cola 5' que no es complementaria a dicha primera cadena o dicha segunda cadena, dicha fracción 3' del cebador P4 que es capaz de hibridarse a dicha segunda cadena en una localización en dirección 5' de una secuencia capaz de hibridarse a dicho cebador P5;

someter dichas primera y segunda combinaciones a ciclos de temperatura para extender dichos cebadores,

combinar dicha primera combinación con dicha segunda combinación para formar un dúplex parcial de ADN con secuencias de T no complementarias de cadena sencilla o su complemento y P5 o su complemento.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha primera combinación y dicha segunda combinación se combinan antes de someter dichas combinaciones a ciclos de temperatura.

10. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha secuencia capaz de hibridarse al cebador P5 está inmediatamente adyacente a una secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

11. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha secuencia capaz de hibridarse al cebador P5 se superpone con una secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

12. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicha secuencia capaz de hibridarse al cebador P5 no está adyacente a una secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

13. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que bien:

bien el cebador P5 tiene un primer marcador y el cebador P4 tiene un segundo marcador.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que dichos marcadores se seleccionan del grupo constituido por oligonucleótidos, enzimas, colorantes, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, coenzimas, sustratos enzimáticos, grupos radiactivos, moléculas orgánicas pequeñas y superficies sólidas.

15. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que el primer marcador es el mismo que el segundo marcador.

16. Un procedimiento para detectar la presencia de una mutación en una secuencia de ácido nucleico diana que comprende:

(a) combinar en un vaso de reacción para preparar una mezcla diana:

(1): la secuencia diana sospechosa de tener la mutación;

(2): un cebador P2 que es capaz de hibridarse a una primera cadena de la secuencia diana,

(3): un cebador P5 que es capaz de hibridarse a una segunda cadena de la secuencia diana,

(4): un cebador P4 con una región 3' capaz de hibridarse a dicha segunda cadena de la secuencia diana y una región T en la cola 5' que no es complementaria a dicha segunda cadena de la secuencia diana, en el que una región sobre la segunda cadena que es capaz de hibridarse a la región 3' de P4 está localizada en dirección 5' de una región de la segunda cadena capaz de hibridarse a P5,

(5): una polimerasa y nucleósido trifosfatos;

(b) extender dichos cebadores a lo largo de dicha secuencia diana;

(c) formar dúplex parciales diana con una cola de dos secuencias no complementarias, dichas secuencias no complementarias que son P5 y T o los complementos de P5 y T;

(d) combinar en un vaso de reacción para preparar una mezcla de referencia:

(1): una secuencia de ácido nucleico de referencia, dicha secuencia de referencia que es sustancialmente idéntica a la secuencia diana excepto por la presencia potencial de la mutación en la secuencia diana;

(2): dicho cebador P2,

(3): dicho cebador P5,

(4): dicho cebador P4, y

(5): una polimerasa y nucleósido trifosfatos;

(e) extender dichos cebadores a lo largo de la secuencia de referencia;

(f) formar dúplex parciales de referencia con una cola de dos secuencias no complementarias, dichas secuencias no complementarias que son P5 y T o los complementos de P5 y T;

(g) combinar dichos dúplex parciales diana con dichos dúplex parciales de referencia;

(h) hibridar las secuencias de la cola no complementarias del dúplex parcial diana con las secuencias de la cola no complementarias del dúplex parcial de referencia para formar un complejo tetramolecular;

(i) someter dicho complejo tetramolecular a condiciones para el intercambio de cadenas en la que, si existe la diferencia entre las secuencias diana y de referencia, se detiene el intercambio de cadenas, y en la que si no existe diferencia, el intercambio de cadenas prosigue hasta que se produzca el intercambio completo de las cadenas;

(j) detectar la presencia de dicho complejo, cuya presencia se relaciona con la existencia de la mutación.

17. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que bien:

y dicha presencia de dicho complejo se detecta determinando la asociación de dichos marcadores.

18. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dichos marcadores se seleccionan del grupo constituido por oligonucleótidos, enzimas, colorantes, moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, coenzimas, sustratos enzimáticos, grupos radiactivos, moléculas orgánicas pequeñas y superficies sólidas.

19. El procedimiento de la reivindicación 17, en el que dicha asociación de dichos marcadores se detecta mediante un ensayo de luminiscencia inducida.

20. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la región capaz de hibridarse al cebador P5 está inmediatamente adyacente a dicha región capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

21. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la región capaz de hibridarse al cebador P5 se superpone con dicha región capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

22. El procedimiento según la reivindicación 16, en el que la región capaz de hibridarse al cebador P5 no está adyacente a dicha región capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

23. El procedimiento según en la reivindicación 16, en el que dicha mezcla diana y la mezcla de referencia se combinan en el mismo vaso de reacción.

24. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que el primer marcador es el mismo que el segundo marcador.

25. Un procedimiento para detectar la presencia de una diferencia entre una secuencia de ácido nucleico diana y una secuencia de ácido nucleico de referencia, en el que dicha diferencia se detecta por la presencia de un complejo tetramolecular que comprende un dúplex parcial con cola de la secuencia diana y dúplex parcial con cola de la cadena de referencia, dicho procedimiento que comprende:

formar el dúplex parcial diana con cola y el dúplex parcial de referencia con cola amplificando las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando un cebador P2, un cebador P4 con una fracción 3' capaz de hibridarse a la secuencia diana o a la secuencia de referencia y una fracción T en la cola 5' que no es complementaria a la secuencia diana o la secuencia de referencia, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia diana o la secuencia de referencia en una localización en dirección 3' de una secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4.

26. Un complejo tetramolecular de una secuencia diana de ácidos nucleicos de doble cadena con una mutación y una secuencia de referencia de ácidos nucleicos de doble cadena, el complejo que se prepara mediante las etapas que comprenden:

(a) amplificar las secuencias de ácidos nucleicos diana y de referencia mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando un cebador P2, un cebador P4 con una región 3' que es capaz de hibridarse a la secuencia de referencia y una región T en la cola 5' que no es complementaria a la secuencia diana o la secuencia de referencia, y un cebador P5 que es capaz de hibridarse a la secuencia diana o la secuencia de referencia en una localización en dirección 3' de una secuencia capaz de hibridarse a dicha fracción 3' del cebador P4;

(b) formar dúplex parciales de la secuencia diana y la secuencia de referencia que tienen colas de dos cadenas no complementarias en la que una primera cadena es la secuencia P5 o su complemento y la segunda cadena es la secuencia T o su complemento;

(c) formar el complejo hibridando dichas cadenas de dicha cola del dúplex parcial de referencia con dichas cadenas de dichas colas del dúplex parcial diana.

27. El complejo tetramolecular de la reivindicación 26, en el que complejo es detectable debido a la presencia de marcadores sobre las cadenas no complementarias de las secuencias diana y de referencia, y en el que además bien:

bien el cebador P4 tiene un primer marcador y el cebador P5 tiene un segundo marcador.

28. Un kit para detectar una mutación en un ácido nucleico diana, dicho kit que comprende en forma envasada:

(a) un ácido nucleico de referencia, dicha referencia que incluye una secuencia de ácido nucleico idéntica a dicha secuencia de ácido nucleico diana excepto por la presencia de la mutación en la diana,

(b) un cebador P2 que es extensible a lo largo de una primera cadena de la diana y dicha referencia;

(c) un cebador P5 que es extensible a lo largo de una segunda cadena de la diana y referencia;

(d) un cebador P4 con una fracción 3' capaz de hibridarse a dicha segunda cadena de la diana y referencia, y una fracción T en la cola 5' que no es complementaria a dicha primera cadena o dicha segunda cadena, dicha fracción 3' del cebador P4 que es capaz de hibridarse a dicha segunda cadena en una localización en dirección 5' de una secuencia capaz de hibridarse a dicho cebador P5.

29. El kit según la reivindicación 28 que comprende adicionalmente una polimerasa y nucleósido trifosfatos.

30. El kit según la reivindicación 28 en el que bien: