ES2283022T3 - Metodos precisos de ensayo de la eficacia para agentes activos incluyendo agentes quimioterapeuticos. - Google Patents

Abstract

UN SISTEMA MEJORADO PARA CLASIFICAR UNA PLURALIDAD DE POSIBLES AGENTES TERAPEUTICOS O QUIMIOTERAPEUTICOS PARA COMPROBAR SU EFICACIA EN UN PACIENTE ESPECIFICO, EN QUE SE TOMA UNA MUESTRA DE TEJIDO DEL PACIENTE, SE CULTIVA Y SE LE EXPONE POR SEPARADO A UNA PLURALIDAD DE TRATAMIENTOS Y/O DE AGENTES TERAPEUTICOS PARA IDENTIFICAR OBJETIVAMENTE EL MEJOR TRATAMIENTO O AGENTE PARA ESE PACIENTE PARTICULAR. LAS INNOVACIONES EN EL PROCEDIMIENTO ESPECIFICO TALES COMO LAS TECNICAS DE PREPARACION DE LAS MUESTRAS DE TEJIDOS HACEN QUE EL PROCEDIMIENTO RESULTE UTIL TANTO DESDE UN PUNTO DE VISTA PRACTICO COMO TEORICO. UNA TECNICA DE PREPARACION DE MUESTRAS DE TEJIDOS ESPECIALMENTE IMPORTANTE ES LA PREPARACION INICIAL DE PARTICULAS MULTICELULARES COHESIVAS DE LA MUESTRA DE TEJIDO EN LUGAR DE SUSPENSIONES O PREPARACIONES DE CELULAS DISOCIADAS ENZIMATICAMENTE, PARA LA PREPARACION DE UNA SOLA CAPA INICIAL DEL CULTIVO DEL TEJIDO. SI SE SOMETEN MUESTRAS UNIFORMES DE CELULAS A UNA AMPLIA VARIEDAD DE AGENTES ACTIVOS(Y CONCENTRACIONES DE LOS MISMOS), SE PUEDEN DETERMINAR EL AGENTE Y LA CONCENTRACION MAS PROMETEDORAS PARA EL TRATAMIENTO DE UN PACIENTE PARTICULAR.

Description

Métodos precisos de ensayo de la eficacia para agentes activos incluyendo agentes quimioterapéuticos.

Campo de la invención

La invención se refiere a la selección y el ensayo de agentes activos, que incluyen agentes quimioterapéuticos, para predecir la eficacia potencial en pacientes individuales en los que está indicado el tratamiento con agentes de este tipo.

Introducción

Todos los agentes activos que incluyen agentes activos quimioterapéuticos se someten a ensayos rigurosos en cuanto a eficacia y seguridad previamente a aprobación para uso médico en los Estados Unidos. Métodos de evaluar la eficacia han incluido elaboradas investigaciones de grandes poblaciones en estudios ciegos por duplicado en cuanto a un método de tratamiento y/o un agente activo dados, con interpretación estadística concomitante de los datos resultantes, pero estas conclusiones se generalizan inevitablemente en cuanto a poblaciones de pacientes que se toman en conjunto. En muchas disciplinas farmacéuticas y particularmente en el área de quimioterapia, sin embargo, los resultados de terapia de paciente individual puede que no concuerden con los datos generalizados - en detrimento del paciente individual. Desde hace mucho tiempo se ha reconocido la necesidad de un método de evaluar el potencial terapéutico de agentes activos, que incluyen pero no se limitan a agentes quimioterapéuticos, respecto a su eficacia en cuanto a un paciente individual dado, previamente al tratamiento a ese paciente.

Ya existen análisis de la técnica anterior que exponen tejido maligno de diversos tipos a una pluralidad de agentes activos, con la finalidad de evaluar la mejor opción para administración terapéutica. Por ejemplo, en Kruczynski, A., y col., "Evidence of a direct relationship between the increase in the in vitro passage number of human non-small-cell-lung cancer primocultures and their chemosensitivity," Anticancer Research, vol. 13, nº 2, págs. 507-513 (1993), se investigó la quimiosensibilidad de cánceres de células pulmonares no pequeñas en injertos in vivo, en primocultivos in vitro, y en líneas de células de cáncer a largo plazo comercialmente disponibles. Se documentó el aumento de quimiosensibilidad y se correlacionó con cambios morfológicos en las células en cuestión. Algunas veces, se ensayan células malignas de modelo animal y/o cultivos establecidos de células con agentes prospectivos de terapia, véase por ejemplo Arnold, J.T., "Evaluation of chemopreventive agents in different mechanistic classes using a rat tracheal epithelial cell culture transformation assay," Cancer Res., vol.55, nº 3, págs. 537-543 (1995).

Cuando se usan células de pacientes reales para hacer análisis in vitro enfocados a pacientes individuales, en procesos típicos de la técnica anterior, por ejemplo Kornblith y col., J. Neurosurg. 48:580-586, (1978), se recogen las células (sometidas a biopsia) y se someten a tripsinización (tejido conjuntivo que se digiere con la enzima tripsina) para dar una suspensión de células adecuada para conversión a la forma deseada de cultivo de tejido. Las colecciones de células de cultivo de tejido in vitro que resultan de esas técnicas están generalmente lastradas por su incapacidad de imitar con precisión la quimiosensibilidad del tumor original u otra biopsia celular. Las técnicas estándar de clonación y cultivo de tejidos son además excesivamente complicadas y costosas para uso en una coyuntura de análisis paciente por paciente. Se mantiene así la necesidad de una técnica de preparación de cultivos de tejidos que proporcione cultivos de células, para fines de selección de fármacos, en la que después de una preparación sencilla los cultivos de células reaccionen de una manera equivalente a su reactividad in vivo, para que se pueda hacer la selección de fármaco o agente quimioterapéutico en cuanto a un paciente particular para el que está indicada una selección de este tipo.

Resumen de la invención

Con el fin de satisfacer esta necesidad, la presente invención es un sistema mejorado para seleccionar un colectivo de agentes terapéuticos o quimioterapéuticos candidatos respecto a su eficacia en cuanto a un paciente específico, en el que se recoge una muestra de tejido del paciente, se cultiva y se expone separadamente a una pluralidad de tratamientos y/o agentes terapéuticos con el fin de identificar objetivamente el mejor tratamiento para las células cultivadas obtenidas del paciente. Innovaciones específicas del método tales como técnicas de preparación de muestra de tejido hacen a este método útil prácticamente, así como teóricamente. Una técnica de preparación de muestra de tejido particularmente importante es la preparación inicial de material en partículas multicelulares cohesivas de la muestra de tejido, en lugar de suspensiones o preparaciones de células disociadas enzimáticamente, para la preparación inicial de monocapa de cultivo de tejido. Con respecto al cultivo de células malignas, por ejemplo, se piensa (sin intención alguna de estar comprometidos por la teoría) que manteniendo las células malignas dentro de un material en partículas multicelulares del tejido originario, se facilita el crecimiento de las propias células malignas frente a la proliferación de fibroblastos u otras células que tiende a suceder cuando se hacen crecer en cultivo células tumorales suspendidas. Se pueden hacer así monocapas de células prácticas para que permitan seleccionar con sentido entre una pluralidad de tratamientos y/o agentes. Se vigila el crecimiento de las células para comprobar el momento para que se inicie el análisis y para determinar la velocidad de crecimiento de las células cultivadas; también se vigilan y se optimizan la secuencia y el momento de adición del fármaco. Sometiendo muestras uniformes de células a una amplia diversidad de agentes activos (y concentraciones de los mismos), se puede determinar el agente más eficaz. Para análisis que conciernen a tratamiento de cáncer, se contempla una evaluación en dos etapas en las que se investigan tanto el efecto citotóxico agudo como el efecto inhibidor a largo plazo de un agente anti-cáncer dado.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es un sistema para seleccionar entre un colectivo de agentes terapéuticos o quimioterapéuticos candidatos respecto a su eficacia en cuanto a un paciente específico, en el que se recoge una muestra de tejido del paciente y se expone separadamente a una pluralidad de tratamientos y/o agentes terapéuticos con el fin de identificar objetivamente el mejor tratamiento o agente. Innovaciones específicas del método tales como técnicas de preparación de muestra de tejido hacen a este método útil prácticamente, así como teóricamente. Una técnica de preparación de muestra de tejido particularmente importante es la preparación inicial de material en partículas multicelulares cohesivas (explantes) de la muestra de tejido, en lugar de suspensiones o preparaciones de células disociadas enzimáticamente, para la preparación inicial de monocapa de cultivo de tejido. Se vigilan y se optimizan el crecimiento celular y la secuencia y los momentos de adición del fármaco.

Una importante aplicación de la presente invención es la selección de agentes quimioterapéuticos y de otras terapias antineoplásticas frente a preparaciones de cultivos de tejidos de células malignas pertenecientes a los pacientes de los que se han sometido a biopsia sus muestras malignas. Terapias anti-cáncer relacionadas que se pueden seleccionar usando el sistema de la invención son tanto terapia y agentes de radiación que potencian la citotoxicidad de la radiación, como agentes anti-cáncer inmunoterapéuticos. Sin embargo, dentro de esta invención también se engloban procesos de selección para tratamientos o agentes terapéuticos para síndromes no malignos, e incluyen sin limitación agentes que combaten síndromes hiperproliferativos, tales como psoriasis, o agentes de curación de heridas. Tampoco se limita el presente análisis de eficacia solamente a la selección de agentes activos que aceleran (curación) o frenan (anti-cáncer, antihiperproliferativos) el crecimiento celular puesto que los agentes, proyectados para potenciar o contener las funciones bioquímicas intracelulares, también se pueden ensayar con el presente sistema de cultivo de tejidos. Por ejemplo, la formación o el bloqueo de enzimas, neurotransmisores y otras sustancias bioquímicas se pueden seleccionar con los métodos de análisis de la presente previamente al tratamiento del paciente.

Cuando el paciente se ha de tratar debido a la presencia de tumor, en la realización preferida de la presente invención se recoge del paciente una biopsia tumoral de >100 mg de tejido no necrótico, no contaminado por cualquier biopsia o procedimiento quirúrgico adecuado conocido en la técnica. La preparación de muestra de biopsia procede como sigue bajo una campana de flujo laminar que se debería conectar al menos 20 minutos antes de uso. Se usa etanol de calidad de reactivo para enjuagar la superficie de la campana previamente al comienzo de la preparación de muestra. A continuación se retira el tumor del contenedor de transporte, bajo condiciones estériles, y se trocea con tijeras estériles. Si el espécimen llega ya troceado, las piezas individuales del tumor se deberían dividir en cuatro grupos. Usando pinzas estériles, cada cuarto de tejido sin dividir se coloca a continuación en 3 ml de un medio de crecimiento estéril (medio F-10 estándar que contiene 17% de suero de ternero y una cantidad estándar de penicilina y estreptomicina) y se trocea sistemáticamente usando dos escalpelos estériles en un movimiento a modo de tijeras, o cuchillas incisivas opuestas manuales o automatizadas mecánicamente equivalentes. Este movimiento de cortes cruzados es importante porque la técnica crea bordes de corte lisos sobre el material en partículas multicelulares tumorales resultantes. Preferiblemente, pero no necesariamente, las partículas del tumor miden cada una 1 mm^{3}. Después de que cada cuarto del tumor ha sido troceado, las partículas se extienden en placas en matraces de cultivo usando pipetas pasteur estériles (9 explantes por T-25 ó 20 partículas por matraz T-75). Se etiqueta a continuación cada matraz con el código del paciente, la fecha de la explantación y otros datos distintivos. Los explantes se deberían distribuir uniformemente por la superficie del fondo del matraz, con incubación invertida inicial en una incubadora a 37ºC durante 5-10 minutos, seguida de adición de aproximadamente 5-10 ml de medio de crecimiento estéril e incubación adicional en la posición normal, no invertida. Los matraces se colocan en una incubadora sin CO_{2}, a 35ºC. Los matraces se deberían comprobar diariamente respecto a crecimiento y a contaminación. Durante un período de unas pocas semanas, con retirada semanal y reposición de 5 ml de medio de crecimiento, los explantes fomentarán el crecimiento de células en una monocapa. Con respecto al crecimiento de células malignas, se cree (sin intención de estar comprometidos por la teoría) que manteniendo las células malignas dentro de un material en partículas multicelulares del tejido originario, se facilita el crecimiento de las propias células malignas frente a la proliferación de fibroblastos (u otras células no deseadas) que tiende a suceder cuando se hacen crecer en cultivo células tumorales suspendidas.

El uso del procedimiento anterior para formar un cultivo celular monocapa maximiza el crecimiento de células malignas de la muestra de tejido, y optimiza así los sucesivos análisis de cultivo de tejido de acción quimioterapéutica de los diversos agentes que se han de ensayar. Sin embargo, el crecimiento potenciado de células malignas reales es solamente un aspecto de la presente invención; otra característica importante es el sistema de vigilancia de la velocidad de crecimiento que se usa para supervisar el crecimiento de la monocapa una vez formada. Una vez que se ha iniciado un cultivo primario y su cultivo secundario de tejido monocapa derivado, se vigila el crecimiento de las células para comprobar el momento en que se inicia el análisis de quimioterapia y para determinar la velocidad de crecimiento de las células cultivadas.

La vigilancia del crecimiento de células se lleva a cabo contando las células en la monocapa sobre una base periódica, sin matar ni teñir las células y sin retirar ninguna célula del matraz de cultivo. El conteo se puede hacer visualmente o por métodos automatizados, con o sin uso de técnicas de estimación conocidas en la técnica (conteo en un área representativa de una cuadrícula multiplicado por el número de áreas de cuadrículas, por ejemplo). Los datos del conteo periódico se usan a continuación para determinar las velocidades de crecimiento que se pueden considerar paralelas o no a las velocidades de crecimiento de las mismas células in vivo en el paciente. Si se pueden documentar ciclos de velocidad de crecimiento, por ejemplo, entonces la dosificación de ciertos agentes activos se puede hacer a la medida del paciente. La misma velocidad de crecimiento se puede usar para evaluar la periodicidad del tratamiento por radiación, asimismo. Se debería destacar que con determinaciones de velocidad de crecimiento llevadas a cabo mientras las monocapas crecen en sus matraces, el presente método no requiere hemocitometría, citometría de flujo ni uso de portaobjetos y tinción, con todo su trabajo y coste concomitantes.

Los protocolos para velocidad de crecimiento de monocapa generalmente usan un microscopio de contraste de fases invertido para examinar matraces de cultivo incubados en una incubadora (5% CO_{2}) a 37ºC. Cuando el matraz se coloca bajo el microscopio de contraste de fases invertido, se examinan diez campos (áreas de una cuadrícula inherente al matraz) usando el objetivo 10x, con la condición de que los diez campos deberían ser no-contiguos, o significativamente alejados unos de otros, de modo que los diez campos sean un muestreo representativo del matraz entero. Se apunta el porcentaje de ocupación de células para cada campo examinado, y el promedio de estos porcentajes proporciona entonces una estimación del porcentaje de confluencia global en el cultivo celular. Cuando las muestras del paciente se han dividido entre dos o entre tres o más matraces, se debería calcular un conteo de células promedio para el total de la muestra del paciente. El porcentaje de confluencia promedio calculado se debería introducir en un sistema de registro de proceso que permita la compilación de datos -y la representación gráfica de curvas de crecimiento- a lo largo del tiempo. Los cultivos monocapa pueden ser fotografiados para documentar la morfología celular y los patrones de crecimiento de los cultivos. La fórmula aplicable es:

Porcentaje \ de \ confluencia = \frac{\text{estimación del área ocupada por células}}{\text{área total en un campo observado}}

Como ejemplo, por lo tanto, si la estimación de área ocupada por las células es 30% y el área total del campo es 100%, el porcentaje de confluencia es 30/100, ó 30.

La adaptación del protocolo anterior para células no tumorales es directa y generalmente constituye un procedimiento equivalente.

La selección de agente activo usando las células cultivadas no procede en el matraz de incubación inicial, sino que generalmente procede usando placas tales como placas de microvaloración. El comportamiento del análisis de quimiosensibilidad usado para fines de selección depende de la capacidad para liberar un número de células reproducible para cada fila en una placa y/o una serie de placas, así como de la capacidad para conseguir una distribución uniforme de células en un pocillo dado. El siguiente procedimiento asegura que las células se transfieren reproduciblemente desde el matraz a las placas de microvaloración, y que las células se distribuyen uniformemente por la superficie de cada pocillo.

La primera etapa para preparar las placas de microvaloración es, evidentemente, preparar y vigilar la monocapa como se ha descrito anteriormente. El siguiente protocolo es a modo de ejemplo y susceptible de variación como será evidente para un experto en la técnica. Las células se retiran del matraz de cultivo y se prepara un sedimento de células por centrifugación. El sedimento de células derivado de la monocapa se suspende a continuación en 5 ml del medio de crecimiento y se mezcla en un tubo cónico con un remolino durante 6 a 10 segundos. El tubo se bascula a continuación 10 veces atrás y adelante. Se pipetea una gota de 0,36 \mul del centro del tubo cónico a un pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación se usa una nueva pipeta para pipetear una parte alícuota de solución de azul tripán, que se añade al mismo pocillo, y las dos gotas se mezclan con aspiración repetida de pipeta. La mezcla resultante se divide a continuación entre dos cámaras de hemocitómetro para examen usando un microscopio óptico estándar. Se cuentan las células en dos de los cuatro cuadrantes del hemocitómetro, bajo amplificación 10x. Sólo se cuentan aquellas células que no han captado el colorante de azul tripán. Se repite este proceso para la segunda cámara de conteo. Se determina así un conteo celular promedio por cámara. Usando medios conocidos en la técnica, se comprueban los valores de conteo de cuadrante, se registran, se multiplican por 10^{4} para dar células/ml, y se calcula en consecuencia la cantidad total de fluido (medio de crecimiento) necesario para suspender las restantes partes alícuotas de células.

Después de que se ha determinado la concentración deseada de células en el medio, se suspenden en el medio de crecimiento partes alícuotas adicionales de células de la monocapa por la vía de remolino y balanceo y se cargan a un dispensador de Terasaki conocido en la técnica. Usando técnicas del dispensador de Terasaki conocidas en la técnica se liberan a las placas de microvaloración partes alícuotas de la suspensión de células preparada. Se puede preparar una pluralidad de placas a partir de una única suspensión de células según se necesite. A continuación se envuelven las placas en gasa de algodón húmeda estéril y se incuban en un cajetín de incubadora por medios conocidos en la técnica.

Después de que se han preparado las placas, se lleva a cabo la exposición de las células en las mismas al agente activo según el siguiente protocolo de ejemplo. Durante esta porción del análisis de la invención, se transfiere la cantidad apropiada de agente activo específico a las placas de microvaloración preparadas según se ha descrito anteriormente. Lo siguiente es un protocolo general, que se puede adaptar. Cada placa de microvaloración se desenvuelve de su esponja de gasa de algodón húmeda y se examina microscópicamente respecto a la adhesión de células. La solución de control se dispensa en filas delimitadas de pocillos dentro de la cuadrícula en la placa de microvaloración, y se añaden cantidades alícuotas apropiadas del agente activo que se ha de ensayar a los pocillos restantes en las filas restantes. Ordinariamente, se administran concentraciones crecientes de modo secuencial del agente activo que se está ensayando en filas numeradas progresivamente más altas en la placa. A continuación las placas se vuelven a envolver en su gasa y se incuban en un cajetín de incubadora a 37ºC bajo CO_{2} al 5%. Después de un tiempo de exposición predefinido, se desenvuelven las placas, se secan con gasa estéril para retirar el agente, se lavan con solución salina equilibrada de Hank, se bañan con medio de crecimiento, y se reponen en la incubadora en un cajetín de incubadora durante un período de tiempo previamente definido, después del que las placas se pueden fijar y teñir para evaluación.

La fijación y la tinción se pueden llevar a cabo según un cierto número de procedimientos adecuados; el siguiente es representativo. Después de la retirada de las placas del cajetín de la incubadora, el medio de cultivo se desecha y las placas se bañan con solución salina equilibrada de Hank. Después de repetidos baños (cada vez con agitación) las placas se bañan a continuación con etanol de calidad de reactivo durante 2-5 minutos. A continuación el etanol se desecha. La tinción se logra con 5 ml por placa aproximadamente de tintura Giemsa, aunque el volumen no es crítico y bañarlas es la meta. La tintura Giemsa se debería dejar en el lugar 5 min. \pm 30 segundos puesto que el tiempo influye en la intensidad de la tinción. La tintura Giemsa se desecha a continuación y las placas se sumergen 3 veces en agua fría del grifo en un vaso de precipitados. A continuación se invierten las placas, se sacuden vigorosamente, y se secan al aire toda la noche (con la tapa de la placa quitada) sobre un bastidor en una mesa de laboratorio. A continuación se cuentan las células por pocillo manualmente o por medios automatizados y/o computarizados, para deducir los datos que se refieren a quimiosensibilidad de las células a diversas concentraciones de exposición. Un entorno de funcionamiento con ordenador particularmente útil para contar células es el compilador OPTIMATE disponible comercialmente, que está diseñado para permitir una función de conteo óptico bien ajustada a los procedimientos computarizados de conteo de células y a los cálculos subsiguientes.

Los procedimientos anteriores no cambian apreciablemente cuando se analizan promotores de crecimiento celular en lugar de agentes de detención celular tales como los agentes quimioterapéuticos. El presente análisis permite que se vigile con igual facilidad la muerte celular o el crecimiento celular. En cualquier caso, la optimización del uso del presente sistema implicará el ensayo comparativo de una diversidad de agentes activos candidatos, para selección del mejor candidato para el tratamiento del paciente sobre la base de los resultados in vitro. Una realización particularmente ventajosa de la invención anteriormente descrita comprende un análisis en dos etapas respecto a citotoxicidad seguida por evaluación de efecto inhibidor a más largo plazo. Agentes quimioterapéuticos pueden así ser evaluados separadamente tanto respecto a su efecto quimioterapéutico directo como respecto a su eficacia de duración a más tiempo.

La identificación de uno o más agentes activos o agentes quimioterapéuticos es periférica a la presente invención, que está proyectada para la selección de eficacia de algunos o todos ellos para un paciente dado. Literalmente cualquier agente activo puede ser seleccionado según la presente invención; se omite por tanto aquí hacer una relación de agentes activos ejemplares.

La esencia de la invención incluye por lo tanto la importante característica de la simplicidad del presente sistema - se usa material en partículas multicelulares cohesivas del tejido del paciente que se ha de ensayar para formar monocapas de células; se vigila el crecimiento de estas monocapas para una predicción precisa del crecimiento de las mismas células in vivo que se correlaciona; y se pueden ensayar diferentes concentraciones de un cierto número de agentes activos con la finalidad de determinar no sólo el agente más apropiado sino la concentración más apropiada de ese agente para exposición del paciente real (según las velocidades de crecimiento celular calculadas). También es importante destacar, en el contexto de la invención, que el presente sistema permite que se lleven a cabo ensayos in vitro en suspensiones de monocapas de cultivo de tejido que han crecido en medio nutritivo bajo condiciones rápidas (en cuestión de semanas), en lugar de con progenie de célula única producida por dilución clonante durante largos períodos de tiempo. En algunos casos, la presente invención es un análisis en dos etapas respeto a citotoxicidad y a inhibición de crecimiento a más largo plazo.

Claims (25)

1. Método para evaluar la quimiosensibilidad de las células de un paciente a un agente activo, tal que las células reaccionan de una manera sustancialmente equivalente a su reactividad in vivo, que comprende las etapas de:

a)

separar un espécimen de tejido del paciente en un material en partículas multicelulares cohesivas;

b)

hacer crecer una monocapa de cultivo de tejido a partir de dicho material en partículas multicelulares cohesivas;

c)

tratar una pluralidad de sitios segregados que comprenden células de dicha monocapa de cultivo de tejido al menos con un agente activo; y

d)

evaluar la quimiosensibilidad de las células en dicha pluralidad de sitios al menos a un agente activo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho espécimen de tejido es de una biopsia y/u operación de cirugía.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho espécimen de tejido es tejido maligno.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho espécimen de tejido se separa en material en partículas multicelulares cohesivas por medios mecánicos.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho material en partículas multicelulares tiene bordes de corte lisos.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho material en partículas multicelulares es de aproximadamente 1 mm^{3}.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicha pluralidad de sitios segregados comprende además una placa que contiene una pluralidad de pocillos en la misma.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que las células en la etapa (c) se inoculan en los sitios segregados usando un dispositivo de pipeteado de pocillo múltiple.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la etapa (c) comprende tratar dicha pluralidad de sitios con una pluralidad de agentes activos a concentraciones diversificadas tales que la evaluación de la etapa (d) identifique una quimiosensibilidad óptima de las células para un único agente activo a una única concentración.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la etapa (c) comprende tratar dicha pluralidad de sitios con una pluralidad de agentes activos durante un período de tiempo adecuado para permitir la determinación tanto del efecto citotóxico inicial como del efecto inhibidor a más largo plazo de al menos uno de dicha pluralidad de agentes activos.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la quimiosensibilidad de las células medida según la etapa (d) es sensibilidad a un agente anti-cáncer.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que las células de la etapa (c) se suspenden en un medio antes de inoculación.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho agente activo es un agente quimioterapéutico.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho agente activo es un agente de curación de heridas.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que dicho agente activo se selecciona entre el grupo que consiste en un agente de terapia de radiación, un agente sensibilizante de terapia de radiación y un agente potenciador de radiación.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho agente activo es un agente inmunoterapéutico.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que dicho agente activo es un agente terapéutico para un síndrome no maligno.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que dicha evaluación de quimiosensibilidad es una formación o bloqueo de enzimas.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que dicha evaluación de quimiosensibilidad es una formación o bloqueo de neurotransmisores.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que dichas células se fijan y se tiñen antes de la evaluación de la quimiosensibilidad.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-20, en el que dicha evaluación de quimiosensibilidad es un conteo de células manual o automatizado.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que se cuentan dichas células usando una función de conteo óptico.

23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el que se cuentan dichas células usando un ordenador.

24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-23, en el que dicha evaluación de quimiosensibilidad se determina midiendo crecimiento celular o muerte celular.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en el que dicha monocapa contiene un número reducido de fibroblastos en comparación con una monocapa producida a partir de células tumorales suspendidas que crecen en cultivo.