ES2283033T3 - O-fucosiltransferasa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A LA IDENTIFICACION, PURIFICACION, OBTENCION POR RECOMBINACION Y CARACTERIZACION DE LA O - FUCOSILTRANSFERASA.

Description

O-fucosiltransferasa.

Antecedentes

La presente invención hace referencia al campo de las glicosiltransferasas, o las enzimas que transfieren residuos de azúcar desde un sustrato donante activado a un grupo aminoacídico o a un grupo carbohidrato en crecimiento.

Las glicosiltransferasas que están implicadas en la biosíntesis de las cadenas de azúcares glicoproteicas y glicolipídicas se hallan en las proteínas de membrana del retículo endoplasmático y del aparato de Golgi. Son responsables de la catálisis de la adición de unidades monosacáridas bien a una cadena de glicanos existente o a un aceptor peptídico o lipídico que inicie una cadena. Los monosacáridos donantes se utilizan típicamente en una forma activada, bien como un azúcar de un nucleótido, por ejemplo la GDP-manosa o, menos frecuentemente, como un donante unido a un lípido, por ejemplo, el dolicol-P-glucosa (Dol-P-Glc). La mayoría de glicosiltransferasas están orientadas luminalmente, es decir con el dominio catalítico dentro de un compartimiento unido a membrana. Ejemplos de enzimas orientadas luminalmente son las galactosiltransferasas y las sialiltransferasas. Su estructura está representada pictóricamente en la Figura 1. Las enzimas se agrupan generalmente en familias basadas en el tipo de azúcar que transfieren (galactosiltransferasas, sialiltransferasas, etc.). Las comparaciones entre clones de cDNA conocidos de glicosiltransferasas (Paulson, J.C. & Colley, K.J., J. Biol. Chem. 264 (39), 17615-618 (1989), han revelado que existe muy poca homología de secuencia entre las enzimas. Sin embargo, tal como se indica en la Figura 1, todas las glicosiltransferasas comparten algunas estructuras comunes: una cola citoplasmática NH2-terminal, un dominio de anclaje del péptido señal de 16-20 aminoácidos y una región tallo extendida seguida por un dominio catalítico COOH-terminal grande. Los dominios señal y de anclaje actúan tanto como péptidos señales no hidrolizables como por regiones de expansión por la membrana, y orientan los dominios catalíticos de estas glicotransferasas dentro del lumen del aparato de Golgi.

El procedimiento que utilizan las células para regular la expresión de secuencias de carbohidratos específicas es de gran interés debido a las muchas evidencias que muestran que los grupos de carbohidratos de la superficie celular favorecen diversas interacciones celulares durante el desarrollo, la diferenciación y la transformación oncogénica, von Figura & Hasilik, A., Annu Rev Biochem, 55, 167-193 (1986); Komfield, S. J. Clin Invest. 77, 1-6 (1986); Munro, S & Pelham, H.R.B., Cell 48, 899-907 (1987); Pelham, H.R.B., EMBO J 7, 913-918 (1988); Paabo S., y col., Cell 50, 311-317 (1987). Se estima que al menos un centenar (100) de glicosiltransferasas son necesarias para la síntesis de las estructuras de carbohidratos en las glicoproteínas y glicolípidos, y la mayoría de éstas están implicadas en la elaboración de secuencias terminales altamente diversas. Paulson, J.C. & Colley, K. J. J. Biol. Chem. 264 (30), 171615-618 (1989). Entre estas enzimas responsables para las elaboraciones terminales, tres (3) enzimas son de un interés particular: las galactosiltransferasas, las fucosiltransferasas y las sialiltrasnferasas.

Las fucosiltransferasas transfieren el azúcar fucosa desde el UDP a los enlaces \alpha1-2, \alpha1-3, \alpha1-4 y \alpha1-6. La fucosa se identificó por primera vez como presente en las uniones glicosídicas con la serina o la treonina como compuestos del tipo Glcbl-3Fucal-O-Ser/Thr y Fucal-O-Ser/Thr en orina humana y tejidos de rata. Hallgreen, P. y col., J. Biol. Chem. 250, 5312-5314 (1975); Klinger M.M. y col., J. Biol Chem 256, 7932-7935 (1981). La identificación de O-fucosa unida a una proteína se realizó por primera vez por Kentzer y col., quienes hallaron un residuo de fucosa unido a un péptido derivado del dominio del factor epitelial de crecimiento (EGF) de la uroquinasa recombinante. Kentzer, EJ y col., Biochem Biophys Res Commun, 171, 401-406 (1990). Patrones de glicosilación similares se hallaron en el activador del plasminógeno tisular (tPA) (Harris RJ & Spellman, MW, Biochemistry 30, 2311-14 (1991)), el factor VII humano (Bjoem y col., 266, 11051-11057 (1991)), el factor XII humano (Harris y col., J. Biol. Chem., 267, 5102-5107 (1992)) y el activador del plasminógeno del vampiro, Gardell y col., J. Biol Chem, 264, 17947-52 (1989). También se ha identificado la O-fucosilación del dominio del EGF del factor XI humano, pero en el extremo reductor del tetrasacárido: NeuAca2-Galbl-4GlcNAcbl-3Fucal-O-Ser61. Nishimura y col., J. Biol. Chem., 267, 17520-17525 (1992); Harris y col., Glycobiology 3, 219-224 (1993). Sin embargo, en todos los casos en los que se ha detectado, la O-fucosa está presente en la secuencia Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-Ser/Thr-Cys. Harris y col., Glycobiology 3, 219-224 (1993).

El EGF es un potente mitógeno de 53 aminoácidos cuya actividad está facilitada por la unión con el receptor del EGF. Carpenter G y Cohen C, J. Biol Chem. 265, 7709-7712 (1990). Las regiones con homología de secuencia EGF se han hallado en un número en aumento de proteínas de la coagulación, fibrinolíticas, proteínas del complemento y del receptor. Paathy L, FEBS Lett., 214, 1-7 (1987); Doolitle RF, Trends Biochem Sci., 14, 244-245 (1989). Aunque, no se cree que interactúen con el receptor del EGF los módulos del EGF de estas proteínas multi-modulares. En cambio, se les han adjudicado propiedades distintas a dichos módulos EGF, incluyendo la unión al ligando (Appella y col., J. Biol. Chem., 262, 4437-4440 (1987); Kurosawa y col., J Biol Chem 263, 5993-5996 (1988), la actividad mitogénica (Engel, FEBS Lett. 251, 1-7 (1989) y el reciclamiento de los receptores (Davis y col., Nature 326, 760-765 (1987). Los módulos del EGF de las proteínas de la coagulación dependientes de vitamina K son necesarios para el plegamiento adecuado de módulos adyacentes que contienen residuos ácido \gamma-carboxilglutámico (Astermark y col., J Biol, Chem 266, 2430-2437 (1991), mientras que otros pueden servir sencillamente como espaciadores entre distintas regiones funcionalmente activas (Stenflo, J. Blood 78, 1637-1651 (1991).

Wang y col., Glycobiology 6, 837-842 (1996) describen un ensayo para la GDP-fucosa: polipéptido fucosiltransferasa con células CHO.

Los dominios EGF se caracterizan por la presencia de 6 residuos cisteína conservados que se espera formen 3 enlaces disulfuro intracatenarios en el patrón 1-3, 2-4 y 5-6 obtenido para el EGF, Savage y col., J. Biol. Chem, 248, 7669-7672 (1973). Un patrón de unión de disulfuros se ha confirmado para el dominio EGF de la proteína del complemento humano Cls, Hess y col., Biochemistry 30, 2827-2833 (1991). Se han obtenido estructuras tridimensionales de módulos sintéticos comprendiendo los EGF N-terminales de los factores humanos X y XI mediante estudios de espectroscopía de RMN (Selander y col., Biochemistry 29, 8111-8118 (1990); Huang y col., Biochemistry 30, 7402-7409 (1991); Baron y col., Protein Sci 1, 81-90 (1992); Ullner y col., Biochemistry 31, 5974-5983 (1992). Las estructuras derivadas son casi idénticas a las determinadas por el EGF (Cooke y col., Nature 327, 339-341 (1987) y el TGF-\alpha (Kohda y col., Biochemistry 28, 953-958 (1989); Tappin y col., Eur. J. Biochem. 179, 629-637 (1989).

Existe un gran interés en la síntesis de proteínas que contienen O-fucosa en los enlaces glicosídicos. Ello es especialmente verdad en las proteínas con dominios EGF que están O-fucosilados. Con el fin de O-fucosilar adecuada y eficientemente estas proteínas, sería altamente deseable una enzima específica para crear enlaces O-fucosa. Sin embargo, los intentos previos para aislar y purificar las O-fucosiltransferasas han demostrado ser insatisfactorios, por tanto existe un gran interés en lograr una O-fucosiltransferasa homogénea, altamente pura así como un ensayo de detección eficiente.

Resumen

La presente invención describe la identificación, la producción recombinante y la caracterización de enzimas O-fucosiltransferasas. Más específicamente, la presente invención describe el aislamiento de los cDNAs que codifican diversas formas de O-fucosiltransferasas y los procedimientos de expresión y caracterización de las O-fucosiltransferasas.

En un aspecto, la presente invención hace referencia a una O-fucosiltransferasa esencialmente pura, tal como se define en las reivindicaciones, incluyendo una secuencia aminoacídica esencialmente idéntica a la secuencia mostrada en la Figura 12A [SEC NO ID.2]. Se obtiene una O-flucosiltransferasa esencialmente pura a partir de fuentes humanas.

La presente invención hace referencia a una O-fucosiltransferasa esencialmente pura, tal como se define en las reivindicaciones, que es capaz de glicosilar el dominio EGF de un péptido con una porción O-fucosa activada. En un aspecto más limitado, la presente invención hace referencia a una O-fucosiltransferasa esencialmente pura que es capaz de glicosilar la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Cys. En un aspecto aún más limitado, la secuencia es -Cys-Xaa-Xaa-C31y-Gly-Ser/Thr-Cys.

En un aspecto relacionado, la presente invención hace referencia a un fragmento funcional o análogo de una O-fucosiltransferasa, tal como se define en las reivindicaciones, incluyendo una secuencia aminoacídica esencialmente idéntica a la secuencia que se muestra en la Fig. 12B [SEC ID NO:9]. En un aspecto todavía más limitado, este fragmento funcional o análogo es capaz de glicosilar la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Cys. En un aspecto más limitado, la secuencia es -Cys-Xaa-Xaa-Gly-Ser/Thr-Cys.

En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de colocación de O-fucosa en un dominio EGF de un polipéptido. En un aspecto más limitado, la secuencia glicosilada es -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Cys. En otro aspecto más limitado, la secuencia es -Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-Ser/Thr-Cys.

Otros aspectos de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Descripción resumida de las figuras

En las Figuras 2-4, una unidad corresponde a 1 \mumol de fucosa transferido por minuto.

La Fig. 1 representa gráficamente la estructura de las glicosiltransferasas, ilustrando el dominio catalítico, el tallo y el dominio transmembrana, en relación con el citoplasma, membrana y lumen de la célula.

La Fig. 2 representa una cromatografía en una columna combinada de DE-52/Affi-Gel Blue. Los círculos vacíos representan la concentración de proteína y los rombos vacíos representan la actividad enzimática. En el punto A, se separó la columna DE-52 y la columna Affi-Gel Blue se lavó con un tampón que contenía NaCl 125 mM. La elución de la enzima se inició en el punto B, con tampón que contenía NaCl 1 M.

La Fig. 3 representa una cromatografía en una columna de resina de afinidad unida al sustrato del aceptor, que aquí fue el Factor VII EGF-1-His6-Ni^{2+}NTA-Agarosa. Los rombos vacíos representan la actividad enzimática y los círculos vacíos representan las concentraciones de las proteínas tal como se monitorizaron a 280 nm. En el punto A y B, la columna se lavó con tampones que contenían NaCl 0,5 M e imidazol 25 mM. La enzima y el dominio EGF del Factor VII se eluyeron juntos en el Punto C con imidazol 0,3 M.

La Fig. 4 representa una cromatografía en una columna de resina de afinidad unida a un análogo del sustrato donante, el cual fue aquí la GDP-hexanolamina-agarosa. Los círculos abiertos representan la concentración de la proteína monitorizada a 280 nm, y los rombos abiertos representan la actividad enzimática. La línea discontínua indica el gradiente de GDP 0-2 nM utilizado para la elución (monitorizado a 280 m, la escala no se muestra). Después de cargar la muestra, la columna se lavó con tampón de equilibrio y el tampón de equilibrio contenía NaCl 125 mM, que se representa como el Punto A. La elución de la enzima se inició en el Punto B.

La Fig. 5 representa un gel de SDS-PAGE de O-fucosiltransferasa preparado por cromatografía de afinidad. Cada columna muestra la proteína detectada por la tinción de plata en una fracción recogida a partir de la columna representada en la Fig. 4.

La Fig. 6 representa los resultados de la digestión por glicosidasas de la O-fucosiltransferasa. Las muestras reducidas se migraron en una electroforesis en un gel al 12% con SDS. El carril 1 corresponde a la reacción control sin glicosidasas. El carril 2 corresponde a la digestión de PNGasa F y el carril 3 a la digestión por Endoglicosidasa H. Las bandas de bajo peso molecular en el carril 2 y 3 corresponden a la PNFasa F y la endoglicosidasa H, respectivamente. Los otros dos carriles son los marcadores de peso molecular.

La Fig. 7 representa una cromatografía por HPLC inversa del dominio EGF del Factor IX y sus mutantes. Los mutantes recombinantes son los descritos en la Tabla 2. Los picos marcados con los tiempos de retención son las proteínas recombinantes tal como se verificó por espectrometría de masas con electrospray. En un cromatograma todos los picos marcados tienen el mismo peso molecular.

La Fig. 8 representa un LC/MS de la reacción producto de la O-fucosiltransferasa tras el EGF-AA mutante. La cromatografía HPLC en fase inversa de la forma no fucosilada se muestra en la Figura 7, panel A. La banda superior de la Fig. 8 es el cromatograma de RP-HPLC del EGF O-fucosilado. Los picos principales se marcaron con el tiempo de retención y sus espectros de masas correspondientes se muestran en el panel inferior. Los iones principales están marcados con sus valores de masa respecto a la carga. Los pesos moleculares calculados son 5817 (picos 28,8, 29,3 & 33,0) y 5864 (únicamente el pico 30,4).

La Fig. 9 es una comparación de las secuencias aminoacídicas entre una secuencia parcial de la O-fucosiltransferasa de CHO aislada y las secuencias humanas y de C. elegans conocidas. La secuencia polipeptídica N-terminal de la O-fucosiltransferasa de CHO está en sombreado. Si la secuencia humana es un cDNA parcial de la proteína desconocida de un gen de una línea celular de mieloblastos y de C. elegans es una secuencia codificante generada por ordenador a partir de dicho genoma.

La Fig. 10 es una transferencia de northern para una O-fucosiltransferasa. Las sondas se obtuvieron de las secuencias KIAA humanas tal como se indicó en la Fig. 11. Los marcadores de peso molecular están indicados en kilobases.

La Fig. 11 es la secuencia de DNA del primer fragmento EcoRI de KIAA180 humano. El primer fragmento EcoRI del cDNA contiene una secuencia codificante parcial dentro de una secuencia aminoterminal completa. La región que concuerda con la secuencia del polipéptido de CHO está en sombreado. Los dos oligonucleótidos utilizados para generar las sondas para la transferencia de Northern (Fig. 10) están marcados y subrayados con doble línea. Los nucleótidos marcados y subrayados con una sola línea se utilizaron en la amplificación por PCR.

La Fig. 12 es la secuencia de DNA de la O-fucosiltransferasa de corazón humano. El panel superior (A) es una secuencia compilada de los clones de cDNA positivos. La región que concuerda con la secuencia de CHO aislada está en sombreado. El residuo "A" en la posición 540 de la secuencia de DNA (indicado por la doble línea) es distinta de la KIAA0180 humana (G en la posición 475 de la Figura 11), sin embargo, los polipéptidos codificados son los mismos. El panel inferior (B) es una comparación de las secuencias amino-terminales de la O-fucosiltransferasa aislada de corazón humano y de células CHO.

La Fig. 13 representa la construcción del plásmido para la expresión de la O-fucosiltransferasa humana. El panel superior (A) es una figura esquemática del plásmido. El panel inferior (B) es la secuencia del inserto. El polipéptido señal artificial está en sombreado y la etiqueta de polihistidinas está dos veces subrayada. La parte de la O-fucosiltransferasa de corazón humano es la misma que la descrita en la Fig. 12.

La Fig. 14. es una comparación gráfica de la actividad O-fucosiltransferasa en los 5 clones recombinantes analizados. Los cultivos se infectaron con 5 clones recombinantes purificados y se analizaron por su actividad enzimática de acuerdo con el procedimiento de la invención. Los cultivos de las células infectadas (Sf9) se utilizaron como controles.

La Fig. 15 es gel del 12% SDS-PAGE teñido con plata de la O-fucosiltransferasa recombinante humana. El carril I contiene el medio de cultivo infectado. El carril 2 contiene la fracción de fluido que ha pasado por la columna Ni^{2+}-NTA. El carril 3 es el resultado del lavado con imidazol 25 mM, mientras que el carril 4 es la elución con imidazol 0,3 M. Los marcadores de peso molecular están en kilodaltons.

SEC ID NO:1 es la secuencia nucleotídica secuenciada de la O-fucosiltransferasa de corazón humano que se ha aislado en el Ejemplo 1 y se indica en la Fig. 12A.

SEC ID NO:2 es la secuencia aminoacídica de la O-fucosiltransferasa de corazón humano aislada de las células Sf9 y que se muestra en la Fig. 12 A.

SEC ID NO:3 es la secuencia aminoacídica N-terminal de la O-fucosiltransferasa de CHO en la Fig. 12B.

SEC ID NO:4 es la secuencia nucleotídica de inicio desde la pb 4101 a la 5399 y representa la secuencia nucleotídica que se muestra en la Fig. 13B. Esta secuencia también comprende el inserto de DNA utilizado en el clonaje y expresión de la O-fucosiltransferasa de corazón humano.

SEC ID NO:5 es la secuencia nucleotídica completa del plásmido de expresión que incluye SEC NO ID:4.

SEC ID NO:6 es la secuencia aminoacídica que representa la inserción del plásmido que se muestra en la Fig. 13B.

SEC ID NO:7 es la secuencia nucleotídica del primer fragmento EcoRI de K1AA0180 humana que se muestra en la Fig. 11.

SEC ID NO:8 es una secuencia aminoacídica generada por ordenador que corresponde con el DNA genómico de C. Elegans y que se muestra en la Fig. 9.

SEC ID NO:9 corresponde a los 61 primeros residuos aminoacídicos del extremo N-terminal de la O-fucosiltransferasa de corazón humano que se muestra en la Fig. 12B.

SEC ID NO:10 es la secuencia nucleotídica de la primera sonda utilizada en la hibridación de la transferencia de northern del Ejemplo 1.

SEC ID NO:11 es la secuencia nucleotídica de la segunda sonda utilizada en la hibridación de la transferencia de northern del Ejemplo 1.

SEC ID NO:12 corresponde al primer cebador de PCR utilizado en la amplificación descrita en el Ejemplo 1.

SEC ID NO:13 es la secuencia aminoacídica del extremo N-terminal del polipéptido expresado en las células Sf9 que se muestra en el Ejemplo 1.

SEC ID NO:15 es el dominio del factor EGF expresado derivado de la secuencia primaria utilizada en la generación del ligando análogo del aceptor descrito en el Ejemplo 2.

SEC ID NO:16 corresponde a los 1100 primeros nucleótidos de la O-fucosiltransferasa de corazón humano que se muestra en la Fig. 12A.

SEC ID NO:17 es la secuencia humana parcial publicada de función desconocida de una línea celular de mioblastos.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

Los términos utilizados en esta solicitud han de considerarse con el significado característico para los expertos en la materia. Sin embargo, los solicitantes desean que los términos siguientes tengan la definición particular que se describe más abajo.

La palabra "proteína" o "polipéptido" se utilizará de forma intercambiable. Dichos términos se refieren a las cadenas de dos o más aminoácidos que están unidos gracias a un enlace peptídico, independientemente de las modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la glicosilación o la fosforilación). El término "enzima" también debería considerarse de forma intercambiable con la O-fucosiltransferasa.

El término "esencialmente pura" hace referencia a una O-fucosiltransferasa que ha sido separada de los componentes que acompañan de forma natural la enzima durante su producción. Dicha producción podría ser de fuentes naturales (líneas celulares, tejidos), fuentes recombinantes, o incluso sintéticas como la adición química de aminoácidos por etapas. De forma característica, el polipéptido es esencialmente puro cuando al menos en un 60% en peso está libre de proteínas y otras moléculas orgánicas que se han asociado durante la síntesis. Preferentemente, la preparación de al menos un 75%, más preferentemente al menos un 90%, y todavía más preferentemente al menos un 99% en peso de la O-fucosiltransferasa. Una O-fucosiltransferasa esencialmente pura puede obtenerse mediante extracción de una fuente natural (por ejemplo, células CHO, corazón humano, hígado, músculo, tejido pancreático o tejido derivado de una línea celular), mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido O-fucosiltransferasa, o químicamente mediante la síntesis de la proteína. La pureza puede cuantificarse mediante cualquier procedimiento, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC.

El término "esencialmente idéntico" respecto a la secuencia polipeptídica debe considerarse como un polipéptido que presenta al menos un 70%, preferentemente un 80%, más preferentemente un 90% y todavía más preferentemente un 95% de identidad de secuencia respecto a la secuencia del polipéptido de referencia. El término "respecto a una secuencia de ácido nucleico" debe considerarse como una secuencia de nucleótidos que presentan al menos un 85%, preferentemente un 90%, más preferentemente un 95% y todavía más preferentemente un 97% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia. Para los polipéptidos, la longitud de las secuencias de comparación será de al menos 25 aminoácidos. Para los ácidos nucleicos, la longitud será por lo general de al menos 75 nucleótidos.

El término "identidad" u "homología" debe considerarse como el porcentaje de residuos aminoacídicos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos de una secuencia correspondiente con la cual se compara, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario para lograr el porcentaje máximo de homología para la secuencia completa y sin considerar cualquier sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. Ni las extensiones N- o C-terminales, ni las inserciones deben considerarse reductoras de la identidad o de la homología. Son bien conocidos en la materia los procedimientos y programas informáticos para el alineamiento.

La identidad de secuencia puede cuantificarse mediante la utilización de programas de análisis de secuencias (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, University of Wisconisn Biotechnology Center, 1710 University Ave., Madison, W1 53705). Este programa compara secuencias similares asignando valores de homología a las diversas sustituciones, deleciones u otras modificaciones.

El término "dominio EGF" o "dominio del factor de crecimiento epitelial" se refiere a una sección, región repetida, motivo o unidad estructural de un polipéptido secretado que se caracteriza por la presencia de 6 residuos de cisteína que se espera formen al menos 3 enlaces disulfuro intracatenarios en un patrón 1-3 2-4 y 5-6.

El término "fragmento funcional o análogo" de un polipéptido nativo es un compuesto que tiene actividad biológica cualitativa en común con un polipéptido nativo. En consecuencia, un fragmento funcional o análogo de una O-fucosiltransferasa es un compuesto que tiene una actividad biológica cualitativa en común con la O-fucosiltransferasa, es decir, puede transferir una porción de O-fucosa activada a un aminoácido o cadena de carbohidratos en crecimiento. "Fragmentos funcionales" incluyen, sin limitarse por ello, fragmentos peptídicos del polipéptido nativo de cualquiera de las especies (incluyendo la humana), y los derivados de polipéptidos (humanos y no-humanos) y sus fragmentos, siempre que sean capaces de efectuar una función similar como el polipéptido completo. El término "análogo" significa una secuencia aminoacídica y sus variantes glicosídicas que también comparten una funcionalidad similar con la molécula de O-fucosiltransferasa activa completa.

Los términos "aminoácido" y "aminoácidos" hacen referencia a los L-\alpha-aminoácidos naturales. Los aminoácidos se identifican bien por la denominación de una o de tres letras.

1

Los aminoácidos anteriores pueden clasificarse de acuerdo con la composición química y propiedades de sus cadenas laterales. Se clasifican en dos grandes grupos, los cargados y los no cargados. Cada uno de estos grupos se divide en subgrupos para clasificar los aminoácidos de forma más exacta:

1. Cargados

Residuos acídicos: ácido aspártico, ácido glutámico

Residuos básicos: lisina, arginina e histidina

2. No cargados

Residuos hidrofílicos: serina, treonina, asparraguina, glutamina

Residuos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina

Residuos no polares: cisteína, metionina, prolina

Residuos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano

El término "variante aminoacídica" hace referencia a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias aminoacídicas comparadas con una secuencia aminoacídica nativa.

Las variantes sustitucionales son aquellas que tienen al menos un residuo aminoacídico en una secuencia nativa que ha sido reemplazado por otro distinto. Las sustituciones pueden ser sencillas, donde sólo se ha sustituido un aminoácido, o múltiples, donde se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.

Las variantes insercionales son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición determinada en una secuencia nativa. Inmediatamente adyacente a una aminoácido significa que está conectado con un grupo \alpha-carboxilo o \alpha-amino del aminoácido.

Las variantes delecionales son aquellas en las que se han eliminado uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. Generalmente, las variantes delecionales tendrán uno o más aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.

El término "variante de glicosilación" se utiliza para referirse a una glicoproteína con un perfil de glicosilación distinto del de una pareja nativa o a las variantes glicoproteicas de un polipéptido no glicosilado en su(s) forma(s) nativa(s). Generalmente la glicosilación del polipéptido puede ser N- u O-. N-glicosilación hace referencia a la unión de la porción carbohidrato con la cadena lateral de un residuo de asparraguina. Las secuencias tripeptídicas, asparraguina-X-serina y asparraguina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidratos con la cadena lateral de la asparraguina. La O-glicosilación hace referencia a la unión con uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa, xilosa o fucosa con un hidroxilaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina también pueden estar implicadas en la O-glicosilación.

El término "célula" o "línea celular" y "cultivo celular" se utilizan de forma intercambiable, y todas estas definiciones incluyen la progenie. También se entenderá que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en su contenido de DNA, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. También se incluye l progenie mutante que tiene la misma función o propiedades biológicas, según se analizó en las células originalmente transformadas.

Las "células huésped" utilizadas en la presente invención son generalmente procariotas o eucariotas. Dichas células huésped se describen, por ejemplo, en la patente americana US 5.108.901, publicada el 28 de Abril de 1992. Las procariotas adecuadas incluyen los organismos gram negativo o gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilli. Un huésped de clonaje preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque otros procariotas gram negativos o positivos como E. coli B, E. coli x 1776 (ATCC 31.537), E. coli W3110 (ATCC 27.325). Pseudomonas species, o Serratia Marcessans son adecuadas. Además de los procariotas, microbios eucariotas como los hongos filamentosos y levaduras también son adecuados como vectores de la invención. Saccharomyces cerevisiae o la levadura común del pan, es uno de los eucariotas inferiores más comúnmente utilizados. Sin embargo, también están disponibles otros géneros, especies y cepas y son de utilidad aquí, como los descritos en la patente y las solicitudes de patente citadas anteriormente. Una cepa de levadura preferida para la presente invención es Saccharomyces cerevisiae HF7c (CLONTECH).

Las células huésped adecuadas también pueden derivarse de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar complejos procesos y actividades de glicosilación. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es adecuado, bien sea un cultivo de células de invertebrados como de vertebrados, aunque las células de mamífero como las humanas son las preferidas. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de plantas y de insectos, por ejemplo, Luckow y col., Bio/Technology 6, 47-55 (1988); Miller y col., Genetic Engineering, Setlow y col., eds., vol. 8, pp. 277-279 (Plenam editores 1986); Y Mseda y col., Nature 315, 592-594 (1985). Es bien conocido el interés generado por las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo tisular). Véase Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, eds., (1973). Ejemplos de líneas de células de mamífero de utilidad son la línea de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de células de riñón embrionario humano (293 o las células 293 subclonadas para el crecimiento en suspensión. Granham y col., H. Gen. Virol., 36, 59 (1977);células de riñón de cría de hámster chino 9BHK, (ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 4216 (1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243-251 (1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather y col., Annual N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 (1982); células MRC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Las células huésped preferidas son las células de riñón embrionario humano 293 y las de ovario de hámster chino. Particularmente preferidas para la presente invención es la línea de células de insecto Sf9 así como otra célula huésped adecuada para la expresión en baculovirus. Ausubel, Ch. 16.9-16.11.

El término "transformación" significa la introducción del DNA en un organismo para que el DNA sea replicable, bien como un elemento extracromosómico o mediante integración cromosómica.

El término "unido operativamente" significa que un gen y una(s) secuencia(s) reguladora(s) se conectan de modo tal que se permita la expresión génica cuando las moléculas adecuadas (por ejemplo, las proteínas activadoras transcripcionales) se unen a la(s) secuencia(s) reguladora(s).

La "transfección" hace referencia a la incorporación de un vector de expresión por una célula huésped independientemente de que cualquier secuencia codificante se exprese.

Los términos "célula huésped transfectada" y "transformada" hacen referencia a la introducción del DNA en una célula. La célula se denomina "célula huésped" y puede ser una procariota o una eucariota. Las células huésped procariotas incluyen diversas cepas de E. coli. Las células huésped eucariotas típicas son las de mamífero, como las células de ovario de hámster chino o las de origen humano. La secuencia de DNA introducida puede proceder de la misma especie como la célula huésped o de una especie distinta de la célula huésped, o puede ser una secuencia de DNA híbrida, que contenga DNA foráneo y DNA homólogo.

Los términos "vector de expresión replicable" y "vector de expresión" hacen referencia a un fragmento de DNA, generalmente de cadena doble, que puede estar insertado en un fragmento de DNA foráneo. El DNA foráneo se define como un DNA heterólogo, que es un DNA que no se halla de forma natural en la célula huésped. El vector se utiliza para transportar el DNA foráneo o el heterólogo en una célula huésped adecuada. Una vez dentro de la célula, el vector puede replicarse independientemente del DNA cromosómico del huésped, y pueden generarse diversas copias del vector y del DNA insertado (foráneo).

El término "vector" hace referencia a una construcción de DNA que contiene una secuencia de DNA que está operativamente unida a una secuencia control adecuada capaz de expresar el DNA en una célula huésped adecuada. Dichas secuencias control incluyen un promotor para la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión adecuada al ribosoma del mRNA y secuencias que controlan la finalización de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fagos, o simplemente un inserto genómico potencial. Una vez transformado en un huésped adecuado, el vector puede replicarse y funcionar de forma independiente del genoma del huésped, o puede en algunos casos, integrarse en el propio genoma. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" se utilizan a veces de forma intercambiable, ya que plásmido es la forma más comúnmente utilizada de vector hasta el momento. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores con funciones equivalentes y que son conocidos en la materia. Los vectores de expresión preferidos para la expresión en el cultivo de células de mamífero se basan en pRK5 (patente europea EP 307.247, Rothe y col., Cell, supra), pSV16B (patente internacional WO 91/08291) y pVL1392 (Pharmigen).

I. Identificación y purificación de la O-fucosiltransferasa

La O-fucosiltransferasa nativa puede, por ejemplo, identificarse y purificarse a partir de ciertos tejidos que posean el mRNA de la O-fucosiltransferasa y que lo expresen a un nivel detectable. La O-fucosiltransferasa, por ejemplo, puede obtenerse del mRNA de hígado de rata (véase Sadler y col., Methods Enzymol 83, 458-514 (1982) para el procedimiento). La O-fucosiltransferasa humana, por ejemplo, puede prepararse de acuerdo con la presente invención a partir de corazón, músculo, riñón y páncreas (Véase la Fig. 10). Adicionalmente, las O-fucosiltransferasas nativas pueden identificarse y purificarse a partir de tejidos que expresen su mRNA, basándose en la presencia de O-fucosa en las proteínas expresadas a partir de dicha fuente de tejido.

El lisado celular se prepara mediante cualquier técnica utilizada comúnmente en la materia. Por ejemplo, la sonicación en tampón acuoso de NaCl e imidazol, seguido de centrifugación. El sobrenadante puede entonces aplicarse a una serie de columnas de afinidad, dependiendo del nivel de pureza deseado. Inicialmente, se halló que una columna de intercambio aniónico seguido de una resina de unión a nucleótidos era efectivo. Mientras que cualquier resina de intercambio aniónico utilizada comúnmente en la materia es adecuada, la DE-52 (Whatman) es la preferida. Las resinas de unión a nucleótidos adecuadas son fácilmente evidentes para los expertos en la materia, sin embargo, las preferidas para utilizar con la presente invención son las resinas de colorantes, como el Cibacron Blue 3GA. Particularmente preferida es el AffiGel Blue (BioRad). Mientras que cierta actividad O-fucosiltransferasa se obtiene después de estas etapas iniciales de purificación, para obtener una mayor actividad, es posible realizar etapas de cromatografía adicionales en donde las columnas de afinidad deberían aplicarse secuencialmente y en donde el sustrato aceptor y los análogos del sustrato donante para la O-fucosiltransferasa se han asociado con una resina de afinidad. El análogo del sustrato donante puede ser cualquier comúnmente utilizado en la purificación de las O-fucosiltransferasas. Por ejemplo, las GDP-hexanolamina asociada con la Sepharose 4B o cualquier otra resina de agarosa adecuada. Beyer y col., J. Biol. Chem. 255 (11), 5364-5372 (1980).

El ligando del aceptor se prepara mediante primero identificación de un dominio polipeptídico que contenga una fucosa O-glicosilada y posteriormente se aplican técnicas de clonaje comúnmente utilizadas para amplificar, y luego purificar el producto expresado. Técnicas particulares que pueden utilizarse para la expresión recombinante son similares a las expuestas para la expresión de la O-fucosiltransferasa, infra. Un ligando de especial utilidad puede generarse a partir del primer dominio EGF del factor VII humano. Se halló que cuando una diana de polihistidinas, que se localiza típicamente entre el péptido señal y el ligando expresado, se coloca en el extremo C-terminal, se incrementa la unión entre el ligando y la resina de afinidad.

Las resinas de afinidad preferidas para la utilización con el ligando del sustrato aceptor son resinas quelantes de metales o IMAC (cromatografía de afinidad por metales inmovilizados) asociada con agarosa. La utilización de resinas quelantes permite la unión del ligando de EGF con la resina en una orientación definida, de acuerdo con la posición de la secuencia de polihistidina. Tal como se mencionó anteriormente, se halló que la unión ligando-resina se incrementaba cuando se insertaba la diana de polihistidinas en el extremo C-terminal, en lugar del extremo N-terminal del inserto de cDNA. Es posible eluir la proteína junto con el ligando en condiciones muy suaves, como imidazol o EDTA. El acoplamiento del EGF recombinante con agarosa- resina de afinidad de metales es muy simple y rápido, y se lleva a cabo preferentemente mezclando la resina y el ligando en tampón Tris. Es además posible utilizar el EGF recombinante sin la purificación inicial sobre una columna de níquel. Ejemplos de resinas de afinidad a metales son las resinas IMAC como Ni^{2+}-NTA (NitroTriacético-Ácido de Qiagen), y las resinas de ligandos de metal asociadas con ácido iminodiacético (Pharmacia).

II. Producción recombinante de O-fucosiltransferasa

Preferentemente, los polipéptidos de O-fucosiltransferasa de la presente invención, se preparan mediante procedimientos de recombinación estándares mediante el cultivo de células transfectadas para expresar el ácido nucleico de la O-fucosiltransferasa. Un procedimiento estándar típico se realiza mediante la transformación de las células con un vector de expresión y la recuperación del polipéptido a partir de las células. Sin embargo, se prevé que los polipéptidos de O-fucosiltransferasas puedan producirse mediante recombinación homóloga, o mediante procedimientos recombinantes utilizando elementos control introducidos en las células que ya contienen el DNA que codifica una O-fucosiltransferasa. Por ejemplo, un promotor/elemento intensificador, un supresor, o un elemento modulador de la transcripción exógeno pueden insertarse en el genoma de la célula huésped a proximidad de una orientación suficiente como para influenciar la transcripción del DNA que codifica el polipéptido de la O-fucosiltransferasa deseado. El elemento control no codifica la O-fucosiltransferasa, sino que es el propio DNA del genoma de la célula huésped. A continuación, las células pueden cribarse por su producción de polipéptido de la presente invención, o por los niveles disminuidos de expresión, según se desee. Las técnicas generales de la tecnología del DNA recombinante se describen, por ejemplo, en Sambrook y col., Molecular Cloning: A laboratory Manua, Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., USA (1995).

En consecuencia, la invención contempla un procedimiento para la producción de una O-fucosiltransferasa que comprende la inserción en el genoma de una célula que contiene el ácido nucleico que codifica un polipéptido de O-fucosiltransferasa, un elemento modulador de la transcripción en proximidad suficiente y orientación con la molécula de ácido nucleico como para influenciar la transcripción, con una etapa opcional de cultivo de células que contienen el elemento modulador de la transcripción y la molécula de ácido nucleico. La invención también contempla una célula huésped que contiene el nucleótido codificante del polipéptido de O-fucosiltransferasa autóctono unido operativamente a una secuencia control exógena reconocida por la célula huésped.

A. Aislamiento del DNA que codifica las O-fucosiltransferasas

Para los propósitos de la presente invención, el DNA que codifica un polipéptido de O-fucosiltransferasa puede obtenerse de librerías de cDNA preparadas a partir de tejidos que supuestamente contienen un mRNA codificante del polipéptido glicosilado con O-fucosa y que expresen dicho polipéptido a un nivel detectable. Por ejemplo, una librería de cDNA puede construirse mediante la obtención de mRNA poliadenilado a partir de una línea celular conocida por expresar los polipéptidos glicosilados en O-fucosa que porten el dominio EGF, y utilizar el mRNA como un molde para sintetizar el cDNA de cadena doble. Las líneas celulares no humanas adecuadas para este propósito se han listado más arriba bajo la descripción de "células huésped".

Las librerías, ya sean de cDNA o genómicas, se criban con sondas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por éste. Para las librerías de expresión de cDNAs, las sondas adecuadas incluyen sondas oligonucleotídicas seleccionadas cuidadosamente (generalmente de aproximadamente 20-80 pares de bases) que codifican porciones conocidas o posibles de polipéptidos de O-fucosiltransferasa de la misma o distinta especie, y/o cDNAs complementarios u homólogos o fragmentos de los mismo que codifican el mismo gen o uno similar. Sondas adecuadas para el cribado de librerías de DNA genómicas incluyen, sin limitación, oligonucleótidos, cDNAs, o fragmentos de lo mismo que codifican el mismo gen o uno similar, y/o DNAs o fragmentos de lo mismo. El cribado de una librería de cDNAs o genómica con la sonda seleccionada puede conducirse utilizando procedimientos estándares tal como se describe en los capítulos 10-12 de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1989); y en el Capítulo 6 de Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, USA (1995).

Un procedimiento preferido para la práctica de la invención es la utilización de secuencias oligonucleotídicas seleccionadas cuidadosamente para cribar librerías de cDNA de tejidos diversos. Las secuencias oligonucleotídicas deberían tener una longitud suficiente y ser poco ambiguas para minimizar falsos positivos. La(s) secuencia(s) nucleotídica(s) se diseña(n) basándose en las regiones de O-fucosiltransferasas que tienen la mínima redundancia de codones. Los oligonucleótidos pueden generarse (es decir, es una mezcla posibles codones para un aminoácido(s) dado(s) en una o más posiciones. La utilización de oligonucleótidos degenerados es de particular importancia si una librería se criba a partir de una especie en la que no se conoce la utilización de un codón preferencial.

El oligonucleótido debe estar marcado de modo que pueda detectarse tras hibridación con el DNA en la librería que se criba. El procedimiento preferido de marcaje es utilizar ATP (por ejemplo \gamma^{32}P) y la polinucleótido quinasa para marcar el extremo 5' del oligonucleótido. Sin embargo, otros procedimientos pueden utilizarse para marcar el oligonucleótido, incluyendo, pero sin limitarse a, el marcaje por biotinilación o enzimático.

Los cDNAs que codifican las O-fucosiltransferasas también pueden ser identificados y aislados mediante técnicas conocidas de la tecnología del DNA recombinante, como el clonaje de expresión dirigida o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) tal como se describe en la patente US 4.683.195, publicada el 28 de Julio de 1987, en la sección 14 de Sambrook y col., supra, o en el capítulo 15 de Ausubel y col., supra. Este procedimiento requiere la utilización de sondas oligonucleotídicas que hibridarán con el DNA que codifica la O-fucosiltransferasa.

Una vez que se ha aislado el cDNA que codifica una O-fucosiltransferasa de una especie, también pueden obtenerse los cDNAs de otras especies mediante hibridación cruzada de especies. De acuerdo con esta aproximación, las librerías de cDNA o genómicas humanas o de otro mamífero se hibridan con secuencias oligonucleotídicas marcadas seleccionadas a partir de secuencias de O-fucosiltransferasas conocidas (como de corazón humano o CHO) de acuerdo con criterios conocidos, incluyendo que la secuencia debería tener una longitud suficiente y ser suficientemente no ambigua para minimizar los falsos positivos. De forma característica, es suficiente un oligonucléotido marcado con P32 que tenga unas 30-50 bses, en particular si el oligonucleótido contiene uno o más codones para la metionina o el triptófano. El ácido nucleico será DNA que se identifica y separa a partir de ácido nucleico que codifica otros polipéptidos a partir de la fuente de ácido nucleico.

Una vez la secuencia es conocida, el gen que codifica un polipéptido O-fucosiltransferasa determinado también puede obtenerse mediante síntesis química, según técnicas conocidas. Por ejemplo, Engles y Uhlmann, Agnew, Chem Int. Ed. Engl. 28, 716 (1989). Estos procedimientos incluyen los procedimientos del triéster, fosforamididta y el H-fosforato, la PCR y otros procedimientos de autocebado, y la síntesis de oligonucleótidos en soportes sólidos.

B. Variantes de secuencia aminoacídica de una proteína O-fucosiltransferasa nativa o de un fragmento de la misma

Las variantes de secuencia de las O-fucosiltransferasas nativas y de los fragmentos funcionales se prepararon mediante procedimientos conocidos en la materia introduciendo cambios nucleotídicos apropiados en una O-fucosiltransferasa nativa o variante, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Existen dos variables principales en la construcción de las variantes de secuencia aminoacídica: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Con la excepción de los alelos que ocurren de forma natural, que no requieren la manipulación de la secuencia de DNA que codifica la O-fucosiltransferasa, las variantes de secuencia aminoacídica de la O-fucosiltransferasa se construyeron preferentemente mediante mutación del DNA, bien para llegar a un alelo nativo o a una variante de secuencia aminoacídica que no se presenta en la naturaleza.

Las alteraciones aminoacídicas pueden realizarse en sitios que difieren en las O-fucosiltransferasas de varias especies, o en regiones altamente conservadas, dependiendo de los objetivos logrados. Por ejemplo, las mutaciones que resultan en una enzima con mayor afinidad para el dominio EGF de polipéptidos serían de utilidad como inhibidores de la O-fucosiltransferasa natural. Además, dichas variantes también serían de utilidad en el diagnóstico de patologías asociadas con la sobreexpresión de la O-fucosiltransferasa. Además, se espera que inhibidores de la O-fucosiltransferasa sean útiles en el tratamiento de patologías asociadas con proteínas o factores que tienen su eficacia determinada al menos en parte por la presencia de la O-fucosa.

Los sitios de mutación se modificarán de forma característica en series, por ejemplo mediante (1) sustituyendo primero con elecciones conservadas y luego con selecciones más radicales dependiendo de los resultados logrados, (2) delecionando el residuo diana de los residuos, o (3) insertando los residuos de la misma o distinta clase adyacente al sitio localizado, o combinaciones de las opciones (1)-(3).

Una técnica de gran ayuda es la denominada el "cribado de alaninas" (Cunningham y Wells, Science 244, 1081-1085 (1985). En dicha técnica, un residuo o un grupo de residuos diana se identifica y sustituye por alanina o polialanina. Aquellos dominios que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones por alanina se refinan introduciendo más u otras sustituciones en los sitios de sustitución por alanina.

Después de identificar la(s) mutación(es), el gen que codifica una variante de O-fucosiltransferasa puede por ejemplo, obtenerse mediante síntesis química tal como se describió anteriormente.

Más preferentemente, el DNA que codifica una secuencia variante aminoacídica de O-fucosiltransferasa se prepara mediante mutagénesis dirigida del DNA que codifica una variante preparada más temprano o una versión no variante de la O-fucosiltransferasa. La mutagénesis dirigida permite la producción de variantes de O-fucosiltransferasas gracias a la utilización de secuencias específicas que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, así como de un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una primera secuencia de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de la deleción a abarcar. Típicamente, un cebador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud es el preferido, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que se altera. En general, las técnicas de mutagénesis dirigida es bien conocida en la materia, tal como se ejemplifica por publicaciones como Edelman y col., DNA 2, 183 (1983). Como será evidente, las técnicas de mutagénesis dirigida utilizan típicamente un vector de fago que existe en la forma de cadena sencilla y de doble cadena. Los vectores típicos de utilidad en la mutagénesis dirigida incluyen los vectores como el fago M13, por ejemplo, tal como se describe en Messing y col., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, A. Walton. Ed., Elsevier, Amsterdam (1981). Este y otros vectores de fagos están disponibles comercialmente y su utilización es bien conocida por los expertos en la materia. Un procedimiento versátil y eficiente para la construcción de mutaciones dirigidas por oligonucleótidos en fragmentos de DNA utilizando el fago M13 se publicó por Zoller, MJ y Smith, M. Nucleic Acids Res, 10, 6487-6500 (1982). También, los vectores plasmídicos que contienen un origen de replicación del fago de cadena sencilla, Veira y col., Meth. Enzymol. 153, 3 (1987) pueden utilizarse para obtener DNA de cadena sencilla. Alternativamente, las sustituciones de nucleótidos se introducen mediante síntesis del fragmento de DNA adecuado in vitro y amplificación mediante procedimientos de PCR conocidos en la materia.

Por lo general, la mutagénesis dirigida de sitio específico se realiza mediante en primer lugar la obtención de un vector de cadena sencilla que incluye en su secuencia una secuencia de DNA que codifica la proteína relevante. Se prepara un cebador oligonucleotídico, que porta la secuencia mutada deseada, generalmente de forma sintética mediante, por ejemplo, el procedimiento de Crea y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765 (1978). Este cebador se anilla a continuación con la secuencia de proteína de cadena sencilla que contiene el vector y se somete a enzimas polimerizantes del DNA como el fragmento Klenow de la polimerasa 1 de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. En consecuencia, se forma un heterodúplex en donde una de las cadenas codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena porta la mutación deseada. Este vector heterodúplex se utiliza a continuación para transformar las células huésped como las células JP101 y se seleccionan los clones que incluyen los vectores recombinantes que portan la reordenación de la secuencia mutada. Luego, la región mutada puede extraerse y colocarse en un vector de expresión adecuado para la producción de proteína.

La técnica de la PCR también puede utilizarse para crear variantes de secuencia aminoacídica de una O-fucosiltransferasa. Cuando pequeñas cantidades de DNA molde se utilizan como material de partida en una PCR, los cebadores que difieren ligeramente en la secuencia de la región correspondiente en un DNA molde pueden utilizarse para generar cantidades relativamente grandes de un fragmento de DNA específico que difiere de la secuencia del molde sólo en las posiciones en donde los cebadores difieren del molde. Para la introducción de una mutación en un DNA plasmídico, uno de los cebadores se diseña para solapar la posición de la mutación y para contener la mutación; la secuencia del otro cebador debe ser idéntica a un fragmento de la secuencia de la cadena opuesta del plásmido, pero esta secuencia puede localizarse en cualquier sitio en el DNA plasmídico. Es preferible, sin embargo, que la secuencia del segundo cebador se localice en los 200 nucleótidos desde el primero, de modo que en el extremo toda la región amplificada de DNA unido por los cebadores pueda secuenciarse fácilmente. La amplificación por PCR utilizando una pareja de cebadores como la descrita resulta en una población de fragmentos de DNA que difieren en la posición de la mutación especificada por el cebador, y posiblemente en otras posiciones, ya que en el copiado del molde se pueden cometer errores.

Si el cociente del molde respecto al material del producto es extremadamente bajo, la gran mayoría de fragmentos de DNA incorporan la(s) mutación(es) deseada(s). Este material se utiliza para reemplazar la región correspondiente en el plásmido que sirve como molde de PCR utilizando tecnología del DNA estándar. Las mutaciones en posiciones separadas pueden introducirse simultáneamente bien utilizando un segundo cebador mutante o realizando una segunda PCR con cebadores mutantes distintos y ligando los dos fragmentos de PCR resultantes con el fragmento del vector en una ligación de tres (o más) etapas.

En un ejemplo específico de mutagénesis por PCR, el DNA plasmídico del molde (1 \mug) se lineariza mediante digestión con una endonucleasa de restricción que tiene una única diana de restricción en el DNA plasmídico fuera de la región a amplificar. De este material, se añaden 100 ng a una mezcla de PCR que contiene tampón de PCR, el cual contiene los 4 desoxinucleótidos trifosfato y se incluye en los equipos GeneAmp® (obtenidos de Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emeryville, CA) y 25 pmoles de cada cebador oligonucleotídico, a un volumen final de 50 \mul. La mezcla de reacción se cubre con 35 \mul de aceite mineral. La reacción se desnaturaliza durante 5 minutos a 100ºC, se coloca rápidamente en hielo y se añade 1 \mul de DNA polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (5 unidades/\mul de Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT y Emryvill, CA) a través del aceite mineral. La mezcla de reacción se inserta en un Termociclador de DNA (también obtenido de Cetus) y se programa de la forma siguiente:

2 min, 55ºC

30 s, 72ºC, luego 19 ciclos de:

3º s, 94ºC

30 s, 72ºC.

Al término del programa, el vial de reacción se retira del termociclador y la fase acuosa se transfiere a un nuevo vial, se extrae con fenol/cloroformo (50:50 vol), y se precipita con etanol, y se recupera el DNA mediante procedimientos estándares. Este material se somete a continuación a tratamientos adecuados para la inserción en un vector.

Otro procedimiento para preparar variantes, la mutagénesis en casete, se basa en la técnica descrita por Wells y col., Gene 34, 315 (1985). El material de partida es el plásmido (o vector) que comprende el DNA de la O-fucosiltransferasa a mutar. Se identifican el/los codón/codones de la O-fucosiltransferasa a mutar. Debe existir una única diana de restricción en cada lado de la(s) diana(s) de mutación identificada(s). Si no existieran dichas dianas, pueden generarse utilizando el procedimiento de mutagénesis mediada por oligonucleótidos descrito anteriormente para introducir dichas dianas en las localizaciones adecuadas en el DNA de la O-fucosiltransferasa. Después de haber introducido las dianas de restricción en el plásmido, éste se corta por las dianas para linearizarlo. Un oligonucleótido de doble cadena que codifica una secuencia del DNA entre la diana de restricción pero que contiene la mutación(mutaciones) deseada(s) se sintetiza utilizando procedimientos estándares. Las dos cadenas se sintetizan de forma separadamente y luego hibridan juntas utilizando técnicas estándares. Este oligonucleótido de doble cadena es denominado el casete. Este casete se diseña para tener extremos 3' y 5' que son compatibles con los extremos del plásmido linearizado, de modo que puede ligarse directamente al plásmido. Este plásmido contiene ahora una secuencia del DNA de la O-fucosiltransferasa.

Otros detalles de las técnicas de mutagénesis anteriores y similares se hallan en los libros de texto de Biología Molecular, por ejemplo, Sambrook y col., supra, y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, y col., supra.

Las sustituciones de residuos aminoacídicos particulares basadas en propiedades comunes de las cadenas laterales también se hallan dentro del ámbito de la invención. Los aminoácidos que ocurren de forma natural se dividen en grupos según las propiedades de sus cadenas laterales:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrofóbicos neutros: cys, ser, thr;

(3) acídicos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influencian la orientación de la cadena: gly, pro y

(6) aromáticos: trp, tyr, phe

Las sustituciones conservadas implican el intercambio de un miembro de un grupo por otro miembro en el mismo grupo, mientras que las sustituciones no conservadas implican el intercambio de un miembro de uno de estas clases por otro. Las variantes obtenidas por sustituciones no conservadas se espera que den como resultado cambios significativos en las propiedades/funciones biológicas de la variante obtenida, y pueden resultar en una O-fucosiltransferasa no funcional. Las posiciones que están conservadas entre las diversas especies se sustituyen por lo general de forma conservada si el objetivo es retener la función biológica.

Las deleciones de secuencia aminoacídica de aproximadamente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente de aproximadamente 1 a 10 residuos, y típicamente son contiguas. Las deleciones, pueden introducirse en regiones no implicadas directamente en el dominio catalítico.

Las inserciones aminoacídicas incluyen las fusiones amino y/o carboxilo terminales con una longitud que va desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cientos o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoacídicos sencillos o múltiples. Las inserciones intrasecuencia (es decir, las inserciones dentro de la secuencia aminoacídica de l O-fucosiltransferasa) pueden variar desde aproximadamente 1 a 10 residuos, más preferentemente de 1 a 5 residuos, más preferentemente de 1 a 3 residuos. Ejemplos de inserciones terminales incluyen los polipéptidos de la O-fucosiltransferasa con un residuo metionil N-terminal, un artefacto de su expresión directa en el cultivo de células recombinantes de bacterias, y la fusión de una secuencia señal N-terminal heteróloga con el extremo N-terminal de la molécula de O-fucosiltransferasa para facilitar la secreción de la O-fucosiltransferasa madura de las células huésped recombinantes. Dichas secuencias señal se obtendrán por lo general de especies de células huésped homólogas. Secuencias adecuadas incluyen STII o Ipp para E. coli, el factor alfa de levaduras y las secuencias señal virales como gD de herpes para las células de mamífero.

Ya que a menudo es difícil de predecir con anterioridad las características de una variante de O-fucosiltransferasa, es evidente que será necesario algún tipo de cribado para seleccionar la variante óptima.

C. Inserción del DNA en el vehículo de clonaje

Una vez que el ácido nucleico que codifica una O-fucosiltransferasa variante o nativa está disponible, se liga generalmente en un vector de expresión replicable para su posterior clonaje (amplificación del DNA), o para su expresión.

Los vectores de expresión y clonaje son bien conocidos en la materia y contienen una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. La selección del vector apropiado dependerá de 1) si el vector se ha de utilizar para la amplificación del DNA o para la expresión, 2) el tamaño del DNA a insertar en el vector, y 3) de la célula huésped a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación del DNA o expresión del DNA) y la célula huésped para la cual es compatible. Los componentes del vector incluyen por lo general, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más marcadores génicos, un intensificador, un promotor, y una secuencia de finalización de la transcripción.

(1) Componente secuencia señal

En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de la molécula de la O-fucosiltransferasa que se inserta en el vector. Si la secuencia señal es heteróloga, debería seleccionarse de modo que sea reconocida y procesada (es decir, cortada por una peptidasa señal) por la célula huésped.

Dado que la O-fucosiltransferasa es del tipo proteína de unión a membrana, posee seguramente una secuencia señal. Puede utilizarse esta secuencia señal nativa o puede elegirse otra. Las secuencias señal heterólogas adecuadas para las células huésped procariotas son las secuencias señal procariotas como la fosfatasa alcalina la penicilinasa, lpp, o los líderes de la entorotoxina estable al calor. Para la secreción en levaduras, pueden utilizarse la invertasa de levaduras, el factor alfa, o los líderes de la fosfatasa ácida. En la expresión de células de mamífero, las secuencias señal de mamífero son las adecuadas.

(2) Componente origen de replicación

Tanto el vector de expresión como el clonaje contienen un ácido nucleico que permite al vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Por lo general, en los vectores de clonaje esta secuencia es una que permite al vector replicarse independientemente de los cromosomas del huésped, e incluye los orígenes de replicación o las secuencias de replicación autónomas. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido conocido pBR322 es adecuado para la gran mayoría de bacterias gram negativas, el origen del plásmido 2 \mu para levaduras y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV, BPV) son útiles para los vectores de clonaje en células de mamífero. Los orígenes de replicación no son necesarios para los vectores de expresión de mamíferos (el origen de SV40 puede utilizarse típicamente sólo porque contiene el promotor temprano). Muchos de los vectores son vectores "lanzadera", es decir, son capaces de replicarse en al menos una clase de organismo pero pueden transfectarse en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. coli y luego el mismo vector se transforma en levaduras o células de mamífero para la expresión incluso si no es capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA también se clona por inserción en el genoma del huésped. Esto se logra con especies de Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que es complementaria a una secuencia hallada en e DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector resulta en la recombinación homóloga con el genoma y la inserción del DNA que codifica el polipéptido heterólogo deseado. Sin embargo, la recuperación del DNA genómico es más compleja que la de un vector replicado exógenamente porque se requiere la digestión con enzimas de restricción para excisar la molécula del polipéptido codificado.

(3) Selección del componente génico

Los vectores de expresión y clonaje deberían contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Este es un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de la célula huésped transformada con el vector. La presencia de este gen asegura que cualquier célula huésped que delecione el vector no obtendrá una ventaja en el crecimiento o la reproducción sobre los huéspedes transformados. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, la ampicilina, la neomicina, el metrotexato o la tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa de bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para parar el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que se transforman satisfactoriamente con un gen heterólogo expresan una proteína que confiere resistencia a fármacos y por ello sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de dicha selección dominante utilizan fármacos como la neomicina, Southern y col., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327 (1982), el ácido micofenólico, Mulligan y col., Science 209, 1422 (1980), o la higromicina, Sudgen y col., Mol. Cel. Biol. 5, 410-413 (1985). Los tres ejemplos proporcionados anteriormente utilizan genes bacterianos bajo el control eucariota para convertir la resistencia a un fármaco adecuado G418 o la neomicina (geneticin), xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Otros ejemplos de marcadores adecuados para las células de mamífero son la dihidrofolato reductasa (DHFR) o la timidina quinasa. Dichos marcadores permiten la identificación de células que eran competentes para incorporar el ácido nucleico deseado. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección de modo que sólo los transformantes se han adaptado a sobrevivir gracias a la incorporación del marcador. La presión de selección se impone mediante cultivo de los transformantes en condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se ha cambiado satisfactoriamente, conduciendo a la amplificación del gen de selección y del DNA que codifica el polipéptido deseado. La amplificación es el proceso por el cual los genes en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento están repetidos en tándem dentro del cromosoma de generaciones sucesivas de células recombinantes. Cantidades aumentadas del polipéptido deseado se sintetizan a partir del DNA amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identificaron en primer lugar mediante cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que carece de hipoxantina, glicina y timidina. Una célula huésped adecuada en este caso es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada tal como se describió por Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980). Un DHFR de utilidad particular es un mutante DHFR que es altamente resistente al MTX (patente europea EP 117.060). Este agente de selección puede utilizarse con cualquier huésped adecuado, por ejemplo, ATCC no. CCL61 CHO-K1, a pesar de la presencia del DNHFR endógeno. El DNA que codifica el DHFR y el polipéptido deseado, respectivamente, se amplificaron mediante exposición a un agente (metrotexato, o MTX) que inactivan el DHFR. Se asegura así que la célula requiera más DHFR (y consiguientemente amplifique todo el DNA exógeno) mediante selección de únicamente las células que crecen en tandas sucesivas de una concentración de MTX cada vez mayor. Alternativamente, los huéspedes co-transformados con genes que codifican el polipéptido deseado, DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionable como el gen neo pueden identificarse utilizando un agente de selección para el marcador seleccionable como el G418 y luego seleccionarse y amplificarse con metrotexato en un huésped de tipo salvaje que contiene el DHFR endógeno (véase la patente americana US 4.965.199).

Un gen de selección adecuado para utilizar en levaduras es el gen trp1 presente en el plásmido de levaduras YRp7 (Stinchcomb y col.., 1979, Nature 282:39; Kingsman y col., 1979, Gene 7:141; o Tschemper y col., 1980, Gene 10:157). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura carente de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No.44086 o PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). La presencia de la lesión trp1 en el genoma de células huésped de levaduras proporciona un entorno efectivo para detectar la transformación mediante el crecimiento en ausencia de triptófano. De modo similar, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) se complementan por plásmidos conocidos que portan el gen Leu2.

(4) Componente promotor

Los vectores de expresión, a diferencia de los vectores de clonaje, deberían contener un promotor que sea reconocido por el organismo huésped y esté unido operativamente con el ácido nucleico que codifica el polipéptido deseado. Los promotores son secuencias no traducidas localizadas cadena arriba del codón de inicio de un gen estructural (generalmente de 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción y la traducción del ácido nucleico bajo su control. Típicamente se agrupan en dos clases, los inducibles y los constitutivos. Los promotores inducibles son promotores que inician niveles aumentados de transcripción a partir del DNA bajo el control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Actualmente, se conoce un gran número de promotores reconocidos por diversas células huésped potenciales. Estos promotores están unidos operativamente al DNA que codifica el polipéptido deseado al eliminarlo de su gen de origen por digestión con enzimas de digestión, seguido por una inserción 5' al codón de inicio para el polipéptido a expresar. No debe interpretarse como que el promotor genómico para un polipéptido de la O-fucosiltransferasa no sea utilizable. Sin embargo, los promotores heterólogos darán como resultado por lo general una transcripción mayor y rendimientos superiores en la O-fucosiltransferasa expresada comparada con los promotores de la O-fucosiltransferasa nativa.

Los promotores adecuados para utilizar con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa (Chang y col., Nature 275:615 (1978); y Goeddel y col., Nature 281:544 (1979)), la fosfatasa alcalina, un sistema de promotor del triptófano (Goeddel, Nucleic Acids Res, 8:4057 (1980)) y al EPO 36.776) y los promotores híbridos como el promotor tac (H. de Boer y col.,Proc Natl Acad Sci USA 80:21-25 (1983)). Sin embargo, otros promotores de bacterias conocidos son adecuados. Sus secuencias nucleotídicas se han publicado, facilitando así a los expertos en la materia la posibilidad de ligarlos con el DNA que codifica la O-fucosiltransferasa (Siebenlist y col., Cell 20:269 (1980)) utilizando engarces o adaptadores para añadir cualquier diana de restricción que se requiera. Los promotores para utilizar en sistemas de bacterias también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente con el DNA que codifica una O-fucosiltransferasa.

Las secuencias promotoras adecuadas para utilizar con los huéspedes de levadura incluyen los promotores de la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzym Reg. 7:149 (1978); y Holland, Biochemistry 17:4900 (1979)), como la enolasa, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, la hexoquinasa, la piruvato descarboxilasa, la fosfo-fructoquinasa, la glucosa 6-fosfato isomerasa, la 3-fosfoglicerato mutasa, la piruvato quinasa, la triosafosfato isomerasa, la fosfoglucosa isomerasa y la glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son inducibles presentan la ventaja adicional de tener una transcripción controlada por las condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, la isocitocromo C, la fosfatasa ácida, las enzimas de degradación asociada con el metabolismo del nitrógeno, la metalotioneina, la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la expresión de levaduras se describen además en R. Hitzeman y col., patente europea EP 73.657A. Los intensificadores de levaduras también se utilizan ventajosamente con los promotores de levaduras.

Las secuencias promotoras de eucariotas son conocidas. En principio, todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada a aproximadamente 25 a 30 bases cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción. Otra secuencia que se localiza a aproximadamente 70-80 bases cadena arriba del inicio de transcripción de muchos genes es la CXCAAT, en donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de muchos genes eucariotas existe una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan de forma adecuada en vectores de expresión de mamíferos.

La transcripción de la O-fucosiltransferasa a partir de vectores en células de huésped de mamífero puede estar controlada por promotores obtenidos de genomas de virus como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente UK 2.211.504, publicada el 5 de Julio de 1989), los adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y la más preferentemente el Virus del Simio 40 (DV40), de promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o el promotor de la inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, y del promotor normalmente asociado con la secuencia de la O-fucosiltransferasa, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores temprano y tardío del virus SV40 se obtienen de forma adecuada como un fragmento de restricción de SV40 que contiene el origen viral de replicación de SV40 [Fiers y col., Nature 273:113 (1978), Mulligan y Berg, Science 209, 1422-1427 (1980); Pavlakis y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7398-7402 (1981)]. El promotor inmediato temprano del citomegalovirus humano se obtiene de forma adecuada como un fragmento de restricción HindIII [Greenaway y col., Gene 18:335-360 (1982)]. Un sistema para la expresión del DNA en huéspedes mamíferos que utiliza el virus del papiloma bovino como vector es el descrito en la patente americana US 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente americana 4.601.978. Véase también, Grya y col., Nature 295. 503-508 (1982) sobre la expresión del cDNA que codifica el interferón inmune humano en células de mono; Reyes y col., Nature 297, 598-601 81982) sobre la expresión del cDNA del interferón \beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus herpes simplex; Canaani y Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166-5170 (1982) sobre la expresión del gen del interferón \beta1 humano en células de ratón y conejo cultivadas; y Gorman y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777-6781 (1982) sobre la expresión de secuencias CAT bacterianas en células de mono CV-1, fibroblastos de embrión de pollo, células de ovario de hámster chino, células HeLa, y células NIH-3T3 de ratón utilizando la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor.

(5) Componente de elemento intensificador

La transcripción de un DNA que codifica las O-fucosiltransferasas de la presente invención por eucariotas superiores se incrementa a menudo mediante la inserción de una secuencia intensificadora en el vector. Los elementos intensificadores del DNA que actúan en cis son aproximadamente de unas 10 a 300 pb, y ejercen su acción sobre el promotor para aumentar su transcripción. Los intensificadores tienen una orientación y posición relativamente independiente y se han hallado en el extremo 5' [Laimins y col., Proc Natl Acad Sci USA 78. 993 (1981)] y en el 3' [Lasky y col., Mol Cell Biol 3, 1108 (1983)] de la unidad de transcripción, dentro de un intrón [Banerji y col., Cell 33, 729 (1983)] así como dentro de la propia secuencia [Osborne y col., Mol. Cel. Biol. 4 1293 (1984)]. Se conocen muchas de las secuencias intensificadoras de los genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, \alpha-fetoproteína e insulina). Típicamente, sin embargo, se utilizará un intensificador de un virus de célula eucariota. Ejemplos incluyen el intensificador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado temprano del origen de replicación, y los intensificadores de adenovirus. Véase también, Yaniv, Nature 297, 17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de promotores eucariotas. El intensificador puede ayustarse en el vector en una posición 5' o 3' respecto al DNA de la O-fucosiltransferasa, pero preferentemente se localiza en un sitio 5' del promotor.

(6) Componente de finalización de la transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y para la estabilización del mRNA. Dichas secuencias están disponibles generalmente de las regiones 5' no traducidas y, ocasionalmente también de las regiones 3' no traducidas de DNAs o cDNAs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica la O-fucosiltransferasa. Las regiones 3' no traducidas también incluyen los sitios de finalización de la transcripción.

La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de uno de los componentes listados más arriba, las secuencias codificantes y control deseadas, utiliza técnicas de ligación estándares. Los plásmidos aislados o los fragmentos del DNA se cortan, se generan extremos romos y se religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para confirmar que las secuencias son correctas en los plásmidos construidos, se utilizan mezclas de ligación para transformar la cepa de E. coli K12, 294 (ATCC 31.446) y se seleccionan los transformantes satisfactorios mediante resistencia a ampicilina o tetraciclina. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res 9, 309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).

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De particular utilidad en la práctica de esta invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del DNA que codifica una O-fucosiltransferasa. Por lo general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, dicha célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Los sistemas transitorios, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten la identificación positiva adecuada de los polipéptidos codificados por los DNAs clonados, así como el cribado rápido de dichos polipéptidos por sus propiedades biológicas o fisiológicas. En consecuencia, los sistemas de expresión transitoria son de especial utilidad en la invención para el propósito de identificar análogos y variantes de una O-fucosiltransferasa.

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de los polipéptidos de O-fucosiltransferasas en el cultivo de células de vertebrados se describe en Getting y col., Nature 293 620-625 (1982); Mantel y col., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson y col., patente europea 117.058. Un plásmido de especial utilidad para la expresión en cultivo de células de mamífero de los polipéptidos de O-fucosiltransferasa es el pRK5 (patente europea EP 307.247). Especialmente preferidos son los sistemas de expresión de baculovirus tal como se describen en Ausubel Cap. 16.9-16.11, supra, en particular, pVL1392 (Pharmigen).

(7) Construcción y análisis de vectores

La construcción de vectores adecuados que contengan uno o más de los componentes listados anteriormente utiliza técnicas estándares de ligación. Los plásmidos aislados o los fragmentos de DNA se cortan, se generan extremos romos y religan en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos.

Para confirmar que las secuencias son correctas en los plásmidos construidos, se utilizan mezclas de ligación para transformar la cepa de E. coli K12, 294 (ATCC 31.446) y se seleccionan los transformantes satisfactorios mediante resistencia a ampicilina o tetraciclina. Los plásmidos de los transformantes se preparan, analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción, y/o se secuencian por el procedimiento de Messing y col., Nucleic Acids Res 9, 309 (1981) o mediante el procedimiento de Maxam y col., Methods in Enzymology 65, 499 (1980).

(8) Vectores de expresión transitorios

De especial utilidad en la práctica de la presente invención son los vectores de expresión que proporcionan la expresión transitoria en células de mamífero del DNA que codifica el polipéptido de la O-fucosiltransferasa. Por lo general, la expresión transitoria implica la utilización de un vector de expresión que sea capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de modo que la célula huésped acumule muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetice niveles elevados de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Sambrook y col., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transitoria, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permiten el cribado de los positivos adecuados de dichos polipéptidos por sus propiedades biológicas o fisiológicas. En consecuencia, los sistemas de expresión transitoria son particularmente útiles en la invención con el propósito de identificar análogos y variantes de los polipéptidos de la O-fucosiltransferasa con actividad enzimática de O-fucosiltransferasa.

(9) Ejemplos de vectores adecuados de células de vertebrados

Otros procedimientos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de un polipéptido O-fucosiltransferasa (incluyendo las proteínas derivadas o nativas funcionales) en el cultivo de células de vertebrados se describe en Gething y col., Nature 293, 620-625 (1981); Mantel y col., Nature 281, 40-46 (1979); Levinson y col., patente europea EP 117.060; y patente europea EP 117.058. Un plásmido especialmente útil para la expresión en el cultivo de células de mamífero de un polipéptidos O-fucosiltransferasa es el pRK5 (patente europea EP 307.247) y el pSV16B (publicación de patente internacional WO91/08291). Especialmente preferido es el vector pVL1392 de insecto (Pharmigen), Ausubel, Cap. 16.9-16.11, supra.

III. Selección y transformación de células huésped

Las células huésped adecuadas para el clonaje o la expresión de vectores en la presente invención son las células descritas anteriormente de procariotas, levaduras o eucariotas superiores. Las procariotas adecuadas incluyen los organismos gram negativos y los gram positivos, por ejemplo, E. coli o bacilli. Un huésped de clonaje preferido es E. coli 294 (ATCC 31.446), aunque también son adecuados otros organismos procariotas gram negativos o positivos como Pseudomonas species, o Serratia Marcesans.

Además de los microbios procariotas, también son adecuados como huéspedes para los vectores de la presente invención los microbios eucariotas como los hongos filamentosos o las levaduras. Saccharomyces cerevisiae o la levadura común del pan, es la más comúnmente utilizada entre los eucariotas inferiores. Aunque también están disponibles otros géneros, especies y cepas de utilidad en la presente invención, como S. pombe [Beach y Nurse, Nature 290, 140 (1981)], Kluyveromyces lactis [Louvencourt y col., J. Bacteriol. 737 (1983)]; Yarrowia (patente europea 402.226); Pichia pastoris (patente europea 183.070), Trichoderma reesia (patente europea EP 244.234), Neurospora crassa [Case y col., Proc Natl Acad Sci USA 76, 5259-5263 (1979)]; y huéspedes de Aspergillus como A. nidulans [Ballance y col., Biochem Biopys res Commun, 112, 284-289 (1983); Tilburn y col., Gene 26, 205-221 (1983); Yelton y col., Proc Natl Acad Sci USA 81, 1470-1474 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J, 4, 475-479 (1985)].

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Las células huésped también pueden derivarse de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de realizar procesos y actividades de glicosilación complejos. En principio, cualquier cultivo de célula eucariota superior es factible, bien sea del cultivo de vertebrados o de invertebrados, aunque las células de mamífero como las humanas son las preferidas. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las de insectos y plantas. Se han identificado numerosas cepas de baculovirus y variantes y las correspondientes células huésped de insectos permisivas como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombyx mori. Véase, por ejemplo, Luckow y col., Biol Technology 6, 47-55 (1988); Miller y col., in Genetic Engineering, Setlow, J.K. y col., eds., vol 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279; y Maeda y col., Nature 315, 592-594 (1985). Diversas de dichas cepas están disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa californica NPV y dichos virus pueden utilizarse como el virus para la presente invención, en particular para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células de plantas de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco pueden utilizarse como huéspedes. Típicamente, las células de plantas se transfectan mediante incubación con ciertas cepas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, que previamente han sido manipulada para contener el DNA de la O-fucosiltransferasa. Durante la incubación del cultivo de células de plantas con A. tumefaciens, el DNA que codifica una O-fucosiltransferasa se transfiere al huésped de células de planta que se transfecta, y en las condiciones adecuadas, expresa el DNA de la O-fucosiltransferasa. Además, las secuencias reguladoras y secuencias señal compatibles con células de plantas están disponibles, como el promotor de la sintasa opalina y las secuencias señal de poliadenilación. Depicker y col., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Además, los segmentos de DNa aislados de la región cadena arriba del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresables en plantasen el tejido de plantas que contiene el DNA recombinante. Véase la patente europea EP 321.196 publicada el 21 de Junio de 1989.

Sin embargo, el interés desarrollado ha sido mayor en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) es per se bien conocida. Véase Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patternson, editores (1973). Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL, 1651); la línea de riñón embrionario humano [293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en suspensión. Graham y col., J. Gen. Virol. 36, 59 (1977)]; células de riñón de cría de hámster 9BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR [CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)]; células de sertoli de ratón [TM4, Mather, Biol. Reprod 23, 243-251 (1980)]: células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W318, ATCC CCL75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI [Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44068 (1982)], células MRC 5; células FS4; y una línea celular de hepatoma humano (Hep G2). Células huésped preferidas son las de riñón embrionario humano 293 y las células de ovario de hámster chino. Las células más preferidas son las de insecto capaces de expresarse en baculovirus: Sf9, ATCC-CRL 1711, Pharmigen (21300C, Invitrogen (B825-01), o células Sf21, Clontech (K1601-E) o Invigtrogen. Véase Ausubel cap. 16.9-16.11, supra.

Las células huésped preferidas en particular para el propósito de la presente invención son las células de vertebrados productoras de polipéptidos O-fucosiltransferasas.

Las células huésped se transfectan y transforman preferentemente con los vectores de expresión y clonaje descritos más arriba y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea conveniente para la inducción de promotores o la selección de transformantes que contengan los genes amplificados.

IV. Cultivo de células huésped

Las células procariotas utilizadas para producir los polipéptidos de la O-fucosiltransferasa de la presente invención se cultivan en medios adecuados tal como se describe en Sambrook y col., supra.

Las células de mamífero pueden cultivarse en medios diversos. Los medios disponibles comercialmente como el Ham F10 (Sigma). Medio Esencial Mínimo (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) son adecuados para el cultivo de células huésped. Además, cualquier medio descrito en Ham y Wallace, Meth. Enzymol. 58, 44 (1979); Barnes y Sato, Anal Biochem 102, 255 (1980), patentes americanas US 4.767.704, 4.657.866; 4.927.762; o 4.560.655; patente internacional WO 90/03430; patente internacional WO 87/00195 o patente americana US 30.985 puede utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como la insulina, la transferrina, o el factor epitelial de crecimiento), sales (como el cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como el HEPES), nucleósidos (como la adenosina y la timidina), antibióticos (como el fármaco Gentamicina®), oligoelementos (definidos como compuestos orgánicos presentes generalmente a concentraciones finales en el orden micromolar), y glucosa o una fuentes de energía equivalente. Cualquier otro suplemento necesario también puede incluirse a concentraciones adecuadas según el criterio del experto en la materia. Las condiciones de cultivo, como la temperatura, pH y otras, adecuadas son aquellas utilizadas anteriormente con la células huésped seleccionada para el clonaje o la expresión, como puede ser el caso, y serán evidentes para el técnico en la
materia.

Las células huésped referidas en esta descripción abarcan el cultivo de células in vitro así como las de un animal huésped o de plantas.

Se prevé que los polipéptidos de la O-fucosiltransferasa de la presente invención puedan producirse mediante recombinación homóloga, o con procedimientos de producción recombinante utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contenían el DNA que codifica la O-fucosiltransferasa particular.

V. Amplificación/Expresión de la detección génica

La amplificación génica y/o la expresión puede cuantificarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de Southern convencional, transferencia de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA [Thomas, Proc Natl Acad Sic USA 77, 5201-5205 (1980)], transferencia de DNA (Análisis de DNA), o hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de forma adecuada, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Diversos marcajes pueden utilizarse, los más frecuentes son los radioisótopos, en particular el P32. Sin embargo, otras secuencias también pueden utilizarse, como los nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina se utiliza como un sitio de unión para la avidina o los anticuerpos, que pueden estar marcados con o una gran variedad de marcajes, como los radionuclidos, los fluorcromos, las enzimas y similares. Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse de modo que reconozcan dúplex específicos, incluyendo dúplex de DNA, dúplex de RNA, e híbridos DNA-RAN o dúplex DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y el ensayo puede llevarse a cabo si el dúplex está unido a la superficie, de modo que la formación del dúplex en la superficie, la presencia del anticuerpo unido al dúplex puede detectarse.

La expresión génica, alternativamente, es posible cuantificar mediante procedimientos inmunológicos, como la tinción inmunohistoquímica de secciones de tejidos del cultivo celular o de fluidos corporales, para cuantificar la expresión del producto génico. Con las técnicas de tinción inmunohistoquímica, una muestra de células se prepara, típicamente mediante deshidratación y fijación, seguido por la reacción con anticuerpos marcados para el producto génico acoplado, si los marcajes son generalmente detectables visualmente, como los marcajes enzimáticos, marcajes fluorescentes, marcajes luminiscentes, y similares. Una técnica de tinción especialmente sensible y adecuada para la utilizar en la presente invención es la descrita por Hse y col., Am J Clin Pharm 75, 734-738 (1980).

Los anticuerpos de utilidad para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos de muestras puede ser monoclonal o policlonal, y puede prepararse en cualquier animal. Convenientemente, los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptidos O-fucosiltransferasa nativo, o contra un polipéptido sintético basado en la secuencia del DNA proporcionada aquí como la descrita más adelante.

VI. Modificaciones covalentes de los polipéptidos de O-fucosiltransferasa

Las modificaciones covalentes de la O-fucosiltransferasa se incluyen dentro del ámbito de la invención. Dichas modificaciones se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar residuos aminoacídicos de la O-fucosiltransferasa con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con lado seleccionados de los residuos terminales, o aprovechando las modificaciones post-traduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son de utilidad en programas dirigidos a la identificación de residuos importantes para la actividad biológica, para los inmunoensayos de la fucosiltransferasa, o para la preparación de anticuerpos fucosiltransferasas para la purificación por inmunoafinidada del recombinante. Por ejemplo, la inactivación completa de la actividad biológica de la proteína después de la reacción con nihidrina debería sugerir que al menos un residuo arginil o lisil es crítico para su actividad, por lo que los residuos individuales que se modificaron en las condiciones seleccionadas se identificaron mediante aislamiento de un fragmento peptídico que contenga el residuo aminoacídico modificado. Dichas modificaciones son conocidas por los técnicos en la materia y se realizan sin demasiada experimentación.

Los residuos cisteinil más comúnmente utilizados se hacen reaccionar con los \alpha-haloacetatos (y las aminas correspondientes), como el ácido cloroacético o la cloroacetamida, para proporcionar carboximetil o carboximidometil derivados. Los residuos cisteinil también se derivan mediante la reacción con bromotrifluoroacetona, ácido \alpha-bromo-\beta(5-imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.

Los residuos histidil se derivaron mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral histidil. También es útil el para-bromofenacil bromuro; la reacción se realiza preferentemente en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.

Los residuos amino terminales de lisinil se hacen reaccionar con succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivación con estos agentes tiene el efecto de reservar la carga de los residuos lisinil. Otros reactivos adecuados para la derivación de residuos con \alpha-amino incluyen los imidoésteres como el metil picolinimidato; el fosfato piridoxal; el piridoxal; el cloroborohidruro; el ácido trinitrobencenosulfónico; la o-metillisourea; 2,4-pentanediona; y la reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

Los residuos arginil se modifican mediante la reacción con uno o más reactivos de entre el fenilglioxal, la 2,3-butanediona, la 1,2-ciclohexanediona y la nihidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido a la elevada pKa del grupo funcional de la guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con grupos de lisina así como con el grupo epsilón-amino de la arginina.

La modificación específica de residuos tirosil puede realizarse, con interés particular introduciendo marcajes espectrales en los residuos tirosil mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, N-acetilimidizol y tetranitrometano se utilizan para formar especies de O-acetil tirosil y derivados 3-nitro, respectivamente. Os residuos tirosil se yodinan con I125 para preparar proteínas marcadas para utilizar en radioinmunoensayo.

Los grupos laterales carboxil (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R') como 1-ciclohexil3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos aspartil y glutamil se convierten en residuos asparraguinil y glutaminil mediante reacción con iones amonio.

Los residuos glutaminil y asparraguinil se desaminan frecuentemente a los residuos correspondientes glutamil y aspartil. Alternativamente, estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la presente invención.

Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxil de residuos seril, treonil o tirosil, la metilación de los grupos \alpha-amino, las cadenas laterales arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, pp. 79-86 [1983]), la acetilación del grupo amino-terminal y la amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Las moléculas pueden estar unidas covalentemente a polímeros no-proteicos, por ejemplo, el polietilén glicol, el propilén glicol o los plioxialquilenos, en la forma indicada en las patentes americanas 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

La derivación con agentes bifuncionales se utiliza para la preparación de agregados intramoleculares de la O-fucosiltransferasa con polipéptidos así como la unión cruzada del polipéptido O-fucosiltransferas a un soporte insoluble en agua o a una superficie para utilizar en ensayos o purificación por afinidad. Además, un estudio de enlaces intracatenarios proporcionará la información directa sobre la estructura conformacional. Los agentes de unión utilizados comúnmente incluyen el 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, el glutaraldehído, los ésteres N-hidroxisuccinimida, los imidoésteres homobifuncionales, y las maleimidas bifuncionales. Los agentes de derivación como el metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propiomidato proporcionan intermediarios que son capaces de formar uniones en presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua como los carbohidratos activados con bromuro de cianógeno y los sistemas de sustratos reactivos descritos en las patentes americanas U.S. 3.959.642; 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; 4.055.635; y 4.330.440 se utilizan para la inmovilización de proteínas y su unión.

Ciertas modificaciones post-traduccionales son el resultado de las células huésped recombinantes sobre el polipéptido expresado. Los residuos glutaminil y asparraguinil son desaminados frecuentemente post-traduccionalmente a los residuos correspondientes glutaminil y aspartil. Alternativamente, estos residuos se desaminan en condiciones ligeramente acídicas. Cualquier forma de estos residuos se halla dentro del ámbito de la invención.

Otras modificaciones post-traduccionales incluyen la hidroxilación de los residuos de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de seril, residuos treonil o tirosil, metilación de grupos \alpha-amino de lisina, arginina y las cadenas laterales de histidina [T.E. Creighton, Proteins:Structure and Molecular Properties, WH. Freeman & co., San Francisco, pp 79-86 (1983)].

Otros derivados que comprenden nuevos polipéptidos de la presente invención unidos covalentemente a un polímero no proteico. El polímero no proteico es generalmente un polímero sintético hidrofílico, es decir, no hallado en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante procedimientos recombinantes o in vitro son útiles como polímeros que se han aislado de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrofílicos se hallan dentro del ámbito de la presente invención, por ejemplo, el polivinilalcohol y la polivinilpirrolidona. De especial interés son los éteres de polialquileno como el polietilén glicol y el polipropilén glicol.

Los polipéptidos de O-fucosiltransferasa pueden estar unidos a diversos polímeros no proteicos, como el polietilén glicol, propilén glicol o polioxialquilenos, en la forma descrita en la patente americana U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Las O-fucosiltransferasas pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante coacervación o polimerización interfacial, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceuticals Sciences, 16ª edición, Osol, A., Ed. (1980).

VII. Variantes de glicosilación de la O-fucosiltransferasa

El patrón de glicosilación propio de la O-fucosiltransferasa nativa es desconocido, sin embargo, las variantes que tienen glicosilación distinta de la secuencia nativa real también se hallan dentro del ámbito de la presente invención. Para simplificar, los cambios en el patrón de glicosilación de un polipéptido nativo se generan normalmente a nivel de DNA, esencialmente mediante técnicas discutidas aquí más arriba respecto a las variantes de secuencia aminoacídica. Por ello, las señales de glicosilación pueden introducirse en la secuencia de DNA de polipéptidos de O-fucosilación nativa.

El acoplamiento químico o enzimático de los glicósidos de las moléculas de O-fucosilación de moléculas de la presente invención también puede utilizarse para añadir sustitutos de carbohidratos. Estos procedimientos son ventajosos en que requieren la producción del polipéptido que es capaz de O-glicosilación (o N-glicosilación). Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcares pueden unirse a (a) una arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos hidroxilo libres como la cisteína, (d) grupos sulfidrilo libres como los de la serina, treonina, o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina, la tirosina, o el triptófano o (f) el grupo amino de la glutamina. Estos procedimientos se describen en la patente internacional WO 87/05330 (publicada el 11 de Septiembre de 1987), y en Aplin y Wriston, CRC Crit Rev Biochem., pp. 259-306.

IX. Procedimientos de utilización de inhibidores de la O-fucosiltransferasa

Tal como se publicó con anterioridad, la O-fucosa se ha hallado en diversas moléculas biológicas de interés. Además, se ha determinado que las glicosilaciones que contienen O-fucosa son esenciales para la propia actividad de estas moléculas biológicas. También se ha observado, un hecho importante, la ausencia de dicha O-fucosa en estas moléculas ha inhibido o disminuido la eficacia de estas moléculas. Por ejemplo, se ha publicado en S.A., Rabbani y col., J. Biol.Chem. (1992) 267:1415-56, que la unión del activador del plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) con su receptor (uPAR) está mediada por el dominio EGF. Además, Rabbani y col., han publicado que el dominio EGF fucosilado de uPA era mitogénico para la línea celular de osteosarcoma, SaOS-2 y que, el dominio EGF no fucosilado no presentaba actividad mitogénica. Esto es particularmente interesante, ya que uPA no fucosilado en un ensayo de inhibición competitiva con uPA fucosilado redujo la mitogenicidad en el modelo.

Las siguientes proteínas tienen dominios EGF similares a los capaces de ser glicosilados por la O-fucosiltransferasa presente: factor VII de coagulación, facto VII(b) de coagulación, fibropelina C (III), factor de crecimiento epitelial rico en Cys del receptor basurero, notch 4, C-Serate-1, Motch B proteína, notch 3 locus neurogénico, notch 2, proteína de membrana globulos grasos principal/MGF-EB, factor IX de coagulación, factor XII de coagulación, factor de crecimiento de hepatocitos, agrina, receptor de la alfa-2-macroglobulina (precursor de proteína I relacionada con el receptor de la lipoproteína de baja densidad), versicán, condroitín sulfato proteoglicano, activador del plasminógeno (uPA), factor de crecimiento derivado del teratocarcinoma (factor de crecimiento Cripto), teratocarcinoma derivado del factor-3 de crecimiento (factor de crecimiento Cripto-3), Motch A, factor VII EGF-glóbulo graso de la leche (MFGM), fibropelina Ia, fibropelina Ib, proteoglicanco PG-M (V3), fibropelina I, C-serrata-2, proteína transmembrana dentada, proteína transmembrana dentada-1, versicán v2, homólogo 4 de notch de locus neurogénico (proteína transformante-3), migas, receptor lazo de tirosin quinasa, ligando del receptor del receptor de crecimiento de fibroblastos, antígeno fetal 1, factor de preadipocitos 1, proteína dlk de tipo delta, proteína 1 derivada del estroma celular, proteína transmembrana deltaD, x-Delta-1, proteína 1 relacionada con la agrina, precursor de la proteína neurogénica, prepromultimerina, proteína de serrate, proteína de hendidura 2, hendidura, receptores acoplados a proteínas G, proteína transmembrana de repeticiones EGF y notch 1 de locus neurogénico.

Los procedimientos para la preparación de inhibidores de la O-fucosiltransferasa son similares a los descritos para la preparación de variantes de O-fucosiltransferasa en la sección B de la parte II: producción recombinante de la O-fucosiltransferasa.

Las formulaciones terapéuticas del polipéptido o anticuerpo se prepararon para el almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mediante mezcla del polipéptido con el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes "aceptables farmacéuticamente" que se utilizan típicamente en la materia (todos estos se denominan "excipientes"). Por ejemplo, los agentes tamponantes, los conservantes, los isotonificadores, los detergentes no iónicos, los antioxidantes y otros aditivos miscelánea. (Véase, Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, A. Osol, Ed. (1980)). Dichos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas.

Los agentes tamponantes ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Están a concentraciones en el intervalo de aproximadamente 2 mM a 50 mM. Agentes tamponantes adecuados para utilizar con la presente invención incluyen los ácidos orgánicos e inorgánicos y las sales como los tampones citrato (por ejemplo, mezcla de citrato monosódico y citrato disódico, mezcla de ácido cítrico y citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico y citrato monosódico, etc.), tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico y succinato monosódico, mezcla de ácido succínico e hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico y succinato disódico, etc.), tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico y tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico y tartrato potásico, mezcla de ácido tartárico e hidróxido sódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico y fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico y fumarato sódico, mezcla de fumarato monosódico y fumarato disódico, etc.), tampones de gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico y gliconato sódico, mezcla de ácido glicónico e hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico y gliconato potásico, etc.), tampón de oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico y oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico e hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico y oxalato potásico, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico y lactato sódico, mezcla de ácido láctico e hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico y lactato potásico, etc.), tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético y acetato sódico, mezcla de ácido acético e hidróxido sódico, etc.). Adicionalmente, pueden incluirse tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como el Tris.

Los conservantes se añaden para retrasar el crecimiento de los microbios y se añaden en cantidades en un intervalo del 0,2%-1% (p/v). Los conservantes adecuados para utilizar con la presente invención incluyen el fenol, bencilalcohol, meta-cresol, metil parabén, propil parabén, cloruro de octadecildimetilbencil amonio, haluros de benzlaconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de hexametonio, alquil parabenos como el metil o el propil parabén, catecol, resorcionol, ciclohexanol, y 3-pentanol.

Los isotonificadores conocidos como estabilizantes están presentes para asegurar la isotonicidad de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen los alcoholes de azúcar polihídricos, preferentemente los trihídricos o los alchoholes de azúcares superiores, como la glicerina, el eritritol, el arabitol, el xilitol, el sorbitol y el manitol. Los alcoholes polihídricos pueden presentarse en una cantidad entre el 0,1% al 25% en peso, preferentemente del 1% al 5% teniendo en cuenta las cantidades relativas de otros ingredientes.

Los estabilizantes hacen referencia a una amplia categoría de excipientes que abarcan según su función desde un agente espesante a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia con la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes polihídricos (enumerados anteriormente); aminoácidos como la arginina, lisina, glicina, glutamina, asparraguina, histidina, alanina, ornitina. La L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares, como la lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinisitol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo los ciclitoles como el inositol; el polietilén glicol, los polímeros de aminoácidos; agentes reductores con azufre, como la urea, el glutatión, el ácido tioglicolato, el tioglicerol, \alpha-monotioglicerol y el tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 residuos); proteínas como la seroalbúmina, la albúmina sérica bovina, la gelatina o las inmunoglobulinas, los polímeros hidrofílicos, como los monosacáridos de polivinilpirrolidona, como la xilosa, manosa, fructosa, glucosa; los disacáridos como la lactosa, manosa, sacarosa y trisacáridos como la rafinosa; polisacáridos como el dextrán. Los estabilizantes están presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte en peso de proteína activa.

Los tensoactivos no iónicos o detergentes (también conocidos como "agentes humectantes") están presentes para solubilizar el agente terapéutico así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por agitación, que también permite la formulación para ser expuesta tensión de superficie sin causar la desnaturalización de la proteína. Los tensoactivos no iónicos adecuados incluyen los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxámeros (184, 188, etc.), polioles de Pluronic®, los monoéteres de sorbitán polioxietilén (Tween®-20, Tween®-80, etc.). Los tensoactivos no iónicos están presentes en un intervalo de concentraciones de 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferentemente a unos 0,07 mg/ml a 0,2 mg/ml.

Los excipientes de miscelánea adicionales incluyen los agentes espesantes (por ejemplo el almidón), los agentes quelantes (por ejemplo el EDTA), los antioxidantes (por ejemplo, el ácido ascórbico, la metionina, la vitamina E) y los cosolventes.

Una formulación puede también contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente unos a otros. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor. Dichas moléculas están presentes de forma adecuada en combinación con cantidades efectivas para el propósito que se pretende.

Los ingredientes activos también pueden incluirse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas coacervación o polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidrometilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de liberación de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microsferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington Pharmaceuticals Sciences, 16ª edición, Osol, A., Ed. (1980).

Las formulaciones para utilizar en la administración in vivo deben ser estériles. Ello se logra fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen las matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo mutantes, cuyas matrices están en la forma de artículos con formas determinadas; por ejemplo, películas, o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen los poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroexietil-metacrilato), o el poli(vinilalcohol), los poliláctidos (patente americana US 3.773.919), los copolímeros del ácido L-glutámico y el etil-L-glutamato, el acetato etilén-vinilo no degradable, los copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables como el LUPRONDEPOT™ (las microsferas inyectables del copolímero del ácido láctico y del ácido glicólico y el acetato de leuprolide), y el ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros como el etilén vinil acetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos más cortos de tiempo. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un periodo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a humedad a 37ºC, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y a cambios posibles en la inmunogenicidad. Es posible diseñar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si el mecanismo de agregación es una formación de enlace S-S intermolecular a través del intercambio de tiodisulfuros, la estabilización puede lograrse modificando residuos sulfidrilos, liofilizando soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros específicos.

La cantidad de polipéptidos terapéuticos, el anticuerpo o fragmento de lo mismo efectivos en el tratamiento de un trastorno o patología particular dependerá de la naturaleza de dicho trastorno o patología, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándares. En la medida de lo posible, es deseable determinar la curva de dosis respuesta y las composiciones farmacéuticas primero in vitro, y luego en sistemas de modelos animales de utilidad antes de probar con humanos. Sin embargo, según el conocimiento de la materia, una composición farmacéutica efectiva para promocionar la supervivencia de neuronas sensoriales puede proporcionar una concentración del agente terapéutico local de entre 5 y 20 ng/ml, y preferentemente entre 10 y 20 ng/ml. Una composición farmacéutica efectiva para promocionar el crecimiento y la supervivencia de las neuronas retinales puede proporcionar una concentración del agente terapéutico local de entre 10 ng/ml y 100 ng/ml.

Una solución acuosa del polipéptido terapéutico, anticuerpo o fragmento de lo mismo se administra por inyección. Cada dosis puede hallarse en el intervalo de aproximadamente 0,5 \mug a aproximadamente 50 \mug por kg de peso corporal, o más preferentemente, a partir de 3 \mug a unos 30 \mug por kg de peso corporal.

El esquema de dosis para la administración cutánea puede variar desde una vez a la semana a diario dependiendo del número de factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del individuo al agente terapéutico.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a modo de ilustración y no de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Análisis de secuencia

Las secuencias aminoterminales de la O-fucosiltransferasa de células CHO se obtuvo utilizando un secuenciador de fase gas automatizado. La proteína (2 \mug) se sometió al análisis durante 61 ciclos. La secuencia obtenida fue la siguiente:

RLAGSWDLAGYLLYXPXMGRFGNQADHFLGSLAFAKLXVRTLAVPPWI
EYQHHKPPFTNLH	[SEC NO ID:3]

Los ciclos que rindieron residuos ambiguos se han marcado como X. Estos son probablemente sitios de glicosilación o residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro con otras partes de la proteína. Una búsqueda en el GenBank con la secuencia anterior halló dos genes homólogos de función desconocida de el hombre y de C. elegans (Fig. 9). La secuencia humana, KIAA0180 es un cDNA parcial de 5009 pb codificante de la proteína de función desconocida de la línea celular de mieloblastoma KG-I. La similitud entre la secuencia de las células CHO de los solicitantes y las secuencia humana publicada es de aproximadamente el 95% en la región solapante (39 aminoácidos en el lado carboxilo de la secuencia de células CHO). El polipéptido de C. elegans se generó por análisis computerizado de la secuencia genómica de C. elegans, CELC15C7-5. Los 61 residuos de la secuencia de células CHO de los solicitantes tiene una similitud del 37% con la secuencia de C. elegans. Sin embargo, si sólo los 43 residuos aminoacídicos del extremo C-terminal de la secuencia de células CHO se compara, la similitud aumenta un 76%. Una comparación realística entre las células CHO y las secuencias humanas publicadas no es posible debido a la información de secuencia incompleta disponible de la secuencia humana. La identidad de secuencia entre las secuencias humanas y de C. elegans es de aproximadamente del 40%.

Análisis de transferencia de Northern

Las sondas oligonucleotídicas se generaron rellenando dos oligonucleótidos parcialmente complementarios de la KIAA0180 humana (secuencias 16-55 y 80-41). Estas secuencias también solaparon con la secuencia polipeptídica de células CHO tal como se indicó en la Fig. 11. Las dos sondas de la transferencia de Northern correspondieron con las secuencias siguientes:

5'-CTTCT TGGGCTCTCT GGCATTTGCA AAGCTGCTAA ACCGT-3'	[SEC ID NO:10]
3'-TTCGACGATT TGGCATGGAA CCGACAGGGA GGAACCTAAC-5'	[SEC ID NO:11]

La transferencia de RNA de múltiples tejidos humanos se obtuvo de Clontech y el experimento se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transferencia dio como resultado dos bandas de aproximadamente 5 y 5,5 Kb, respectivamente, que estuvieron presentes en el corazón, la placenta, el hígado, el músculo y el páncreas, pero no el pulmón, el riñón y el cerebro (véase la Fig. 10). Las secuencias de las sondas se obtuvieron de las posiciones 16-80 de KIAA0180, la región que concuerda con la secuencia del polipéptido N-terminal de la O-fucosiltransferasa de células CHO de la Figura 11.

Aislamiento de los clones de cDNA

Los cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se obtuvieron de KIAA0180 y correspondían con kiaa 16-55 y kiaa 1110-1071. Los cebadores correspondieron con las secuencias siguientes:

5'-CTTCT TGGGCTCTCT GGCATTTGCA AAGCTGCTAA ACCGT-3'	[SEC ID NO:12]
3'-TCCCTGGGGA GTTCCTCCCT CTGCGAGGTA-5'	[SEC ID NO:13]

El producto predicho fue de aproximadamente 1,1 Kb (véase Fig. 11). Las sondas se generaron mediante el procedimiento de random priming con el producto de PCR como molde.

La librería de cDNA de corazón se obtuvo de Clontech. El cribado se llevó a cabo de acuerdo con el manual del producto. Después del cribado de un millón de clones recombinantes, se identificaron 31 positivos, de los cuales 20 se sometieron a dos cribados más para su confirmación. El DNA de lambda recombinantes de los clones aislados se digirió con EcoRI y se sometió a la transferencia de Southern (Ausubel y col., ap. 2, supra), utilizando la misma sonda que para la transferencia de northern descrita anteriormente, que dió como resultado 8 clones que contenían la secuencia codificante de la O-fucosiltransferasa.

Subclonaje y secuenciación del DNA

Los fragmentos EcoR1 positivos, identificados por la transferencia de Southern, se purificaron mediante extracción con el equipo Qiagen del gel de agarosa y se subclonaron en pBluescript SK+ (Stratagene). El DNA plasmídico se preparó utilizando el equipo de Maxiprep de Qiagen y el DNA se utilizó para la secuenciación. Dicha secuenciación se llevó a cabo en un secuenciador de DNA automático ABI 370, que identificó que siete clones contenían la secuencia KIAA 0180. Se obtuvo una secuencia compilada de los resultados que contenían el primer fragmento EcoRI de KIAA0180 y la secuencia del polipéptido N-terminal de la O-fucosiltransferasa de las células CHO (Figura 12A). Aunque el polipéptido traducido se inicia con un residuo Met, los residuos N-terminal exactos están todavía por determinar. Los clones que se extendían más allá del residuo 5'-metionina tenían secuencias distintas, posiblemente debido a un artefacto de clonaje introducido por la región rica en GC. El polipéptido de la secuencia obtenida tal como se indicó en la Fig. 12B, representa probablemente la secuencia de la O-fucosiltransferasa humana activa, ya que la secuencia N-terminal de la enzima de CHO se inicia en la misma posición, aunque con arginina en lugar de metionina. El alineamiento de las secuencias de células de CHO se muestra también en la Figura 12B.

Expresión

Los sistemas de expresión de Baculovirus se utilizaron para expresar la proteína de células de insecto Sf9. Una forma modificada del plásmido pVL1392 se utilizó como el vector, tal como se indica en la Figura 13. Este plásmido se diseñó especialmente para la expresión en sistemas de baculovirus-insectos. Éste consiste en un péptido señal artificial para la secreción, una etiqueta de 6 hisitidinas para la purificación y la O-fucosiltransferasa humana putativa descrita anteriormente. La transfección se llevó a cabo con un equipo de expresión Virus BaculoGold (Pharmigen). Se purificaron tres veces 5 clones de virus recombinantes de las calvas. La expresión ser realizó 5x108 pfu virus recombinantes a 2x107 células Sf9. El ensayo de actividad de la O-fucosiltransferasa del medio de cultivo Sf9 después de la infección por virus mostró que 4 de los cinco clones expresaban O-fucosiltransferasa secretora y los cultivos infectados con los 5 virus y las células Sf9 infectadas no tenían actividad enzimática (Fig. 14).

Tanto el medio de cultivo como las células se recolectaron 72 h después de la infección y la O-fucosiltransferasa recombinante se purificó con Ni2+-NTA agarosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La proteína purificada del lisado celular produjo una banda única d e43 Kd en el SDS-PAGE teñido con plata (Fig. 15), lo que concordó con el tamaño predicho de la molécula. La secuencia amino-terminal, tal como se determinó por análisis de secuencia N-terminal se obtuvo mediante secuenciación en fase gas y se confirmó que la proteína que se expresaba era recombinante y no una enzima endógena de células Sf9. La secuencia N-terminal se determinó de la manera siguiente:

RSHHHHHHMPAGSWDPAGYLLYXPXMGR

[SEC ID NO:14]

Ejemplo 2 Ensayo de fucosiltransferasa

Un volumen de reacción de 50 \mul de los siguientes ingredientes: imidazol-HCl 0,1M, pH 7,0; MnCl_{2} 50 mM; GDP-C^{14}-Fucosa (4000-8000 cpm/nmol), dominio EGF-1 del Factor VII humano recombinante 20 \muM y aproximadamente 0,01-0,1 miliunidades de actividad enzimática. La mezcla se incubó a 37ºC durante 10-20 minutos. La reacción se paró al colocar la mezcla en hielo, luego se diluyó con 950 \mul de EDTA 0,25 M, pH 8,0. La separación de la fucosa incorporada de GDP-fucosa, fucosa-fosfato se llevó a cabo pasando la solución a través de un cartucho C18 (Altech, Extract Clean, C18 18, 200 mg). El cartucho se lavó con 5 ml de H2O y el producto se eluyó con 3 ml de acetonitrilo al 80% que contenía TFA al 0,052%. El eluyente se mezcló con 10 ml de Aquasol II (NEN/-Du Pont) y se contó utilizando un contador de centelleo líquido.

Dominios EGF del factor VII y IX humanos recombinantes y de los mutantes

La construcción del dominio EGF del Factor IX y sus genes mutantes fue la misma que para el dominio EGF del Factor VII. Una forma recombinante del primer dominio EGF del factor VII humano se produjo en E. coli. Las secuencias de los dominios EGF se tomaron del residuo 45-87 de la proteína madura, con 6 residuos histidina unidas al extremo C-terminal, seguido de tres residuos del vector de clonaje. La construcción incluyó la siguiente secuencia primaria:

TVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTHHHHHHGSA

[SEC ID NO:15].

Los mutantes se construyeron utilizando el mismo casete oligonucleotídico con las secuencias mutadas de acuerdo con el procedimiento de la mutagénesis en casete. Wells y col., Gene 34, 315 (1985). La expresión fue llevada a cabo a una escala de 1 litro. Los dominios EFG recombinantes se purificaron de los espacios periplásmicos con Ni2+-NTA agarosa (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la purificación no desnaturalizante. Para 1 litro de fluido de cultivo, 0,5 ml de la resina se utilizaron y el eluyente se concentró a continuación en un Centricon-3 a aproximadamente 200 \mul y se utilizó en las etapas siguientes.

Ejemplo 3 Purificación de la O-fucosiltransferasa del extracto de células CHO

Purificación de O-fucosiltransferasa. La mayor parte de la actividad se recuperó en la fracción soluble del lisado celular. Mientras que la actividad no debería unirse a la columna de intercambio aniónico DE-52, debería hallarse cuantitativamente retenida en la resina Affi-Gel-blue. Se descubrió posteriormente que esta enzima tiene una gran afinidad hacia su sustrato aceptor, el dominio EGF recombinante, y un análogo del sustrato donante, GDP-hexanolamina. Como resultado, se generaron resinas de afinidad con estas dos moléculas como ligandos, lo cual es una etapa clave de purificación. La enzima se purificó 500.000 veces de la pasta celular con un 20% de rendimiento, cuantificado por su actividad. Esta información se indica en la Tabla 1.

Etapa 1

Preparación del extracto de células CHO

Ya que la O-fucosiltransferasa presenta propiedades similares a las de otras proteínas unidas a membrana, y probablemente tiene una región tallo muy susceptible a la proteolisis. Con el fin de evitar el procesamiento de las partículas de membrana, los inhibidores de la proteasa deberían omitirse durante la preparación del homogenado inicial. La pasta de células CHO congelada se descongeló a temperatura ambiente y se mantuvo fría a 4ºC durante todo el proceso. Se utilizó un tampón de baja fuerza iónica durante la homogenización para mantener las células, la adición de DNasa I al homogenado redujo la viscosidad y facilitó las etapas siguientes cromatográficas. Tal como se indicó en la Tabla 1, la mayor parte de la actividad se recuperó después de la primera etapa con la que se alcanzó una purificación de 2,2 veces.

La pasta de células CHO congelada (100 gramos) se descongeló a temperatura ambiente y se mantuvo en hielo. Las células se homogenizaron mediante sonicación en 300 ml de tampón con imidazol-HCl 20 mM, pH 7,0 y NaCl 25 mM tres veces durante 30 segundos (Virsonic 550, al 20%, con una sonda de ½ pulgada). Se añadieron DNasaI (2 mg/ml, 1 ml) y MgCl_{2} 1 M (0,4 ml) al homogenado, que luego se centrifugó a 10.000xg (Sorvell RC-GSA rotor) durante 45 minutos. El sobrenadante (355 ml) se retuvo para una posterior purificación.

Etapa 2

Cromatografía DE-52 y Affi-Gel Blue

Ya que la enzima pasó a través de la columna DE-52 y se unió a la Affi-Gel Blue, las dos columnas se conectaron para las etapas iniciales de carga y lavado. En el punto A tal como se indica en la Figura 1, la columna DE-52 se desunió de la columna Affi-Gel Blue. Alguna proteína unida débilmente se lavó tras incrementar la concentración de sales (NaCl 125 mM). En el punto B, tal como se indicó en la Figura 2, la enzima se eluyó con NaCl 1 M. La aplicación de un gradiente de NaCl no mejoró la purificación. En la Figura 2, la cantidad de proteína no asociada con la actividad enzimática fue relativamente baja debido a que una porción significante de lo unido a la columna DE-52 y que no se mostró en la cromatograma. La purificación combinada para las dos columnas fue de 7,3 veces con un rendimiento del 70%. El volumen total de la preparación se redujo de 350 a 40 ml.

Las dos columnas, una DE-52 (2,5x3,0) y la otra Affi-Gel Blue (2,5x15 cm) se combinaron y equilibraron con el mismo tampón utilizado para la homogenización. El sobrenadante de la etapa del extracto de células CHO se cargó en la columna DE-52 (1 minuto) y la columna se lavó con el mismo tampón. La columna DE-52 se desunió de la columna Affi-Gel Blue. La última se lavó con 200 ml de tampón imidazol-HCl 25 mM, pH 7,0 y NaCl 125 mM y se prosiguió con una elución de 400 ml de alta concentración salina (imidazol-HCl 25 mM, pH 7,0 y NaCl 1 M). La fracción eluida que contenía la actividad enzimática se agrupó y se dializó contra el tampón de Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, NaCl 25 mM y glicerol al 25% (p/v). El volumen final fue de 40 ml.

Etapa 3

FVII-EGF-H6-Ni^{2+}-NTA-Agarosa (sustrato aceptor)

La resina de análogo aceptor preferida para utilizar en la presente invención es el Factor VII-EGF-his_{6} y Ni^{2+}-NTA-agarosa. La utilización de Ni2+-NTA agarosa tiene diversas ventajas sobre las resinas de unión covalentes convencionales. En primer lugar, el ligando EGF se unió a la resina en una orientación definida, de acuerdo con la posición de la secuencia polihistidina. El ligando EGF puede prepararse tal como se describió en el Ejemplo 2. La enzima O-fucosiltransferasa se unió a la resina mejor cuando la etiqueta de polihistidina se halló en el extremo carboxi-terminal del dominio EGF en lugar de su extremo amino-terminal, ya que la primera se utilizó para la purificación. En segundo lugar, la unión de la etiqueta de polihistidina a la resina Ni^{2+}-NTA fue estable en muchas condiciones utilizadas para la purificación de proteína. El acoplamiento de EGF a Ni^{2+}-NTA-agarosa fue bastante cuantitativo y la resina fue muy estable. Es posible eluir la proteína con el ligando juntos en condiciones muy suaves, como el imidazol o el EDTA. El acoplamiento del EGF recombinante con Ni2+-NTA-agarosa es muy sencillo y rápido, y preferentemente se lleva a cabo mezclando la resina y el ligando en tampón Tris. Es además posible utilizar el EGF recombinante sin la purificación inicial sobre una columna de níquel.

No se ha observado pérdida del dominio EGF recombinante incluso después de un lavado extensivo. Tal como se muestra en la Figura 3, la unión de la enzima con la resina fue cuantitativa. En el punto A, la Figura 3, la columna se lavó con tampón que contenía NaCl 0,5 M y se eluyó una gran cantidad de proteína unida no específicamente. La unión de la enzima con el dominio EGF fue suficientemente fuerte como para soportar un lavado con NaCl 2 M.

Ya que la desnaturalización de la enzima fue posible, y la unión con la resina Ni^{2+}NTA fue no covalente, la enzima se recuperó mediante primero disociación el dominio EGF de la resina. En el punto B, tal como se indica en la Fig. 3, la columna se lavó con tampón que contenía imidazol 25 mM, y se eliminó más proteína unida inespecíficamente. En el punto C, tal como se indica en la Fig. 3, se utilizó una solución de imidazol 0,3 M para eluir el dominio EGF etiquetado con polihistidina junto con la enzima. La etapa de purificación fue significativamente superior, 16 veces, que la indicada en la Tabla 1 porque se recuperaron unos 6 mg de dominio EGF del Factor VII recombinante presente en el eluido.

La resina de afinidad con el sustrato aceptor como ligando se generó mezclando 6 mg de VFVII-EGF-H6 con 10 ml de resina Ni^{2+}-NTA-Agarosa en Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 durante 4 h a 4ºC. A continuación, la resina se empaquetó en una columna (1,5 x6,0 cm) y se lavó con 40 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, seguido por otro lavado de 30 ml de Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,5 M. Luego se equilibró con el mismo tampón utilizado para la diálisis en la etapa de cromatografía con DE-52 y Affi-Gel Blue.

La muestra dializada se suplementó con MnCl_{2} 1 mM y GDP 0,1 mM y se cargó en la columna de afinidad a una velocidad de flujo de 0,5 ml/min, seguido por 40 ml del mismo tampón (con MnCl_{2} 1 mM, y GDP 0,2 mM). La columna se lavó a continuación con 45 ml del mismo tampón que contenía NaCl 0,5 M y 45 ml de imidazol-HCl 25 mM, pH 7,0, NaCl 25 mM y glicerol al 25% (p/v), respectivamente. La enzima se eluyó a continuación con 90 ml de imidazol-HCl 0,3 M, pH 7,0, glicerol al 25% (p/v). Las fracciones que contenían actividad se agruparon y dializaron contra imidazol-HCl 25 mM, pH 7,0, NaCl 25 mM, glicerol al 25% (p/v).

Etapa 4

GDP Hexanolamina Agarosa (Sustrato donante)

La GDP-hexanolamina se ha utilizado extensamente en la purificación de muchas fucosiltransferasas. Beyer y col., J. Biol. Chem 255 (11), 5364-5372 (1980). La O-fucosiltransferasa también se une a esta resina. Sin embargo, tal como se indica en la Fig. 4, al menos la mitad de la cantidad total de la enzima fluyó a través de la columna cuando la muestra se cargó en la columna de GDP-hexanolamina-agarosa. En el punto A, tal como se indicó en la Fig. 4, la columna se lavó con tampón que contenía NaCl 125 mM en la elución de cierta proteína unida inespecíficamente. Después de este punto, se utilizó un gradiente de GDP (0-2 mM) para la elución específica de la enzima. Las fracciones recolectadas de este gradiente contenían una cantidad muy limitada de proteína, tal como se indica en la Fig. 5. En dicha figura, un gel de SDS-PAGE teñido con plata, sólo fue visible una banda de 44KD. La variación de la intensidad de banda también refleja la actividad enzimática entre las distintas fracciones.

La resina de afinidad con el análogo de sustrato donante como ligando se realizó acoplando la GDP-Hexanolamina (30 \mumol) con la resina Sepharose 4B activada por CNBr (10 ml, Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante). La resina se empaquetó a continuación en una columna (i.d. cm) y se equilibró con el mismo tampón utilizado para la preparación de la columna del sustrato aceptor.

La muestra dializada (13 ml) se suplementó con MnCl2 5 mM y se cargó en la columna a 5 ml/h. La columna se lavó a continuación con 30 ml de imidazol-HCl 25 mM, pH 7,0, NaCl 25 mM, MnCl2 5 mM y glicerol al 25% (p/v), seguido por 45 ml del mismo tampón con NaCl 125 mM y luego 10 ml de tampón que contenía NaCl 24 mM. La elución se llevó a cabo utilizando un gradiente de lineal de GDP 0-2 mM, que se inició con imidazol-HCl 25 mM al 100%, pH 7,0, NaCl 25 mM, MnCl2 5mM, glicerol al 25% (p/v) y finalizó con 100% del mismo tampón con GDP 2 mM en un volumen total de 50 ml. La columna se lavó con otros 40 ml del último tampón. Las fracciones que contenían actividad se examinaron por primera vez por SDS-PAGE teñido con plata y se agruparon los que presentaban una sola banda. El glicerol se añadió a una concentración final del 50% (p/v) para el almacenamiento a -20ºC.

Los resultados de la purificación se indican en la Tabla 1 que indica los resultados de una preparación de enzima a partir de 100 gramos de pasta de células CHO. Los cromatogramas de las etapas 2-4 se indican en las Figuras 2-4, respectivamente.

TABLA 1

2

Ejemplo 3 Digestión de glicosidas de la O-fucosiltransferasa purificada 1. Digestión con PNGasa

La proteína pura en tampón de almacenamiento (50 \mul) se precipitó en primer lugar con 250 \mul de acetona a -20ºC y luego se centrifugó en una microcentrífuga durante 15 min. El sedimento se lavó con 200 \mul de acetona y se secó al aire. La proteína se redisolvió a continuación con 10 \mul de SDS al 0,5%, \beta-mercaptoetanol 10 mM y Tris-HCl 0,15 M, pH 8,0, y se calentó a 100ºC durante 3 minutos. La digestión se llevó a cabo añadiendo 0,5 unidades de PNGasa F en 20 \mul de NP-40 al 2%, EDTA 30 mM, pH 8,0 y la solución se incubó a 37ºC durante toda la noche. La muestra digerida (10 ml) se analizó directamente en SDS-PAGE.

2. Digestión con endo H

La proteína se desnaturalizó tal como se describió anteriormente. La digestión se llevó a cabo con 1 mU de la glicosidasa en 30 \mul de citrato sódico 50 mM, pH 5,5, PMSF 2 mM, NP-40 al 0,25% a 37ºC durante 4,5 horas. Una alícuota (10 \mul) de la muestra se analizó en SDS-PAGE para determinar el progreso de la digestión.

HPLC de fase inversa y espectrometría de masas con electrospray

Se realizaron análisis LC-MS en un espectrómetro de masas triple cuádruple PE/Sciex AP-300 accionado con un sistema de cromatografía líquida Hewlett-Packard 1090. Las separaciones se llevaron a cabo en una columna C-18 (2,1x250 mm, Vydac), haciendo pasar un gradiente de agua/acetonitrilo/TFA a 0,2 ml/min. El tampón A contenía TFA al 0,06% y agua y el tampón B, TFA al 0,052% y acetonitrilo al 80%. El gradiente se realizó con las siguientes etapas: 0-1 min, 2-10% B; 1-5 min, 10-25% B; 5-25 min, 25-35% B; 25-30 min, 35-98% B. El fluido a lo largo de la columna se controló a 214 nm para la proteína y se introdujo a continuación en el espectrómetro de masas a través de un empalme 1:5 delante de un vaporizador de iones regular. El potencial del orificio se ajustó a 50 V y el potencial del vaporizador de iones a 4700 V. El escáner de masas se realizó desde 400-2500 m/z con el tamaño de la etapa de 0,5 amu y un tiempo de morada de 0,1 ms. Los resultados se analizaron con un BioMultiView 1,2.

Caracterizaciones 1. Digestión de glicosidasa

Muchas de las glicosiltransferasas son glicoproteínas y contienen diversos tipos y cantidades de oligosacáridos. Además, la mayoría de estas glicosiltransferasas reside en el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi. La naturaleza de la glicosilación de la O-fucosiltransferasa purificada se examinó utilizando las endoglicosidasas, PNGasa F y Endo H. La Figura 6 indica que después de la digestión con PNGasa, el peso molecular de la proteína se redujo aproximadamente a 40 Kd, unos 4 Kd en total (carril 2), lo que sugiere la presencia de un N-oligosacárido. Los resultados también indican que más de un oligosacárido de tipo manosa grande estaba presente en la enzima.

2. Especificidad del sustrato aceptor

Tal como se describió anteriormente, toda la O-fucosilación del dominio EGF tuvo lugar en la secuencia consenso putativa CXXGGS/TC. Con el fin de probar si los dos residuos glicina son o no necesarios para la O-fucosilación, se construyeron mutantes del dominio EGF del Factor IX humano tal como se muestra en la Tabla II. Los tres mutantes se construyeron utilizando la alanina para reemplazar bien uno o los dos residuos glicina y se analizó como sustrato aceptor para la O-fucosiltransferasa purificada. Los ensayos que utilizan los cuatro dominios EGF recombinantes dieron todos contajes positivos. Parecía que los dos residuos glicina no se necesitaban absolutamente para la
actividad.

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TABLA II Mutantes del dominio EGF del Factor IX humano

4

El análisis de los dominios EGF del Factor IX con HPLC de fase inversa demostró que tras el cambio de glicina a alanina, los dominios EGF mutantes presentaban picos múltiples en los cromatogramas mientras que el de tipo salvaje sólo tenía un pico (Fig. 7). Las caracterizaciones posteriores de los distintos picos por espectrometría de masas indicaron que todos los picos de mutantes tenían el mismo peso molecular, lo que sugiere que los múltiples picos representaban especies plegadas de forma distinta de los dominios EGF mutantes. El análisis también condujo a la conclusión de que el cambio del residuo glicina tenía un efecto significativo tras el plegamiento del dominio
EGF.

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Con el fin de determinar si todas las formas distintas de los mutantes sirvieron como sustrato para la O-fucosiltransferasa, se utilizó una HPLC de fase inversa con espectrometría de masas con electrospray para analizar el producto de la reacción de fucosilación. En la Figura 8 se muestra el experimento que utiliza el mutante Ala-Ala. El análisis de los otros mutantes analizados dió resultados similares. Después de la reacción de fucosilación, el peso molecular de tres de cuatro picos (30.4) tenía un peso molecular distinto (5964), que era 146 unidades más que los otros picos (5817) y el pico correspondiente antes de la reacción de fucosilación. Estos resultados indican sólo una de las cuatro especies plegadas diferentemente sirve como un sustrato aceptor para la O-fucosiltransferasa. Aunque los dos residuos de glicina no se necesitaron absolutamente para la actividad, su presencia fue importante para el propio plegamiento del dominio EGF, ya que el dominio EGF de tipo salvaje fue un sustrato mejor que los mutantes. La enzima O-fucosiltransferasa necesitó su sustrato con el fin de tener la propia estructura tridimensional para proceder a una función correcta.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Yang Wang, Michael W. Spellman

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(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: O-Fucosiltransferasa

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS:17

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DIRECCIÓN: Genentech, Inc.

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(B)

CALLE: 1 DNA Way

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(C)

CIUDAD: South San Francisco

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

código POSTAL: 94080

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(v)

FORMATO INFORMÁTICO LEGIBLE:

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(A)

TIPO MEDIO: 3,5 pulgadas, 1,44 Mb disco blando

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

PROGRAMA: WinPatin (Genentech)

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(vi)

RESULTADOS DE LA ACTUAL SOLICITUD:

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(A)

NÚMERO DE LA SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE SOLICITUD:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

FECHA ANTERIOR DE SOLICITUD

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 08/792498

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(B)

FECHA DE SOLICITUD: 01/31/97

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(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL AGENTE/ABOGADO:

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(A)

NOMBRE: Sovoboda, Craig G

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 39.044

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(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: P1041P1PCT

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 650/225-1489

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 650/952-9881

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1514 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1

5

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 365 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2

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7

8

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 61 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3

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9

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 4:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1300 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11284 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5

11

13

14

15

16

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 397 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5009 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7

23

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 474 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8

27

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 61 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCTTGGGC TCTCTGGCAT TTGCAAAGCT GCTAAACCGT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGACGATT TGGCATGGAA CCGACAGGGA GGAACCTAAC

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTCTTGGGC TCTCTGGCAT TTGCAAAGCT GCTAAACCGT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCCTGGGGA GTTCCTCCCT CTGCGAGGTA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ser His His His His His His Met Pro Ala Gly Ser Trp Asp}

\sac{Pro Ala Gly Tyr Leu Leu Tyr Xaa Pro Xaa Met Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1100 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 343 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17

33

34

Claims (11)

1. Enzima O-fucosiltransferasa que es capaz de glicosilar un dominio EGF de un polipéptido con una porción O-fucosa activada, en donde dicha enzima se selecciona a partir del grupo que consiste en un polipéptido que comprende la SEC ID NO:9, un polipéptido que comprende la SEC ID NO:2, un polipéptido que comprende la SEC ID NO:9 con sustituciones conservadoras y un polipéptido que comprende la SEC ID NO:2 con sustituciones conservadoras y en donde dicha enzima es al menos 99% pura en peso.

2. Enzima de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido glicosilado comprende la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Tyr-Cys-.

3. Enzima de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el polipéptido glicosilado comprende la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-Ser/Thr-Cys-.

4. Enzima de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia siguiente:

MPAGSWDPAGYLLYCPCMGRFGNQADHFLGSLAFAKLLNRTLAVPPWI EYQHHKPPFTNLH SEC ID NO:9.

5. Enzima de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la SEC ID NO:2.

6. Fragmento funcional o análogo de una O-fucosiltransferasa que presenta al menos una identidad de secuencia del 95% con la secuencia: MPAGSWDPAGYLLYCPCMGRFGNQADHFLGSLAFAKLLNRTLAVPPWIEYQHHKPPF
TNLH [SEC ID NO:9], que es capaz de glicosilar un dominio EGF de un polipéptido con una porción O-fucosa activada, en donde dicho fragmento o análogo es al menos 99% puro en peso.

7. Fragmento o análogo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el polipéptido glicosilado tiene la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Tyr-Cys.

8. Fragmento o análogo de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el polipéptido glicosilado tiene la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-Ser/Tyr-Cys.

9. Procedimiento de glicosilación de un dominio EGF de un polipéptido con una porción O-fucosa activada que comprende la aplicación de una O-fucosiltransferasa de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el polipéptido glicosilado comprende la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Ser/Thr-Cys.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el polipéptido glicosilado comprende la secuencia -Cys-Xaa-Xaa-Gly-Gly-Ser/Thr-Cys.