ES2282388T3 - Cepa sim-7 dsm 14043 del microorganismo termofilo bacillus coagulans para la produccion de l(+)-lactato a partir de azucares fermentables y sus mezclas. - Google Patents

Abstract

Cepa del microorganismo Bacillus coagulans SIM-7 DSM14043.

Description

Cepa SIM-7 DSM 14043 del microorganismo termófilo Bacillus coagulans para la producción de L(+)-lactato a partir de azúcares fermentables y sus mezclas.

Campo de la técnica

La invención pertenece al área de la biotecnología y puede usarse para la producción de L(+)-lactato ópticamente puro por medio de síntesis microbiológica.

Antecedentes de la técnica

La síntesis microbiológica de L(+)-lactato se basa en la fermentación homoláctica, dando como resultado dos moléculas de lactato a partir de una molécula de hexosa fermentada (por ejemplo glucosa o galactosa).

La síntesis química industrial de L(+)-lactato puro no se ha resuelto hasta ahora, por tanto no hay alternativa a la síntesis microbiológica de este compuesto.

En la síntesis microbiológica de L(+)-lactato, desde el punto de vista de la eficacia del consumo de energía, la temperatura de cultivo máxima posible de la cepa microbiana que favorece el establecimiento del procedimiento de fermentación sin etapas de esterilización a alta temperatura del equipo y de los medios de fermentación es crucial.

En los procedimientos disponibles actualmente basados en las especies de Lactobacillus la temperatura de cultivo no excede los 45ºC lo que no excluye la contaminación con microorganismos termófilos si el cultivo se realiza en medios ricos en nutrientes en condiciones no estériles (J.H. Litchfield; In Advances in Applied Microbiology, Neidleman S.L. ed., vol. 42, páginas 45-95, 1996). La temperatura de cultivo óptima es de 52ºC en procedimientos basados en Bacillus coagulans TB/04 (T. Payot, Z. Chemaly, F. Fick Enzyme and Microbial Technology, 24, páginas 191-199, 1999). La desventaja en este caso es la inhibición del procedimiento a altas concentraciones de azúcares (superiores al 7,5%) lo que complica el uso de esta cepa a escala industrial.

El prototipo para la presente invención es la cepa microbiana Bacillus coagulans DSM 5196 (patente estadounidense nº 5079164; C12P 7/56, C12R 1/07; Jungbunzlauer Aktiengesellschaft, 1992). En los procedimientos basados en este organismo la temperatura de cultivo óptima es de 52ºC. Es posible cultivar este organismo a la concentración inicial de azúcares de hasta el 20%. Sin embargo, este organismo puede convertir sólo el 70% de glucosa o sacarosa de los medios de crecimiento en lactato lo que es menor que en las aplicaciones industriales actuales (85-90%).

Además, el Bacillus coagulans DSM 5196 no puede hidrolizar almidón, dictando la necesidad de un tratamiento preliminar del almidón como una materia prima barata (licuefacción y sacarificación) en el procedimiento tecnológico separado.

Descripción de la invención

El objetivo de la presente invención es la cepa termófila de un microorganismo que puede crecer y producir lactato a temperatura superior a la descrita para procedimientos análogos hasta ahora, siendo más resistente a las altas concentraciones iniciales de azúcar, que puede hidrolizar almidón y adecuada para la producción de L(+)-lactato tanto a partir de monosacáridos fermentables como de almidón.

El objeto de la invención es una cepa termófila del microorganismo Bacillus coagulans SIM-7 DSM14043 que se aisló a partir de cereal sobrecalentado (trigo) con las características de degradación microbiana. Se molió el trigo y se licuó el almidón. El hidrolizado resultante con el contenido en azúcar del 18-20% se usó a 60ºC como un cultivo de enriquecimiento. La selección adicional de la cepa microbiana se consiguió usando métodos microbiológicos habituales.

Caracteres culturales y morfológicos. Las colonias de la cepa del microorganismo Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 son aproximadamente umbonadas, brillantes, transparentes, de superficie lisa, composición seca, y un diámetro de 2...3 mm. Las células Gram-positivas con forma de bastón largas forman cadenas. Las células son motrices, forman endosporas ovales subterminales.

Caracteres fisiológicos y bioquímicos. La cepa de microorganismos crece en los monosacáridos glucosa, manosa, galactosa, fructosa y en los disacáridos sacarosa, maltosa, celobiosa. A partir de polisacáridos crece en almidón. La lactosa no se fermenta. No puede degradar caseína y gelatina.

Tiene un metabolismo fermentativo. Fermenta la glucosa y el almidón a L(+)-lactato sin formar CO_{2}. La formación de D(-)-lactato está ausente. Es tolerante al oxígeno. Catalasa positiva y citocromo c negativa. La capacidad de formar indol está ausente.

Temperatura de crecimiento. La cepa del microorganismo crece a la temperatura de hasta 65ºC y la viabilidad de las esporas se conserva a 85ºC al menos durante 40 minutos. Su temperatura óptima de cultivo es de 57ºC y convierte azúcares fermentables, incluyendo el almidón, en el nivel altamente puro de L(+)-lactato, cuyo rendimiento a partir del azúcar metabolizado alcanza el 95%. Puede crecer y producir L(+)-lactato a temperatura de hasta 65ºC que es 5-10º superior a la del caso de otras cepas notificadas anteriormente.

Identificación de la cepa de microorganismos como el objeto de la invención

Usando el sistema de identificación de microbios Gram-positivos de la empresa Biolog Inc. basado en el modelo de actividades metabólicas (GP2 MicroPlate) la base de datos GP Database (versión 4.01A) se identificó la cepa SIM-7 con la mayor probabilidad (99%) como la especie Bacillus thermoglucosidasius. Estos datos están, sin embargo, en contradicción con los datos secuenciales del gen de ARNr 16S de la cepa SIM-7 (Gene Bank nº de registro AF346895). Los datos del banco de genes sugieren los parientes más cercanos de la cepa SIM-7, la cepa Bacillus sp HC15 (AC252329) con dos diferencias, Bacillus coagulans NCDO 1761 (X606014) con seis diferencias, Bacillus coagulans IAM 12463 (D16267) con siete diferencias y Bacillus coagulans JCM2257 (D8313) con ocho diferencias de los 1464 nucleótidos en total. Al mismo tiempo, Bacillus thermoglucosidasius (AB021197) difiere en 131 nucleótidos sometidos a prueba. Dr. Watanabe et al. [Watanabe, K., Kitamura, K., Suzuki, Y (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:2066-2073] han comparado secuencias de nucleótidos de un gen catabólico, oligo-1,6-glucosidasa en cepas Bacillus thermoglucosidasius KP1006 y Bacillus coagulans ATCC 7050. La similitud secuencial global de estas proteínas era del 59% (Watanabe et al.). Tanto la secuencia del gen de ARNr 16S como la secuencia de nucleótidos parcial del gen de oligo-1,6-glucosidasa de la cepa SIM-7 muestran claramente su afiliación a la especie Bacillus coagulans. Entre las posiciones 643 y 1287 de nucleótido de este gen de las cepas Bacillus coagulans ATCC 7050 y Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 hay sólo dos diferencias, llevando ambas al intercambio del aminoácido Met_{399}/Ile y Gln_{402}/His, correspondientemente (secuencias de nucleótidos respectivas, GeneBank D78342, a en la posición 1244 en lugar de g y t en la posición 1253 en lugar de a). Por consiguiente, la cepa SIM-7 es una variante termófila no típica de la especie Bacillus coagulans, a pesar de la similitud metabólica general a la especie Bacillus thermoglucosidasus. La cepa Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 tampoco tiene actividad beta-galactosidasa y de manera diferente a la cepa Bacillus coagulans DSM 5196 (Kirkovits et al.) no puede crecer en lactosa pero puede crecer en galactosa.

El microorganismo con las propiedades mencionadas anteriormente se depositó en el Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), con el número de registro DSM 14043, 08-02-2001.

La capacidad de la cepa del microorganismo para crecer a una temperatura alta y usar dextrinas simplifica la producción de lactato a partir de almidón, permitiendo evitar la sacarificación del almidón como una etapa tecnológica separada y por tanto ahorra la glucoamilasa necesaria para la sacarificación y hace el procedimiento más barato.

En la fermentación de almidón licuado parcialmente a la temperatura de 57ºC la energía para el mezclado disminuye debido a la viscosidad inferior del medio. La capacidad de fermentar varios mono y disacáridos hace a la cepa útil para la producción de L(+)-lactato a partir de los sustratos complejos de azúcares o a partir de la mezcla de los mismos. Si van a usarse cereales como la fuente de almidón, las necesidades de la cepa para los compuestos de nitrógeno y minerales se cubrirán principalmente por los compuestos derivados de los cereales. La cepa del microorganismo es resistente a altas concentraciones iniciales de azúcares (17-20%) en el medio de crecimiento, acumula glucosa en el medio de crecimiento pero acumula el 13-14% de lactato de calcio en el medio. Gracias a la mejor solubilidad del lactato de calcio a una temperatura de fermentación superior, si el procedimiento implica Ca^{2+} para la neutralización, es posible elevar la concentración de lactato de calcio hasta 160-170 g l^{-1}.

El método para la producción de L(+)-lactato a partir de azúcares fermentables y sus mezclas se basa en el cultivo de la cepa del microorganismo en el intervalo de temperatura de entre 53-65ºC, con la temperatura óptima para el cultivo de 57ºC en medios que consisten en azúcares fermentables parcialmente, incluyendo dextrinas, almidón y otros nutrientes. Como resultado de la fermentación, la concentración final de L(+)-lactato obtenida es del 12% con el rendimiento del 95%. El cultivo de la cepa del microorganismo se llevará a cabo sin esterilización a alta temperatura del equipo y del medio. Usando harina de cereal como la fuente de azúcares en la fermentación, las necesidades de la cepa del microorganismo para los compuestos de nitrógeno y minerales en los medios de crecimiento se cubrirán con compuestos derivados del cereal.

Descripción de las realizaciones 1. Aislamiento de la cepa termófila del microorganismo Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043

Se aisló la cepa del microorganismo a partir del sobrecalentado y con las características de la degradación microbiana de cereal (trigo). Se molió la masa de trigo y se licuó. Se usó el hidrolizado de almidón resultante con el contenido en azúcar del 18-20% como un cultivo de enriquecimiento a la temperatura de 60ºC. Se sembró el cultivo para las colonias individuales, se recogieron las colonias con la capacidad de acidificar el medio y se seleccionaron posteriormente por la capacidad de fermentación homoláctica mediante la ausencia de producción de CO_{2}. Se sometió a prueba enzimáticamente la producción de Z(+)-lactato mediante L-lactato deshidrogenasa. Entre las colonias que producen L(+)-lactato, resistentes a oxígeno y termotolerantes se aisló el cultivo puro de Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043.

2. Producción de L(+)-lactato

Se suspendió la harina de triticale en 1 litro de agua y se licuó el almidón con \alpha-amilasa a 85ºC hasta DE = 22,5. Se sacarificó el almidón licuado con glucosamilasa a 60ºC. Se separaron el material de fibra insoluble y la proteína del almidón sacarificado mediante centrifugación. Se añadió al sobrenadante pasteurizado con un contenido en glucosa de 14,8 g l^{-1} hasta el 0,6% de extracto de levadura y se usó como un medio de fermentación para Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043. Se neutralizó el ácido láctico formado con el carbonato de calcio añadido al medio de fermentación. El pH de la fermentación estaba entre 5,3-6,2, la temperatura fue de 57ºC y la agitación de 100 revoluciones por minuto. En estas condiciones, tras 98 horas de fermentación, se consiguió una concentración final de L(+)-lactato del 12,3%. El rendimiento del L(+)-lactato a partir de la glucosa metabolizada fue del 95,5%.

Claims (5)

1. Cepa del microorganismo Bacillus coagulans SIM-7 DSM14043.

2. Método para la producción de L(+)-lactato a partir de azúcares fermentables y sus mezclas por medio de los microorganismos según la reivindicación 1, caracterizado porque la cepa del microorganismo se cultivará a la temperatura de entre 53-65ºC y el medio de fermentación contiene azúcares fermentables parcialmente, incluyendo dextrinas y almidón y otros nutrientes.

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el cultivo de la cepa del microorganismo se llevará a cabo a la temperatura de 57ºC.

4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque el cultivo de la cepa del microorganismo se llevará a cabo sin esterilización a alta temperatura del equipo y de los medios.

5. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque la harina de cereales se usará como la fuente de azúcares fermentables.