ES2283294T3 - Enzimas de la ruta biosintetica para la produccion de triacilglicerol y moleculas de dna recombinante que codifican estas enzimas. - Google Patents
Enzimas de la ruta biosintetica para la produccion de triacilglicerol y moleculas de dna recombinante que codifican estas enzimas. Download PDFInfo
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Abstract
Uso de una enzima que consiste en a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como la indicada en los Nº ID SEC 2 ó 4; b) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC 1 ó 3; o c) un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC 2 ó 4, como un catalizador en una reacción independiente de acil-CoA de la transferencia de ácidos grasos desde fosfolípidos hasta diacilglicerol en la producción biosintética de triacilglicerol.
Description
Enzimas de la ruta biosintética para la
producción de triacilglicerol y moléculas de DNA recombinante que
codifican estas enzimas.
La presente invención se refiere al uso de
enzimas que catalizan la transferencia de ácidos grasos desde
fosfolípidos hacia diacilglicerol en la ruta biosintética para la
producción de triacilglicerol.
El triacilglicerol (TAG) es la reserva de
energía basada en lípidos más común en la naturaleza. Se cree que
la principal ruta para la síntesis de TAG implica tres
transferencias de acilo secuenciales desde acil-CoA
hacia una cadena principal de glicerol (1, 2). Durante muchos años,
se creyó que la acil-CoA:diacilglicerol
aciltransferasa (DAGAT), que cataliza la tercera reacción de
transferencia de acilo, era la única enzima implicada en la
síntesis de TAG. Actúa desviando el diacilglicerol (DAG) desde la
síntesis de lípidos de membrana hacia TAG (2). Genes que codifican
esta enzima se identificaron recientemente tanto en el ratón (3)
como en plantas (4, 5) y se observó que las proteínas codificadas
eran homólogas a acil-CoA:colesterol aciltransferasa
(ACAT). También se presentó recientemente que existe otra DAGAT en
el hongo oleaginoso Mortierella ramanniana, que no está
relacionada con la DAGAT de ratón, la familia de genes de ACAT o con
ningún otro gen conocido (6).
Otro tipo de enzimas son las que catalizan la
transferencia de ácidos grasos desde fosfolípidos hacia esterol
(28, 29, 30). Moléculas de ácido nucleico que codifican para enzimas
que catalizan la transferencia de ácidos grasos desde fosfolípidos
hacia diacilglicerol en la ruta biosintética para la producción de
triacilgliceroles ya se describieron en la técnica (31), pero no se
conocía su función en una transferencia dependiente de
acil-CoA.
La presente invención se refiere a enzimas y a
sus genes codificantes para transformación. Más específicamente, la
invención se refiere al uso de un tipo de genes que codifican un
tipo de enzimas no descrito previamente posteriormente denominadas
en la presente memoria fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasas
(PDAT), en donde esta enzima cataliza una reacción independiente de
acil-CoA. Dicho tipo de genes expresados solo en
organismos transgénicos potenciará la cantidad total de aceite
(triacilgliceroles) producida en las células. Los genes de PDAT, en
combinación con un gen para la síntesis de un ácido graso no común,
cuando se expresan en organismos transgénicos, potencian los
niveles de los ácidos grasos no comunes en los
triacilgliceroles.
Existe un interés considerable en todo el mundo
en producir un material de alimentación químico, tal como ácidos
grasos, para uso industrial a partir de fuentes vegetales renovables
en vez de productos petroquímicos no renovables. Este concepto
tiene un gran atractivo para los fabricantes y los consumidores
basándose en la conservación de recursos que proporciona una
oportunidad significativa de desarrollar nuevos cultivos
industriales para agricultura.
Existe una serie diversa de ácidos grasos
inusuales en aceites procedentes de especies vegetales silvestres y
estos se han caracterizado bien. Muchos de estos ácidos tienen
potencial industrial y esto ha conducido al interés en
"domesticar" especies vegetales pertinentes para permitir la
producción agrícola de ácidos grasos particulares.
El desarrollo en las tecnologías de ingeniería
genética combinado con una mayor comprensión de la biosíntesis de
ácidos grasos inusuales hace posible transferir genes que codifican
para enzimas clave implicadas en la síntesis de un ácido graso
particular desde una especie silvestre a cultivos oleaginosos
"domesticados". De este modo, pueden producirse ácidos grasos
individuales con pureza y cantidades altas a costes moderados.
En todos los cultivos, como colza, girasol,
palma oleaginosa, etc., el aceite (es decir, triacilgliceroles) es
el producto más valioso de las semillas o frutos y otros compuestos
como almidón, proteína y fibra se consideran subproductos con menos
valor. Potenciar la cantidad de aceite por unidad de peso a costa de
otros compuestos en cultivos oleaginosos incrementaría por lo tanto
el valor del cultivo. Si pueden regularse al alza genes que regulan
la distribución de carbono reducido en la producción de aceite, las
células acumularían más aceite a costa de otros productos. Tales
genes podrían usarse no solo en células ya altamente productoras de
aceite, tales como cultivos oleaginosos, sino que también podrían
inducir la producción de aceite significativa en cultivos de
contenido de aceite moderado o bajo tales como, por ejemplo, soja,
avena, maíz, patata, remolachas azucareras y nabos así como en
microorganismos.
Muchos de los ácidos grasos inusuales de
interés, por ejemplo ácidos grasos de cadena media, ácidos grasos
hidroxilados, ácidos grasos epoxídicos y ácidos grasos acetilénicos,
tienen propiedades físicas que son claramente diferentes de los
ácidos grasos vegetales comunes. Los presentes inventores han
encontrado que, en especies vegetales que acumulan naturalmente
estos ácidos grasos no comunes en su aceite de las semillas (es
decir, triacilglicerol), estos ácidos están ausentes de o presentes
en cantidades muy bajas en los (fosfo)lípidos de membrana de
las semillas. La baja concentración de estos ácidos en los lípidos
de la membrana es muy probablemente un requisito previo para la
función apropiada de la membrana y de ese modo para las funciones
apropiadas de la célula. Un aspecto de la invención es que puede
hacerse que semillas de cultivos transgénicos acumulen altas
cantidades de ácidos grasos no comunes si estos ácidos grasos se
retiran eficazmente de los lípidos de membrana y se canalizan hacia
triacilgliceroles de las semillas.
\newpage
Los inventores han identificado una nueva clase
de enzimas en plantas que catalizan la transferencia de ácidos
grasos desde fosfolípidos hacia diacilglicerol en la producción de
triacilglicerol a través de una reacción independiente de
acil-CoA y que estas enzimas
(fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasas, abreviadas como PDAT)
están implicadas en la retirada de ácidos grasos epoxigenados
hidroxilados, y probablemente también otros ácidos grasos no
comunes tales como ácidos grasos de cadena media, de los
fosfolípidos en las plantas.
Se observó que esta reacción enzimática estaba
presente en preparaciones microsomales de levadura del pan
(Saccharomyces cerevisiae). La presente invención trata
además del uso de una enzima que comprende una secuencia de
aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC 2. Se obtuvo el llamado
mutante de levadura "knock out" (con inactivación total de
expresión), interrumpido en el gen respectivo, y se observaba que
las membranas microsomales del mutante carecían totalmente de
actividad de PDAT. Así, resultaba que el gen interrumpido codifica
una enzima PDAT (Nº ID SEC 1 y 2). Por otra parte, esta enzima PDAT
se caracteriza a través de la secuencia de aminoácidos que se
indica en el Nº ID SEC 2, que contiene un motivo de lipasa de la
cadena de secuencia conservada FXKWVEA.
Otros genes y/o proteínas de función desconocida
hasta ahora se identificaron y se contemplan dentro del alcance de
la presente invención. Se identificó un gen de Arabidopsis
thaliana (Nº ID SEC 3 y secuencia de aminoácidos predicha
correspondiente Nº ID SEC 4).
La presente invención trata de un constructo
génico que comprende dicha secuencia de nucleótidos de la presente
invención que está conectada operablemente a un ácido nucleico
heterólogo.
El término conectada operablemente significa una
organización en serie, por ejemplo, de un promotor, una secuencia
codificante, un terminador y/o elementos reguladores adicionales,
por la que cada elemento puede cumplir su función original durante
la expresión de la secuencia de nucleótidos.
Además, un vector que comprende dicha secuencia
de nucleótidos de la presente invención se contempla en la presente
invención. Este incluye también un vector de expresión así como un
vector que comprende además un gen marcador seleccionable y/o
secuencias de nucleótidos para la replicación en una célula huésped
y/o la integración en el genoma de la célula huésped.
En un aspecto diferente, esta invención se
refiere a un método para producir una PDAT en una célula huésped o
la progenie de la misma, incluyendo semillas oleaginosas
genéticamente manipuladas, levadura y mohos o cualquier otro
organismo que acumula aceite, a través de la expresión de un
constructo en la célula. Células que contienen una PDAT como
resultado de la producción de la secuencia que codifica PDAT también
se contemplan dentro del alcance de la invención.
Además, la invención trata de una célula u
organismo transgénico que contiene dicha secuencia de nucleótidos
y/o dicho constructo génico y/o dicho vector. El objetivo de la
presente invención es además una célula u organismo transgénico que
es una célula u organismo eucariótico. Preferiblemente, la célula u
organismo transgénico es una célula de levadura o una célula de
planta o una planta. La presente invención trata además de dicha
célula u organismo transgénico que tiene una ruta biosintética
alterada para la producción de triacilglicerol. Una célula u
organismo transgénico que tiene un contenido de aceite alterado
también se contempla dentro del alcance de esta invención.
Además, la invención trata de una célula u
organismo transgénico en el que la actividad de PDAT está alterada
en dicha célula u organismo. Esta actividad alterada de PDAT se
caracteriza por una alteración en la expresión génica, la actividad
catalítica y/o la regulación de la actividad de la enzima. Por otra
parte, se incluye en la presente invención una célula u organismo
transgénico, en donde la ruta biosintética alterada para la
producción de triacilglicerol se caracteriza por la prevención de la
acumulación de ácidos grasos no deseables en los lípidos de la
membrana.
En una modalidad diferente, esta invención
también se refiere a métodos para usar una secuencia de DNA que
codifica una PDAT para incrementar el contenido de aceite dentro de
una célula.
Otro aspecto de la invención se refiere al
alojamiento de altas cantidades de ácidos grasos no comunes en el
triacilglierol producido dentro de una célula, introduciendo una
secuencia de DNA que produce una PDAT que retira específicamente
estos ácidos grasos de los lípidos de membrana de la célula y los
canaliza hacia triacilglicerol. Células vegetales que tienen tal
modificación también se contemplan en la presente memoria.
Además, la invención trata de un procedimiento
para la producción de triacilglierol, que comprende hacer crecer
dicha célula u organismo transgénico bajo condiciones por las que
dicha secuencia de nucleótidos se expresa y por las que dichas
células transgénicas que comprenden dicha enzima que cataliza la
transferencia de ácidos grasos desde fosfolípidos hacia
diacilglierol formando triacilglierol.
Por otra parte, los triacilglieroles producidos
mediante el procedimiento mencionado anteriormente se incluyen en
el alcance de la presente invención.
El objetivo de la presente invención es además
el uso de una de las secuencias de nucleótidos presentes y/o una de
dichas enzimas para la producción de triacilglierol y/o
triacilgliceroles con ácidos grasos no comunes. El uso de una de
dichas secuencias de nucleótidos presentes y/o una de dichas enzimas
de la presente invención para la transformación de cualquier célula
u organismo para ser expresada en esta célula u organismo y dar
como resultado un contenido de aceite alterado, preferiblemente
incrementado, de esta célula u organismo también se contempla
dentro del alcance de la presente invención.
Una PDAT de esta invención incluye cualquier
secuencia de aminoácidos, tal como una proteína, un polipéptido o
un fragmento peptídico obtenible a partir de una fuente de
microorganismo o planta que demuestre la capacidad para catalizar
la producción de triacilglierol a partir de un fosfolípido y
diacilglicerol bajo condiciones reactivas enzimáticas. Por
"condiciones reactivas enzimáticas" se entiende que están
disponibles cualesquiera condiciones necesarias en un ambiente (por
ejemplo, factores tales como temperatura, pH, falta de substancias
inhibidoras) que permitan que la enzima funcione.
Otras PDATs son obtenibles a partir de las
secuencias específicas proporcionadas en la presente memoria. Por
otra parte, será evidente que pueden obtenerse PDATs naturales y
sintéticas, incluyendo secuencias de aminoácidos modificadas y
materiales de partida para el modelado de proteínas sintéticas a
partir de las PDATs ejemplificadas y de PDATs que se obtienen a
través del uso de tales secuencias ejemplificadas. Secuencias de
aminoácidos modificadas incluyen secuencias que se han mutado,
truncado, incrementado y similares, ya se sinteticen tales
secuencias parcialmente o totalmente. Las secuencias que se
purifican realmente a partir de preparaciones vegetales o son
idénticas o codifican proteínas idénticas a las mismas,
independientemente del método usado para obtener la proteína o la
secuencia, se consideran igualmente derivadas de la naturaleza.
Además, sondas de ácido nucleico (DNA y RNA) de
la presente invención pueden usarse para rastrear y recuperar PDATs
"homólogas" o "relacionadas" a partir de una variedad de
fuentes vegetales y microbianas.
Además, también es evidente que un experto en la
técnica puede, con la información proporcionada en esta solicitud,
identificar en cualquier organismo una actividad de PDAT, purificar
una enzima con esta actividad y de ese modo identificar una
secuencia de ácido nucleico (no homóloga) que codifica tal
enzima.
La presente invención puede caracterizarse
esencialmente por los siguientes aspectos:
- 1.
- Uso de un gen de PDAT (clon genómico o cDNA) para transformación.
- 2.
- Uso de una molécula de DNA de acuerdo con el punto 1, en el que dicho DNA se usa para la transformación de cualquier organismo no humano para ser expresado en este organismo y dar como resultado una enzima de PDAT recombinante activa para incrementar el contenido de aceite del organismo.
- 3.
- Uso de una molécula de DNA de acuerdo con el punto 1, en el que dicho DNA se usa para la transformación de cualquier organismo no humano para prevenir la acumulación de ácidos grasos no deseables en los lípidos de membrana.
- 4.
- Uso de acuerdo con el punto 1, en el que dicho gen de PDAT se usa para transformar organismos acumuladores de aceite transgénicos no humanos manipulados para producir cualquier ácido graso no común que es dañino si está presente en cantidades altas en lípidos de membrana, tales como ácidos grasos de cadena media, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos epoxigenados y ácidos grasos acetilénicos.
- 5.
- Uso de acuerdo con el punto 1, en el que dicho gen de PDAT se usa para transformar organismos no humanos, y en el que dichos organismos se cruzan con otros organismos acumuladores de aceite manipulados para producir cualquier ácido graso no común que es dañino si está presente en cantidades altas en lípidos de membrana, que comprenden ácidos grasos de cadena media, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos epoxigenados y ácidos grasos acetilénicos.
- 6.
- Uso de acuerdo con el punto 1, en el que la enzima codificada por dicho gen de PDAT o cDNA está codificando para una PDAT con clara especificidad para acilo.
- 7.
- Organismos acumuladores de aceite transgénicos no humanos, que comprenden, en su genoma, un gen de PDAT transferido mediante tecnología de DNA recombinante o hibridación somática.
- 8.
- Organismos acumuladores de aceite transgénicos de acuerdo con el punto 7, que comprenden, en su genoma, un gen de PDAT que tiene especificidad para substratos con un ácido graso no común particular y el gen para dicho ácido graso no común.
- 9.
- Organismos transgénicos de acuerdo con el punto 7 u 8, que se seleccionan del grupo que consiste en hongos, plantas y animales.
- 10.
- Organismos transgénicos de acuerdo con el punto 7 u 8, que se seleccionan del grupo de plantas agrícolas.
- 11.
- Organismos transgénicos de acuerdo con el punto 7 u 8, que se seleccionan del grupo de plantas agrícolas y donde dicho gen de PDAT se expresa bajo el control de un promotor específico de un órgano de almacenamiento.
- 12.
- Organismos transgénicos de acuerdo con el punto 7 u 8, que se seleccionan del grupo de plantas agrícolas y donde dicho gen de PDAT se expresa bajo el control de un promotor de semilla.
- 13.
- Un método para alterar la especificidad para acilo de una PDAT mediante la alteración de la secuencia de nucleótidos de un gen codificante presente en la naturaleza y como consecuencia de esta alteración crear un gen que codifica para una enzima con nueva especificidad para acilo.
- 14.
- Una proteína codificada por una molécula de DNA de acuerdo con el punto 1.
- 15.
- Una proteína de acuerdo con el punto 14, denominada fosfolípido:diacilglicerol aciltransferasa.
- 16.
- Una proteína de acuerdo con el punto 15, que tiene una clara especificidad para acilo.
- 17.
- Una proteína de acuerdo con el punto 16, que tiene la secuencia de aminoácidos que se indica en el Nº ID SEC 2 (y las proteínas codificadas por los genes de longitud total o parciales indicados en el Nº ID SEC 1, 3) o una secuencia de aminoácidos con al menos 30% de homología con dicha secuencia de aminoácidos.
- 18.
- Una proteína de acuerdo con el punto 16, aislada de Saccharomyces cerevisiae.
Las cepas de levadura silvestres usadas eran
bien FY1679 (MAT\alpha his3-\Delta200
leu2- -\Delta1 trp1- -\Delta6
ura3-52) o bien W303-1A
(MAT a ADE2-1
can1-100 his3-11,15
leu2-3, 112 trp1-1
ura3-1) (7). La cepa de interrupción
YNR008w::
KanMX2 FVKT004-04C(AL), que es congénita con FY1679, se obtuvo de la colección Euroscarf (8). Un fragmento de 2751 pb que contenía el gen YNR008w con 583 pb de DNA de flanqueo 5’ y 183 pb de 3’ se amplificó a partir de DNA genómico W303-1A usando polimerasa de Taq con 5’-TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3’ y 5’-CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC-3’ como cebadores. El producto de PCR resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el sitio EcoRV de pBluescript (pbluescript-pdat). A partir de experimentos complementarios, el fragmento clonado se liberó de pBluescript mediante digestión con HindIII-SacI y a continuación se clonó entre los sitios HindIII y SacI de pFL39 (9), generando así pUS1. Para la sobreexpresión del gen de PDAT, un fragmento EcoRI de 2202 pb del plásmido pBluscript que contiene solo 24 pb de DNA de flanqueo 5’ se clonó en el sitio BamHI del vector de expresión de GAL1-TPK2 pJN92 (12), generando así pUS4.
KanMX2 FVKT004-04C(AL), que es congénita con FY1679, se obtuvo de la colección Euroscarf (8). Un fragmento de 2751 pb que contenía el gen YNR008w con 583 pb de DNA de flanqueo 5’ y 183 pb de 3’ se amplificó a partir de DNA genómico W303-1A usando polimerasa de Taq con 5’-TCTCCATCTTCTGCAAAACCT-3’ y 5’-CCTGTCAAAAACCTTCTCCTC-3’ como cebadores. El producto de PCR resultante se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el sitio EcoRV de pBluescript (pbluescript-pdat). A partir de experimentos complementarios, el fragmento clonado se liberó de pBluescript mediante digestión con HindIII-SacI y a continuación se clonó entre los sitios HindIII y SacI de pFL39 (9), generando así pUS1. Para la sobreexpresión del gen de PDAT, un fragmento EcoRI de 2202 pb del plásmido pBluscript que contiene solo 24 pb de DNA de flanqueo 5’ se clonó en el sitio BamHI del vector de expresión de GAL1-TPK2 pJN92 (12), generando así pUS4.
Microsomas de semillas en desarrollo de girasol
(Helianthus annuus), Ricinus communis y Crepis
palaestina se prepararon usando el procedimiento de Stobart y
Stymne (11). Para obtener microsomas de levadura, 1 g de células de
levadura (peso fresco) se resuspendió en 8 ml de tampón enfriado
con hielo (Tris-Cl 20 mM, pH 7,9, MgCl_{2} 10 mM,
EDTA 1 mM, glicerol al 5% (v/v), DTT 1 mM, sulfato amónico 0,3 M)
en un tubo de vidrio de 12 ml. A este tubo se añadieron 4 ml de
cuentas de vidrio (diámetro 0,45-0,5 mm) y el tubo
se agitó a continuación fuertemente (3 x 60 s) en un homogeneizador
de células MSK (B. Braun Melsungen AG, Alemania). La suspensión
homogeneizada se centrifugó a 20.000 x g durante 15 min a 6ºC y el
sobrenadante resultante se centrifugó de nuevo a 100.000 x g durante
2 h a 6ºC. La pella de 100.000 x g se resuspendió en fosfato
potásico 0,1 M (pH 7,2) y se almacenó a -80ºC. Se denomina
subsiguientemente la fracción microsomal de levadura en bruto.
Se sintetizaron enzimáticamente ácido
ricinoleico
(12-hidroxi-9-octadecenoico)
y vernólico
(12,13-epoxi-9-otadecenoico)
radiomarcados a partir de ácido
[1-^{14}C]oleico y
[1-^{14}C]linoleico, respectivamente,
mediante incubación con preparaciones microsomales de semillas de
Ricinus communis y Crepis palaestina, respectivamente
(12). La síntesis de fosfatidilcolinas (PC) o fosfatidiletanolaminas
(PE) con grupos acilo marcados con ^{14}C en la posición
sn-2 se realizó usando acilación bien enzimática (13) o bien
sintética (14) de ácido [^{14}C]oleico,
[^{14}C]ricinoleico o [^{14}C]vernólico. Se
sintetizó dioleoil-PC, que estaba marcada en la
posición sn-1, a partir de
sn-1-[^{14}C]oleoil-liso-PC
y ácido oleico no marcado según se describe en (14). Se sintetizó
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-DAG
a partir de PC mediante la acción de fosfolipasa C tipo XI de B.
Cereus (Sigma Chemical Co.) según se describe en (15). Se
sintetizaron monovernoloil- y divernoleoil-DAG a
partir de TAG extraída de semillas de Euphorbia lagascae,
usando la TAG-lipasa (Rizhopus arrhizus,
Sigma Chemical Co.) según se describe previamente (16). Se sintetizó
monoricinoleoil-TAG de acuerdo con el mismo método
usando TAG extraída de haba de ricino.
La composición de lípidos totales de la levadura
se determinó a partir de células recogidas de un cultivo líquido de
40 ml, rotas en un agitador de cuentas de vidrio y extraídas en
cloroformo como se describe por Bligh y Dyer (17) y a continuación
separadas mediante cromatografía en capa fina en hexano/éter
dietílico/ácido acético (80:20:1) usando placas de gel de sílice 60
(Merck) prerrevestidas. Las áreas con lípidos se localizaron
mediante exposición breve a vapores de I_{2} y se identificaron
por medio de patrones apropiados. Lípidos polares, ésteres
esterólicos y triacilgliceroles, así como las restantes clases de
lípidos secundarias, denominadas otros lípidos, se cortaron de las
placas. Se prepararon ésteres metílicos de ácido graso calentando
el material cortado seco a 85ºC durante 60 min en ácido sulfúrico al
2% (v/v) en metanol seco. Los ésteres metílicos se extrajeron con
hexano y se analizaron mediante GLC a través de una columna de
sílice fundida CP-Wax58-CB de 50 m x
0,32 mm (Chrompack), con ácido metilheptadecanoico como un patrón
interno. El contenido de ácidos grasos de cada fracción se
cuantificó y se usó para calcular la cantidad relativa de cada
clase de lípido. Para determinar el contenido de lípidos total,
partes alícuotas de 3 ml procedentes de cultivos de levadura se
recogieron mediante centrifugación y las pellas resultantes se
lavaron con agua destilada y se liofilizaron. El peso de las
células secadas se determinó y el contenido de ácidos grasos se
cuantificó mediante análisis de GLC después de la conversión en
ésteres metílicos según se describe anteriormente. El contenido de
lípidos se calculó a continuación como nmoles de ácido graso (FA)
por mg de peso seco de levadura.
Partes alícuotas de fracciones microsomales en
bruto (correspondientes a 10 nmoles de PC microsomal) procedentes
de semillas de plantas o células de levadura se liofilizaron durante
la noche. Lípidos de substrato marcados con ^{14}C disueltos en
benceno se añadieron a continuación a los microsomas secados. El
benceno se evaporó bajo una corriente de N_{2}, dejando los
lípidos en contacto directo con las membranas, y se añadieron 0,1
ml de fosfato potásico 50 mM (pH 7,2). La suspensión se mezcló a
fondo y se incubó a 30ºC durante el período de tiempo indicado,
hasta 90 min. Los lípidos se extrajeron de la mezcla de reacción
usando cloroformo y se separaron mediante cromatografía en capa fina
en hexano/éter dietílico/ácido acético (35:70:1,5) usando placas de
gel de sílice 60 (Merck). Los lípidos radiactivos se visualizaron y
se cuantificaron sobre las placas mediante autorradiografía
electrónica (Instant Imager, Packard, EE.UU. de A.).
Células de levadura se hicieron crecer a 28ºC en
un agitador giratorio en medio YPD líquido (extracto de levadura al
1%, peptona al 2%, glucosa al 2%), medio sintético (18) que contenía
glicerol al 2% (v/v) y etanol al 2% (v/v) o medio mínimo (19) que
contenía 16 g/l de glicerol.
La presente invención se caracteriza además por
los siguientes ejemplos que no son limitativos:
Un gran número de ácidos grasos inusuales puede
encontrarse en semillas oleaginosas (20). Muchos de estos ácidos
grasos, tales como ácido ricinoleico (21) y vernólico (22), se
sintetizan usando fosfatidilcolina (PC) con grupos oleoílo o
linoleoílo esterificados en la posición sn-2,
respectivamente, como el precursor intermedio. Sin embargo, aunque
la PC puede ser un substrato para la síntesis de ácidos grasos
inusuales y es el principal lípido de membrana en las semillas, los
ácidos grasos inusuales raramente se encuentran en las membranas. En
cambio, principalmente se incorporan en el TAG. Un mecanismo para
transferencia eficaz y selectiva de estos grupos acilo inusuales de
PC hasta TAG debe por lo tanto existir en semillas oleaginosas que
acumulan tales ácidos grasos inusuales.
Esta reacción de transferencia se caracterizaba
bioquímicamente en semillas de haba de ricino (Ricinus
communis) y Crepis palaestina, plantas que acumulan
altos niveles de ácidos ricinoleico y vernólico, respectivamente, y
girasol (Helianthus annuus), una planta que tiene solo ácidos
grasos comunes en su aceite de semillas. Fracciones microsomales en
bruto de semillas en desarrollo se incubaron con PC que tenía grupos
oleoílo, ricinoleoílo o vernoloílo marcados con ^{14}C en la
posición sn-2. Después de la incubación, los lípidos se
extrajeron y se analizaron mediante cromatografía en capa fina. Se
encontró que la cantidad de radiactividad que se incorporaba en la
fracción lipídica neutra se incrementaba linealmente a lo largo de
un período de 4 horas (datos no mostrados). La distribución de
grupos [^{14}C]acilo dentro de la fracción lipídica neutra
se analizó después de 20 min (Fig. 1). De forma interesante, la
cantidad y la distribución de radiactividad entre diferentes lípidos
neutros era fuertemente dependiente tanto de la especie de planta
como del tipo de cadena de [^{14}C]acilo. Así, los
microsomas de girasol incorporaban la mayoría del marcador en DAG,
independientemente del tipo de grupo [^{14}C]acilo. En
contraste, los microsomas de R. communis incorporaban
preferiblemente grupos [^{14}C]ricinoleoílo y
[^{14}C]vernoloílo en TAG, mientras que los grupos
[^{14}C]oleoílo se encontraban principalmente en DAG. Los
microsomas de C. palaestina, finalmente, incorporaban solo
grupos [^{14}C]vernoloílo en DAG, encontrándose los grupos
[^{14}C]ricinoleoílo principalmente como ácidos grasos
libres, y grupos [^{14}C]oleoílo en DAG. Esto muestra que
los altos niveles in vivo de ácido ricinoleico y vernólico en
la fracción reunida de TAG de R. communis y C.
palaestina, respectivamente, pueden explicarse por una
transferencia eficaz selectiva de los grupos acilo correspondientes
desde PC hasta TAG en estos organismos.
La síntesis in vitro de triacilgliceroles
en preparaciones microsomales de haba de ricino en desarrollo se
resume en la Tabla 1.
Se investigó si la DAG podía servir tanto como
un donante de acilo como también como un aceptor de acilo en las
reacciones catalizadas por los microsomas de semillas oleaginosas.
Por lo tanto, divernoloil-DAG no marcado se incubó
bien con
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-DAG
o bien
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-PC
en presencia de microsomas de R. communis. La síntesis de
moléculas de TAG que contenían grupos tanto
[^{14}C]ricinoleoílo como vernoloílo eran 5 veces mayor
cuando la [^{14}C]ricinoleoil-PC servía
como donante de acilo en comparación con
[^{14}C]ricinoleoil-DAG (Fig. 1B). Estos
datos sugieren intensamente que la PC es el donante de acilo
intermedio y el DAG el aceptor de acilo en la formación
independiente de acil-CoA de TAG por microsomas de
semillas oleaginosas. Por lo tanto, esta reacción es catalizada por
una nueva enzima que puede llamarse fosfolípido:diacilglicerol
aciltransferasa (PDAT).
Células de levadura silvestres se incubaron bajo
condiciones en las que se induce la síntesis de TAG. Se prepararon
membranas microsomales a partir de estas células y se incubaron con
sn-2-[^{14}C]-ricinoleoil-PC
y DAG y los productos marcados con ^{14}C formados se analizaron.
Los grupos [^{14}C]ricinoleoílo derivados de PC dentro de
la fracción lipídica nueva se encontraron principalmente en ácidos
grasos libres o TAG, y además la cantidad de TAG sintetizada
dependía de la cantidad de TAG que se añadía a la reacción (Fig.
2). La síntesis in vitro de TAG que contiene grupos tanto
ricinoleoílo como vernoloílo, una especie de TAG no presente in
vivo, a partir de
sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-PC añadida
exógenamente y vernoloil-DAG no marcado (Fig. 2,
carril 3) demuestra claramente la existencia de una síntesis
independiente de acil-CoA de TAG que implica PC y
DAG como substratos en membranas microsomales de levadura. Por
consiguiente, la síntesis de TAG en levadura puede catalizarse
mediante una enzima similar a la PDAT encontrada en plantas.
Se conoce un gen en el genoma de la levadura
(YNR008w), pero no se sabe nada acerca de la función de YNR008w,
excepto que el gen no es esencial para el crecimiento bajo
circunstancias normales. Se prepararon membranas microsomales a
partir de la cepa de levadura FVKT004-04C(AL)
(8) en las que este gen con función desconocida se había
interrumpido. La actividad de PDAT en los microsomas se ensayó
usando PC con ácidos grasos radiomarcados en la posición
sn-2. Se encontró que esta actividad estaba completamente
ausente en la cepa de interrupción (Fig. 2, carril 4). De forma
significativa, la actividad podía restaurarse parcialmente mediante
la presencia de YNR008w sobre el plásmido de una sola copia pUS1
(Fig. 2, carril 5). Por otra parte, los grupos acilo de
fosfadiletanolamina (PE) se incorporaban eficazmente en TAG mediante
microsomas procedentes de la cepa silvestre mientras que no se
producía incorporación a partir de este substrato en la cepa mutante
(datos no mostrados). Esto muestra que YNR008w codifica una PDAT de
levadura que cataliza la transferencia de un grupo acilo desde la
posición sn-2 de fosfolípidos hacia DAG, formando así TAG.
Debe apuntarse que no se formaban ésteres de colesterol a partir de
PC radiactiva incluso en incubaciones con ergosteroles añadidos, ni
la cantidad de ácidos grasos libres radiactivos formados a partir
de PC se afectaba por la interrupción del gen YNR008w (datos no
mostrados). Esto demuestra que la PDAT de levadura no tiene
actividades sintetizadoras de éster de colesterol o de
fosfolipasa.
El efecto de sobreexpresar el gen que codifica
PDAT se estudió transformando una cepa de levadura silvestre con el
plásmido pUS4 en el que el gen se expresa a partir del promotor
GAL1:TPK2 inducido por galactosa. Células que contienen el
vector de expresión vacío se usaron como control. Las células se
hicieron crecer en medio sintético de
glicerol-etanol y la expresión del gen se indujo
bien después de 2 horas (fase logarítmica inicial) o bien después de
25 horas (fase estacionaria) mediante la adición de galactosa. Las
células se incubaron a continuación durante otras 21 horas, después
de lo cual se recogieron y se realizaron ensayos. Se encontró que la
sobreexpresión de PDAT no tenía efecto significativo sobre la
velocidad de crecimiento, según se determinaba mediante la densidad
óptica. Sin embargo, el contenido de lípidos total, medido como
\mumoles de ácidos grasos por mg de peso seco de levadura, era
47% (fase logarítmica) o 29% (fase estacionaria) superior en la cepa
que sobreexpresa PDAT que en el control. Por otra parte, el
contenido de lípidos polares y ésteres de esterol estaba inalterado
por la sobreexpresión de PDAT. En cambio, el contenido de lípidos
elevado en estas células se debe totalmente a un contenido de TAG
incrementado (Fig. 3A, B). Así, la cantidad de TAG se incrementaba
dos veces en células en fase logarítmica inicial que sobreexpresan
PDAT y 40% en células en fase estacionaria. Es interesante apuntar
que se alcanzaba un incremento significativo en el contenido de TAG
sobreexpresando PDAT incluso bajo condiciones (es decir, en fase
estacionaria) en las que se induce DAGAT y así contribuye
significativamente a la síntesis de TAG. La actividad de PDAT in
vitro ensayada en microsomas procedentes de la cepa que
sobreexpresa PDAT era 7 veces superior que en la cepa de control,
un hallazgo que está de acuerdo con los niveles incrementados de
TAG que se observaban in vivo (Fig. 3C). Estos resultados
demuestran claramente el uso potencial del gen de PDAT para
incrementar el contenido de aceite en organismos transgénicos.
La especificidad para el substrato de PDAT de
levadura se analizó usando microsomas preparados a partir de la
cepa que sobreexpresa PDAT (véase la Fig. 4). La velocidad de
síntesis de TAG, bajo condiciones dadas en la figura 4 con
dioleoil-PC como el donante de acilo, era 0,15
nmoles por min y mg de proteína. Con ambos grupos oleoílo de la PC
marcados, era posible, bajo las condiciones de ensayo dadas,
detectar la transferencia de 11 pmoles/min de cadena de
[^{14}C]oleoílo en TAG y la formación de 15 pmoles/min de
liso-PC. En microsomas procedentes de la cepa
deficiente en PDAT, no se detectaba TAG en absoluto y solo
cantidades traza de liso-PC, sugiriendo intensamente
que la DPAT de levadura cataliza la formación de cantidades
equimolares de TAG y liso-PC cuando se suministraba
con PC y DAG como substratos. El hecho de que se forme algo más de
liso-PC que de TAG puede explicarse por la presencia
de una fosfolipasa en microsomas de levadura, que produce
liso-PC y ácidos grasos no esterificados a partir de
PC.
La especificidad de PDAT de levadura para
diferentes posiciones de grupos acilo se investigó incubando los
microsomas con dioleoil-PC que tenía un grupo
[^{14}C]acilo bien en la posición sn-1 (Fig. 4A,
barra 2) o bien en la posición sn-2 (Fig. 4A, barra 3). Se
encontró que el producto marcado con ^{14}C principal en el
primer caso era liso-PC, y en el último caso TAG. Se
concluye que la PDAT de levadura tiene una especificidad para la
transferencia de grupos acilo desde la posición sn-2 del
fosfolípido hacia DAG, formando así
sn-1-liso-PC y TAG. Bajo las
condiciones de ensayo dadas, se forman cantidades traza de DAG
marcado con ^{14}C a partir de la PC marcada en sn-1
mediante la acción reversible de una
CDP-colina:colina fosfotransferasa. Este DAG
marcado puede a continuación convertirse adicionalmente en TAG
mediante la actividad de PDAT. Por lo tanto, no es posible
distinguir si las pequeñas cantidades de TAG marcado que se forma en
presencia de dioleoil-PC que tiene un grupo
[^{14}C]acilo en la posición sn-1 se sintetizan
directamente a partir de la PC marcada en sn-1 mediante una
PDAT que también puede actuar sobre la posición sn-1 o si se
convierte en primer lugar en DAG marcado en sn-1 y a
continuación se acila mediante una PDAT con selectividad estricta
para la transferencia de grupos acilo en la posición sn-2 de
la PC. Conjuntamente, esto muestra que la PDAT codifica por YNR008w
cataliza una transferencia de acilo desde la posición sn-2 de
PC hacia DAG, provocando así la formación de TAG y
liso-PC.
La especificidad para el substrato de PDAT de
levadura se analizó adicionalmente con respecto al grupo de cabeza
del donante de acilo, el grupo acilo transferido y las cadenas de
acilo de la molécula de DAG aceptora. Los dos lípidos de membrana
principales de S. cerevisiae son PC y PE y, como se muestra
en la Fig. 4B (barras 1 y 2), la dioleoil-PE es
casi 4 veces más eficaz que la dioleoil-PC como
donante de acilo en la reacción catalizada por PDAT. Por otra
parte, la velocidad de transferencia de acilo depende intensamente
del tipo de grupo acilo que se transfiere. Así, un grupo
ricinoleoílo en la posición sn-2 de la PC se transfiere 2,5
veces más eficazmente en TAG que un grupo oleoílo en la misma
posición (Fig. 4B, barras 1 y 3). En contraste, la PDAT de levadura
no tiene preferencia para la transferencia de grupos vernoloílo
sobre grupos oleoílo (Fig. 4B, barras 1 y 4). La cadena de acilo de
la molécula de DAG aceptora también afecta a la eficacia de la
reacción. Así, la DAG con un grupo ricinoleoílo o vernoloílo es un
aceptor de acilo más eficaz que la dioleoil-DAG
(Fig. 4B, barras 1, 5 y 6). Conjuntamente, estos resultados
muestran claramente que la eficacia de la transferencia de acilo
catalizada por PDAT depende fuertemente de las propiedades de los
lípidos de substrato.
Secuencias de nucleótidos y aminoácidos de
varios genes de PDAT se dan en los Nº ID SEC 1 a 15. Secuencias
provisionales y/o parciales adicionales se dan como Nº ID SEC 1a a
5a y 1b a 11b, respectivamente. Una de las secuencias genómicas de
Arabidopsis (Nº ID SEC 4) identificaba un clon de cDNA de
Arabidopsis EST, T04806. Este clon de cDNA se caracterizaba
completamente y la secuencia de nucleótidos se da como Nº ID SEC 5.
Basándose en la homología de secuencia del cDNA de T04806 y la
secuencia de DNA genómico de Arabidopsis thaliana (Nº ID SEC
4), es evidente que una A adicional está presente en la posición 417
en el clon de cDNA (datos no mostrados). Excluir este nucleótido
daría la secuencia de aminoácidos representada en el Nº ID SEC
12.
Para la expresión del gen de PDAT de levadura en
Arabidopsis thaliana, un fragmento EcoRI del
pBluescript-PDAT se clonó junto con promotor de
napina (25) en el vector pGPTV-KAN (26). Un plásmido
(pGNapPDAT) que tenía el gen de PDAT de levadura en la orientación
correcta se identificó y se transformó en Agrobacterium
tumefaciens. Estas bacterias se usaron para transformar plantas
de Arabidopsis thaliana columbia (C-24)
usando el método de transformación radical (27). Plantas
transformadas con un vector vacío se usaron como controles.
Semillas de primera generación (T1) se
recogieron y se germinaron sobre medio que contiene kanamicina.
Semillas de segunda generación (T2) se reunieron a partir de
plantas individuales y sus contenidos de ácidos grasos se
analizaron mediante cuantificación de los ésteres metílicos mediante
cromatografía de gas-líquido después de la
metilación de las semillas con ácido sulfúrico al 2% en metanol a
85ºC durante 1,5 horas. La cuantificación se realizó con ésteres
metílicos de ácido heptadecanoico como patrón interno.
A partir de la transformación con pGNapPDAT, una
planta T1 (26-14) daba lugar a siete plantas T2 de
las cuales tres plantas daban semillas con contenido de aceite
estadísticamente (en una prueba bilateral de la diferencia media)
superior que las semillas de plantas T2 generadas a partir de planta
T1 32-4 transformada con un vector vacío (Tabla
2).
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31. Verhasselt y otros, (1994),
YEAST, vol. 10, 135.
Fig.
1
(A) Microsomas de semillas en desarrollo de
girasol, R. communis y C. palaestina, se incubaron
durante 80 min a 30ºC con PC (8 nmoles) que tenía ácido oleico en
su posición sn-1, y ácido bien oleico, bien ricinoleico o
bien vernólico marcado con ^{14}C en su posición sn-2. La
radiactividad incorporada en TAG (barras abiertas), DAG (barras
sólidas) y ácidos grasos no esterificados (barras sombreadas) se
cuantificó usando cromatografía en capa fina seguida por
autorradiografía electrónica, y se muestra como porcentaje de
substrato marcado añadido. (B) Síntesis in vitro de TAG que
tiene dos grupos vernoloílo y uno [^{14}]ricinoleoílo por
microsomas de R. communis. Los substratos añadidos eran
divernoloil-DAG no marcado (5 nmol) bien junto con
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-DAG
(0,4 nmol, 7700 dpm/nmol) o bien con
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-PC
(0,4 nmol, 7700 dpm/nmol). Los microsomas se incubaron con los
substratos durante 30 min y a 30ºC, después de lo cual las muestras
se retiraron para el análisis de lípidos como se describe en la
sección "métodos generales". Los datos mostrados son el
promedio de dos experimentos.
Fig.
2
Membranas microsomales (10 nmol de PC) de la
cepa de levadura silvestre FY1679 (carriles 1-3),
una cepa de levadura congénica
(FVKT004-04C(AL)) que se interrumpe con
respecto a YNR008w (carril 4) o la misma cepa de interrupción
transformada con el plásmido pUS1, que contiene el gen YNR008w
detrás de su promotor natural (carril 5), se ensayaron con respecto
a la actividad de PDAT. Como substratos, se usaron 2 nmol de
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-PC
bien junto con 5 nmol de dioleoil-DAG (carriles 2,
4 y 5) o bien junto con
rac-oleoil-vernoloil-DAG
(carril 3). El ensayo enzimático y el análisis de lípidos se
realizaron como se describe en Materiales y Métodos. Las células se
precultivaron durante 20 h en medio YPD líquido, se recogieron y se
resuspendieron en un volumen igual de medio mínimo (19) que contiene
16 g/l de glicerol. Las células se hicieron crecer a continuación
durante 24 h adicionales antes de recogerse. La selección con
respecto al plásmido se mantuvo haciendo crecer las células
transformadas en medio sintético que carece de uracilo (18).
Abreviaturas: 1-OH-TAG,
monoricinoleoil-TAG;
1-OH-1-ep-TAG,
monoricinoleoil-monovernoloil-TAG;
OH-FA, ácido ricinoleico no esterificado.
Fig.
3
El gen de PDAT en el plásmido pUS4 se
sobreexpresó a partir del promotor GAL1-TPK2
inducido por galactosa en la cepa silvestre W303-1A
(7). Su expresión se indujo después de (A) 2 horas o (B) 25 horas de
crecimiento mediante la adición de una concentración final de 2%
(p/v) de galactosa. Las células se incubaron a continuación durante
otras 22 horas antes de recogerse. La cantidad de lípidos de las
células recogidas se determinó mediante análisis por GLC de sus
contenidos de ácidos grasos y se presenta como \mumoles de ácidos
grasos por mg de peso seco en TAG (barra abierta), lípidos polares
(barra sombreada), ésteres esterólicos (barra sólida) y otros
lípidos (barra rayada). Los datos mostrados son los valores medios
de resultados con tres cultivos de levadura independientes. (C)
Síntesis in vitro de TAG mediante microsomas preparados a
partir de células de levadura que contienen bien el vector vacío
(vector) o bien el plásmido de PDAT (+ PDAT). Las células se
hicieron crecer como en la Fig. 3A. Los lípidos de substrato
dioleoil-DAG (2,5 nmol) y
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]-oleoil-PC
(2 nmol) se añadieron a partes alícuotas de microsomas (10 nmol de
PC), que se incubaron a continuación durante 10 min a 28ºC. La
cantidad de marcador incorporado en TAG se cuantificó mediante
autorradiografía electrónica. Los resultados mostrados son los
valores medios de dos experimentos.
Fig.
4
La especificidad de PDAT se ensayó incubando
partes alícuotas de microsomas liofilizados (10 mmol de PC) con
lípidos de substrato a 30ºC durante 10 min (cuadro A) o 90 min
(cuadro B). Se uso DAG no marcada (2,5 nmol) como substratos junto
con diferentes fosfolípidos marcados, según se muestra en la
figura. (A) Especificidad de posición sn de DPAT de levadura
referente al substrato donante de acilo.
Dioleoil-DAG junto con
sn-1-[^{14}C]oleoil-sn-2-[^{14}C]oleoil-PC
(di-[^{14}C]-PC),
sn-1-[^{14}C]oleoil-sn-2-oleoil-PC
(sn1-[^{14}C]-PC) o
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]oleoil-PC
(sn2-[^{14}C]-PC). (B) Especificidad de
PDAT de levadura con relación al grupo de cabeza del fosfolípido y
de la composición de acilo del fosfolípido así como de
diacilglicerol. Dioleoil-DAG junto con
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]oleoil-PC
(oleoil-PC),
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]oleoil-PE
(oleoil-PE),
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]ricinoleoil-PC
(ricinoleoil-PC) o
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]vernoloil-PC
(vernoloil-PC). En los experimentos presentados en
las dos barras más a la derecha, se usaron
monoricinoleoil-DAG
(ricinoleoil-DAG) o
monovernoloil-DAG (vernoloil-DAG)
junto con
sn-1-oleoil-sn-2-[^{14}C]-oleoil-PC.
El marcador que se incorporaba a TAG (barras sólidas) y
liso-PC (LPC, barras abiertas) se cuantificó
mediante autorradiografía electrónica. Los resultados son los
valores medios de dos experimentos. Los microsomas usados eran de
células W303-1A que sobreexpresan el gen de PDAT
procedente del promotor GAL1-TPK2, según se
describe en la Fig. 3. La expresión se indujo en la fase
estacionaria inicial y las células se recogieron después de 24 h
adicio-
nales.
nales.
\newpage
Tab.
1
Partes alícuotas de microsomas (20 nmol de PC)
se liofilizaron y se añadieron lípidos de substrato en solución de
benceno: (A) 0,4 nmoles de [^{14}C]-DAG (7760
dpm/nmol) y, cuando se indicaba, 1,6 nmoles de DAG no marcada; (B)
0,4 nmoles de [^{14}C]-DAG (7760 dpm/nmol) y 5
nmoles de di-ricinoleoil-PC no
marcada y (C) 0,25 nmol de [^{14}C]-PC (4000
dpm/nmol) y 5 nmol de DAG no marcado. El benceno se evaporó mediante
N_{2} y se añadieron 0,1 ml de fosfato potásico 50 mM, se
mezclaron a fondo y se incubaron a 30ºC durante (A) 20 min, (B) y
(C) 30 min. Los ensayos se terminaron mediante la extracción de los
lípidos en cloroformo. Los lípidos se separaron a continuación
mediante cromatografía en capa fina sobre placas de gel de sílice 60
(Merck; Darmstadt, Alemania) en hexano/éter dietílico/ácido acético
35:70:1,5. Los lípidos radiactivos se visualizaron y la
radiactividad se cuantificó sobre la placa mediante
autorradiografía electrónica (Instant Imager, Packard, EE.UU. de
A.). Los resultados se presentan como valores medios de dos
experimentos.
Radiactividad en diferentes especies de
triacilglieroles (TAG) formadas. Abreviaturas usadas:
1-OH-, mono-rici-
noleoil-; 2-OH, di-ricinoleoil-; 3-OH-, triricinoleoil; 1-OH-1-ver-, mono-ricinoleoil-monovernoleoil-; 1-OH-2-ver-, mono-ricinoleoil-divernoleoil-. Se prepararon enzimáticamente DAG y PC radiomarcadas. Los grupos ricinoleoílo radiomarcados se unen en la posición sn-2 del lípido y el grupo oleoílo no marcado en la posición sn-1. Se preparó DAG no marcado con cadenas de vernoloílo o ricinoleoílo mediante la adición de TAG lipasa (6) sobre aceite de Euphorbia lagascae o haba de ricino, respectivamente. La di-ricinoleoil-PC sintética fue amablemente proporcionada por Metapontum Agribios (Italia).
noleoil-; 2-OH, di-ricinoleoil-; 3-OH-, triricinoleoil; 1-OH-1-ver-, mono-ricinoleoil-monovernoleoil-; 1-OH-2-ver-, mono-ricinoleoil-divernoleoil-. Se prepararon enzimáticamente DAG y PC radiomarcadas. Los grupos ricinoleoílo radiomarcados se unen en la posición sn-2 del lípido y el grupo oleoílo no marcado en la posición sn-1. Se preparó DAG no marcado con cadenas de vernoloílo o ricinoleoílo mediante la adición de TAG lipasa (6) sobre aceite de Euphorbia lagascae o haba de ricino, respectivamente. La di-ricinoleoil-PC sintética fue amablemente proporcionada por Metapontum Agribios (Italia).
Tab.
2
Ácidos grasos totales por mg de semillas T2
reunidas de plantas de Arabidopsis thaliana individuales
transformadas con gen de PDAT de levadura bajo el control de
promotor de napina (26-14) o transformadas con
vector vacío
(32-4).
(32-4).
* = diferencia estadística entre plantas de
control y plantas transformadas con PDAT en una prueba bilateral de
la diferencia media a \alpha = 5.
Nº ID SEC 1: Secuencia de DNA genómico y
secuencia de aminoácidos sugerida del gen de PDAT de
Saccharomyces cerevisiae, YNR008w, con número de registro
del GenBank Z71623 e Y13139, con el número de ID de nucleótido
1302481.
Nº ID SEC 2: La secuencia de aminoácidos del
YNR008w de marco de lectura abierto sugerido de Saccharomyces
cerevisiae.
Nº ID SEC 3: Secuencia de nucleótidos del clon
de cDNA de Arabidopsis thaliana con número de registro del
GenBank T04806 y número de ID de nucleótidos 315966.
Nº ID SEC 4: Secuencia de aminoácidos predicha
del clon de cDNA de Arabidopsis thaliana con el número de
registro del GenBank T04806.
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1986
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1983)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schizosaccharomyces pombe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2427
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 671
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(402)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 616
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neurospora crassa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3896
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 709
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lycopersicon esculentum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 623
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schizosaccharomyces pombe
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 432
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 552
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1a
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2a
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3a
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 389
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4a
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1986
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1983)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5a
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Stymne Dr., Sten
\vskip0.400000\baselineskip
<120>
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150>
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1986
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico.
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1923)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 661
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Schizosaccharomyces pombe
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<230> 4b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3685
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (120)..(402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> cDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1) .. (402)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<211> Zea mays
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 616
\vskip0.400000\baselineskip
<212> CDNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neurospora crassa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9b
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1562
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA genómico
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 9
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<210> 10b
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<211> 3935
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<212> DNA genómico
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 10
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<210> 11b
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<213> tomate
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<400> 11
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<110> BASF AG
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RUTA BIOSINTÉTICA PARA LA PRODUCCIÓN DE TRIACILGLICEROL Y MOLÉCULAS
DE DNA RECOMBINANTE QUE CODIFICAN ESTAS ENZIMAS
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<212> DNA genómico
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1983)
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<400> 1
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<211> 661
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<212> PRT
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<213> Saccharomyces cerevisiae
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<211> 2427
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<212> cDNA
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<213> Arabidopsis thaliana
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<213> Arabidopsis thaliana
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<400> 4
Claims (3)
1. Uso de una enzima que consiste en
- a)
- un polipéptido con una secuencia de aminoácidos como la indicada en los Nº ID SEC 2 ó 4;
- b)
- un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos como la indicada en el Nº ID SEC 1 ó 3; o
- c)
- un polipéptido codificado por una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como la indicada en el Nº ID SEC 2 ó 4,
- como un catalizador en una reacción independiente de acil-CoA de la transferencia de ácidos grasos desde fosfolípidos hasta diacilglicerol en la producción biosintética de triacilglicerol.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, para
la producción de triacilgliceroles con ácidos grasos no comunes, en
el que los ácidos grasos no comunes se proporcionan para la reacción
en forma de fosfolípidos y en el que dichos ácidos grasos no
comunes se seleccionan del grupo que consiste en ácidos grasos de
cadena media, ácidos grasos hidroxilados, ácidos grasos
epoxigenados y ácidos grasos acetilénicos.
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1,
mediante la transformación de cualquier célula de planta, planta o
célula de microorganismo, preferiblemente célula de levadura, con
una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste
en las secuencias indicadas en el Nº ID SEC 1 ó 3 o una secuencia de
nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos como la
indicada en el Nº ID SEC 2 ó 4, para ser expresada en dicha célula
u organismo y dar como resultado un contenido de aceite incrementado
de dicha célula u organismo.
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