ES2283060T3 - Marcador de seleccion. - Google Patents

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ES2283060T3 ES98928753T ES98928753T ES2283060T3 ES 2283060 T3 ES2283060 T3 ES 2283060T3 ES 98928753 T ES98928753 T ES 98928753T ES 98928753 T ES98928753 T ES 98928753T ES 2283060 T3 ES2283060 T3 ES 2283060T3
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Abstract

La invención se refiere a nuevos marcadores de selección, concretamente a una (Na, K)-ATPasa mutada que incluye las secuencia de aminoácido: "IFILANIPXPXGTVTIXXID" en la que X se elige entre un grupo de cisteIna, leucina, glicina, alanina, valina, isoleucina y en la que al menos un X es cisteIna.

Description

Marcador de selección.
Introducción
La presente invención se relaciona con un nuevo método para seleccionar células que involucra a una enzima mutada de ocurrencia natural esencial para la vida, concretamente una (Na,K)-ATPasa (EC 3.6.1.3). Se reivindica una (Na,K)-ATPasa mutada de ocurrencia natural o una subunidad de la misma, así como sus usos médicos.
En Herrera y colaboradores (J. Cell. Biol. Vol. 105, páginas 1855-1865, 1987) se estudiaron tres isoformas de la subunidad a de la Na,K-ATPasa de rata expresadas en forma diferencial, para investigar la expresión específica para el tejido y la estructura primaria. Ellos encontraron que las diferentes isoformas se expresaban en forma diferencial. Por ejemplo, la isoforma \alpha1 se expresó en todo tejido fetal y de adulto mientras que la isoforma \alpha2 se expresó predominantemente en el cerebro y en el corazón fetal. A partir del análisis estructural, Herrera y colaboradores predijeron una proteína politópica con siete regiones para atravesar la membrana y dos regiones putativas involucradas en el enlazamiento de la ouabaína. La interacción de la subunidad a de la Na,K-ATPasa, principalmente la subunidad al con ouabaína, se cree que es una de las explicaciones de la resistencia a la ouabaína, por ejemplo, en las ratas.
Cuando se transfectan genes a células o a individuos, se requiere a menudo una selección y es deseable una multiplicación de las células que han recibido al nuevo gen. Esto puede hacerse de mucha maneras. Hoy en día un procedimiento usual es utilizar simultáneamente genes que sean resistentes a los antibióticos o citostáticos que hagan que las células con el nuevo gen sean resistentes a esas sustancias. Es posible entonces hacer una selección entre las células huésped que han recibido el gen de resistencia a los antibióticos y aquellas células huésped que no lo han recibido por medio del uso del antibiótico correspondiente. Este es un procedimiento bien conocido por una persona capacitada en el arte. (Ver por ejemplo los protocolos de transferencia y expresión génica (Murria E. J., ed.) Human Press, New Jersey).
Sin embargo, este procedimiento tiene algunas desventajas. Es costoso y puede alterar a la célula huésped debido al hecho de que tiene que ser colocado un gen artificial junto con un cierto gen seleccionado. Las células deben ser seleccionadas utilizando antibióticos o citostáticos. Estos compuestos antibióticos y citostáticos podrían interferir también con otros mecanismos celulares. No es adecuado insertar genes que confieran resistencia a los antibióticos o a los citostáticos en células humanas en el caso de la terapia génica. Un problema actual con la terapia génica es que la eficiencia es baja, posiblemente debido al bajo nivel de células transfectadas con el gen.
Por lo tanto, existe la necesidad de un nuevo método para selección de las células que carezca de estas desventajas.
Resumen de la invención
Se ha encontrado ahora que por medio del uso de una proteína que sea (Na,K)-ATPasa o una de sus \alpha-subunidades que contenga la secuencia de aminoácidos: IFHANIPX_{1}PX_{2}GTVTILCID, en donde al menos una entre X_{1} y X_{2} es cisteína, como marcador pata seleccionar las células, la mayoría de las desventajas enlistadas anteriormente pueden ser superadas. Preferiblemente, la proteína contiene al menos uno de las tres siguientes secuencias de aminoácidos:
IFIIANIPCPLGTVTILCID, 
\hskip0.5cm
IFIIANIPLPCGTVTILCID 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
IFHANIPCPCGTVTILCID.
Por lo tanto, se ha descubierto ahora un nuevo sistema de selección que satisface las necesidades anteriormente mencionadas. El sistema se basa en el uso de una proteína que ya existe dentro de la proteína de la célula como gen de selección especialmente (Na,K)-ATPasa: EC 3.6.1.3. Esta enzima es esencial para la célula y el gen se expresa en todas las células de mamífero. La (Na,K)-ATPasa (a.k.a. Na^{+}, K^{+}-ATPasa o NKA) es esencial para la célula y transporta a los iones sodio y potasio al otro lado de la membrana de la célula. Sin la función de esta enzima la célula morirá.
En este sistema, tal gen ha sido mutado en una forma particular tal que causa una perdida en la sensibilidad a la sustancia ouabaína (un esteroide corticoide o glucósido). Esta sustancia es capaz de matar a todas las células que no han recibido a la proteína mutada y las células sobrevivientes son únicamente las células que han recibido al producto génico mutado. La ouabaína normalmente reduce la actividad de la (Na,K)-ATPasa.
Existen ventajas con este nuevo sistema. No se le tiene que añadir un gen heterólogo a las células. Esta mutación menor es más natural que añadir un gen artificial o hacer algunas mutaciones mayores. Además, la sustancia de selección ouabaína es también relativamente barata y estable. La ouabaína no es una sustancia antibiótica ni un compuesto citostático. En terapia génica, no será necesario hacer una evaluación selectiva utilizando compuestos antibióticos o citostáticos. También se da la posibilidad de purificar y multiplicar únicamente las células de interés para terapia génica (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con intervención mínima en el sistema natural de la célula. Este nuevo sistema brinda una posibilidad mejorada de transportar nuevos genes dentro de las células de humanos y de animales. Esto también puede mejorar los resultados en terapia génica y el transplante por ejemplo de células madre hematopoyéticas, que han sido sometidas a terapia génica, para humanos. Debido al hecho de que la selección puede ser llevada a cabo con una enzima, preferiblemente NKA, que ya está ubicada en la célula, una respuesta inmunológica sobre las células transfectadas se minimiza o elimina cuando las células son transplantadas dentro de un paciente, por ejemplo cuando se trasplantan células madres (no células embrionarias o células germinales) dentro un humano. Se debe considerar que el riesgo de que ocurra una reacción inmunológica es mucho mayor cuando se utiliza un gen de selección que normalmente no se expresa en la célula. Existe también una nueva posibilidad para estudiar los efectos de los glycósidos cardíacos (por ejemplo, digitalis) sobre células o animales completos que son resistentes a estas drogas. Esta
enzima resistente a la ouabaína podría ser también muy útil cuando se estudia la enzima o sus efectos biológicos.
Entraremos ahora en más detalle sobre la invención.
Descripción detallada de la invención
La proteína codificada por el gen así como las variantes, subfragmentos y múltiplos de la proteína que tienen esencialmente las mismas características antigénicas y/o de enlazamiento también constituyen un objetivo de la presente invención. La nueva proteína es denominada 799/801 NKA. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos de la 799/801 NKA debería ser al menos 70% homóloga, más preferiblemente al menos 85% homóloga, aún más preferiblemente al menos 90% homóloga y lo más preferible al menos 95% homóloga a cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en las SEQ ID NOs: 1, 2 ó 3. Preferiblemente, 799/801 NKA tiene ya sea una cisteína en la posición 799 o en la posición 801 o una cisteína en ambas posiciones. Cuando llamamos más adelante esencial a la proteína en este documento, queremos decir que la célula no puede sobrevivir sin su función.
Por "subfragmento" se entiende un fragmento parte de la proteína dada que tiene esencialmente las mismas características antigénicas y/o de enlazamiento. Por "variantes" se entiende a las proteínas o a los péptidos en los cuales la secuencia original de aminoácidos ha sido modificada o cambiada por inserción, adición, sustitución, inversión, o exclusión de uno o más aminoácidos. Por "múltiplos" se entiende aquellas proteínas que contienen múltiplos de la proteína entera original o aquellas proteínas que contienen múltiplos de subfragmentos y/o variantes de las mismas.
La presente invención también se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican a 799/801 NKA. Como se las utiliza dentro del contexto de la presente invención, las secuencias de ácido nucleico que codifican a 799/801 NKA se consideran que son sustancialmente similares a aquellas divulgadas aquí si: (a) la secuencia de ácido nucleico se deriva de la región de codificación de un gen NKA nativo (incluidas, por ejemplo, las variaciones de las secuencias divulgadas aquí); (b) la secuencia de ácido nucleico es capaz de hibridación hasta secuencias de ácido nucleico de la presente invención bajo condiciones ya sea de moderada o de alta rigurosidad (hibridación en 5 x SSPE que contiene 0,1% de SDS y 0,1 mg/ml de ssADN, a 50-65ºC dependiendo de la longitud de la sonda, ó 10-20ºC por debajo del T_{m} de la sonsa; lavado en 1 x SSPE, 0,1% de SDS a 15-20ºC por debajo del T_{m} de la sonda para rigurosidad moderada, y en 0,1 x SSPE, 0,1% a 10ºC por debajo del T_{m} de la sonda para condiciones de alta rigurosidad) (ver Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989); o (c) las secuencias de ácido nucleico se degeneran como resultado del código genético para las secuencias de ácido nucleico definidas en (a) o (b). Además, aunque las moléculas de ácido nucleico son mencionadas aquí en primer lugar, como debería ser evidente para alguien entrenado en el arte dada la divulgación suministrada aquí, una gran variedad de moléculas relacionadas de ácido nucleico pueden ser utilizadas también en diferentes modalidades descritas aquí, incluidas por ejemplo, ARN, análogos de ácido nucleico, así como moléculas quiméricas de ácido nucleico que pueden estar compuestas de más de un tipo de ácido nucleico.
Dentro de otro aspecto de la presente invención, se proveen sondas e iniciadores para detectar secuencias de ácidos nucleicos que codifican a 799/801NKA. Dentro de una modalidad de la invención, se proveen sondas que son capaces de hibridar a los ácidos nucleicos de 799/801NKA (ADN o ARN). Para los propósitos de la presente invención, las sondas son "capaces de hibridar" a los ácidos nucleicos de 799/801NKA si ellas hibridan a las SEQ ID NO 5 hasta 8 bajo condiciones de rigurosidad moderada o alta (verla sección más arriba relacionada con moléculas de ácido nucleico, y Sambrook y colaboradores, supra); Preferiblemente, la sonda puede ser utilizada para hibridar secuencias adecuadas de nucleótidos en presencia de 5 x SSPE, 0,1% de SDS y 0,1 mg/ml de ssADN, a 10-20ºC por debajo del T_{m} de la sonsa. Los lavados posteriores se pueden realizar en 1 x SSPE, 0,1% de SDS a 15-20ºC para condiciones de rigurosidad moderada, y en 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS a 0ºC por debajo del T_{m} de la sonda para condiciones de rigurosidad alta.
Las sondas de la presente invención pueden estar compuestas ya sea de ácidos desoxirribonucleicos (ADN), de ácidos ribonucleicos (ARN), de análogos de ácidos nucleicos, o de cualquier combinación de estos, y pueden ser únicamente aproximadamente de 12 nucleótidos de longitud, usualmente aproximadamente de 14 a 18 nucleótidos de longitud, y posiblemente tan grandes como la secuencia completa que codifica a 799/801NKA. La selección del tamaño de la sonda depende un poco del uso de la sonda. Por ejemplo, una sonda larga utilizada bajo condiciones de alta rigurosidad es más específica, mientras que un oligonucleótido cuidadosamente seleccionado de la secuencia puede detectar una estructura de interés especial.
Las sondas pueden ser construidas y marcadas utilizando técnicas que son bien conocidas en el arte. Las sondas más cortas, por ejemplo de 12 ó 14 bases pueden ser generadas sintéticamente. Las sondas más largas de aproximadamente 75 bases hasta menos de 1,5 kb se generan preferiblemente, por ejemplo, por medio de amplificación por PCR en presencia de precursores marcados tales como ^{32}p-dCTP, digoxigenina-dUTP, o biotina-dATP. Las sondas de más de 1,5 kb son generalmente más fácilmente amplificadas transfectando una célula con un plásmido que contiene la sonda relevante, cultivando la célula transfectada en grandes cantidades, y purificando la secuencia relevante de las células transfectadas (ver Sambrook y colaboradores, supra).
Las sondas pueden ser marcadas por medio de una variedad de marcadores, incluidos, por ejemplo, marcadores radioactivos, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, y marcadores cromogénicos. El uso de 32p es particularmente preferido para marcar o etiquetar a una sonda particular.
Como se observó anteriormente, las sondas de ácido nucleico de la presente invención pueden se utilizadas para detectar la presencia de moléculas de ácido nucleico de 799/801NKA dentro de una muestra. Sin embargo, si tales moléculas de ácidos nucleicos están presentes únicamente en número limitado, entonces puede ser benéfico amplificar la secuencia relevante de tal manera que pueda ser más fácilmente detectada u obtenida.
Se pueden utilizar una variedad de métodos con el propósito de amplificar una secuencia seleccionada, incluidos, por ejemplo, amplificación de ARN (ver Lizardi y colaboradores, Bio/Technology 6:1197-1202, 1988, Kramer y colaboradores, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli y colaboradores, Clinical Chem. 35(91) 1826-1831, 1989; patente estadounidense No 4.786.600), y amplificación de ácido nucleico utilizando Reacción en cadena de la Polimerasa ("PCR") (ver las patentes estadounidenses Nos. 4.683.195, 4.683.202, y 4.800.159) (ver también las patentes estadounidenses Nos. 4.876.187, y 5.011.769, que describen un sistema alternativo de detección/amplificación que comprende el uso de enlaces peptídicos escindibles).
Dentro de una modalidad preferida particular, se utiliza amplificación por PCR para detectar u obtener ácidos nucleicos de 799/801NKA. En resumen, como se describa con más detalle más adelante, una muestra de ácido nucleico se desnaturaliza a 95ºC con el propósito de generar ácidos nucleicos de cadena sencilla. Los iniciadores específicos, como se discute más adelante, se alinean entonces entre 37ºC y 70ºC, dependiendo de la proporción de AT/GC en los iniciadores. Los iniciadores se extienden a 72ºC con Taq polimerasa con el propósito de generar la cadena opuesta para el molde. Estas etapas constituyen un ciclo, que se puede repetir con el propósito de amplificar la secuencia seleccionada. Se necesita una sonda de una secuencia de ácido nucleico para detectar la presencia de la 799/801NKA, que comprende al menos XYZCCCXYZ, preferiblemente TCCAXYZCCCXYZGGCACCG, derivada de las SEQ ID NOs: 5-7 donde XYZ es TGT o CTG y al menos una de ellas es TGT y donde esta sonda de una secuencia de ácido nucleico tiene preferiblemente una longitud de 9-100 nucleótidos. Un método para detectar la 799/801NKA en una célula, comprendería las etapas de
a)
suministrar el ADN de la célula disponible para detección de acuerdo a métodos generalmente conocidos;
b)
llevar a cabo una detección por PCR utilizando la sonda anterior;
c)
detectar la presencia de los productos de amplificación formados en la etapa b) por medio de métodos generalmente conocidos.
Un kit para detectar la presencia de la 799/801NKA en una célula debe contener una sonda de una secuencia de ácido nucleico mencionada anteriormente.
Los iniciadores para la amplificación de una cierta secuencia se deben seleccionar a partir de secuencias que sean altamente específicas y formen dúplex estables con la secuencia objetivo. Los iniciadores deben ser también no complementarios especialmente en el extremo 3', no deben formar dímeros consigo mismos o con otros iniciadores, y no deben formar estructuras secundarias o dúplex con otras regiones del ácido nucleico. En general, se prefieren los iniciadores de aproximadamente 18 a 20 nucleótidos, y se pueden sintetizar fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en el arte.
En otro aspecto, la presente invención se relaciona con vectores y con células huésped que contienen a las secuencias de ácido nucleico anteriormente mencionadas. Las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas que codifican a 799/801NKA (o porciones de la misma) pueden ser fácilmente introducidas en una amplia variedad de células huésped. Ejemplos representativos de tales células huésped incluyen células de plantas, células eucariotas, y células procariotas. Dentro de las modalidades preferidas, se introducen moléculas de ácido nucleico o proteínas en las células de un animal vertebrado o de sangre caliente, tal como de un humano, macaco, perro, vaca, caballo, cerdo, oveja, rata, hámster, ratón, o pez, o cualquier híbrido del mismo (excluyendo híbridos de humano/animal).
Las moléculas de ácido nucleico (o vectores) pueden ser introducidos en células huésped por medio de una gran variedad de mecanismos, incluida por ejemplo la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y colaboradores, cell 14:725, 1978), lipofección, pistola génica (Corsaro y Pearson, Somatic Cell Gen. 1603, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), electroporación (Neumann y colaboradores, EMBO J., 1:841-845, 1982), transfección retroviral, adenoviral, mediada por fusión de protoplasto o transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel y colaboradores, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, 1987).
Las moléculas de ácido nucleico, anticuerpos, y proteínas de la presente invención pueden ser marcadas o conjugadas (ya sea a través de medios covalentes o no covalentes) para una variedad de marcas o de otras moléculas, incluidos por ejemplo, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, moléculas tóxicas, moléculas que son no tóxicas pero que se hacen tóxicas por exposición a un segundo compuesto y a radionúclidos.
Los ejemplos representativos de etiquetas fluorescentes adecuadas para el uso dentro de la presente invención incluyen, por ejemplo, Isotiocianato de Fluoresceína (FITC), Rodamina, Texas Red, Luciferasa y Ficoeritrina (PE). Se prefiere particularmente para el uso un citometría de flujo FITC que se puede conjugar con un anticuerpo purificado de acuerdo con el método de Keltkamp en "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. 1. Experiments on the Conditions of Conjugation", Immunology 18: 865-873, 1970. (Ver también Keltkamp, "Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies. II. A Reproducible Method", Immunology 18: 875-881, 1970; y Goding, "Conjugation of Antibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard Methods", J. Immunol. Methods 13: 215-226, 1970). Para la coloración histoquímica, HRP, que es la preferida, se puede conjugar con el anticuerpo purificado de acuerdo con el método de Nakane y Kawaoi ("Peroxidase-Labeled Antibody: A New Method of Conjugation", J. Histochem. Cytochem. 22: 1084-1091, 1974; ver también, Tijssen y Kurstak, "Highly Efficient and Simple Methods for Preparation of Peroxidase and Active Peroxidase Antibody Conjugates for Enzyme Immunoassays", Anal. Biochem. 136; 451-457, 1984).
Ejemplos representativos de marcadores enzimáticos o etiquetas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, y \beta-galactosidasa. Ejemplos representativos de moléculas tóxicas incluyen ricina, abrina, toxina de difteria, toxina de cólera, gelonina, proteína antiviral de fitolaca, tritina, toxina de Síguela, y exotoxina A de Pseudomonas. Ejemplos representativos de moléculas que son no tóxicas, pero que se hacen tóxicas por exposición a un segundo compuesto incluyen timidina quinasas tales como HSVTK y VZVTK. Ejemplos representativos de radionúclidos incluyen Cu-64, Ga-67, CTa-68, Zr-89, Ru-97, Tc-99m, Rh-105, Pd-109, In-111, I-123, I-125, I-131, Re-186, Re-188, Au-198, Au-199, Pb-203, At-211, Pb-212 y Bi-212.
Como será evidente para alguien entrenado en el arte dada la divulgación suministrada aquí, las moléculas de ácido nucleico anteriormente descritas, anticuerpos, proteínas y péptidos pueden ser marcados también con otras moléculas tales como oro coloidal, así como cualquier miembro de un par de enlazamiento de gran afinidad (por ejemplo, avidina-biotina).
Como se observó anteriormente, la presente invención también provee una variedad de composiciones farmacéuticas, que comprenden células eucariotas transformadas con genes que codifican a 799/801/NKA, junto con portadores, excipientes o diluyentes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Generalmente, tales portadores deben ser no tóxicos para los receptores con las dosis y concentraciones empleadas. Ordinariamente, la preparación de tale composiciones implica la combinación del agente terapéutico con amortiguadores, antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (aproximadamente menos de 10 residuos), proteínas, aminoácidos, carbohidratos incluidos glucosa, sacarosa, o dextrinas, agentes de quelación tales como EDTA, glutationa y otros estabilizantes y excipientes. La solución fisiológica amortiguada neutra o salina mezclada con albúmina en suero no específica son ejemplos de diluyentes apropiados. Tales composiciones pueden encontrar uso en aplicaciones de terapia génica.
Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar para administración por medio de una variedad de rutas diferentes, incluidas por ejemplo la intraarticular, intracraneal, intradérmica, intramuscular, intraocular, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, subcutánea o aún directamente dentro de un tumor (por ejemplo, por medio de inyección estereotáxica). Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser colocadas dentro de contenedores, junto con material de empaque que provee instrucciones relacionadas con el uso de tales composiciones farmacéuticas. Generalmente, tales instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración del reactivo, así como dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, suero fisiológico o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
Como se mencionó previamente, se pueden utilizar cantidades efectivas de la proteína o fragmentos o variantes de la misma como ingredientes activos en composiciones farmacéuticas posiblemente junto con excipientes farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de excipientes adecuados son el manitol, la lactosa, el almidón, la celulosa, la glucosa, etc., únicamente por mencionar unos pocos. Los ejemplos dados del adyuvante y de los excipientes no se consideran como limitantes de la invención.
Por lo tanto, la invención es útil entre otros, en los siguientes campos:
Genético: Para seleccionar las células transfectadas con genes para purificación y multiplicación de poblaciones de células específicas en el campo de la terapia génica en humanos y animales y también para una exitosa selección en el área de las transfecciones de células en cultivos celulares. Esto da la posibilidad, después de hacer la selección, de evaluar la eficiencia de la transfección/terapia génica por medio del método utilizado. Existe también una posibilidad de almacenar células transfectadas purificadas para usos adicionales (por ejemplo, a -70ºC en nitrógeno líquido). Este procedimiento puede repetirse para obtener una cantidad adecuada o las células necesarias para terapia.
Fisiológico: La mutación/mutaciones en la proteína, preferiblemente (Na,K)-ATPasa, y sus efectos pueden ser utilizados en cultivos celulares y en animales transgénicos no humanos en estudios a nivel celular, de un órgano y del organismo completo, en conexión con el uso de los efectos de glycósidos cardíacos (por ejemplo, digitalis).
En este sistema, se utiliza un gen que ya se expresó en todas las células de mamífero y que es esencial para la supervivencia de la célula. Estudios anteriores han mostrado que la actividad de esta enzima puede ser influenciada por la sustancia química ouabaína (un glucósido cardíaco) que está muy relacionado con digitalis. La sensibilidad para esta influencia depende de la estructura de la enzima y a través de mutaciones de la enzima se puede alterar (Lingrel J.B. Jour. Biol. Chem. 1994 páginas 10659-19662; Palais M., Jour Biol. Chem., 1996, páginas 14176-14182; Burns, E.L., Jour. Biol. Chem., 1996 páginas 15879-15883). En estos estudios se utilizó el gen en cordero y se mostró que diferentes mutaciones produjeron diferentes resultados.
Aquí se elaboró una mutación específica en la subunidad alfa l de NKA de rata donde se alteró al aminoácido leucina en la posición 799 por el aminoácido cisteína en la misma posición en el gen que codifica para la subunidad alfa 1 de (Na,K)-ATPasa (NKA) en la rata (Figura 1) que inesperadamente resultó en una enzima con una resistencia casi completa a la ouabaína. También, los experimentos utilizando la misma subunidad alfa 1 de NKA pero donde la mutación había sido hecha en posición la 801 en vez de en la 799 de leucina por cisteína, resultan en el mismo efecto que aquella anterior. Cantley y colaboradores (Jour. Biol. Chem. 1994 páginas 15358-61) han mostrado una mutación en la subunidad alfa 1 de NKA de humano y de murino y su importancia para la resistencia a la ouabaína. Ellos han reportado células con un IC_{50} para ouabaína aproximadamente de 5 mM.
NKA es una proteína integrante de la membrana encontrada en las células de todos los eucariotas superiores y es responsable de desplazar a los iones sodio y potasio a través de la membrana celular utilizando ATP como la fuerza conductora. La NKA es un miembro de la clase tipo P de ATPasas que incluyen al retículo sarcoplásmico y a las Ca^{2+}-ATPasas en la membrana plasmática y a las ^{H}+,^{K}+-ATPasas encontradas en el estómago y el colon, además de varias enzimas transportadoras de procariotas (Lingrel J., Jour. Biol. Chem., 1994, páginas 19659-19662). Estas enzimas comparten un ciclo catalítico similar que involucra a una proteína fosforilada intermedia.
La NKA se compone de dos subunidades en proporciones equimolares. Estas son la subunidad alfa con una masa molecular aproximadamente de 113 kDa y la subunidad beta glicosilada más pequeña con una proporción de proteína que cuenta para los 35 kDa de todas las que están por encima de la masa molecular de 55 kDa. Existen isoformas tanto para las subunidades \alpha (\alpha1, \alpha2 y \alpha3) como \beta (\beta1, \beta2 y \beta3). La isoforma \alpha1 está presente en la mayoría de los tejidos, mientras que la isoforma \alpha2 está predominantemente en el músculo esqueletal y se detecta también en el cerebro y en el corazón. La isoforma \alpha3 se limita esencialmente a tejido neural y cardíaco.
Debido al hecho de que todos los mamíferos (en particular humanos, pollos, caballos, cerdos, ovejas pero también camarones como el Bufo marino) tiene aproximadamente la misma secuencia en esta área, esto es, 20 aminoácidos secuencia arriba y 20 aminoácidos secuencia abajo a partir de esta mutación, es muy probable que una mutación similar en estas especies producirá una enzima similar con las mismas características. También es muy probable que si ocurre un cambio de la leucina en posición 801 por una cisteína junto con un cambio en la posición 799 de leucina por cisteína, se obtendría también una enzima con características similares a las de las subunidades alfa 1 de NKA únicamente con una mutación ya sea en la posición 799 o en la 801. Sin embargo, esta sustitución de un aminoácido específico es de gran importancia para el resultado. Lo único e inesperado en esto fue que w c mostró que el cambio del aminoácido leucina 799 por cisteína en el gen de rata que codifica para la subunidad alfa l de NKA produce este drástico cambio en la sensibilidad a la ouabaína. Con concentraciones de ouabaína hasta de 2 mM, no se podía detectar una inhibición significativa de la enzima. También podían ser concebibles otros glucósidos cardíacos tales como: ouabagenina, digitoxina, digitogenina, digoxina, bufalina. Los glycósidos cardíacos podían ser posiblemente utilizados en concentraciones desde 1 nM hasta 5000 \muM, preferiblemente desde 1 \muM hasta 5000 \muM, para separar las células que contienen a la NKA mutada de las células que no contienen a la NKA mutada donde las células se exponen a un glicósido cardíaco y se recuperan las células supervivientes.
La similitud muy grande en la secuencia de aminoácidos entre las especies y las isoformas de esta enzima, en la región de interés, fortalecen la posibilidad de que estas mutaciones puedan ser utilizadas en varias otras especies e isoformas diferentes de la subunidad alfa 1 de la Na^{+},K^{+}-ATPasa de rata. Esto le da a la invención campos más amplios de disponibilidad. También es muy probable que por medio del uso de la subunidad mutada de NKA de cada especie, se pueda hacer una selección de células en aquella especie particular por medio del uso de la subunidad mutada de NKA en esa especie particular. Esto resultará probablemente en el más natural sistema actual de selección.
Un ejemplo en la similitud de aminoácidos (aa) en este dominio (62 aa secuencia arriba y 82 aa secuencia debajo de las mutaciones). La similitud (homología) se da como % de la secuencia de la subunidad alfa 1 de rata.
Alfa 1 humana 100%
Alfa 3 humana 97,2%
Alfa 1 de caballo 99,3%
Alfa 1 de cerdo 99,3%
Alfa 3 de cerdo 98,6%
Alfa 1 de pollo 98,6%
Alfa 2 de pollo 99,3%
Alfa 3 de pollo 96,5%
Alfa 1 de oveja 98,6%
Alfa 2 de rata 98,6%
Alfa 3 de rata 96,5% 
\newpage
Estas subunidades diferentes en una mezcla adecuada serían útiles cuando se preparan animales transgénicos no humanos con diferentes características.
Se había utilizado el gen natural más temprano que codifica para la subunidad alfa l de NKA (vector Ouabr, ver Research Cataloge 1994-1995 de PharMingen, página 271) para la selección de la transfección, pero esto ha tenido limitaciones debido a que su resistencia solamente había sido parcial y únicamente unos pocos tipos de células podían ser transfectadas. La subunidad alfa 1 de NKA proviene aquí de rata que únicamente la hace útil cuando se trata con ratas. Esta nueva enzima (NKA-Leu799Cys, a la que llamamos aquí 799NKA) con una insensibilidad total por la ouabaína hacen a esta proteína mutada y a su gen correspondiente interesantes en diferentes áreas tanto en investigación como clínicamente.
El hecho de que la subunidad \alpha1 de NKA se exprese en todos los tipos de células, puede ser utilizado por medio del uso de áreas/regiones genómicas naturales que controlan la actividad de transcripción del gen. Un ejemplo de una estructura genética que puede ser una parte de la construcción que está destinada a ser utilizada en el área de terapia génica es la siguiente:
100
Donde A, D, E y F son las estructuras genómicas reguladoras naturales secuencia arriba y secuencia debajo de estos genes, alternativamente estructuras reguladoras fundamentalmente activadas.
B es un "gen de selección" que es un gen de ocurrencia natural para la célula que se expresa en todas las células y que uno tiene para la función esencial de la célula (en nuestro ejemplo 1 la subunidad de NKA). Este gen está mutado para que tenga una o más características alteradas (no nocivas para la célula) lo que hace posible que la célula distinga entre el gen de ocurrencia natural y las células no transfectadas (en nuestro ejemplo NKA L799C/L801C). Donde Z representa la mutación en el "gen de selección".
y C es por si mismo el gen más importante para terapia génica.
En la patente estadounidense 4.474.893 se ha sugerido que con el uso de hibridomas resistentes a la ouabaína para seleccionar a las células resistentes a la misma, serían capaces de sobrevivir a los niveles de ouabaína que matan a las células normales sensibles a la ouabaína. La resistencia a la ouabaína puede ser utilizada por si misma como marcador de selección, o en combinación con otros marcadores. También es muy probable que por medio de la mutación de otras proteínas esenciales en las células usted pudiera adquirir una posibilidad similar para hacer una selección entre las células, esto es, células que han recibido esta mutación natural menor de células ordinarias. Otras proteínas esenciales en las células son por ejemplo las enzimas metabólicas y las ADN o ARN polimerasas.
Una explicación de porqué esta mutación por cisteína en la posición 799 causa esta inmensa diferencia cuando se utiliza la NKA en altas concentraciones de ouabaína puede ser que existe un puente de disulfuro cys=cys formado (Kirley, T.L. y colaboradores, Jour. Biol. Chem 1986, páginas 4525-4528). El enlazamiento sugerido entre una cisteína y la ouabaína podría ser eliminado en vista e la invención descrita en esta solicitud debido a la formación de este puente cys=cys. Esta teoría no limita sin embargo la invención de ninguna manera.
La invención será descrita ahora en más detalle con referencia a los dibujos que la acompañan, en los cuales:
La Figura 1 muestra la actividad de la (Na,K)-ATPasa en porcentaje en comparación con el no tratado vs. la concentración de ouabaína en \muM. La Leu799Cys de NKA s una (Na,K)-ATPasa donde la leucina 799 se muta por una cisteína. WT NKA es una (Na,K)-ATPasa natural.
La SEQ ID NO: 1 se relaciona con una subunidad alfa 1 de la (Na,K)-ATPasa (NKA) con su leucina 879 (que corresponde a la 799) mutada por cisteína. La SEQ ID NO: 2 se relaciona con una subunidad alfa 1 de la (Na,K)-ATPasa (NKA) con su leucina 881 (que corresponde a la 801) mutada por cisteína. La SEQ ID NO: 3 se relaciona con una subunidad alfa 1 de la (Na,K)-ATPasa (NKA) con su leucina 879 (que corresponde a la 799) mutada por cisteína y también a su leucina 881 (que corresponde a la 801) mutada por cisteína. La SEQ ID NO: 4 es una subunidad alfa 1de NKA natural. Las SEQ ID NOs: 5-8 son las secuencias de ADN correspondientes a las anteriores secuencias de aminoácidos mencionadas. NO: corresponde a NO: 5, NO: 2 corresponde a NO: 6, NO: 3 corresponde a NO: 7 y NO: 4 corresponde NO: 8. Las SEQ ID NOs: 1-4 incluyen un péptido de inicio de 80 aminoácidos y las SEQ ID NOs: 5-8 incluyen un codón de inicio de 240 ácidos nucleicos de longitud.
La invención será descrita ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos.
Estos ejemplos se dan únicamente para propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención reivindicada aquí.
\global\parskip0.920000\baselineskip
Procedimientos experimentales Mutagénesis
Para introducir la mutación de leucina 799 por cisteína (L799C) o de leucina 801 por cisteína (L801C) en la subunidad \alpha1 de Na^{+},K^{+}-ATPasa, se utilizó una secuencia de ADNc del gen insertado dentro de un vector PBS+BlueScript. Y se introdujeron las mutaciones utilizando una estrategia de mutación por reacción en cadena de la polimerasa (Pfu ADN polimerasa de Stratagene, la Joya, California). Para producir los fragmentos necesarios para crear cada mutación, la PCR se llevó a cabo con los siguientes pares de iniciadores: para crear la mutación L799C:
5'-ATGATTGACCCTCCTCGAGCTGCT-3' 
\hskip0,3cm
5'-AATAAATATCAAGAAGGGGGTGAT-3';
5'-GGCCTGGATCATACCGATCTGT-3' 
\hskip0,8cm
5'-ATTGCAAACATTCCATGTCCCCTGG-3';
para crear la mutación L801C:
5'-ATGATTGACCCTCCTCGAGCTGCT-3' 
\hskip0,3cm
5'-GTTTGCAATAATAAATATCAAGAAGGG-3'
5'-GGCCTGGATCATACCGATCTGT-'3 
\hskip0,8cm
5'-ATTCCACTGCCCTGTGGCACCGTGA-3'.
Se utilizaron los siguientes ciclos para la reacción por PCR: 96ºC durante 3 min seguido por 30 ciclos de 57ºC durante 30 seg, 72ºC durante 1 min y 95ºC durante 20 seg, y finalmente 72ºC durante 5 min. Los fragmentos fueron sometidos a reacción con un polinucleótido quinasa (Boehringer Mannheim, Alemania) durante 30 min a 37ºC y luego ligados con la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Pfu ADN ligasa, Stratagene, La Jolla, California) con ADNc tipo silvestre de \alpha1 de Na^{+},K^{+}-ATPasa como molde. Se utilizaron los siguientes ciclos para la reacción LCR: 96ºC durante 2 min y 60ºC durante 2 min seguido por 30 ciclos de 96ºC durante 20 seg y 60ºC durante 20 seg.
Los fragmentos mutados fueron purificados por medio de electroforésis en gel de agarosa, digeridos con enzimas de restricción Bcl 1 y Eco 47 (New England Biolabs Inc. Estados Unidos) y sustituidos por el fragmento tipo silvestre. Cada clon completo fue secuenciado con un Kit Taq Dye Deoxi Terminador Cycle Sequencing de Applied Biosystems en un Termociclador marca Perkin Elmer Cetus para ADN modelo 9600 para confirmar la mutación y excluir otras mutaciones.
Transfección
El tipo silvestre y el mutante \alpha1 de la Na^{+},K^{+}-ATPasa fueron subclonados en un promotor CMV o adenovirus que contiene un vector de expresión de mamífero y establemente transfectado en células COS7 (mono), LLC-PK1 (cerdo) y MDCK (perro) utilizando el método del Fosfato de Calcio (descrito por Okayama, H., y Chen, C. (1991) en Gene transfer and expression protocols (Murray EJ, ed) páginas 15-21, Humana Press, New Jersey). Las células fueron cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero de ternera fetal y 5% de penicilina/estreptomicina en aire humidificado a 37ºC con 5,3% de CO_{2}. Las células, que se derivan de especies diferentes a las de rata, expresan una Na^{+},K^{+}-ATPasa con una sensibilidad relativamente alta a la ouabaína. La selección de clones transfectados se logró como se describió (Fisone, G., Cheng, S., Nairn, A., Czernik, A., Hemmings, H., Hvvg, J., Bertorello, A., Kaiser, R., Bergman, T., Jvrnvall, H., Aperia, A. and Greengard, P. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9368-9373, Vilsen, B. FEBS Letters (1992) 314(3) 301-307 y Vilsen, B. Biochemistry (1993) 32(48): 13340-13349). En resumen, las células fueron cultivadas en 10 o hasta en 500 \muM de ouabaína durante 3-4 semanas, y se cambió el medio cada tercer día. Las células no transfectadas murieron en el lapso de 2-3 días en medio de ouabaína, mientras que las células que expresan a la subunidad \alpha1 de Na^{+},K^{+}-ATPasa de rata mutante o de tipo silvestre relativamente insensibles a la ouabaína, sobrevivieron. Después de este procedimiento de selección por medio de la ouabaína, se recolectaron varios cientos de clones sencillos con aproximadamente la misma velocidad de crecimiento y sembrados nuevamente en placa en DMEM que contiene 10 ó 500 \muM de ouabaína. Seleccionamos clones de células, que expresan a la Na^{+},K^{+}-ATPasa mutante y de tipo silvestre, que tenían niveles similares de actividad de Na^{+},K^{+}-ATPasa transfectada. La abundancia de Na^{+},K^{+}-ATPasa, tal como se determinó por medio de inmunotransferencia, estaba también dentro del mismo rango en ambos tipos de células. En estudios piloto pudimos distinguir claramente entre poblaciones de Na^{+},K^{+}-ATPasa sensibles a la ouabaína (endógenas) e insensibles a la ouabaína (transfectadas) que fueron completamente inhibidas (la enzima tipo silvestre) por concentraciones de ouabaína de 10^{-5} M y 5x10^{-3} M, respectivamente. Aproximadamente 60% de la Na^{+},K^{+}-ATPasa fue resistente a la ouabaína 10^{-5} M y se consideró que era Na^{+},K^{+}-ATPasa mutada o de tipo silvestre de rata. Además, la expresión del ARNm para la Na^{+},K^{+}-ATPasa mutante y de tipo silvestre mRNA estaba en cada protocolo verificado por medio de RT-PCR con ARNasa libre de ADNase (Pharmacia Biotech, Suecia) trató al ARN total.
Hidrólisis de ATP
Las células que expresan Na^{+},K^{+}-ATPasa mutante y de tipo silvestre fueron sembradas (3,0 x 10^{5} células/pozo) en pozos de 30 mm de diámetro y cultivadas hasta confluencia. Las células fueron lisadas por tratamiento con Tris-HCl 1 mM, pH 7,5 sobre hielo durante 15 min y se preparó una fracción de membrana cruda como se describió (Horiuchi, A., Takeyasu, K., Mouradian, M., Jose, P. y Felder, R. (1993) Mol. Pharmacol. 43, 281-285). La fracción de membrana fue congelada en alícuotas y almacenada durante la noche a -70ºC. Se midió la hidrólisis de ATP dependiente de la Na^{+},K^{+}-ATPasa por triplicado como se describió (Fisone, G., Cheng, S., Nairn, A., Czemik, A., Hemmings, H., Hvvg, J., Bertorello, A., Kaiser, R., Bergman, T., Jvrnvall, H., Aperia, A. y Greengard, P. (1994) J. Biol. Chem. 269, 9368-9373). Se determinó la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa transfectada como la diferencia entre la actividad de la ATPasa a 10^{-5} M y concentraciones de ouabaína que se incrementan en etapas.
Estos procedimientos experimentales produjeron estos resultados en tres ejemplos diferentes:
Ejemplo 1
Después que había sido creada la mutación (leucina 799 por cisteína) en la (Na,K)-ATPasa fue transfectada a una línea celular de mamífero (COS-7). Se estudió la actividad de la enzima normal y de la mutada (ver Figura 1). Se puede observar que la enzima mutada mantiene su actividad casi al 100%, mientras que la actividad de la enzima natural se inhibe en un 85-90% con una concentración de ouabaína de 2 mM.
Ejemplo 2
Se hizo un estudio de la supervivencia de la célula, donde las células transfectadas con la enzima mutada sobrevivieron a un tratamiento prolongado con ouabaína 500 \muM mientras que las células transfectadas con la enzima natural murieron con una concentración de 500 \muM.
Ejemplo 3
LLC-PK1 (células de riñón de cerdo) y MDCK (células de riñón de perro) también han sido transfectadas y los estudios de supervivencia han mostrado que estos tipos de células también sobreviven, se multiplican y mantienen su exterior natural con concentraciones de ouabaína hasta de 500 \muM.
Se acepta generalmente que las células LLC-PK1 tienen una tendencia a diferenciarse cuando la población de células se desarrolla hasta confluencia y las células forman configuraciones circulares con propiedades de transporte similares a las células epiteliales. La transfección de la subunidad alfa 1 mutada de Na^{+},K^{+}-ATPasa de rata (L799 y/o L801C) dentro de las células LLC-PK1 no pareció alterar las características morfológicas y de desarrollo de estas células, en concentraciones tan altas de ouabaína de 500 x 10^{-6} M.
La transfección de las líneas celulares COS7 y MDCK no afectó la morfología y el desarrollo de estas células como en el caso de las células LLC-PK1.
Las células no transfectadas murieron dentro de unos pocos días en 1-50 x 10^{-6} M de ouabaína, las células transfectadas de tipo silvestre murieron en el lapso de unos pocos días en ouabaína 500 x 10^{-6} mientras que las células mutantes transfectadas sobrevivieron a concentraciones tan altas de ouabaína de al menos 1 x 10^{-3} M.
Ejemplo 4 Adhesión de las Células
La adhesión de las células sobre sustratos recubiertos con fibronectina fue evaluada en pozos de microtitulación (Costar). Todos los pozos fueron preincubados durante la noche a 4ºC con una concentración de 5 \mug/ml de fibronectina. Antes de añadir las células, cada pozo fue preincubado con 1% de BSA durante 30 minutos a 37ºC y luego lavado con suero libre de DMEM. Las células COS-7 no transfectadas y las células COS-7 que expresan a la Na^{+},K^{+}-ATPasa tipo silvestre o de L799C fueron cultivadas en un medio que contiene 3 \muCi/ml de H3-timidina suplementada con 10% de suero fetal de ternera y cosechadas aproximadamente después de 72 horas a 60-80% de confluencia. Se sembraron aproximadamente 25000 células/pozo en suero libre de DMEM. Las células fueron incubadas primero 15 min con diferentes concentraciones de ouabaína y luego se les permitió adherirse a sustratos recubiertos con fibronectina (5 \mug/ml) durante 30 min de incubación a 37ºC y luego se las lavó con suero libre de DMEM. Se midió la radiactividad en un contador de Centelleo Wallac. Los resultados se presentan como % de radioactividad remanente comparado con las células no tratadas.
Resultados de la Adhesión de las Células
Este sistema se basa en diferencias en la adhesión de las células entre células transfectadas y no transfectadas cuando se las expone a la ouabaína. Ya que podemos mostrar aquí que una inhibición de la actividad de la Na^{+},K^{+}-ATPasa conduce a una inhibición concomitante de la adhesión de las células, esto puede ser utilizado para seleccionar las células transfectadas, fácil de utilizar en diferentes aplicaciones, en poca horas en vez de varias semanas. Esto puede acelerar el procedimiento varias veces. Durante la selección con diferentes concentraciones de ouabaína (esto es, la inhibición de la Na^{+},K^{+}-ATPasa), la adhesión de las células disminuyó la dependencia de la dosis en las células no transfectadas pero no se observó cambio en la adhesión en las células transfectadas. Cuando se logró la inhibición completa de la Na^{+},K^{+}-ATPasa no se observó casi ninguna adhesión. El efecto sobre la adhesión fue observado en minutos. Este procedimiento podría ser repetido para obtener una eficiencia en la selección del 100% en horas.
Los resultados en la Figura 2 se presentan como la media de 3 experimentos. Se puede observar claramente una "perdida de adhesión" en las células no transfectadas y en las transfectadas de tipo silvestre comparado con las células transfectadas L799C con la Na^{+},K^{+}-ATPasa.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Karolinska Innovation
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: Tomtebodav 11F
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Estocolmo
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): 171 77
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TELÉFONO: 08-7286510
\vskip0.500000\baselineskip
(H)
TELEFAX: 08-303423
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVO MARCADOR DE SELECCIÓN (subunidad alfa 1 de NKA mutada)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
COMPUTADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rattus rattus 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: rata
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
1
2
3
4
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Subunidad alfa 1 de NKA
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: rata
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TIPO DE CÉLULA: rata
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8
9
10
11
12 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Subunidad alfa 1 de NKA
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: rata
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TIPO DE CÉLULA: rata
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
13
14
15
16
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Subunidad alfa 1 de NKA
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: rata
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TIPO DE CÉLULA: rata
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3636 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rattus rattus 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: RATA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
25
26
27
28
29
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3636 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rattus rattus 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: RATA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
31
32
33
34
35 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3636 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Rattus rattus 
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: RATA
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
36
37
38
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3636 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
ENTRELAZAMIENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: subunidad alfa 1 de NKA
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
AISLADO DEL INDIVIDUO: rata
\vskip0.500000\baselineskip
(G)
TIPO DE CÉLULA: rata
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
41
42
43
44
45

Claims (12)

1. Una proteína que es (Na,K)-ATPasa o una de sus subunidades alfa que comprende la secuencia de aminoácidos:
IFIIANIPX_{1}PX_{2}GTVTILCID
donde al menos uno entre X_{1} y X_{2} es cisteína.
2. La proteína de acuerdo a la reivindicación 1 que comprende al menos una de las siguientes tres secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste de:
IFIIANIPCPLGTVTILCID, 
\hskip0.5cm
IFIIANIPLPCGTVTILCID 
\hskip0.5cm
o 
\hskip0.5cm
IFHANIPCPCGTVTILCID.
3. La proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2 que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3.
4. Una secuencia de ácido nucleico que codifica a una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Un vector que comprende al ácido nucleico de la reivindicación 4.
6. Una célula que comprende a un vector de acuerdo con la reivindicación 5.
7. Una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleica de acuerdo con la reivindicación 4 para uso médico.
8. Un vector para uso en terapia génica que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 junto con otra secuencia de ácido nucleico de interés fisiológico.
9. Un método para detectar si una cierta transfección o transformación de una célula eucariota con un gen de interés es exitosa, que comprende:
a)
transfectar o transformar la célula con un vector que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4 así como al gen de interés;
b)
incubar las células de la etapa a) con una cantidad adecuada, preferiblemente 1-5000 \muM, de un glicósido cardíaco tal como ouabaína, ouabagenina, digitoxina, digitogenina, digoxina y bufalina;
c)
poner en contacto a las células de la etapa b) con una matriz sólida recubierta con fibronectina;
d)
detectar a cualquiera de las células que se haya enlazado a la matriz.
10. El método de acuerdo a la reivindicación 9, en donde la incubación en la etapa b) dura de 5 a 30 minutos, y preferiblemente durante 15 minutos, y donde la etapa c) se lleva a cabo durante 5 a 60 minutos, y preferiblemente durante 30 minutos.
11. El método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en donde el glicósido cardíaco es ouabaína.
12. Un método para evaluación selectiva de células animales que comprende una proteína de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende las etapas de:
a)
exponer las células a un glicósido cardíaco tal como ouabaína, ouabagenina, digitoxina, digitogenina, digoxina y bufalina;
b)
recobrar las células sobrevivientes.
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