ES2282129T3 - Procedimiento para producir un cultivo de celulas aviares iniferenciadas utilizando celulas aviares primordiales germ. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir un cultivo de células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres embrionarias que es capaz de soportar una división celular adicional, comprendiendo el procedimiento: (a) recoger células gonadales aviares que comprenden células germinales primordiales a partir de un embrión aviar después de la formación de la línea primitiva, (b) depositar la células gonadales aviares en contacto con una matriz de alimentación acondicionada previamente que comprende células de fibroblasto, y (c) cultivar las células gonadales aviares sobre la matriz de alimentación acondicionada previamente en presencia de medio durante un tiempo suficiente para producir un cultivo celular aviar que consiste esencialmente en células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres embrionarias.
Description
Procedimiento para producir un cultivo de
células aviares indiferenciadas utilizando células aviares
primordiales germ.
La presente invención se refiere a células
aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres
embrionario en general, y en particular se refiere a células aviares
germinales primordiales y células aviares indiferenciadas que
expresan un fenotipo de células madres embrionario.
- ATCC
- - Colección de Cultivos de Tipo Americano
- bFGF
- - factor básico de crecimiento fibroblástico
- BRL
- - hígado de rata búfalo
- DMEM
- - medio Eagle modificado Dulbecco
- EDTA
- - etilendiamine tetra acetato
- ES
- - células madre embrionarias
- ESCs
- - células madres embrionarias
- FBS
- - suero fetal bovino
- FGF
- - factor de crecimiento de fibroblasto
- H&H
- - sistema de técnica de Hanburger & Hamilton
- IGF
- - factor de crecimiento similar a la insulina
- LIF
- - factor inhibidor de la leucemia
- PBS
- - salino tamponado con fosfato
- PGCs
- - células madres primordiales
- SSEA-1
- - marcador específico de etapa de antígeno embrionario de ratón para PGCs y ESCs
- STO
- - línea de células de fibroblasto de ratón
- SCF
- - factor de células madre (también llamado "steel factor" o SF)
- TGF-\beta1
- - factor transformador de crecimiento-\beta1.
En mamíferos, las células germinales
primordiales cultivadas a partir de la cresta genital tienen la
habilidad de dar lugar a células madres embrionarias pluripotentes.
Por ejemplo, la Patente U.S. Nº 5.690.926 publicada el 25 de
noviembre, 1997, de Hogan; la Patente U.S. Nº 5.670.372
publicada el 23 de setiembre, 1997, de Hogan; y la Patente
U.S. Nº 5.537.357 publicada el 26 de setiembre, 1995, de
Hogan, describiendo cada una células madres embrionarias
pluripotenciales de mamífero y procedimientos para realizar las
mismas. El descubrimiento de estas patentes está limitado a células
madres embrionarias de mamífero y en particular al cultivo de murina
y otras células madres embrionarias de mamífero utilizando una
combinación de factores de crecimiento que consisten en SCF, FGF y
LIF.
La técnica anterior actual informa sobre el
cultivo de células germinales primordiales aviarias (PGCs) han
concentrado los esfuerzos para mantener un fenotipo PGC y para
estimular la proliferación. Ver por ejemplo, Chang, I.K. et
al., Cell. Biol. Int. 1997 Agosto; 21 (8):
495-9; Chang,I. K. et al., Cell. Biol. Int.
1995 Febrero; 19 (2): 143-9; Allioli, N. et
al., Dev. Biol. 1994 Septiembre; 165(1):
30-7 y PCT Publicación Nº WO 99/06533, publicada el
11 Febrero, 1999 (Solicitante - University of Massachusetts;
Inventores - Ponce de Leon et al.).
Las células aviares no diferenciadas que
expresan un fenotipo de célula madre embrionaria (ESC) y los
procedimientos para producir las mismas se describen en la patente
U.S. Nº 5.340.740 publicada el 23 de agosto, 1994 por Petitte et
al.; la patente U.S. Nº 5.656.479 publicada el 12 de agosto,
1997 por Petitte et al.; y la patente U.S. Nº 5.830.510
publicada el 3 de noviembre, 1998 por Petitte et al. Las
células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo ESC son
útiles, entre otras cosas, como una herramienta para el estudio de
desarrollo embrionario (es decir, mediante el marcado de las
células con un gen marcador y observando su distribución después de
inyección in vivo) y para la producción de aves de corral
transgénicas. Son útiles para permitir la aplicación de
recombinación homóloga a la producción de aves de corral
transgénicas. En vista de dichos usos, el desarrollo de
procedimientos adicionales para obtener
células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo ESC representa una necesidad continuada en la técnica.
células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo ESC representa una necesidad continuada en la técnica.
Se describe un procedimiento para producir un
cultivo sostenido de células aviares no diferenciadas expresando un
fenotipo de célula madre embrionaria. El procedimiento comprende:
(a) recoger células aviares gonadales que comprenden células madres
primordiales a partir de un embrión aviar después de la formación de
la línea primitiva; (b) depositar las células aviares en contacto
con una matriz de alimentación acondicionada previamente que
comprende células de fibroblasto, y (c) cultivar las células aviares
sobre la matriz de alimentación en presencia de un medio durante un
medio suficiente para producir un cultivo de células aviares que
consiste esencialmente en células aviares no diferenciadas que
expresan un fenotipo de células madres embrionarias.
Las células aviares se recogen a partir de un
embrión más tarde de la etapa 14 (H&H), preferentemente a partir
de un embrión de etapa 14 hasta una etapa 45, más preferentemente a
partir de un embrión de etapa 15 hasta una etapa 31, y aún más
preferentemente a partir de un embrión de etapa 27 hasta la etapa
30. Más preferentemente, las células aviares se depositan en
contacto con la matriz de alimentación en un número que oscila entre
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 células. Aún
más preferentemente, aproximadamente se depositan 20.000 células
aviares en contacto con la matriz de alimentación.
La matriz de alimentación puede comprender
células de fibroblasto. Las células de fibroblasto pueden estar
presentes en la matriz de alimentación en un número que oscila desde
aproximadamente 40.000 hasta aproximadamente 60.000 células,
preferentemente desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente
60.000 células, aún más preferentemente, desde aproximadamente
55.000 hasta aproximadamente 60.000 células. Más preferentemente,
aproximadamente 60.000 células de fibroblasto están presentes en la
matriz de alimentación.
Preferentemente, las células de fibroblasto
comprende células de fibroblasto de ratón, más preferentemente
células de fibroblasto de ratón STO. En una realización preferida,
las células de fibroblasto de ratón forman una capa de alimentación
de fibroblasto de ratón.
El embrión aviar es un embrión opcionalmente
seleccionado a partir del grupo que incluye, pero no se limita, a
pollos, pavos, patos, ocas, codornices y embriones de faisán. En una
realización preferida, el embrión aviar es un embrión de pollo.
Por lo tanto, es un objeto de la presente
invención proporcionar un proceso novedoso para el cultivo de
células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo de
células madres embrionarias.
Es otro objeto de la presente invención
proporcionar un procedimiento para el cultivo de células aviares no
diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres
embrionarias a partir de células aviares que comprenden células
madre primordiales.
Es un objetivo adicional de la presente
invención proporcionar una matriz de alimentación para utilizar en
la preparación de un cultivo de células aviares no diferenciadas que
expresan un fenotipo de células madres embrionarias no
diferenciadas utilizando células germinales aviares
primordiales.
Es otro objetivo de la presente invención
caracterizar un número óptimo de células aviares que comprenden
células germinales primordiales para su uso en el establecimiento de
un cultivo de células aviares no diferenciadas que expresan un
fenotipo de células madres embrionarias.
Alguno de los objetos de la invención se han
establecido con anterioridad, otros objetivos se harán evidentes en
la continuación de la descripción, cuando se relacionan con los
Ejemplos de Laboratorio y Dibujos adjuntos como se describe mejor a
continuación.
La figura 1 es un gráfico de barras que
representa la tasa de supervivencia de PGCs gonadales sobre un
número diferente de células alimentadoras STO en cultivo. Se
sembraron 10.000 células gonadales por pozo sobre un número
diferente de células STO (50.000, 55.000 y 60.000 células por pozo).
Se contaron células positivas a los antígenos-1
embrionarios específicos de etapa de ratón (SSEA-1 -
un marcador para PGCs y ESCs) así como el número de PGCs a los 0, 1
y 3 días después del cultivo. En el grupo de las 60.000 células por
pozo el número de PGCs se muestra más alto que los otros grupos en
el día 3 (P < 0,05). Este resultado indica que se prefiere una
monocapa substancialmente completa de células alimentadoras, por
ejemplo una monocapa que comprende aproximadamente 60.000 células,
para el cultivo de PGCs.
La figura 2 es un gráfico de barras que describe
la tasa de supervivencia de cultivos de PGC gonadal que utilizan
células de alimentación previamente acondicionadas STO. Se sembraron
20.000 células gonadales por pozo sobre 60.000 células STO por pozo
después de 1 o 2 días de acondicionamiento previo. Las PGCs muestran
una alta tasa de supervivencia con 2 días de acondicionamiento
previo.
La figura 3 es un juego de gráficos de barra que
describen los efectos de la siembra de diferente número de células
gonadales por pozo de cultivo.
La figura 3A es un gráfico de barras que
describe el número de colonias mayor de 20 células positivas
SSEA-1 sobre diferentes números de células STO
(40.000, 50.000 o 60.000 por pozo - referidos como "40",
"50", y "60" de la Leyenda presentada en la figura 3A)
después de sembrar 10.000 o 20.000 células gonadales por pozo
(referidas como "10" y "20" en la Leyenda presentada en
la figura 3A). Por lo tanto, en la Leyenda presentada en la figura
3A, las designaciones "40/10", "50/10" y "60/10"
respectivamente se refieren a células STO que ascienden a 40.000,
50.000 o 60.000 por pozo y a la siembra de 10.000 células gonadales
por pozo, y las designaciones "40/20", "50/20" y
"60/20" respectivamente se refieren a células STO que ascienden
a 40.000, 50.000 o 60.000 por pozo y a la siembra de 20.000 células
gonadales por pozo.
La figura 3B es un gráfico de barra que describe
la proliferación de PGCs gonadales sobre un número diferente de
células STO (40.000, 50.000 o 60.000 por pozo - referidas como
"40", "50" y "60" en la Leyenda presentada en la
figura 3B) después de sembrar 10.000 o 20.000 células gonadales por
pozo (referidas como "10" y "20" en la Leyenda presentada
en la figura 3B). Por lo tanto, la Leyenda presentada en la figura
3B, las designaciones "40/10", "50/10" y "60/10"
respectivamente se refieren a células STO que ascienden a 40.000,
50.000 o 60.000 por pozo y a la siembra de 10.000 células gonadales
por pozo, y las designaciones "40/20", "50/20" y
"60/20" respectivamente se refieren a células STO que
ascienden a 40.000, 50.000 o 60.000 por pozo y a la siembra de
20.000 células gonadales por pozo. La proliferación de PGCs
individuales fue más alta (P < 0,05) utilizando 20.000 células
gonadales versus 10.000 células gonadales. De forma similar, el
número de colonias positivas SSEA-1 formadas
después de 5 días depende del número de células gonadales
sembradas.
La figura 4 es una serie de fotografías que
muestran el teñido de SSEA-1 de células gonadales de
pollo cultivadas sobre células STO durante cinco días, como se
describe con anterioridad para la figura 3.
La figura 4A describe un cultivo recién sembrado
(día 0) que muestra una PGC individual SSEA-1
positiva. Sólo fueron positivas las PGCs para el epitope
SSEA-1 en el inicio del cultivo.
La figura 4B describe una colonia de células ES
positivas SSEA-1 después del cultivo durante tres
días.
La figura 4C describe una colonia mayor de
células ES derivadas PGC después de tres días de cultivo.
La figura 4D describe una imagen de bajo aumento
de un cultivo de 3 días teñido con SSEA-1. Obsérvese
las PGCs teñidas individualmente y las colonias de células ES
SSEA-1 positivas.
La figura 4E describe el teñido
SSEA-1 de colonias de células ES después de 5 días
de cultivo.
La figura 4F describe una imagen de alto aumento
de una colonia de células ES derivadas PGC después de 5 días de
cultivo.
En mamíferos, las células germinales
primordiales cultivadas a partir de la cresta genital tienen la
habilidad a dar lugar a células madre embrionarias pluripotentes.
Sin embargo, informes sobre el cultivo de PGCs aviares se han
concentrado en los esfuerzos para mantener un fenotipo PGC y en
estimular la proliferación. Por lo tanto, un objetivo de la
presente invención era desarrollar y proporcionar un procedimiento
que permitiría el desarrollo de células aviares no diferenciadas
que expresan un fenotipo de células madres embrionarias de PGCs
aviares.
A diferencia de PGC aisladas a partir de
embriones de mamíferos como se describe en la Patente U. S. Nº
5.690.926 publicada el 25 de Noviembre, 1997 por Hogan,
Patente U. S. Nº 5.670.372 publicada el 23 de Setiembre, 1997 por
Hogan, y Patente U. S. Nº 5.537.357 publicada el 26 de
Setiembre, 1995 por Hogan, las células aviares gonadales que
comprenden células madres primordiales aisladas según la presente
invención también comprenden un número significativo de células
estromales. La presencia de células estromales añade un desarrollo
complicado al procedimiento de la presente invención que no se
observa en sistemas mamíferos.
Mientras los siguientes términos se cree que son
bien entendidos por alguien con habilidad ordinaria en la técnica,
se establecen las siguientes definiciones para facilitar la
explicación de la invención.
El término "aviar" tal como se emplea aquí
se refiere a cualquier especie aviar, incluyendo, pero no limitado
a Gallinacea sp., pollos, pavos, patos, gansos, codornices y
faisanes. Comúnmente se prefiere el pollo.
\newpage
El término "sostenido" tal como se emplea
aquí respecto a células ES y cultivos de células ES se refiere a
una célula o cultivo celular capaz de soportar una división celular
adicional, aún cuando las células están eventualmente sujetas a
senescencia.
La frase "fenotipo de células madre
embrionarias" se refiere a células aviares no diferenciadas que
tienen un núcleo grande, un nucléolo prominente, y poco
citoplasma.
Se ha informado que PGCs de ratón mantenidas en
capas de células de alimentación STO en presencia de LIF y bFGF
resultan en células que se asemejan a células madres embrionarias.
Ver Resnick et al. Nature 359:
550-551 (1992); Matsui et al., Cell
70: 841-843 (1992). Resnick et al.
Nature 359: 550-551 (1992) sugiere que tales
células se designan como "germen embrionario" (EG) para células
de conveniencia para implicar que se originan a partir de PGCs
in vitro. Sin embargo, se reconoce entre aquellos con un
conocimiento ordinario en la técnica que las células germinales
embrionarias y las células madres embrionarias son fenotípicamente
lo mismo por el hecho de que se ven iguales bajo inspección
microscópica (a pesar de diferencias informadas en la metilación de
algunos genes), desarrollan los mismos marcadores inmunológicos, y
son funcionalmente lo mismo en el hecho de que ambas han mostrado
que se diferencian extensivamente en cultivo y que contribuyen a
quimeras cuando se inyectan en blastocitos huéspedes, demostrando
así su naturaleza pluripotente y totipotente. Por lo tanto, la
frase "células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo
de células madres embrionarias" abarca células derivadas a
partir de células aviares germinales primordiales y por lo tanto se
utiliza para describir las células cultivadas según el
procedimiento de la presente invención.
Siguiendo una convención de la ley de patentes
vigente desde hace tiempo, los términos "un" y "una"
significan "uno o más" cuando se utilizan en esta solicitud,
incluyendo las reivindicaciones.
Los embriones aviares a partir de los cuales se
obtienen células para llevar a cabo la presente invención se hallan
en una etapa después de la formación de la línea primitiva y se
hallan en una etapa anterior a la diferenciación sexual. Los
embriones aviares a partir de los cuales se obtienen las células
para llevar a cabo la presente invención se hallan preferentemente
después de la etapa 14, más preferentemente etapa 14 a etapa 15,
aún más preferentemente etapa 15 a etapa 31, incluyendo las etapas
17, 18, 19, 20 y 21, y más preferentemente en la etapa 27 a 30 de
desarrollo del sistema de etapas de Hanburguer & Hamilton
(H&H).
Dichos embriones pueden obtenerse
convenientemente a partir de huevos fertilizados que se incubaron
durante aproximadamente 55 hasta aproximadamente 168 horas (es
decir desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 7 días), más
preferentemente durante aproximadamente 72 hasta aproximadamente 168
horas (es decir desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7
días), aún más preferentemente durante aproximadamente 96 hasta
aproximadamente 168 horas (es decir desde aproximadamente 4 hasta
aproximadamente 7 días), y aún más preferentemente durante
aproximadamente 96 hasta aproximadamente 120 horas (es decir desde
aproximadamente 4 hasta aproximadamente 5 días). En una realización
preferida las células PGCs embrionarias gonadales y estromales
pueden recogerse a partir de gónadas embrionarias utilizando una
solución adecuada, tales como EDTA y/o solución tamponadora.
Preferentemente, se tiene cuidado de obtener una suspensión de una
única célula.
Por lo tanto, un aspecto de la presente
invención se refiere a la producción de células aviares no
diferenciadas que expresan un fenotipo de célula madre embrionaria
a partir de células aviares gonadales que comprenden células
germinales primordiales recogidas a partir de un embrión aviar.
Antes del descubrimiento de la presente invención, la vista general
entre aquellos con habilidad ordinaria en la técnica era que las
células embrionarias gonadales aviares que comprenden células
germinales primordiales, tales como pueden recogerse a partir de,
por ejemplo, la cresta genital o gónada embrionaria aviar,
finalmente se diferenciarían sólo en células germinales. La
presente invención muestra que una porción de células gonadales
aviares comprenden células primordiales germinales recogidas a
partir de, por ejemplo, la cresta genital o gónadas, de un embrión
aviar se vuelven células no diferenciadas que expresan un fenotipo
de células madre embrionarias. Por lo tanto, el procedimiento de la
presente invención proporciona por conveniencia durante el cultivo
de células no diferenciadas que expresan un fenotipo de células
madre embrionarias en las que las células germinales primordiales
pueden aislarse en números mayores a partir de, por ejemplo, la
cresta genital o las gónadas, y son típicamente más fáciles de
aislar en vista del desarrollo más avanzado del embrión aviar.
Típicamente, los cultivos de la presente
invención incluyen una matriz de alimentación como se define aquí.
Una matriz de alimentación puede ser tanto células como líneas de
células cultivadas con el propósito de obtener ESCs.
Alternativamente, una matriz de alimentación puede derivarse a
partir de o proporcionarse por el órgano o tejido en el cual se
ubican las células madres primordiales, por ejemplo, la gónada.
Alternativamente, las células de alimentación que comprenden la
matriz de alimentación pueden sustituirse con una matriz
extracelular más factores de crecimiento ligados.
Una matriz de alimentación como se emplea aquí
está construida según los procedimientos conocidos en la técnica.
Como se indica con anterioridad, la matriz de alimentación está
acondicionada previamente. Mediante el término "acondicionada
previamente" se indica que la matriz de alimentación se cultiva
en presencia de medio durante un período de tiempo previo al
depósito de las células gonadales que comprenden células germinales
primordiales en contacto con la matriz de alimentación, por ejemplo
un tiempo suficiente para iniciar y establecer la producción de,
por ejemplo, factores de crecimiento u otros factores mediante la
matriz de alimentación. Como se describe en los Ejemplos de
Laboratorio, una matriz de alimentación está acondicionada
previamente mediante el cultivo de la matriz de alimentación en sí
durante uno o dos días antes del depósito de células gonadales que
comprenden células germinales primordiales en contacto con la
matriz de alimentación.
La matriz de alimentación preferentemente
comprende células de fibroblasto de ratón. Se prefieren los
fibroblastos STO, pero los fibroblastos primarios también son
adecuados. También, mientras la presente invención se ha descrito
respecto al uso de matrices de alimentación de células de ratón, se
contempla que matrices de alimentación que comprenden células a
partir de otras especies murinas (por ejemplo, rata); también pueden
utilizarse otras especies mamíferas (por ejemplo, especies
unguladas, bovinas y porcinas); o especies avícolas (por ejemplo,
Gallinacea, pollos, pavos, patos, gansos, codornices y
faisanes).
El procedimiento de cultivo de la presente
invención puede comprender opcionalmente el establecimiento de una
monocapa de células de alimentación. Las células de alimentación
pueden inactivarse mitóticamente utilizando técnicas estándar. Por
ejemplo, las células de alimentación pueden exponerse a radiación
gamma (por ejemplo, 4000 Rads de radiación gamma) o pueden tratarse
con Mitomicina C (por ejemplo, 10 \mug/ml durante
2-3 horas). Los procedimientos para inactivar
mitóticamente células también se detallan en la información
típicamente enviadas con células desde la American Type Culture
Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA
20110-2209 (por ejemplo, están disponibles células
de alimentación STO bajo el número de adquisición ATCC 1503). Las
monocapas opcionalmente pueden cultivarse hasta aproximadamente 80%
de confluencia, preferentemente hasta aproximadamente 90% de
confluencia, y más preferentemente aproximadamente 100% de
confluencia. Mientras que la configuración de las células de
alimentación como una monocapa es la configuración preferida para el
cultivo, cualquier configuración adecuada se contempla como dentro
del ámbito de la presente invención. Por lo tanto, por ejemplo,
capas, monocapas, grupos, agregados u otras asociaciones o
agrupamientos de células de alimentación se contemplan como
incluidas dentro del ámbito de la presente invención y están
particularmente contempladas como incluidas dentro del significado
del término "matriz".
Por lo tanto, las PGCs aviares pueden extenderse
de forma no uniforme a través de las células de alimentación
vertical, horizontal, diagonalmente o en cualquier combinación de
las mismas, de forma tal que se forman los agregados celulares.
Según la presente invención, se contempla por lo tanto que los
cultivos pueden formarse mediante la mezcla de PGCs con células de
alimentación apropiadas e insertando la mezcla en un contenedor de
cultivo adecuado, tal como una placa
multi-pozos.
El medio utilizado para llevar a cabo la
presente invención puede ser cualquier medio adecuado. El medio
puede ser un medio acondicionado o un medio sintético, siendo ambos
conocidos en la técnica. El medio acondicionado, y en particular
medio acondicionado BRL, es el comúnmente preferido. A modo de
ejemplo, el medio acondicionado BRL se prepara según técnicas
reconocidas en la técnica, tal como se describe en Smith, A. G. y
Hooper M. L., Dev. Biol. 1987 Mayo; 121(1):
1-9. Células BRL están disponibles en la ATCC bajo
el número de adquisición CRL-1442. Opcionalmente,
el medio puede suplementarse con factores de crecimiento, incluyendo
pero no limitándose al factor de inhibición de leucemia (LIF),
factor de crecimiento a modo de insulina (IGF), factor de
crecimiento de fibroblasto (FGF), factor básico de crecimiento de
fibroblasto (bFGF), factor de células madre (SCF - también llamado
factor acero o SF), factor \beta1 de crecimiento transformador
(TGF-\beta1) y ácido antiretinóico.
En una realización preferida, las células
gonadales embriónicas aviares comprenden células germinales
primordiales a partir de un embrión aviar incubado de cuatro a
cinco días que se siembran sobre la matriz de alimentación
acondicionada previamente con medio acondicionado, y las células
aviares dan lugar a nidos o colonias de células que exhiben un
fenotipo de células madre embrionarias. A diferencia del caso con
células madres de mamífero, comúnmente se prefiere tener una matriz
de alimentación acondicionada previamente para facilitar la
supervivencia y desarrollo de PGCs aviares en células aviares no
diferenciadas que expresan un fenotipo ESC. Las células
embrionarias aviares de la presente invención pueden cultivarse
durante al menos uno o dos meses como es típico para un cultivo
primario de células, lo que es significativamente mayor que la vida
usual de dos semanas de cultivos primarios de células a partir de
un embrión aviar no incubado.
Los cultivos celulares de la presente invención
pueden formularse para la administración a animales mediante la
disociación de las células (por ejemplo, mediante disociación
mecánica) y mezclando íntimamente las células con un vehículo
farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, solución salina tamponada
con fosfato (PBS)). Las células aviares en tales formulaciones
pueden prepararse para transportar una secuencia heteróloga de ADN
en un sujeto aviar en la forma descrita con mayor detalle a
continuación.
Las células aviares no diferenciadas producidas
por el procedimiento de la presente invención son útiles, entre
otras cosas, como una herramienta para el estudio de desarrollo
embrionario (es decir, mediante el marcado de las células con un
gen marcador y observando su distribución después de la inyección
in vivo) y la producción de aves de corral transgénicas. Son
útiles al permitir la aplicación de recombinaciones homólogas a la
producción de aves de corral transgénicas.
Las células aviares no diferenciadas que
expresan un fenotipo de células madres embrionarias también deberían
ser útiles para la producción de quimeras aviares, incluyendo
quimeras aviares transgénicas. Se contempla que las quimeras
aviares transgénicas serían útiles para la recuperación de proteínas
heterólogas, que preferentemente pueden recuperarse directamente de
los huevos de dichas quimeras aviares transgénicas. Por ejemplo,
tales aves pueden utilizarse para la producción y la recuperación
de proteínas terapéuticas y otros polipéptidos.
En especies aviares, se han aislado ciertos
tipos de células donantes que retienen viabilidad cuando se inyectan
en embriones receptores. Ver Etches et al., Poultry
Science 72: 882-887 (1993); Etches et
al., en Avian Incubation, Capítulo 22, Butterworth
Publishers (1990); Verrinder Gibbins et al., Fourth World
Congress on Genetics Applied to Livestock Production,
Edinburgh, (1990); Petitte et al., Development 108,
185-189 (1990)). Estos estudios muestran que
células blastodérmicas derivadas de embriones en Etapa X (embrión en
la oviposición) permanecen viables cuando se transfieren a
embriones receptores en Etapa X comparables. Por lo tanto, la
presente invención proporciona un nuevo procedimiento de alteración
del fenotipo de un ave y las aves así producidas con las células
madres embrionarias aviares aquí descritas. El procedimiento
comprende transfectar células madres embrionarias aviares como se
describen aquí con la secuencia de ADN in vitro (por ejemplo,
mediante electroporación o transformación con un vector
retroviral), e inyectándolas luego las células madres embrionarias
transfectadas en un huevo que contiene un ave embrionaria (por
ejemplo, en el saco vitelino o en la membrana corioalantoica,
preferentemente en la cavidad subgerminal, y preferentemente durante
del desarrollo embrionario temprano (por ejemplo, antes del día 2 o
3 de incubación, y más preferentemente antes del día 1 de
incubación), con la secuencia de ADN siendo efectiva para provocar
un cambio en el fenotipo en el ave después de la incubación (por
ejemplo, un cambio en la expresión de proteína, un cambio en la
tasa de crecimiento, eficiencia de alimentación, resistencia a
enfermedades, o una combinación de todos estos factores).
Preferentemente, el huevo en el cual se
introduce el ADN se incuba hasta la incubación, y el ave producida
de esta manera se cría hasta por lo menos una edad en la cual se
expresa el cambio en el fenotipo. No tiene consecuencias deletéreas
si el embrión transformado y el ave es quimérica, en tanto y en
cuanto se logra una respuesta fisiológica en el animal después de
incubación suficiente para suscitar un cambio fenotípico medible en
cualquier forma adecuada. A modo de ejemplo adicional, la expresión
de la proteína en la quimera, o la cría transgénica de la misma
producida por la transmisión de la línea germinal de la secuencia de
ADN, puede establecerse a través de la incorporación de un promotor
incluido en la secuencia de ADN introducido acoplado con
tratamiento de la quimera, o cría transgénica de la misma, con un
agente que induce al promotor.
El mecanismo de inyección in ovo no es
crítico, pero se prefiere que el procedimiento no dañe demasiado los
tejidos y órganos del embrión o las membranas extraembrionarias que
lo rodean de forma que el tratamiento no disminuirá la tasa de
incubación. Por ejemplo, los solicitantes han llevado a cabo
inyecciones in ovo mediante la formación de una ventana en
un huevo y utilizando entonces una micro pipeta o aguja para la
inyección, tal como una micro pipeta de 50 \mum de diámetro o una
aguja de 50 \mum de diámetro. Si se desea, el huevo puede
sellarse con un material de sellado substancialmente impermeable a
las bacterias tal como cera o similar para evitar la subsiguiente
entrada de bacterias no deseadas. El material adecuado de sellado
puede comprender opcionalmente composiciones antimicrobianas
biológicamente aceptables.
Se prevé que un sistema de inyección automático
de alta velocidad para embriones aviares será particularmente
adecuado para practicar la presente invención. Todos dichos
dispositivos, adaptados para practicar la presente invención,
comprenden un inyector que contiene las células aviares no
diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres
embrionarias como se describe aquí, con el inyector posicionado para
inyectar con el ADN un huevo transportado por el aparato. Además,
un aparato de sellado operativamente asociado con el aparato de
inyección puede proporcionarse para sellar el orificio en el huevo
después de la inyección del mismo.
La secuencia de ADN introducida in ovo
con células madres embrionarias de la invención es, en general, una
construcción que comprende un promotor funcional en células aviares
y un gen que codifica un péptido o proteína operativamente unido al
promotor. Preferentemente, la proteína o péptido es fisiológicamente
activo y capaz de producir un cambio fenotípico en el ave. En
general, la construcción de ADN puede ser una secuencia lineal de
ADN (introducida en las células madres embrionarias de la invención
mediante electroporación) o una secuencia transportada por un
vector u otro transportador adecuado para transforma las células
madres embrionarias de la invención utilizando varias técnicas
conocidas en la técnica, tales como liposomas, fosfato de calcio,
electroporación o DMSO. Los vectores, como se discute más adelante,
pueden ser plásmidos, virus (incluyendo retrovirus), y fagos, ya
sea en forma nativa o derivados de los mismos.
Son ilustrativos de los genes que codifican una
proteína o péptido aquellos que codifican una proteína o péptido
seleccionado a partir de un grupo que consiste en hormona de
crecimiento, hormona de liberación tiroidea (TRH), MDX de Marek, y
antígenos recombinantes inmunogénicos tales como aquellos para
diarrea parasitaria.
Es bien conocida la producción de genes
clonados, ADN recombinante, vectores, células huésped transformadas,
proteínas y fragmentos de proteínas mediante ingeniería genética.
Ver por ejemplo, Pat. U.S. Nº 4.761.371 de Bell et
al. en Col. 6 línea 3 hasta Col. 9 línea 65; Pat. U.S. Nº
4.877.729 de Clark et al. en Col. 4 línea 38 hasta Col. 7
línea 6; Pat. U.S. Nº 4.912.038 de Schilling en Col. 3 línea
26 hasta Col. 14 línea 12. Los protocolos para restricción de
digestión de endonucleasa, preparación de vectores, purificación de
ADN y otros procedimientos como éstos son esencialmente como se
describe en manuales estándar de clonado. Ver Sambrook et
al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (2º Ed.,
Cold Spring Harbor Press, N. Y. (1989)).
Un vector es una construcción de AND replicable
utilizada aquí ya sea para amplificar y/o expresar el ADN que
codifica el gen de interés. Un vector de expresión adecuado tendrá
elementos de control capaces de expresar el ADNc clonado o ADN
genómico ubicado en la orientación correcta cuando el vector se
introduce en el huésped correcto. Tales elementos típicamente
incluyen pero no están limitados a una región promotora que
interactúa específicamente con proteínas celulares implicadas en la
transcripción o que pueden ser inducibles mediante la aplicación de
un agente inductor, elementos potenciadores que pueden estimular la
transcripción varias veces a partir de promotores heterólogos
ligados, un receptor ensamblado y/o una secuencia donante, y señales
de terminación y poliadenilación. También se requiere la secuencia
para un sitio de unión de ribosoma capaz de permitir la traducción
y que está operativamente unido al gene a expresar. Recientemente,
se ha aislado un promotor específico del músculo que se ubica hacia
arriba tanto del gen estructural del músculo esquelético y el
elemento promotor proximal esencial y se asocia operativamente con
cada uno. (Mar y Ordahl, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85, 6404-6408 (1988)). Los vectores comprenden
plásmidos, virus (por ejemplo, adenovirus, citomegalovirus), fagos
y fragmentos de ADN integrables en el genoma huésped mediante
recombinación. El vector puede opcionalmente replicar y funcionar
de forma independiente del genoma huésped, o puede en algunos casos
integrarse en el genoma en sí.
Los siguientes ejemplos de laboratorio se han
incluido para ilustrar los modos preferidos de la invención.
Ciertos aspectos de los siguientes Ejemplos de Laboratorio se
describen en términos de técnicas y procedimientos hallados o
contemplados por los presentes inventores para trabajar
adecuadamente en la práctica de la invención. Estos Ejemplos de
Laboratorio se ejemplifican a través del uso de prácticas estándar
de laboratorio de los inventores. A la luz del presente
descubrimiento y del nivel general de habilidad en la técnica,
aquellos con habilidad apreciarán que los siguientes Ejemplos de
Laboratorio pretenden ser ejemplificantes y que pueden emplearse
numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del
espíritu y el ámbito de la invención.
Una mezcla de PGCs gonadales y células
estromáticas se recogieron a partir de una etapa
27-30 (H&H) de gónadas embrionarias utilizando
EDTA. Se tuvo cuidado de obtener una suspensión de células
individuales. En particular, las gónadas de embriones de pollos a
partir de la etapa 27-30 (H&H) se recogieron
mediante disección directa y se agruparon en una gota de salino
tamponado con fosfato libre de Ca^{2+} y Mg^{2+} (PBS(-)).
Después de la recogida a partir de los embriones, las gónadas se
colocaron en un ml de 0,02% EDTA en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y
luego se colocaron en un incubador a 37ºC durante 10 minutos. Se
centrifugó el tubo entonces a 200G durante 3 minutos y se extrajo
el sobrenadante. Las gónadas recogidas se pasaron entonces a través
de un filtro celular (FALCON© 2360, tamaño de poro 100 \muM) con
DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) a un nuevo tubo.
Esto proporcionó una suspensión de células individuales.
Se prepararon capas de alimentación STO
irradiadas en 96 placas de pozos utilizando DMEM que contenía 10%
FBS. Se comprobaron entonces distintos parámetros de cultivo,
incluyendo la fuente de FBS, número de células de alimentación,
lote de células STO (viejo vs. nuevo), acondicionamiento previo de
la capa de alimentación, y el número de células gonadales
sembradas.
Las células gonadales se cultivaron sobre capas
de alimentación STO durante 3-5 días y se tiñeron
con anti-SSEA1. El número de PGCs individuales
SSEA-1 positivas y el número de colonias
SSEA-1 positivas se examinaron el día 0, 1, 3 y 5
del cultivo. En muchos casos, hubo una muerte considerable de PGC en
las primeras 24 horas de cultivo seguida por un incremento en el
número PGCs individuales en los días 3-5. La
supervivencia y proliferación de las PGCs gonadales estuvo afectada
por la calidad de la capa de alimentación STO, el número de células
STO sembradas, el acondicionamiento previo de la capa de
alimentación STO, y el número de células gonadales inicialmente
sembradas. Se observó una variación considerable entre experimentos
dentro de un lote de FBS, sugiriendo que la fuente de FBS puede
influir en el cultivo.
La figura 1 muestra la tasa de supervivencia de
PGCs gonadales en diferentes números de células de alimentación STO
en cultivo. Se sembraron 10.000 células por pozo de células
gonadales sobre diferentes números de células STO: 50.000, 55.000 y
60.000 células por pozo. Las células SSEA-1
positivas se contaron igual que el número de PGCs a los 0, 1 y 3
días del cultivo. En el grupo de 60.000 células por pozo el número
PGCs es más alto que en los otros grupos al día 3 (P<0,05). Este
resultado indica que se prefiere la monocapa completa de células de
alimentación para el cultivo de PGC.
El acondicionamiento previo de la capa de
alimentación STO mejora la muerte inicial de células vista dentro
de las primeras 24 horas. A los 3 días de cultivo, pueden hallarse
colonias de células SSEA-1 positivas junto con PGCs
individuales. Estas colonias se incrementan en número y tamaño
después de cinco días de cultivo. Estas células dentro de las
colonias eran más pequeñas que las PGCs y se empaquetan
ajustadamente con bordes de colonia bien definidos y expresando así
un fenotipo de células madres embrionarias. Se estimó que algunas
colonias contenían más de 2.000 células. La mezcla de PGCs y
colonias a modo de ESC sugiere que sólo una fracción de las PGCs
gonadales puede desarrollar un fenotipo ESC.
La figura 2 muestra la tasa de supervivencia de
cultivos de PGC gonadales utilizando células de alimentación STO
acondicionadas previamente. Se sembraron 20.000 células gonadales
sobre 60.000 células STO por pozo después de 1 o 2 días de
acondicionamiento previo. Las PGCs muestran una alta tasa de
supervivencia con dos 2 días de acondicionamiento previo.
La figura 3A muestra el número de colonias mayor
de 20 células SSEA-1 positivas sobre diferentes
números de células STO (40.000, 50.000 o 60.000 por pozo) después
de sembrar 10.000 o 20.000 células gonadales por pozo. El número de
colonias que tienen más de 20 células SSEA-1
positivas se determinó para diferenciar las colonias que comprenden
células no diferenciadas que expresan un fenotipo ESC de las PGCs
individuales y agrupamientos al azar de PGCs en una forma
conservadora.
La figura 3B muestra la proliferación de PGCs
gonadales sobre un número diferente de células STO (40.000, 50.000
o 60.000 por pozo) después de sembrar 10.000 o 20.000 células
gonadales por pozo. La proliferación de PGCs individuales fue más
alta (P<0,05) utilizando 20.000 células gonadales versus 10.000.
Similarmente, el número de colonias SSEA-1
positivas formadas después de 5 días era dependiente del número de
células gonadales sembradas.
Las referencias listadas a continuación así como
todas las referencias citadas en la especificación se listan en la
extensión en que suplementan, explican, proporcionan un antecedente
o indican metodología, técnicas y/o composiciones aquí
empleadas.
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La descripción anterior es solo con el propósito
de ilustración, y no con el propósito de limitación - estando la
invención definida mediante las reivindicaciones.
Claims (13)
1. Procedimiento para producir un cultivo de
células aviares no diferenciadas que expresan un fenotipo de
células madres embrionarias que es capaz de soportar una división
celular adicional, comprendiendo el procedimiento:
(a) recoger células gonadales aviares que
comprenden células germinales primordiales a partir de un embrión
aviar después de la formación de la línea primitiva,
(b) depositar la células gonadales aviares en
contacto con una matriz de alimentación acondicionada previamente
que comprende células de fibroblasto, y
(c) cultivar las células gonadales aviares sobre
la matriz de alimentación acondicionada previamente en presencia de
medio durante un tiempo suficiente para producir un cultivo celular
aviar que consiste esencialmente en células aviares no
diferenciadas que expresan un fenotipo de células madres
embrionarias.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que las células gonadales
aviares se recogen a partir de un embrión de etapa 14 hasta etapa
45, a partir de un embrión de etapa 15 hasta etapa 31, o a partir
de un embrión de etapa 27 hasta etapa 30, donde las etapas son según
el sistema de etapas de Hamburguer & Hamilton (H&H).
3. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que las células gonadales
aviares se depositan en contacto con la matriz de alimentación
acondicionada previamente en un número que oscila desde
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 20.000 células.
4. Procedimiento según la reivindicación 3,
caracterizado por el hecho de que aproximadamente 20.000
células gonadales aviares se depositan en contacto con la matriz de
alimentación acondicionada previamente.
5. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que células de fibroblasto
están presentes en la matriz de alimentación acondicionada
previamente en un número que oscila entre aproximadamente 40.000
hasta aproximadamente 60.000 células, en un número que oscila entre
aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente 60.000 células, en un
número que oscila entre aproximadamente 55.000 hasta aproximadamente
60.000 células, o en un número de aproximadamente 60.000 células de
fibroblasto.
6. Procedimiento según la reivindicación 5,
caracterizado por el hecho de que las células de fibroblasto
son células de fibroblasto de ratón.
7. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que las células de fibroblasto
de ratón forma una capa de alimentación de células de
fibroblasto.
8. Procedimiento según la reivindicación 6,
caracterizado por el hecho de que las células de fibroblasto
de ratón son células de fibroblasto STO de ratón.
9. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que las células aviares no
diferenciadas son capaces de mantener el fenotipo de células madre
cuando crecen sobre la matriz de alimentación acondicionada
previamente de fibroblasto en presencia del medio durante al menos
tres días.
10. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el embrión aviar es un
embrión seleccionado a partir de un grupo que consiste en embriones
de pollos, pavos, patos, gansos, codornices y faisanes.
11. Procedimiento según la reivindicación 9,
caracterizado por el hecho de que el embrión aviar es un
embrión de pollo.
12. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que el medio es un medio
acondicionado.
13. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado por el hecho de que la matriz de alimentación
acondicionada previamente es una matriz de alimentación
acondicionada previamente de células de fibroblastos.
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