ES2282399T3 - Procedimiento microbiologico para la obtencion de l-carnitina. - Google Patents
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Abstract
Hidrolasa, que transforma el éster de metilo de la 4-butirobetaína como substrato en 4-butirobetaína, caracterizada porque tiene: a) un pI de 4, 15 ñ 0, 30 y b) un peso molecular de 22, 0 ñ 2, 0 kDa, determinado según SDS-PAGE.
Description
Procedimiento microbiológico para la obtención
de L-carnitina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la obtención de L-carnitina a
partir de ésteres de betaína. La invención se refiere, además, a
hidrolasas, que convierten los ésteres de betaína en las betaínas
orrespondientes.
La L-carnitina es una substancia
natural, similar a las vitaminas, que interviene en el transporte de
los ácidos grasos a través de la membrana mitocondrial y por lo
tanto posibilita la degradación de los ácidos grasos. La
L-carnitina encuentra aplicación como agente para el
complemento de los alimentos. La administración de la
L-carnitina puede compensar una producción
insuficiente de L-carnitina por parte del cuerpo,
por ejemplo en el caso de un gran esfuerzo deportivo. Para niños de
corta edad es esencial el complemento del alimento con
L-carnitina.
Se conocen varios procedimientos biotecnológicos
para la obtención de la L-carnitina.
La publicación
EP-A-0 158 194 describe un
procedimiento para la obtención de la L-carnitina a
partir de la 4-butirobetaína mediante
microorganismos, que son capaces de producir la
L-carnitina a partir de la
4-butirobetaína y/o de la crotonobetaína sin
catabolizar a ésta última.
La publicación
WO-A-95/10613 describe un
procedimiento para la obtención de la L-carnitina a
partir de la 4-butirobetaína y/o de la
crotonobetaína mediante microorganismos, que han sido transformados
con un fragmento de ADN, que abarca uno o varios genes bcoC,
bcoA/B y bcoD que codifican el enzima de la
biosíntesis de la L-carnitina en el metabolismo de
la butirobetaína/crotonobetaína.
Estos dos procedimientos tienen el inconveniente
de que los eductos empleados, constituidos por la
4-butirobetaína y por la crotonobetaína, son
difícilmente accesibles y, por lo tanto, representan un factor de
costes fundamental en la síntesis de la L-carnitina.
De este modo, la publicación EP-B-0
360 222 describe un procedimiento químico para la obtención de la
4-butirobetaína a partir de la
4-butirolactona, en el cual se transforma la
4-butirolactona, en primer lugar, por medio de HCl
para dar la 4-clorobutirobetaína y, a continuación,
se prosigue la transformación con etanol y con trimetilamina para
dar el éster de etilo de la 4-butirobetaína. Este
último se hidroliza a continuación, por medio de NaOH diluido, para
dar la 4-butirobetaína y la
4-butirobetaína se separa del éster de etilo de la
4-butirobetaína, no transformado, mediante
electrodiálisis.
La tarea de la invención consiste, por lo tanto,
en poner a disposición un procedimiento para la obtención de la
L-carnitina, en el cual no se requiera betaína como
material de partida.
La tarea anteriormente indicada se resolvió con
un procedimiento biotecnológico, en el cual se prepara la
L-carnitina, deseada, a partir de ésteres de la
betaína. Concretamente se han encontrado, sorprendentemente,
hidrolasas, que son capaces de valorizar los ésteres de betaína como
substratos y de hidrolizarlos para dar las betaínas
correspondientes, que pueden hacerse reaccionar a continuación para
dar la L-carnitina.
El objeto de la presente invención consiste, por
lo tanto, en un procedimiento biotecnológico para la obtención de la
L-carnitina, en el que se transforma un éster de
betaína de la fórmula general
en la que R^{1} y R^{2}
significan bien hidrógeno o conjuntamente significan un enlace y
R^{3} significa alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, en caso
dado substituido, arilo, en caso dado substituido o arilalquilo, en
caso dado substituido, por medio de una hidrolasa, que es capaz de
transformar un éster de betaína de la fórmula general I, como
substrato, para dar la betaína correspondiente, o por medio de un
microorganismo, que contenga una hidrolasa de este tipo, para dar la
betaína de la fórmula
general
en la que R^{1} y R^{2} tienen
el significado anteriormente indicado y la betaína formada de la
fórmula general II se convierte en la L-carnitina
por medio de un microorganismo que sea capaz de transformar esta
betaína en la
L-carnitina.
En este caso y a continuación se entenderán por
alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, tanto grupos alquilo
lineales como también grupos alquilo ramificados. Ejemplos de
alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono son metilo, etilo, propilo,
isopropilo, butilo, isobutilo, terc.-butilo, pentilo y sus
isómeros, hexilo y sus isómeros, heptilo y sus isómeros, octilo y
sus isómeros, nonilo y sus isómeros así como decilo y sus isómeros.
Es preferente alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, de forma muy
especialmente preferente alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono.
Los restos alquilo pueden estar insubstituidos o pueden estar
substituidos por ejemplo con uno o varios grupos hidroxilo y/o
átomos de halógeno. En este caso y a continuación se entenderá, por
halógeno, flúor, cloro, bromo y yodo. Ejemplos de ésteres de betaína
de la fórmula general I, en la que R^{3} significa alquilo con 1
hasta 10 átomos de carbono insubstituido son el éster de metilo de
la 4-butirobetaína, el éster de etilo de la
4-butirobetaína, el éster de propilo de la
4-butirobetaína, el éster de isopropilo de la
4-butirobetaína, el éster de butilo de la
4-butirobetaína, el éster de terc.-butilo de
la 4-butirobetaína y el éster de isobutilo de la
4-butirobetaína, el éster de metilo de la
crotonobetaína, el éster de etilo de la crotonobetaína, el éster de
propilo de la crotonobetaína, el éster de isopropilo de la
crotonobetaína, el éster de butilo de la crotonobetaína, el éster
de terc.-butilo de la crotonobetaína y el éster de isobutilo de la
crotonobetaína. Ejemplos de ésteres de betaína de la fórmula general
I, en la que R^{3} significa alquilo con 1 hasta 10 átomos de
carbono substituido son el éster de 2-hidroxietilo
de la butirobetaína, el éster de 3-hidroxipropilo de
la 4-butirobetaína, el éster de
2,3-dihidroxipropilo de la
4-butirobetaína, el éster de
2-cloroetilo de la 4-butirobetaína,
el éster de 2-hidroxietilo de la crotonobetaína, el
éster de 3-hidroxipropilo de la crotonobetaína, el
éster de 2,3-dihidroxipropilo de la crotonobetaína y
el éster de 2-cloroetilo de la crotonobetaína.
En este caso, y a continuación, se entenderán
por arilo, restos aromáticos monocíclicos o bicíclicos, por ejemplo
fenilo, 1-naftilo o 2-naftilo, que
pueden estar tanto insubstituidos como también substituidos, por
ejemplo con uno o varios grupos nitro y/o átomos de halógeno.
Ejemplos de ésteres de betaína de la fórmula general I, en la que
R^{3} significa arilo insubstituido o substituido, son el éster de
fenilo de la 4-butirobetaína, el éster de
4-nitrofenilo de la 4-butirobetaína,
el éster de 4-clorofenilo de la
4-butirobetaína, el éster de
1-naftilo de la 4-butirobetaína, el
éster de fenilo de la crotonobetaína, el éster de
4-nitrofenilo de la crotonobetaína, el éster de
4-clorofenilo de la crotonobetaína y el éster de
1-naftilo de la crotonobetaína.
En este caso, y a continuación, se entenderán
por arilalquilo, los restos alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono
correspondientes substituidos con arilo, especialmente los restos
alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono y, preferentemente, los
restos alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono, teniendo arilo el
significado anteriormente citado y pudiendo estar insubstituido o
substituido tal como precedentemente. El arilalquilo preferente es
el bencilo, que puede estar substituido o insubstituido sobre el
anillo de fenilo, por ejemplo con uno o varios grupos nitro y/o
átomos de halógeno. Ejemplos de ésteres de betaína de la fórmula
general I, en la que R^{3} significa arilalquilo son el éster de
bencilo de la 4-butirobetaína, el éster de
4-nitrobencilo de la
4-butirobetaína, el éster de
4-clorobencilo de la
4-butirobetaína, el éster de bencilo de la
crotonobetaína, el éster de 4-nitrobencilo de la
crotonobetaína y el éster de 4-clorobencilo de la
crotonobetaína.
Los ésteres de la betaína empleados
preferentemente, que quedan abarcados por la fórmula general I, son
el éster de metilo de la 4-butirobetaína, el éster
de metilo de la crotonobetaína, el éster de etilo de la
4-butirobetaína, el éster de etilo de la
crotonobetaína, el éster de propilo de la
4-butirobetaína, el éster de propilo de la
crotonobetaína, el éster de
2,3-dihidroxi-propilo de la
4-butirobetaína, el éster de
2,3-dihidroxi-propilo de la
crotonobetaína, el éster de fenilo de la
4-butirobetaína, el éster de fenilo de la
crotonobetaína, el éster de bencilo de la
4-butirobetaína y el éster de bencilo de la
crotonobetaína. Son especialmente preferentes el éster de metilo de
la 4-butirobetaína, el éster de metilo de la
crotonobetaína, el éster de etilo de la
4-butirobetaína, el éster de etilo de la
crotonobetaína, el éster de
2,3-dihidroxi-propilo de la
4-butirobetaína y el éster de
2,3-dihidroxi-propilo de la
crotonobetaína. Son muy especialmente preferentes el éster de metilo
de la 4-butirobetaína y el éster de metilo de la
crotonobetaína.
Las hidrolasas, que son capaces de transformar
los ésteres de betaína, que quedan abarcados por la fórmula general
I, especialmente el éster de metilo de la
4-butirobetaína y/o el éster de metilo de la
crotonobetaína, como substrato para dar las betaínas
correspondientes, han sido encontradas, sorprendentemente, en los
microorganismos del género Agrobacterium/Rhizobium, que han
sido descritos ya en la publicación
EP-A-0 158 194 y en la publicación
WO-A-95/10613. Las nuevas
hidrolasas, que son capaces de transformar a los ésteres de betaína,
no han sido descritas todavía y por lo tanto constituyen igualmente
un objeto de la invención.
Las hidrolasas, según la invención, que pueden
ser obtenidas por ejemplo a partir de microorganismos del género
Agrobacterium/Rhizobium son capaces de transformar al éster
de metilo de la 4-butirobetaína, como substrato,
para dar la 4-butirobetaína. Éstas se caracterizan
por medio de un punto isoeléctrico (pI) de 4,15 \pm 0,30 así como
por un peso molecular de 22,0 \pm 2,0 kDa, determinado por medio
de SDS-PAGE.
Estas hidrolasas se presentan en los
microorganismos del género Agrobacterium/Rhizobium junto con
una segunda hidrolasa con un peso molecular de 33 kDa, que, sin
embargo, no es capaz de transformar a los ésteres de betaína. Esta
puede aislarse, a partir de estos microorganismos, según métodos
conocidos en el ramo y pueden separarse de la hidrolasa de 33
kDa.
Las hidrolasas, según la invención, son
frecuentemente capaces de transformar, además del éster de metilo de
la 4-butirobetaína, también otros ésteres de betaína
abarcados por esta fórmula general I, por ejemplo el éster de metilo
de la crotonobetaína, como substrato para dar la betaína
correspondiente.
Las hidrolasas, según la invención, pueden
obtenerse, preferentemente, a partir de microorganismos del género
Agrobacterium/Rhizobium, especialmente de las cepas
Agrobacterium/Rhizobium HK4 (DSM 2938), HK13 (DSM 2903),
HK1331b (DSM 3225) y HK1349 (DSM 3944). Las cepas HK4 (DSM 2938),
HK13 (DSM 2903) y HK1331b (DSM 3225) han sido descritas en la
publicación EP-A-0 158 194. La cepa
HK1349 (DSM 3944) ha sido descrita en la publicación
EP-B-0 543 344. La cepa HK4 (DSM
2938) representa el tipo salvaje, las otras cepas están mutadas en
el gen bcoE y L-carnitina dehidrogenasa
negativa. Las cepas HK4 (DSM 2938), HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM
3225) y HK1349 (DSM 3944) presentan tanto una elevada similitud con
los representantes típicos del género Agrobacterium así como
también con representantes típicos del género Rhizobium, sin
embargo no pudieron asociarse de manera inequívoca con ninguno de
estos géneros. Por lo tanto se entenderán por microorganismos del
género Agrobacterium/Rhizobium tanto los microorganismos del
género Agrobacterium así como también los microorganismos
del género Rhizobium, así como los microorganismos del género
de las cepas HK4 (DSM 2938), HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM 3225) y
HK1349 (DSM 3944).
La cepa HK4 (DSM 2903) fue depositada el 3 de
abril de 1984, la cepa HK13 (DSM 2903) fue depositada el 23 de
febrero de 1984, la cepa HK1331b (DSM 3225) fue depositada el 8 de
febrero de 1985 y la cepa HK1349 (DSM 3944) fue depositada el 1 de
noviembre de 1991 en la colección alemana de microorganismos y
cultivos celulares GmbH (Deutschen Sammlung für Mikroorganismen y
Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig), Alemania, de acuerdo con el tratado de Budapest. El
plazo para la custodia del microorganismo HK1349 (DSM 3944) está
garantizado, de acuerdo con la solicitud de extensión, hasta el 1 de
noviembre de 2031.
Además, se ha encontrado, sorprendentemente, que
también hidrolasas, ya conocidas, por ejemplo determinadas lipasas,
esterasas y proteasas, son capaces de convertir ésteres de betaína,
que quedan abarcados por la fórmula general I, especialmente el
éster de metilo de la 4-butirobetaína y/o el éster
de metilo de la crotonobetaína, como substrato para dar las betaínas
correspondientes. Estas hidrolasas pueden emplearse igualmente en el
procedimiento según la invención.
Ejemplos de hidrolasas conocidas, que convierten
el éster de metilo de la 4-butirobetaína para dar la
4-butirobetaína, son esterasas, lipasas y proteasas,
especialmente esterasas de hígado de caballo (obtenibles por ejemplo
en Roche diagnostics o Fluka), esterasas de hígado de cerdo
(obtenibles por ejemplo en Roche diagnostics o Fluka), esterasa
Chirazym L2 (obtenible por ejemplo en Roche diagnostics), lipasas
procedentes de Bacillus thermocatenulatus (obtenibles por
ejemplo en Roche diagnostics), lipasas B de Candida antartica
(obtenibles por ejemplo en Roche diagnostics), la proteasa
Subtilisin A60 (obtenible por ejemplo en NovoNordisk), la esterasa
PFE II procedente de Pseudomonas fluorescens (DSM 50106,
Khalameyzer et al., Appl. Environm. Microbiol.
1999, 65, 477-482), la esterasa PFE I
procedente de Pseudomonas fluorescens (Bornscheuer et
al., J. Biotechnol. 1998, 60,
105-111) y la esterasa SDE procedente de
Streptomyces diastatochromogenes (obtenible por ejemplo en
Jülich Fine Chemicals, Bornscheuer et al., Biotechnol.
Letters 1999, 21, 101-104, Tesch
et al., J. Bacteriol. 1996, 178,
1858-1865).
Las hidrolasas, empleadas de manera
especialmente preferente, son las nuevas hidrolasas, según la
invención, procedentes de Agrobacterium/Rhizobium, las
lipasas procedentes de Bacillus thermocatenulatus, las
esterasas PFE II procedentes de Pseudomonas fluorescens (DSM
50106) así como las esterasas SDE procedentes de Streptomyces
diastatochromogenes.
La conversión de la betaína de la fórmula
general II, formada por medio de la hidrolasa, se lleva a cabo por
medio de microorganismos, que son capaces de convertir esta betaína
en la L-carnitina. Tales microorganismos han sido
descritos ya en el estado de la técnica.
Ejemplos de microorganismos adecuados son los
microorganismos que ya han sido citados de los géneros
Agrobacterium/Rhizobium, especialmente de las cepas HK13 (DSM
2903), HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) y HK1349 que contienen
el plásmido pVK100 q (DSM 8726), y microorganismos de los géneros
Pseudomonas, Achromobacter o Escherichia. Los
microorganismos ventajosos son aquellos que no catabolicen la
carnitina formada, especialmente las cepas de
carnitina-dehidrogenasa negativa.
La conversión de los ésteres de betaína para dar
la betaína puede llevarse a cabo no solamente con las hidrolasas
libres, sino, ventajosamente, también con microorganismos que
contengan y que expresen las hidrolasas anteriormente descritas. En
este caso, puede tratarse tanto de microorganismos de origen
natural, en los cuales el gen, que codifica la hidrolasa, sea una
parte integrante natural del genoma, así como también puede tratarse
de microorganismos recombinantes, que estén transformados con un ADN
que codifique una hidrolasa de este tipo.
Cuando la conversión del éster de betaína se
lleve a cabo con un microorganismo, que contenga una hidrolasa, será
conveniente que este microorganismo sea capaz, simultáneamente, de
convertir la betaína formada en la L-carnitina. El
microorganismo, que contiene la hidrolasa, es entonces,
simultáneamente, el microorganismo que convierte la betaína formada
en la L-carnitina. El procedimiento según la
invención puede llevarse a cabo entonces a partir del éster de
betaína deseado de la fórmula I con un solo microorganismo. Los
microorganismos ventajosos son, a su vez, aquellos que no
catabolicen la carnitina formada, especialmente cepas de
carnitina-dehidrogenasa negativa.
Cuando la conversión del éster de betaína deba
conducir únicamente hasta la betaína, el microorganismo no será
capaz, ventajosamente, de valorizar la betaína formada ni de
convertirla para dar carnitina.
Ejemplos de microorganismos, que portan en su
genoma, de manera natural, el gen que codifica la hidrolasa, son
microorganismos de los géneros Agrobacterium/Rhizobium,
Bacillus, Pseudomonas o Streptomyces. Los
microorganismos preferentes de este tipo son los microorganismos del
género Agrobacterium/Rhizobium, especialmente de las cepas
HK13 (DSM 2903); HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que
contienen el plásmido pVK100q (DSM 8726) y microorganismos de las
especies Bacillus thermocatenulatus, Pseudomonas
fluorescens o Streptomyces diastatochromogenes.
Para la obtención de los microorganismos
recombinantes pueden clonarse, según métodos estándar, los genes que
codifican las hidrolasas anteriormente citadas, según la invención y
conocidas. Para ello pueden aislarse los genes, en caso dado, como
paso previo, de manera usual, determinándose, por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos N-terminal de la hidrolasa
deseada y aislándose el gen de la hidrolasa a partir de un banco
genético del microorganismo correspondiente con ayuda de las sondas
de ADN derivadas de esta secuencia de aminoácidos
N-terminal. A continuación se transforma un
organismo huésped adecuado con un ADN recombinante por regla
general, que contenga el gen aislado, ventajosamente con un vector
de ADN lineal o anular. El microorganismo recombinante, obtenido de
este modo, puede integrar en el genoma el gen de la hidrolasa bien
tras recombinación homóloga o puede portarlo como elemento
extracromosómico.
Para la transformación son preferentes vectores
autorreplicantes, por ejemplo vectores de expresión, que contengan
la secuencia que codifica las hidrolasas, bajo el control de
secuencias de regulación adecuadas, es decir, por ejemplo, de un
promotor, que esté conectado aguas arriba del gen de la hidrolasa, y
de un punto de enlace para el ribosoma. El promotor y el punto para
el enlace del ribosoma se elegirán de tal manera, que puedan
funcionar en el huésped correspondiente de tal manera que se exprima
el gen. De acuerdo con la elección del promotor se lleva a cabo la
expresión de un gen, de este tipo, bien de manera constructiva o de
manera inducida. Usualmente estos vectores portan también un gen
marcador seleccionable, con el cual puede demostrarse la presencia
del vector en el huésped una vez verificada la transformación. En
una forma especial de realización, el vector de expresión puede
abarcar, adicionalmente, los genes para el metabolismo de
butirobetaína/crotonobetaína, que han sido descritos por ejemplo en
la publicación WO-A-95/10613. La
transcripción de estos genes se controlará entonces bien por el
propio promotor, que controla también la transcripción del gen de la
hidrolasa, o por otro promotor adecuado.
Ejemplos de promotores adecuados son los
promotores P_{L} y P_{R} del fago Lambda (Schauter et
al., Gene 1987, 52,
279-283), el promotor P_{trc} (Amann et
al., Gene 1988, 69, 301-315), los
promotores P_{Nm} y P_{S1} (Labes et al., Gene
1990, 89, 37-46), el promotor
P_{trp} (Amann et al., Gene 1983, 25,
167-178), el promotor P_{lac} (Amann et
al., Gene 1983, 25,
167-178) y el promotor P_{tac}, (Russel y Bennet,
Gene 1982, 20, 231-243) y el promotor
de la ramnosa (Volff et al., Mol. Microbiol.
1996, 21(5), 1037-1047).
Ejemplos de vectores de expresión específicos
para Escherichia coli son pBR322 (Bolivar et al.,
Gene, 1977,
2(2), 95-113), pBLUESCRIPT-KS+® y pBLUESCRIPT-SK+® (Stratagene), pUC18 y pUC19 (Yannisch-Perron et al., Gene 1985, 33, 103-119), pK18 y pK19 (Pridmore, Gene 1987, 56, 309-312), pRK290X (Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids Research, 14, 4207-4227) y pRA95 (que puede ser obtenido, por ejemplo, en Nycomed Pharma AS, Huidove, Dinamarca) y derivados de estos vectores, que tengan el mismo promotor, el mismo punto de enlace ribosómico y el mismo origen de replicación.
2(2), 95-113), pBLUESCRIPT-KS+® y pBLUESCRIPT-SK+® (Stratagene), pUC18 y pUC19 (Yannisch-Perron et al., Gene 1985, 33, 103-119), pK18 y pK19 (Pridmore, Gene 1987, 56, 309-312), pRK290X (Alvarez-Morales et al., Nucleic Acids Research, 14, 4207-4227) y pRA95 (que puede ser obtenido, por ejemplo, en Nycomed Pharma AS, Huidove, Dinamarca) y derivados de estos vectores, que tengan el mismo promotor, el mismo punto de enlace ribosómico y el mismo origen de replicación.
Ejemplos de vectores de expresión específicos
para el huésped, que son específicos para los organismos huésped
gram-negativos, son los vectores denominados
"broad host range", por ejemplo los plásmidos pRK290 (Ditta
et al., PNAS 1980, 77,
7347-7351), pKT240 (Bagdasarian et al.,
Gene 1983, 26, 273-282), el
pGSS33 (Sharpe et al., Gene 1984, 29,
93-102), pVK100 (Knauf y Nester, Plasmid
1982, 8, 45-54), pME285 (Haas y Itoh,
Gene 1985, 36, 27-36) y derivados de
estos vectores, que tengan el mismo promotor, el mismo punto de
enlace ribosómico y el mismo origen de replicación.
Como huésped es adecuado cualquier
microorganismo, que pueda ser transformado con un ADN que codifique
la hidrolasa deseada y que sea capaz, después de esta
transformación, de expresar esta hidrolasa y por lo tanto de
hidrolizar un éster de betaína para dar la betaína.
Los huéspedes preferentes son aquellos
microorganismos, que sean capaces de producir la
L-carnitina a partir de la
4-butirobetaína y/o de la crotonobetaína. Los
microorganismos adecuados son, por ejemplo, aquellos que porten en
su genoma, de manera natural, los genes para el metabolismo de la
butirobetaína/crotonobetaína. Entre éstos son especialmente
preferentes aquellos huéspedes que no catalibolicen la carnitina
formada. En este caso se trata, por ejemplo, de cepas que son
carnitina-dehidrogenasa-negativa,
por ejemplo de cepas que no contienen ningún gen bcoE o que
no contienen ningún gen bcoE intacto.
Ejemplos de huéspedes adecuados son los
microorganismos de los géneros Agrobacterium/Rhizobium,
Pseudomonas (Lindtstedt et al, J. Bacteriol,
1970, 101(3), 1094-5),
Achromobacter (Naidu et al., J. Ind Microbiol.
Biotechnolog. 2001, 26(5),
309-315) o Escherichia (Jung et al.,
Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 1993, 50,
21-44). Los huéspedes, de este tipo, especialmente
preferentes son los microorganismos del género
Agrobaeterium/Rhizohium, especialmente las cepas HK13 (DSM
2903), HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan
el plásmido pVK100 q (DSM 8726).
\newpage
Los microorganismos recombinantes, que están
transformados con un ADN, que codifican una hidrolasa, según la
invención, que convierte al éster de metilo de la
4-butirobetaína, como substrato, en
4-butirobetaína, no son conocidos por el estado de
la técnica.
Los microorganismos recombinantes, que están
transformados con un ADN, que codifique una hidrolasa, que convierta
al éster de metilo de la 4-butirobetaína, como
substrato, en la 4-butirobetaína, siendo capaces los
microorganismos de producir, a partir del éster de metilo de la
4-butirobetaína, la L-carnitina, sin
catabolizar a esta última, tampoco son conocidos por el estado de la
técnica.
Los microorganismos preferentes, según la
invención, son microorganismos del género
Agrobacterium/Rhizobium, especialmente las cepas de los
géneros Agrobacterium/Rhizobium HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM
3225),
HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan el plásmido pVK100 q (DSM 8726), y de los géneros Pseudomonas, Achromobacter o Escherichia, que estén transformados con un ADN, que codifique una hidrolasa que hidrolice al éster de metilo de la 4-butirobetaína para dar la 4-butirobetaína. Especialmente la hidrolasa codificada es una hidrolasa según la invención.
HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan el plásmido pVK100 q (DSM 8726), y de los géneros Pseudomonas, Achromobacter o Escherichia, que estén transformados con un ADN, que codifique una hidrolasa que hidrolice al éster de metilo de la 4-butirobetaína para dar la 4-butirobetaína. Especialmente la hidrolasa codificada es una hidrolasa según la invención.
Los microorganismos preferentes, que contienen
una hidrolasa, que transforma un éster de metilo de
4-butirobetaína, como substrato, en
4-butirobetaína y que pueden ser empleados en el
procedimiento según la invención, son:
- a)
- microorganismos del género Agrobacterium/Rhizobium, preferentemente de las cepas HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan el plásmido pVK100q (DSM 8726), y microorganismos del género Bacillus, Pseudomonas o Streptomyces, especialmente de las especies Bacillus thermocatenulatus, Pseudomonas fluorescens o Streptomyces diastatochromogenes.
- b)
- microorganismos recombinantes del género Agrobacterium/Rhizobium, preferentemente de las cepas HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan el plásmido pVK100q (DSM 8726), y microorganismos del género Pseudomonas, Bacillus, Achromobacter o Escherichia, que estén transformados con un ADN, que codifique una hidrolasa según la invención, que transforme los ésteres de metilo de la 4-butirobetaína, como substrato, para dar la 4-butirobetaína, así como
- c)
- microorganismos recombinantes del género Agrobacterium/Rhizobium, preferentemente de las cepas HK13 (DSM 2903), HK1331b (DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) o HK1349 que contengan el plásmido pVK100q (DSM 8726), y microorganismos del género Bacillus, Pseudomonas o Streptomyces, especialmente de las especies Bacillus thermocatenulatus, Pseudomonas fluorescens o Streptomyces diastatochromogenes, que estén transformados con un ADN, que codifique una lipasa, esterasa o proteasa conocida, que transforme los ésteres de metilo de la 4-butirobetaína, como substrato, para dar la 4-butirobetaína, especialmente las lipasas procedentes de Bacillus thermocatenulatus, las esterasas PFE II procedentes de Pseudomonas fluorescens (DSM 50106) así como las esterasas SDE procedentes de Streptomyces diastatochromogenes.
El cultivo de los microorganismos puede llevarse
a cabo en un medio que contenga inductores adecuados para la
inducción de los enzimas del metabolismo de la
butirobetaína/crotonobetaína. En caso dado puede añadirse al medio
un éster de betaína de la fórmula general I para la inducción de la
hidrolasa.
A modo de ejemplo, puede efectuarse un cultivo
previo de los microorganismos, en los cuales el huésped sea una de
las cepas Agrobacterium/Rhizobium HK13 (DSM 2903), HK1331b
(DSM 3225), HK1349 (DSM 3944) y HK1349 que contengan el plásmido
pVK100 q (DSM 8726), en medio para el cultivo previo "Nutrient
Yeast broth", al cual se ha añadido L-carnitina
como inductor del enzima del metabolismo de la
4-butirobetaína/L-carnitina y, a
continuación, se desarrollan en un medio mínimo, que contiene
betaína, glicerina y L-glutamato como fuentes de
C.
Preferentemente, se llevará el procedimiento,
según la invención, de tal manera que el éster de betaína de la
fórmula general I se alimente a la mezcla de la reacción de tal
manera, que la concentración de este éster de betaína permanezca por
debajo del 10% (peso/volumen) en la mezcla de la reacción.
Preferentemente, se llevarán a cabo los dos
procedimientos, según la invención, a un valor del pH en el
intervalo desde 6 hasta 8 y a una temperatura en el intervalo desde
15 hasta 50ºC, por ejemplo desde 25 hasta 35ºC.
La obtención de la L-carnitina,
según la invención, a partir de un éster de betaína de la fórmula
general I puede llevarse a cabo bien con microorganismos en
crecimiento o con microorganismos en reposo. Preferentemente se
llevará a cabo el procedimiento, según la invención, de tal manera
que la obtención de la L-carnitina se verifique en
la fase de crecimiento logarítmica final de los microorganismos o
con microorganismos en reposo.
La L-carnitina obtenida se
elaborará según los métodos estándar.
El empleo de las hidrolasas, según la invención,
que transforman el éster de metilo de la
4-butirobetaína en 4-butirobetaína,
en un procedimiento para la obtención de
L-carnitina, se refiere tanto al empleo de las
hidrolasas, según la invención, como también al empleo de las
hidrolasas conocidas, que tengan esta propiedad. Es preferente el
empleo de las hidrolasas según la invención así como el de las
lipasas, las esterasas y las proteasas conocidas, que transformen el
éster de metilo de la 4-butirobetaína en
4-butirobetaína, por ejemplo el de las lipasas
procedentes de Bacillus thermocatenulatus, el de las
esterasas PFE II procedentes de Pseudomonas fluorescens (DSM
50106) así como el de las esterasas SDE procedentes de
Streptomyces diastatochromogenes.
El empleo, según la invención, de
microorganismos, que contengan una hidrolasa, que transforme el
éster de metilo de la 4-butirobetaína en
4-butirobetaína, en un procedimiento para la
obtención de la L-carnitina, se refiere tanto al
empleo de los microorganismos de origen natural, así como también al
empleo de los microorganismos recombinantes.
La figura 1 representa la dependencia de la
actividad relativa de la hidrolasa específica, determinada por medio
del ensayo con el acetato de 4-nitrofenilo, de las
hidrolasas procedentes de HK1349 (DSM 3944), con respecto al valor
del pH en tampón 50 mM de fosfato de sodio a 25ºC.
La figura 2 representa las actividades relativas
de las hidrolasas específicas, determinadas por medio del ensayo del
acetato de 4-nitrofenilo, de las hidrolasas
procedentes de HK1349 (DSM 3944) al cabo de 16 horas de incubación a
temperaturas desde 5 hasta 70ºC en tampón 50 mM de fosfato de sodio
a pH 7,5.
La figura 3 representa los geles
SDS-PAGE de las hidrolasas obtenidas a partir de
HK1349 (DSM 3944) con los pesos moleculares de 22 kDa (fracción B y
C) y 33 kDa (fracción A). La detección se llevó a cabo tanto con
coloración de actividad así como también con
Coomassie-Blue.
La figura 4 representa la determinación del pI
de las hidrolasas de 22 kDa (fracción C) y de las hidrolasas de 33
kDa (fracción A) mediante el sistema Phast (Amersham Pharmacia). La
detección se llevó a cabo tanto con coloración de actividad como
también con Coomassie-Blue.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
La solución se trató en autoclave a 121ºC y 1
bar de sobrepresión durante 30 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución se filtró de manera estéril.
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes anteriormente indicados se
disolvieron en agua destilada (1 litro). La solución se combinó con
ácido clorhídrico concentrado (2 a 3 gotas) y, a continuación, se
trató en el autoclave a 121ºC y 1 bar de sobrepresión durante 30
minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes se disolvieron en agua destilada
(1 litro). La solución se trató en el autoclave a 121ºC y a 1 bar de
sobrepresión durante 30 minutos.
Los componentes se completaron con 450 ml de
agua destilada, en caso dado se añadieron una o varias fuentes de C
y se ajustó el valor del pH con NaOH a 7,0. La solución se trató en
el autoclave a 121ºC y a 1 bar de sobrepresión durante 30 minutos,
se enfrió hasta 45ºC y se combinó con
\vskip1.000000\baselineskip
Los componentes se completaron con agua
destilada (450 ml), se añadió agar (7,5 g), en caso dado se
añadieron una o varias fuentes de C y se ajustó el valor del pH con
NaOH a 7,0. La solución se trató en el autoclave a 121ºC y a 1 bar
de sobrepresión durante 30 minutos, se enfrió a 45ºC y se combinó
con
La solución, todavía caliente (45ºC), se vertió
en cápsulas de Petri (desde 20 hasta 25 ml de solución/cápsula de
Petri).
La determinación del éster de metilo de la
butirobetaína (BBMe), del éster de etilo de la butirobetaína (BBEt),
de la butirobetaína y de la L-carnitina mediante
HPLC se llevó a cabo bajo las condiciones siguientes: HPLC: Waters
LC-Module I plus; columna: Hamilton
pRP-X200 250 \times 4,1 mm; velocidad de paso: 1,3
ml/min; detección: conductibilidad. La butirobetaína y la
L-carnitina se eluyeron con HClO_{4} 5 mM en
acetonitrilo : agua = 1:24 (v/v). el éster de metilo de la
butirobetaína (BBMe) y el éster de etilo de la butirobetaína (BBEt)
se eluyeron con HClO_{4} 5 mM en acetonitrilo : agua = 1:4
(v/v).
La determinación del éster de metilo de la
butirobetaína (BBNME) y de la butirobetaína por medio de la
cromatografía de capa delgada se llevó a cabo bajo las condiciones
siguientes: placas de celulosa; eluyente: butanol : ácido acético :
agua = 8:4:2 (v/v/v); detección: vapor de yodo.
La determinación de la actividad de la hidrolasa
se llevó a cabo por fotometría por medio del ensayo con acetato de
4-nitrofenilo. Para ello se combinó la solución de
la proteína (900 \mul) con una solución de acetato de
4-nitrofenilo (10 mM en dimetilsulfóxido; 100
\mul) a 25ºC. La absorción del 4-nitrofenol,
formado durante la hidrólisis (e = 15 \times 10^{3} \times
M^{-1} cm^{-1}) se midió a 410 nm. En este caso 1 unidad (U)
corresponde a la cantidad de 4-nitrofenol (en
\mumoles), que se libera por minuto. La determinación del
contenido en proteína de la solución de proteína empleada se llevó a
cabo con el estuche para el ensayo de proteína BCA (Bicin choninic
acid) (Pierce) según las indicaciones del fabricante. La actividad
de la hidrolasa específica se indica en U/mg de proteína y
corresponde a la cantidad de 4-nitrofenol (en
\mumoles), que se libera por minuto y por mg de proteína.
La determinación del peso molecular de la
hidrolasa se lleva a cabo por medio de la electrofóresis de gel
SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE)
(tampón: tris (0,025 M), glicina (0,192 M), SDS (0,1% (p/v)); pH
8,4; gel colector: 10 mA, gel de separación: 25 mA). La detección se
llevó a cabo tanto con Coomassie-Blue así como
también con coloración de actividad. La coloración de actividad se
llevó a cabo de la manera siguiente: el gel se incubó en solución
para la renaturalización (Triton X (0,5% (p/v)) en tampón tris
\times HCl (0,1 M; pH 7,5) durante 30 minutos a 25ºC. A
continuación se añadió solución de acetato de
1-naftilo (10 ml) y solución Fast Red (10 ml). Las
hidrolasas se colorearon aproximadamente al cabo de 30 minutos de
pardo-rojizo. La solución de acetato de
1-naftilo se preparó de la manera siguiente: se
disolvió el acetato de 1-naftilo (4 mg) en acetona
(1,0 ml) y se completó hasta 10 ml con tampón tris \times HCl (0,1
M; pH 7,5). La solución de Fast Red se preparó de la manera
siguiente: se disolvió el Fest Red (10 mg) en tampón tris \times
HCl (0,1 M; pH 7,5; 10 ml).
Se incubó la cepa HK4 (DSM 2938) en placas de
agar con medio mínimo, con adición de 0,4% (p/v) de betaína como
única fuente de C tras el raspado de colonias individuales, a 30ºC
durante 48 hasta 72 horas. Para el cultivo se sobreinocularon
colonias individuales de la cepa de las placas de agar en el medio
mínimo que contenía el éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) y
el éster de etilo de la butirobetaína (BBEt) como, respectivamente,
única fuente de C y se incubaron a 30ºC y a 140 revoluciones por
minuto durante 48 hasta 96 horas.
Se llevó a cabo un ensayo de control, en el cual
se verificó el cultivo de la cepa HK4 (DSM 2938) bajo las mismas
condiciones, sin embargo con adición de butirobetaína en lugar de un
éster de la butirobetaína como única fuente de C.
Los resultados se han reunido en la tabla 1.
La cepa HK4 (DSM 2938) creció en el medio
mínimo, que contenía el éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) y
el éster de etilo de la butirobetaína (BBEt) como, respectivamente,
única fuente de C. El crecimiento de la cepa HK4 (DSM 2938) sobre el
éster de butirobetaína como única fuente de C fue, sin embargo,
claramente menor que el crecimiento sobre la butirobetaína como
única fuente de C.
Se sobreinocularon las cepas HK13 (DSM 2903) y
HK1349 (DSM 3944) respectivamente en el medio de cultivo previo
"Nutrient Yeast broth" (10 ml), al que se añadió
L-carnitina (0,05% (p/v)) como inductor del
metabolismo de la L-carnitina y se incubaron durante
2 días a 30ºC y a 140 revoluciones por minuto. Los cultivos previos
(0,01 ml) se sobreinocularon en el medio mínimo (10 ml), que
contenía, además, un 0,02% (p/v) de betaína, un 0,05% (v/v) de
glicerina, un 0,50% (p/v) de L-glutamato y bien un
0,75% (p/v) de éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) o bien un
0,75% (p/v) del éster de etilo de la butirobetaína (BBEt), y se
incubaron a 30ºC y a 140 revoluciones por minuto. Al cabo de 40
horas, el OD_{650} de ambos cultivos fue aproximadamente de 9,0 y
los cultivos se encontraban en la fase estacionaria. Al cabo de
otras 34 horas se tomaron muestras. Las células se centrifugaron
(11.000 revoluciones por minuto, 5 minutos) y el sobrenadante se
ensayó por medio de HPLC con respecto al contenido en butirobetaína,
en L-carnitina y en éster de butirobetaína no
convertido. Los resultados se han reunido en la tabla 2.
Como ensayos de control, se almacenaron el éster
de metilo de la butirobetaína (BBMe) y el éster de etilo de la
butirobetaína (BBEt), respectivamente, en el mismo medio y bajo las
mismas condiciones, sin embargo sin adición de células. Bajo estas
condiciones no pudo demostrarse una hidrólisis de los ésteres de
butirobetaína para dar butirobetaína.
Las cepas HK13 (DSM 2903) y HK1349 (DSM 3944)
convierten, respectivamente, tanto al éster de metilo de la
butirobetaína (BBMe) como también al éster de etilo de la
butirobetaína (BBEt) en 74 horas en un 40% aproximadamente. En el
caso de la conversión del éster de metilo de la butirobetaína la
proporción de la butirobetaína formada es mayor que la de la
L-carnitina, mientras que en el caso de la
conversión del éster de etilo de la butirobetaína la proporción en
L-carnitina formada es mayor que la de la
butirobetaína.
Se cultivaron las cepas HK13 (DSM 2903), HK1349
que contiene el plásmido pVK100q (DSM 8726) y HK1331b (DSM 3225), de
manera análoga a la del ejemplo 2, sin embargo el medio mínimo
contenía un 0,90% (p/v) éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) o
de éster de etilo de la butirobetaína (BBEt) en lugar de un 0,75%
(p/v). El medio para el cultivo previo de la cepa HK1349, que
contiene el plásmido pVK100q (DSM 2903) contenía, adicionalmente,
tetraciclina (10 \mug/ml). Al cabo de 52 horas, el OD_{650} de
los cultivos fue de 10,0 aproximadamente y los cultivos se
encontraban en fase estacionaria. Al cabo de otras 92 horas se
tomaron muestras. Las células se centrifugaron (11.000 revoluciones
por minuto, 5 minutos) y el sobrenadante se ensayó por medio de HPLC
con respecto al contenido en butirobetaína, en
L-carnitina y en ésteres de butirobetaína no
transformados.
Las cepas HK13 (DSM 2903) y HK1349 que contiene
el plásmido pVK100q (DSM 8726) y HK1331b (DSM 3225) convirtieron
respectivamente tanto al éster de metilo de la butirobetaína (BBMe)
como también al éster de etilo de la butirobetaína (BBEt) en 144
horas aproximadamente en un 50% con formación de butirobetaína y de
L-carnitina.
Se sembró un inóculo (0,2 ml) de la cepa HK1349
(DSM 3944) en medio mínimo (25 ml), que contenía, además, un 0,2%
(p/v) de betaína, un 1,0% (p/v) de L-glutamato y un
0,2% (p/v) de butirobetaína y se incubó a 30ºC y a 140 revoluciones
por minuto hasta que el OD_{650 \ nm} fue de 3,0 hasta 7,0. El
cultivo previo, obtenido de este modo, (2 ml) se sobreinoculó en el
medio mínimo (1,5 l) que contenía, además, un 0,2% (p/v) de betaína,
un 1,0% (p/v) de L-glutamato y un 0,2% (p/v) de
butirobetaína y se incubó a 30ºC y a 140 revoluciones por minuto
hasta que el OD_{650 \ nm} fue de 3,0 hasta 7,0. El cultivo se
centrifugó (3.500 revoluciones por minuto; 30 minutos; 16ºC) y las
células se volvieron a suspender en tampón de fosfato de sodio 50 mM
(150 ml; pH 7,5). La suspensión celular, obtenida de este modo,
tenía un OD_{650 \ nm} de 37.
La suspensión celular (HK1349 (DSM 3944),
OD_{650 \ nm} 37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5),
obtenida según el ejemplo 4.1., se centrifugó (4.000 revoluciones
por minuto; 10 minutos; 4ºC) y se determinó la actividad de la
hidrolasa específica del sobrenadante por medio del ensayo con
acetato de 4-nitrofenilo. En un segundo experimento
se maceró la suspensión celular (HK1349 (DSM 3944), OD_{650 \ nm}
37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5), obtenida según el
ejemplo 4.1., mediante tratamiento durante 10 minutos con
ultrasonidos con refrigeración en baño de hielo, los fragmentos
celulares se separaron por centrifugación (4.000 revoluciones por
minuto; 10 minutos; 4ºC) y se determinó la actividad de la hidrolasa
específica del sobrenadante mediante el ensayo con acetato de
4-nitrofenilo. La actividad máxima de la hidrolasa
específica (0,31 U/mg de proteína) se consideró como valor 100%. Los
resultados se han reunido en la tabla 3. La actividad hidrolítica se
presenta de manera intracelular.
La suspensión celular (HK1349 (DSM 3944),
OD_{650 \ nm} 37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5),
obtenida según el ejemplo 4.1., se maceró mediante tratamiento
durante 10 minutos con ultrasonidos con refrigeración en el baño de
hielo, se incubó con diversos detergentes (5% (v/v) de detergente;
30 minutos; 25ºC) y los fragmentos celulares se separaron por
centrifugación (4.000 revoluciones por minuto; 10 minutos; 4ºC). La
actividad de la hidrolasa específica del sobrenadante es determinó
por medio del ensayo del acetato de 4-nitrofenilo.
La actividad máxima de la hidrolasa específica (0,30 U/mg de
proteína) se consideró como el valor 100%. Los resultados se han
reunido en la tabla 4. La actividad máxima de la hidrolasa
específica, se observó con empleo de Triton
X-114.
El sobrenadante, indicado en la tabla 3, así
como el sobrenadante indicado en la tabla 4, que fueron tratados con
Triton X-114 o con lisozima, se ensayaron por medio
de SDS-PAGE. En todos los sobrenadantes se
encontraron una hidrolasa de 22 kDa y una hidrolasa de 33 kDa.
La suspensión celular (HK1349 (DSM 3944),
OD_{650 \ nm} 37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5),
obtenida según el ejemplo 4.1., se maceró por tratamiento durante 10
minutos con ultrasonidos con refrigeración en el baño de hielo, se
incubó con Triton X-114 (5% (v/v); 30 minutos; 25ºC)
y a continuación se centrifugó (4.000 revoluciones por minuto; 10
minutos; 4ºC). El sobrenadante se liofilizó. El sobrenadante
liofilizado (100 mg) se disolvió en tampón de fosfato de sodio (50
mM; pH 7,5; 1,0 ml) y se añadieron a emulsiones de acetato de etilo,
de butirato de etilo y de butirato de metilo (5% (v/v) Ester
emulsionados por medio de un Ultraturrax en agua destilada que
contenía un 2% (p/v) de goma arábiga; 20 ml) a 37ºC. El ácido,
liberado por la hidrólisis del éster, se titula con NaOH (0,01 M)
con empleo de un medidor del pH. En este caso 1 U (unidad)
corresponde a la cantidad de ácido (en \mumoles), que se libera
por minuto. La actividad máxima de la hidrolasa específica, (0,039
U/mg de proteína) se consideró como el valor 100%. Los resultados se
han reunido en la tabla 5.
El sobrenadante (100 mg) liofilizado, obtenido
según el ejemplo 4.4 se disolvió en tampón de fosfato de sodio (50
mM; pH 7,5; 1,0 ml). Esta solución (50 \mul) se diluyó con
tampones de fosfato de sodio con valores de pH diferentes (50 mM; pH
5,0 hasta 9,0; 850 \mul) y se combinó con una solución de acetato
de 4-nitrofenilo (10 mM en dimetilsulfóxido, 100
\mul) a 25ºC. La absorción del 4-nitrofenol,
formado durante la hidrólisis (\varepsilon = 15 \times 10^{3}
\times M^{-1} cm^{-1}) se midió a 410 nm. Los resultados se
han representado en la figura 1. El pH óptimo es de 7,5.
La suspensión celular (HK1349 (DSM 3944),
OD_{650 \ nm} 37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5),
obtenida según el ejemplo 4.1., se maceró por tratamiento durante 10
minutos con ultrasonidos con refrigeración en baño de hielo, se
incubó con Triton X-114 (5% (v/v); 30 minutos; 25ºC)
y, a continuación, se centrifugó (4.000 revoluciones por minuto; 10
minutos; 4ºC). El sobrenadante se incubó a temperaturas comprendidas
en el intervalo desde 5 hasta 70ºC durante 16 horas. Tras la
incubación se determinó la actividad de la hidrolasa específica por
medio del ensayo con acetato de 4-nitrofenilo. Los
resultados se han representado en la figura 2. La actividad de la
hidrolasa específica disminuye a medida que aumenta la temperatura.
Al cabo de 16 horas de incubación a 30ºC está presente todavía el
85% aproximadamente de la actividad original, al cabo de 16 horas de
incubación a 45ºC, la actividad original es del 50% aproximadamente
todavía y, al cabo de 16 horas de incubación a 50ºC está presente
todavía el 35% aproximadamente de la actividad original.
La suspensión celular (HK1349 (DSM 3944),
OD_{650 \ nm} 37, tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5),
obtenida según el ejemplo 4.1., se maceró mediante tratamiento
durante 10 minutos con ultrasonidos con enfriamiento en el baño de
hielo, se incubó con Triton X-114 (5% (v/v); 30
minutos; 25ºC) y a continuación se centrifugó (4.000 revoluciones
por minuto; 10 minutos; 4ºC). Se purificaron muestras del
sobrenadante (10 ml) mediante filtración a través de gel (Sephacryl™
S-200, 100 cm^{3}; eluyente: tampón de fosfato de
sodio (50 mM; pH 7,5); velocidad de paso: 1 ml/min).
Se determinó la actividad de la hidrolasa
específica de las fracciones individuales (2 ml) mediante el ensayo
con acetato de 4-nitrofenilo. Las fracciones, que
tenían actividad de la hidrolasa, se analizaron por medio de
SDS-PAGE. Las fracciones, que contenían únicamente
una hidrolasa con el peso molecular de 33 kDa, se reunieron
(fracción A). Las fracciones, que contenían únicamente una hidrolasa
con el peso molecular de 22 kDa, y que eran "impuras" según el
SDS-PAGE, se reunieron (fracción B), así como las
fracciones, que contenían únicamente una hidrolasa con el peso
molecular de 22 kDa, y que eran, "puras" según el
SDS-PAGE, se reunieron (fracción C). Las fracciones,
que eran "puras", contenían una proporción en proteínas
foráneas menor que la de las fracciones "impuras". Se determinó
de nuevo la actividad de la hidrolasa específica de las fracciones
A, B y C mediante el ensayo con acetato de
4-nitrofenilo y estas soluciones de proteínas se
analizaron de nuevo por medio de SDS-PAGE. Los
resultados se han reunido en la tabla 6 y en la figura 3.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción A, que contiene la hidrolasa de 33
kDa y la fracción C, que contiene la hidrolasa de 22 kDa, se
concentraron mediante ultrafiltración. Se determinaron los puntos
isoeléctricos de la hidrolasa de 22 kDa y de la hidrolasa de 33 kDa
con el sistema Phast (Amersham Pharmacia) según las explicaciones
del fabricante. Para ello se analizaron las fracciones A y C con un
gel, que presentaba un gradiente de pH desde 3 hasta 9. Los
resultados se han representado en la figura 4. La fracción C se
analizó, adicionalmente, con un gel que presentaba un gradiente de
pH desde 4 hasta 6,5. La detección se llevó a cabo de manera análoga
a la de la detección en el caso del SDS-PPAGE. La
hidrolasa de 33 kDa tenía un pI de 6,58, la hidrolasa de 22 kDa
tenía un pI de 4,15.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción C, procedente del ejemplo 5, (1,0
ml) se concentró por medio de Centricons (2 ml, 10 kDa; 5.000
revoluciones por minuto; 60 minutos; 4ºC) hasta 1/10 de su volumen
original. Una solución de la reacción, constituida por el éster de
metilo de la butirobetaína (BBMe) (50 \mumoles) y por el tampón de
fosfato de sodio (50 mM; pH 7,5; 500 \mul) se combinó con la
fracción C, concentrada, (100 \mul) a 37ºC. La conversión del
éster de metilo de la butirobetaína en butirobetaína se siguió
cualitativamente por medio de cromatografía de capa delgada. La
hidrolasa de 22 kDa de la fracción C transformó al éster de metilo
de la butirobetaína (BBMe) en 1 hora, de manera demostrable, en
butirobetaína y al cabo de 60 horas lo hizo en un 15%
aproximadamente (estimado).
De manera análoga, se concentraron las
fracciones A, procedentes del ejemplo 5, y se transformaron con el
éster de metilo de la butirobetaína (BBMe). La hidrolasa de 33 kDa
de la fracción A no transformó al éster de metilo de la
butirobetaína (BBMe) en butirobetaína.
\vskip1.000000\baselineskip
De manera análoga a la del ejemplo 6 se
transformó el éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) con PFE I,
procedente de Pseudomonas fluorescens (Bornscheuer et
al. J. Biotechnol. 1998, 60,
105-111), con la esterasa PFE II, procedente de
Pseudomonas fluorescens (DSM 50106, Khalameyer et al
Appl. Environm. Microbiol. 1999, 65,
477-482) y con la esterasa SDE, procedente de
Streptomyces diastatochromogenes (obtenible por ejemplo en la
firma Jülich Fine Chemicals, Bomscheuer et al. Biotechnol.
Letters 1999, 21, 101-104, Tesch
et al. J. Bacteriol. 1996, 178,
1858-1865) (respectivamente 6 mg
aproximadamente).
Las tres esterasas hidrolizaron al éster de
metilo de la butirobetaína (BBMe), presentando la esterasa PFE II la
actividad máxima. Las esterasas PFE II y SDE transforman el éster de
metilo de la butirobetaína (BBMe) ya al cabo de 1 hora, de manera
demostrable, en butirobetaína.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinó una solución de reacción constituida
por el éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) (1,0% (p/v)) en
tampón de fosfato de potasio (10 mM; pH 7,0; 2,0 ml) con diversas
hidrolasas (10 hasta 15 mg o 20 \mul) a 25ºC. El valor del pH de
la mezcla de la reacción se sigue durante 24 horas por medio de una
sonda de pH. El pH debería descender debido a la hidrólisis de la
butirobetaína formada. En aquellas reacciones, en las que pudo
observarse un descenso del valor del pH, se determinó el contenido
en éster de metilo de la butirobetaína (BBMe) y de la butirobetaína
en la mezcla de la reacción mediante HPLC. Los resultados se han
reunido en la tabla 7. La lipasa procedente de Bacillus
thermocatenulatus (Roche diagnostics) y las esterasas de hígado
de cerdo (de Fluka y Roche diagnostics), fueron las que
transformaron en grado máximo al éster de metilo de la butirobetaína
(BBMe) para dar butirobetaína. La lipasa procedente de Bacillus
thermoeatenulatus ya ha sido clonada
(Schmid-Dannert et al., Biochim. Biophys.
Acta 1996, 1301, 105-114).
Claims (11)
1. Hidrolasa, que transforma el éster de metilo
de la 4-butirobetaína como substrato en
4-butirobetaína, caracterizada porque
tiene:
- a)
- un pI de 4,15 \pm 0,30 y
- b)
- un peso molecular de 22,0 \pm 2,0 kDa, determinado según SDS-PAGE.
2. Procedimiento para la obtención de
L-carnitina, en el que se transforma un éster de
betaína de la fórmula general
en la que R^{1} y R^{2}
significan bien hidrógeno o conjuntamente significan un enlace y
R^{3} significa alquilo con 1 hasta 10 átomos de carbono, en caso
dado substituido, arilo, en caso dado substituido o arilalquilo, en
caso dado substituido, por medio de una hidrolasa, que transforma un
éster de betaína de la fórmula general I como substrato en betaína,
o por medio de un microorganismo, que contenga una hidrolasa de este
tipo, para dar la betaína correspondiente de la fórmula
general
en la que R^{1} y R^{2} tienen
el significado anteriormente indicado, y esta betaína se transforma
en L-carnitina por medio de un microorganismo, que
sea capaz de convertir la betaína de la fórmula II en
L-carnitina.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que la hidrolasa es una hidrolasa según la reivindicación 1.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 2 ó
3, en el que el microorganismo, que contiene la hidrolasa, es
simultáneamente el microorganismo que transforma la betaína formada,
de la fórmula general II, en L-carnitina.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 4, en el que el microorganismo, que contiene la
hidrolasa, es un microorganismo de origen natural o un
microorganismo recombinante.
6. Procedimiento para la obtención de betaínas
de la fórmula general
en la que R^{1} y R^{2} tienen
el significado indicado en la reivindicación 5, en el que se
hidroliza un éster de betaína de la fórmula
general
en la que R^{1} y R^{2} tienen
el significado anteriormente indicado y R^{3} tiene indicado en la
reivindicación 5, por medio de una hidrolasa, que hidrolice un éster
de betaína de la fórmula general I, o por medio de un microorganismo
que contenga una hidrolasa de este tipo, para dar la betaína
correspondiente de la fórmula general
II.
7. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 6 en el que el éster de betaína de la fórmula
general I se alimenta de tal manera que la concentración del éster
de betaína permanezca por debajo del 10% (p/v) en la mezcla de la
reacción.
8. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 7, en el que el valor del pH se encuentra en el
intervalo desde 6 hasta 8 y la temperatura se encuentra en el
intervalo desde 15 hasta 50ºC.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 2 a 8, en el que se emplea un éster de betaína de
la fórmula general I
en la que R^{1} y R^{2}
significan bien hidrógeno o conjuntamente significan un enlace y
R^{3} significa
metilo.
10. Empleo de una hidrolasa, que transforma al
éster de metilo de la 4-butirobetaína en
4-butirobetaína, en un procedimiento para la
obtención de L-carnitina.
11. Empleo de microorganismos, que contengan una
hidrolasa, que transforme al éster de metilo de la
4-butirobetaína en 4-butirobetaína,
para la obtención de L-carnitina.
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