ES2282254T3 - Genes de virulencia, proteinas y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Microorganismo deficiente en transformación que comprende una primera mutación que interrumpe la expresión de un primer gen que comprende una secuencia nucleotídica identificada en la presente memoria como SEC. ID. nº 1, o una molécula relacionada que presenta por lo menos el 60% de identidad de secuencia, para su utilización terapéutica.
Description
Genes de virulencia, proteínas y su
utilización.
La presente invención se refiere a genes y
proteínas bacterianos y a su utilización. Más particularmente, se
refiere a genes y proteínas/péptidos obtenidos a partir de
Neisseria meningitidis, y a su utilización en terapia y en
la identificación de fármacos.
Neisseria meningitidis es un patógeno
bacteriano Gram negativo que está implicado en el choque séptico y
en la meningitis bacteriana. Esta bacteria es la causa principal de
la meningitis bacteriana en los países desarrollados, y produce
epidemias a gran escala en África y China. En el Reino Unido,
Neisseria meningitidis es la causa principal de muerte en la
infancia aparte de los accidentes de tráfico en carretera. La
bacteria habita de forma natural en la nasofaringe humana y logra
entonces acceder al torrente sanguíneo en el que produce septicemia
o meningitis grave. Aunque los antimicrobianos actuales son eficaces
en la eliminación de las bacterias del cuerpo, la mortalidad de la
septicemia meningocócica continua siendo considerable.
Se ha propuesto también la inmunización con
microorganismos de N. meningitidis no virulentos. La falta de
virulencia se consigue mediante modificación genética para
interrumpir la expresión de los genes implicados en la virulencia.
Una preocupación es que una cepa mutante pueda revertir en su forma
virulenta ocupando el ADN por sustitución. Por consiguiente es
deseable proporcionar medios para tratar o prevenir enfermedades
producidas por Neisseria meningitidis, p. ej. por
inmunización.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de genes en Neisseria meningitidis que se
requieren para la competencia natural (absorción e incorporación de
ADN exógeno).
Los genes identificados en la presente memoria
pueden ser utilizados para preparar microorganismos que son
deficientes en transformación. Los microorganismos mutantes
normalmente tendrán una mutación que interrumpe la expresión de uno
o más de los genes identificados en la presente memoria, para
proporcionar una cepa que carece de capacidad para absorber ADN.
Estos microorganismos también tendrán utilización en terapia y en
diagnóstico.
Según un primer aspecto de la invención, un
microorganismo comprende una mutación que interrumpe la expresión
de un gen que comprende cualquiera de las secuencias nucleotídicas
identificadas en la reivindicación 1, o un homólogo de las mismas
con por lo menos el 40% de identidad de secuencia, para su
utilización terapéutica o en diagnóstico.
Los microorganismos pueden tener muchas
utilizaciones terapéuticas para tratar infecciones por
Neisseria, incluyendo su utilización en vacunas para
aplicación profiláctica.
Según un segundo aspecto, un péptido está
codificado por un operón que incluye algunas de las secuencias
nucleotídicas identificadas en la reivindicación 1.
La presente invención se basa en el
descubrimiento de genes que codifican péptidos que son responsables
de la absorción del ADN. Los péptidos y genes de la invención son
útiles por lo tanto para la preparación de agentes terapéuticos
para tratar la infección. Debe entenderse que las referencias a la
terapia incluyen también los tratamientos preventivos, p. ej.
vacunación. Además, aunque los productos de la invención estén
destinados principalmente al tratamiento de infecciones en
pacientes humanos, se considera también que las aplicaciones en
veterinaria están comprendidas dentro del alcance de la
invención.
La presente invención se describe haciendo
referencia a Neisseria meningitidis. Sin embargo, todas las
cepas de Neisseria y muchas otras cepas bacterianas Gram
negativas son probablemente las que incluyen péptidos o proteínas
relacionados que tienen identidad o similitud de secuencia de
aminoácidos con las identificadas en la presente memoria. Los
organismos que contienen probablemente los péptidos incluyen, pero
no se limitan a los géneros Salmonella, Enterobacter,
Klebsiella, Shigella y Yersinia.
Preferentemente, los péptidos que pueden
utilizarse en los diversos aspectos de la invención presentan más
del 40% de similitud con los péptidos identificados en la presente
memoria. Más preferentemente, los péptidos presentan más del 60% de
similitud de secuencia. Aún más preferentemente, los péptidos
presentan más del 80% de similitud de secuencia, p. ej. 95% de
similitud. Con respecto a las secuencias polinucleotídicas
identificadas en la presente memoria, los polinucleótidos
relacionados que pueden ser útiles en varios aspectos de la
invención pueden presentar más del 40% de identidad con las
secuencias identificadas en la presente memoria. Más
preferentemente, las secuencias polinucleotídicas presentan más del
60% de identidad de secuencia. Aún más preferentemente, las
secuencias polinucleotídicas presentan más del 80% de identidad de
secuencia, p. ej. 95% de identidad.
Los términos "similitud" e "identidad"
son conocidos en la materia. La utilización del término
"identidad" se refiere a una comparación de secuencias basada
en correspondencias idénticas entre las posiciones
correspondientemente idénticas en las secuencias que se comparan.
El término "similitud" se refiere a una comparación entre
secuencias de aminoácidos y tiene en cuenta no solamente los
aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes, sino
también los aminoácidos funcionalmente similares en las posiciones
correspondientes. De este modo, la similitud entre las secuencias
polipeptídicas indica la similitud funcional, además de la similitud
de secuencias.
Los niveles de identidad entre las secuencias
génicas y los niveles de identidad o similitud entre las secuencias
de aminoácidos pueden calcularse utilizando procedimientos
conocidos. En relación con la presente invención, los
procedimientos informáticos disponibles al público para determinar
la identidad y similitud incluyen los BLASTP, BLASTN y FASTA
(Atschul et al., J. Molec. Biol., 1990;
215:403-410), el programa BLASTX disponible en NCBI
y el programa Gap del Genetics Computer Group, Madison, WI. Los
niveles de similitud e identidad proporcionados en la presente
memoria, se obtuvieron utilizando el programa Gap, con una
penalización Gap de 12 y una penalización de longitud Gap de 4 para
determinar las comparaciones de secuencias de aminoácidos y una
penalización Gap de 50 y una penalización de longitud de Gap de 3
para las comparaciones de secuencias polinucleotídicas.
Una vez caracterizado un gen según la invención,
es posible utilizar la secuencia génica para investigar los genes o
péptidos relacionados en otros microorganismos. Esto puede
realizarse investigando en las bases de datos existentes, p. ej.
EMBL o GeneBank.
Los péptidos o proteínas según la invención
pueden purificarse y aislarse por procedimientos conocidos en la
técnica. En particular, una vez identificada la secuencia génica,
será posible utilizar técnicas recombinantes para expresar los
genes en un hospedador adecuado. Los fragmentos activos y las
moléculas relacionadas pueden identificarse y pueden ser útiles en
terapia. Por ejemplo los péptidos o sus fragmentos activos pueden
utilizarse como determinantes antigénicos en una vacuna, para
provocar una respuesta inmunitaria. Pueden utilizarse también en la
preparación de anticuerpos, para inmunización pasiva o aplicaciones
de diagnóstico. Los anticuerpos adecuados incluyen los anticuerpos
monoclonales, o fragmentos de los mismos, incluyendo los fragmentos
Fv de una sola cadena. Los métodos para la preparación de
anticuerpos resultarán evidentes para los expertos en la
materia.
Los fragmentos activos de los péptidos son los
que conservan la función biológica del péptido, es decir conservan
la capacidad de absorber el ADN. Típicamente, el fragmento será de
por lo menos 30 nucleótidos (10 aminoácidos) de tamaño,
preferentemente de 60 nucleótidos (20 aminoácidos) y
aún más preferentemente mayor de 90 nucleótidos (30
aminoácidos) de tamaño.
Los genes identificados en la presente memoria
es probable que sean útiles tanto en la generación de cepas de
vacuna que no pueden absorber ADN exógeno, y como diana para
antimicrobianos. Los microorganismos atenuados pueden producirse
con una mutación atenuante en un gen o genes virulentos junto con
una mutación que interrumpe un gen o genes de la invención,
proporcionando un microorganismo atenuado que no puede absorber el
ADN extrace-
lular.
lular.
El término "virulencia" es conocido en la
materia y se refiere a la patogenicidad de un microorganismo. La
utilización del término "no virulento" pretende por
consiguiente referirse a microorganismos que no sean ya
patógenos.
Los genes con virulencia adecuada resultarán
evidentes para los expertos en la materia, e incluyen los genes
auxótropos y los identificados en Sun et al., Nature
medicine, 2000; 6(11): 1269-1273.
El experto en la materia estará al corriente de
los procedimientos para interrumpir la expresión de genes
específicos. Las técnicas que pueden utilizarse incluyen la
inactivación de la inserción o las técnicas de deleción génica. Los
microorganismos atenuados según la invención pueden comprender
también mutaciones adicionales en otros genes.
La preparación de vacunas basadas en
microorganismos atenuados es conocida por los expertos en la
materia. Las composiciones de la vacuna pueden formularse con
portadores o adyuvantes adecuados, p. ej. alúmina, según sea
necesario o se desee, para proporcionar inmunización eficaz contra
la infección. La preparación de formulaciones de vacuna resultará
evidente para el experto en la materia.
Los microorganismos atenuados pueden utilizarse
también como sistemas portadores para la administración de
antígenos heterólogos, proteínas terapéuticas o ácidos nucleicos
(ADN o ARN). En esta forma de realización, los microorganismos
atenuados se utilizan para administrar un antígeno, proteína o ácido
nucleico heterólogos a una zona específica in vivo. La
introducción de un antígeno, péptido o ácido nucleico heterólogo en
un microorganismo atenuado puede realizarse por técnicas
convencionales, incluyendo la utilización de montajes recombinantes,
p. ej. vectores, que comprenden polinucleótidos que expresan al
antígeno heterólogo o a la proteína terapéutica, e incluyen también
secuencias activadoras adecuadas. Como los microorganismos son
deficientes en transformación será necesario incorporar ácidos
nucleicos heterólogos por un mecanismo activo, p. ej.
electroporación. Esta es una técnica conocida. Alternativamente, el
gen que codifica al antígeno o proteína heterólogo puede
incorporarse en el genoma del organismo y en los activadores
endógenos utilizados para controlar la expresión. Una alternativa
adicional consiste en modificar los microorganismos para interrumpir
los genes identificados en la presente memoria después de
transformar en primer lugar con el gen heterólogo.
Más generalmente, y como es bien conocido por
los expertos en la materia, una cantidad adecuada de un componente
activo de la invención puede seleccionarse, para su utilización
terapéutica, como pueden seleccionarse los portadores o excipientes
adecuados y las vías de administración. Estos factores serían
seleccionados o determinados según criterios conocidos tales como
la naturaleza o gravedad de la enfermedad que ha de tratarse, el
tipo y/o salud del paciente, etc.
Los diversos productos de la invención pueden
utilizarse también en aplicaciones de veterinaria.
Lo que sigue a continuación es una breve
panorámica del procedimiento experimental utilizado para identificar
los genes.
Se utilizó mutagénesis marcada con firma (STM)
(Hensel et al., Science, 1995; 269:
400-403) para identificar los genes en N.
meningitidis que son esenciales para la absorción del ADN. En la
STM, se marcan mutantes aislados con identificadores de secuencia
única, lo que permite analizar simultáneamente un gran número de
mutantes.
Se utilizó un banco mutante de Tn10 serogrupo B
de Neisseria meningitidis para identificar mutantes que
presentaban un defecto de transformación. Se transformaron grupos
de mutantes con ADN plásmido o cromosómico que lleva un marcador
con resistencia a la eritromicina. Se identificaron mutantes
deficientes en transformación colocando en placas grupos
transformados de bacterias mutantes en el medio sólido, en presencia
y ausencia de eritromicina y realizando una identificación de STM.
Las bacterias que contienen una versión modificada del transposón
Tn10 insertado dentro de un gen de competencia no pudieron
recuperarse de las placas que contenían eritromicina inoculada con
una población mixta de mutantes, y por consiguiente probablemente
serán defectuosas para la absorción del ADN exógeno.
Se identificaron las secuencias nucleotídicas de
Neisseria meningitidis clonadas inmediatamente después de la
inserción de Tn10, y se caracterizaron sus secuencias traducidas. Se
buscaron a continuación homólogos en las bases de datos de
proteínas y ADN existentes
(www.sanger.ac.uk/Projects/N-meningitidis;
www.tigr.org; y www.ncbi.nlm.nih. gov).
En los mutantes seleccionados se determinó la
capacidad para absorber el ADN exógeno y se demostró que absorben
ADN exógeno a niveles de por lo menos 5 veces por debajo de los
niveles naturales. Como los genes se transcriben como parte de un
operón es posible que la mutación sea debida a un efecto polar en un
gen corriente abajo.
Para prevenir la identificación de mutantes que
simplemente no pudieron expresar un fenotipo menos resistente a la
eritromicina o con cápsula, en todos los mutantes supuestamente con
defectos de competencia se analizó su capacidad también para ser
transformados en resistentes a la tetraciclina. Los resultados
confirmaron que los mutantes eran deficientes en
transformación.
Los genes de la invención se presentan en la
Tabla 1 junto con la identificación de cualquier homólogo conocido.
Además, la Tabla 1 presenta la frecuencia de transformación,
ilustrando la insuficiencia de absorción de ADN presentada por
estos mutantes, en comparación con el tipo natural.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
<110> Microscience Limited
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<120> Genes de virulencia, proteínas y su
utilización
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> REP06443WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> (aún desconocido)
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<141>
2001-05-18
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<150> 0012079.0
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<151>
2000-05-18
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<160> 22
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<170> PatentIn Ver 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 2040
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(2040)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 680
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1257
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1257)
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 419
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 599
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(597)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 199
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 1773
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1773)
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 591
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
\newpage
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 1572
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1572)
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 524
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 1185
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(1185)
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<400> 11
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<210> 12
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<211> 395
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
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<210> 13
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<211> 804
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<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(804)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 15
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<211> 2391
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(2391)
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<400> 15
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<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 796
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<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 252
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(252)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
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<210> 218
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 789
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(789)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
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<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 263
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (132)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria meningitidis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
Claims (11)
1. Microorganismo deficiente en transformación
que comprende una primera mutación que interrumpe la expresión de
un primer gen que comprende una secuencia nucleotídica identificada
en la presente memoria como SEC. ID. nº 1, o una molécula
relacionada que presenta por lo menos el 60% de identidad de
secuencia, para su utilización terapéutica.
2. Microorganismo según la reivindicación 1,
que comprende además una segunda mutación que interrumpe la
expresión de un gen de virulencia.
3. Microorganismo según la reivindicación 1 ó
2, en el que la primera mutación da como resultado la inactivación
insercional o una deleción génica.
4. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el microorganismo es
Neisseria meningitidis.
5. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, que comprende un antígeno heterólogo,
un péptido heterólogo o un ácido nucleico.
6. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la identidad de secuencia es
de por lo menos el 90%.
7. Microorganismo según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el primer gen codifica normalmente
un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos identificada
en la presente memoria como SEC. ID. nº 2.
8. Vacuna que comprende un microorganismo según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Utilización de un producto según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de un medicamento
para su utilización en el tratamiento o la prevención de una
enfermedad asociada a la infección por Neisseria o bacterias
Gram-negativas.
10. Utilización según la reivindicación 9, en
la que la enfermedad es la meningitis.
11. Utilización según la reivindicación 9 ó 10,
para tratamiento veterinario.
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