ES2283068T3 - Vector de adenovirus porcino recombinante. - Google Patents
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Abstract
Vector recombinante que comprende un adenovirus porcino recombinante de serotipo 3 (PAV3) que incorpora de manera estable, y capaz de expresar la secuencia nucleotídica heteróloga en el que dicha secuencia nucleotídica heteróloga se incorpora en una zona no esencial de un sitio en las unidades 97 a 99, 5 de la cartografía del PAV3.
Description
Vector de adenovirus porcino recombinante.
La presente invención se refiere a vectores de
transferencia de genes que producen antígenos (secuencias de genes
heterólogas o fragmentos de las mismas) utilizados para generar
respuestas inmunitarias en cerdos destinados al comercio que pueden
resultar diezmados por enfermedad. Dichos vectores son especialmente
útiles para la preparación de vacunas que pueden administrarse
fácilmente a gran escala para proteger a los cerdos contra la
enfermedad. La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de producción de vectores de transferencia adecuados,
a los procedimientos de preparación de las vacunas a base de los
vectores, a las estrategias de administración y a un procedimiento
para proteger a los cerdos de la enfermedad.
La productividad de la industria porcina
intensiva depende del control de las enfermedades infecciosas.
Aunque las enfermedades pueden controlarse en parte mediante una
buena higiene y medidas sanitarias, la industria debe basarse
todavía en la vacunación para proteger las piaras. En una situación
comercial, el coste por animal es elevado desde el punto de vista
de la alimentación y de los costes actuales de control de la
enfermedad y por consiguiente, los costes en la prevención de la
enfermedad y el control mediante cualquier vacuna recién propuesta
deben ser económicos, eficaces y de fácil administración.
Convencionalmente, las vacunas que constituyen
las partículas víricas vivas se han preparado mediante atenuación
del virus y selección de las formas atenuadas. Alternativamente, se
prepararon vacunas inactivadas a partir de virus virulentos.
La descripción más reciente de la utilización de
vectores víricos en el control de la enfermedad en cerdos fue el
mutante por deleción del virus de la pseudorrabia para el control de
la enfermedad de Aujesky. La utilización de un herpesvirus como
vector presenta la ventaja de poder estimular una respuesta humoral
y mediada por células, proporcionando de este modo posible
protección para una vida prolongada. Otra ventaja es la capacidad de
insertar otras secuencias heterólogas en este vector, que se
expresan en un activador adecuado, para producir antígenos
destinados a la exposición al sistema inmunitario de los animales,
protegiéndoles de este modo contra dos enfermedades. Existen
inconvenientes en este sistema. En primer lugar, está el asunto de
la latencia. Los herpesvirus tienen capacidad para integrarse
dentro de las neuronas en los ganglios durante la vida del animal.
Esto únicamente requiere una intensidad adecuada en el animal para
producir la reactivación del virus y en consecuencia toda la
enfermedad. Sin embargo, se conoce actualmente que la deleción de un
gen específico, glucoproteína E, atenuará el virus e impedirá la
reactivación desde la latencia. Por consiguiente, este vector de
deleción actualmente se utiliza ampliamente como vector de
erradicación para la enfermedad de Aujesky y en consecuencia no
estará disponible como vector adecuado para la transferencia de
otros antígenos.
Por lo tanto el objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar un vehículo de transferencia para
las secuencias heterólogas del material genético que es
particularmente adecuado para la administración a gran escala.
En particular, el objetivo de la presente
invención consiste en proporcionar o potenciar los medios para la
generación y/o optimización de la inmunidad mediada por anticuerpos
o células a fin de proporcionar protección contra la infección en
las enfermedades porcinas habituales. Otro objetivo consiste en
proporcionar un procedimiento para la preparación de unos medios
adecuados para la generación y/o optimización de la inmunidad
mediada por anticuerpos o células a fin de proteger a los cerdos
contra la infección en las enfermedades porcinas habituales. Otro
objetivo consiste en proporcionar una estrategia de protección.
La presente invención proporciona, en una forma
de realización, un adenovirus recombinante porcino capaz de
expresar el ADN de interés, estando dicho ADN de interés integrado
de manera estable en un punto apropiado de dicho genoma del
adenovirus porcino recombinante.
En otra forma de realización la invención
proporciona un vector recombinante que incluye un adenovirus porcino
recombinante que incorpora de manera estable por lo menos una
secuencia nucleotídica heteróloga. Preferentemente la secuencia
nucleotídica heteróloga es capaz de expresión como polipéptido
antigénico. El polipéptido antigénico codificado por lo menos por
una secuencia nucleotídica es preferentemente extraño al vector
hospedador.
En otra forma de realización de la presente
invención la secuencia nucleotídica heteróloga es capaz de expresión
como molécula inmunopotenciadora.
Debe entenderse también que la secuencia
nucleotídica heteróloga puede codificar y/o expresar, un polipéptido
antigénico y una molécula inmunopotenciadora.
El vector recombinante puede comprender un
adenovirus porcino recombinante vivo en el que las proteínas
estructurales del virión están inalteradas con respecto a éste en
el adenovirus porcino natural a partir del cual se produce el
adenovirus porcino recombinante.
La presente invención se refiere parcialmente al
descubrimiento de que existen zonas no esenciales en el genoma del
adenovirus porcino que no corresponden a las caracterizadas
anteriormente en otros adenovirus haciendo de este modo a este virus
particularmente adecuado para la transferencia de secuencias
heterólogas.
La presente invención se refiere también al
descubrimiento de que el adenovirus porcino genera una respuesta
prolongada en los cerdos que le hace de este modo muy adecuado como
vehículo para la vacuna. Además, la existencia de numerosos
serotipos específicos para los aparatos respiratorio o
gastrointestinal, permite la selección de un vehículo para la vacuna
adecuado a un órgano diana y del tipo de respuesta inmunitaria
requerido.
La invención se refiere también al
descubrimiento de que el adenovirus porcino puede encapsular el ADN
genómico mayor de la regla del 105% para adenovirus de mamífero con
genomas de tamaño intermedio y que los viriones encapsulados
resultantes son estables in vitro e in vivo.
Los adenovirus son una familia grande y diversa,
que han sido aislados en muchas especies vivas, incluyendo el
hombre y otros mamíferos así como una variedad de aves. Como
resultado los adenovirus han sido separados por lo menos en dos
géneros, los Mastoadenoviridae y Aviadenoviridae, y
más recientemente se ha propuesto un tercer género, el
Atadenoviridae, que incluye algunos adenovirus bovinos y
aviares (síndrome del descenso de puesta) (Benkö y Harrach,
Archives of Virology 143, 829-837, 1998).
Los adenovirus porcinos son agentes infecciosos
frecuentes de cerdos y hasta la fecha se han reconocido cuatro
serotipos distintos (Adair y McFerran, 1976) y pruebas de por lo
menos uno más (Derbyshire et al., 1975). De los cuatro
serotipos descubiertos, tres (serotipos 1 a 3) fueron aislados del
aparato gastrointestinal mientras que el cuarto fue recuperado en
el sistema respiratorio. Los adenovirus porcinos se considera que
son un agente patógeno bajo muy extendido y aunque se realizan
aislamientos en general en animales enfermos, lo más probable era
que los adenovirus estuvieran presentes solamente en forma de una
infección secundaria. Se han aislado en cerdos con diarreas e
infecciones respiratorias pero se ha considerado que por lo menos
las infecciones por adenovirus gastrointestinales son normalmente
asintomáticas (Sanford y Hoover, 1983). Los adenovirus porcinos se
propagan por ingestión o inhalación y la infección experimental por
vía oral, intranasal e inoculaciones intratraqueales han dado como
resultado la absorción del virus. Los estudios experimentales de
patogenicidad han demostrado que los puntos principales de infección
son el intestino delgado inferior probablemente las amígdalas
(Sharpe y Jessett, 1967; Shadduck et al, 1968). En la
infección del serotipo 4, parece desarrollarse una viremia en
infecciones experimentales. Sin embargo, ésta puede ser una
manifestación menos frecuente en serotipos gastrointestinales
(Shadduck et al., 1968). La excreción fecal es la causa más
frecuente de la propagación del PAV, que está presente durante
varias semanas después de la infección. Las secreciones nasales
también tienen lugar en condiciones experimentales. Se ha sugerido
que la función de los PAV en la neumonía consiste en que un factor
de predisposición o sinérgico (Kasza et al., 1969; Schiefer
et al., 1974) pero la neumonía experimental con serotipo 4
no requirió un segundo agente para producir la enfermedad
(Smith et al., 1973).
(Smith et al., 1973).
Los adenovirus porcinos han de examinarse
todavía con mucho detalle y se conoce poco acerca de su función en
la enfermedad o su frecuencia de aparición. Esto es debido al hecho
de que no producen ninguna enfermedad significativa en las piaras y
no han podido atraer el interés de la industria por pérdida de
producción. Es probable que el número de serotipos de adenovirus
porcinos es mucho mayor de cuatro y que probablemente existe en la
mayoría de las piaras de cerdos como un comensal normal.
La investigación realizada sobre el adenovirus
porcino con respecto a su morfología y biología molecular, ha
demostrado algunas similitudes con otros Mastadenovirus
examinados. Su morfología es la de otros adenovirus examinados con
un cápsido icosahédrico que contiene un núcleo de un genoma de ADN
bicatenario. Se ha publicado muy poca investigación sobre la
caracterización del genoma del PAV (Benkö et al., 1990,
Kleiboeker et al., 1993, Reddy et al., 1993,
Kleiboeker, 1994). El tamaño del genoma del PAV (aprox. 34,8 kb) es
ligeramente más pequeño que el de los adenovirus humanos (aprox.
35,9 kb). Un estudio ha demostrado utilizando la hibridación con
sondas de ADN procedentes del genoma total de adenovirus humano de
tipo 2 que existe una homología razonable del ADN entre los
adenovirus porcino y humano (Benkö et al., 1990). Un artículo
reciente sobre el serotipo 4 del PAV demostró que su esquema
genómico era también similar al de los adenovirus humanos en el área
de las zonas L4 y E3 (incluyendo los genes 33K y pVIII) incluso
aunque la homología de la secuencia no fuera tan acusada como
pudiera haberse esperado (Kleiboeker, 1994).
Aunque al seleccionar el PAV apropiado para el
desarrollo de vectores vivos para administrar vacunas a cerdos, es
importante tener en cuenta la frecuencia natural de los serotipos.
Estos serotipos no encontrados normalmente en el campo presentan
ventajas obvias respecto a los que están expuestos frecuentemente
los cerdos y para los que pueden haber desarrollado inmunidad.
Otra consideración es la capacidad del vector
para permanecer activo en el cerdo más allá del periodo en el que
los anticuerpos maternos en el calostro protegen los cerdos
inmediatamente después del parto.
Otras consideraciones importantes al seleccionar
los potenciales vectores del PAV son la patogenicidad y la
inmunogenicidad. Preferentemente los virus vivos del vector deberían
ser muy infecciosos pero no patógenos (o por lo menos atenuados) de
modo que no les afectan desfavorablemente las especies diana.
Los candidatos preferidos para los vectores de
vacuna son cepas no patógenas de serotipo 4 (respiratorio) y
serotipo 3 (gastrointestinal). El serotipo 3 se ha seleccionado como
serotipo de elección debido a las excelentes capacidades de
crecimiento en líneas celulares de riñón de cerdo en continuo. El
aislamiento de otros serotipos, que parece probable, puede alterar
bien esta selección. Es destacable que las cepas más virulentas
producen una respuesta mayor al anticuerpo.
Las secuencias nucleotídicas heterólogas que
pueden incorporarse en las zonas no esenciales del genoma vírico y
que pueden codificar los determinantes antigénicos de organismos
infecciosos contra los que es deseable la generación de anticuerpo
o la inmunidad mediada por células pueden ser los que expresan
determinantes antigénicos de infecciones intestinales producidas
por virus gastrointestinales; por ejemplo infecciones por rotavirus
o parvovirus, o virus respiratorios, por ejemplo virus de la
paragripe o el de la encefalitis japonesa.
Las secuencias nucleotídicas heterólogas que
pueden incorporarse incluyen los determinantes antigénicos de los
agentes siguientes:
- \circ
- Parvovirus porcino
- \circ
- Mycoplasma hyopneumoniae
- \circ
- Paragripe porcina
- \circ
- Gastroenteritis transmisible (coronavirus porcino)
- \circ
- Rotavirus porcino
- \circ
- Virus del cólera porcino (fiebre porcina clásica)
- \circ
- Disentería porcina
- \circ
- Virus de la fiebre porcina africana
- \circ
- Virus de la pseudorrabia (virus de la enfermedad de Aujesky) en particular, la glucoproteína D del virus de la pseudorrabia
- \circ
- Virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV)
- \circ
- Las secuencias nucleotídicas heterólogas más preferidas para la incorporación en los vectores de la invención son las que expresan determinantes antigénicos de parvovirus porcino, rotavirus porcino, coronavirus porcino y virus de la fiebre porcina clásica.
Está asimismo previsto que las secuencias
heterólogas incorporadas pueden ser moléculas inmunopotenciadoras
tales como las citocinas o los activadores de crecimiento, por
ejemplo la interleucina 4 (IL4) porcina, interferón gamma
(\gammaIFN), factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias
de granulocitos (G-CSF), ligando
FLT-3 e interleucina 3 (IL-3).
El tipo de respuesta inmunitaria estimulado por
los vectores candidatos puede afectar la selección de secuencias
nucleotídicas heterólogas para la inserción en las mismas. Los
serotipos 1, 2 y 3 del PAV, que infectan de manera natural a través
del intestino pueden producir inmunidad local de las mucosas y por
lo tanto son más adecuadas para las infecciones de los intestinos
(p. ej., el virus de la fiebre porcina clásico). El serotipo 4 del
PAV, que infecta de manera natural a través del sistema
respiratorio, puede ser más adecuado para las infecciones del
aparato respiratorio (p. ej., la paragripe porcina) puede también
producir buena inmunidad local.
El ADN de interés que puede comprender genes
heterólogos que codifican determinantes antigénicos o moléculas
inmunopotenciadoras puede estar situado por lo menos en una zona no
esencial del genoma vírico.
Las zonas no esenciales del genoma vírico que
pueden ser adecuadas para los fines de sustitución con las
secuencias nucleotídicas heterólogas o inserción de las mismas
pueden ser zonas que no codifican al final del terminal derecho del
genoma en unidades 97 a 99,5 de la cartografía. Las zonas que no
codifican preferidas incluyen la zona preliminar (E3) del genoma del
PAV en las unidades 81 a 84 de la cartografía.
Las secuencias génicas heterólogas pueden estar
asociadas a un activador y a una secuencia líder para que la
secuencia nucleotídica pueda expresarse in situ tan
eficazmente como sea posible. Preferentemente la secuencia génica
heteróloga está asociada al activador tardío principal adenovírico
porcino y a la secuencia líder de corte y empalme. El activador
tardío principal de adenovirus de mamífero se une cerca de las
unidades 16 a 17 de la cartografía en la cartografía genética del
adenovirus y contiene un motivo de la secuencia TATA clásica
(Johnson, D. C., Ghosh-Chondhury, G., Smiley, J. R.,
Fallis, L. y Graham., F. L. (1988), Abundant expresión of herpes
simples virus glycoprotein gB using an adenovirus vector.
Virology 164, 1-14).
La secuencia líder de corte y empalme del
serotipo del adenovirus porcino en consideración es una secuencia
tripartita que corta y empalma en el extremo 5' del ARNm de todos
los genes tardíos.
La secuencia génica heteróloga puede también
estar asociada a una secuencia de poliadenilación.
El lugar del activador tardío principal del
adenovirus porcino, puede utilizarse cualquier otro activador
eucariótico adecuado. Por ejemplo, pueden utilizarse los del virus
SV40, citomegalovirus (CMV) o adenovirus humano.
Pueden considerarse también otras señales de
tratamiento y poliadenilación aparte de las de los adenovirus
porcinos, por ejemplo, la del SV40.
En otro aspecto de la invención se proporciona
una vacuna recombinante para generar y/u optimizar la inmunidad
mediada por anticuerpos o células con el fin de proporcionar o
aumentar la protección contra la infección por organismos
infecciosos en cerdos, incluyendo la vacuna por lo menos un vector
recombinante de adenovirus porcino que incorpora por lo menos una
secuencia nucleotídica heteróloga formulada con portadores y
excipientes adecuados. Preferentemente la secuencia nucleotídica es
capaz de expresión como polipéptido antigénico o como molécula
inmunopotenciadora. Más preferentemente, la secuencia nucleotídica
heteróloga puede codificar y/o expresar, un polipéptido antigénico y
una molécula inmunopotenciadora.
El polipéptido antigénico codificado por lo
menos por una secuencia nucleotídica es preferentemente extraño al
vector hospedador. Por lo menos una secuencia nucleotídica puede
asociarse a un activador/líder y a una secuencia poli A.
El vacuna recombinante puede comprender un el
vector de adenovirus porcino recombinante vivo en el que las
proteínas estructurales del virión están inalteradas con respecto a
éste en el adenovirus porcino natural a partir del cual se produce
el adenovirus porcino recombinante.
Los candidatos a vector preferidos destinados a
su utilización en la vacuna recombinante son cepas de PAV de
serotipo 3 y 4. La utilización de otros serotipos es posible,
dependiendo de la inmunidad que existe en la piara y de su
medio.
La vacuna puede ser dirigida contra las
infecciones respiratorias e intestinales producidas por una variedad
de agentes. Para dirigir la vacuna contra un organismo infeccioso
específico, pueden incorporarse secuencias génicas heterólogas que
codifican los determinantes antigénicos de los organismos
infecciosos en zonas no esenciales del genoma del adenovirus
porcino que comprende el vector. Si la vacuna va a utilizarse para
optimizar la protección contra la enfermedad, las secuencias
nucleotídicas heterólogas adecuadas pueden ser las de los
inmunopotenciadores tales como citocinas o activadores de
crecimiento.
La vacuna puede comprender otros constituyentes,
tales como estabilizantes, excipientes, otros compuestos
farmacéuticamente aceptables o cualquier otro antígeno o parte del
mismo. La vacuna puede estar en forma de una preparación
liofilizada o en forma de suspensión, todas las cuales son
frecuentes en el campo de la producción de vacunas.
Un transportador adecuado para dicha vacuna
puede ser una solución salina isotónica tamponada.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un procedimiento de preparación de una vacuna para la generación
y/u optimización de anticuerpos o para la inmunidad mediada por
células a fin de producir o aumentar la protección contra un
organismo infeccioso en un cerdo, que incluye la construcción de un
vector de adenovirus porcino recombinante que incorpora de manera
estable por lo menos una secuencia nucleotídica heteróloga, y
colocar dicho vector de adenovirus porcino recombinante en una
forma adecuada para su administración. Preferentemente la secuencia
es capaz de la expresión como polipéptido antigénico aunque puede
ser también una molécula inmunopotenciadora. Más preferentemente,
la secuencia nucleotídica puede codificar y/o expresar, un
polipéptido antigénico y una molécula inmunopotenciadora. La
secuencia nucleotídica es convenientemente extraña al vector
hospedador.
hospedador.
Aún más preferentemente, la secuencia
nucleotídica está asociada a secuencias activadoras/líder y de poli
A.
La forma de administración puede ser la de una
unidad de dosificación entérica recubierta, un inóculo para
administración intraperitoneal, intramuscular o subcutánea, un
pulverizador en aerosol, aplicación por vía oral o intranasal.
También es posible la administración en el agua potable o en
gránulos de pienso.
En otro aspecto de la invención, se proporciona
un procedimiento de producción de un vector de vacuna de adenovirus
porcino que incluye la inserción en el adenovirus porcino de por lo
menos una secuencia nucleotídica heteróloga. Dicha secuencia
nucleotídica heteróloga es capaz preferentemente de expresión como
polipéptido antigénico aunque puede ser también una molécula
inmunopotenciadora. Más preferentemente, la secuencia nucleotídica
puede codificar y/o expresar, un polipéptido antigénico y una
molécula inmunopotenciadora.
Preferentemente el polipéptido antigénico
codificado por lo menos por una secuencia nucleotídica es extraño al
vector hospedador.
Más preferentemente, la secuencia nucleotídica
heteróloga está asociada a secuencias activadoras/líder y de poli
A.
En un procedimiento de construcción de un vector
adecuado para la zona no esencial que va a alterarse para
incorporar el ADN extraño podría construirse mediante recombinación
heteróloga. Mediante este procedimiento se clona la zona no
esencial y el ADN extraño junto las secuencias de poliadenilación
líder y activadora se insertan preferentemente por recombinación
homóloga entre las secuencias situadas a los lados. Mediante este
procedimiento también es posible la eliminación de las porciones de
la zona no esencial para crear más espacio para las inserciones
mayores de ADN que están más allá de las limitaciones de encapsulado
normal del virus.
Mediante este procedimiento puede construirse
una casete de expresión de ADN que contiene un activador de PAV
apropiado con la secuencia génica extraña así como las secuencias
líder y las secuencias de reconocimiento de poliadenilación con los
sitios exclusivos de la enzima de restricción que flanquean la
casete permitiendo la fácil inserción dentro del genoma del PAV.
En otro aspecto de la invención se proporcionan
estrategias para la administración de las vacunas de la
invención.
En una estrategia, un antígeno heterólogo y una
molécula inmunomoduladora tal como una citocina pueden expresarse en
el mismo recombinante y transferirse como una vacuna individual.
En una estrategia según la invención las vacunas
basadas en vector PAV pueden administrarse como cócteles que
comprenden 2 o más vectores víricos que transportan diferentes genes
extraños o inmunopotenciadores.
En una estrategia de vacunación preferida de la
invención, el cóctel o la estrategia simultánea, se utiliza una
vacuna basada tanto en el serotipo 3 como en el serotipo 4 del
PAV.
En otra estrategia preferida, se construye un
adenovirus porcino básico recombinante de serotipo 3 y el gen de la
fibra del serotipo 4 que sustituye al del serotipo 3 o la fibra del
serotipo 4 clonado además en la vacuna para ampliar el objetivo de
la invención a la transferencia tanto intestinal como
respiratoria.
En una estrategia alternativa según la
invención, las vacunas basadas en el vector PAV pueden administrarse
consecutivamente unas de otras para administrar vacunas de refuerzo
o nuevas vacunas en alguna etapa posterior a la vacunación inicial
con PAV. Las vacunas utilizadas están basadas preferentemente en
cepas heterólogas de PAV.
En una versión preferida de la estrategia
"consecutiva", se seleccionan vacunas basadas en cepas aisladas
por serotipo no relacionadas a fin de conseguir máxima protección
contra la infección. En un ejemplo de dicha estrategia una vacuna
basada en el serotipo 3 de PAV se administra posteriormente o antes
de la vacunación con una vacuna basada en el serotipo 4 del PAV.
Se inoculan convenientemente cerdos con vacunas
de vector según la invención a cualquier edad. Los lechones pueden
vacunarse con 1 día, las hembras reproductoras pueden vacunarse
regularmente hasta el momento del parto y después de éste.
Preferentemente según la estrategia consecutiva
o la estrategia de cóctel, los cerdos se vacunan aunque todavía no
sean completamente inmunocompetentes. De manera más conveniente, los
cerdos de días pueden vacunarse para la protección contra la
infección después de un periodo de 4 semanas posterior a la
vacunación inicial.
En una forma de realización adicional de la
invención se proporciona una utilización de los vectores para la
preparación de un medicamento destinado a la producción de una
respuesta inmunitaria en un cerdo administrando al cerdo una
cantidad eficaz de una vacuna recombinante según la invención. Una
cantidad eficaz es una cantidad suficiente para producir una
respuesta inmunitaria, preferentemente por lo menos 10^{4}
TCID_{50} por dosis.
La vacuna de la invención desde luego puede
combinarse con vacunas contra otros virus u organismos tales como
parvovirus o de la enfermedad de Aujeszky en el momento de su
administración.
En un aspecto preferido de esta forma de
realización de la invención, la administración es por vía oral o
intranasal.
Los procedimientos para la construcción y
experimentación de vectores recombinantes y vacunas según la
presente invención son bien conocidos por los expertos en la
materia. Los procedimientos normalizados para la digestión,
ligadura y electroforesis de endonucleasa se realizaron según las
instrucciones de los fabricantes o suministradores. Las técnicas
normalizadas no están descritas con detalle y resultarán evidentes
por los expertos en la materia.
La Figura 1 ilustra la cartografía de la
endonucleasa de restricción del ADN del genoma completo del serotipo
3 del PAV.
La Figura 2 ilustra la caracterización de la
secuencia y la clonación del activador tardío principal y las
secuencias líder de corte y empalme del serotipo 3 del PAV.
La Figura 3 ilustra las secuencias del activador
tardío principal, la secuencia potenciadora corriente arriba y los
determinantes 1, 2 y 3 de corte y empalme.
La Figura 4 ilustra las 720 bases terminales del
extremo derecho del genoma.
La Figura 5 ilustra la zona activadora de E3 y
el área L4 de solapamiento.
La Figura 6 ilustra un procedimiento de
construcción preferido de un vector PAV.
La Figura 7 representa los datos de temperatura
de cerdos vacunados con una vacuna a base de PAV después de la
prueba de provocación con el antígeno CSFV.
La Figura 8 representa gráficamente las
concentraciones de anticuerpo anti-PAV detectadas
por ELISA en cerdos antes y después de la vacunación con una vacuna
a base de PAV.
La Figura 9 ilustra gráficamente el desarrollo
de anticuerpos neutralizantes en cerdos vacunados con una vacuna a
base de PAV antes y después de la prueba de provocación con el
antígeno CSFV.
La Figura 10 ilustra gráficamente la media de
los recuentos de leucocitos (WBC) de cerdos vacunados con una vacuna
de PAV recombinante que expresa G-CSF porcino.
La Figura 11 ilustra gráficamente el cambio de
porcentaje en los recuentos de leucocitos (WBC) después de la
vacunación con una vacuna de PAV recombinante que expresa
G-CSF porcino.
La Figura 12 representa gráficamente el cambio
de porcentaje en las poblaciones de monocitos después de la
vacunación con PAV-G-CSF
recombinante.
La Figura 13 representa gráficamente el cambio
de porcentaje en las poblaciones de linfocitos después de la
vacunación con PAV-G-CSF
recombinante.
La Figura 14 representa gráficamente el cambio
en la estimulación de linfocitos T después de la vacunación con
PAV-G-CSF recombinante.
Las Figuras 15a, b y c ilustran gráficamente un
procedimiento de construcción de un vector E3 de PAV.
Se describen a continuación aspectos de las
formas de realización preferidas de la invención basados en el
serotipo 3 y el serotipo 4 de cepas de PAV. Aunque estas dos cepas
se han seleccionado debido a sus puntos de infección en el cerdo,
debe apreciarse que otras cepas de adenovirus porcino pueden ser más
adecuadas para la construcción de vectores de vacuna con la
condición de que reúnan los criterios de selección descritos
anteriormente en la presente memoria.
En general, los PAV se consideran de baja
patogenicidad con pocas consecuencias en este campo. La importancia
patogénica de PAV se estudia en Derbyshire, 1989. El primer informe
de aislamiento de PAV fue de un cerdo de 12 días con diarrea (Haig
et al., 1964). Dos años después, el PAV de tipo 4 se
describió por primera vez, aislado en el cerebro de un cerdo que
padecía encefalitis de causa desconocida (Kasza, 1966). Los informes
posteriores han asociado el PAV principalmente a diarreas en este
campo aunque esto se produce normalmente con poca frecuencia. El
PAV puede ser aislado también de forma regular de animales sanos sin
síntomas de enfermedad y es muy probable que su aislamiento de
animales enfermos sea más una coincidencia de su extensión que un
indicador de patogenicidad. Sin embargo, se ha descrito una
asociación entre el serotipo 4 y la enfermedad respiratoria (Watt,
1978) y esto ha sido apoyado por infección experimental (Edington
et al., 1972). Las infecciones experimentales con serotipos
gastrointestinales del virus (p. ej., serotipo 3) han podido
producir diarrea pero los cambios patológicos producidos no fueron
clínicamente significativos.
El genoma del serotipo 3 del PAV seleccionado
fue caracterizado por procedimientos convencionales. En la Figura 1
se ilustran las cartografías de la endonucleasa de restricción del
ADN del genoma completo. Los genomas están orientados de izquierda
a derecha. Por convención los genomas de adenovirus se orientan
normalmente de modo que la zona terminal a partir de la que se
sintetizan los transcritos de ARNm no tardíos está situada en el
extremo izquierdo. Las enzimas utilizadas para generar la
cartografía se indican al borde de cada cartografía.
Mediante la utilización de la enzima de
restricción y de las cartografías genéticas del genoma del serotipo
3 de PAV, se localizó una zona que contenía las secuencias del MLP y
las secuencias líder (Fig. 1). Los fragmentos identificados en esta
zona se clonaron en vectores plásmido y se secuenciaron.
La secuencia del activador de MLP fue
identificada al contener una secuencia TATA clásica, la única en la
zona secuenciada, así como factores corriente arriba y se confirmó
posteriormente por la posición de la secuencia líder y el punto de
inicio de la transcripción.
Las Figuras 2 y 3 ilustran la caracterización de
la secuencia del activador tardío principal y las secuencias líder
de corte y empalme del serotipo 3 del PAV.
A fin de determinar la estructura y secuencia de
la secuencia líder de corte y empalme para el ARNm tardío, se
infectaron células porcinas de riñón con PAV y se dejó proceder la
infección hasta el final del ciclo de infección (normalmente 20 a
24 h p.i.). En ese momento se purificó el ARN completo en las
células infectadas utilizando el kit de purificación de ARN
completo RNAgents (Promega). El ARN aislado se precipitó con
isopropanol y se almacenó a -70ºC en alícuotas de 200 \mul hasta
que se necesitó. Se aisló poli A (ARNm) procedente de ARN completo
mediante la utilización del Poly AT tract System (Promega, EEUU). El
ARNm aislado se utilizó en la producción de ADNc.
Para la producción de ADNc, se produjeron
oligonucleótidos para la cadena complementaria del gen hexon y del
gen básico penton, siendo ambos transcritos del MLP. Se produjo un
oligonucleótido más que cubrió el punto de terminación propuesto
del transcrito tardío principal, 24 bases corriente abajo de la
secuencia TATA. Este oligonucleótido se utilizó junto con el
utilizado en la producción de ADNc en la reacción en cadena de
polimerasa con Taq. El ADN resultante producido a partir de clones
positivos se digirió con enzimas de restricción apropiadas para
determinar el tamaño del fragmento insertado. El secuenciado de ADN
de estos fragmentos insertados se realizó utilizando una
modificación de la técnica de terminación en cadena (Sanger, F.,
Nicklen, S. y Gulson, A. R., 1977, DNA sequencing with chain
terminating inhibitors. PNAS USA
74:5463-5467) para permitir la ampliación de Taq ADN
polimerasa (Promega, USA).
Para confirmar el punto de terminación de la
secuencia líder, se preparó ADNc reciente y en este momento se
añadió una cola de restos de dGTP a éste. En resumen, se incubó ADNc
con dGTP 1 mM y 15 unidades de desoxinucleotidil transferasa
terminal (Promega) en tampón de CaCl_{2} 2 mM a 37ºC durante 60
minutos. Se interrumpió la reacción calentando a 70ºC durante 10
minutos. El ADN se precipitó a continuación en etanol y se volvió a
poner en suspensión en un volumen adecuado para su utilización en
la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La PCR se realizó tal
como se describió anteriormente utilizando un poli (dC)
oligonucleótido con una secuencia XbaI en el extremo 5'. Se
truncaron los fragmentos resultantes terminados en T4 ADN polimerasa
a 37ºC durante 30 minutos en presencia de nucleótidos en exceso y
se clonaron en la secuencia SmaI del vector pUC18. Se realizó
la preparación y secuenciado del ADN, tal como se describió
anteriormente, en los clones que se demostró que son positivos por
hibridación.
La Figura 3 ilustra las secuencias por separado
del activador principal tardío, corriente arriba de la secuencia
potenciadora y de los determinantes 1, 2 y 3 de corte y empalme como
se determinó por los estudios del ADNc. La Figura 2 ilustra la
secuencia de ADN de la casete de activador completa con los
componentes unidos.
El extremo derecho se identificó mediante
clonación y secuenciado completo del fragmento J de ApaI del
serotipo 3 del PAV de aproximadamente 1,8 Kbp. La repetición
terminal invertida (ITR) se ha determinado por comparación de la
secuencia RHE con la del extremo izquierdo. La ITR es de 144 bases
de longitud y representa el punto de partida en el que las
inserciones potenciales pueden realizarse. La Figura 4 presenta la
secuencia de las 720 bases del terminal. Los puntos de interés de
la endonucleasa de restricción para la inserción del ADN extraño
están indicados en la secuencia terminal. Una supuesta secuencia
TATA para el activador E4 está identificada, estando ésta en el
extremo más izquierdo para el posible punto de inserción. Las
inserciones iniciales se efectuarán en las secuencias SmaI o
EcoRI.
La zona E3 del genoma, que es también un área no
esencial, ha sido localizada y clonada. La zona activadora de E3 ha
sido identificada y el área L4 solapante secuenciada (Figura 5). La
zona del E3 después de la señal de poliadenilación de la L4 es
también un posible punto de inserción y puede también utilizarse
para la deleción para crear más espacio para las inserciones de
casete mayores.
La Figura 6 ilustra un procedimiento preferido
de construcción de un vector PAV. El fragmento J de ApaI del
extremo izquierdo del serotipo 3 del PAV se clona y una secuencia de
230 bp de endonucleasa de restricción SmaI única procedente
de las repeticiones invertidas se utilizó como punto de
inserción.
La casete de expresión del activador tardío
principal que contiene el gen E2 (gp55) del virus de la fiebre
porcina clásico (virus del cólera porcino) se clonó en la secuencia
SmaI del fragmento RHE.
Un procedimiento preferido de recombinación
homóloga consistió en cortar el ADN del PAV 3 genómico con
HpaI, una secuencia única en el genoma, y transfectar este
ADN con el plásmido de la casete de expresión de corte ApaI
que contiene gp55.
La mezcla de ADN se transfectó en células de
riñón de cerdo preferentemente primarias mediante técnicas
normalizadas de precipitación con cloruro de calcio.
El procedimiento preferido de transfección
genera virus recombinante por recombinación homóloga entre PAV 3
genómico y plásmido (Fig. 6).
Los ejemplos siguientes presentan la
construcción de adenovirus porcinos recombinantes representativos de
la presente invención. Los virus recombinantes se propagan y se
valoran en células de riñón porcinas primarias.
Una casete de expresión constituida por el
activador tardío principal del adenovirus porcino, el gen (gp55)
del virus de la fiebre porcina clásico (CSFV) y SV 40 poliA se
insertó en la secuencia SmaI del extremo izquierdo (MU
97-99.5) del serotipo 3 del adenovirus porcino y se
utilizó para generar en células de riñón primarias porcinas un PAV
3 recombinante. El tamaño de la casete de expresión fue de 2,38
kilopares de bases. No se realizó ninguna deleción del PAV 3
genómico. Los adenovirus de mamífero con genomas intermedios (~36
kb) se ha demostrado que se adaptan hasta el 105% de la longitud
genómica natural y los genomas mayores de este tamaño son
incapsulables o sumamente inestables, experimentando frecuentemente
transposiciones del ADN (Betts, Prevec y Graham, Journal of
Virology 67, 5911-5921 (1993), Packaging
capacity and stability of human adenovirus type 5 vectors: Parks
and Graham, Journal of Virology, 71,
3293-3298 (1997), A helper dependent system for
adenovirus vector production helps a lower limit for efficient DNA
packaging). En la presente invención, la longitud genómica del PAV
fue de 34,8 kb, en la que se insertó sin ninguna otra deleción una
casete de expresión de 2,38 kb. La longitud del ADN genómico
resultante del adenovirus porcino recombinante de la presente
invención fue 106,8%, y por lo tanto excedía el límite máximo
supuesto para la construcción de un recombinante estable. El virus
recombinante fue purificado en placa tres veces y atenuado de manera
estable en células de riñón de cerdo primarias. Se demostró que el
recombinante contiene gp55 por hibridación en transferencia
Southern. Se demostró la expresión de gp55 infectando la línea
celular PK primaria cultivada en cubreobjetos de vidrio con el
adenovirus porcino recombinante. Después de 24 horas, la tinción
inmunofluorescente (IF) presentaba células infectadas que expresan
gp55.
Una casete de expresión constituida por el
activador tardío principal del adenovirus porcino, el gen que
codifica el factor estimulante de colonias de granulocitos porcino
(G-CSF) y SV40 poliA se insertó en la secuencia
SmaI del extremo izquierdo (MU 97-99.5) del
serotipo 3 del adenovirus porcino y se utilizó para generar en
células de riñón primarias porcinas un PAV 3 recombinante. El tamaño
de la casete de expresión fue de 1,28 kilopares de bases. No se
realizó ninguna deleción del PAV 3 genómico. El virus recombinante
fue purificado en placa dos veces y atenuado de manera estable en
células de riñón de cerdo primarias. Se demostró que el
recombinante contiene G-CSF por hibridación en
transferencia Southern y reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se
demostró la expresión de G-CSF infectando células de
riñón primarias con el PAV-G-CSF.
Los sobrenadantes del cultivo tisular procedentes de células de
riñón primarias infectadas se electroporizaron a continuación en
geles de SDS-PAGE y se transfirieron a filtros. Las
células infectadas que expresan a G-CSF fueron
detectadas en una transferencia Western utilizando un antisuero
policlonal de conejo contra el G-CSF porcino
expresado por E. coli recombinante purificado.
Una casete de expresión constituida por el
activador tardío principal del adenovirus porcino, una forma
truncada del gen gp55 del virus de la fiebre porcina clásico
fusionado en el marco al gen que codifica la longitud total o la
forma madura del factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos porcino (GM-CSF) y SV40 poliA se insertó
en la secuencia SmaI del extremo derecho (MU
97-99.5) del serotipo 3 del adenovirus porcino y se
utilizó para generar en las células de riñón primarias porcinas un
PAV 3 recombinante. El tamaño de la casete de expresión fue de 2,1
kilopares de bases. No se realizó ninguna deleción del PAV 3
genómico. El virus recombinante fue purificado en placa dos veces y
se demostró que contiene gp55 y GM-CSF por PCR.
El vector pJJ408 de inserción que contiene el
fragmento I de ApaI del extremo derecho del genoma de
serotipo 3 del PAV (aproximadamente 1,8 kbp), se alargó para que
contenga el fragmento BglII B completo que comprende 7,2 kbp
del extremo derecho de PAV3 (Figura 15a y b). Este fragmento
contiene tanto la secuencia de inserción del extremo derecho
descrito anteriormente como la zona E3. La secuencia de inserción
del extremo derecho se manipuló genéticamente para que contenga las
secuencias MLP/TPL del PAV3 seguidas de una secuencia de clonación
múltiple en la secuencia de SV40 poli A.
Se construyó una secuencia de inserción E3
escindiendo un fragmento SnaBI/BsrGI de 622 bp en la
zona E3 del serotipo 3 del PAV. La casete de expresión
MLP/TPL-gp55-poli A se insertó en la
secuencia SnaBI/BsrGI (Figura 15b y c). Este plásmido
se utilizó en transfecciones para producir un PAV3 recombinante que
contiene el casete
MLP/TPL-gp55-poli A insertado en la
zona E3 parcialmente eliminada (Figura 15c).
Se digirió ADN de PAV3 natural con enzima de
restricción SnaBI que proporciona dos fragmentos de 28.712
kbp y 5.382 kbp. El fragmento izquierdo grande que incluye la zona
de solapamiento del extremo derecho y el extremo izquierdo del
genoma de PAV3 se purificó en gel. Este fragmento se transfectó en
las células PK primarias junto con el ADN del vector de inserción
E3/rhe restringido con KpnI en placas petri de 3 cm para
permitir que tenga lugar la recombinación homóloga entre el PAV3 y
el ADN del vector de inserción. Utilizando este procedimiento, se
recuperaron únicamente los virus recombinantes.
Se mantuvieron las células durante 5 días a 37ºC
y a continuación se congelaron y descongelaron dos veces. El lisado
se atenuó en células PK primarias recientes y se observó el
desarrollo de las placas. El virus recombinante se colocó en placas
purificadas y se demuestra que contiene gp55 por PCR.
En este experimento se utilizaron lechones de 5
a 6 semanas para representar cerdos inmunocompetentes. Un grupo de
lechones (nº 2, nº 6 y nº 7) se vacunaron con
PAV-gp55 recombinante administrado por vía
subcutánea a una dosis de 1 \times 10^{7} pfu por lechón. Un
grupo de lechones de referencia (nº 3, nº 8, nº 11, nº 12, nº 13 y
nº 14) no se vacunaron. No se observaron síntomas clínicos (ni
aumento de temperatura) en el grupo de lechones vacunado (Tabla
1).
Cinco semanas después de la vacunación con el
PAV-gp55 recombinante ambos grupos de cerdos se
sometieron a la prueba de provocación con una dosis letal (1
\times 10^{3,5} TCID_{50} de virus del cólera porcino
virulento (virus de la fiebre porcina clásico) aplicado por vía
subcutánea.
Se controlaron las temperaturas de los cerdos y
los resultados se tabulan en la Tabla 2 y se representan
gráficamente en la Figura 7.
Los resultados demuestran que el día 5 el grupo
de referencia tenía temperaturas elevadas (mayores de 40,5ºC) y
presentaba síntomas clínicos de enfermedad. El grupo vacunado no
presentaba síntomas clínicos de enfermedad. Los cerdos del grupo de
referencia se murieron o se les practicó la eutanasia el día 9. El
grupo vacunado fue sometido a eutanasia el día 16. Tras la muerte
todos los cerdos de referencia presentaban enfermedad clínica grave,
los cerdos vacunados no presentaban síntomas clínicos de
enfermedad.
Los resultados indican que los cerdos vacunados
por vía subcutánea con el PAV-gp55 recombinante
sobrevivieron a la prueba de provocación con el virus de la fiebre
porcina clásico a una dosis letal.
Se extrajeron sueros de ambos grupos de cerdos y
se analizó la presencia de anticuerpos contra PAV por ELISA. Estos
análisis demostraron la presencia de anticuerpos preexistentes
contra PAV antes de la vacunación. El nivel de estos anticuerpos
aumentó después de la vacunación con el PAV-gp55
recombinante hasta el máximo entre los días 28 y 36 después de la
vacunación. Estos resultados están tabulados en la Figura 8.
Se extrajeron sueros del grupo de cerdos
vacunado antes y después de la prueba de provocación con CSFV y se
analizó la presencia de anticuerpos neutralizantes contra CSFV. Los
sueros se analizaron los días 0 y 28 después de la vacunación con
PAV-gp55 recombinante (antes de la prueba de
provocación) y a continuación otra vez el día 16 después de la
prueba de provocación (día 52 después de la vacunación). En la
Figura 9 los resultados presentan anticuerpos
no neutralizantes detectados el día 0, bajos niveles de anticuerpos neutralizantes el día 28 y altos niveles el día 52.
no neutralizantes detectados el día 0, bajos niveles de anticuerpos neutralizantes el día 28 y altos niveles el día 52.
Estos resultados demuestran que el
PAV-gp55 recombinante puede proteger los cerdos de
la prueba de provocación letal con virus de la fiebre porcina
clásico en presencia de anticuerpos preexistentes contra PAV.
En este experimento se utilizaron lechones de 5
a 6 semanas para representar cerdos inmunocompetentes. Un grupo de
cerdos (n=4) se vacunaron con
PAV-G-CSF recombinante administrado
por vía subcutánea a una dosis de 1 \times 10^{7} pfu por
lechón. Un segundo grupo (n=4) se vacunó con PAV natural (wt)
administrado por vía subcutánea a una dosis de 1 \times 10^{7}
pfu por lechón. Un grupo de referencia (n=4) no se vacunó. Se
extrajo sangre a los cerdos a intervalos de 8 horas durante un
periodo de 104 horas después de la vacunación. Se determinaron
recuentos de sangre completa y se controlaron los recuentos medios
de leucocitos (WBC) de cada grupo. Estos resultado se representan
gráficamente en la Figura 10 y el cambio de porcentaje en los
recuentos medios de WBC se representan gráficamente en la Figura
11.
Los cerdos vacunados con PAV wt o
PAV-G-CSF presentaban síntomas
clínicos de enfermedad con diarrea leve 24 a 72 horas después de la
vacunación. Ambos grupos de cerdos se recuperaron completamente 80 a
96 horas después de la vacunación. Los cerdos de referencia no
presentaban síntomas clínicos de enfermedad.
Los resultados del análisis de la sangre
completa demuestran que los recuentos medios de WBC de los cerdos de
referencia aumentaron a lo largo de todo el experimento.
Los cerdos vacunados con PAV wt presentan
asimismo un aumento en los recuentos de WBC, con una disminución en
los recuentos de WBC entre 48 y 80 horas después de la vacunación y
recuperación desde 80 a 96 horas en adelante.
Los cerdos vacunados con el
PAV-G-CSF recombinante presentan una
disminución significativa de los recuentos de WBC a lo largo del
experimento. Un análisis estadístico de estos resultados está
tabulado en la Tabla 3. El análisis demuestra que las diferencias
entre los recuentos medios de WBC (referencias y
PAV-G-CSF; PAV wt y
PAV-G-CSF) fueron significativos lo
que indica que el PAV-G-CSF
recombinante alteraba las proporciones de las células implicadas en
la inmunidad.
| a: hipótesis no válida; no existe diferencia entre los recuentos medios de WBC. | |
| b: \begin{minipage}[t]{145mm} p>0,05, insuficiente para rechazar las hipótesis no válidas en el nivel de confianza del 95%, se deduce que no existe diferencia entre los niveles medios de leucocitos.\end{minipage} | |
| c: \begin{minipage}[t]{145mm} p<0,05, hipótesis no válida, rechazada en el nivel de confianza del 95%, se deduce que existe diferencia entre los niveles medios de leucocitos.\end{minipage} | |
| d: se extrajo sangre a 4 cerdos en cada grupo a intervalos de 8 horas. |
Se determinaron también recuentos diferenciados
de WBC y se controlaron en cada grupo. El cambio de porcentaje en
poblaciones medias de monocitos se representa gráficamente en la
Figura 12 y el cambio de porcentaje en poblaciones medias de
linfocitos se representa gráficamente en la Figura 13. La Figura 12
demuestra que las poblaciones de monocitos aumentaron rápidamente
en los cerdos tras la vacunación con PAV wt, pero se suprimieron
por vacunación con PAV-G-CSF
recombinante. Este efecto era debido a la expresión de
G-CSF por el recombinante. El análisis estadístico
de estos resultados se tabula en la Tabla 4. El análisis demuestra
que existía una diferencia significativa entre el PAV wt y
PAV-G-CSF desde 32 a 96 horas
después de la vacunación. La Figura 13 demuestra que existieron
cambios en las cifras de población de linfocitos tras la vacunación
con el PAV-G-CSF recombinante. Las
referencias sin vacunar presentan cifras de linfocitos estables
durante el experimento, mientras que los cerdos vacunados con PAV
wt presentan un aumento significativo en la población de linfocitos
como respuesta a la infección. Los cerdos vacunados con el
PAV-G-CSF recombinante presentan una
disminución en la población de linfocitos. Un análisis estadístico
de estos resultados está tabulado en la Tabla 5. El análisis
demuestra que existía una diferencia significativa entre PAV wt y el
PAV-G-CSF recombinante entre 8 y 96
horas después de la vacunación. Las diferentes respuestas en la
proliferación celular de linfocitos tras la vacunación con
PAV-G-CSF recombinante y PAV wt
fueron debidas a la expresión de G-CSF por el
recombinante. Estos resultados demuestran que la vacunación con
PAV-G-CSF recombinante produce un
cambio en las subpoblaciones de células implicadas en la
inmunidad.
| a: hipótesis no válida; no existe diferencia entre los recuentos medios de monocitos. | |
| b: \begin{minipage}[t]{145mm} p>0,1, insuficiente para rechazar las hipótesis no válidas en el nivel de confianza del 90%, se deduce que no existe diferencia entre los niveles medios de monocitos.\end{minipage} | |
| c: \begin{minipage}[t]{145mm} p<0,05, hipótesis no válida, rechazada en el nivel de confianza del 95%, se deduce que existe diferencia entre los niveles medios de monocitos.\end{minipage} | |
| d: se extrajo sangre a 4 cerdos en cada grupo a intervalos de 8 horas. |
\vskip1.000000\baselineskip
| a: hipótesis no válida; no existe diferencia entre los recuentos medios de linfocitos. | |
| b: \begin{minipage}[t]{145mm} p>0,05, insuficiente para rechazar las hipótesis no válidas en el nivel de confianza del 95%, se deduce que no existe diferencia entre los niveles medios de linfocitos.\end{minipage} | |
| c: \begin{minipage}[t]{145mm} p<0,05, hipótesis no válida, rechazada en el nivel de confianza del 95%, se deduce que existe diferencia entre los niveles medios de linfocitos.\end{minipage} | |
| d: se extrajo sangre a 4 cerdos en cada grupo a intervalos de 8 horas. |
La Figura 14 representa gráficamente los cambios
en la proliferación de linfocitos T de cada grupo después de la
estimulación con Concanavalina A (Con A). Estos resultados confirman
que existía una proliferación significativa de linfocitos T después
de la vacunación con PAV wt el día 2 después de la vacunación,
mientras que la vacunación con el
PAV-G-CSF recombinante produjo una
supresión de la proliferación de linfocitos T el día 3.
Los resultados de la vacunación con un
G-CSF porcino que expresa el PAV recombinante
demuestran que G-CSF tiene un efecto significativo
sobre las células implicadas en respuestas inmunitarias.
Debe apreciarse que mientras que este documento
demuestra los límites y enlaces de la presente invención, todas las
formas de realización comprendidas dentro del alcance por ejemplo
con respecto a genes heterólogos, secuencias de inserción, tipos de
activador y serotipo no han sido necesariamente ejemplificadas de
manera específica aunque se pretende que estén comprendidas dentro
del alcance de la protección proporcionada por la presente
invención.
Figura
2
Secuencia completa de la casete del activador
tardío principal PAV que incluye los nucleótidos 5' (corriente
arriba) añadidos del USF.
Recuento de bases nucleotídicas: 76 A 143 C 187
G 96 T Total 502 bp
El factor estimulante corriente arriba (USF) y
el motivo TATA están en negrita. La secuencia principal completa
está en cursiva con la secuencia de coronación y las secuencias de
corte y empalme entre determinantes individuales indicados en doble
subrayado o un solo subrayado respectivamente.
Figura
3
Secuencias individuales de los componentes de la
casete del activador
I. La secuencia 5' (corriente arriba) está
incluida en la casete larga.
II. Secuencia que incluye USF, el motivo TATA y
la secuencia para el punto de coronación.
III. Primera secuencia líder
IV. Segunda secuencia líder
V. Tercera secuencia líder
Secuencia del extremo derecho del genoma del
PAV, siendo esta área una secuencia propuesta para la inserción de
casetes de expresión.
Recuento de bases nucleotídicas 183 A 255 C 306
G 204 T Total 948 bases
La repetición terminal invertida (ITR) se
muestra en negrita. Los sitios enzimáticos de interés están
subrayadas con el nombre de la enzima a continuación. Se presenta
también la TATA supuesta para la zona E4.
<110> Commonwealth Scientific and
Industrial Research Organisation Pig Research Development
Corporation
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MACROBUTTON Titulo MACROBUTTON
Titulo Vector de adenovirus porcino recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> NJL/P30143EP
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\vskip0.400000\baselineskip
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<151>
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<151>
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 502
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 190
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 61
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
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<210> 4
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<211> 83
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Adenovirus porcino
\newpage
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<400> 7
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Claims (15)
1. Vector recombinante que comprende un
adenovirus porcino recombinante de serotipo 3 (PAV3) que incorpora
de manera estable, y capaz de expresar la secuencia nucleotídica
heteróloga en el que dicha secuencia nucleotídica heteróloga se
incorpora en una zona no esencial de un sitio en las unidades 97 a
99,5 de la cartografía del PAV3.
2. Vector según la reivindicación 1, en el que
dicho adenovirus porcino recombinante comprende un adenovirus
porcino vivo que presenta proteínas estructurales de virión
inalteradas respecto a las de un adenovirus porcino natural del cual
procede dicho adenovirus porcino recombinante.
3. Vector según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicha secuencia nucleotídica heteróloga codifica un polipéptido
antigénico y/o una molécula inmunopotenciadora.
4. Vector según la reivindicación 3, en el que
dicho polipéptido antigénico comprende uno o más determinantes
antigénicos de agentes infecciosos que producen enfermedad
intestinal en cerdos, de agentes infecciosos que producen
enfermedades respiratorias en cerdos, de virus de la pseudorrabia
(virus de la enfermedad de Aujeszky), de glucoproteína D del virus
de la pseudorrabia, de virus del síndrome respiratorio y
reproductivo porcino (PRRSV) del virus del cólera del cerdo, de
parvovirus porcino, de coronavirus porcino, de rotavirus porcino, de
virus de paragripe porcino o de Mycoplasma hyopneumoniae.
5. Vector según la reivindicación 3, en el que
dicha molécula inmunopotenciadora es el ligando
FLT-3; la interleucina 3 (IL-3); la
interleucina 4 (IL-4) porcina; el interferón gamma
(\gammaIFN); el factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos porcino (GM-CSF); o el factor estimulante
de colonias de granulocitos porcino (G-CSF).
6. Vector según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia nucleotídica
heteróloga está asociada al activador tardío principal y a los
elementos líder tripartidos.
7. Procedimiento para la producción de un vector
de adenovirus porcino recombinante para su utilización como vacuna,
que comprende:
- a.
- obtener una secuencia de serotipo 3 de adenovirus porcino; y
- b.
- insertar en dicha secuencia en una zona no esencial de un sitio en las unidades 97 a 99,5 de la cartografía del PAV3, por lo menos una secuencia nucleotídica heteróloga ligada funcionalmente a una secuencia de activador eficaz.
8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el
que, antes de la inserción a dicha secuencia nucleotídica
heteróloga, se inserta un sitio de enzima de restricción en dicho
sitio.
9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8,
modificado por las características de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6.
10. Vacuna recombinante para generar y/u
optimizar la inmunidad mediada por anticuerpos o células con el fin
de proporcionar o aumentar la protección contra la infección por
organismos infecciosos en cerdos, incluyendo dicha vacuna por lo
menos un vector recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, y portadores y/o excipientes adecuados.
11. Vacuna recombinante según la reivindicación
10, en la que dichos portadores y/o excipientes se seleccionan de
manera que dicha vacuna se pueda administrar en forma de
pulverizador en aerosol, en forma de dosificación entérica
recubierta o de inóculo.
12. Procedimiento para la producción de una
vacuna recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 10 u
11, que incluye mezclar por lo menos un vector recombinante según
las reivindicaciones 1 a 6 junto con portadores y/o excipientes
adecuados.
13. Utilización de un vector recombinante según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de una
vacuna destinada a la vacunación de cerdos contra enfermedades.
14. Utilización según la reivindicación 13, que
comprende un primer vector y un segundo vector que presentan
diferentes secuencias nucleotídicas heterólogas incorporadas de
manera estable en los mismos.
15. Vector recombinante según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, para su utilización en la vacunación de
cerdos contra enfermedades.
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