ES2281659T3 - Substancias marcadoras y su utilizacion en metodos de diagnostico. - Google Patents

Abstract

Procedimiento de diagnosis in vitro aplicado a una muestra de orina de un sujeto para la determinación de la manipulación abusiva de la muestra a diagnosticar por parte del sujeto, en el cual le son administradas al sujeto las sustancias marcadoras PEG (polietilenglicoles) que son no metabolizables o tan sólo escasamente metabolizables y diagnosticables en la orina; caracterizado por el hecho de que además de las sustancias marcadoras anteriormente mencionadas le fue al mismo tiempo y adicionalmente administrada al sujeto una sustancia metabolizable del grupo de los derivados del ácido benzoico y del ácido 4-hidroxibenzoico que puede ser determinada en el mismo cromatograma con las sustancias marcadoras de PEG no metabolizables y tras el metabolismo ya no puede ser determinada en la muestra en la que se analizan las sustancias marcadoras.

Description

Substancias marcadoras y su utilización en métodos de diagnóstico.

La invención se refiere a un procedimiento de diagnosis in vitro aplicado a una muestra de orina de un sujeto para la determinación de la manipulación abusiva de la muestra a diagnosticar por parte del sujeto según el preámbulo de la reivindicación 1.

Para la terapia de pacientes drogadictos han sido introducidos los llamados programas de metadona y de heroína. A los sujetos que participan en los mismos les está prohibido el consumo de otros estupefacientes y drogas ilegales, estando legalmente prescritos estrictos controles del llamado consumo paralelo en la orina. Ante todo el consumo paralelo de opiáceos y cocaína debe ser conocido para la valoración de la necesidad de medicación substitutiva [S. T. Chermack et al., Drug Alcohol Depend 59 (2000) 43-49]. El continuado consumo paralelo pone en peligro la consecución del objetivo que se persigue con el tratamiento, que no es otro que el de la plena abstinencia del consumo de drogas y engloba a los de evitar la sintomatología aguda de abstinencia, evitar los casos de muerte asociados a los opiáceos, reducir el riesgo de infección con virus de la inmunodeficiencia humana y de la hepatitis, proteger a la población frente a la criminalidad asociada a la adquisición de drogas y lograr la resocialización y la reintegración profesional. Ante todo debido al creciente número de casos de muerte asociados a la metadona [Die Beauftragte der Bundersregierung. Sucht- und Drogenbericht 2001. Bundesministerium für Familie und Gesundheit, Berlín, abril 2002], el frecuente y demostrado consumo paralelo puede conducir según prescripción legal a la exclusión del respectivo programa de medicación substitutiva [Bundesausschu\beta der Ärzte und Krankenkassen: Richtlinien des Bundesausschusses der Ärzte und Krankenkassen zur substitutionsgestützten Behandlung Opiatabhängiger. Colonia, 1999]. Por consiguiente, por parte de los drogadictos hay gran interés en lograr resultados falso-negativos en la analítica de drogas en la orina. Habitualmente esto puede conseguirse bebiendo en exceso con la finalidad de lograr una fuerte dilución de la orina, mezclando con la orina sustancias perturbadoras preanalíticas con alto potencial de adulteración [S.L. Mikkelsen et al., Clin. Chem. 34 (1988) 2333-2336] o bien sustituyendo la propia orina por una orina con contenido de metadona pero exenta de drogas que puede adquirirse en el mercado. Cada nuevo procedimiento de determinación de drogas es inmediatamente contrarrestado desde el escenario de las drogas mediante la adopción de contramedidas. La competencia entre el escenario y la analítica puede documentarse y seguirse a través de publicaciones especializadas en revistas tales como "High Times". Una misión de la analítica de drogas es la que consiste en detectar e inutilizar en la medida de lo posible estas adulteraciones y maniobras fraudulentas llevadas a cabo con riqueza de ideas y con un alto nivel de conocimientos.

El documento DE 101 12 470 A1 describe un procedimiento de marcación endógena de mamíferos del que se dice que permite establecer una correspondencia inequívoca entre un fluido corporal, una secreción, una muestra de tejido o un excremento y un individuo. Dicho procedimiento consiste en la administración oral o parenteral de sustancias no metabolizables o tan sólo escasamente metabolizables y su subsiguiente determinación analítica como tales o bien en forma de sus metabolitos en los materiales de muestra anteriormente mencionados. Este enfoque ha quedado ya acreditado en la rutina clínica con marcadores de polietilenglicol (PEG) para la supervisión de los sujetos drogodependientes que reciben terapia de sustitución con metadona. Los sujetos beben 100 ml de la solución bebible de metadona mezclada con sustancias marcadoras, y después de un tiempo de espera de 30 a 60 minutos entregan su orina. Ésta es centrifugada y analizada mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en columna Nucleosil C18, 3 \mum, 125 mm x 4,6 mm DI con una mezcla de metanol y agua (44% / 56%) a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min. La preparación de la muestra se efectúa automáticamente en línea mediante cambio de columna en Nucleosil C18 5 \mum, 60 mm x 4,6 mm DI, y la caracterización de los marcadores en el eluido se efectúa mediante detección del índice de refracción (RID).

También este procedimiento de marcación endógena es susceptible de manipulación. Los sujetos que son atendidos por las ambulancias de dispensación de metadona lo inutilizan escupiendo restos de la solución bebible en orina exenta de droga o escupiendo en una orina exenta de sustancias de consumo paralelo el contenido de una bola de algodón en rama impregnada con solución bebible que llevan en la boca.

Es además conocido un procedimiento (US 5 179 027) en el que le son administradas al sujeto distintas sustancias marcadoras que son ambas detectables en la orina. En trabajosas diagnosis que exigen la utilización de personal que cuente con la debida formación deben determinarse cuantitativamente ambas sustancias marcadoras con respecto a la cantidad y a la relación entre sí. Se indica como de 24 h un marco temporal sólo para la entrega de la secreción. Además, las dosificaciones y combinaciones para los distintos individuos deben variarse y documentarse con los puntos en el tiempo en los que se efectúan las administraciones. Una vez concluido el periodo de recogida se registran la cantidad y la fecha y hora de recogida.

Como marca para la correspondencia de una muestra a un individuo se utiliza la creatinina como sustancia no metabolizable propia del cuerpo, que para diferenciarla de la creatinina propia del cuerpo y para incrementar la cantidad de marcadores está marcada con distintos isótopos estables no radiactivos. Para la ingestión de estos isótopos son necesarias tan sólo trazas para sobrepasar el límite inferior de determinación del análisis por cromatografía de gases/espectrografía de masas. La verificación de la integridad de una muestra se efectúa mediante la determinación cuantitativa de la sustancia marcadora parcialmente metabolizable PABA (ácido p-aminobenzoico), sus estereoisómeros, sus sales y sus metabolitos.

En la aplicación de este procedimiento conocido, la contaminación de una orina ajena con solución bebible con marcadores es detectable mediante la determinación del PABA y de sus derivados.

Aquí es donde interviene la invención. En consecuencia, la invención persigue la finalidad de aportar un procedimiento de diagnosis in vitro mediante el cual puedan descubrirse las manipulaciones dentro del marco de la marcación endógena. Las sustancias marcadoras utilizadas para ello ventajosamente no deben representar una agresión adicional para el sujeto, y además no deben ocasionar costes adicionales en cuanto a materiales y al personal.

Esta finalidad es alcanzada mediante la invención con el procedimiento de diagnosis in vitro según la reivindicación 1. Se indica en la reivindicación 2 una configuración ventajosa del mismo.

En el procedimiento de diagnosis in vitro según la invención, además de las sustancias marcadoras de PEG no metabolizables o tan sólo escasamente metabolizables se le administra al sujeto una sustancia metabolizable del grupo de los derivados del ácido benzoico y del ácido 4-hidroxibenzoico que puede ser determinada en el mismo cromatograma con las sustancias marcadoras de PEG no metabolizables y tras el metabolismo ya no es detectable en la muestra.

Las sustancias marcadoras que le son adicionalmente administradas al sujeto son metabolizadas en el cuerpo, con lo cual ya no están presentes en la orina. Al intentar el sujeto manipular la correspondencia escupiendo en la orina, puede detectarse ahí la sustancia marcadora, con lo cual puede impedirse con seguridad la manipulación. Por este motivo constituye una acertada caracterización la expresión "marcador en saliva".

Así pues, cuando se mezclan con la solución bebible como marcadores en saliva sustancias metabolizables que habitualmente no están presentes en las orinas, su determinación ahí permite descubrir con seguridad una maniobra fraudulenta.

Ciertamente, el documento DE 101 12 470 A1 menciona que pueden tomarse muestras de saliva. Pero la toma de muestras ahí descrita sirve para la identificación de sustancias tomadas ilegalmente, así como para establecer la correspondencia entre la muestra y un individuo, y no puede proporcionar la prueba de intenciones fraudulentas con respecto a la correspondencia de la muestra.

Son ideales marcadores en saliva sustancias metabolizables que están autorizadas como aditivos para comestibles y fármacos. Tras la toma oral, dichas sustancias no están normalmente presentes en forma intacta en la orina. Hay intención de adulterar el resultado del análisis cuando se determina en el análisis de marcadores en la orina la sustancia utilizada como "marcador en saliva".

Las sustancias marcadoras en saliva según la invención son fácilmente solubles en la solución bebible. A las concentraciones necesarias, dichas sustancias no tienen efecto farmacológico alguno, color vistoso alguno ni sabor intenso alguno. Cromatográficamente dichas sustancias se comportan de manera similar al comportamiento de las sustancias marcadores de PEG que se utilizan.

Las sustancias marcadoras en saliva según la invención son fácilmente determinables mediante los procedimientos de análisis y detección que están establecidos en los laboratorios clínico-químicos.

Las sustancias marcadoras en saliva de la invención están definidas en las reivindicaciones 1 y 2.

Son sustancias marcadoras preferidas los llamados Ésteres Nipa 4-hidroxibenzoato de metilo, de etilo y de propilo, que están autorizados como conservantes. La solución bebible de metadona debe ser conservada, y cuando se utilizan los conservantes anteriormente mencionados no se produce agresión adicional alguna de los sujetos ni se dan costes adicionales de tipo alguno. De los conservantes anteriormente mencionados el más adecuado es el 4-hidroxibenzoato de metilo (MHB), puesto que las propiedades cromatográficas de esta sustancia son muy similares a las de los marcadores de PEG. Este compuesto es eluido por la columna junto con los marcadores de PEG, no siendo necesarios adicionales pasos de análisis.

El 4-hidroxibenzoato de metilo, también llamado metilparaben y Nipagin-M®, está autorizado como aditivo para comestibles y fármacos con el número E 218 (Lista Roja). Este compuesto se usa ante todo para la conservación de preparaciones farmacéuticas tales como colirios, pomadas y emulsiones, y debido a su baja toxicidad está autorizado para la conservación de comestibles.

Además de la aplicación en las ambulancias de dispensación de metadona, los "marcadores en saliva" pueden utilizarse dentro del marco de la marcación endógena en todos los sectores de la medicina humana y veterinaria en los cuales haya interés en querer enmascarar con intencionalidad fraudulenta la procedencia de muestras y en los que haya la posibilidad de contaminar muestras con la sustancia marcadora. De esta manera son controlables todos los colectivos predispuestos al fraude que se mencionan en el documento DE 101 12 470 A1. Son ejemplos de los mismos, entre otros, el control antidoping en el deporte de alta competición y en las competiciones de animales, la supervisión del tráfico rodado y del transporte de personas, la supervisión de la continuada abstinencia del consumo de drogas para la renovación del permiso de conducir, los análisis para la contratación de empleados (Decreto Reagan), los análisis médicos personales y los controles veterinarios.

El análisis de marcadores en saliva se efectúa dentro del marco de la marcación endógena junto con los marcadores de PEG mediante cromatografía de líquidos de alta resolución y subsiguiente detección del índice de refracción. El 4-hidroxibenzoato de metilo posee tan sólo un pequeño índice de refracción, pero un coeficiente de absorción suficientemente bueno a 256 nm. Si se conecta un detector ultravioleta en serie con el detector del índice de refracción, la agresión a la que se ve sometido el sujeto puede ser reducida con un factor > 10. Todas las señales de los marcadores en el cromatograma se evalúan dentro de los tiempos de retención determinados a partir de los cromatogramas estándar y de referencia.

Ejemplo

Se aclara a base de un ejemplo cómo se impiden las maniobras fraudulentas cuando se aplica la marcación endógena.

Le son administrados a un sujeto 100 ml de solución bebible de metadona que contiene 1 - 3 g de mezcla marcadora de PEG y está conservada con un 0,01% (10 mg/100 ml) de 4-hidroxibenzoato de metilo. El análisis se efectúa según la prescripción que se describe en el documento DE 101 12 470 A1. Tras haber transcurrido 30 - 60 minutos, el sujeto entrega su orina. Tras el paso por el detector del índice de refracción, el eluido es medido adicionalmente por un detector ultravioleta conectado en serie a \lambda = 256 nm. Se obtiene un cromatograma en el que al característico perfil de detección del índice de refracción de los marcadores de PEG administrados le está superpuesto el registro del detector ultravioleta.

Si el detector ultravioleta registra gráficamente tan sólo una línea base en la zona de retención del marcador en saliva y si el detector del índice de refracción identifica la composición marcadora administrada, la muestra de orina puede ser inequívocamente considerada como correspondiente al sujeto en cuestión. Si el cromatograma ultravioleta contiene por el contrario un pico para el tiempo de retención del marcador en saliva, puede considerarse que ha quedado demostrado que el sujeto ha mezclado con premeditada intención fraudulenta orina exenta de sustancias de consumo paralelo con sustancia marcadora.

Se adjuntan dos cromatogramas según las Figs. 1 y 2, uno de los cuales concretamente corresponde al marcador en saliva 4-hidroxibenzoato de metilo en solitario (Fig. 1), mientras que el segundo corresponde a dicho marcador junto con la sustancia marcadora PEG 300 (Fig. 2).

Si se utilizan fracciones de PEG monodispersas como sustancias marcadoras, con respecto a la velocidad de análisis es ventajoso modificar el sistema cromatográfico. Si se prefieren PEGs de cadena más corta con tiempos de permeación más cortos, el análisis deberá realizarse en Nucleosil 300-C4 5 \mum, 125 mm x 4,6 mm DI con un 33% de CH_{3}OH/ 67% de H_{2}O. De lo contrario, el más largo tiempo de permanencia del MHB en la fase estacionaria conduce a unos prolongados tiempos de análisis.

Claims (2)

1. Procedimiento de diagnosis in vitro aplicado a una muestra de orina de un sujeto para la determinación de la manipulación abusiva de la muestra a diagnosticar por parte del sujeto, en el cual le son administradas al sujeto las sustancias marcadoras PEG (polietilenglicoles) que son no metabolizables o tan sólo escasamente metabolizables y diagnosticables en la orina;

caracterizado por el hecho de que

además de las sustancias marcadoras anteriormente mencionadas le fue al mismo tiempo y adicionalmente administrada al sujeto una sustancia metabolizable del grupo de los derivados del ácido benzoico y del ácido 4-hidroxibenzoico que puede ser determinada en el mismo cromatograma con las sustancias marcadoras de PEG no metabolizables y tras el metabolismo ya no puede ser determinada en la muestra en la que se analizan las sustancias marcadoras.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que como sustancia metabolizable se usa 4-hidroxibenzoato de metilo.