ES2281743T3

ES2281743T3 - Ensayo para detectar el estado de metilacion por extension con iniciadores especificos de metilacion (mspe).

Info

Publication number: ES2281743T3
Application number: ES04029887T
Authority: ES
Inventors: Zheng Li; Jeanne Harvey
Original assignee: Bayer Healthcare LLC
Current assignee: Bayer Healthcare LLC
Priority date: 2003-12-16
Filing date: 2004-12-16
Publication date: 2007-10-01
Anticipated expiration: 2024-12-16
Also published as: DE602004004988D1; JP2005204652A; EP1544309A1; EP1544309B1; US20050214812A1; DE602004004988T2; US20080213789A1; ATE355390T1

Abstract

Un método de detección de la metilación en 5¿ del DNA en un residuo citosina de un sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico, que comprende: (a) obtener DNA de una muestra a analizar; (b) poner en contacto el DNA con un compuesto bisulfítico; (c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena; (d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3¿ del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; en donde el extremo 3¿ del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; (e) hibridar los productos de extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva; y (f) determinar el estado de metilación en 5¿ en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo3¿ del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el residuo Terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5¿ de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3¿ del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo Terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5¿ de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva queno se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs, ddCTP marcado y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3¿ del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3¿ del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna en la muestra; o en donde (d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3¿ del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3¿ del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3¿ del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5¿ de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra.

Description

Ensayo para detectar el estado de metilación por extensión con iniciadores específicos de metilación (MSPE).

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a métodos para determinar el estado de metilación del DNA de sitios CpG en genes. Adicionalmente, la presente invención se refiere a métodos de diagnóstico de trastornos o enfermedades por determinación del estado de metilación del DNA de ácidos nucleicos en un individuo.

Antecedentes de la invención

En los mamíferos, la metilación del DNA ocurre usualmente en las citosinas localizadas en posición 5' de guaninas, conocidos como dinucleótidos CpG. La DNA (citosina-5)-metiltransferasa (DNA-Mtasa) cataliza esta reacción por adición de un grupo metilo procedente de S-adenosil-L-metionina a la posición del quinto carbono de la citosina. Chiang, PK, et al., "S-adenosylmethionine and methylation", FASEB J., 10:471-480 (1996). La mayoría de las citosinas en los dinucleótidos CpG están metiladas en el genoma humano, pero algunas permanecen sin metilar en áreas específicas ricas en GC. Estas áreas se denominan islas CpG. Antequera, F. et al., "High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lives", Cell, 62:503-514 (1990). Las islas CpG tienen típicamente una longitud comprendida entre 0,2 y aproximadamente 1 kb y están localizadas aguas arriba de muchos genes domésticos y específicos de tejido, pero pueden extenderse también a regiones codificantes de genes. Antequera, F. et al., "High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines", Cell, 62:503-514 (1990).

La metilación del DNA es un cambio heredable, reversible, y epigenético, que tiene potencial para alterar la expresión de genes, lo cual tiene consecuencias profundas de desarrollo y genéticas. Se sabe que la metilación del DNA juega un papel en la regulación de la expresión génica durante el desarrollo celular. Este suceso epigenético esta asociado frecuentemente con la silenciación de la transcripción de los genes grabados, algunos elementos repetitivos y genes en el cromosoma X inactivo. Li, E. et al, "Role for DNA methylation in genomic imprinting", Nature, 366:362-365 (1993); Singer-Sam, J. and Riggs, AD, X chromosome inactivation and DNA methylation, Jost, J.P. and Saluz, H.P. (compiladores), DNA Methylation: Molecular Biology and Biological Significance. Birkhaeuser Verlag, Basilea, Suiza, pp. 358-384 (1993). En las células neoplásticas, se ha observado que las islas CpG normalmente no metiladas pueden llegar a metilarse de manera aberrante, o hipermetilarse. Jones, PA, "DNA methylation errors and cancer", Cancer Res., 56:2463-2467 (1996).

La citosina metilada de modo aberrante en los dinucleótidos CpG es un fenómeno muy extendido en el cáncer. Jones, PA y Laird, PW, "Cancer epigenetics comes of age", Nat. Genet. 21:163-167 (1999). Como resultado de la hipermetilación de las islas CpG, la estructura de la cromatina en el promotor puede verse alterada, impidiendo la interacción normal con la maquinaria de la transcripción. Baylin, SB, et al. "Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasias", en Advances in cancer research (compiladores G.F. Vande Wolde y J. Klein). Vol. 72:141-196 (1998), Academic Press, San Diego, CA. Cuando sucede esto en genes críticos para la inhibición del crecimiento, la silenciación resultante de la transcripción podría promover la progresión de los tumores. Adicionalmente, se ha demostrado que la hipermetilación de las islas CpG promotoras es un mecanismo común para la desactivación de la transcripción de los genes supresores de tumores clásicos y genes importantes para la regulación del ciclo celular, así como para la reparación de los desapareamientos del DNA.

Basándose en estos descubrimientos, puede decirse que la metilación de la citosina juega un papel importante en el control de la expresión génica, y que el cambio del patrón o estado de metilación podría causar enfermedades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para determinar la situación o estado de metilación del DNA en un sitio o sitios de interés específicos de CpG. El método comprende:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(b) poner en contacto el DNA con un agente que modifica la citosina no metilada a uracilo al tiempo que deja inalterada cualquier citosina metilada en 5';

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo situado más cerca de 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo de 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra;

(e) hibridar los productos de extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva; y

(f) determinar el estado de metilación en 5' en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o estado de metilación del DNA en un sitio o sitios de interés específicos de CpG, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(b) poner en contacto el DNA con una agente que modifica la citosina no metilada a uracilo al tiempo que deja inalterada cualquier citosina metilada en 5';

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra.

(e) hibridar los productos de la extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva.

(f) determinar el estado de metilación en 5' del residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o estado de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG de interés específicos, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(b) poner en contacto el DNA con un agente que modifica la citosina no metilada a uracilo en tanto que deja inalterada cualquier citosina metilada en 5';

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs, ddCTP marcado y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna en la muestra;

(e) hibridar los productos de la extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva; y

Alternativamente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o estado de metilación del DNA en un sitio o sitios específicos CpG de interés, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra;

(f) determinar el estado de metilación en 5' en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA sin metilado en la muestra.

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra;

(e) hibridar los productos de extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva;

Alternativamente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o estado de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG de interés específicos, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar un DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE específicos que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna existente en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA no metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar;

(e) hibridar los productos de la extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es el mismo que la primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es el mismo que la segunda secuencia exclusiva; y

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o el estado de metilación en un sitio o sitios CpG específicos de interés, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar un DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna existente en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina en el sitio CpG en la cadena superior; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA no metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior;

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el DNA del paso (a) sea DNA genómico.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el agente utilizado para convertir la citosina no metilada en uracilo sea un compuesto bisulfítico. Preferiblemente, el agente utilizado para modificar la citosina no metilada es bisulfito de sodio.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que la PCR se utilice para amplificar los ácidos nucleicos tratados químicamente. En una realización preferida, la amplificación PCR se conduce con al menos un par de iniciadores PCR, y los iniciadores PCR deberían reconocer tanto los moldes de DNA metilado como no metilado. Los iniciadores PCR pueden comprender una secuencia que se hibrida a condiciones severas a al menos aproximadamente 7, con preferencia aproximadamente 12, de modo preferible aproximadamente 15, de modo más preferible aproximadamente 25, 50, 75, 100, o más nucleótidos, y de modo ideal aproximadamente 17 a 40 nucleótidos. En otra realización preferida, se utilizan pares múltiples de iniciadores PCR que reconocen sitios CpG múltiples, y se realiza PCR múltiplex para amplificar el molde de DNA.

De acuerdo con la presente invención, las reacciones MSPE se realizan para el análisis de los niveles de metilación de uno o más sitios CPG en una o más moléculas de ácido nucleico. En una realización preferida, pueden agruparse varias reacciones PCR simples o multiplexadas al tiempo que se conducen las reacciones MSPE. En una realización, los iniciadores MSPE utilizados en la reacción de extensión con iniciadores están diseñados para hibridarse a secuencias que contienen originalmente dinucleótidos CpG.

Para el análisis de un sitio CpG definido, se incluyen preferiblemente en la reacción de extensión al menos dos clases de iniciadores MSPE. Una clase de iniciador MSPE es específica para metilación y se reasocia a los sitios CpG metilados, y la otra clase de iniciador MSPE es específica para sitios CpG no metilados y se reasocia a los sitios CpG no metilados de los ácidos nucleicos amplificados. Cada clase de iniciador MSPE está constituida por dos restos. La porción del extremo 3' se reasocia a uno o más sitios CpG definidos en los ácidos nucleicos amplificados, y la porción del extremo 5' se reasocia a una secuencia exclusiva/adaptadora que no se reasocia a ninguno de los ácidos nucleicos amplificados.

En una realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando dNTPs marcados, en donde dATP, dTTP, y dCTP pueden estar marcados. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando ddCTP marcado. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, y mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena inferior del DNA molde y utilizando los dNTPs marcados, en donde dATP, dTTP, y dGTP pueden estar marcados. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena inferior del DNA amplificado y utilizando mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, y mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores inversos marcados que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado utilizando los dNTPs sin marcar. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores inversos marcados que se reasocian a la cadena inferior del DNA amplificado utilizando los dNTPs sin marcar.

Los dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos que se incorporan en los productos de extensión pueden marcarse con un marcador detectable. Marcadores detectables son bien conocidos en la técnica. Puede utilizarse cualquier tipo de marcador detectable. En una realización preferida, el marcador es un radioisótopo. En otra realización preferida, el marcador es un agente fluorescente. En otra realización preferida, el marcador es un resto de fijación tal como biotina.

El marcador detectable puede ser un marcador primario que puede detectarse directamente, o un marcador secundario que puede detectarse indirectamente.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar y cuantificar los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG por análisis de la intensidad de señal del producto de reacción MSPE que contiene uno o más sitios CpG. En una realización preferida, pueden determinarse grandes números de sitios CpG simultáneamente por su nivel de metilación relativo, v.g., la determinación y cuantificación de los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG pueden realizarse de un modo muy potente o en una microrred.

Otro aspecto de la presente invención proporciona también un kit para detección de los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG. El kit puede incluir (1) un agente que modifica nucleótidos de citosina no metilados, (2) iniciadores para amplificación de la molécula de ácido nucleico, (3) iniciadores MSPE como se definen en la reivindicación 1 para el ácido nucleico que contiene CpG metilado (marcado o sin marcar), (4) iniciadores MSPE como se definen en la reivindicación 1 para el ácido nucleico que contiene CpG no metilado (marcado o sin marcar), (5) dNTPs marcados y sin marcar, (6) ddNTPs marcados y sin marcar, y (7) iniciadores inversos marcados y sin marcar. El kit puede incluir adicionalmente tampón de amplificación de ácido nucleico y reactivos para las reacciones MSPE. Preferiblemente, el agente que modifica la citosina no metilada es un compuesto bisulfítico.

Otro aspecto de la presente invención proporciona también un método de utilización del presente método y/o kit para determinar una predisposición a una enfermedad o trastorno, o para diagnosticar y/o pronosticar una enfermedad o trastorno, o para monitorizar la respuesta terapéutica de un fármaco o compuesto en un individuo, que comprende determinar los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG en una molécula de ácido nucleico, y comparar el nivel de metilación relativo en el individuo con el nivel de metilación relativo de dicha molécula de ácido nucleico de un individuo de control (o estándar) que no presenta predisposición para la enfermedad o trastorno, en donde una diferencia significativa en el nivel de metilación relativo es indicativa de la predisposición a la enfermedad o trastorno del individuo.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la lectura de fluorescencia del DNA molde tanto metilado como no metilado.

La Figura 2 muestra la relación de la metilación esperada respecto a la observada.

La Figura 3 muestra la potencia predictiva del ensayo (relación calculada frente a la relación esperada).

La Figura 4 muestra una descripción esquemática de la invención.

Descripción detallada de la invención I Generalidades

La presente invención se refiere a métodos para determinar la situación o estado de metilación del DNA en muestras. En general, el primer paso de los métodos incluye modificar químicamente los sitios CpG, convertir las citosinas no metiladas en uracilo, dejando la citosina metilada en 5' sin modificar. El DNA tratado químicamente puede amplificarse luego por técnicas convencionales de biología molecular que incluyen amplificación PCR. La situación o estado de metilación en los productos de DNA amplificado pueden analizarse luego por reacción de extensión con iniciadores utilizando iniciadores marcados o dNTPs o ddNTPs. Otro aspecto de la presente invención se refiere a las aplicaciones clínicas de la situación o estatus de metilación como un marcador de enfermedad o como base para tratamientos. En particular, la metilación anormal en los sitios CpG desactiva las expresiones de los genes. Por esta razón, los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG particulares en comparación con los niveles de no metilación en los mismos sitios sirve como herramienta de diagnóstico, pronostico o terapéutica.

Definiciones

Como se utiliza en esta memoria, el término "metilación" hace referencia a la unión covalente de un grupo metilo en la posición C5 de la citosina base de los nucleótidos dentro de los dinucleótidos CpG de la región reguladora de los genes. La expresión "situación de metilación" o "estado de metilación" hace referencia a la presencia o ausencia de 5-metil-citosina ("5-mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleótidos CpG dentro de una secuencia de DNA. Tal como se utilizan en esta memoria, las expresiones "estado de metilación" y "situación de mutilación" se utilizan de modo intercambiable. Un sitio de metilación es una secuencia de nucleótidos contiguos enlazados que es reconocida y metilada por una metilasa específica de secuencia. Una metilasa es una enzima que metida (es decir, fija de modo covalente un grupo metilo) uno o mas nucleótidos en un sitio de metilación.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "islas CpG" son secuencias cortas de DNA ricas en di nucleótido CpG que pueden encontrarse en la región 5' de aproximadamente la mitad de todos los genes humanos. La expresión "sitio CpG" hace referencia al di nucleótido CpG dentro de las islas CpG. Las islas CpG tienen típicamente, pero no siempre, una longitud comprendida entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 1 kb.

Tal como se utiliza en esta memoria, el termino "muestra" utilizado en su sentido mas amplio, hace referencia a cualquier material vegetal, animal o viral que contiene DNA o RNA, tal como, por ejemplo, tejido o fluido aislado de un individuo (incluyendo, sin limitación, plasma, suero, fluido cerebroespinal, linfa, lágrimas, saliva y secciones de tejidos) o de constituyentes de cultivos de células in vitro, así como muestras del ambiente. El término "muestra" hace referencia también a "una muestra biológica". Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "una muestra biológica" hace referencia a un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes (v.g. fluidos corporales, que incluyen, pero sin carácter limitante sangre, moco, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, saliva, fluido amniótico, sangre del cordón amniótico, orina, fluido vaginal y semen). "Una muestra biológica" hace referencia adicionalmente a un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo entero o un subconjunto de sus tejidos, células o partes componentes, o una fracción o porción de los mismos, que incluyen, pero sin carácter limitante, por ejemplo, plasma, suero, fluido vaginal, fluido linfático, las secciones externas de la piel, los tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células de la sangre, tumores, y órganos. En muchos casos, la muestra se ha extraído de un animal, pero la expresión "muestra biológica" puede hacer referencia también a células o tejidos analizados in vivo, es decir, sin separación del animal. Típicamente, una "muestra biológica" contendrá células del animal, pero el término puede hacer referencia también a material biológico no celular, tal como fracciones no celulares de sangre, saliva, u orina, que pueden utilizarse para medir los niveles de polinucleótidos o polipéptidos asociados al cáncer. "Una muestra biológica" hace referencia adicionalmente a un medio, tal como un caldo o gel nutriente en el cual se ha propagado un organismo, que contiene componentes celulares, tales como proteínas o moléculas de ácido nucleico.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "agente" hace referencia a cualquier compuesto que tiene la propiedad de modificar la citosina no metilada para dar otro nucleótido dejando al propio tiempo inalterada cualquier citosina metilada en 5'. La modificación diferenciará la citosina no metilada de la metilada. Preferiblemente, el agente modifica la citosina no metilada a uracilo. Preferiblemente, el agente utilizado para modificar la citosina no metilada es bisulfito de sodio. Sin embargo, pueden utilizarse también en la presente invención otros agentes que modifican análogamente la citosina no metilada, pero no la citosina metilada.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "iniciador" hace referencia a un polinucleótido que, tanto si se purifica a partir de un material digerido por restricción de ácido nucleico o como si se ha producido por síntesis, es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico cuando se pone en condiciones en las cuales se induce la síntesis de un producto de extensión con iniciadores que es complementario a una cadena de ácido nucleico, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente para polimerización tal como DNA-polimerasa, transcriptasa inversa o análogos, y a una temperatura y pH adecuados. El iniciador es preferiblemente monocatenario para eficiencia máxima, pero puede ser alternativamente bicatenario. En caso de ser bicatenario, el iniciador se trata primeramente para separar sus cadenas antes de ser utilizado para preparar los productos de extensión. Preferiblemente, el iniciador es un polidesoxirribonucleótido. El iniciador tiene que ser suficientemente largo para iniciar la síntesis de los productos de extensión en presencia de los agentes para polimerización. Las longitudes exactas de los iniciadores dependerán de muchos factores, que incluyen temperatura y la fuente del iniciador. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, un iniciador polinucleotídico contiene típicamente 15 a 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Las moléculas iniciadoras cortas requieren generalmente temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "un iniciador MSPE" hace referencia a un oligonucleótido que se hibrida al sitio CpG a ensayar. "Un iniciador MSPE" contiene dos restos. El extremo 5' del iniciador MSPE contiene una secuencia exclusiva que no se hibrida a ningún DNA existente en la muestra a ensayar, y el extremo 3' del iniciador MSPE contiene una secuencia complementaria a una región que contiene los sitios CpG a ensayar.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "secuencia exclusiva", a la que se hace referencia también como "código de cremallera" o "secuencia adaptadora", es una secuencia, generalmente exógena a las secuencias diana, v.g. artificial. En una realización preferida, la secuencia adaptadora está diseñada para ser sustancialmente complementaria (y de modo preferible perfectamente complementaria) a una sonda de captura de una microperla o microrred de detección. Preferiblemente, la sonda de captura está inmovilizada en un soporte sólido que puede incluir microesferas o sustratos planares tales como portaobjetos de plástico o vidrio como se describen en esta memoria para soportes de redes. Un ejemplo no limitante son oligos modificados con amina en posición 3': CP32: 5' CGAACGCTCTGAGGTCACAGCGTC 3' (SEQ ID NO. 1), CP33: 5' GTGCTCCAGAGGCTGATGCCGC 3' (SEQ ID NO. 2), CE32: 5' GACGCTGTGACCTCAGAGCGTTCG 3' (SEQ ID NO. 13), y CE33: 5' GCGGCATCAGCCTCTGGAGCAC 3' (SEQ ID NO. 14).

Como se utiliza en esta memoria, el término "amplificación" hace referencia al proceso de síntesis de moléculas de ácido nucleico que son complementarias a una o ambas cadenas de un ácido nucleico molde. La amplificación de una molécula de ácido nucleico incluye típicamente desnaturalización del ácido nucleico molde, reasociación de iniciadores al ácido nucleico molde a una temperatura que es inferior a las temperaturas de fusión de los iniciadores, y alargamiento enzimático a partir de los iniciadores para generar un producto de amplificación. Los pasos de desnaturalización, reasociación y alargamiento pueden ser realizados cada uno una sola vez. Generalmente, sin embargo, los pasos de desnaturalización, reasociación y alargamiento se realizan múltiples veces de tal modo que la cantidad de producto de amplificación va creciendo, en muchos casos exponencialmente, aunque no se requiere la amplificación exponencial por los presentes métodos. La amplificación requiere típicamente la presencia de desoxirribonucleosido-trifosfatos, una enzima DNA-polimerasa y un tampón apropiado y/o co-factores para la actividad óptima de la enzima polimerasa. La expresión "producto amplificado" hace referencia a las secuencias de ácido nucleico que se producen por el proceso de amplificación tal como se define en esta memoria.

Como se utiliza en esta memoria, el término "marcador" hace referencia a cualquier átomo o molécula que puede utilizarse para proporcionar un efecto detectable (preferiblemente cuantificable) y que puede estar unido a un ácido nucleico o proteína. Los marcadores incluyen, pero sin carácter limitante, tintes y radiomarcadores tales como ^{32}P; restos de fijación tales como biotina; haptenos tales como digoxigenina; restos luminógenos, fosforescentes o fluorógenos; y tintes fluorescentes solos o en combinación con restos que pueden suprimir o desplazar los espectros de emisión por transferencia de energía de resonancia con fluorescencia (FRET). Los marcadores pueden proporcionar señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, gravimetría, difracción o absorción de rayos X, magnetismo, actividad enzimática, etcétera. Un marcador puede ser un resto cargado (carga positiva o negativa), o alternativamente, puede tener carga neutra. Los marcadores pueden incluir o estar constituidos por secuencias de ácido nucleico o proteínas, con tal que la secuencia que comprende el marcador sea detectable. La expresión "dNTPs marcados" hace referencia a los dNTPs que están modificados por los marcadores fijados. La expresión "ddNTPs marcados" hace referencia los ddNTPs que están modificados por los marcadores fijados.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "se hibrida" hace referencia a una proceso en el cual una cadena de ácido nucleico se reasocia a y forma un dúplex estable, sea homodúplex o heterodúplex, en condiciones de hibridación normales con una segunda cadena de ácido nucleico complementaria, y no forma un dúplex estable con moléculas de ácido nucleico no afines en las mismas condiciones de hibridación normales. La formación de un dúplex se realiza por reasociación de dos cadenas complementarias de ácido nucleico en una reacción de hibridación. La reacción de hibridación puede hacerse muy específica por ajuste de las condiciones de hibridación (a las que se hace referencia a menudo como severidad de hibridación) en las cuales tiene lugar la reacción de hibridación, tal que la hibridación entre dos cadenas de ácido nucleico no formará un dúplex estable, v.g., un dúplex que conserva una región de clase de cadena doble en condiciones normales de severidad, a no ser que las dos cadenas de ácido nucleico contengan cierto número de nucleótidos en secuencias específicas que son sustancial o completamente complementarias. Las condiciones de "hibridación normales o de severidad normales" se determinan fácilmente para cualquier reacción de hibridación dada. Véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "hibridarse" o "hibridación" hace referencia a cualquier proceso por el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria por apareamiento de bases.

Tal como se utiliza en esta memoria, "una DNA-polimerasa" hace referencia a una enzima que cataliza la polimerización de desoxinucleótidos. Generalmente, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del iniciador reasociado a una secuencia molde de DNA, y continuará en la dirección 5' a lo largo del molde. DNA-polimerasas conocidas incluyen, por ejemplo, DNA-polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), DNA-polimerasa I de E. coli, DNA-polimerasa T7, DNA-polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), DNA-polimerasa de Bacillus stearothermophilus, DNA-polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli) (a la que se hace referencia también como DNA-polimerasa Vent), DNA-polimerasa de Thermotoga maritima (UlTma), DNA-polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), y DNA-polimerasa de Pyrococcus GB-D (PGB-D). La actividad de polimerasa de cualquiera de las enzimas anteriores puede definirse por medios bien conocidos en la técnica. Una unidad de actividad de DNA-polimerasa, de acuerdo con la presente invención, se define como la cantidad de enzima, que cataliza la incorporación de 10 nmoles de dNTPs totales en forma de polímero, que termina en 30 minutos a 72ºC. DNA-polimerasas termoestables preferidas que pueden utilizarse en la invención incluyen Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tch, el fragmento Stoffel, DNA-polimerasas VENT® y DEEPVENT®, y mutantes, variantes y derivados de las mismas. Véanse los documentos Pat. U.S. No. 5.436.149; Pat. U.S. No. 4.889.818; Pat. U.S. No. 4.965. 188; Pat. U.S. No. 5.079.352; Pat. U.S. No. 5.614.365; Pat. U.S. No. 5.374.553; Pat. U.S. No. 5.270.179; Pat. U.S. No. 5.047.342; Pat. U.S. No. 5.512.462; Pat. U.S. No. 6.015.668; Pat. U.S. No. 5.939.301; Pat. U.S. No. 5.948.614; Pat. U.S. No. 5.912.155; WO 97/09451; WO 98/35060; WO 92/06188; WO 92/06200; WO 96/10640; Barnes, W. M., Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, F. C., et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, J.-M., et al., Nucl. Acids Res. 22(15) :3259-3260 (1994).

Como se utiliza en esta memoria, "detección" hace referencia a la identificación de la presencia o ausencia de una molécula en una muestra. En los casos en que la molécula a detectar es un ligando, el paso de detección puede realizarse por fijación del ligando con un anticuerpo que está marcado de modo detectable. Un marcador detectable es una molécula que es capaz de generar, sea independientemente, o en respuesta a un estímulo, una señal observable. Un marcador detectable puede ser, pero sin carácter limitante, un marcador fluorescente, un marcador cromógeno, un marcador luminiscente, o un marcador radiactivo. Métodos de "detección" de un marcador incluyen métodos cuantitativos y cualitativos adaptados para microscopía estándar o confocal, análisis FACS, y los adaptados para métodos de alta capacidad que implican placas de pocillos múltiples, redes o microrredes. Una persona con experiencia en la técnica puede seleccionar conjuntos de filtros y fuentes de energía de excitación apropiados para la detección de emisión fluorescente por un ligando o tinte fluorescente dado. "Detección", tal como se utiliza en esta memoria, puede incluir también el uso de anticuerpos múltiples para un ligando a detectar, en donde los anticuerpos múltiples se fijan a diferentes epítopes en el ligando a detectar. Los anticuerpos utilizados de este modo pueden emplear dos o más marcadores detectables, y pueden incluir, por ejemplo, un par FRET. Una molécula de polipéptido se "detecta" de acuerdo con la presente invención cuando el nivel de señal detectable es absolutamente mayor que el nivel de ruido de fondo del marcador detectable, o cuando el nivel de ácido nucleico medido es absolutamente mayor que el nivel medido en una muestra de control.

Tal como se utiliza en esta memoria, "detección" se refiere también a la detección de la presencia de una molécula de ácido nucleico diana (v.g., una molécula de ácido nucleico de interés) y hace referencia a un proceso en el cual la señal generada por una molécula de ácido nucleico sonda marcada directa o indirectamente (capaz de hibridarse a una diana contenida en una muestra) se mide o se observa. Así, la detección del ácido nucleico sonda es directamente indicativa de la presencia, y por consiguiente la detección, de un ácido nucleico diana, tal como una secuencia que codifica un gen marcador. Por ejemplo, si el marcador detectable es un marcador fluorescente, el ácido nucleico diana se "detecta" por observación o medida de la luz emitida por el marcador fluorescente sobre el ácido nucleico sonda cuando el mismo es excitado por la longitud de onda apropiada, o si el marcador detectable es un par fluorescente/apagador, el ácido nucleico diana se "detecta" por observación o medida de la luz emitida después de asociación o disociación del par fluorescente/apagador presente en el ácido nucleico sonda, en donde la detección del ácido nucleico sonda indica detección del ácido nucleico diana. Si el marcador detectable es un marcador radiactivo, el ácido nucleico diana, después de la hibridación con una sonda marcada radiactivamente es "detectado", por ejemplo, por autorradiografía. Métodos y técnicas para "detectar" marcadores fluorescentes, radiactivos, y otros productos químicos marcadores pueden encontrarse en Ausubel et al. (1995, Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Edición, John Wiley and Sons, Inc.). Alternativamente, un ácido nucleico puede ser "detectado indirectamente" en los casos en que un resto se fija a un ácido nucleico sonda que se hibridará con la diana, tal como una actividad enzimática, permitiendo la detección en presencia de un sustrato apropiado, o un antígeno específico u otro marcador que permita la detección por adición de un anticuerpo u otro indicador específico. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico diana puede detectarse por amplificación de una muestra de ácido nucleico preparada a partir de una muestra clínica de un paciente, utilizando iniciadores oligonucleotídicos, que están diseñados específicamente para hibridarse con una porción de la secuencia de ácido nucleico diana. Métodos de amplificación cuantitativos, tales como, pero sin carácter limitante, TaqMan, pueden utilizarse también para "detectar" un ácido nucleico diana de acuerdo con la invención. Una molécula de ácido nucleico se "detecta", tal como se utiliza en esta memoria, en el caso en que el nivel de ácido nucleico medido (por ejemplo por PCR cuantitativa), o el nivel de señal detectable proporcionado por el marcador detectable es absolutamente mayor que el nivel de ruido de fondo.

Tal como se utiliza en esta memoria, "detección" hace referencia adicionalmente a la detección de la situación o el estatus en un sitio CpG específico de una molécula de ácido nucleico diana que son indicativos de una condición de enfermedad en una célula o tejido. La situación o el estatus de metilación en un sitio CpG específico de una molécula de ácido nucleico diana pueden proporcionar información útil para diagnóstico, monitorización de enfermedades, y enfoques terapéuticos. Pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para determinar el estatus de metilación de un dinucleótido CpG específico. Tales métodos incluyen, pero sin carácter limitante, escaneo genómico de marcas de restricción, véase Kawai et al., "Comparison of DNA methylation patterns among mouse cell lines by restriction landmark genomic scanning", Mol. Cell Biol. 14 (11): 7421-7427 (1994); amplificación de islas CpG metiladas, véase Toyota et al., "Identification of differentially methyIated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification," Cancer Res., 59: 2307-2312 (1999), véase también WO 00/26401Al; hibridación con mutilación diferencial, véase Huang et al., "Methylation profiling of CpG islands in human breast cancer cells," Hum. Mol. Genet., 8: 459-470 (1999); PCR específica de mutilación (MSP), véase Herman et al., "Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands", PNAS USA 93: 9821-9826 (1992), véase también Patente U.S. No. 5.786.146; extensión con iniciadores nucleotídicos sencillos sensibles a la metilación (Ms-SnuPE), véase Pat. U.S. No. 6.251.594; análisis combinado de restricción-bisulfito (COBRA), véase Xiong and Laird) "COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay", Nucleic Acids Research, 25(12): 2532-2534 (1997); secuenciación genómica con bisulfito, véase Frommer et al., "A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands", PNAS USA, 89: 1827-1831 (1992); y extensión con iniciadores específicos de metilación (MSPE), etc.

Tal como se utiliza en esta memoria, "detección" hace referencia adicionalmente a la detección precoz, o prognosis, o respuesta terapéutica de una enfermedad o trastorno en un paciente. "Detección", tal como se utiliza en esta memoria hace referencia adicionalmente a la detección de la recurrencia de una enfermedad en un individuo, utilizando los mismos criterios de detección que se han indicado arriba. Tal como se utiliza en esta memoria, "detección" hace referencia además a la medida de un cambio en el grado de enfermedad o trastorno antes y/o después del tratamiento con un compuesto terapéutico. En este caso, un cambio en el grado de cáncer colorrectal en respuesta a un compuesto terapéutico hace referencia a un aumento o disminución en los niveles de metilación de sitios CpG al menos en un 10% en respuesta a la presencia de un compuesto terapéutico con relación al nivel de expresión en ausencia del compuesto terapéutico.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "ácido nucleico" hace referencia a polinucleótidos tales como ácido desoxirribonucleico (DNA), y, en caso apropiado, ácido ribonucleico (RNA). Debe entenderse también que el término incluye, como equivalentes, análogos de RNA o DNA producidos a partir de análogos de nucleótidos, y, en caso aplicable a la realización que se describe, polinucleótidos monocatenarios (de sentido o antisentido) y bicatenarios. ESTs, cromosomas, cDNAs, mRNAs, y rRNAs son ejemplos representativos de moléculas a las que puede hacerse referencia como ácidos nucleicos.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "célula cancerosa" o "célula de cáncer", utilizada en forma singular o plural, se refiere a células que han sufrido una transformación maligna que las hace patológicas para el organismo hospedador. La transformación maligna es un proceso mono- o multi-etápico, que implica en parte una alteración en la constitución genética de la célula y/o el perfil de expresión de los genes. La transformación maligna puede ocurrir espontáneamente, o por vía de un suceso o combinación de sucesos tales como tratamiento con fármacos o productos químicos, radiación, fusión con otras células, infección viral, o activación o desactivación de genes particulares. La transformación maligna puede ocurrir in vivo o in vitro, y puede, en caso necesario, ser inducida experimentalmente. Las células malignas pueden encontrarse dentro de la masa tumoral bien definida o pueden haber sufrido metástasis a otras localizaciones físicas. Una característica de las células del cáncer es la tendencia a crecer de una manera que es incontrolable por el hospedador, pero la patología asociada con una célula de cáncer particular puede tomar cualquier forma. Las células primarias del cáncer (es decir, las células obtenidas desde cerca del sitio de la transformación maligna) pueden distinguirse fácilmente de las células no cancerosas por técnicas de patología bien establecidas, particularmente examen histológico. La definición de una célula de cáncer, tal como se utiliza en esta memoria, incluye no sólo una célula de cáncer primaria, sino cualquier célula derivada de una célula de una célula de cáncer ancestral. Esto incluye células de cáncer metastatizadas, y cultivos y líneas de células in vitro derivados(as) de células de cáncer.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "oligonucleótido" hace referencia a una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente al menos 5 nucleótidos, de modo más preferible al menos aproximadamente 10-15 nucleótidos y de modo más preferible al menos aproximadamente 15 a 30 o más nucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que dependen a su vez de la función o uso últimos del oligonucleótido. El oligonucleótido puede generarse de cualquier manera, con inclusión de síntesis química, replicación de DNA, transcripción inversa, PCR, o una combinación de los mismos.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aislamiento" hace referencia a un proceso en el cual el material se retira de su entorno original (v.g., el entorno natural si el mismo existe naturalmente). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido existe naturalmente presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o DNA o polipéptido, separado de algo o la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dicho polinucleótido podría ser parte de un vector y/o dicho polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, y podría estar todavía aislado en el sentido de que el vector o composición no forma parte de su entorno natural. Por ejemplo, un polinucleótido existente naturalmente, presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido, separado de algo o la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Se excluyen específicamente de la definición de "aislado" los materiales siguientes: cromosomas existentes naturalmente (tales como extensiones de cromosomas), genotecas artificiales de cromosomas, genotecas genómicas, y genotecas de cDNA que existen sea como una preparación de ácido nucleico in vitro o como una preparación de células hospedadoras transfectadas/transformadas, en donde las células hospedadoras son o bien una preparación heterogénea in vitro o están extendidas en placas como una población heterogénea de colonias simples. Se incluyen también específicamente las genotecas anteriores en las cuales un polinucleótido especificado constituye menos del 5% del número de inserciones de ácido nucleico en las moléculas vectoras. Se excluyen además específicamente preparaciones de DNA genómico de células enteras o preparaciones de RNA de células enteras (con inclusión de dichas preparaciones de células enteras, que están cizalladas mecánicamente o digeridas enzimáticamente). Se excluyen además específicamente todas las preparaciones de células enteras anteriores sea como una preparación in vitro o como una mezcla heterogénea separada por electroforesis (con inclusión de transferencias de mancha de las mismas) en donde el polinucleótido de la invención no se ha separado adicionalmente de los polinucleótidos heterólogos en el medio de electroforesis (v.g., separación adicional por escisión de una banda simple de una población de bandas heterogénea en un gel de agarosa o mancha de nailon).

La presente invención proporciona un método para determinar una situación o el estatus de metilación del DNA en un sitio CpG dentro de islas CpG, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs marcados y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo más próximo a 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna secuencia de DNA en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra;

(f) determinar el estatus de metilación en 5' en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o el estatus de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG específicos de interés, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, dNTPs marcados y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra;

(e) hibridar los productos de la extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es complementario a dicha primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es complementario a dicha segunda secuencia exclusiva;

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o el estatus de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG de interés específicos, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA a partir de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs, ddCTP marcado y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra;

Alternativamente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o el estatus de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG de interés específicos, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra;

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 3' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra;

Alternativamente, en otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar la situación o el estatus de metilación del DNA en un sitio o sitios CpG específicos de interés, que comprende los pasos de:

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA no metilada, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar;

(e) hibridar los productos de la extensión con iniciadores de (d) a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es igual que la primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es igual que la segunda secuencia exclusiva; y

(a) obtener y/o utilizar DNA de una muestra a analizar;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a ninguna de las secuencias de DNA en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA no metilado, el extremo más próximo a 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior;

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Cualquier muestra de ácido nucleico, en forma purificada o no purificada, puede utilizarse de acuerdo con la presente invención, con tal que la misma contenga, o se sospeche que contenga una secuencia de ácido nucleico que contiene los ácidos nucleicos que contienen CpG. En muchos genes, las islas CpG comienzan inmediatamente aguas arriba de un promotor y se extienden aguas abajo hasta la región transcrita. La metilación de una isla CpG en un promotor impide usualmente la expresión del gen. Las islas pueden rodear también la región 5' de la región codificante del gen así como la región 3' de la región codificante. Por tanto, pueden encontrarse islas CpG en regiones múltiples de una secuencia de ácido nucleico incluso aguas arriba de las secuencias codificantes en una región reguladora que incluye una región promotora, en las regiones codificantes (v.g., exones), aguas abajo de las regiones codificantes en, por ejemplo, regiones intensificadoras, y en intrones. En general, el ácido nucleico que contiene CpG es DNA. Sin embargo, los métodos de la invención pueden emplear, por ejemplo, muestras que contienen DNA, o DNA y RNA, con inclusión de RNA mensajero, en donde el DNA o RNA puede ser monocatenario o bicatenario, o puede incluirse en la muestra un híbrido DNA-RNA. Puede emplearse también una mezcla de ácidos nucleicos. La secuencia de ácido nucleico específica a detectar puede ser una fracción de una molécula mayor o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta, de tal modo que la secuencia específica constituye el ácido nucleico entero. No es necesario que la secuencia a estudiar esté presente inicialmente en forma pura; el ácido nucleico puede ser una fracción mejor de una mezcla compleja, tal como la contenida en el DNA humano entero. Los ácidos nucleicos pueden ser existentes naturalmente o no existentes naturalmente. Adicionalmente, su estatus de metilación puede ser el resultado de procesos in vivo, o de manipulaciones experimentales (v.g., exposición deliberada a un agente que se supone deteriora el DNA, o un agente de metilación supuesto). En una realización preferida, el ácido nucleico contenido en la muestra es DNA genómico.

Los métodos de aislamiento de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse métodos adecuados en textos estándar de biología molecular.

La muestra que contiene DNA para detección de CpG metilado puede obtenerse de cualquier fuente. Preferiblemente, la muestra puede obtenerse de líneas de células, sangre, esputos, heces, orina, suero, fluido cerebro-espinal, pelo, tejido embebido en parafina, por ejemplo, tejido de los ojos, intestino, riñones, cerebro, corazón, próstata, pulmones, mama o hígado, portaobjetos histológicos, y todas las combinaciones posibles de los mismos.

De acuerdo con la presente invención, se prefiere que el agente utilizado para convertir la citosina no metilada en uracilo sea un compuesto bisulfítico. Preferiblemente, el agente utilizado para modificar la citosina no metilada es bisulfito de sodio. Sin embargo, otros agentes que modifican análogamente la citosina no metilada, pero no la citosina metilada, pueden utilizarse también en los métodos de la presente invención. El bisulfito (NaHSO_{3}) reacciona fácilmente con el enlace doble 5,6 de la citosina, pero insuficientemente con la citosina metilada. La citosina reacciona con el ion bisulfito para formar un compuesto intermedio sulfonado de reacción con citosina, que es susceptible de desaminación, dando lugar a un uracilo sulfonado. El grupo sulfonato puede eliminarse en condiciones alcalinas, dando como resultado la formación de uracilo. El uracilo es reconocido como una timina por la polimerasa Taq y por consiguiente después de la PCR, el producto amplificado resultante contiene citosina únicamente en la posición en la que existe 5-metilcitosina en el DNA molde de partida.

En el paso (c) de los métodos de la presente invención, pueden utilizarse diversos métodos conocidos en la técnica para amplificar los ácidos nucleicos. Los métodos de amplificación utilizados en la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, PCR y LCR, etc. Adicionalmente, otros métodos de amplificación que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención son amplificación isotérmica, reacciones de extensión con iniciadores, amplificación de círculo rodante, y otras reacciones de amplificación conocidas por los expertos en la técnica.

La PCR o reacción en cadena de la polimerasa, como se describe en las patentes U.S. Núms. 4.683.195 y 4.683.202, es un método de aumento de la concentración de un segmento de una secuencia de ácido nucleico diana en una mezcla de ácidos nucleicos sin clonación o purificación. Esta tecnología proporciona un enfoque a los problemas de concentración baja de secuencias diana. La PCR puede utilizarse para aumentar directamente la concentración de la diana a un nivel fácilmente detectable. Este proceso para amplificar la secuencia diana implica introducir un exceso molar de dos iniciadores oligonucleotídicos que son complementarios a sus respectivas cadenas de la secuencia diana bicatenaria para la mezcla de DNA que contiene la secuencia diana deseada. La mezcla se desnaturaliza y se deja hibridar posteriormente. Después de la hibridación, los iniciadores se extienden con polimerasa a fin de formar cadenas complementarias. Los pasos de desnaturalización, hibridación, y extensión con polimerasa pueden repetirse tantas veces como sea necesario, a fin de obtener concentraciones relativamente altas de un segmento de la secuencia diana deseada. La longitud del segmento de la secuencia diana deseada está determinada por las posiciones relativas de los iniciadores uno con respecto a otro, y, por consiguiente, esta longitud es un parámetro controlable. Debido a que los segmentos deseados de la secuencia diana se convierten en las secuencias dominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que los mismos están "amplificados por PCR".

La reacción en cadena de la ligasa (LCR); a la que se hace referencia a veces como "Reacción de Amplificación de Ligasa" (LAR) descrita por Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189 (1991); Barany, PCR Methods and Applic., 1:5 (1991); y Wu y Wallace, Genomics 4:560 (1989) se ha convertido en un método alternativo bien reconocido para amplificar ácidos nucleicos. En la LCR, cuatro oligonucleótidos, dos oligonucleótidos adyacentes que se hibridan exclusivamente a una cadena de DNA diana, y una serie complementaria de oligonucleótidos adyacentes, que se hibridan a la cadena opuesta, se mezclan y se añade a la mezcla DNA-ligasa. Con tal que existe una complementariedad completa en la unión, la ligasa enlazará covalentemente cada serie de moléculas hibridadas. Es importante que, en la LCR, se ligan una a otra dos sondas únicamente cuando están apareadas en bases con secuencias de la muestra diana, sin lagunas o apareamientos incorrectos. Los ciclos repetidos de desnaturalización, hibridación y ligación amplifican un segmento corto de DNA. La LCR se ha utilizado también en combinación con PCR para conseguir una detección mejorada de cambios de una sola base. Segev, Publicación PCT No. WO.9001069 A1 (1990). Sin embargo, debido a que los cuatro oligonucleótidos utilizados en este ensayo pueden aparearse para formar dos fragmentos ligables cortos, existe potencial para la generación de una señal de ruido de fondo independiente de la diana. El uso de LCR para escrutinio de mutantes está limitado al examen de posiciones de ácido nucleico específicas.

En una realización preferida, se utiliza PCR para amplificar los ácidos nucleicos tratados químicamente. La amplificación PCR puede realizarse siguiendo protocolos estándar. Por ejemplo, se utilizan aproximadamente 1-2 \mul del DNA tratado químicamente como molde para la amplificación por PCR específica de cadena en una región de interés. En un perfil de reacción PCR para amplificar una porción de una isla CpG 5', por ejemplo, un procedimiento de desnaturalización inicial de 94-95ºC durante 3-10 minutos seguido por un ciclo de 94-95ºC de 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos para un total de 30-40 ciclos. Las reacciones PCR se realizan en volúmenes de 10-50 \mul en condiciones de: aproximadamente 50 ng de DNA convertido con bisulfito (menos para las muestras micro-diseccionadas), Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5-2,5 mM, KCl 50 mM, 200 \muM de cada dNTP, 0,4 \muM de concentración final de cada iniciador y 1 unidad de polimerasa Taq.

En una realización, la amplificación PCR se conduce con al menos un par de iniciadores PCR. Los iniciadores PCR utilizados en la presente invención deberían reconocer a la vez los moldes de DNA metilado y sin metilar. Dicho de otro modo, los iniciadores PCR deberían estar diseñados para reasociarse a áreas que no contengan los sitios CpG metilados si es posible. No obstante, los dos iniciadores PCR deberían abarcar los sitios CpG. De acuerdo con la presente invención, los iniciadores PCR son preferiblemente monocatenarios para eficiencia máxima de amplificación. Preferiblemente, los iniciadores PCR son moléculas de DNA o RNA monocatenarias que se hibridan a una secuencia molde de ácido nucleico e inician la síntesis enzimática de la cadena de ácido nucleico complementaria. Adicionalmente, los iniciadores PCR son complementarios para una porción de una molécula diana presente en una agrupación de moléculas de ácido nucleico.

Los iniciadores PCR de la presente invención deben tener longitud suficiente. En una realización, los iniciadores PCR pueden comprender una secuencia que se hibrida a condiciones severas a al menos aproximadamente 7, con preferencia aproximadamente 12, con más preferencia aproximadamente 15, de modo más preferible aproximadamente 25, 50, 75, 100 o más nucleótidos, y en el caso ideal aproximadamente 17 a 40 nucleótidos. Como se utiliza en esta memoria, la expresión "se hibrida a condiciones severas" tiene por objeto describir condiciones para hibridación y lavado en las cuales secuencias de nucleótidos que son al menos 75%, 80%, 85%, preferiblemente 90% idénticas una a otra se mantienen típicamente hibridadas una a otra. Tales condiciones severas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden encontrarse en las secciones 6.3.1-6.3.6 de Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989). En otra realización, el iniciador PCR puede comprender una secuencia que se hibrida a condiciones moderadamente severas a al menos aproximadamente 7, con preferencia aproximadamente 12, con más preferencia aproximadamente 15, de modo más preferible aproximadamente 25, 50, 75, 100, o más nucleótidos. Para propósitos de ilustración, condiciones moderadamente severas adecuadas para ensayar la hibridación de un polinucleótido de esta invención con otros polinucleótidos, incluyen prelavado en una solución de 5 x SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hibridación a 50ºC hasta 60ºC, 5 x SSC, durante una noche; seguido por lavado dos veces a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de 2 x, 0,5 x y 0,2 x SSC en que contienen 0,1% de SDS. Un experto en la técnica comprenderá que la severidad de hibridación puede ser manipulada fácilmente, por ejemplo por alteración del contenido de sal de la solución de hibridación y/o la temperatura a la que se lleva a cabo la hibridación.

Existe una correlación positiva entre longitud de iniciador y tanto la eficiencia como la exactitud con la que un iniciador se reasociará a una secuencia diana. En particular, las secuencias más largas tienen una temperatura de fusión (Tm) mayor que lo hacen las más cortas, y tienen menos probabilidad de repetirse dentro de una secuencia diana dada, minimizando con ello la hibridación promiscua. Las secuencias de iniciadores con un contenido elevado de G-C o que comprenden secuencias palindrómicas tienden a auto-hibridarse, como lo hacen sus sitios diana propuestos, dado que las cinéticas de hibridación unimoleculares, más bien que las bimoleculares, se ven favorecidas generalmente en solución. No obstante, también es importante diseñar un iniciador que contenga números suficientes de pares de nucleótidos G-C dado que cada par G-C está unido por 3 enlaces de hidrógeno, en lugar de los 2 que se encuentran en un par de bases A-T.

Los iniciadores PCR de la presente invención están diseñados también de tal modo que tengan una temperatura de fusión (Tm) particular por el método de estimación de la temperatura de fusión. Programas comerciales, que incluyen Oligo™, Primer Design y programas disponibles en internet, con inclusión de Primer3 y Oligo Calculator pueden utilizarse para calcular una Tm de un iniciador. Preferiblemente, la Tm de un iniciador PCR está comprendida con preferencia entre aproximadamente 45ºC y 70ºC, y de modo más preferible entre aproximadamente 55ºC y 65ºC. Preferiblemente, la Tm de un iniciador es aproximadamente 3-5ºC más alta que la Tm de los iniciadores PCR correspondientes.

Se contempla que los iniciadores PCR de la presente invención se preparen por métodos de síntesis, sean químicos o enzimáticos. Alternativamente, tales moléculas o fragmentos de las mismas son existentes naturalmente, y se aislan a partir de su fuente natural o se adquieren de un suministrador comercial.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona en un solo recipiente, pares múltiples de iniciadores, cada uno de los cuales se reasocia a una región CpG definida dentro de una molécula de ácido nucleico. Los pares múltiples de iniciadores permiten amplificaciones concurrentes de sitios CpG diferentes en un solo recipiente y producen fragmentos de ácido nucleico amplificados múltiples. Los fragmentos de ácido nucleico amplificados múltiples pueden detectarse luego y cuantificarse en una modalidad de alta capacidad.

Los ácidos nucleicos amplificados se identifican preferiblemente como metilados o no metilados por una reacción de extensión con iniciadores de metilación específicos (MSPE). La reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando métodos estándar conocidos en la técnica, pero con iniciadores MSPE. Por ejemplo, en una realización, las reacciones MSPE se llevan a cabo a 95ºC durante 10 minutos, seguidos por 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 30 segundos, a lo largo de 30-40 ciclos. En el paso en que las reacciones MSPE se llevan a cabo sobre los ácidos nucleicos amplificados, se utilizan una serie de iniciadores MSPE sea separadamente en distintos recipientes o simultáneamente en un solo recipiente. Generalmente, los iniciadores MSPE utilizados en la reacción de extensión con iniciadores están diseñados para hibridarse a secuencias que contienen originalmente los dinucleótidos CpG a analizar. La selección y el diseño de un iniciador MSPE para una reacción de extensión óptima son bien conocidos por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Preferiblemente, los iniciadores MSPE comprenden secuencias que se hibridan en condiciones severas a al menos aproximadamente 7, con preferencia aproximadamente 12, de modo más preferible aproximadamente 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, o más secuencias de ácido nucleico consecutivas.

Se considera que la presente invención debe abarcar más de una clase de iniciadores MSPE. Para análisis de un sitio CpG definido, se incluyen preferiblemente al menos dos clases de iniciadores MSPE en la reacción de extensión. Por ejemplo, una clase de iniciador MSPE es específica para metilación y reasociación al sitio o sitios CpG metilado(s), y la otra clase de iniciador MSPE es específica para no metilación y reasociación al sitio o sitios CpG no metilados de los ácidos nucleicos amplificados. Cada clase de iniciador MSPE está constituida por dos restos. La porción del extremo 5' se reasocia a una secuencia exclusiva/adaptadora que no se reasocia a ninguno de los ácidos nucleicos amplificados, y la porción del extremo 3' se reasocia al sitio o sitios CpG a analizar en los ácidos nucleicos amplificados. En una realización, el extremo más próximo a 3' del iniciador MSPE se reasocia al sitio o sitios CpG a analizar. La expresión "el extremo más próximo a 3'", tal como se utiliza en esta memoria, hace referencia a los últimos pocos nucleótidos en el extremo 3' del iniciador MSPE, con preferencia los 4 últimos nucleótidos, más preferiblemente los dos últimos nucleótidos, y muy preferiblemente el último nucleótido, reasociándose el último nucleótido del iniciador MSPE en la posición citosina del sitio o sitios CpG a analizar. Por ejemplo, en un iniciador MSPE de metilación específico, el último nucleótido se reasocia a la citosina de un sitio CpG en la cadena superior o a la guanina de la cadena inferior, mientras que en un iniciador MSPE específico de no metilación, el último nucleótido se reasocia a la timina de TpG en la cadena superior o a la adenina en la cadena inferior, dado que la citosina no metilada del sitio CpG se ha convertido en uracilo y amplificado como timina.

La secuencia exclusiva/adaptadora (a la que se hace referencia a veces en la técnica como "código de cremallera") es una secuencia generalmente exógena a las secuencias diana, v.g., artificial, que está diseñada de modo que sea sustancialmente complementaria (y de modo preferible perfectamente complementaria) a una sonda de captura en un dispositivo de detección. Particularmente, la sonda de captura está inmovilizada en un soporte sólido que puede incluir microesferas o sustratos planos tales como portaobjetos de plástico o vidrio. La longitud de la secuencia adaptadora variará dependiendo de la "fuerza" de fijación deseada y el número de adaptadores diferentes deseado. En una realización preferida, la secuencia adaptadora tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 6 y aproximadamente 500 nucleótidos, de modo más preferible entre aproximadamente 8 y aproximadamente 100 nucleótidos, y de modo muy preferible entre aproximadamente 10 y aproximadamente 25 nucleótidos. Generalmente, cada secuencia adaptadora identifica exclusivamente un fragmento de ácido nucleico amplificado. La detección de la secuencia adaptadora se realiza después de la hibridación con una sonda de captura que es complementaria a la secuencia adaptadora.

En una realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando los dNTPs marcados, en donde están marcados dATP, dTTP, y dCTP. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena inferior del DNA amplificado y, utilizando los dNTPs marcados, en donde están marcados dATP, dTTP y dGTP.

En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando ddCTP marcado. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado y utilizando mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, y mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena inferior del DNA amplificado y utilizando dNTPs y ddNTPs mezclados, marcados y sin marcar.

Alternativamente, en otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena superior del DNA amplificado, los iniciadores inversos marcados, y los dNTPs sin marcar. Los iniciadores inversos, tal como se utiliza el término en esta memoria, hacen referencia a un iniciador que es complementario a la cadena de extensión por los iniciadores MSPE. Los iniciadores inversos marcados se extenderán en la dirección opuesta del iniciador MSPE utilizando la cadena de extensión de MSPE como molde y se detendrán en el extremo 5' de los iniciadores MSPE. En otra realización, la reacción de extensión con iniciadores se conduce utilizando iniciadores MSPE que se reasocian a la cadena inferior del DNA amplificado, los iniciadores inversos marcados, y los dNTPs sin marcar.

Los dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos que se incorporan en los productos de extensión pueden marcarse con un marcador detectable. El marcador detectable puede comprender un radiomarcador, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un anticuerpo enlazado a un nucleótido que puede ser detectado subsiguientemente, un hapteno enlazado a un nucleótido que puede ser detectado subsiguientemente, o cualquier otro nucleótido o nucleótido modificado que puede ser detectado sea directa o indirectamente. En una realización, dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos están marcados con radioisótopos. El producto de extensión radiomarcado puede ser detectado por la presencia de radiactividad. Por ejemplo, dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos pueden marcarse con ^{32}P, y el producto de extensión puede analizarse por desnaturalización en gel de poliacrilamida y análisis de imágenes fosforescentes. En otra realización, dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos se marcan con agentes fluorescentes. En una realización preferida, dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos se marcan con Cianina 3, Cianina 5, ficoeritrina, Alexa 532, fluoresceína, TAMRA, tetrametilrodamina, nucleótidos fluorescentes, digoxigenina, o análogos. En una realización más preferida, dNTPs, ddNTPs o iniciadores inversos se marcan con biotina. Cuando se utiliza la biotina para marcación, el producto de extensión puede capturarse por medio de microesferas fijadas a la sonda de captura y cuantificarse por métodos fluorescentes.

En una realización preferida, el marcador detectable es un marcador primario que puede detectarse directamente, tal como un fluoróforo. En otra realización preferida, el marcador detectable es un marcador secundario que puede detectarse indirectamente. Dicho marcador incluye, pero sin carácter limitante, uno de los pares de fijación tales como biotina/estreptavidina, restos modificables químicamente, inhibidores de nucleasas, enzimas tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasas alcalinas, luciferasas, etc. Pares de fijación adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, antígenos y anticuerpos, proteínas y moléculas pequeñas, enzimas y sustratos o inhibidores, receptores y ligandos, carbohidratos y sus parejas de fijación, y ácido nucleico y proteínas de fijación de ácido nucleico, etc. En general, el más pequeño del par se une a los NTPs o dNTPs para incorporación en ácidos nucleicos. Preferentemente, los pares de fijación incluyen biotina (o imino-biotina) y estreptavidina, digoxigenina y anticuerpos, y reactivos Prolinx_. Más preferiblemente, los pares de fijación comprenden biotina o imino-biotina y estreptavidina.

El producto de extensión MSPE se analiza ulteriormente en cuanto a cuantificación relativa de la metilación de citosina en una muestra. La cuantificación incluye hibridar primeramente el producto de extensión MSPE a sondas de captura que son complementarias a las secuencias adaptadoras en el producto de extensión MSPE. Diversos procedimientos de hibridación son bien conocidos en la técnica y la presente invención no se limita a ningún procedimiento de hibridación particular. En general, la hibridación se lleva a cabo usualmente en soluciones de alta concentración iónica (6 x SSC o 6 x SSPE) a una temperatura de 20-25ºC, por debajo de la Tm. Ejemplos específicos de condiciones de hibridación severa incluyen 5 x SSPE, formamida al 50% a 42ºC, o 5 x SSPE a 68ºC. Las condiciones de lavado severas se determinan a menudo empíricamente en experimentos preliminares, pero usualmente implican una combinación de sal y temperatura que es aproximadamente 12-25ºC por debajo de la Tm. Un ejemplo de condiciones de lavado de alta severidad es 1 x SSC a 60ºC. Un ejemplo de condiciones de lavado de severidad muy alta es 0,1 x SSPE, 0,1% SDS a 42ºC. Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984). Un ejemplo de condiciones de lavado extremadamente severas es 0,1 x SSPE, 0,1% SDS a 50-65ºC. En una realización preferida, el lavado a severidad alta se lleva a cabo en condiciones de 1 x SSC y 60ºC. En otra realización preferida, la hibridación se lleva a cabo a 40ºC, utilizando 0,5 x tampón de hibridación, que se ha preparado a partir de HEPES, sal de sodio, 13,0 g/l, HEPES, ácido libre, 12,0 g/l, lauril-sulfato de litio, 10 g/l, LiCl, 21,2 g/l, sero-albúmina bovina, 10,0 g/l, caseína 1,5 g/l, BRIJ-35, 10,0 g/l, MgCl_{2}, 2,0 g/l, ZnCl_{2}, 0,00136 g/l, azida de sodio 0,50 g/l, Proclin-300, 0,50 g/l, pH 7,5. A continuación se aplica Tampón de Lavado (0,4 x SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l azida de sodio, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7) a la mezcla de reacción varias veces a la temperatura ambiente. Como está bien reconocido en la técnica, diversas combinaciones de factores pueden dar como resultado condiciones de severidad sustancialmente equivalentes. Tales condiciones equivalentes están dentro del alcance del descubrimiento de la presente invención.

En una realización, las sondas de captura se hibridan a los polinucleótidos marcados en condiciones severas, más típicamente de alta severidad, o muy severas, o en condiciones extremadamente severas. Las sondas de captura comprenden polinucleótidos de aproximadamente 5 a aproximadamente 100, con preferencia aproximadamente 6 a aproximadamente 75, o aproximadamente 8 a aproximadamente 65, o aproximadamente 10 a aproximadamente 50, o aproximadamente 15 a aproximadamente 40, o aproximadamente 16 a aproximadamente 35, o aproximadamente 18 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud. Las sondas de captura pueden sintetizarse fácilmente por métodos bien conocidos en la técnica para la síntesis de polinucleótidos tales como los descritos en la Patente U.S. No. 4.973.679. Alternativamente, las sondas de captura pueden encargarse de numerosas fuentes comerciales.

En otra realización, las sondas de capturas pueden estar enlazadas a un soporte sólido, tales como, pero sin carácter limitante, una microperla, una perla de cromatografía, una perla de afinidad, un chip de gen, un guiaondas plano, una membrana, una placa de microtitulación, una placa de vidrio, una placa de plástico, o análogos. En una realización más preferida, las sondas de captura están enlazadas a una microperla, preferiblemente microperlas Luminex. En una realización, las sondas de captura están enlazadas simplemente a las microperlas por el procedimiento bien conocido de acoplamiento con carbodiimida. Las microperlas Luminex se describen extensamente en la Patente U.S. No. 6.268.222. Las microperlas o microesferas son partículas pequeñas discretas. La composición de las perlas varía dependiendo de la clase de sonda de captura y el método de síntesis. Composiciones de perlas adecuadas incluyen las utilizadas en síntesis de péptidos, ácido nucleico y restos orgánicos, con inclusión, pero sin carácter limitante, de plásticos, materiales cerámicos, vidrio, poliestireno, 5-metilestireno, polímeros acrílicos, materiales paramagnéticos, sol de dióxido de torio, carbono grafito, dióxido de titanio, látex o dextranos reticulados tales como Sepharose, celulosa, nailon, micelas reticuladas y Teflón. Las microperlas incorporan nanopartículas polímeras que se tiñen con uno o más tintes fluorescentes. La totalidad de las nanopartículas en una población dada se tiñen con la misma concentración de un tinte, y por incorporación de una cantidad conocida de estas nanopartículas en las microperlas. Variando la cantidad y relación de diferentes poblaciones de nanopartículas, es posible establecer y distinguir un gran número de poblaciones discretas de microperlas (microesferas) con espectros de emisión exclusivos. Los tintes fluorescentes utilizados son de la clase conocida generalmente como tintes de cianina, con longitudes de onda de emisión entre 550 nm y 900 nm. Estos tintes pueden contener grupos metino; el número de grupos metino influye en las propiedades espectrales del tinte. Los tintes de monometino que son piridinas tienen típicamente una emisión de fluorescencia entre el azul y el verde, mientras que las quinolinas tienen una emisión de fluorescencia amarilla-verde. Los análogos de tintes de trimetino están desplazados sustancialmente hacia las longitudes de onda rojas, y los tintes de pentametino están desplazados aún más, exhibiendo a menudo emisión de fluorescencia infrarroja. No obstante, puede utilizarse cualquier tinte compatible con la composición de las perlas.

Cuando se utilizan cierto número de microperlas diferentes en la práctica de los métodos descritos en esta memoria, es preferible, aunque no necesario, que los tintes tengan espectros de excitación iguales o solapantes, pero posean espectros de emisión diferenciables. Pueden producirse clases o poblaciones de partículas múltiples a partir de sólo dos tintes. La relación de poblaciones de nanopartículas con tintes rojo/anaranjados se altera por un incremento adecuado en la proporción de tal modo que la relación obtenida no se solape ópticamente con la relación inicial. De este modo se producen un gran número de clases de microperlas con fluorescencia diferente.

Pueden emplearse diversos métodos para detectar y cuantificar el nivel de metilación relativo en uno o más sitios CpG en una molécula de ácido nucleico. Las redes de detección utilizados en la presente invención pueden incluir, pero sin carácter limitante, un detector de estado sólido, tubo fotomultiplicador, película fotográfica, o el simple ojo humano, cualquiera de los cuales puede utilizarse en asociación con instrumentación adicional tal como un espectrómetro, microscopio luminométrico, lector de placas, escáner fluorescente, citómetro de flujo, o cualquier combinación de los mismos, para completar el red de detección.

En una realización, las microperlas se identifican utilizando un citómetro de flujo, por ejemplo un clasificador de células activado por fluorescencia, en donde las diferentes clases de perlas en una mezcla pueden separarse físicamente unas de otras basándose en la identidad de fluorocromo, el tamaño y/o la forma de cada clase de perla, y determinarse la presencia del polinucleótido diana cualitativa o cuantitativamente basándose en la presencia del marcador detectable para cada agrupación clasificada que contiene perlas de una clase particular. Puede utilizarse cualquier citómetro de flujo capaz de detectar tanto las partículas como el marcador contenidos en el polinucleótido hibridado a la sonda de captura. Se prefieren citómetros de flujo con láseres de excitación y detectores múltiples. En una realización, se utiliza el citómetro de flujo Luminex 100. Como es bien conocido en la técnica, la disposición exacta necesaria para detección óptima variará con factores tales como el citómetro de flujo utilizado, el marcador polinucleotídico utilizado, y las partículas utilizadas. La optimización de los ajustes y condiciones para el uso de un citómetro de flujo para la práctica de los métodos descritos en esta memoria puede ser realizada por el técnico experto sin experimentación excesiva. Orientaciones generales en cuanto al uso de citómetros de flujo pueden encontrarse en textos tales como Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3ª edición, Wiley-Liss, 1995 y Jaroszeski et al., Flow Cytometry Protocols, Humana Press, 1998. Un ejemplo del uso de microperlas fluorescentes y citometría de flujo puede encontrarse en Smith et al., Clin. Chem., 44: 2054-2056 (1998). El uso de la citometría de flujo es especialmente útil en la situación en que se utilizan más de una clase de partículas y una pluralidad de sondas de captura para determinar simultáneamente la presencia de polinucleótidos diana múltiples (análisis múltiplex).

En una realización, la detección y cuantificación de los niveles de metilación relativos en uno o más sitios CpG en moléculas de ácido nucleico incluyen el uso de microperlas conjugadas con tintes, tales como tintes fluorescentes. Por ejemplo, para un sitio CpG definido en una molécula de ácido nucleico, los productos MSPE contienen los ácidos nucleicos de ambos orígenes, metilado y no metilado. Por tanto, en la detección del nivel relativo de metilación de un sitio CpG, una huella fluorescente dada se conjuga a una microperla que están enlazada a una sonda de captura particular, en donde la sonda de captura es complementaria a una secuencia adaptadora particular, correspondiendo dicha secuencia adaptadora al estado metilado de un sitio CpG particular en una molécula de ácido nucleico, mientras que otra huella fluorescente dada está conjugada a otra microperla que está enlazada a otra sonda de captura particular, en donde dicha sonda de captura es complementaria a otra secuencia adaptadora particular, correspondiendo dicha secuencia adaptadora al estado metilado del mismo sitio CpG en la misma molécula de ácido nucleico. La detección del nivel relativo de metilación incluye identificar primeramente la huella fluorescente en las microperlas, y determinar y cuantificar luego la intensidad de las señales fluorescentes en el producto de extensión MSPE marcado. El nivel relativo de metilación en dicho sitio CpG se calcula comparando las señales fluorescentes del producto de extensión MSPE metilado con las señales fluorescentes del producto de extensión MSPE no metilado. Como se ha descrito arriba, el producto de extensión MSPE está marcado con el marcador primario o el marcador secundario.

Alternativamente, los niveles relativos de metilación en sitios CpG múltiples en una molécula de ácido nucleico o incluso en moléculas de ácido nucleico diferentes pueden determinarse simultáneamente por utilización de las microperlas conjugadas y siguiendo pasos de detección similares. Por ejemplo, secuencias adaptadoras diferenciables se enlazan cada una al estado metilado o no metilado de una molécula de ácido nucleico que contiene un sitio CpG. Además, las secuencias adaptadoras diferenciables están diseñadas cada una para corresponder a cada sitio CpG definido. Finalmente, una microperla diferenciable se conjuga con un tinte específico para cada secuencia adaptadora diferenciable. Análogamente, el paso de detección incluye identificar primeramente una huella fluorescente diferenciable en una microperla, y determinar y cuantificar después la intensidad de las señales de fluorescencia en el producto de extensión MSPE marcado. Como se ha descrito arriba, el producto de extensión MSPE se marca con el marcador primario o el marcador secundario.

En otra realización, la detección y cuantificación de los niveles de metilación relativos en sitios CpG múltiples en moléculas de ácido nucleico pueden realizarse también en una modalidad de alta capacidad, v.g., en microrredes. El análisis basado en microrredes de los niveles de metilación relativos permite trabajar con centenares o millares de sitios CpG simultáneamente en lugar de uno solo o un pequeño número de sitios CpG cada vez. Un microrred de DNA está compuesto de un conjunto ordenado de moléculas de DNA de secuencias conocidas dispuestas usualmente en configuración rectangular en un pequeño espacio tal como 1 cm^{2} en un formato de portaobjetos estándar de microscopio. Por ejemplo, una red de 200 x 200 podría contener 40.000 manchas, correspondiendo cada mancha a una sonda de secuencia conocida. Una microrred de este tipo puede utilizarse potencialmente para monitorizar al mismo tiempo la expresión de 40.000 ácidos nucleicos en un tipo de célula dado en diversas condiciones. Las sondas tendrán usualmente la forma de cDNA, ESTs u oligonucleótidos. Son muy preferidos ESTs y oligonucleótidos en el campo de 30-200 bases de longitud, dado que los mismos proporcionan un sustrato ideal para hibridación. Existen dos enfoques para construir estas microrredes, conocidas también como chips, uno de los cuales implica fijación covalente de sondas pre-sintetizadas, implicando el otro la construcción o síntesis de sondas directamente en el chip. La muestra o material de ensayo está constituida usualmente por ácidos nucleicos que se han amplificado por PCR. La PCR sirve para los propósitos duales de amplificar el material de partida y permitir la introducción de etiquetas fluorescentes. Para una exposición detallada de la tecnología de microrredes, véase, v.g., Graves, Trends Biotechnol. 17: 127-134 (1999).

La metilación puede detectarse también por medio de microrredes de alta densidad. Las microrredes de alta densidad se construyen depositando una cantidad extremadamente pequeña de soluciones de DNA en una localización exacta en una red utilizando máquinas de alta precisión, varias de las cuales están disponibles comercialmente. Un enfoque alternativo iniciado por Packard Instruments permite la deposición de DNA prácticamente del mismo modo que una impresora de chorro de tinta deposita puntos sobre el papel. Las microrredes de DNA de alta densidad están disponibles comercialmente de cierto número de fuentes, tales como Affymetrix, Incyte, Bergen, Genemed MMolecular Biochemicals, Sequenom, Genomics Solutions, Clontech, Research Genetics, Operon y Stratagene. Por lo general, la marcación para el análisis de microrredes de DNA implica fluorescencia, lo cual permite leer simultáneamente señales múltiples independientes. Esto hace posible la hibridación simultánea del mismo chip con dos muestras marcadas con tintes fluorescentes diferentes. El cálculo de la relación de fluorescencia en cada mancha permite la determinación del cambio relativo en la expresión de cada gen, o el nivel relativo de metilación en el mismo, en dos condiciones diferentes. Por ejemplo, la comparación entre un tejido normal y un tejido tumoral correspondiente utilizando este enfoque ayuda a identificar genes cuya expresión está alterada de modo significativo. Así pues, el método ofrece una herramienta particularmente poderosa cuando el perfil de expresión de genes de la misma célula debe compararse en dos o más condiciones. Escáneres de alta resolución con capacidad para monitorizar la fluorescencia a diversas longitudes de onda están disponibles comercialmente.

Dado que pueden utilizarse simultáneamente grandes números de clases de secuencias adaptadoras, cada una de las cuales es específica para un solo sitio CpG diana, es posible detectar cualitativa o cuantitativamente los niveles de metilación relativos de centenares o millares de sitios CpG en un solo experimento. Por ejemplo, sondas de captura diferentes complementarias a secuencias adaptadoras diferentes se inmovilizan sobre un soporte sólido, formando redes, estando localizadas las diferentes secuencias adaptadoras en diferentes posiciones en las redes. Para propósitos de detección, se aplican a las redes mezclas de productos de extensión MSPE que se derivan de sitios CpG diferentes, fijándose cada sitio CpG particular a una sonda de captura particular en una localización particular en las redes. La intensidad de señal del producto MSP marcado en una localización particular puede determinarse por métodos bien conocidos en la técnica, y los niveles relativos de metilación en dichos sitios CpG pueden calcularse por comparación de la intensidad de secuencia en dos localizaciones correspondientes a los estados metilado y no metilado de un sitio CpG particular. Como se ha descrito arriba, el producto de extensión MSPE está abarcado con el marcador primario o el marcador secundario.

Otro aspecto de la presente invención proporciona también un kit para la detección de los niveles relativos de metilación en uno o más sitios CpG de una molécula de ácido nucleico. El kit puede incluir (1) un agente que modifica los nucleótidos de citosina no metilados, (2) iniciadores para amplificación de la molécula de ácido nucleico, (3) iniciadores MSP como se definen en la reivindicación 1 para el ácido nucleico que contiene CpG metilado (marcado o no marcado), (4) iniciadores MSPE como se definen en la reivindicación 1 para el ácido nucleico que contiene CpG no metilado (marcado o no marcado), (5) dNTPs marcados y sin marcar, (6) ddNTPs marcados y sin marcar, y (7) iniciador inverso marcado o sin marcar. El kit puede incluir adicionalmente tampón de amplificación de ácido nucleico y reactivos para las reacciones MSPE. Preferiblemente, el agente que modifica la citosina no metilada es un compuesto bisulfítico.

Otro aspecto de la presente invención proporciona también un método de determinación de una predisposición a una enfermedad o trastorno, o para el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad o trastorno, o para monitorizar la respuesta terapéutica a un fármaco o compuesto en un individuo, que comprende determinar el estado relativo de metilación en uno o más sitios CpG en una molécula de ácido nucleico, y comparar el nivel relativo de metilación en el individuo con el nivel relativo de metilación de dicha molécula de ácido nucleico en un individuo de control (o estándar) que no presenta predisposición alguna a la enfermedad o trastorno, y en donde una diferencia significativa en el nivel relativo de metilación es indicativa de la predisposición a la enfermedad o trastorno en el individuo. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, se excluyen aquellas realizaciones que hacen referencia a métodos de diagnostico practicados en el cuerpo humano o animal.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se utilizó como red modelo la secuencia promotora del gen p16. La secuencia se expone a continuación:

1

Como controles de metilación positivo y negativo se utilizó DNA genómico de las líneas de células HT29 y LNCaP, dado que las mismas se habían confirmado previamente por vía experimental.

El DNA genómico se modificó inicialmente de acuerdo con el método de Frommer (Frommer, M., L.E. McDonald, D.S. Millar, P.M. Collis, F. Watt, G.W. Grigg, P.M. Molloy y C.L. Paul, "A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 1827-1831 (1992)). Resumidamente, 1 \mug de DNA genómico obtenido de cada línea de células HT29 y LNCaP se diluyó en 50 \mul con agua destilada, se añadieron 5,5 \mul de NaOH 2 M, y se incubó a 37ºC durante 10 minutos (para crear DNA monocatenario). Se añadieron a cada tubo 30 \mul de hidroquinona 10 mM recién preparada (Sigma). Se añadieron luego 520 \mul de bisulfito de sodio 3 M recién preparado (Sigma S-8890), de pH 5,0. Los reactivos se mezclaron concienzudamente y se cubrieron luego con aceite mineral, después de lo cual se incubaron a 50ºC durante 16 horas (para una duración más prolongada, la C metilada comienza a convertirse en T). Después de retirar el aceite, se añadió a cada tubo 1 ml de resina Wizard DNA Cleanup (Promega A7280), antes de aplicar la mezcla a una columna miniprep en el kit DNA Wizard Cleanup. La columna se lavó con 2 ml de isopropanol al 80%, y se eluyó con 50 \mul de agua caliente (60-70ºC). Se añadieron a cada tubo 5,5 \mul de NaOH 3 M, y se incubó a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se añadió luego como vehículo 1 \mul de glucógeno, 33 \mul de NH_{4}Ac 10 M, y 3 volúmenes de etanol para precipitación del DNA. Se centrifugó el pelet y se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en 20 \mul de agua. Se utilizó 1 \mul de DNA en cada reacción PCR.

Después de la modificación con bisulfito, la secuencia cambió a (Y denota C/T, dado que la citosina no metilada se ha convertido en uracilo, y se reconoce como timina; la citosina metilada se mantiene intacta como citosina):

2

La reacción PCR se condujo utilizando el protocolo estándar. Un \mul del DNA tratado químicamente se utilizó como amplificación molde de la PCR. En una reacción PCR, se utilizó un procedimiento de desnaturalización inicial de 95ºC durante 10 minutos seguido por un ciclo de 95ºC de 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos para un total de 40 ciclos. Las reacciones PCR se realizaron en un volumen de 50 \mul, que contenía aproximadamente 20 ng de DNA convertido con bisulfito, Tris-HCl 15 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 2,0 mM, KCl 50 mM, 200 \mul de cada uno de los dNTP, 0,4 \muM de concentración final de cada iniciador y 1 unidad de DNA-polimerasa AmpliTaq Gold. Los iniciadores fueron: p16Hmod1F 5' GAAGAAAGAGGAGGGGTTGG 3' (SEQ ID No. 5)/p16Hmod1R 5' CTACAAACCCTCTACCCACC 3' (SEQ ID No. 6). Los amplicones se cuantificaron con Agilent Bio Analyzer®.

Se utilizó una mezcla en serie (Tabla 1) de los dos amplicones con relación variable como molde en una reacción MSPE dúplex utilizando incorporación de dGTP biotinilado. La reacción se inició con una desnaturalización inicial de 95ºC durante 10 minutos seguida por un ciclo de 95ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos para un total de 30 ciclos. La reacción de 25 \mul contenía: 2,5 \mul de amplicones premezclados de relaciones variables (enumerados en la Tabla 1), Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 50 mM, 8 \muM de cada dNTP sin marcar, 4 \muM de dGTP biotinilado, 100 nM de concentración final de cada uno de los iniciadores MSPE, 25 nM de cada iniciador inverso, y 0,5 unidades de polimerasa AmpliTaq Gold. Los iniciadores fueron:

15183, CE-Metil_136U22 5' GAF GCT JTJ ACC TFA JAG CJT TCG TTT CGG TTG ATT GGT TGG TTA C 3' (SEQ ID NO.7), en donde los primeros 24 nucleótidos son la secuencia de código de cremallera.

15184 Metil_252L23 5' GCT ACA AAC CCT CTA CCC ACC TA 3' (SEQ ID NO.8)

15185 CE-unMetil_134U24 5' JCG JCA TFA GCF TCT JGA GFA CGT TTT TGG TTG ATT GGT TGG TTA T 3' (SEQ ID NO.9), en donde los primeros 22 nucleótidos son la secuencia de código de cremallera.

15186 unMetil_252L24 5' CAC TAC AAA CCC TCT ACC CAC CTA 3' (SEQ ID NO.10)

(J = iso G, F = iso C, dos bases AEGIS^{TM} (isoC e IsoG), pares de bases exclusivos no estándar, desarrollados por EraGen Biosciences, licenciados por la Bayer Corporation. Tanto "J" como "F" se designan como "n" en el listado de secuencias de acuerdo con la norma WIPO. Los usos de los símbolos "J" y "F" se aplican también a SEQ ID No's 10 y 11.)

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Cantidad de DNA Molde en el Ensayo MSPE

3

Después de la reacción, se transfirieron los productos MSPE a una agrupación de perlas que contenía perlas Luminex®, que se habían conjugado con oligos derivatizados con amina: 15189 CP32-3a 5' CGA AFG CTF TJA GGT FAF AGC JTC Sp-LCA 3' (SEQ ID No. 11)/15190 CP33-3a 5' GTJ CTC FAG AJG CTJ ATG FCG F-Sp-LCA 3' (SEQ ID No. 12), respectivamente. La conjugación se realizó utilizando el protocolo estándar, y las perlas se resuspendieron a 5.000 \mul en tampón 1 x TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5). La hibridación se condujo por cuadruplicado al mismo tiempo. Básicamente, se transfirieron 4 \mul del producto MSPE a una reacción de hibridación de 50 \mul que contiene 0,5 x tampón de hibridación y perlas Luminex® 8 y 9 (a razón de 2.000 de cada perla). El tampón se preparó a partir de HEPES, sal de sodio, 13,0 g/l, HEPES, ácido libre, 12,0 g/l, lauril-sulfato de litio, 10 g/l, LiCl, 21,2 g/l, seroalbúmina bovina, 10,0 g/l, caseína, 1,5 g/l, BRIJ-35, 10,0 g/l, MgCl_{2}, 2,0 g/l, ZnCl_{2}, 0,00136 g/l, azida de sodio, 0,50 g/l, Proclin-300, 0,50 g/l, pH 7,5. La reacción se incubó a 96ºC durante 2 minutos, 40ºC durante 30 minutos. Las perlas se lavaron una sola vez con 100 y una sola vez con 200 \mul de Tampón de Lavado (0,4 x SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l azida de sodio, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7). Se añadieron a cada reacción 50 \mul de estreptavidina-ficoeritrina diluida en relación 1:500 (SA-PE, 1 mg/ml), se mezcló suavemente a la temperatura ambiente durante 15 minutos (evitando la luz) y se lavó de nuevo con 100 \mul de Tampón de Lavado. Las perlas se resuspendieron en 80 \mul de tampón TTL (Tris 50 mM, Tween-20 0,1%, LiCl 400 mM, pH 8,0), y la medida se realizó en un instrumento Luminex® 100^{TM}.

TABLA 2 Lectura (MFU) de Luminex® 100^{TM}

4

\hskip0,5cm

MFU, Unidad Media de Fluorescencia; M, metilada; U, no metilada; NTC, Control Sin Molde.

Los resultados exhibían una lectura excelente tanto para las señales metiladas como para las no metiladas [Fig. 1] con una cantidad limitada de molde (nivel ng, véase la Tabla 2). El ruido de fondo de la señal metilada y no metilada era mínimo, 1,03 y 18,03 MFU, respectivamente. La relación de señal a ruido era > 22 veces (401,48/18,03, véase la Tabla 2). Las señales tanto metilada como no metilada se discriminaban claramente, con variabilidad mínima (<9,53%) entre las reacciones de cuadruplete. La intensidad de señal de ambas se encuentra en campos comparables, ajustándose estrechamente a una curva binomial (R^{2} > 0,995) [Fig. 1].

Ejemplo 2

5

Se utilizó como controles de metilación positivo y negativo DNA genómico de las líneas de células HT29 y LNCaP, dado que las mismas se habían confirmado previamente por vía experimental.

6

La reacción PCR se condujo utilizando un protocolo estándar. Un \mul del DNA tratado químicamente se utilizó como amplificación molde de PCR. En una reacción PCR, se utilizó un procedimiento de desnaturalización inicial de 95ºC durante 10 minutos seguido por un ciclo de 95ºC de 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 30 segundos para un total de 40 ciclos. Las reacciones PCR se realizaron en un volumen de 50 \mul, que contenía aproximadamente 20 ng de DNA convertido con bisulfito, Tris-HCl 15 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 2,0 mM, KCl 50 mM, 200 \mul de cada uno de los dNTP, 0,4 \muM de concentración final de cada iniciador y 1 unidad de DNA-polimerasa AmpliTaq Gold. Los iniciadores fueron: p16Hmod1F 5' GAAGAAAGAGGAGGGGTTGG 3' (SEQ ID No. 5)/p16Hmod1R 5' CTACAAACCCTCTACCCACC 3' (SEQ ID No. 6). Los amplicones se cuantificaron con Agilent BioAnalyzer®.

15184 Metil_252L23 5' GCT ACA AAC CCT CTA CCC ACC TA 3' (SEQ ID NO.8)

15186 unMetil_252L24 5' CAC TAC AAA CCC TCT ACC CAC CTA 3' (SEQ ID NO.10)

Después de la reacción, los productos MSPE se transfirieron a una agrupación de perlas que contenía perlas Luminex®, que se habían conjugado con oligos derivatizados con amina: 15189 CP32-3a 5' CGA AFG CTF TJA GGT FAF AGC JTC Sp-LCA 3' (SEQ ID No. 11)/15190 CP33-3a 5' GTJ CTC FAG AJG CTJ ATG FCG F-Sp-LCA 3' (SEQ ID No. 12), respectivamente. La conjugación se realizó utilizando el protocolo estándar, y las perlas se resuspendieron a 5.000 \mul en tampón 1 x TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5). La hibridación se condujo por cuadruplicado al mismo tiempo. Básicamente, se transfirieron 4 \mul del producto MSPE a una reacción de hibridación de 50 \mul que contiene 0,5 x tampón de hibridación y perlas Luminex® 8 y 9 (a razón de 2.000 de cada perla). El tampón se preparó a partir de HEPES, sal de sodio, 13,0 g/l, HEPES, ácido libre, 12,0 g/l, lauril-sulfato de litio, 10 g/l, LiCl, 21,2 g/l, seroalbúmina bovina, 10,0 g/l, caseína, 1,5 g/l, BRIJ-35, 10,0 g/l, MgCl_{2}, 2,0 g/l, ZnCl_{2}, 0,00136 g/l, azida de sodio, 0,50 g/l, Proclin-300, 0,50 g/l, pH 7,5. La reacción se incubó a 96ºC durante 2 minutos, 40ºC durante 30 minutos. Las perlas se lavaron una sola vez con 100 y una sola vez con 200 \mul de Tampón de Lavado (0,4 x SSC, 1,0 g/l SDS, 0,50 g/l azida de sodio, 0,50 g/l Proclin-300, pH 7,7). Se añadieron a cada reacción 50 \mul de estreptavidina-ficoeritrina diluida en relación 1:500 (SA-PE, 1 mg/ml), se mezcló suavemente a la temperatura ambiente durante 15 minutos (evitando la luz) y se lavó de nuevo con 100 \mul de Tampón de Lavado. Las perlas se resuspendieron en 80 \mul de tampón TTL (Tris 50 mM, Tween-20 0,1%, LiCl 400 mM, pH 8,0), y la medida se realizó en un instrumento Luminex® 100^{TM}.

TABLA 3 Porcentaje de Metilación Esperado frente al Observado

7

\hskip0,5cm

M, metilado; U, no metilado

La relación esperada frente a la relación molde de entrada se ajusta estrechamente a una curva binomial (R^{2} = 0,9994), demostrando la alta capacidad cuantitativa del ensayo [Fig. 2]. La relación se calculó directamente a partir de la lectura Luminex® 100^{TM} utilizando la curva estándar. El poder predictivo es prácticamente 100%, con independencia de la composición de la diana (desde 0 a 100% de metilación) [Fig. 3].

Una descripción esquemática de la invención se muestra en Fig. 4.

Otras realizaciones

Otras realizaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Debe entenderse que la descripción detallada que antecede se proporciona únicamente por razones de claridad y es meramente ilustrativa.

<110> Bayer HealthCare LLC

\hskip1cm

Li, Zheng

\hskip1cm

Harvey, Jeanne

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\vskip0.400000\baselineskip

<120> ENSAYO PARA DETECTAR EL ESTADO DE METILACIÓN POR EXTENSIÓN CON INICIADORES ESPECÍFICOS DE METILACIÓN (MSPE)

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 1657/2042

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> us 60/530,010

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<151> 2003-12-16

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\vskip0.400000\baselineskip

<160> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn version 3.3

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgaacgctct gaggtcacag cgtc

\hfill

24

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Artificial

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<220>

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<223> Iniciador

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<400> 2

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgctccaga ggctgatgcc gc

\hfill

22

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia promotora después de tratamiento con bisulfito

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> base_modificada

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(340)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Y en las posiciones 41, 46, 48, 52, 56, 59, 65, 87, 91, 94, 112, 115,118, 139, 157, 161, 163, 168, 174, 189, 193, 205, 211, 221, 226, 236, 240, 247, 274, 290, 294, 307 y 338 denota C/T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagaaagag gaggggttgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctacaaaccc tctacccacc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" en las posiciones 3, 7, 9, 14, 16 y 20 es base modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)..(14)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20)..(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gangctntna cctnanagcn ttcgtttcgg ttgattggtt ggttac

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctacaaacc ctctacccac c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(45)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" en las posiciones 1, 4, 8, 12, 16 y 20 es base modificada.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ncgncatnag cntctngagn acgtttttgg ttgattggtt ggtta

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactacaaac cctctaccca ccta

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" en las posiciones 5, 9, 11, 16, 18 y 22 es base modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)..(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)..(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)..(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (18)..(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaangctnt naggtnanag cntc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<223> "n" en las posiciones 3, 7, 11, 15 y 19 es base modificada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)..(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)..(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)..(15)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> característica_misc

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)..(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtnctcnaga ngctnatgnc g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacgctgtga cctcagagcg ttcg

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggcatcag cctctggagc ac

\hfill

22

Claims

1. Un método de detección de la metilación en 5' del DNA en un residuo citosina de un sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico, que comprende:

(a) obtener DNA de una muestra a analizar;

(b) poner en contacto el DNA con un compuesto bisulfítico;

(c) amplificar el DNA utilizando iniciadores específicos de cadena;

(d) realizar una reacción de extensión con iniciadores utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra;

(f) determinar el estado de metilación en 5' en el residuo citosina del sitio CpG por comparación de la intensidad de hibridación del DNA metilado con la intensidad de hibridación del DNA no metilado en la muestra;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, dNTPs marcados, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el residuo Terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo Terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, dNTPs, ddCTP marcado y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna en la
muestra;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores de metilación específicos de extensión con iniciadores (MSPE) que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina en el sitio CpG a analizar, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, mezcla de dNTPs y ddNTPs marcados, mezcla de dNTPs y ddNTPs sin marcar, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 3' del primer iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho primer iniciador MSPE comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra; en donde el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior de la secuencia de DNA no metilada, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior, y el extremo 5' de dicho segundo iniciador MSPE comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE específicos que se hibridan a la cadena superior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna contenida en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo citosina del sitio CpG a analizar; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna existente en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena superior del DNA no metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo timina que se deriva de la citosina del sitio CpG a analizar; y

(e) los productos de la extensión con iniciadores de (d) se hibridan a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es el mismo que la primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es el mismo que la segunda secuencia exclusiva;

o en donde

(d) la reacción de extensión con iniciadores se realiza utilizando al menos un par de iniciadores MSPE que se hibridan a la cadena inferior del DNA amplificado, al menos un iniciador inverso marcado, dNTPs, y una DNA-polimerasa, en donde el extremo 5' del primer iniciador MSPE del par comprende una primera secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia de DNA alguna existente en la muestra, y el extremo 3' del primer iniciador MSPE comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo guanina complementario a la citosina en el sitio CpG en la cadena superior; en donde el extremo 5' del segundo iniciador MSPE del par comprende una segunda secuencia exclusiva que no se hibrida a secuencia alguna de DNA existente en la muestra, y el extremo 3' del segundo iniciador MSPE del par comprende una secuencia de polinucleótidos que es específica para la cadena inferior del DNA no metilado, el residuo terminal 3' del iniciador se hibrida al residuo adenina que se deriva de la citosina del sitio CpG en la cadena superior; y

(e) los productos de la extensión con iniciadores de (d) se hibridan a al menos un par de oligonucleótidos, en donde el primer oligonucleótido del par es el mismo que la primera secuencia exclusiva, y el segundo oligonucleótido del par es el mismo que la segunda secuencia exclusiva.

2. Uso del método de la reivindicación 1 para detectar una enfermedad o trastorno en un individuo, en donde una diferencia significativa en el estatus de metilación de un residuo citosina de un sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico de dicho individuo, como se determina utilizando el método de la reivindicación 1, comparado con el estatus de metilación del mismo sitio CpG en una secuencia de ácido nucleico de un individuo o estándar que no padece la enfermedad o el trastorno, como se determina utilizando el método de la reivindicación 1, es indicativo de la presencia de dicha enfermedad o trastorno en dicho individuo.

3. Un kit para la detección de ácido nucleico que contiene CpG metilado procedente de una muestra que comprende: (1) un compuesto bisulfítico; (2) iniciadores para amplificación de la molécula de ácido nucleico; (3) iniciadores MSPE como se definen en la reivindicación 1 para ácidos nucleicos que contienen CpG metilado; (4) iniciadores MSPE como se definen en la reivindicación 1 para ácidos nucleicos que contienen CpG no metilado; (5) dNTPs marcados y sin marcar; (6) ddNTPs marcados y sin marcar; y (7) iniciadores inversos marcados o sin marcar.