ES2282460T3 - Composciones bacterianas inmunogenicas de celulas completas incapacitadas. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición bacteriana de célula entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto susceptible a una infección por una enfermedad causada por una bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador.

Description

Composiciones bacterianas inmunogénicas de células completas incapacitadas.

Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos y composiciones para la producción de composiciones inmunogénicas bacterianas de células enteras inactivadas, que son muy similares a los patógenos infecciosos vivos pero no son infecciosas.

Antecedentes de la invención

El incremento alarmante en la resistencia bacteriana a los antibióticos disponibles, enfermedades contraídas en viajes internacionales y las enfermedades infecciosas recientemente identificadas, han resaltado la necesidad de nuevas vacunas efectivas. Las vacunas de células enteras inactivadas, son un componente importante de las aproximaciones que aparecen para cubrir estas necesidades de salud pública. La administración de vacunas de células enteras, es uno de los métodos más bien estudiados de vacunación contra infección bacteriana. Las ventajas particulares de las vacunas de células enteras incluyen la presentación de muchos antígenos (incluyendo antígenos protectores pero todavía indefinidos), opciones mínimas de efectos secundarios cuando no se dan de manera parenteral, un potencial de virulencia de cero y un carácter de tipo adyuvante. Los estudios en modelos animales y en humanos han mostrado inmunogenicidad cuando las vacunas de células enteras se administran oral o parenteralmente. También se ha demostrado la protección efectiva contra infecciones bacterianas respiratorias entéricas y sistémicas. Aunque solamente la vacuna de tosferina de células enteras inactivadas se ha utilizado para inmunizar al público en general, otras vacunas de células enteras tienen el potencial para un uso global.

Existen únicamente dos tipos básicos de vacunas de células enteras: las vivas atenuadas y las inactivadas. Las características de las vacunas vivas e inactivadas son diferentes, y estas características determinan como se usa la vacuna.

Grundling et al., J Bacteriol. 2000 Nov.; 182(21):6082-90, describen el análisis genético y bioquímico de interacciones de dímeros y oligómeros de la holina S de lambda, una proteína de membrana pequeña que permeabiliza la membrana interior a un tiempo precisamente programado después de la infección y permite que la endolisina acceda a su sustrato, dando como resultado la lisis de la célula hospedadora. Mindich et al., J Virol. 1982 Dic; 44(3):1013-20, describen el aislamiento de mutantes sin sentido del bacteriófago que contiene el lípido PRDI.

Vacunas vivas atenuadas

Las vacunas vivas atenuadas se producen al modificar una bacteria productora de la enfermedad ("salvaje") en el laboratorio. Las vacunas vivas atenuadas disponibles en los Estados Unidos incluyen virus vivos y bacterias vivas. Estos virus o bacterias salvajes se atenúan o se debilitan en el laboratorio habitualmente mediante cultivo repetido. Con el fin de producir una respuesta inmune, las vacunas vivas atenuadas deben replicarse (crecer) en la persona vacunada. Se da una dosis relativamente pequeña del virus o bacteria, la cual se replica en el cuerpo y se incrementa hasta un gran volumen suficiente para estimular una respuesta inmune. Cualquier cosa que dañe al organismo vivo en el vial (por ejemplo, calor, luz) o interfiera en la replicación del organismo en el cuerpo (anticuerpo circulante) puede causar que la vacuna sea ineficaz. Aunque las vacunas vivas atenuadas se replican, habitualmente no provocan enfermedad, tal como puede suceder con el organismo natural ("salvaje"). Cuando una vacuna viva atenuada provoca una "enfermedad", es habitualmente mucho más moderada que la enfermedad natural y se refiere como una reacción adversa. La respuesta inmune a una vacuna viva atenuada es virtualmente idéntica a aquella producida por una infección natural. El sistema inmune no diferencia entre una infección con una bacteria de vacuna debilitada y una infección con una bacteria de tipo salvaje. Las vacunas vivas atenuadas son generalmente efectivas con una dosis excepto aquellas que se administran oralmente.

Sin embargo, las vacunas vivas atenuadas encuentran diversas limitaciones. Primero, las vacunas vivas atenuadas pueden provocar reacciones fatales o severas como resultado de una replicación descontrolada (crecimiento) del virus de vacuna. Esto sucede sólo en personas con inmunodeficiencia (por ejemplo, de leucemia, tratamiento con ciertos fármacos o infección por VIH). Además dependiendo de como se genera la cepa de la vacuna, una vacuna atenuada viva puede algunas veces revertirse a su forma patogénica original (que causa la enfermedad). Hasta la fecha, esto solamente se sabe que sucede con la vacuna de polio viva. La inmunidad activa de una vacuna viva atenuada puede no desarrollarse debido a la interferencia del anticuerpo en circulación con el virus de la vacuna. El anticuerpo de cualquier fuente (por ejemplo, a través de la placenta, transfusión) puede interferir en el crecimiento del organismo de vacuna, y conduce a una no respuesta a la vacuna (también conocida como fallo de vacuna). El virus de la vacuna del sarampión parece ser más sensible al anticuerpo en circulación. Los virus de la vacuna del rotavirus y de la polio están menos afectados. Las vacunas vivas atenuadas son lábiles y se pueden dañar o destruir por el calor y la luz. Se deben manejar y almacenar cuidadosamente. Las vacunas vivas atenuadas actualmente disponibles, incluyen virus vivos (sarampión, paperas, rubeola, polio, fiebre amarilla, vaccinia y varicela), y dos vacunas bacterianas vivas (BCG y tifoidea oral).

Vacunas inactivadas

Las vacunas inactivadas pueden estar compuestas de virus o bacterias completos o fracciones de cada uno. Las vacunas fraccionadas están basadas en proteínas o en polisacáridos. Las vacunas basadas en proteínas incluyen toxoides (toxinas bacterianas inactivadas) y productos de subunidad. La mayoría de las vacunas basadas en polisacáridos, se componen de un polisacárido de pared celular puro procedente de las bacterias. Las vacunas de polisacáridos conjugados son aquellas en las cuales el polisacárido se une químicamente a una proteína. Esta unión hace al polisacárido una vacuna más potente. Estas vacunas se producen mediante crecimiento de las bacterias en medios de cultivo, luego se inactivan con el calor y/o productos químicos (habitualmente formalina). En el caso de las vacunas fraccionadas, el organismo se trata además para purificar solamente aquellos componentes a ser incluidos en la vacuna (por ejemplo, la cápsula de polisacáridos de neumococo).

Las vacunas inactivadas no están vivas y no se pueden replicar. La dosis completa del antígeno se administra en la inyección (en comparación con las vacunas atenuadas vivas, que proporcionan dosis adicionales con la replicación en el hospedador). Las vacunas inactivadas no pueden provocar una enfermedad por la infección, incluso en una persona inmunodeficiente. A diferencia de los antígenos vivos, los antígenos inactivados no se ven afectados habitualmente por el anticuerpo en circulación. Las vacunas inactivadas se pueden dar cuando el anticuerpo está presente en la sangre (por ejemplo, en la infancia o después de recibir productos sanguíneos que contienen anticuerpos). Las vacunas inactivadas siempre requieren múltiples dosis. En general la primera dosis no produce una inmunidad protectora sino que solamente "activa" el sistema inmune. Una respuesta inmune protectora se desarrolla después de la segunda o tercera dosis.

A diferencia de las vacunas vivas, en las cuales la respuesta inmune se asemeja cercanamente a una infección natural, la respuesta inmune a una vacuna inactivada es principalmente humoral. Resulta en poca o ninguna inmunidad celular. Las concentraciones de anticuerpos contra antígenos inactivados disminuyen durante el tiempo. Como resultado, algunas vacunas inactivadas pueden requerir dosis complementarias periódicas para incrementar o reforzar las concentraciones de anticuerpo. En algunos casos el antígeno crítico para la protección contra la enfermedad puede no estar definido, requiriendo así el uso de vacunas de "células enteras". Las vacunas inactivadas actualmente disponibles incluyen virus enteros inactivados (influenza, polio, rabia, hepatitis A) y bacterias completas inactivadas (tosferina, tifoidea, cólera, peste). Las vacunas "fraccionadas" incluyen subunidades (Hepatitis B, influenza, tosferina acelular, tifoidea Vi, enfermedad de Lyme), toxoides (difteria, tétanos, botulinum), polisacáridos puros (neumococos, meningococos, Haemophilus influenzae de tipo b), y conjugados de polisacáridos (Haemophilus influenzae de tipo b y neumococos).

En resumen se reconoce que cuanto más similar sea una vacuna a la enfermedad natural, mejor es la respuesta inmune a la vacuna. Aunque las vacunas atenuadas son más prometedoras a este respecto, poseen riesgos de enfermedad en hospedadores inmunocomprometidos y la reversión a organismos patogénicos de tipo salvaje. Las vacunas inactivadas evitan estos problemas, pero todavía pueden ser menos deseables que estas vacunas no imiten una infección natural, y entonces no pueden producir una respuesta inmune relevante o producir una respuesta inmune protectora tan robusta como se pudiera desear.

Así existe una necesidad en el campo de vacunas bacterianas seguras, que se asemejen al organismo infeccioso más cercanamente que las vacunas inactivadas pero que tengan un riesgo reducido o no significativo de provocar una enfermedad en el sujeto vacunado. La presente invención atiende esta necesidad.

Breve descripción de la invención

La invención se refiere a composiciones inmunogénicas bacterianas de células enteras incapacitadas, producidas por la infección de un bacteria con un bacteriófago Lys menos (en inglés "Lys minus bacteriophage") que es deficiente en la proteína de lisina. El bacteriófago Lys menos es incapaz de facilitar una lisis eficiente del hospedador bacteriano, ya que la actividad enzimática de la lisina del fago se necesita para la degradación enzimática de la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El bacteriófago Lys menos conserva su actividad en la infección de su hospedador bacteriano adecuado, la destrucción de genoma bacteriano y la replicación que son suficientes para inhibir el crecimiento y replicación bacterianas. La bacteria resultante infectada con Lys menos, se proporciona en un estado de bacteriostasis, y no es capaz de replicarse más (por ejemplo, está incapacitada). A continuación, se puede usar la bacteria incapacitada para obtener una respuesta inmune para propósitos profilácticos y/o terapéuticos. Así, la invención se refiere también a bacterias incapacitadas formuladas adecuadamente para su uso en composiciones inmunogénicas para obtener una respuesta inmune, por ejemplo, para la producción de anticuerpos en un hospedador no humano o en una vacuna bacteriana de células enteras.

En un aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición bacteriana de células enteras incapacitadas en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto susceptible a infección por una enfermedad causada por una bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada mediante la infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador.

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En otro aspecto, se proporciona el uso de una composición bacteriana de células enteras incapacitadas en la fabricación de una vacuna para vacunar a un sujeto contra una enfermedad causada por un patógeno bacteriano, comprendiendo la vacuna la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicha vacuna se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el sujeto.

En un aspecto más, la presente invención proporciona el uso de una composición bacteriana de células enteras incapacitadas en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, en donde la composición comprende una bacteria incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuosos en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a un antígeno presente en o en la bacteria.

La invención además proporciona una composición que comprende una bacteria incapacitada y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la bacteria incapacitada se produce mediante infección de una bacteria patogénica con un bacteriófago Lys menos.

En realizaciones específicas de cada uno de los aspectos anteriores, la bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que consiste en Mycobacteria, Staphylococci, Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Salmonella, Streptococcus, Klebsiella y Yersinia, y en donde el bacteriófago inhibe el crecimiento de las bacterias infecciosas. En realizaciones específicas adicionales de cada uno de los aspectos anteriores, el bacteriófago defectuoso en la lisis es el bacteriófago Lys menos.

Un aspecto de la invención, es que se proporcionan procedimientos para producir una composición inmunogénica de células enteras bacterianas que están incapacitadas de manera que mantiene la inmunogenicidad o antigenicidad de la bacteria, pero que no permite la recuperación de la bacteria y la replicación e infección en el hospedador.

Otro aspecto de la invención, es proporcionar procedimientos y composiciones para efectuar una respuesta inmune protectora contra infecciones bacterianas, particularmente infecciones por bacterias patogénicas.

Una ventaja de la invención es que las bacterias incapacitadas por infección con los bacteriófagos Lys menos, no son capaces de recuperarse de la bacteriostasis con la eliminación del bacteriófago libre. Así, las vacunas bacterianas incapacitadas se asocian con un riesgo sustancialmente reducido de provocar la enfermedad en un hospedador vacunado en comparación con las vacunas vivas atenuadas.

Otra ventaja de la invención es que el antígeno contra el cual se desea una respuesta inmune, cuando se produce en bacterias incapacitadas por fagos, no se modifica significativamente en términos de los antígenos presentes en la superficie de células bacterianas, o en términos de los antígenos que se proporcionan como inclusión o cuerpos agregados dentro de las bacterias que son procesados por el sistema inmune, por ejemplo, a continuación de la fagocitosis de la bacteria por un macrófago. En contraste, la inactivación bacteriana inducida químicamente puede resultar en la reticulación de proteínas de superficie y una modificación química e irreversible del antígeno.

Estos y otros objetivos, ventajas y características de la invención, serán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica con la lectura de los detalles de las composiciones de la invención y sus métodos de uso tal como se describen más completamente a continuación.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un esquema que muestra el uso de un hospedador bacteriano que tiene un plásmido con un gen de lisina mutante, para uso en la producción de un bacteriófago Lys menos de la invención.

La figura 2 ilustra el SDS-PAGE de los productos de los genes producidos por los plásmidos pGMB011 y pGMB021 (carril 1: pGMB11, sin inducir; carril 2: pGMB011, inducido; carril 3; pGMB021, sin inducir; carril 4: pGMB021, inducido; carril 5: marcador 14-97 kDa).

La figura 3 ilustra los resultados de la PCR de la construcción pGMB021 usada para experimentos de recombinación (carril 1: cebadores GMB1/GMB2; carril 2: cebadores GMB2/GMB5; carril 3: marcadores; carril 4: cebadores GMB5/GMB6).

La figura 4 ilustra la PCR de placas turbias producto del gen GFP (carriles 1-5, 7, 8, 17 y 18: pools positivos para el producto del gen GFP; carriles 6, 11-16; pools negativos para el producto del gen GFP; carriles 9, 19: control positivo; carriles 10, 20: marcador de PM).

La figura 5 representa la PCR de placas turbias para el producto de gen lisina-GFP-lisina (carriles 1-6: placas turbias #1, 2, 3, 4, 7, 8: carril 7: control positivo para el producto lisina-GFP-lisina (ADN plásmido); carril 8: marcador PM; carril 9: control positivo para el producto de lisina (ADN plásmido); carril 10: control negativo).

La figura 6 ilustra lisados de fagos recombinantes con moteados en una capa de E. coli que muestra niveles diferentes de contaminación con el fago de tipo salvaje o la ausencia total de placas salvajes (mancha #1: lisado #11 que muestra un número contable de placas salvajes; mancha #2: lisado que muestra un alto número de placas salvajes que lisan completamente las células; mancha #3: lisado que no muestra ninguna de las placas salvajes).

La figura 7 ilustra un fago recombinante que contiene los lisados moteados en una capa de E. coli que muestra la ausencia de placas.

La figura 8 ilustra lisados que contienen fagos recombinantes (RP) que conducen a la pérdida de viabilidad de las células E. coli infectadas (cuadrante #1: \sim50% de pérdida de viabilidad observada con el lisado RP #33; cuadrantes #2 y 4: pérdida total de viabilidad en el caso de los lisados RP #34 y #36; cuadrante #3: ninguna pérdida significativa de viabilidad con el lisado RP #35).

Antes de que se describa la presente invención, se debe entender que esta invención, no está limitada a una metodología, protocolos, bacteriófagos, patógenos bacterianos, especies o géneros animales, construcciones y reactivos particulares descritos, como tales pueden por supuesto variar. También se debe entender, que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir solamente realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante ya que el alcance de la presente invención estará solamente limitado por las reivindicaciones anexas.

En donde se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima de la unidad del límite inferior a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera, entre los límites superior e inferior del rango también se describe específicamente. Cada rango más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio, en un intervalo establecido, y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo establecido está englobado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños, se pueden incluir independientemente o excluir del intervalo, y cada intervalo en donde alguno, ninguno o ambos límites están incluidos en los intervalos más pequeños también está incluido dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo establecido. En donde el intervalo establecido incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos también se incluyen en la invención.

A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien experto en la técnica a quien pertenece esta invención. Aunque se pueden usar cualquiera de los procedimientos y materiales similares equivalentes a los aquí descritos en la práctica o probando la presente invención, se describen ahora los procedimientos y materiales preferidos.

Se debe indicar que como se usa en la presente y en la reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "y", y "el", incluyen los referentes en plural al menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Así, por ejemplo la referencia a "un bacteriófago" incluye una pluralidad de tales bacteriófagos y la referencia a la célula hospedadora, incluye la referencia a una o más células hospedadoras y equivalentes de las mismas conocidas por aquellos expertos en la técnica y así sucesivamente.

Las publicaciones aquí discutidas, se proporcionan únicamente para su divulgación previa a la fecha de presentación de la solicitud actual. Nada en la presente se constituye como una admisión de que la presente invención no está acreditada por ser anterior a tal publicación en virtud de la invención previa. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación actuales lo cual puede necesitar que sea confirmado independientemente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona procedimientos y composiciones para la producción de bacterias de células enteras inactivadas, bacterias que se generan usando un bacteriófago defectuoso en la capacidad para lisar la célula hospedadora bacteriana. Los bacteriófagos son virus altamente específicos que infectan a las bacterias. Después de la infección de una bacteria como E. coli por un fago lítico, tal como T4, tiene lugar una reconfiguración profunda de todas las síntesis macromoleculares. La polimerasa de ARN RNAP de la bacteria hospedadora se une a los sitios de inicio del genoma del fago conocidos como genes tempranos inmediatos (IE) y los transcribe. Algunos de los productos IE degradan al ADN hospedador (bacteriano) que carece de la base modificada hidroximetilcitosina (mientras que otro producto, la ADP-ribosa, se une a las subunidades alfa de RNAP bacterianas y la hace incapaz de reconocer a los promotores celulares bacterianos. Esto resulta en el cese de la transcripción de los genes hospedadores. Estos eventos suceden en los primeros 3 a 5 minutos después de la infección.

En la siguiente etapa el RNAP modificado reconoce y se une a los genes denominados temprano retrasados (DE) eliminando así una expresión adicional de los genes IE del fago. Los productos de genes DE están involucrados en la replicación del genoma de fagos usando las bases de ADN bacterianas degradadas. Uno de los productos de los genes DE es un factor sigma nuevo que provoca que el RNAP hospedador reconozca solamente los genes tardíos (L) que son los siguientes en ser traducidos. Los genes tardíos están involucrados en la síntesis de nuevas proteínas de las cápsides, extremos y fibras de extremo y ensamblan proteínas, todas las cuales siendo necesarias para ensamblar las partículas de fagos de progenie. Finalmente el gen de lisozima de los fagos se activa resultando en la lisis de la célula hospedadora bacteriana y la liberación del fago de la progenie.

Durante la década anterior, se han investigado los componentes claves esenciales para la lisis de hospedador por bacteriófagos. Se reconoce ahora que dos proteínas, una endolisina y una holina, son necesarias para que suceda la lisis del hospedador. Las endolisinas son enzimas muralíticas que se acumulan en el citosol, y las holinas son proteínas de membrana pequeñas que regulan el acceso de las endolisinas a la pared celular a través de la membrana citoplásmica (Wang y otros Ann. Rev. Microbiol. 54, 799-825 (2000)). La región de gen de lisis del bacteriófago lambda se clona en un plásmido multi-copia, pBH 20 bajo el control transcripcional del operador lac y la inducción de este "operón de lisis" conduce a un comportamiento lítico paralelo al de células infectadas con bacteriófagos (Garrett, J. et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981). Los dos genes de lisis cph1 y cpl1 del bacteriófago Streptococcal pneumoniae Cp-1, que codifica la holina y la lisina respectivamente, se han clonado y expresado en E. coli (Martin et al., J. Bacteriol. 180, 210 (1998)). La expresión de la holina Cph1 resulta en la muerte de las células bacterianas pero no en la lisis. La expresión concomitante de tanto la holina como la lisina del fago Cp-1 en E. coli resultó en lisis celular. Además, el gen cph1 fue capaz de complementar una mutación lambda Sam (que lleva una mutación ámbar en el gen de holina) en la cepa no supresora de E. coli HB101 para liberar la progenie de fagos. La expresión regulada de los genes S y R de la lisis de fagos lambda provoca una lisis espectacular de las células de serovar Typhimurium del Vibrio cholerae y Salmonella enterica (Jain y otros Infect Immun, 68, 986 (2000).

La presente invención se refiere a bacterias que están incapacitadas (por ejemplo, no son capaces de replicarse para soportar una infección en un hospedador), bacterias que se incapacitan mediante infección con un bacteriófago específico que carece de uno o más componentes del sistema de lisis del fago. El fago modificado entra en el hospedador bacteriano, interrumpe las síntesis macromoleculares del hospedador, se replica en sí mismo pero no lisa el hospedador bacteriano. Las bacterias infectadas con fagos están incapacitadas y no pueden esparcir la infección, pero conservan los epítopos antigénicos en la superficie celular en una conformación esencialmente nativa y la configuración o expresa el antígeno como un cuerpo de inclusión o forma agregada, que luego puede ser procesado por el sistema inmune por ejemplo, a continuación de la fagocitosis de la bacteria por un macrófago. Las bacterias infectadas con fagos tienen esencialmente la misma inmunogenicidad que el patógeno vivo y producen por lo tanto una respuesta inmune protectora contra el patógeno bacteriano. Así, las bacterias incapacitadas de la invención son útiles, por ejemplo, en la producción de una respuesta inmune contra un antígeno de interés por ejemplo, para la producción de anticuerpos en un animal no humano, como una vacuna bacteriana de células enteras y similares.

Los aspectos específicos de la invención se describirán ahora en mayor detalle.

Definiciones

Por "bacteriófago" y "fago", términos que se usan intercambiablemente en la presente, significa cualquiera de una diversidad de virus que tiene una afinidad específica e infectan bacterias. Estas incluyen así, colifagos, que infectan Escherichia coli (por ejemplo, el fago lambda y los fagos uniformes T, T2, T4, y T6). Los fagos están compuestos generalmente por un recubrimiento de proteína o cápside que encierra al material genético, ADN o ARN, que se inyecta en la bacteria para la infección. En el caso de fagos virulentos, todas las síntesis del ADN, ARN y proteínas del hospedador se suspenden y se usa el genoma del fago para dirigir la síntesis de los ácidos nucleicos y las proteínas del fago utilizando el aparato de traducción y transcripción del hospedador. Estos componentes del fago luego se autoensamblan para formar nuevas partículas de fago. La síntesis de la lisozima del fago conduce a la ruptura de una pared celular bacteriana que libera típicamente una progenie de 100-200 fagos. Los fagos moderados, tales como lambda, pueden mostrar también este ciclo lítico cuando infectan una célula, pero más frecuentemente inducen la lisogenia en la cual el fago se integra en el ADN del hospedador bacteriano para persistir como un profago. En general el bacteriófago de interés de la invención son fagos líticos más que fagos moderados.

Por "fago Lys menos" o "bacteriófago Lys menos", cuyos términos se usan intercambiablemente, significa un fago deficiente en la proteína de lisina. Los bacteriófagos Lys menos son incapaces de facilitar una lisis eficiente del hospedador bacteriano ya que la actividad enzimática de la lisina del fago se necesita para la degradación enzimática de la capa de peptidoglicano de la pared celular bacteriana. El bacteriófago Lys menos mantiene la actividad en la infección de su hospedador bacteriano apropiado, destrucción del genoma bacteriano, y replicación, que son suficientes para inhibir el crecimiento y la replicación bacterianos. El fago Lys menos incluye aquellos generados por mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de lisis de fago. El fago Lys menos, abarca el fago defectuoso en lisina debido a la eliminación de todo o una parte del ácido nucleico que codifica la lisina, de manera que no se produce lisina detectable, o se produce una forma truncada de la lisina la cual tiene una actividad reducida para facilitar la lisis (por ejemplo, la lisina truncada no es efectiva en la promoción eficiente de la lisis del hospedador bacteriano o no facilita ninguna actividad de lisis mediada por lisina de tipo salvaje detectable). El fago Lys menos también incluye aquellos en los que un ácido nucleico que codifica la lisina se une operativamente a un promotor inducible de manera que tiene lugar la producción de lisina a un nivel efectivo para inducir la lisis sólo cuando está en presencia de un agente que activa el promotor inducible. Preferiblemente, el agente inductor es uno que normalmente no se encuentra en el hospedador
a ser tratado usando el fago, por ejemplo, el inductor no es un agente que es endógeno al hospedador ser a tratado.

El fago Lys menos, también incluye un fago que produce la proteína de lisina modificada, cuya lisina es deficiente para promover la lisis bacteriana debido a la presencia de una o más mutaciones. Tales mutaciones incluyen al menos una, o una combinación de una o más, eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones de ácido nucleico, que resultan en una alteración en la correspondiente secuencia de aminoácido de la proteína de lisina codificada. Así, el fago Lys menos abarca generalmente fagos en los cuales el gen de lisina está completa o parcialmente eliminado para el gen de lisina o modificado de otra manera (por ejemplo, por adición, sustitución o reemplazo de los nucleótidos codificantes) para proporcionar una expresión sustancialmente disminuida o ninguna expresión de la lisina funcional. El fago Lys menos también se puede reproducir inhibiendo la función de la lisina en un hospedador a través de la expresión del ARN de interferencia (por ejemplo, antisentido) o la producción de péptidos inhibidores en la célula hospedadora, los ARN de interferencia o péptidos inhibidores pudiendo ser producidos por esas células (por ejemplo, a partir
de una célula bacteriana hospedadora modificada genéticamente) o a partir de un ácido nucleico liberado de fagos.

Por "incapacitado" en el contexto de una célula bacteriana incapacitada producida de acuerdo con la invención, significa que la célula bacteriana está en un estado de bacteriostasis irreversible. Aunque la bacteria conserva su estructura, y conserva así por ejemplo, la inmunogenicidad, antigenicidad y/o interacciones ligando-receptor asociadas con una bacteria de tipo salvaje, no es capaz de replicarse debido a la presencia de un fago infeccioso dentro de la célula bacteriana.

Por "aislado" significa que el material es al menos un 60%, en peso libre de proteínas y moléculas orgánicas que se encuentran de manera natural con las cuales se asocia de manera natural. Preferiblemente, el material es al menos un 75%, más preferiblemente al menos un 90%, y más preferiblemente al menos un 99% en peso de material de interés. "Aislado" incluye de esta manera preparaciones que se enriquecen del material deseado.

Los términos "polinucleótidos" y "ácido nucleico", usados intercambiablemente en la presente, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos. De esta manera, los términos incluyen pero no se limitan a, ADN o ARN de estructura de cadena múltiple, doble o única, ADN genómico, híbridos de ADN-ARN, ADNc o un polímero que comprende bases purina y pirimidina u otras bases de nucleótido derivados, no naturales, modificados químicamente o bioquímicamente o naturales.

Los términos "polipéptidos" y "proteína", usados intercambiablemente en la presente, se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden incluir aminoácidos codificados y no codificados, modificados químicamente o bioquímicamente (por ejemplo, modificación post-traduccional tal como glicosilación), o aminoácidos derivados, polipéptidos poliméricos, y polipéptidos que tienen estructuras de péptidos modificados. El término incluye proteínas de fusión, incluyendo pero no limitándose a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líder heterólogas y homólogas, con o sin residuos de metionina N-terminales; proteínas etiquetadas inmunológicamente y similares.

El término "polinucleótido recombinante" tal y como se usa en el presente documento, se dirige a un polinucleótido de un origen genómico, ADNc, semisintético, o sintético el cual en virtud de su origen, o manipulación: (1) no está asociado con toda o una porción de un polinucleótido al cual se asocia en la naturaleza, (2) se enlaza a un polinucleótido diferente al que se une en la naturaleza, o (3) no se encuentra en la naturaleza.

"Células hospedadoras recombinantes", "células hospedadoras", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares", y otros términos denotan microorganismos o células eucariotas superiores cultivadas como identidades unicelulares con referencia a las células que pueden, o tienen, que ser usadas como receptores del vector recombinante u otro ADN de transferencia e incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Se debe entender que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente idéntica completamente en morfología, o el complemento de ADN genómico o total, que la precursora original, debido a la naturaleza, mutación deliberada o accidental.

"Unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes de esta manera descritos están en una relación que permite que funcionen en su manera pretendida. Una secuencia control "unida operativamente" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

Un "marco de lectura abierto" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido; esta región puede representar una porción de una secuencia codificante o una secuencia codificante total.

Una "secuencia de codificación" es una secuencia de polinucleótido que se transcribe en ARNm y/o se traduce en un polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio de la traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de la traducción en la extremo 3'. Una secuencia de codificación puede incluir pero no se limita a secuencias de ARNm, ADNc y de polinucleótido recombinantes.

"Heterólogos" significa que los materiales se derivan de diferentes fuente (por ejemplo, de diferentes genes, diferentes especies etc).

"Transformación", como se usa en la presente se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedadora, sin tener en cuenta el procedimiento usado para la inserción, por ejemplo, ingestión directa, transducción, acoplamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente, se puede integrar en el genoma hospedador.

Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador", y "paciente", se usan intercambiablemente en la presente y se refiere a cualquier sujeto que tiene una infección bacteriana que se puede tratar usando el bacteriófago terapéutico de la invención, y del cual se desea el tratamiento o terapia. Los sujetos y pacientes mamíferos, particularmente sujetos o pacientes humanos son de interés particular. Otros sujetos pueden incluir ganado perros, gatos, conejillos de indias, conejos, ratas, ratones, caballos y demás.

Los términos "tratamiento", "tratado" y "tratar" y similares, se usan en la presente para referirse generalmente a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completamente o parcialmente una enfermedad o síntoma del mismo, y/o puede ser terapéutico n términos de una estabilización parcial o completa o cura para una enfermedad y/o efecto o adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente cubre cualquier tratamiento de una enfermedad de un sujeto, particularmente un sujeto mamífero, más particularmente un humano e incluye, (a) prevenir que tenga lugar la enfermedad o síntoma en un sujeto, que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que no se ha diagnosticado todavía por tenerlo; (b) inhibir el síntoma de la enfermedad, esto es, suspender su desarrollo, o aliviar el síntoma de la enfermedad, esto es, provocar la regresión de la enfermedad o síntoma.

Por "bacteria infecciosa" significa una bacteria que tiene una infección establecida en el hospedador, y que se puede asociar con una enfermedad o un síntoma indeseable como resultado. Generalmente, las bacterias infecciosas son bacterias patogénicas.

Por "bacterias resistentes a fármaco" o "bacterias resistentes a antibióticos" se entiende una cepa bacteriana que es resistente a la inhibición del crecimiento o a la muerte por antibiótico. Las bacterias resistentes a multifármacos son resistentes a dos o más antibióticos. La resistencia a fármacos puede abarcar por ejemplo, la muerte ineficaz de las bacterias infecciosas, de manera que al menos permanece una dosis infecciosa en el sujeto y continúa la infección, resultando en síntomas continuos de la enfermedad infecciosa asociada o una evidencia posterior de tales síntomas. También puede abarcar la resistencia a fármacos la inhibición del crecimiento de bacterias resistentes a fármacos hasta que dicha terapia de tiempo se descontinúa, después de lo cual las bacterias comienzan a replicarse y además la enfermedad infecciosa.

Por "inhibición del crecimiento bacteriano" en el contexto de la infección de una célula bacteriana con un bacteriófago Lys menos, significa que después de la infección de las bacterias el bacteriófago inhibe o interfiere en los mecanismos de traducción y/o transcripción normales de la célula hospedadora bacteriana, de manera que las bacterias infectadas no se someten a una división celular sustancial (replicación) y se provoca que entre en un estado de bacteriostasis.

El término "inmunidad protectora" significa que una vacuna, composición inmunogénica, o programa de inmunización que se administra a un mamífero induce una respuesta inmune que previene, retrasa el desarrollo de, o reduce la severidad de una enfermedad que es causada por una bacteria patogénica o disminuye o elimina por completo los síntomas de la enfermedad.

La frase "una cantidad suficiente para producir una respuesta inmune a epítopos presentes en dicha preparación" significa que existe una diferencia detectable entre un indicador medido de respuesta inmune antes y después de la administración de una preparación de vacuna particular o composición inmunogénica. Los indicadores de respuesta inmune incluyen, pero no se limitan a: titulación o especificidad de anticuerpo, como se detecta por un ensayo tal como el inmunoensayo enlazado a la enzima (ELISA), ensayo bactericida, citometría de flujo, inmunoprecipitación, inmunodifusión Ouchter-Lowny; ensayos de detección de unión de, por ejemplo, "spot", Western blot o ensayos de antígeno; ensayos de citotoxicidad, etc.

Los términos "composición bacteriana inmunogénica", "composición inmunogénica", y "vacuna" se usan intercambiablemente en la presente para significar una preparación capaz de provocar una respuesta inmune celular y/o humoral en un sujeto cuando se administra en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune a los epítopos presentes en la preparación.

Un "antígeno de superficie" es un antígeno que está presente en la estructura de superficie de una célula bacteriana (por ejemplo, la membrana exterior, la membrana interior, el espacio periplásmico, cápsula, pilos, etc.).

El término "inmunológicamente naïve" con respecto a un patógeno bacteriano particular, significa un individuo (por ejemplo, un mamífero tal como un paciente humano) que nunca ha sido expuesto (a través de la infección o administración) al patógeno bacteriano específico o a una composición de antígeno derivada de dicha bacteria en cantidades suficientes para provocar una inmunidad protectora, o si se ha expuesto falla en el montaje de una respuesta inmune protectora.

Tal y como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a un polipéptido o grupo de polipéptidos que comprenden al menos un sitio de combinación de anticuerpos. Un "sitio de combinación de anticuerpos" o "dominio de unión" se forma a partir del plegamiento de dominios variables de una(s) molécula(s) de anticuerpo para formar espacios de unión tridimensionales con una forma de superficie interna y una distribución de carga complementaria a las características de un epítopo de un antígeno, lo que permite una reacción inmunológica con el antígeno. Un sitio de combinación de anticuerpo puede formarse a partir de un dominio de cadena pesada y/o ligera (V_{H} y V_{L}, respectivamente), que forman bucles hipervariables que contribuyen a la unión del antígeno. El término "anticuerpo" incluye por ejemplo, anticuerpos vertebrados, anticuerpos híbridos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos alterados, anticuerpos univalentes, las proteínas Fab y anticuerpos de un único dominio. Un anticuerpo "anti-idiotipo", se refiere a un tipo de anticuerpo que imita la estructura de un antígeno para el cual otro anticuerpo es específico.

Bacteriófago para la producción del bacteriófago Lys menos para usarse en la producción de vacunas bacteriales incapacitadas

Un fago Lys menos útil en la producción de una bacteria incapacitada, que a su vez es útil en vacunas de la invención, se puede generar a partir de cualquier bacteriófago de tipo salvaje, preferiblemente a partir de un fago lítico. De esta manera, los procedimientos y composiciones de la invención pueden aplicarse al desarrollo de cualesquiera de una variedad de bacteriófagos Lys menos que son específicos para cualesquiera de una variedad de bacterias y de esta manera son útiles en el tratamiento de una amplia variedad de infecciones bacterianas. Aunque está contemplado que la presente invención pueda usarse para generar cualesquiera de una variedad de vacunas bacterianas de células enteras, cuyas vacunas se pueden usar de manera profiláctica o terapéutica, ya sea solas o junto con otras terapias (adjuntas o de presentación única) para infecciones bacterianas.

De particular interés es el desarrollo de vacunas para especies bacterianas y cepas clínicamente importantes, particularmente especies y cepas bacterianas resistentes a fármacos. Ejemplos de estos se listan a continuación. El número de acceso en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, MD) para un ejemplo de bacteriófago de tipo salvaje que infecta las cepas clínicamente relevantes correspondientes, se proporcionan siguiendo las cepas que infectan. Tales fagos son ejemplos de aquellos que pueden modificarse para ser Lys menos para proporcionar un bacteriófago de acuerdo con la invención. La lista es como sigue:

1.

Todos los miembros clínicamente importantes de la familia Enterobacteriaceae, incluido pero no limitado a:

a.

Todas las cepas clínicamente importantes de Escherichia, siendo de interés particular E. coli (fago ATCC #23723-B2);

b.

Todas las cepas clínicamente importantes de Klebsiella, siendo de particular interés K.pneumoniae (fago ATCC # 23356-B1).

c.

Todas las cepas clínicamente importantes de Shigella, siendo de particular interés S.dysenteriae (fago ATCC #11456a-B1).

d.

Todas las cepas clínicamente importantes de Salmonella incluyendo S. abortus-equi (fago ATCC #9842-B1), S. typhi (fago ATCC #19937-B1), S. typhimurium (fago ATCC #19585-B1), S, newport (fago ATCC #27869-B1), S. paratyphi-A (fago ATCC #12176-B1), S. paratyphi-B (fago ATCC #19940-B1), S. potsdam (fago ATCC #259578-B2), y S. pollurum (fago ATCC #19945- B1).

e.

Todas las cepas clínicamente importantes de Serratia, más notablemente S. marcescens (Fago ATCC #14764-B1).

f.

Todas las cepas clínicamente importantes de Yersinia, más notablemente Y. pestis (Fago ATCC #11953-B1).

g.

Todas las cepas clínicamente importantes de Enterobacter, más notablemente E. cloacae (Fago ATCC #23355-B1);

2.

Todas las de Enterococci clínicamente importantes, más notablemente E. faecalis (Fago ATCC #19948-B1) y E. faecium (Fago ATCC #19953-B1).

3.

Todas las cepas clínicamente importantes de Haemophilus, más notablemente H. influenzae (el fago ejemplificativo se puede obtener de la Organización Mundial de la Salud (OMS) o de otros laboratorios que los hagan disponibles de forma pública);

4.

Todos los Mycobacteria clínicamente importantes, más notablemente M. tuberculosis (Fago ATCC #25618-B1), M. avium-intracellulare, M. bovis, y M. leprae (fago ejemplificativo comercialmente disponible de la OMS, por medio del Instituto Nacional de Salud Pública y Protección Ambiental, Bilthoven, Países Bajos);

5.

Neisseria gonorrhoeae y N. meningitidis (fago ejemplificativo que se puede obtener de manera pública de la OMS y de otras fuentes);

6.

Todas las Pseudomonads, clínicamente importantes siendo de particular interés P. aeuruginosa (Fago ATCC #14203-B1);

7.

Todos los Staphylococci, clínicamente importantes siendo de particular interés S. aureus (Fago ATCC#27690-B1) y S. epidermidis (fago ejemplificativo públicamente disponible a través de la OMS, por medio del instituto Colindale en Londres);

8.

Todos los Streptococci, clínicamente importantes siendo de particular interés S. pneumoniae (fago ejemplificativo que se puede obtener públicamente de la OMS o de otras fuentes); y

9.

Vibrio cholera (fago #14100-B1).

Los patógenos bacterianos adicionales, demasiado numerosos para mencionarse aquí, particularmente aquellos para los cuales se ha desarrollado una resistencia a fármacos, también pueden ser susceptibles a terapia de acuerdo con la presente invención. En resumen, todas las infecciones bacterianas provocadas por bacterias para las cuales hay un fago correspondiente actualmente disponible, o para los cuales se puede identificar el fago, se pueden tratar usando la pre-
sente invención al hacer el fago correspondiente Lys menos, y poner en contacto las bacterias con el fago Lys menos.

También se puede usar un nuevo fago en la presente invención. Tales fagos novedosos se aíslan continuamente de desechos de hospitales y de otras fuentes mediante procedimientos estándar. Típicamente, 9 ml de una muestra de desechos se mezclan con un 1 ml de caldo 10X LB, se añade 0,1 ml de caldo LB agitado durante la noche para el crecimiento del cultivo de una cepa bacteriana diana y se incuba durante la noche a 37°C. Se añade cloroformo (0,1 ml) y se incuba a 37°C durante 15 minutos con agitación a 300 rpm. A continuación se centrifuga a 14,000 rpm durante 20 minutos a 4ºC y el sobrenadante se guarda en tubos Eppendorf estériles. Estas preparaciones crudas de fagos se purifican y caracterizan adicionalmente si se necesita.

Lisinas de fagos

La lisis de la célula bacteriana hospedadora por muchos tipos de bacteriófagos, depende de al menos 2 tipos diferentes de proteínas (Young et al., Microbiol. Rev. 56, 430 (1992)). La degradación de la pared celular bacteriana se logra por las lisinas. Los ejemplos mejor estudiados son el producto de gen e T4, una lisozima (Tsugita et al., J. Biol. Chem. 243, 391 (1968)) y la proteína lambda R, una transglicosilasa (Garrett et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981)). En la década pasada se han identificado y caracterizado los genes de lisina de un gran número de bacteriófagos. Estos incluyen las lisinas del bacteriófago T7 (Inouye et al., Biol. Chem. 248, 7247 (1973)), gp 19 del fago P22 de Salmonella typhimurium (Rennell et al., Virol. 143, 280 (1985)), phi 29 gp 15 de dos fagos de las bacterias gram-positivo Lactococcus lactis y Bacillus subtilis (Garvey et al., Nucleic Acids Res. 14, 10001 (1986)), el bacteriófago del pneumococo Cp-1 (Garcia et al., J. Virol. 61, 2573 (1987)), el fago f6 de pseudomonas (Caldentey et al., Biochim. Biophys. Acta 1159, 44 (1992)), el gen K del bacteriófago P2 (Ziermann et al., J. Bacteriol. 176, 4974 (1994)), el gen 17 del bacteriófago P1 (Schmidt et al., Bacteriol. 178, 1099 (1996)), las lisinas del bacteriófago de Listeria monocytogenes, Ply 511 y Ply 518 (Gaeng et al., Appl. Environ. Microbiol. 66, 2951 (2000)) así como diversos fagos que infectan a los lactobacilos (Shearman et al., Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063 (1994)); Henrich et al., J. Bacteriol. 177, 723 (1995)).

Se dan a continuación lisinas adicionales de fagos publicadas en la literatura.

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Cuando el gen de lisina de un bacteriófago de interés no haya sido todavía identificado, se puede lograr dicha identificación usando procedimientos de rutina en la materia. Los genes de lisina de los bacteriófagos se pueden identificar mediante por ejemplo, procedimientos basados en la secuenciación del genoma de bacteriófagos y la comparación de la secuencia con aquellas del bacteriófago en la que se ha descrito el gen de lisina. La comparación de las secuencias de aminoácidos de las lisinas descritas hasta la fecha, revela tres regiones conservadas (Schmidt et al., J Bacteriol. 178, 1099 (1996). La primera región conservada contiene el sitio catalítico con la secuencia EG y la hendidura del sitio activo. Los genes de lisina de los bacteriófagos recientemente aislados, o los bacteriófagos en los cuales no ha sido todavía descrito el gen de lisina, se pueden identificar y aislar por técnicas de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) usando cebadores que corresponden a la secuencia de nucleótidos de las regiones conservadas de los genes de lisina conocidos. Al usar las partes conservadas del gen de lisina, los genes de lisina de cualquier fago se pueden aislar usando oligos degenerados, homólogos con cualquiera de 2 de 3 regiones conservadas. Una vez que se forma la secuencia de este producto de PCR, se pueden diseñar nuevos cebadores para la secuencia de las regiones en la dirección ascendente y en la dirección descendente de los genes de lisina, usando como plantilla el ADN del fago para la formación de secuencias.

Generación de los fagos mutantes Lys menos

El fago Lys menos se puede generar de cualquiera de una diversidad de maneras consistentes con el suministro de un fago defectuoso en la lisis de acuerdo con la invención. Preferiblemente, el fago Lys menos se genera modificando el genoma del bacteriófago de manera que el bacteriófago sea deficiente en la proteína de lisina de tipo salvaje (Lys) o de manera que el bacteriófago contenga un gen de lisina funcional unido operativamente a un promotor inducible. Alternativamente, los bacteriófagos tienen niveles reducidos de lisina, y de esta manera velocidades reducidas de lisis, se pueden seleccionar identificando fagos que infectan las bacterias e inhiben la replicación del hospedador bacteriano, pero que tiene tasas reducidas de lisis, por ejemplo, el bacteriófago actúa como agente bacteriostático del hospedador bacteriano, pero no lisa la célula hospedadora bacteriana a una velocidad o nivel asociado con un fago de tipo salvaje que no es deficiente en el sistema de lisis de fagos.

Los bacteriófagos deficientes en la proteína de lisina (fagos "Lys menos"), incluyen aquellos generados por la mutación o eliminación del gen que codifica la lisina del sistema de lisis de fagos. El fago "Lys menos" engloba fagos defectuosos en lisina debido a la eliminación de toda o de una porción del ácido nucleico que codifica la lisina, de manera que no se produce ninguna lisina detectable, o se produce una forma truncada de la lisina que tiene una actividad disminuida en la facilitación de la lisis (por ejemplo, la lisina truncada es ineficiente en la promoción de lisis eficiente del hospedador bacteriano, o no facilita ninguna actividad de lisis mediada por lisina de tipo salvaje detectable). El fago "Lys menos" también incluye fagos que producen una proteína de lisina modificada, lisina que es defectuosa en la promoción de la lisis bacteriana debido a la presencia de una o más mutaciones. Dichas mutaciones incluyen al menos una, o alguna combinación de una o más eliminaciones, sustituciones, adiciones o inserciones de ácido nucleico, que resultan en una alteración de la secuencia de aminoácidos correspondiente de la proteína de lisina codificada.

El fago Lys menos también incluye aquellos en los que el gen que codifica la lisina se ha modificado de manera tal que el gen se une operativamente a un promotor inducible de manera que la lisina se produce solamente cuando el fago se pone en contacto con un agente o condición ambiental (tal como temperatura, metales, sales, iones, nutrientes, fármacos, etc.) que activa al promotor inducible. Tal fago Lys menos puede producirse modificando el gen de lisina de tipo salvaje, para que incluya un promotor inducible, reemplazando el gen de lisina con un ácido nucleico codificante de lisina, unido operativamente a un promotor inducible, o mutando o eliminando el gen que codifica lisina e insertando en el fago un ácido nucleico codificante de lisina, unido operativamente a un promotor inducible.

Se puede generar el bacteriófago que tiene lisina defectuosa usando procedimientos microbiológicos clásicos, tales como ensayos de morfología de placas (ver por ejemplo, Streisinger et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 26, 25 (1961)).

También se puede generar el fago Lys menos, usando técnicas recombinantes tal como la mutagénesis dirigida al sitio (Smith Ann. Rev. Genet. 19, 423 (1985)), por ejemplo, usando técnicas de amplificación de ácido nucleico tal como PCR (Zhao et al., Methods Enzymol. 217, 218(1993)) para introducir eliminaciones sencillas, inserciones y mutaciones puntuales. Otros procedimientos para la mutagénesis de eliminación implican, por ejemplo, el uso de la nucleasa BAL31, que acorta progresivamente un fragmento de ADN de estructura de cadena doble desde las terminaciones 5' y 3', o la exonucleasa III, que digiere el ADN diana por la terminación 3' (ver por ejemplo, Henikoff Gene 28, 351 (1984)). El grado de digestión en ambos casos, está controlado por el tiempo de incubación o la temperatura de reacción o ambos. Se pueden introducir mutaciones puntuales mediante tratamiento con mutágenos tal como bisulfito de sodio, que desamina la desoxicitidina a desoxiuridina lo que resulta en la sustitución de un par de bases A:T por un par de bases G:C en aproximadamente un 50% de las moléculas plantilla después de una ronda de replicación (Botstein et al., Science 229, 1193 (1985)).

Otros procedimientos ejemplificativos para introducir mutaciones puntuales, implican la incorporación enzimática de análogos de nucleótidos o la incorporación errónea de nucleótidos normales o alfa-tionucleótidos por ADN polimerasas (Shortle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1588 (1982)). En la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, se clona el ADN diana en un vector M13 para producir una plantilla de ADN de tipo salvaje de estructura de cadena sencilla, a la cual se hibrida el oligo mutágeno. Esto produce una región no complementaria (en circuito) en el cebador oligo o sobre la plantilla, lo que resulta en una inserción o eliminación respectivamente. Los pares de bases no emparejados entre la plantilla y el cebador causa mutagénesis puntual. Los procedimientos de mutagénesis basados en PCR (u otros procedimientos de mutagénesis basados en técnicas de amplificación de ácidos nucleicos), se prefieren generalmente ya que son simples y más rápidos que las técnicas clásicas descritas más arriba (Higuchi et al., Nucleic Acids Res. 16, 7351(1988); Vallette et al., Nucleic Acids Res. 17, 723(1989)).

Se pueden identificar bacteriófagos defectuosos en lisinas, cribando un fago candidato mediante por ejemplo, la comparación de la capacidad del fago candidato para lisar un hospedador bacteriano de tipo salvaje respecto la capacidad del fago candidato para lisar un hospedador bacteriano recombinante, modificado para que exprese la proteína de lisina (por ejemplo, por un fago auxiliar, a partir de un plásmido auxiliar introducido que codifica la lisina del fago, o a partir de una secuencia codificante de lisina de una fago recombinante, integrado en el genoma del hospedador bacteriano). Los fagos candidatos que lisan el hospedador bacteriano que expresa lisina, pero que falla al efectuar o no afecta eficientemente la lisis del hospedador bacteriano de tipo salvaje, representa un fago ejemplificativo Lys menos adecuado para su uso en la invención.

Una aproximación de particular interés para la generación de fagos Lys menos que carecen totalmente de la actividad lisozima del gen de lisina, es eliminar la primera región conservada que contiene el sitio catalítico y la hendidura del sitio activo. En base a la secuencia de nucleótidos de la lisina, se generan los productos de PCR que carecen de la región conservada I y se transforman en el hospedador bacteriano adecuado junto con el fago de tipo salvaje. Se puede usar un marcador de selección, tal como la proteína fluorescente verde de medusas (GFP; Chalfie, M. et al., Science 263, 802, 1994), en lugar de un marcador de resistencia al antibiótico. Los marcadores de resistencia a un antibiótico pueden ser indeseables cuando el fago puede estar dentro de la vacuna en cierto nivel (por ejemplo, como contaminante). Las réplicas de las bacterias de resistencia (para evitar la mutagénesis por UV) se criban a continuación por expresar GFP bajo luz UV.

Producción de los fagos Lys menos usando técnicas de rescate del marcador

En otra realización, el fago Lys menos que tiene un defecto deseado en el gen de lisina, se generan usando técnicas de recuperación del marcador. La técnica de recuperación del marcador se ha utilizado ampliamente para mapear mutaciones en los fagos, y para transferir mutaciones generadas artificialmente a partir de los genes de los fagos clonados en un plásmido al genoma de los fagos (Volker et al., Mol. Gen. Genet. 177, 447(1980)). Un ejemplo del uso de esta técnica, es la aplicación para identificar genes involucrados en el ensamblaje y maduración del fago T4. Específicamente, los fragmentos de restricción que contienen los genes para el ensamble del fago T4 y de maduración 20 a 22 se clonaron en plásmidos, se sometieron a mutagénesis y luego se recombinaron las mutaciones de vuelta en el genoma del fago mediante infección de E. coli que lleva el plásmido con un doble mutante T4 20/21 am (ámbar) (Volker, supra, 1980). La progenie del fago que se había sometido a recombinación con el plásmido, se seleccionó por formación de placas en un hospedador su^{-} (que carece de un supresor ámbar) permitiendo la selección del fago recombinante. Estos fagos am^{+} se separaron a continuación por exclusión de forma no selectiva por las mutaciones sensibles a temperaturas deseadas en los genes 20 y 21.

Se puede emplear una estrategia similar para el gen de lisina. El gen de lisina mutante (ya sea un gen de lisina no funcional o un gen de lisina funcional unido operativamente a un promotor inducible), que se puede generar usando las técnicas recombinantes descritas más arriba, se clonan en un plásmido que tiene un marcador de selección, por ejemplo, resistencia a ampicilina. Se usan dos tipos de hospedadores bacterianos que contienen plásmidos con genes de lisina mutante (hospedador de lisina mutante) o de tipo salvaje (hospedador de lisina WT). Se usa la cepa anterior que contiene el gen de lisina de tipo salvaje, como la cepa auxiliar para la producción a gran escala del fago mutante Lys menos, en donde el fago Lys menos es uno que carece de un gen de lisina de inducible. Esta última cepa que contiene el gen de lisina mutante, se usa para introducir las mutaciones Lys en el fago de tipo salvaje. La Fig. 1 proporciona un esquema de una célula hospedadora bacteriana que tiene un gen de lisina mutante útil en la generación del fago Lys menos de la invención.

Los hospedadores bacterianos que expresan la lisina mutante recombinante, para la producción de los fagos Lys menos (como se ilustra en la figura 1) se pueden generar mediante el uso de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se aíslan las secuencias de las regiones que flanquean el gen de lisina (alrededor de 100 pares base en cada lado) en cada uno de los fagos a ser mutados. Generalmente, al menos alrededor de una homología de 50 pb es proporcionada a cada lado, flanqueando la región de interés que codifica el gen de lisina de fagos (Singer (1982) Cell, 31: 25-33). Los ADN que corresponden a la regiones en dirección cadena arriba y dirección cadena abajo de cada gen de lisina del fago se aíslan por amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y se clonan en un plásmido que tiene un primer marcador de selección (por ejemplo, resistencia a ampicilina) con un sitio de restricción adecuado entre las dos regiones para la inserción de un casete de ADN en el cual se expresa un segundo marcador de selección (por ejemplo GFP) de un promotor temprano del mismo fago. Este plásmido se introduce en las células hospedadoras bacterianas adecuadas por transformación y selección del primer marcador de selección (ejemplificado aquí por la resistencia ampicilina). Se muestra un plásmido ejemplificativo con un gen de lisina mutante útil en esta técnica en la Fig. 1. Alternativamente la construcción del plásmido se puede integrar genómicamente en el ADN genómico del hospedador bacteriano.

El hospedador bacteriano que contiene el gen de lisina mutante, se infecta con un fago de tipo salvaje a una baja multiplicidad de infección. Cuando se replica el fago, alguno de los fagos se recombinan por un evento doble de cruce con el gen de lisina mutante en el hospedador bacteriano, para producir el fago Lys menos. Ya que es probable que la recombinación en cualquier célula no sea 100% eficiente, puede haber un fago de tipo salvaje en las mismas células que el fago Lys menos. El virus de tipo salvaje actuará como un virus auxiliar para provocar la lisis de las células infectadas tanto si tiene lugar la recombinación como si no.

Los dos tipos de virus se recogen lisando las células bacterianas con cloroformo, y el fago Lys menos se purifica del virus del tipo salvaje mediante purificación en placas. El virus de cada placa se prueba, a continuación, para ver si es de tipo salvaje o Lys menos. La prueba para identificar el fago Lys menos se puede llevar a cabo por ejemplo, examinando la capacidad del fago de cada placa para infectar y matar dos tipos de células hospedadoras cuando se detectan por la formación de placas. Un tipo de célula hospedadora es la bacteria hospedadora normal (de tipo salvaje), el otro es la bacteria hospedadora de lisina de tipo salvaje descrita más arriba. El fago de tipo salvaje lisará y matará de manera efectiva ambos tipos de hospedadores, mientras que el fago Lys menos mata solamente las células hospedadoras que expresan lisina.

Cuando el fago Lys menos expresa un marcador de detección (por ejemplo, GFP), y particularmente cuando el marcador de selección se expresa a partir de un promotor temprano vírico, se pueden visualizar directamente las placas fluorescentes que representan el fago Lys menos durante la purificación de placas. El fenotipo Lys menos de estos fagos puede confirmarse, a continuación, mediante cribado tal y como se ha descrito más arriba.

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Generación de la lisina de tipo salvaje en el hospedador para producción a escala ampliada del fago Lys menos

Los fagos Lys menos se pueden replicar y ensamblar en sus bacterias hospedadoras pero por definición, no serán capaces de lisar al hospedador y liberar de manera eficiente los fagos de la progenie. Para la producción de los fagos terapéuticos Lys menos, es esencial la liberación de los fagos modificados del hospedador bacteriano. Cuando el fago Lys menos es uno en el cual un gen de lisina está bajo control de un promotor inducible, se puede lograr la lisis del hospedador bacteriano poniendo en contacto el fago con un agente que active al promotor inducible, con lo cual se induce la producción de lisina y la lisis consiguiente de las células bacterianas hospedadoras.

La lisis de las bacterias hospedadoras y la liberación del fago Lys menos también se puede lograr introduciendo un plásmido auxiliar que lleve un gen de lisina bajo un promotor inducible en un hospedador bacteriano. Los estudios previos han demostrado que la expresión de los genes de lisis del fago lambda en E. coli resultan en una lisis uniformemente definida (Garrett et al., Mol. Gen. Genet. 182, 326,1981). Recientemente los productos del gen S y R del fago lambda (holina y lisina respectivamente) se han usado en un sistema de lisis inducible (Jain et al.,Infection & Immunity 68, 986, 2000). De esta manera, se pueden producir grandes cantidades de fagos Lys menos en hospedadores adecuados que contienen un plásmido auxiliar que lleva un gen de lisina que codifica una lisozima altamente potente (por ejemplo, la lisozima T4) bajo un promotor inducible.

Los genes de lisina de cualquiera de los fagos secuenciados se pueden aislar mediante técnicas de amplificación de ácidos nucleicos (por ejemplo, PCR) y clonar en un plásmido que tiene marcador de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina) de manera que se expresan a partir de un promotor inducible utilizando procedimientos estándar de ADN recombinante. El gen de lisina escogido será uno con la menor cantidad de homología con el gen de lisina del fago, para evitar la recombinación entre el fago Lys menos y el gen de lisina en la cepa del hospedador para producir recombinantes de tipo salvaje. La eficacia de la producción de solamente los fagos Lys menos se determina confirmando que el stock de fagos Lys menos no produce placas en una cepa de hospedador carente del gen de lisina. Si es necesario, se puede usar una diversidad de cepas hospedadoras auxiliares que expresan lisina a partir de diferentes fuentes y promotores inducibles, para encontrar empíricamente la cepa hospedadora adecuada que produzca el nivel más bajo de recombinantes de tipo salvaje.

Estrategias alternativas para producción de bacteriófagos defectuosos en la lisis

Los bacteriófagos defectuosos en la lisis de la invención, abarcan no solamente los fagos que tienen un gen de lisina defectuoso, sino también el fago que es defectuoso en la maquinaria de lisis debido a defectos diferentes al gen Lys o adicionalmente al gen Lys. Por ejemplo, más que ser defectuoso solamente en el gen de lisina, se pueden eliminar o modificar tanto el gen de lisina como el gen de holina para no ser funcionales en el fago y el sistema de lisis. Tales fagos defectuosos se pueden producir para expresar los componentes carentes o defectuosos de lisis en un plásmido auxiliar en un hospedador bacteriano. Martin et al., (J, Bacteriol. 180, 210 (1998)) ha demostrado que la expresión concomitante de holina y lisina del fago de neumococos Cp-1 en E. coli resulta en lisis celular. Se pueden usar estrategias similares discutidas más arriba para evitar la generación del fago de tipo salvaje mediante recombinación durante la fase de producción.

Puesto que las holinas son las proteínas que atraviesan las membranas que permiten que las lisinas de fagos tengan acceso a la mureína de pared celular bacteriana, la eliminación o activación del gen de holina solo, también es suficiente para generar los bacteriófagos terapéuticos que carecen de un potencial de respuesta inmune. Dependiendo de la estructura y propiedades del fago específico, la eliminación o inactivación del gen de lisina, el gen de holina o ambos se puede emplear para generar el fago terapéutico deseado.

Cualquier cepa de fago capaz de facilitar un daño directo o indirecto en bacterias (u otros patógenos) (por ejemplo en la inhibición o interferencia de la transcripción y/o traducción del ADN bacteriano (por ejemplo a través de la competencia del ADN del fago para la misma maquinaria de células hospedadoras), que inhibiendo la replicación bacteriana y similares) se contempla como útil en la presente invención. Estos fagos que son líticos y los fagos que son lisogénicos pero que pueden más tarde convertirse en líticos se pueden adaptar para su uso en la presente invención.

Patógenos bacterianos para los cuales pueden generarse vacunas de células enteras incapacitadas de acuerdo con la invención

Cualquiera de una variedad de bacterias patogénicas puede usarse para generar una vacuna bacteriana de células enteras incapacitadas, de acuerdo con la invención. Los patógenos bacterianos ejemplificativos son aquellos descritos más arriba junto con sus correspondientes bacteriófagos (cuando se conocen).

Además, el bacteriófago Lys menos puede usarse para crear vacunas bacterianas de células enteras incapacitadas, usando bacterias que son manipuladas genéticamente para expresar una proteína heteróloga o para sobreexpresar una proteína endógena. Por ejemplo, la bacteria puede modificarse genéticamente para expresar uno o más ácidos nucleicos que codifican una o más moléculas de interés, particularmente moléculas que provocan o potencian una respuesta inmune protectora, por ejemplo, antígenos recombinantes. De particular interés son los fragmentos antigénicos de dichas moléculas, por ejemplo, epítopos. Los ácidos nucleicos pueden codificar, por ejemplo, toda o parte de una proteína de membrana externa, pilina, flagelo, u otra proteína que está implicada en la generación de una respuesta inmune protectora.

Cualquier secuencia de ADN que codifica una molécula antigénica o fragmento de las mismas, (por ejemplo, epítopo) ya sea, de un organismo heterólogo o endógeno, que cuando se expresa en una bacteria produce una inmunidad protectora contra el organismo o contra una condición o trastorno causado con el organismo, puede aislarse para usarse en las preparaciones de vacuna de la presente invención. En una realización, el antígeno es un antígeno de superficie. En otra realización el organismo es un microorganismo patogénico. Todavía en otra modalidad, la molécula antigénica o fragmento de la misma, es característica del cáncer y proporciona inmunidad protectora contra el cáncer o provoca una respuesta inmune contra el cáncer lo que resulta en la reducción o eliminación del cáncer en un sujeto.

Las moléculas antigénicas, o fragmentos de las mismas, pueden encontrarse en patógenos, tales como bacterias, parásitos, virus, u hongos. Las bacterias, parásitos, virus y hongos de interés incluyen pero no se limitan a, los incluidos en la tabla a continuación.

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Además, pueden usare las moléculas antigénicas de células de cáncer. Los antígenos característicos de células de cáncer y útiles en preparaciones de vacuna de la presente invención incluyen, pero no se limitan a MAGE, MUC1, HER2/neu, CEA, pS3, tirosinasa, MART-1/melan A, gp 100, TRP-1, TRP-2, PSA, CDK4-R24C, BCR/ABL, K-ras mutada ESO-1, CA15-3, CA125, CA19-9, CA27.29, TPA, TPS, citoqueratina 18, y p53 mutada.

Si los antígenos no se han identificado aún, los antígenos potencialmente útiles para formulaciones de vacuna pueden identificarse por varios criterios, tales como la implicación del antígeno en la neutralización de la infección por patógenos (Norrby, E., 1985, Summary, en Bacines 85, Lerner, R. A., R. M. Chanock, and F. Brown (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pp. 388-389), tipo o especificidad de grupo, reconocimiento por las células inmunes o antisuero del paciente, y/o la demostración de efectos protectores del anti-suero o células inmunes específicas para el antígeno.

Las moléculas inmunoreactivas pueden identificarse y caracterizarse mediante procedimientos conocidos en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden generarse en la superficie u otras moléculas de un patógeno pueden identificar aquellos que son capaces de ser reconocidos por los anticuerpos. Alternativamente, los péptidos sintéticos pequeños conjugados a moléculas portadoras pueden probarse para la generación de anticuerpos monoclonales que se unan a los sitios correspondientes al péptido en la molécula intacta (ver por ejemplo, Wilson, I. A., et al., 1984, Cell 37:767).

Se pueden crear las bacterias manipuladas genéticamente útiles en la invención utilizando la tecnología del ADN recombinante. Una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica de interés se inserta en un vector de expresión, se transforma o transfecta en una célula hospedadora bacteriana apropiada y se cultiva en condiciones apropiadas para la expresión. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica y se describen generalmente en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).

La secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico, bacteriano o de otra manera, para facilitar la expresión y/o cuando se desee, facilita la presentación del polipéptido antigénico expresado en la superficie de la célula bacteriana (Cattozzo et al., J. Biotechnol 56, 191 (1997), Stocker y Newton, Int. Rev. Immunol. 11, 167 (1994), Stocker, Res. Microbiol. 141, 787 (1990), Newton et al., Science 244, 70 (1989), USPN 6.130.082)). Por ejemplo, Newton et al., (Res. Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionó un epítopo de VIH1 gp41, que es parte de la proteína gp160, a un gen de flagelo de Salmonella en la orientación y marco de lectura correctos. El plásmido se colocó en una cepa de Salmonella, de vacuna viva de flagelina negativa, la cual hizo a continuación una proteína con la secuencia de epítopo de VIH1 externo integrada en este. Ratones inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante mostraron la producción de un anticuerpo con afinidad para gp160.

La secuencia de nucleótidos que codifica una molécula antigénica también pueden fusionarse con un ácido nucleico, bacteriano o de otra manera, para facilitar la presentación del polipéptido antigénico expresado en la superficie celular de la bacteria manipulada genéticamente (Cattozzo et al., J. Biotechnol 56, 191 (1997), Stocker y Newton, Int. Rev. Immunol. 11, 167 (1994), Stocker, Res. Microbiol. 141, 787 (1990), Newton et al., Science 244, 70 (1989), USPN 6.130.082)). Por ejemplo, Newton et al., (Res. Microbiol. 146, 203 (1995)) fusionó un epítopo de VIH1 gp41, que es parte de la proteína gp160, a un gen de flagelo de Salmonella en la orientación y marco de lectura correctos. El plásmido se colocó en la cepa de Salmonella, de vacuna viva de flagelina negativa, la cual hizo a continuación una proteína con la secuencia de epítopo de VIH1 externo integrada en este. Ratones inmunizados con la vacuna viva de la Salmonella recombinante mostraron la producción de un anticuerpo con afinidad para gp160.

Puede determinarse la inmunopotencia de la molécula inmunogénica expresada por la bacteria manipulada genéticamente en una preparación de vacuna de células enteras incapacitadas al observar la respuesta inmune de animales de ensayo después de la inmunización con las bacterias que expresan el antígeno recombinante. Los animales de ensayo pueden incluir ratones, conejillos de indias, conejos, pollos, chimpancés y otros primates, y eventualmente sujetos humanos. Los procedimientos de introducción de la bacteria recombinante incapacitada pueden incluir la ruta oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal o cualquier otra ruta estándar de inmunización.

La respuesta inmune de los sujetos de ensayo puede analizarse mediante varias aproximaciones tales como: (a) la reactividad del suero inmune resultante al antígeno nativo o un fragmento del mismo, o para el organismo que se encuentra de manera natural aislado (por ejemplo, organismo de tipo salvaje) del cual se deriva la molécula antigénica de ensayo cuando se determina mediante técnicas conocidas, por ejemplo ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), inmunoblot, radioinmunoprecipitaciones, etc., (b) la reactividad de los linfocitos aislados del sujeto inmunizado para el antígeno nativo o fragmento del mismo, o el organismo que se encuentra de manera natural del cual se deriva la molécula antigénica de ensayo cuando se determina mediante técnicas conocidas, por ejemplo, ensayos de respuesta blastogénica, ensayos de citotoxicidad, hipersensibilidad de tipo retardado, etc., (c) la capacidad del suero inmune para neutralizar la infección del organismo in vitro o la actividad biológica del antígeno nativo, y (d) la protección de la enfermedad y/o mitigación de síntomas infecciosos en animales inmunizados.

Uso de la bacteria inactivada para la producción de anticuerpos

Para la producción de anticuerpos con una molécula antigénica expresada por bacterias, bacterias que pueden manipularse genéticamente para expresar una proteína heteróloga o para sobreexpresar una proteína endógena, se pueden inmunizar varios animales hospedadores mediante inyección con una composición inmunogénica de células enteras incapacitadas que comprende la bacteria incapacitada por infección con un fago defectuoso en lisis.

Dichos animales hospedadores pueden incluir, pero no se limitan a conejos, ratones, y ratas, por nombrar algunos. Pueden usarse varios adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de las especies hospedadoras, incluyendo pero no limitándose a Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como el hidróxido de aluminio, sustancias de superficie activa tal como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones aceitosas, hemocianina de una especie de lapa ("keyhole limpet"), dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivados de los sueros de animales inmunizados con el antígeno. Para la producción de anticuerpo policlonales, los animales hospedadores tales como los descritos más arriba, pueden inmunizarse mediante una inyección con una composición bacteriana de células enteras incapacitadas de la invención. La composición puede complementarse con adyuvantes.

Se puede seguir durante el tiempo la titulación de anticuerpos en el sujeto inmunizado mediante técnicas estándar, tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) usando un polipéptido inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo pueden aislarse del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. Los anticuerpos específicos para un antígeno, o fragmento del mismo, particularmente, para una molécula antigénica recombinante expresada por una bacteria manipulada genéticamente, se pueden seleccionar para (por ejemplo, parcialmente purificada) o purificada mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad.

Por ejemplo, se produce un antígeno de proteína expresado de manera recombinante y purificado (o parcialmente purificado) en una bacteria manipulada genéticamente tal y como se describe en el presente documento, y se acopla de manera covalente o no covalente a un soporte sólido tal como, una columna de cromatografía. La columna puede entonces usarse para purificar por afinidad anticuerpos específicos para las proteínas de una muestra que contiene anticuerpos dirigidos contra un gran número de diferentes epítopos, generándose así una composición de anticuerpos sustancialmente purificada, esto es, una que está sustancialmente libre de anticuerpos contaminantes. Por una composición de anticuerpos sustancialmente purificada se entiende en este contexto que la muestra de anticuerpos contiene como máximo sólo un 30% (en peso seco) de los anticuerpos contaminantes dirigidos contra epítopos diferentes a aquellos en la proteína deseada o polipéptido de interés, y preferiblemente, como máximo un 20%, aun más preferiblemente como máximo un 10% y más preferiblemente como máximo un 5% (en peso seco) de la muestra es anticuerpos contaminantes. Una composición de anticuerpos purificados significa que al menos un 99% de los anticuerpos en la composición se dirigen contra la proteína o polipéptido antigénico deseado.

Los anticuerpos monoclonales, que son poblaciones homogéneas de anticuerpos para un antígeno en particular, pueden obtenerse mediante cualquier técnica que proporcione la producción de anticuerpos mediante, por ejemplo, líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen pero no se limitan a, la técnica de hibridoma de Kohler y Milstein, (1975, Nature 256, 495-497; y patente US No. 4.376.110), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030), y la técnica de hibridoma-EBV (Cole y otros, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce el mAb deseado puede cultivarse in vitro o in vivo. La producción de altas concentraciones de mAbs in vivo hace de este el procedimiento de producción actualmente preferido.

Usos de anticuerpos dirigidos contra bacterias inactivadas

Los anticuerpos generados contra la composición bacteriana inmunogénica de células enteras incapacitadas de la invención tiene usos potenciales en inmunoensayos de diagnostico, inmunoterapia pasiva, y generación de anticuerpos anti-idiotípicos. En una realización, la composición usada para generar los anticuerpos comprende bacterias manipuladas genéticamente para expresar una proteína heteróloga o para sobre expresar una proteína endógena.

Los anticuerpos generados pueden aislarse por técnicas estándar conocidas en la técnica (por ejemplo, cromatografía de inmunoafinidad, centrifugación, precipitación, etc.) y usarse en inmunoensayos diagnosticos para detectar la presencia de células o virus cancerosos, bacterias, hongos o parásitos de importancia médica o veterinaria en tejidos humanos o animales, sangre suero etc. Los anticuerpos también pueden usarse para observar el proceso de tratamiento y/o enfermedad. Cualquiera de los sistemas de inmunoensayos conocidos en la materia, tales como los indicados en el presente documento, pueden usarse con este propósito incluyendo, pero no limitando a, sistemas de ensayos competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como radioinmunnoensayos, ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima), inmunoensayos sándwich, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, ensayos de fijación de complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A y ensayos de inmunoelectroforesis, etc., en donde tales inmunoensayos son conocidos en la técnica.

Las preparaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse en la producción de anticuerpos para usarse en inmunoterapia pasiva, en las que la protección a corto plazo de un hospedador se consigue mediante administración de un anticuerpo preformado dirigido contra un organismo heterólogo.

Los anticuerpos generados mediante preparaciones de vacuna de la presente invención también pueden usarse en la producción de anticuerpo anti-idiotípico. El anticuerpo anti-idiotípico pueden entonces a su vez usarse para inmunización, con el fin de producir una subpoblación de anticuerpos que se unan al antígeno inicial del microorganismo patogénico (Jerne, N, K., 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373; Jerne, N.K., et al., 1982. EMBO 1:234).

Formulaciones, rutas de administración y dosis

Las vacunas de la invención pueden formularse de cualquier manera apropiada. En general las vacunas de la invención pueden administrarse oralmente, nasalmente, nasofaringealmente, parenteralmente, entéricamente, gástricamente, tópicamente, transdérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, en tableta, sólido, polvos, liquido forma de aerosol localmente o sistémicamente, con o sin excipientes añadidos. Los procedimientos actuales para preparar composiciones parenteralmente administrables son bien conocidos o aparentes por aquellos expertos en la materia y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Science, 15^{th} ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennylvania (1980).

Se reconoce que los polipéptidos y compuestos relacionados descritos arriba cuando se administran oralmente deberán protegerse de la digestión. Esto puede realizarse ya sea al mezclar o empacar la bacteria incapacitada en un portador apropiado altamente resistente tal como un liposoma. Las preparaciones también pueden proporcionarse para liberarse en formas de liberación controladas o liberación retardada y la administración de las preparaciones antigénicas como una mezcla o de una manera en serie.

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Las vacunas incapacitadas de la invención se proporcionan generalmente en composiciones con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Varios excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Tal y como se usa en la presente invención, "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combina con un ingrediente activo de una composición, permite que el ingrediente mantenga la actividad biológica y sin causar reacciones perjudiciales en el sistema inmune del sujeto.

Los portadores farmacéuticamente ejemplificativos incluyen soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones estériles. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a, alguno de los excipientes farmacéuticos estándar tales como solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones tal como emulsión de aceite/agua y diversos tipos de agentes humectantes. Ejemplos de solventes no acuosos son el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de olivo y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen soluciones acuosas/alcohólicas, agua, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, aceites fijos o de Ringer lactados. Vehículos intravenosos incluyen regeneradores de fluidos y nutrientes, regeneradores de electrolitos (tales como aquellos basados en la dextrosa de Ringer) y similares.

Una composición que comprende un bacteriófago de la invención, también se puede liofilizar usando medios bien conocidos en la materia, para la posterior reconstitución y uso de acuerdo con la invención.

Son también de interés, las formulaciones para la administración liposómica, y formulaciones que comprenden la vacuna bacteriana de células enteras microencapsuladas. Las composiciones que comprenden dichos excipientes se formulan mediante procedimientos convencionales bien conocidos (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Capítulo 43, 14a Ed. Mack Publishing Col, Easton PA 18042, USA).

En general, se pueden preparar las composiciones farmacéuticas en diversas formas tales como gránulos, tabletas, píldoras, supositorios, cápsulas (por ejemplo, adaptadas para administración oral) microperlas, microesferas, liposomas, suspensiones, ungüentos, lociones y similares. Los portadores y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de grado farmacéutico, adecuados para uso oral y tópico se pueden usar para elaborar composiciones que comprenden los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos en la materia incluyen medios acuosos, aceites animales y vegetales y grasas. Los agentes estabilizantes, agentes emulsionantes y humectantes, sales para variar la presión osmótica o tampones de pH para asegurar un valor adecuado de pH.

La composición farmacéutica puede comprender otros componentes además del bacteriófago. Además, las composiciones farmacéuticas pueden comprender más de un bacteriófago, por ejemplo dos o más, tres o más, cinco o más, o diez o más bacteriófagos diferentes, en donde el bacteriófago diferente puede ser específico para bacterias iguales o diferentes. Como se indica más arriba el bacteriófago puede administrase en conjunto con otros agentes, tales como un agente antimicrobiano convencional (ver tabla anterior). En algunas realizaciones se puede desear administrar el bacteriófago y antibiótico dentro de la misma formulación.

Las composiciones se administran a un animal que está en riesgo de adquirir una enfermedad causada por el patógeno bacteriano para prevenir o al menos detener parcialmente el desarrollo de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para uso terapéutico dependerán de, por ejemplo, la composición de antígeno, la manera de administración, el peso y estado general de salud del paciente y el criterio del médico que prescribe. Se pueden administrar dosis únicas o múltiples de las composiciones dependiendo de la dosis y frecuencia requerida y tolerada por el paciente, y la ruta de administración.

Las cantidades para la inmunización de la mezcla generalmente están en el rango de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 1,0 mg por 70 kilogramos del paciente, más comúnmente es de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,2 mg por 70 kilogramos del paciente. Pueden usarse dosis desde 0,001 hasta aproximadamente 10 mg por paciente y día, particularmente cuando el antígeno se administra en un sitio aislado y no en el torrente sanguíneo, tal como en una cavidad corporal o en el lumen de un órgano. Son posibles dosis sustancialmente superiores (por ejemplo, 10 hasta 100 mg o más) en administración oral, nasal o tópica. La administración inicial de la mezcla puede seguirse de una inmunización de refuerzo ("booster") de la misma o diferente mezcla, con al menos una de refuerzo, siendo preferida más habitualmente dos de refuerzo.

La invención también contempla que la composición de vacuna que comprende una vacuna bacteriana incapacitada pueda incluir una o más cepas de bacterianas.

Las vacunas pueden administrase a cualquier sujeto, generalmente un sujeto mamífero, que tiene o es susceptible a, una infección por un patógeno bacteriano. Los sujetos de particular interés incluyen, pero no se limitan necesariamente a, humanos y animales domésticos (por ejemplo, ganado mascotas y similares) así como animales mantenidos en cautividad (por ejemplo, en zoológicos o parques acuáticos).

Aunque el sujeto no necesita ser inmunológicamente naive, las vacunas de la invención se administran típicamente a un sujeto que es inmunológicamente naive con respecto al patógeno bacteriano concreto. En una realización particular, el mamífero es un niño humano de alrededor de 5 años o más joven y preferiblemente alrededor de 2 años de edad o más joven. La vacuna de la invención puede administrarse como una dosis única o, si desea o es necesaria, la dosis inicial puede seguirse por vacunas de refuerzo varios días, varias semanas, o varios meses o años después de la dosis inicial. En general, la administración a cualquier mamífero se inicia preferiblemente antes del primer signo de los síntomas de la enfermedad, o al primer signo de una exposición posible o real al patógeno bacteriano.

Ejemplos

Las realizaciones anteriores de la presente invención, se describen adicionalmente en los siguientes ejemplos. Sin embargo, la presente invención no está limitada a los ejemplos, y serán evidentes las variaciones para aquellos expertos en la materia, sin alejarse del alcance de la presente invención. En particular, se puede sustituir cualquier bacteria y fago conocido para infectar dichas bacterias, en los experimentos de los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se incluyen para proporcionar a aquellos expertos en la materia, una descripción y divulgación completa de la forma de cómo llevar a cabo y utilizar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores refieren como su invención. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se debe tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en número, la temperatura es en grados centígrados y la presión de o cercana a la atmosférica.

Ejemplo 1 Creación del fago T4 Lys menos

La secuencia de nucleótidos del gen de lisozima (e) del bacteriófago T4, junto con 130 nucleótidos adicionales a cada lado, fue publicada por Owen et al. (J. Mol. Biol. 165, 229, 1983). Los ADN correspondientes a los nucleótidos de las regiones de dirección cadena arriba y dirección cadena abajo del gen e, se aíslan por PCR y se clonan en el plásmido de resistencia a ampicilina pUC 18 con sitios únicos de restricción (Xba I y Pst I) entre las dos regiones ((Sambrook, J. y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Se genera un casete de ADN que contiene el gen para una forma mutante de la proteína fluorescente verde (GFP) que tiene una fluorescencia 40 veces más brillante que la proteína de tipo salvaje, como un fragmento Xba I-Pst I a partir del plásmido pmut2 que lleva gfp (Cormack, B.P., Valdivia, R.H. y Falkow, S. Gene 173, 33, 1996), y se introduce entre las secuencias de dirección cadena arriba y dirección cadena abajo del gen de lisozima en pUC18 (pGG8). El promotor y finalizador de la expresión de GFP en este casete se reemplazan por el promotor temprano del gen de la dihidrofolato reductasa T4 frd (Rosenberg, M. y Court, D. Ann. Rev. Genet. 13, 319, 1979) en la terminación 5', y el finalizador de la transcripción situado entre los genes 44 y 45 de T4 (Spicer y Konigsberg in Bacteriophage T4 eds. Mathews, Kutter, Mosig y Berget, American Society for Microbiology, Washington, DC, 1983, pp. 299) en la terminación 3' respectivamente. El promotor frd está en la clase temprana inmediata de los promotores T4 que son de los primeros en expresarse en células bacterianas infectadas con T4. Se usa la polimerasa del ARN del hospedador para la transcripción desde este promotor.

Este plásmido pGG8 se transforma en células de E. coli HB101 mediante el procedimiento RbCl y se selecciona por resistencia a ampicilina. Las células de E. coli HB101 que llevan el plásmido pGG8 con el gen de lisozima mutante, se infectan a continuación con el fago T4 de tipo salvaje a baja multiplicidad de infección. Durante la replicación, algunos se recombinan con el gen de lisozima mutante llevado en los plásmidos en las células para proporcionar el fago Lys menos. Es posible que la recombinación en cualquier célula no sea 100% eficiente. Ambos tipos de fagos se recogen lisando las células bacterianas con cloroformo, y el fago Lys menos se separa del de tipo salvaje mediante purificación en placa. Cada placa se prueba a continuación para ver si es del tipo salvaje o Lys menos. Los fagos Lys menos pueden identificarse por la fluorescencia verde de las placas de replicado bajo luz UV ya que el GFP se expresa bajo el promotor temprano T4. Esto se puede confirmar además probando el fago de cada placa en E. coli HB101 así como células que expresan el gen de lisina descrito abajo. Mientras que el fago de tipo salvaje elimina ambos hospedadores, el fago Lys menos sólo elimina las células hospedadoras que expresan la lisina.

Ejemplo 2 Producción del fago T4 Lys menos en E. coli

El sistema de lisis de dos genes del fago neumococo Cp-1, se ha clonado y expresado en E. coli (Martín et al., J. Bacteriol. 180, 210 (1998). La PCR que usa el ADN de Cp-1 como plantilla, genera fragmentos de ADN que contienen el gen cpl1 (lisina) o los genes de casete cph1-cpl1(holina-lisina), en los que los genes mantienen sus propios sitios de unión a ribosoma. Usando los oligonucleótidos apropiados, se crean los sitios de restricción Sac II y Sac I en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de PCR para la clonación en el plásmido pNM185 (Mermod et al., J. Bacteriol. 167, 447 (1986)). El gen cpl1 o el casete que contiene los genes cph1 y cpl1 se expresan bajo el control de un promotor regulado positivamente (Pm) del operón de ruta meta del plásmido TOL. La transcripción de los genes de Pm es inducida específicamente por el producto del gen regulador xylS solamente cuando están presentes las moléculas efectoras tipo 3-metilbenzoato. La transformación de células de E. coli HB101 con los plásmidos pNM185 que llevan el casete cpl1 o cph1-cpl1, se lleva a cabo mediante el procedimiento RbCl ((Sambrook y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las células de E. coli HB101 transformadas se hacen crecer en caldo LB u otro medio apropiado, y se inocula con el fago T4 Lys menos. En el momento apropiado, la expresión del casete cpl1 o el cph1-cpl1 en el plásmido pNM185 se induce por la adición de 3-metilbenzoato 2 mM para efectuar la liberación de la progenie del fago T4 Lys menos.

Ejemplo 3 Creación del plásmido pGMB021 para usar en la generación del fago recombinante Lys menos

Materiales y Métodos. La Tag ADN polimerasa, los dNTP, la fosfatasa intestinal de ternero, los enzimas de restricción, cebadores y la T4 ADN ligasa, se obtuvieron de Bangalore Genei Pvt. Ltd (BGPL), Bangalore. Los vectores pRSET procedían de Invitrogen Ltd, USA.

Las ligaciones se llevaron a cabo con la relación vector:inserto de 1:10 M. Los productos de la PCR junto con los vectores digeridos se purificaron en gel de agarosa usando los reactivos del kit de extracción en gel Qiagen salvo que se indique de otra manera.

Construcción del clon de lisozima T4 en el vector pRSETB (pRSETB-T4L) basado en el promotor T7. La amplificación por PCR del gen de lisina de T4 se llevó a cabo con el fago T4 de tipo salvaje obtenido de BGPL, usando los siguientes cebadores:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 GMB1: \+ Delantero 5' CG GAA TTC CAT ATG AAT ATA TTT GAA ATG TTA
CGT 3' \+ (SEC ID NO:1)\cr \+\+\cr  GMB2: \+ Inverso 5' AA AGC GGC
CGC AAG CTT TAG ATT TTT ATA CGC GTC CCA 3' \+ (SEC ID
NO:2).\cr}

La desnaturalización inicial fue a 95°C durante 4 minutos, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, hibridación a 55°C durante 30 segundos, y una extensión a 72°C durante 30 segundos. Los contenidos se extendieron finalmente durante 7 minutos a 72°C.

A continuación, el producto de la PCR obtenido se purificó y se rellenó con Klenow antes de la ligación al vector pRSETB digerido con PvuII y desfosforilado con CIP. La relación vector a inserto se mantiene a 1:10M. La ligación se realizó a 22°C durante 5 horas y luego se transformaron células competentes DH5 alfa con la mezcla de ligación anterior. Los transformantes se seleccionaron a continuación en una placa LB amp (concentración final 100 ug/ml) a 37°C durante la noche. Los transformantes se cribaron por PCR de colonia de acumulados ("pool colony PCR") y los clones positivos se comprobaron a continuación por digestión por restricción después de aislar el ADN.

El ADN de los clones positivos se secuenció por ABI Prism de Pharmacia. El clon anterior expresaba la proteína lisozima T4 como se observa en el gel SDS-PAGE. La proteína era una proteína de lisina etiquetada con His de 25 kDa tal como se esperaba (ver Figura 2, carriles 1 y 2). Se seleccionó PGMB011 para uso adicional.

Construcción de GFP como proteína de fusión con etiqueta his en el vector pRSETA (pSETA-GFP). Para interrumpir el gen de lisina con un gen reportero, se escogió el gen GFP. Primero, el gen GFP se amplificó del plásmido pUC-GFP en el kit de enseñanza GFP de BGPL, usando los siguientes cebadores:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+\hfil#\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 GMB5: \+ Delantero 5' CC GGA ATT CAT ATG AGT AAA GGA GAA GAA CTT
TTC 3'  \;  \+ (SEC ID NO:3)\cr \+\+\cr  GMB6: \+ Inverso
5' CC GGA ATT CAT TTA TTT GTA TAG TTC ATC CAT GCC 3' \+ (SEC ID
NO:4).\cr}

La desnaturalización inicial fue a 95°C durante 4 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 segundos, hibridación a 60°C durante 30 segundos, y extensión a 72°C durante 30 segundos. La extensión final fue a 72°C durante 7 minutos. El producto purificado se digirió con EcoR1 y luego se ligó con pRSETA cortado con EcoR1.

Los clones se cribaron a continuación por PCR de acumulados de colonias para GFP y se observó la expresión de pequeña escala de GFP en SDS-PAGE. Todos los clones se revisaron bajo luz UV por la fluorescencia GFP que indicaba que el clon tenía la GFP en la orientación correcta con respecto al promotor T7. El tamaño de la proteína GFP fue de 36 kDa tal como se espera.

Interrupción del gen de lisina T4 con GFP en la estructura con el extremo 5' del gen de lisina T4 para la construcción de pGMB021. El fragmento GFP del clon pRSETA-GFP se subclonó a continuación en pGMB011 parcialmente digerido (un vector pRSETB-T4L producido más arriba) con EcoR1. Los transformantes se cribaron por PCR con GMB5/GMB6 y luego se revisaron por la expresión a pequeña escala de la proteína de fusión GFP-lisina con etiqueta his. La proteína de fusión GFP-lisina con etiqueta His expresada del clon anterior (42 KDa) (ver Figura 2, carriles 3 y 4) y su fluorescencia mostrada bajo luz UV, indica que el gen GFP estaba intacto en esta construcción.

El clon anterior se probó además por PCR con cebadores GMB1/GMB2 (cebadores específicos de lisina T4). Como se esperaba, la PCR con GMB1/GMB2 dio un producto de lisina-GFP-lisina de aproximadamente 1200 pb que mostraba lo intacto de los genes GFP y lisina (Figura 3). Este clon se usó en el experimento recombinante descrito en el Ejemplo 4 de más abajo.

Ejemplo 4 Generación y aislado del fago recombinante Lys menos

Se infectaron células DH5\alpha que contenían el plásmido pGMB021 con el fago T4 de tipo salvaje a 2,5 m.o.i. Esta alta multiplicidad de infección asegura que cada célula se infecta con al menos un fago. Después de 40 minutos de incubación, se añadió cloroformo (1%) y se centrifugó el lisado. Se separó el sobrenadante y se aireó durante 30 minutos a temperatura ambiente para la evaporación del cloroformo residual.

El lisado se trató con DNasa (50 ug/ml) durante 30 minutos a 37°C para digerir el ADN cromosómico y plásmido, y luego se tituló. A continuación, se infectaron células de E. coli normales (que no llevan plásmido) con el lisado a 0,1 m.o.i. Esta baja multiplicidad de infección asegura que todas las células infectadas contienen un único fago, lo que a su vez sirve para separar el fago recombinante y los fagos de tipo salvaje.

La mezcla de infección anterior se incubó a 37°C durante 30 minutos y luego se centrifugó. Se separaron los pellets celulares y el sobrenadante. Las células que contenían el fago Lys menos no se lisaron y, por lo tanto, estaban presentes en los gránulos celulares junto con células no infectadas. Se descartó el sobrenadante, ya que esta fracción era posible que contuviera la mayoría de los fagos de tipo salvaje. Los pellets se volvieron a suspender a continuación en el medio de cultivo (Caldo Luria) y se lisaron con lisozima de huevo blanco (10 ug/ml) y cloroformo (2%). Este lisado se usó para infectar células pLys E BL21(DE3) a 0,1 m.o.i., y se colocaron en placas en un tramo de las mismas células. Se escogieron específicamente estas células para esta etapa ya que expresan de manera constitutiva la lisozima del fago T7 a partir de un plásmido y deberían ayudar al fago Lys menos a formar placas.

Se apreciaron dos tipos de placas en la placa, varias placas de tipo salvaje y algunas placas de minúsculas o de punta de alfiler. Se recogieron las placas de punta de alfiler y se volvieron a suspender en el medio de cultivo. A continuación, se dejó que éstas infectaran células BL21(DE3) pLysE y luego se colocaron en placas en una mezcla 1:1 de células BL21(DE3)pLysE (que hacen la lisozima T7) y células LE392 (sin lisozima).

Las áreas turbias que representan el fago recombinante se distinguieron de las placas de tipo salvaje en el tramo de la mezcla de células. Se recogieron estas áreas turbias. Una parte se volvió a suspender en agua para PCR y el resto se volvió a suspender en medio de cultivo. El producto del gen GFP fue amplificable a partir de muchas de las placas turbias (Figura 4).

Se amplificó también la lisina-GFP-lisina T4 de longitud completa. Sin embargo, también se produjo el producto del gen de lisina de tipo salvaje, lo que indicó la presencia del fago de tipo salvaje (Figuras 5 y 6). La eliminación selectiva del fago de tipo salvaje de estos lisados tuvo lugar infectando células a un bajo m.o.i. y la lisis de las células a los 40 minutos. En este momento, el fago de tipo salvaje debería estar otra ronda de infección de células y estar en el estadio de eclipse (en forma de ADN). La lisis de las células destruye de esta manera el fago de tipo salvaje antes de ensamblarse en partículas. Después de 3-5 rondas de dicha eliminación, los lisados fueron menos placas (Figura 7). La confirmación de la presencia del fago recombinante en dichos lisados, y la cuantificación se realizaron estimando el número de células viables después de la infección. La pérdida de viabilidad de las células infectadas fue evidente durante el plaqueado de la mezcla de infección (Figura 8).

Con el fin de enriquecer el fago recombinante y evitar el uso de cloroformo y suplementación externa de lisozima, se usó un tipo de célula de E. coli mutante sensible a la temperatura (RE 7) (que crece a 30°C y se lisa a 42°C). Se alcanzó un enriquecimiento del fago recombinante a un nivel de \sim2x10^{8}/ml. Esta preparación se usó para infectar una cepa patogénica de E. coli a 2 m.o.i. Estas células en su estado nativo provocan la muerte del 80% de los animales cuando se inyectan a una dosis de 10^{8} células/ratón dentro de 48 horas. Las células patogénicas inactivadas con el fago recombinante, han sido inyectadas en ratones para evaluar la eficacia como una vacuna inactivada de células enteras.

Ejemplo 5 Estudio preliminar de la eficacia del fago Lys menos en la protección de ratones contra una infección experimental por E. coli

Se inyectó en ratones macho y hembra Swiss Albino de 6 a 8 semanas de edad, de manera intraperitoneal, una cepa patogénica de E. coli que provoca un 100% de mortalidad a 108 cfu. Todos los ratones murieron dentro de 48 horas.

Cuando se inyectó en los ratones con 5x10^{7} células, se observó una mortalidad del 70-80%. No hubo mortalidad sin embargo, a 10^{6} cfu.

Por lo tanto, se inyectó en los ratones (i) 10^{6} células de tipo salvaje o (ii) 10^{6} células que se hicieron no viables mediante infección con el fago Lys menos. Después de dejarlas 10 días para el desarrollo de una respuesta inmune, se desafiaron los animales con células de tipo salvaje (5x10^{7} cfu) junto con animales a los que se les administró solamente solución salina y se observaron hasta un periodo de 10 días. Hubo una mortalidad importante en el grupo inyectado con E. coli inactivada con el fago Lys menos probablemente debido a la endotoxina.

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En el grupo control del vehículo, hubo una mortalidad del 80% como se esperaba. En el grupo donde se usaron células de tipo salvaje como vacuna, se observó una mortalidad del 20% lo que indicaba una protección del 80%. En el grupo en donde las células habían resultado no viables por el fago Lys menos, no hubo mortalidad en absoluto, lo que indica una protección total.

3

Respuesta de anticuerpos

Para verificar la presencia de anticuerpos en los ratones que sobrevivieron en grupos diferentes, se sacrificaron los ratones 7 días después de la dosis de exposición que se administró y se recogió el suero. Se recolectó el suero a partir de los animales del grupo de control de vehículo no expuestos que sirvieron como control negativo. Se comprobaron las muestras de suero por reactividad con las células 443 de E. coli. Se confirmó la presencia de anticuerpos anti-E. coli en los sueros en un ELISA de formato estándar usando una preparación de células E. coli (cepa #MTCC443) recubierta en pocillos de microplacas para la captura y IgG de anti-ratón conjugado a la enzima fosfatasa alcalina como reportero. Se marcaron los ratones como positivo para los anticuerpos anti-E. coli contra la media de los valores OD de 6 sueros de control negativo usados.

Todos los ratones que sobrevivieron al desafío mostraron la presencia de anticuerpos anti-E. coli 443. El grupo del fago Lys menos fue comparable al grupo de células vivas administradas. Todos los valores que se muestran en la tabla a continuación representan la media de los ensayos por duplicado. La media OD de los animales control (6) no expuestos a E. coli (control sin infectar) fue de 0,3.

4

<110> Gangagen, Inc.

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<120> Composiciones inmunogénicas bacterianas de células enteras incapacitadas

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<130> AHB/FP6217392

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<140> EP 02763771.9

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<141> 2002-09-27

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<150> PCT/US02/30844

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<151> 2002-09-27

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<150> 60/325.796

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<151> 2001-09-27

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<160> 4

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 1

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cggaattcca tatgaatata tttgaaatgt tacgt

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35

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<210> 2

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 2

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aaagcggccg caagctttag attttttatac gcgtccca

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38

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<210> 3

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 3

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ccggaattca tatgagtaaa ggagaagaac ttttc

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<210> 4

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<211> 35

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 4

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ccggaattca tttatttgta tagttcatcc atgcc

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35

Claims (10)

1. Uso de una composición bacteriana de célula entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un patógeno bacteriano en un sujeto susceptible a una infección por una enfermedad causada por una bacteria patogénica, en donde la composición comprende la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y en donde dicho medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el hospedador.

2. Uso de una composición bacteriana de célula entera incapacitada en la fabricación de una vacuna para vacunar a un sujeto contra una enfermedad causada por un patógeno bacteriano, comprendiendo la vacuna la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y donde dicha vacuna se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a la bacteria patogénica en el sujeto.

3. Uso de una composición bacteriana de célula entera incapacitada en la fabricación de un medicamento para provocar una respuesta inmune a un antígeno en un sujeto, donde la composición comprende una bacteria incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis, y donde el medicamento se administra en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune a un antígeno presente dentro o en la bacteria.

4. Composición que comprende una bacteria incapacitada y un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde la bacteria incapacitada se produce mediante infección de una bacteria patogénica con un bacteriófago Lys menos.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la bacteria patogénica incapacitada mediante infección con un bacteriófago defectuoso en la lisis se manipula genéticamente para sobreexpresar un antígeno endógeno.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o la composición de la reivindicación 4 en donde la bacteria patogénica es de un género seleccionado del grupo que consiste en Mycobacteria, Staphylococci, Vibrio, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia, Haemophilus, Neisseria, Pseudomonas, Shigella, Serratia, Salmonella, Streptococcus, Klebsiella y Yersinia.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, la reivindicación 2 o la reivindicación 3 o la composición de la reivindicación 4, donde el bacteriófago defectuoso en la lisis es el bacteriófago Lys menos.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde el antígeno es un antígeno bacteriano endógeno a la bacteria.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 3, donde el antígeno es un antígeno recombinante.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el antígeno recombinante es exógeno a la bacteria.