ES2283306T3 - Vacunas de virus parainluenza recombinante atenuadas por supresion o eliminacion de un gen no esencial. - Google Patents
Vacunas de virus parainluenza recombinante atenuadas por supresion o eliminacion de un gen no esencial. Download PDFInfo
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Abstract
Virus parainfluenza (PIV) recombinante infeccioso que comprende un genoma o antigenoma de PIV, una proteína de nucleocápside (N), una fosfoproteína (P), y una proteína grande de polimerasa (L), en el que se introduce una modificación en el genoma o antigenoma que comprende una supresión parcial o completa de uno o más ORFs C, D o V o uno o más cambios de nucleótidos seleccionados entre (i) la introducción de uno o más codones de terminación, (ii) una mutación en un sitio de edición del ARN, (iii) una mutación que modifica un aminoácido determinado por un codón de iniciación y (iv) la introducción de una mutación con desplazamiento del marco de lectura, por lo cual se reduce o elimina la expresión de los mencionados uno o más ORFs C, D o V, caracterizado porque la modificación en el genoma o antigenoma determina uno o más cambios fenotípicos deseados en el PIV recombinante, seleccionados entre (i) la atenuación en un cultivo celular, (ii) la atenuación en el tracto respiratorio superior y/oinferior de un huésped mamífero.
Description
Vacunas de virus parainfluenza recombinante
atenuadas por supresión o eliminación de un gen no esencial.
El virus parainfluenza humano tipo 3 (HPIV3) es
una causa común de infección grave del tracto respiratorio inferior
en lactantes y niños menores de un año de edad. Es la segunda causa
principal de hospitalización por enfermedad vírica del tracto
respiratorio inferior en este grupo de edad, solamente detrás del
virus sincitial respiratorio (RSV) (Collins y otros, págs.
1205-1243. En B. N. Fields (Knipe y otros,
editores), Fields Virology, 3ª ed., vol. 1.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996;
Crowe y otros, Vaccine 13: 415-421, 1995;
Marx y otros, J. Infect. Dis. 176: 1423-1427,
1997). Las infecciones por este virus dan como resultado una
morbidez sustancial en niños menores de 3 años de edad. HPIV1 y
HPIV2 son los agentes etiológicos principales de la
laringotraqueobronquitis (crup) y también pueden provocar neumonía y
bronquiolitis graves (Collins y otros, 3ª ed. En "Fields
Virology", B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, R. M.
Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman, y S. E. Straus,
Editores, Vol. 1, págs. 1205-1243.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
En un estudio a largo plazo durante un periodo de 20 años, HPIV1,
HPIV2 y HPIV3 se identificaron como agentes etiológicos en el 6,0,
3,2 y 11,5%, respectivamente, de las hospitalizaciones por
enfermedad del tracto respiratorio, suponiendo un total del 18% de
las hospitalizaciones y, por este motivo, existe una necesidad de
una vacuna efectiva (Murphy y otros, Virus Res 11,
1-15, 1988). Los virus parainfluenza también se han
identificado en una proporción significativa de casos de efusiones
del oído medio inducidas por virus en niños con otitis media
(Heikkinen y otros, N Engl J Med 340: 260-4,
1999). Por lo tanto, existe la necesidad de producir una vacuna
contra estos virus que pueda evitar la enfermedad grave del tracto
respiratorio inferior y la otitis media que acompaña estas
infecciones por HPIV.
A pesar de los considerables esfuerzos para
desarrollar tratamientos con vacunas efectivos contra el HPIV,
todavía no se han conseguido agentes de vacunación autorizados para
ninguna cepa de HPIV, ni para mejorar enfermedades relacionadas con
el HPIV. Hasta la fecha, sólo se ha prestado una atención especial a
dos candidatos a vacuna viva atenuada de PIV. Uno de estos
candidatos es una cepa de PIV bovino (BPIV3) que está relacionada
antigénicamente con el HPIV3 y que se ha demostrado que protege a
los animales contra HPIV3. BPIV3 está atenuado, es genéticamente
estable e inmunogénico en lactantes humanos y niños (Karron y otros,
J. Inf. Dis. 171: 1107-14 (1995a); Karron y
otros, J. Inf. Dis. 172: 1445-1450, (1995b)).
Un segundo candidato a vacuna de PIV3, JS cp45, es un mutante
adaptado al frío de la cepa de tipo salvaje JS (wt) de HPIV3 (Karron
y otros, (1995b), cita anterior; Belshe y otros, J. Med.
Virol. 10: 235-42 (1982)). Este candidato a
vacuna viva atenuada, pasado por frío (cp), de PIV3 muestra
fenotipos sensibles a la temperatura (ts), con adaptación al frío
(ca), y con atenuación (att) que son estables tras la replicación
viral in vivo. El virus cp45 es protector frente al ataque
con PIV3 humano en animales experimentales y está atenuado, es
genéticamente estable e inmunogénico en lactantes humanos y niños
seronegativos (Hall y otros, Virus Res.
22:173-184 (1992); Karron y otros,(1995b), cita
anterior).
Para facilitar el desarrollo de candidatos a
vacuna de PIV, la tecnología del ADN recombinante ha hecho posible
recientemente la recuperación de virus infecciosos de ARN de hebra
negativa a partir de ADNc (ver anterioridades en Conzelmann, J.
Gen. Virol. 77:381-89 (1996); Palese y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:11354-58,
(1996)). En este contexto, se ha informado del rescate del
recombinante para el virus respiratorio sincitial (RSV), el virus
de la rabia (RaV), el virus de la estomatitis vesicular (VSV); el
virus del sarampión (MeV), el virus de la peste bovina, el virus 5
de simio (SV5), el virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) y el
virus Sendai (SeV,) infecciosos, a partir de ARN antigenómico
codificado por ADNc en presencia de proteínas virales esenciales
(ver, por ejemplo, Garcin y otros, EMBO J.
14:6087-6094 (1995); Lawson y otros, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 92:4477-81 (1995); Radecke y
otros, EMBO J. 14:5773-5784 (1995); Schnell y
otros, EMBO J. 13:4195-203 (1994); Whelan y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
92:8388-92 (1995); Hoffman y otros, J. Virol.
71:4272-4277 (1997); Kato y otros, Genes to
Cells 1:569-579 (1996), Roberts y otros,
Virology 247(1), 1-6 (1998); Baron y
otros, J. Virol. 71:1265-1271 (1997);
Publicación Internacional de Patente No. WO 97/06270; Collins y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
92:11563-11567 (1995); Solicitud de Patente de
U.S.A. No. 08/892,403, presentada el 15 de julio de 1997
(correspondiente a la Solicitud Internacional de Patente publicada
No. WO 98/02530 y a las Solicitudes Provisionales de Patentes
U.S.A. con números de prioridad 60/047,634, presentada el 23 de
mayo de 1997, 60/046,141, presentada el 9 de mayo de 1997, y
60/021,773, presentada el 15 de julio de 1996); Juhasz y otros,
J. Virol. 71(8):5814-5819 (1997); He y
otros Virology 237:249-260 (1997); Baron y
otros J. Virol. 71:1265-1271 (1997);
Whitehead y otros, Virology
247(2):232-9 (1998a); Whitehead y otros,
J. Virol. 72(5):4467-4471 (1998b);
Peeters y otros J. Virol. 73:5001-5009, 1999;
Jin y otros Virology 251:206-214
(1998); Bucholz y otros, J. Virol. 73:251-259 (1999); y Whitehead y otros, J. Virol. 73:(4) 3438-3442 (1999)).
(1998); Bucholz y otros, J. Virol. 73:251-259 (1999); y Whitehead y otros, J. Virol. 73:(4) 3438-3442 (1999)).
Recientemente se desarrolló un método para la
producción de HPIV con un fenotipo wt a partir de ADNc para la
recuperación de una cepa JS de PIV3 recombinante, infecciosa (ver,
por ejemplo, Durbin y otros, Virology
235:323-332, 1997; la Solicitud de Patente
U.S.A. con número de serie 09/083,793, presentada el 22 de mayo de
1998; la Solicitud de Patente Provisional U.S.A. No. 60/047,575,
presentada el 23 de mayo de 1997 (correspondiente a la Publicación
Internacional de Patente No. WO 98/53078), y la Solicitud de Patente
Provisional U.S.A. No. 60/059,395, presentada el 19 de septiembre
de 1997). Además, estas invenciones tienen en cuenta la manipulación
genética de clones de ADNc para determinar las bases genéticas de
cambios fenotípicos en mutantes biológicos, por ejemplo, qué
mutaciones en el virus HPIV3 cp45 determinan sus fenotipos ts, ca y
att, y qué gen o genes de BPIV3 determinan su fenotipo de
atenuación. De forma adicional, estas invenciones hacen factible la
construcción de candidatos a vacuna de PIV nuevos y la evaluación
de su nivel de atenuación, inmunogenicidad y estabilidad
fenotípica.
De este modo, el PIV3 recombinante de tipo
salvaje infeccioso (r)PIV3, así como una variedad de
derivados ts, se han recuperado en la actualidad a partir de
ADNc, y se han utilizado sistemas de genética inversa para generar
virus infecciosos portadores de determinadas mutaciones atenuantes y
para estudiar las bases genéticas de la atenuación de los virus de
vacuna existentes. Por ejemplo, las tres sustituciones de
aminoácidos encontradas en el gen L de cp45, de forma única
o en combinación, se ha descubierto que determinan los fenotipos
ts y de atenuación. En otras regiones del PIV3cp45
están presentes otras mutaciones ts y atenuantes. Además, se
ha generado un candidato a vacuna de PIV1 quimérico mediante el
sistema de recuperación de ADNc de PIV3, mediante la sustitución de
los marcos de lectura abiertos (ORFs) HN y F de PIV3 por los de PIV1
en un ADNc de PIV3 de longitud completa que contiene las tres
mutaciones atenuantes en L. El virus quimérico recombinante obtenido
a partir de este ADNc se denomina rPIV3-1
cp45L (Skiadopoulos y otros, J Virol
72:1762-8, 1998; Tao y otros, J Virol
72:2955-2961, 1998; Tao y otros, Vaccine
17:1100-1108, 1999). El
rPIV3-1.cp45L estaba atenuado en hámsteres e
indujo un alto nivel de resistencia al ataque con PIV1. Se ha
producido un virus quimérico recombinante, denominado
rPIV3-1.cp45 que contiene 13 de las 15
mutaciones de cp45, es decir, excluye las mutaciones en HN y
F, y está muy atenuado en el tracto respiratorio superior e inferior
de los hámsteres (Skiadopoulos y otros, Vaccine en edición,
1999).
A pesar de estos numerosos avances en el
desarrollo de agentes de vacunación efectivos contra diferentes
grupos de PIV, permanece la clara necesidad en la técnica de
herramientas y métodos adicionales para diseñar vacunas seguras y
efectivas para aliviar los serios problemas de salud atribuibles a
PIV, en particular, enfermedades en lactantes y niños debidas a
infección por HPIV3. Entre los ataques pendientes en este contexto
se encuentra la necesidad de herramientas adicionales para generar
candidatos a vacuna adecuados atenuados, inmunogénicos y
genéticamente estables, para su utilización en diversos ámbitos
clínicos. Para facilitar estos objetivos, se deben ampliar los
métodos existentes para la identificación e incorporación de
mutaciones atenuantes en cepas de vacuna recombinantes. De forma
sorprendente, la presente invención satisface esta necesidad y
proporciona ventajas adicionales, tal como se describe a
continuación.
continuación.
Según la presente invención, se proporciona un
virus parainfluenza recombinante infeccioso (PIV) que comprende un
genoma o antigenoma de PIV, una proteína de nucleocápside (N), una
fosfoproteína (P), y una proteína grande de la polimerasa (L), en
el que se introduce una modificación en el genoma o antigenoma que
comprende una supresión parcial o completa de uno o más ORFs C, D o
V o uno o más cambios de nucleótidos seleccionados entre (i) la
introducción de uno o más codones de terminación, (ii) una mutación
en un sitio de edición del ARN, (iii) una mutación que modifica un
aminoácido determinado por un codón de iniciación, y (iv) la
introducción de una mutación con desplazamiento del marco de
lectura, en el que la expresión de los mencionados uno o más ORFs
C, D o V se reduce o elimina, caracterizado porque la modificación
en el genoma o antigenoma determina uno o más de los cambios
fenotípicos deseados en el PIV recombinante seleccionados entre (i)
la atenuación en un cultivo de células, (ii) la atenuación en
tracto respiratorio superior e/o inferior de un huésped
mamífero.
Preferentemente, la modificación introducida en
el genoma o antigenoma comprende una supresión parcial o completa
de, como mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V, o uno o más
cambios de nucleótidos, que reducen o eliminan la expresión de,
como mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V. Más
preferentemente, los ORFs D y V, se modifican ambos mediante una
supresión parcial o completa o uno o más cambios de nucleótidos, que
reducen o eliminan su expresión.
Preferentemente, se introducen tres codones de
terminación mediante un cambio de nucleótido en las posiciones
2692, 2695 y 2698 del antigenoma del ORF D.
Preferentemente, se introducen dos codones de
terminación mediante un cambio de nucleótido en las posiciones 2845
y 2854 del antigenoma del ORF D.
Preferentemente, se cambia el codón de
iniciación del ORF C a un codón de treonina mediante un cambio de
nucleótido en la posición 1795 del mencionado genoma o antigenoma y
se introducen dos codones de terminación mediante una modificación
de los nucleótidos 1813 y 1869.
Preferentemente, se atenúa sustancialmente
5-10 veces o más el crecimiento viral en un cultivo
de células, comparado con el crecimiento de la correspondiente cepa
parental de PIV de tipo salvaje o mutante.
Preferentemente, se atenúa sustancialmente
10-100 veces o más el crecimiento viral en el tracto
respiratorio superior e inferior, comparado con el crecimiento de
la correspondiente cepa parental de PIV de tipo salvaje o
mutante.
Preferentemente, se atenúa sustancialmente
100-1.000 veces o más el crecimiento viral en el
tracto respiratorio superior e inferior, comparado con el
crecimiento de la correspondiente cepa parental de PIV de tipo
salvaje o mutante.
Preferentemente, se modifica el genoma o
antigenoma mediante la introducción de una o más mutaciones
atenuantes identificadas en un PIV humano mutante de origen
biológico.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
contiene, como mínimo, dos mutaciones atenuantes.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
contiene, como mínimo, una mutación atenuante estabilizada mediante
múltiples cambios de nucleótidos en un codón que determina la
mutación.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
contiene, como mínimo, una y hasta un complemento completo de
mutaciones atenuantes presentes en el PIV3 JS cp45.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
contiene, como mínimo, una y hasta un complemento completo de
mutaciones atenuantes que determinan una sustitución de aminoácidos
en Tyr 942, Leu 992 y/o Thr 1558 en el gen L de PIV3; Val 96 y Ser
389 en N; Ile 96 en C; Ile 420 y/o Ala 550 en F; Val 384 en HN, y/o
una sustitución de nucleótidos en el líder 3' en la posición 23,
24, 28 y/o 45 y/o en la posición 62 en la secuencia de inicio de
gen
de N.
de N.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
comprende una modificación de nucleótido adicional que determina un
cambio fenotípico seleccionado entre un cambio en las
características de crecimiento, en atenuación, en sensibilidad a la
temperatura, en adaptación al frío, en tamaño de placa, en
restricción de la variedad de huésped o un cambio en la
inmunogenicidad.
Según otro aspecto de la presente invención, se
da a conocer una composición inmunogénica para provocar una
respuesta inmune contra PIV, y la composición comprende una cantidad
suficiente inmunogénicamente del PIV recombinante en un
transportador fisiológicamente aceptable.
Preferentemente, la composición inmunogénica se
formula en una dosis de 10^{3} a 10^{7} PFU.
Preferentemente, la composición inmunogénica se
formula para su administración en el tracto respiratorio superior
mediante pulverizador, aerosol o en forma de gotas.
Preferentemente, el PIV recombinante provoca una
respuesta inmune contra uno o más virus seleccionados entre HPIV1,
HPIV2 y HPIV3.
Preferentemente, el PIV recombinante provoca una
respuesta inmune contra HPIV3 y otro virus seleccionado entre HPIV1
y HPIV2.
Según otro aspecto de la presente invención, se
da a conocer una molécula de polinucleótico aislada que comprende
un genoma o antigenoma de PIV recombinante que contiene una
modificación de nucleótido que comprende una supresión parcial o
completa de uno o más ORFs C, D o V, o uno o más cambios de
nucleótido que reducen o eliminan la expresión de los mencionados
uno o más ORFs C, D o V, que se caracteriza porque la modificación
en el genoma o antigenoma determina uno o más cambios fenotípicos
deseados en el PIV recombinante, seleccionados entre (i) la
atenuación en un cultivo celular, (ii) la atenuación en el tracto
respiratorio superior y/o inferior de un huésped mamífero.
Preferentemente, la expresión de los mencionados
ORFs C, D o V se reduce o elimina mediante la introducción de uno o
más codones de terminación, una mutación en un sitio de edición del
ARN, una mutación que modifica el aminoácido determinado por un
codón de iniciación, o la supresión de uno o más ORFs C, D o V, de
forma completa o parcial.
Preferentemente, la modificación introducida en
el genoma o antigenoma comprende una supresión parcial o completa
de, como mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V o uno o más
cambios de nucleótido que reducen o eliminan la expresión de, como
mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V.
Preferentemente, los ORFs D y V se modifican
ambos mediante una supresión parcial o completa o uno o más cambios
de nucleótido que reducen o eliminan su expresión.
Preferentemente, el genoma o antigenoma
recombinante se modifica, además, por una o más mutaciones
atenuantes.
Preferentemente, la molécula de polinucleótido
aislada también comprende una modificación de nucleótido que
determina un cambio fenotípico seleccionado entre un cambio en las
características de crecimiento, atenuación, sensibilidad a la
temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa, restricción de la
variedad de huésped o un cambio en la inmunogenicidad.
Según otro aspecto de la presente invención, se
da a conocer un método para la producción de una partícula
infecciosa de PIV recombinante, atenuada, a partir de una o más
moléculas de polinucleótido aisladas que codifican el mencionado
PIV, y el método comprende la expresión en una célula o un lisado
libre de células de un vector de expresión que comprende el
polinucleótido aislado, y proteínas N, P y L de PIV.
Preferentemente, el genoma o antigenoma de PIV
quimérico y las proteínas N, P y L se expresan mediante dos o más
vectores de expresión diferentes.
Según otro aspecto de la presente invención, se
da a conocer un vector de expresión que comprende un promotor de
transcripción unido de forma operativa, una secuencia de
polinucleótidos y un finalizador de la transcripción.
En la presente invención se describen
herramientas y métodos para la introducción de cambios estructurales
y fenotípicos definidos y predeterminados en PIV infecciosos. En un
ejemplo se da a conocer una molécula de polinucleótido aislada que
comprende un promotor de transcripción unido de forma operativa, una
secuencia de polinucleótidos que codifica un genoma o antigenoma de
PIV, y un finalizador de la trascripción. El genoma o antigenoma
contiene una mutación "knock out" que reduce o elimina la
expresión de uno o más de los genes de C, D y/o V, o una mutación
que suprime todo o una parte de uno o más de los ORFs C, D y/o
V.
La expresión de uno o más de los ORFs C, D y/o V
se puede reducir o eliminar mediante la modificación del genoma o
antigenoma de PIV para incorporar una mutación que cambia el codón
de iniciación de M para el ORF C o uno o más codones de
terminación. De forma alternativa, uno o más de los ORFs C, D y/o V
se suprime de forma completa o parcial, o se modifica mediante
otras mutaciones, tales como mutaciones puntuales, para proporcionar
la proteína o proteínas correspondientes parcial o completamente,
no funcionales o para interrumpir totalmente la expresión de la
proteína. De forma alternativa, las mutaciones se pueden realizar en
el sitio de edición que evita la edición y elimina la expresión de
proteínas a las que se accede mediante la edición de ARN (Kato y
otros, EMBO 16:578-587, 1997 y Schneider y
otros, Virology 227:314-322,1997).
El PIV recombinante que tiene mutaciones en C, D
y/o V contiene características fenotípicas muy deseadas para el
desarrollo de una vacuna. Las modificaciones anteriores
identificadas en el genoma o antigenoma recombinante determinan uno
o más cambios fenotípicos deseados en el virus o partícula subviral
resultante. Los candidatos a vacuna se generan de tal modo que
muestran una o más de las características identificadas como (i) un
cambio en las propiedades de crecimiento en un cultivo de células,
(ii) la atenuación en el tracto respiratorio superior o inferior de
huéspedes mamíferos, (iii) un cambio en el tamaño de placa viral,
(iv) un cambio en el efecto citopático, y (v) un cambio en la
inmunogenicidad.
En ejemplos de recombinantes de PIV descritos en
la presente invención, entre los cambios fenotípicos deseados se
incluyen la atenuación del crecimiento viral in vitro y/o en
huéspedes mamíferos, comparado con el crecimiento de una cepa
correspondiente de PIV parental de tipo salvaje o mutante. En
aspectos más detallados, el crecimiento viral en un cultivo de
células se puede atenuar aproximadamente 5-10 veces
debido a mutaciones por supresión knock out o de genes (o segmentos
de genoma). La atenuación viral en el tracto respiratorio superior
y/o inferior de huéspedes mamíferos se atenúa preferentemente
10-100 veces aproximadamente, y algunas veces
100-1000 veces o más, para facilitar el desarrollo
de la vacuna. Al mismo tiempo, el PIV recombinante, tal como se
describe en la presente invención, tiene características
inmunogénicas que estimulan una respuesta inmune protectora contra
el ataque de PIV wt tanto en el tracto respiratorio superior como en
el inferior en huéspedes mamíferos.
El genoma o antigenoma de PIV que contiene una o
más mutaciones knock out de C, D y V puede ser una secuencia de PIV
humano o no humano, o una versión modificada por recombinación de la
misma. En un ejemplo, la secuencia de polinucleótidos codifica un
genoma o antigenoma quimérico que comprende una secuencia de PIV
humano unido por recombinación con una secuencia de PIV no humana,
tal como un gen o fragmento de gen de PIV bovino (BPIV) (véase, por
ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional U.S.A titulada
"Vacunas de virus parainfluenza quimérico
humano-bovino atenuado", presentada por Bailey y
otros, el 9 de julio de 1999 e identificada por el Expediente del
Agente No. 15280-399000 US).
En ejemplos adicionales, el polinucleótido
codifica una quimera de secuencias de un PIV no humano y, como
mínimo, otro PIV de origen humano o no humano.
También se describe una partícula infecciosa
aislada de PIV que comprende un genoma o antigenoma de PIV
recombinante (rPIV) que contiene una o más mutaciones knock out de
C, D y/o V. La partícula infecciosa aislada de PIV puede ser una
partícula viral o subviral. Según se utiliza en la presente
invención, el término partícula subviral se refiere a cualquier
partícula de PIV infecciosa que carece de elemento estructural, por
ejemplo, un segmento de gen, un gen, una proteína o un dominio
funcional de proteína, el cual está presente en un virus completo
(por ejemplo, un virión ensamblado que incluye un genoma o
antigenoma completo, nucleocápside y envoltura). De este modo, un
ejemplo de partícula subviral es una nucleocápside infecciosa que
contiene un genoma o antigenoma, y los productos de los genes N, P
y L. Otras partículas subvirales se obtienen mediante supresiones
parciales o completas de genes no esenciales, segmentos de genoma
y/o productos de genes completos o parciales (por ejemplo, F, HN, M
o C), entre otros elementos genómicos y estructurales no
esenciales.
Junto con los efectos fenotípicos que se dan a
conocer en el PIV recombinante que contiene una o más mutaciones
por supresión o knock out en C, D y/o V, a menudo es deseable
ajustar el fenotipo de atenuación e inmunogénico mediante la
introducción de mutaciones adicionales que incrementan o disminuyen
la atenuación y/o modulan la actividad inmunogénica del virus
recombinante. De este modo, las cepas de vacuna candidatas se pueden
atenuar más mediante la incorporación de, como mínimo, una, y,
preferentemente, dos o más mutaciones atenuantes, por ejemplo,
mutaciones identificadas en un mutante de PIV de origen biológico o
identificadas empíricamente mediante minirreplicones recombinantes,
un virus recombinante, o un virus de origen biológico. Entre las
cepas de PIV mutante en este contexto se encuentran las mutantes
pasadas por frío (cp), adaptadas a frío (ca), las restringidas en
la variedad de huéspedes (hr), las de placa pequeña (sp) y/o las
sensibles a la temperatura (ts), por ejemplo, la cepa mutante de
HPIV3 JS cp45. En realizaciones de ejemplo, una o más mutaciones
atenuantes tienen lugar en la proteína L de la polimerasa, por
ejemplo, en la posición correspondiente a Tyr942, Leu992, o Thr1558
de JS cp45. Por ejemplo, se pueden seleccionar mutaciones en la
proteína N e incorporarlas en un mutante por supresión o knock out
en C, D y/o V, por ejemplo, que codifique una o más sustituciones de
aminoácidos en la posición correspondiente a los residuos Val96 o
Ser389 de JS cp45. Mutaciones alternativas o adicionales pueden
codificar una o más sustituciones de aminoácidos en la proteína C,
por ejemplo, en la posición correspondiente a Ile96 de JS cp45. Aún
otras mutaciones adicionales para el ajuste de la atenuación de un
mutante por supresión o knock out en C, D y/o V se encuentran en la
proteína F, por ejemplo, en la posición correspondiente a Ile420 o
Ala450 de JS cp45, y en la proteína HN, por ejemplo, en la posición
correspondiente al residuo Val384 de JS cp45 (Skiadopoulos y otros,
J. Virol. 73:1374-1381, 1999; Skiadopoulos y
otros, J Virol. 73:1374-1381, 1999).
Entre las mutaciones atenuantes de mutantes PIV
de origen biológico para la incorporación en mutantes por supresión
o knock out en C, D y/o V también se incluyen las mutaciones en
partes no codificadoras del genoma o antigenoma de PIV, por
ejemplo, en una secuencia líder 3'. En este contexto se pueden
diseñar mutaciones de ejemplo en una posición en el líder 3' de un
virus recombinante en una posición correspondiente al nucleótido
23, 24, 28 ó 45 de JS cp45 (Skiadopoulos y otros, J. Virol.
73:1374-1381, 1999). Aún se pueden diseñar otras
mutaciones de ejemplo en la secuencia de inicio del gen N, por
ejemplo, mediante el cambio de uno o más nucleótidos en la
secuencia de inicio del gen N, por ejemplo, en la posición
correspondiente al nucleótido 62 de JS cp45.
Se proporciona un gran "menú" de mutaciones
atenuantes a partir de JS cp45 y otros mutantes de PIV de origen
biológico y cada una de las mutaciones mencionadas se puede combinar
con cualquier otra mutación o mutaciones para ajustar el nivel de
atenuación en un PIV recombinante que contiene una o más mutaciones
por supresión o knock out en C, D y/o V. Por ejemplo, entre las
mutaciones en PIVs recombinantes se pueden incluir una o más, y,
preferentemente, dos o más, mutaciones de JS cp45. Los mutantes por
supresión o knock out en C, D y/o V deseados de la presente
invención seleccionados para su utilización como vacuna a menudo
tienen, como mínimo, dos, y a veces, tres o más mutaciones
atenuantes para conseguir un nivel satisfactorio de atenuación para
un uso clínico
amplio.
amplio.
Los PIV recombinantes que contienen una o más
mutaciones por supresión o knock out en C, D y/o V pueden incorporar
una o más mutaciones atenuantes estabilizadas por múltiples
sustituciones de nucleótidos en un codón que determina la
mutación.
Algunas mutaciones adicionales que se pueden
adoptar o transferir a mutantes por supresión o knock out en C, D
y/o V se pueden identificar en virus diferentes de PIV de ARN de
cadena negativa no segmentado e incorporar en los mutantes de PIV
de la presente invención. Esto se consigue rápidamente mediante el
mapeo de la mutación identificada en un virus heterólogo de ARN de
cadena negativa al sitio correspondiente, homólogo, en un genoma o
antigenoma de un PIV receptor y mediante la mutación de la secuencia
existente en el receptor al genotipo mutante (mediante una mutación
idéntica o bien conservadora), tal como se describe en la Solicitud
de Patente U.S.A. titulada "Producción de vacunas de virus
atenuados de arn de cadena negativa a partir de secuencias de
nucleótidos clonadas", presentada por Murphy y otros el 13 de
abril de 1999 e identificada por el Expediente del Agente No.
17634-000600).
Además de las mutaciones descritas
anteriormente, los mutantes infecciosos por supresión o knock out en
C, D y/o V contienen, de forma deseable, secuencias de nucleótidos
heterólogas, codificadoras o no codificadoras de cualquier virus
PIV o similar a PIV, heterólogo, por ejemplo, HPIV1, HPIV2, HPIV3,
PIV bovino (BPIV) o PIV murino (MPIV) para formar un genoma o
antigenoma quimérico. Por ejemplo, un PIV recombinante puede
incorporar secuencias de dos o más cepas de PIV de tipo salvaje o
mutantes, por ejemplo, HPIV1 y HPIV3. De forma alternativa,
mutantes por supresión o knock out en C, D y/o V pueden contener
secuencias de un PIV humano y no humano, por ejemplo, HPIV y
BPIV.
Uno o más polinucleótidos de PIV humano,
codificadores o no codificadores, en un genoma o antigenoma
"receptor" o "de background" se sustituyen por una
secuencia homóloga de un virus heterólogo PIV o diferente a PIV,
sola o combinada con una o más mutaciones puntuales atenuantes
seleccionadas, por ejemplo, entre mutaciones cp y/o ts, para
obtener cepas de vacuna atenuadas nuevas. La partícula aislada de
PIV infecciosa puede ser de PIV humano, o PIV3 humano (HPIV3)
(véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Provisional U.S.A.
titulada "Vacunas de virus parainfluenza quimérico
humano-bovino atenuado", presentada por Bailey y
otros el 9 de julio de 1999 e identificada por el Expediente del
Agente No. 15280-399000US.
También se describen partículas infecciosas
aisladas de PIV que incorporan secuencias de nucleótidos de HPIV3
unidas a, como mínimo, una secuencia de un PIV heterólogo, tal como
HPIV1, HPIV2, BPIV o MPIV. Por ejemplo, genes completos de HPIV3 se
pueden sustituir por genes homólogos de otras formas de PIV, tales
como los genes de glicoproteína HN y/o F de PIV1 o PIV2. De forma
alternativa, un segmento de genoma seleccionado, por ejemplo, una
cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o ectodominio de HN o
F de HPIV1 o HPIV2, se puede sustituir por un gen o segmento de gen
correspondiente para obtener construcciones que codifican proteínas
quiméricas, por ejemplo, proteínas de fusión que contienen una cola
citoplásmica y/o un dominio de transmembrana de PIV3 fusionado a un
ectodominio de PIV1 o PIV2. De forma alternativa, se pueden añadir
genes o segmentos de genes de un PIV (es decir, sin sustitución)
dentro de un background de PIV heterólogo para crear un clon
resultante con propiedades inmunogénicas nuevas.
Además del PIV recombinante que tiene las
mutaciones por supresión o knock out en C, D y/o V descritas, se
describen clones de ADNc, vectores y partículas, cada uno de los
cuales contiene una o más mutaciones objetivo, específicas de
fenotipo, que se indican en la presente invención. Éstas se
introducen en combinaciones seleccionadas, por ejemplo, en un
polinucleótido aislado que es un genoma o antigenoma de ADNc
recombinante para obtener un virus o partícula subviral infeccioso,
atenuado adecuadamente tras la expresión, según los métodos
descritos en la presente invención. Este proceso, junto con la
evaluación fenotípica rutinaria, proporciona mutantes por supresión
o knock out en C, D y/o V que tienen las característica deseadas,
tales como atenuación, sensibilidad a la temperatura,
inmunogenicidad alterada, adaptación al frío, tamaño de placa
pequeño, restricción en la variedad de huésped, estabilidad
genética, etc. En particular, se seleccionan los candidatos a vacuna
que están atenuados y todavía son suficientemente inmunogénicos
para provocar una respuesta inmune en el huésped mamífero
vacunado.
Los mutantes por supresión o knock out en C, D
y/o V, con o sin la adopción de mutaciones atenuantes adicionales,
por ejemplo, a partir de virus mutantes de origen biológico, se
pueden construir de modo que tengan una o más modificaciones de
nucleótidos adicionales para obtener un cambio fenotípico,
estructural o funcional deseado. Habitualmente, la modificación de
nucleótido seleccionada determinará un cambio fenotípico, por
ejemplo, un cambio en las características de crecimiento, en
atenuación, en sensibilidad a la temperatura, en adaptación al
frío, en tamaño de placa, en restricción de la variedad de huésped,
o en inmunogenicidad. En este contexto, entre los cambios
estructurales se incluyen la introducción o eliminación de sitios de
restricción en ADNc que codifican PIV, para facilitar la
manipulación e identificación.
Entre los cambios de nucleótidos en el genoma o
antigenoma de un mutante por supresión o knock out en C, D y/o V se
incluyen la modificación de un gen viral adicional mediante la
supresión parcial o completa del gen o la reducción o eliminación
(knock out) de su expresión. Entre los genes diana para su mutación
en este contexto se incluyen la proteína N de la nucleocápside, la
fosfoproteína P, la subunidad grande L de la polimerasa, la
proteína de matriz M, la proteína HN
hemaglutinina-neuraminidasa, la proteína de fusión
F. Hasta el punto en el que el virus recombinante permanece viable
e infeccioso, cada una de estas proteínas se puede suprimir,
sustituir o reordenar selectivamente, en su totalidad o en parte,
sola o en combinación con otras modificaciones deseadas, para
conseguir mutantes por supresión o knock out en C, D y/o V nuevos.
Por ejemplo, uno o más de estos genes, se pueden suprimir en su
totalidad o en parte o su expresión se puede reducir o eliminar (por
ejemplo, mediante la introducción de un codón de terminación,
mediante una mutación en un sitio de edición del ARN, mediante una
mutación que modifica el aminoácido determinado por un codón de
iniciación, o mediante una mutación con desplazamiento del marco de
lectura) para alterar el fenotipo del clon recombinante resultante,
para mejorar las características de crecimiento, atenuación,
inmunogenicidad u otras características fenotípicas deseadas.
Entre las modificaciones de nucleótidos
alternativas en mutantes por supresión o knock out en C, D y/o V,
se incluyen una supresión, inserción, adición o reordenamiento de
una secuencia reguladora que actúa en cis para un gen seleccionado
en el genoma o antigenoma recombinante. En un ejemplo, una secuencia
reguladora que actúa en cis de un gen de PIV se cambia para que se
corresponda con una secuencia reguladora heteróloga, que puede ser
una secuencia reguladora que actúa en cis homóloga del mismo gen en
un PIV diferente, o una secuencia reguladora que actúa en cis de un
gen de PIV diferente. Por ejemplo, una señal de finalización de un
gen se puede modificar mediante la conversión o sustitución a una
señal de finalización de un gen diferente en la misma cepa de PIV.
La modificación de nucleótidos puede contener una inserción,
supresión, sustitución o disposición de un sitio de inicio de
traducción en el genoma o antigenoma recombinante, por ejemplo, para
eliminar un sitio de inicio de traducción alternativo para una
forma seleccionada de una proteína.
Además, se puede obtener una variedad de otras
alteraciones genéticas en un genoma o antigenoma de PIV que tiene
una supresión o knock out en C, D y/o V, sola o junto con una o más
mutaciones atenuantes adoptadas a partir de un mutante de PIV de
origen biológico. Por ejemplo, se pueden insertar genes o segmentos
de genoma completos o parciales, de fuentes diferentes a PIV. De
forma alternativa, se puede cambiar el orden de los genes o se
puede sustituir un promotor del genoma de PIV con su antigenoma
homólogo. Se pueden hacer modificaciones diferentes o adicionales
en el genoma o antigenoma recombinante para facilitar
manipulaciones, tales como la inserción de sitios de restricción
únicos en varias regiones intergénicas o en otros lugares. Se pueden
eliminar secuencias génicas no traducidas para incrementar la
capacidad de inserción de secuencias foráneas.
Todavía en aspectos adicionales, se pueden
modificar moléculas o vectores de polinucleótidos que codifican el
genoma o antigenoma de PIV recombinante para codificar secuencias
que no son de PIV, por ejemplo, una citoquina, un epítopo T
colaborador, un creador de sitios de restricción, o una proteína de
un patógeno microbial (por ejemplo, un virus, una bacteria o un
hongo) capaz de provocar una respuesta inmune protectora en un
huésped deseado. Los mutantes por supresión o knock out en C, D y/o
V se construyen de modo que contengan un gen o segmento de genoma
de un virus sincitial respiratorio (RSV), por ejemplo, un gen que
codifica una proteína antigénica (por ejemplo, una proteína F o G),
un dominio inmunogénico o un epítopo de RSV.
En la presente invención también se describen
composiciones (por ejemplo, polinucleótidos aislados y vectores que
contienen un ADNc que codifica PIV) y métodos para la producción de
un PIV recombinante infeccioso aislado que contiene una o más
mutaciones por supresión o knock out en C, D y/o V. Entre estos
ejemplos se incluyen moléculas y vectores de polinucleótidos nuevas
aisladas que contienen tales moléculas, que comprenden un genoma o
antigenoma de PIV que se modifica mediante una supresión parcial o
completa de uno o más ORFs C, D y/o V, o uno o más cambios de
nucleótidos que reducen o eliminan la expresión de los mismos. En la
presente invención también se describe el mismo vector de expresión
u otro diferente, que comprende una o más moléculas de
polinucleótido aisladas que codifican proteínas N, P y L. Estas
proteínas también se pueden expresar directamente a partir del
genoma o antigenoma de ADNc. El vector o los vectores se pueden
expresar o coexpresar en una célula o un lisado libre de células,
obteniendo de este modo una partícula de PIV o partícula subviral
infecciosa, mutante por supresión o knock out en C, D y/o V.
Los métodos y composiciones anteriores para la
producción de un mutantes de PIV por supresión o knock out en C, D
y/o V obtienen partículas infecciosas virales o subvirales o
derivados de las mismas. Un virus infeccioso es comparable a la
partícula de virus PIV auténtico y es infeccioso de la misma forma.
Puede infectar directamente células frescas. Una partícula subviral
infecciosa habitualmente es un subcomponente de la partícula viral,
la cual puede iniciar una infección bajo las condiciones adecuadas.
Por ejemplo, una nucleocápside que contiene el ARN genómico o
antigenómico y las proteínas N, P y L es un ejemplo de una partícula
subviral que puede iniciar una infección si se introduce en el
citoplasma de las células. Entre las partículas subvirales se
incluyen partículas virales que carecen de una o más proteínas, uno
o más segmentos de proteína, u otro componente o componentes
virales.
virales.
En la presente invención también se describe una
célula o un lisado libre de células que contiene un vector de
expresión que comprende una molécula de polinucleótido aislada que
comprende un genoma o antigenoma de PIV mutante por supresión o
knock out en C, D y/o V, tal como se ha descrito anteriormente, y un
vector de expresión (el mismo vector o uno diferente) que comprende
una o más moléculas de polinucleótido aisladas que codifican las
proteínas N, P y L de PIV. Una o más de estas proteínas también
pueden ser del ADNc del genoma o antigenoma. Tras la expresión, el
genoma o antigenoma y N, P y L se combinan para producir un virus
PIV infeccioso o partícula subviral infecciosa.
En la presente invención también se describe una
célula o sistema de expresión sin células (por ejemplo un lisado
libre de células) que incorpora un vector de expresión que comprende
una molécula de polinucleótido aislada que codifica un genoma o
antigenoma de PIV que contiene una o más mutaciones por supresión o
knock out en C, D y/o V, y un vector de expresión que comprende una
o más moléculas de polinucleótido aisladas que codifican las
proteínas N, P y L de un PIV. Tras la expresión, el genoma o
antigenoma y las proteínas N, P y L se combinan para producir una
partícula de PIV infecciosa, tal como una partícula viral o
subviral.
Los PIVs recombinantes son útiles en varias
composiciones para generar una respuesta inmune deseada contra PIV
en un huésped susceptible a infección por PIV. Los mutantes por
supresión o knock out en C, D y/o V atenuados son capaces de
provocar una respuesta inmune protectora en un huésped mamífero
infectado, y todavía están suficientemente atenuados como para no
provocar síntomas inaceptables de enfermedades respiratorias graves
en el huésped inmunizado. El virus atenuado o partícula subviral
atenuada pueden estar presentes en el sobrenadante de un cultivo
celular, aislado del cultivo, o purificado parcial o completamente.
El virus también se puede liofilizar, y se puede combinar con una
variedad de otros componentes para el almacenamiento o liberación en
un huésped, según se desee.
En la presente invención también se describen
vacunas que comprenden un transportador y/o adyuvante
fisiológicamente aceptables y una partícula de PIV o partícula
subviral aislada, mutante por supresión o knock out en C, D y/o
V.
La vacuna está compuesta por un PIV mutante por
supresión o knock out en C, D y/o V que comprende, como mínimo, una
y, preferentemente, dos o más mutaciones adicionales u otras
modificaciones de nucleótidos, tal como se ha descrito
anteriormente, para conseguir un equilibrio adecuado entre
atenuación e inmunogenicidad. La vacuna se puede formular en una
dosis de 10^{3} a 10^{7} PFU de virus atenuado. La vacuna puede
comprender un virus atenuado por supresión o knock out en C, D y/o
V que provoca una respuesta inmune contra una única cepa de PIV o
contra múltiples cepas de PIV. En este sentido, el PIV mutante por
supresión o knock out en C, D y/o V se puede combinar en
formulaciones de vacuna con otras cepas de vacuna de PIV, o con
otros virus de vacuna viral, tal como un RSV.
En la presente invención también se describe un
método para la estimulación del sistema inmune de un individuo,
para provocar una respuesta inmune contra PIV en un sujeto mamífero.
El método comprende la administración de una formulación de una
cantidad inmunogénicamente suficiente de un PIV atenuado, mutante
por supresión o knock out en C, D y/o V en un transportador y/o
adyuvante fisiológicamente aceptables. La composición inmunogénica
es una vacuna compuesta de un PIV mutante por supresión o knock out
en C, D y/o V que contiene, como mínimo, una y, preferentemente,
dos o más mutaciones atenuantes u otras modificaciones de
nucleótidos que determinan un fenotipo deseado, tal como se ha
descrito anteriormente. La vacuna se puede formular en una dosis de
10^{3} a 10^{7} PFU de virus atenuado. La vacuna puede contener
un virus PIV atenuado, mutante por supresión o knock out en C, D
y/o V que provoque una respuesta inmune contra un único PIV, contra
múltiples PIVs, por ejemplo, HPIV1 y HPIV3, o contra uno o más PIVs
y contra un patógeno diferente a PIV, tal como RSV. En este
contexto, el PIV mutante por supresión y knock out en C, D y/o V
puede provocar una respuesta inmune monoespecífica o una respuesta
inmune poliespecífica contra múltiples PIVs, o contra uno o más PIVs
y contra un patógeno diferente a PIV, tal como RSV. De forma
alternativa, el PIV mutante por supresión y knock out en C, D y/o V
que presenta características inmunogénicas diferentes se puede
combinar en una mezcla de vacuna o administrar separadamente en un
protocolo de tratamiento coordinado para provocar protección más
efectiva contra un PIV, contra múltiples PIVs, o contra uno o más
PIV(s) y contra un patógeno diferente a PIV, tal como
RSV.
La composición inmunogénica se puede administrar
al tracto respiratorio superior, por ejemplo, mediante
pulverización, un aerosol o en forma de gotas.
La presente invención se describirá a
continuación con referencia a los dibujos que se adjuntan. Debe
destacarse que el alcance de protección conseguido es tal como se
define en las reivindicaciones.
La figura 1 describe la organización de los ORFs
P/C/D/V de HPIV3 (no a escala). Se muestran los tres marcos de
lectura del ARNm P (+1, +2 y +3) con los ORFs P, C y V representados
por rectángulos. Se indican las longitudes de los aminoácidos. La
posición del sitio de edición del ARN se muestra como una línea
vertical y su secuencia motivo se muestra y se numera según su
posición de nucleótidos en la secuencia antigenómica de HPIV3
completa. El Panel A detalla la organización del ARNm P no editado.
La secuencia que contiene los sitios de inicio de traducción de los
ORFs P y C se muestra y se numera según la secuencia antigenómica
completa. Las posiciones de nucleótidos de los ORFs P, C, D y V en
la secuencia antigenómica completa del clon de tipo salvaje JS son:
P, 1784-3595; C, 1794-2393; D,
2442-2903; V, 2792-3066. En relación
al ARNm P, el AUG que abre el ORF P se encuentra en las posiciones
80-82. El Panel B detalla la organización de una
versión editada del ARNm P que contiene una inserción de dos
residuos G no codificados (GG) en el sitio de edición. Esto cambia
el registro de lectura, de tal forma que el extremo de más arriba
del ORF P en el marco +2 se fusiona al ORF D en el marco +3. La
proteína quimérica resultante contiene los 241 aminoácidos del
extremo N-terminal codificados por el ORF P
fusionado a los 131 aminoácidos del extremo
C-terminal codificados por el ORF D. El Panel C
muestra las posiciones de las mutaciones de ejemplo, que
interrumpen los ORFs C, D y V, mostrados en la versión editada del
ARNm P del Panel B. Los codones de terminación introducidos se
indican mediante líneas verticales dentro de los rectángulos. El
ORF C se modificó para cambiar el codón 1 de M a T, y los codones 7
y 26 para crear codones de terminación. El ORF D se modificó par
introducir codones de terminación en los codones 304, 305 y 306,
numerados según la proteína D quimérica de 372 aminoácidos que
contiene los 241 aminoácidos del extremo N-terminal
de P fusionados a los 131 aminoácidos del extremo
C-terminal de D. El ORF V se modificó para
introducir codones de terminación en los codones 17 y 20. Estas dos
últimas mutaciones dieron como resultado sustituciones de
aminoácidos en los codones 354 y 357 del ORF D (asteriscos).
La figura 2 da a conocer un ensayo de
radioinmunoprecipitación que muestra que la expresión de la proteína
C ha sido abrogada en el virus rC-KO. Los
lisados celulares marcados con ^{35}S de la línea (a) se
inmunoprecipitaron con un antisuero de conejo específico de C
policlonal. Una banda de 22 kD correspondiente a la proteína C
(flecha abierta) se encuentra presente de forma clara en rJS
pero ausente en la línea (a) de rC-KO. Los
lisados celulares de la línea (b) se inmunoprecipitaron mediante
una mezcla de dos anticuerpos monoclonales específicos de la
proteína HN de HPIV3. La banda de 64 kD correspondiente a la
proteína HN (flecha cerrada) se encuentra presente en ambos lisados
de virus, confirmando que se trata de HPIV3 y expresan niveles
similares de proteínas.
La figura 3 muestra los resultados de una
replicación multicíclica de mutantes knock out
rC-KO y rDV-KO de
ejemplo, comparados con los virus parentales rJS. Las
valoraciones de virus se muestran como TCID_{50}/ml y son la
media de muestras duplicadas.
La presente invención da a conocer un PIV
recombinante (rPIV) en el cual la expresión de uno o más de
los ORFs C, D y/o V se reduce o elimina para obtener una colección
de candidatos a vacuna de PIV nuevos. La expresión de los ORFs C, D
y/o V se puede reducir o eliminar mediante la modificación de un
genoma o antigenoma de PIV recombinante para incorporar una
mutación que cambia la asignación de codificación del codón de
iniciación del ORF C o de uno o más codones de terminación en el
ORF C, D y/o V. Entre otras modificaciones para conseguir la
interrupción de la expresión de C, D y/o V o la expresión o función
de una o más proteínas correspondientes para generar candidatos a
vacuna de PIV atenuados se incluyen la supresión parcial o completa
de la secuencia o secuencias codificadoras de C, D y/o V, en total
o en parte, para proporcionar la proteína o las proteínas C, D y/o
V parciales o completamente no funcionales o finalizar su
expresión.
El HPIV3 es un miembro del recientemente
nombrado género Respirovirus de la familia de los
Paramyxoviridae en el orden de los Mononegavirales.
Su genoma es una cadena simple de ARN de sentido negativo de 15462
nucleótidos (nt) de longitud (Galinski y otros, Virology
165:499-510, (1988); Stokes y otros, Virus
Res. 25:91-103 (1992)). El PIV3 codifica, como
mínimo, ocho proteínas: la proteína N de la nucleocápside, la
fosfoproteína P, la proteína C no estructural, la proteína D, la
proteína M de la matriz, la glicoproteína F de fusión, la proteína
HN hemaglutinina-neuraminidasa, y la proteína
grande L de la polimerasa (Collins y otros, págs.
1205-1243. En B. N. Fields (Knipe y otros,
editores), Fields Virology, 3ª ed., vol.1.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia,
1996).
Las proteínas M, HN y F están asociadas a la
envoltura, y las dos últimas son glicoproteínas de superficie que,
tal como en el caso de cada PIV, son los antígenos principales de
neutralización y protección (Collins y otros, 3ª ed. En
"Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M.
Howley, R. M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman y
S.E. Straus, Editores), Vol. 1, págs. 1205-1243.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
Se piensa que la significativa divergencia en la secuencia entre
proteínas HN o F de PIV comparables entre los PIVs es la base de la
especificidad de tipo de la inmunidad protectora (Collins y otros,
3ª ed. En "Fields Virology" (B. N. Fields, D. M. Knipe,
P. M. Howley, R.M. Chanock, J. L. Melnick, T. P. Monath, B. Roizman
y S. E. Straus, Editores), Vol. 1, págs. 1205-1243.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996;
Cook y otros, Amer Jour Hyg 77:150-159, 1963;
Ray y otros, J Infect Dis 162: 746-9,
1990).
Cada uno de los genes de HPIV3 se transcriben
como un ARNm único que codifica una proteína única, con la excepción
del ARNm P, que contiene cuatro ORFs, en concreto, P, C, D y V
(figura 1) (Galinski y otros, Virology
186:543-550, 1992; Spriggs y otros, J. Gen
Virol. 67:2705-2719, 1986). Las proteínas P y C
se traducen a partir de ORFs separados, que se solapan en el ARNm
(figura 1). Aunque todos los paramixovirus codifican una proteína P,
solamente los miembros del género Respirovirus y
Morbillivirus codifican una proteína C. Los virus
individuales varían en el número de proteínas expresadas a partir
de un ORF C y en su importancia en la replicación del virus in
vitro e in vivo. El virus Sendai (SeV) expresa cuatro
proteínas iniciadas independientemente a partir del ORF C: C', C,
Y1 e Y2, cuyos sitios de inicio de traducción aparecen en ese orden
en el ARNm (Curran, y otros, Enzyme
44:244-9, 1990; Lamb y otros, págs.
181-214. En D. Kingsbury (editores), Los
Paramixovirus ("The Paramyxoviruses"). Plenum Press, New York,
1991), mientras que el HPIV3 y el virus del sarampión (MV)
solamente expresan una única proteína C (Bellini y otros, J
Virol. 53:908-19, 1985; Sanchez y otros,
Virology 147:177-86, 1985; Spriggs y otros,
J Gen Virol. 67:2705-2719, 1986).
Un SeV recombinante viable en el cual las cuatro
proteínas obtenidas de C se eliminaron, se replicó ineficazmente
in vitro (Kurotani y otros, Genes Cells.
3:111-124, 1998), aunque la eliminación de proteínas
C individuales tuvo efectos complejos (Cadd y otros, J
Virol. 70:5067-74, 1996; Curran, y otros,
Virology 189:647-56, 1992; Latorre y otros,
J Virol. 72: 5984-93, 1998). Un SeV
recombinante que contenía una mutación puntual única que dio como
resultado la sustitución de una fenilalanina (F) a una serina (S) en
la posición de aminoácido 170 de la proteína C se atenuó en
ratones, pero su replicación en un cultivo celular no se redujo
(Garcin y otros, Virology 238:424-431, 1997;
Itoh y otros, J Gen Virol. 78:3207-15, 1997).
En marcado contraste con el SeV, un virus del sarampión (MV) sin C
se replicó eficientemente en células Vero (Radecke y otros,
Virology 217:418-21, 1996), aunque mostró
restricción en la replicación en células sanguíneas periféricas
humanas y apareció algo atenuado in vivo (Escoffier y otros,
J Virol. 73:1695-8, 1999; Valsamakis y otros,
J Virol. 72:7754-61, 1998).
Además de los ORF P y C, el ARNm P de PIV3 tiene
otros dos ORF, en concreto, D y V. La proteína D de PIV3, una
proteína de fusión de los ORFs P y D, se expresa a partir del gen P
mediante el proceso de edición transcripcional, o edición del ARN,
en el cual dos residuos de G no codificados se añaden al ARNm P en
el sitio de edición del ARN (figura 1) (Galinski y otros,
Virology 186: 543-550, 1992; Pelet y otros,
Embo J. 10:443-8, 1991). El BPIV3 es el
único de los otros paramixovirus que expresa una proteína D y lo
hace mediante el mismo mecanismo.
Casi todos los miembros del género
Respirovirus, Rubulavirus, y Morbillivirus expresan
una proteína V. El único miembro que claramente no lo hace es el
HPIV1, que carece de un ORF V de impacto (Matsuoka y otros, J
Virol. 65:3406-10, 1991).
El ORF V se caracteriza por la presencia de un
dominio rico en cisteína que está altamente conservado (Cattaneo y
otros, Cell 56:759-64, 1989; Park y otros,
J Virol 66:7033-9, 1992; Thomas y otros,
Cell 54:891-902, 1988; Vidal y otros, J
Virol 64:239-46, 1990). El ORF V se mantiene en
cada uno de los HPIV3 secuenciados hasta la fecha, lo cual sugiere
que este ORF se expresa y retiene la función para este virus
(Galinski y otros, Virology 155:46-60, 1986;
Spriggs y otros, J Gen Virol 67:2705-2719,
1986; Stokes y otros, Virus Res 25:91-103,
1992).
La proteína V de BPIV3 se expresa cuando un
residuo G no secuenciado se añade al sitio de edición del ARN
(Pelet y otros, Embo J 10:443-8, 1991). Sin
embargo, en el caso de HPIV3, de dos a cuatro codones de terminación
de la traducción están situados entre el sitio de edición y el ORF
V, y no está claro si el HPIV3 representa otro ejemplo en el cual
este ORF no se expresa, o si se expresa mediante algún otro
mecanismo. Una posibilidad es que la edición de HPIV3 también tenga
lugar en un segundo sitio, más abajo, en el gen P, aunque esto no
pareció ocurrir en un cultivo celular (Galinski y otros,
Virology 186:543-550, 1992).
De forma alternativa, podría ser que los
ribosomas ganaran acceso al ORF V mediante un desplazamiento del
marco de lectura ribosómico. Esto sería comparable a la situación
del locus P de MV. MV expresa proteínas C, P, y V, pero también
expresa una proteína R nueva que se sintetiza por un desplazamiento
del marco de lectura, del ORF P al ORF V (Liston y otros, J
Virol. 69:6742-50, 1995).
Aunque los medios mediante los cuales HPIV3
expresa su proteína V no son claros, la conservación extrema de su
ORF V en cepas diferentes sugiere que, en realidad, se expresa. La
función de la proteína V no está bien definida, pero se han
recuperado recombinantes MV y SeV sin V que replican eficientemente
in vitro pero que muestran replicación reducida in
vivo (Delenda, y otros, Virology
228:55-62, 1997; Delenda y otros, Virology
242:327-37, 1998; Kato y otros, Embo J.
16:578-587, 1997; Kato y otros, J Virol.
71:7266-7272, 1997; Valsamakis y otros, J
Virol. 72:7754-61, 1998).
El genoma viral de PIV también contiene regiones
de líder y trailer extragénicas, que poseen los promotores
requeridos para la replicación y transcripción viral. De este modo,
el mapa genético de PIV se representa como líder
3'-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-trailer
5'. La transcripción se inicia en el extremo 3' y avanza mediante
un mecanismo de parada-inicio secuencial que está
guiado por motivos conservados cortos que se encuentran en los
límites del gen. El extremo de más arriba de cada gen contiene una
señal de inicio de gen (GS), que dirige la iniciación de su ARNm
correspondiente. El extremo terminal de más abajo de cada gen
contiene un motivo de fin de gen (GE) que dirige la poliadenilación
y terminación. Se han descrito secuencias de ejemplo para las cepas
de PIV3 humanas JS (acceso al GenBank número Z11575) y Washington
(Galinski M. S. En Kingsbury, D. W. (Editores), Los Paramixovirus
("The Paramyxoviruses"), págs. 537-568, Plenum
Press, New York, 1991), y para la cepa de PIV3 bovino 910N (GenBank
número acceso D80487).
Tal como se utiliza en la presente invención,
"gen de PIV" se refiere generalmente a una parte del genoma de
PIV que codifica un ARNm y habitualmente empieza en el extremo de
más arriba con una señal de inicio de gen (GS) y acaba en el
extremo de más abajo con la señal de fin de gen (GE). El término gen
de PIV también es intercambiable con el término "marco de lectura
abierto de traducción", u ORF. Además de los genes, el genoma
viral de PIV también contiene secuencias no codificadoras,
intergénicas, y regiones líder y trailer extragénicas que contienen
promotores requeridos para la replicación y trancripción viral. De
este modo, el mapa genético de PIV se representa parcialmente como
líder
3'-N-P/C/D/V-M-F-HN-L-trailer
5'. La transcripción se inicia en el extremo 3' y avanza mediante
un mecanismo de parada-inicio secuencial que está
guiado por motivos conservados cortos que se encuentran en los
límites del gen. Para construir los mutantes por supresión en C, D
y/o V de la presente invención, se deben eliminar uno o más genes de
PIV en su totalidad o en parte. Esto significa que se pueden hacer
supresiones parciales o completas en marcos de lectura abiertos y/o
en secuencias reguladoras que actúan en cis de cualesquiera uno o
más de los genes de PIV. Con "segmento de genoma" se indica
cualquier longitud de nucleótidos continuos del genoma de PIV, que
pueden ser parte de un ORF, un gen, o una región extragénica, o una
combinación de los mismos.
Los medios alternativos de construcción de
mutantes en C, D, y/o V de la presente invención implican la
construcción de virus "knock out" para reducir o eliminar la
expresión de genes sin la supresión de partes importantes del
genoma de PIV. En particular, la expresión de uno o más ORFs C, D
y/o V se reduce o elimina, preferentemente, mediante la
modificación del genoma o antigenoma de PIV recombinante mediante la
introducción de un codón de terminación, mediante una mutación en
un sitio de edición del ARN, mediante una mutación que modifica el
aminoácido determinado por un codón de iniciación, o mediante una
mutación con desplazamiento de marco de lectura en el ORF o los
ORFs diana. Una mutación se puede realizar en el sitio de edición
que evita la edición y elimina la expresión de proteínas cuyo ARNm
se genera mediante la edición del ARN (Kato y otros, EMBO
16:578-587, 1997 y Scrineider y otros,
Virology 227:314-322, 1997).
El genoma o antigenoma de PIV se puede someter a
mutagénesis para generar uno o más codones de terminación en el ORF
o los ORFs C, D y/o V. En un ejemplo, un codón de iniciación de
metionina se cambia a treonina en el ORF C. En otro ejemplo, se
introducen dos codones de terminación mediante mutaciones en la
posición de nucleótido (nt) 1795 (se cambia de T a C) y en la nt
1813 (se cambia de C a A) en el genoma o antigenoma que introduce
codones de terminacion que corresponden a las posiciones 7 y 26 del
ORF C. Esto genera un virus mutante knock out en C denominado
rC-KO. En otros tres virus mutantes, los ORF
D y V se interrumpieron por separado y en combinación. En el
mutante knock out en D, solo, denominado
rD-KO, las mutaciones se introdujeron para
interrumpir la expresión del ORF D, lo cual introdujo cambios de C a
A en las posiciones nt 2692, 2695 y 2698 del antigenoma de longitud
completa. Estas mutaciones puntuales crearon tres codones de
terminacion consecutivos en el supuesto ORF D, lo cual dio como
resultado la finalización prematura de la proteína D después del
codón 303 en una proteína D quimérica de 372 aminoácidos. En otros
ejemplos, se construyó un mutante knock out en V solo,
rV-KO, mediante la introducción de dos
mutaciones puntuales en las posiciones nt 2845 (de A a T) y 2854 (de
C a T) del antigenoma de longitud completa. Estas mutaciones crearon
codones de terminación prematuramente (posiciones de aa 17 y 20) en
el supuesto ORF V. Los cambios en rD-KO y
rV-KO se introdujeron colectivamente en un
clon único para crear un mutante knock out DV combinatorio,
rDV-KO.
Tal como se ha destacado anteriormente, el PIV
recombinante de la presente invención, que contiene una o más
mutaciones en el ORF o los ORFs C, D y/o V, posee características
fenotípicas altamente deseables para el desarrollo de vacunas. Las
modificaciones descritas en la presente invención que eliminan el
ORF o los ORFs C, D y/o V, en su totalidad o en parte, o reducen o
eliminan la expresión del ORF o los ORFs C, D y/o V, determinan una
variedad de cambios fenotípicos deseados en el virus o partícula
subviral resultante. Los mutantes por supresión y knock out en C, D
y/o V muestran crecimiento viral atenuado comparado con el
crecimiento de una cepa RSV parental, de tipo salvaje o mutante. El
crecimiento, por ejemplo, en cultivos celulares, se puede reducir
aproximadamente dos veces, de forma más frecuente, 5 veces
aproximadamente, y preferentemente 10 veces aproximadamente, o más,
en su totalidad (por ejemplo, tal como se mide después de un período
de 7 días en un cultivo) comparado con el crecimiento de la
correspondiente cepa RSV parental, de tipo salvaje o mutante. En
aspectos más detallados, el RSV recombinante de la presente
invención mostró una cinética de crecimiento viral alterada.
Los virus de vacuna recombinantes que contenían
una o más mutaciónes por supresión y knock out en el ORF o los ORFs
C, D y/o V también pueden mostrar fenotipos de atenuación in
vivo. Por ejemplo, se puede reducir la replicación en el tracto
respiratorio superior y/o inferior en un modelo de animal aceptado
para la replicación de PIV en humanos, por ejemplo, hámsteres y
monos verdes africanos (AGMs), aproximadamente dos veces, más
frecuentemente, 5 veces aproximadamente, 10 veces o 20 veces y,
preferentemente, de 100 veces a 1.000 veces, aproximadamente, o
más, en su totalidad (por ejemplo, tal como se mide en un día o en
cada uno de 3 a 8 días consecutivos, siguientes a la infección)
comparado con el crecimiento de la correspondiente cepa de PIV
parental, de tipo salvaje o mutante. Además de los fenotipos de
atenuación destacados anteriormente, o conjuntamente con ellos, la
mutación o las mutaciones por supresión y knock out en ORF C, D y/o
V también pueden mostrar un cambio en el tamaño de placa viral; un
cambio en efecto citopático y/o un cambio en inmunogenicidad.
Una característica particular de los virus de
vacuna recombinantes de la presente invención es que, aunque están
atenuados, tal como se ha destacado anteriormente, son, sin embargo,
infecciosos y provocan un nivel deseado de reacción inmune
anti-PIV en el huésped vacunado. En particular, los
recombinantes candidatos a vacuna de la presente invención son
suficientemente inmunogénicos como para provocar una respuesta
inmune protectora contra el ataque posterior por un virus wt. Tal
como se explica con los ejemplos de la presente invención, la
infección previa con virus mutantes knock out en C, D y/o V indujo
una respuesta sustancial a los anticuerpos HAI contra HPIV3, tanto
en hámsteres como en AGMs, indicando que estos recombinantes de
ejemplo son protectores y, por lo tanto, representan candidatos a
vacuna prometedores. En los recombinantes de vacuna, la actividad
inmunogénica se equilibrará frente al nivel de atenuación para
conseguir candidatos a vacuna útiles, y se marcará, habitualmente,
por una reducción de la replicación de los virus de ataque, por
ejemplo rJS de HPIV3, en el tracto respiratorio inferior y/o
superior de huéspedes modelo (por ejemplo, hámsteres y primates no
humanos) de aproximadamente 50-100 veces,
100-500 veces, preferentemente
500-2.000 veces, aproximadamente, y hasta 3.000
veces o más en su totalidad (por ejemplo, tal como se mide entre
3-8 días tras el ataque). De este modo, los virus
de vacuna recombinantes de la presente invención mantienen la
inmunogenicidad mientras que muestran reducciones concomitantes en
replicación y crecimiento. Este ensamblaje sorprendente de rasgos
fenotípicos es altamente deseado para el desarrollo de vacunas.
La presente invención asegura el desarrollo de
candidatos a vacuna viva atenuada de RSV que incorporan mutaciones
por supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V. Estos virus
recombinantes se construyen mediante un intermediario de ADNc y un
sistema de recuperación basado en ADNc. Los virus recombinantes que
se han obtenido a partir de ADNc replican independientemente y se
propagan de la misma manera que lo harían si fuesen de origen
biológico. Los mutantes por supresión y knock out en uno o más ORFs
C, D y/o V se modifican también para incorporar mutaciones de
atenuación específicas, así como una variedad de otras mutaciones y
modificaciones de nucleótidos, para obtener los comportamientos
fenotípicos o estructurales deseados. Las descripciones detalladas
de los materiales y métodos para la producción de PIVs
recombinantes a partir de ADNc, y para realizar y examinar la
variedad amplia de mutaciones y modificaciones de nucleótidos
expuestas en la presente invención, se dan a conocer en, por
ejemplo, Durbin y otros, Virology
235:323-332, 1997; la Solicitud de Patente U.S.A.
con No. de Serie 09/083,793, presentada el 22 de mayo de 1998; la
Solicitud Provisional de Patente U.S.A. No. 60/047,575, presentada
el 23 de mayo de 1997 (que corresponde a la Publicación
Internacional de Patente No. WO 98/53078), y la Solicitud
Provisional de Patente de U.S.A No. 60/059,385, presentada el 19 de
septiembre de 1997.
En particular, estos documentos describen
métodos y procedimientos para mutagenizar, aislar y caracterizar
PIVs para obtener cepas mutantes atenuadas (por ejemplo, cepas
mutantes sensibles a la temperatura (ts), pasadas por frío (cp),
adaptadas a frío (ca), de placa pequeña (sp) y restringidas en la
variedad de huésped (hr)) y para la identificación de los cambios
genéticos que determinan el fenotipo atenuado. En conjunto con estos
métodos, los documentos anteriores detallan procedimientos para la
determinación de la replicación, inmunogenicidad, estabilidad
genética y eficacia protectora de PIV humanos atenuados de origen
biológico y producidos por recombinación en sistemas modelo
aceptados, que incluyen los sistemas de modelo murino y primate no
humano. Además, estos documentos describen métodos generales para
el desarrollo y examen de composiciones inmunogénicas, entre las
que se incluyen las vacunas monovalentes y bivalentes, para la
profilaxis y tratamiento de la infección por PIV. En los documentos
anteriores también se describen métodos para la producción de PIV
recombinante infeccioso mediante la construcción y expresión de
ADNc que codifica un genoma o antigenoma de PIV con proteínas de PIV
esenciales, los cuales incluyen la descripción de los siguientes
plásmidos de ejemplo, que se pueden utilizar para producir clones
virales de PIV infecciosos p3/7(131)(ATCC 97990);
p3/7(131)2G(ATCC 97889); y
p218(131)(ATCC97991); depositado cada uno bajo los términos
del Tratado de Budapest con la Colección Americana de Cultivos Tipo
(ATCC) de 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, U.S.A, y con los anteriores números de
acceso identificados otorgados.
En las referencias anteriores también se
describen métodos para la construcción y evaluación de PIV
recombinantes infecciosos que se modifican para incorporar
mutaciones específicas de fenotipo identificadas en mutantes de PIV
de origen biológico, por ejemplo, mutantes pasados por frío (cp),
adaptados a frío (ca), restringidos en la variedad de huésped (hr),
de placa pequeña (sp), y/o sensibles a la temperatura (ts), por
ejemplo, la cepa mutante JS HPIV3 cp45. Las mutaciones
identificadas en estos mutantes se pueden adoptar rápidamente en
PIV recombinantes que contienen una o más mutaciónes knock out en C,
D y/o V. En un ejemplo, una o más mutaciones atenuantes tienen
lugar en la proteína L de la polimerasa, por ejemplo, en la posición
correspondiente a Tyr942, Leu992 o Thr1558 de JS cp45. Estas
mutaciones se pueden incorporar en el PIV recombinante de la
presente invención mediante una sustitución de aminoácido idéntica
o conservadora, tal como la identificada en el mutante biológico.
De este modo, los recombinantes de PIV pueden contener una mutación
en la que Tyr_{942} se sustituye por His, Leu_{992} se
sustituye por Phe, y/o Thr_{1558} se sustituye por Ile. Las
sustituciones que son conservadoras respecto a estos aminoácidos de
sustitución también son útiles para conseguir un fenotipo deseado
del mutante.
Entre otras mutaciones de ejemplo adoptadas a
partir de un mutante de PIV de origen biológico, se incluyen una o
más mutaciones en la proteína N, que incluyen mutaciones específicas
en una posición que corresponde a los residuos Val_{96} o
Ser_{389} de JS cp45. En aspectos más detallados, estas
mutaciones se representan como sustituciones de Val_{96} a Ala o
de Ser_{389} a Ala o sustituciones que son conservadoras de éstas.
También son útiles con los PIV recombinantes de la presente
invención las sustituciones de aminoácidos en la proteína C, por
ejemplo, una mutación en una posición correspondiente a Ile_{96}
de JS cp45, representada preferentemente por una sustitución
idéntica o conservadora de Ile_{96} a Thr. Entre otras mutaciones
de ejemplo adoptadas de mutantes de PIV de origen biológico se
incluyen una o más mutaciones en la proteína F, que incluyen
mutaciones adoptadas de JS cp45 en la posición
correspondiente a los residuos Ile_{420} o Ala_{450} de JS
cp45, representadas preferentemente por sustituciones de
ácido de Ile_{420} a Val o de Ala_{450} a THr o sustituciones
conservadoras de las mismas. Otros recombinantes de PIV adoptan una
o más sustituciones de aminoácidos en la proteína HN, tal como se
muestra como ejemplo a continuación, mediante un PIV recombinante
que adopta una mutación en la posición correspondiente al residuo
Val_{384} de JS cp45, representada preferentemente por la
sustitución de Val_{384} a Ala.
Todavía entre otros ejemplos adicionales, se
incluyen PIV recombinantes que contienen una o más mutaciones en
partes no codificadoras del genoma o antigenoma de PIV, por ejemplo,
en una secuencia líder 3'. En este contexto, se pueden diseñar
mutaciones de ejemplo en una posición en el líder 3' de un virus
recombinante en una posición correspondiente a los nucleótidos 23,
24, 28 ó 45 de JS cp45. Todavía se pueden diseñar otras
mutaciones de ejemplo en la secuencia de inicio de gen N, por
ejemplo, mediante el cambio de uno o más nucleótidos en la
secuencia de inicio de gen N, por ejemplo, en una posición
correspondiente al nucleótido 62 de JS cp45. En aspectos más
detallados, los mutantes knock out en C, D y/o V contienen un cambio
de T a C en el nucleótido 23, un cambio de C a T en el nucleótido
24, un cambio de G a T en el nucleótido 28, y/o un cambio de T a A
en el nucleótido 45. El cambio de una A a T en la secuencia de
inicio de gen N en la posición correspondiente al nucleótido 62 de
JS, se muestra como ejemplo de mutaciones adicionales en secuencias
extragénicas.
Estas mutaciones de ejemplo anteriores, que se
pueden diseñar en un mutante knock out en C, D y/o V, se han
recuperado con éxito en PIV recombinantes, tal como representan los
clones de PIV recombinantes denominados rcp45, rcp45 L, rcp45 F,
rcp45 M, rcp45 HN, rcp45 C, rcp45 F, rcp45 3'N, 3'NL, Y rcp45
3'NCMFHN (Durbin y otros, Virology
235:323-332, 1997; Skiadopoulos y otros, J
Virol 72:1762-8; Solicitud de Patente U.S.A. con
No. de Serie 09/083,793, presentada el 22 de mayo de 1998; la
Solicitud Provisional de Patente U.S.A. No. 60/047,575, presentada
el 23 de mayo de 1997 (correspondiente a la Publicación
Internacional de Patente No. WO 98/53078), y a la Solicitud
Provisional de Patente U.S.A. No. 60/059,385, presentada el 19 de
septiembre de 1997.
A partir de JS cp45 y otros mutantes de PIV de
origen biológico, se proporciona un gran "menú" de mutaciones
atenuantes, cada una de las cuales se pueden combinar con cualquier
otra mutación o mutaciones para ajustar el nivel de atenuación,
inmunogenicidad y estabilidad genética en un PIV recombinante que
contiene una o más mutaciones por supresión o knock out en C, D y/o
V. En este contexto, muchos PIVs recombinantes pueden contener una
o más, y preferentemente dos o más, mutaciones de mutantes de PIV de
origen biológico, por ejemplo, cualquier mutación o combinación de
mutaciones identificadas en JS cp45. Los recombinantes de PIV en el
alcance de la presente invención incorporarán una pluralidad y
hasta un complemento completo de las mutaciones presentes en JS
cp45 u otras cepas de PIV mutantes de origen biológico. Estas
mutaciones se pueden estabilizar frente a la reversión en PIVs
recombinantes que contienen una o más mutaciones por supresión o
knock out en C, D y/o V mediante sustituciones múltiples de
nucleótidos en un codón que determina cada mutación.
Entre otras mutaciones adicionales que se pueden
incorporar en los mutantes de PIV por supresión y knock out en el
ORF o los ORFs C, D y/o V se encuentran mutaciones, por ejemplo
mutaciones atenuantes, identificadas en un PIV heterólogo o en
virus relacionados de forma más lejana de ARN de cadena negativa no
segmentada. En particular, la atenuación y otras mutaciones
deseadas identificadas en un virus de RNA de cadena negativa se
pueden "transferir", por ejemplo, copiar, a una posición
correspondiente dentro del genoma o antigenoma de los mutantes por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V. Brevemente, las
mutaciones deseadas en un virus heterólogo de ARN de cadena
negativa se transfieren al receptor de PIV. Esto implica el mapeo
de la mutación en el virus heterólogo, identificando, de este modo,
mediante alineamiento de secuencia, el sitio correspondiente en el
PIV receptor, y mutando la secuencia nativa en el receptor RSV al
genotipo mutante (mediante una mutación idéntica o bien
conservadora), tal como se describe en la Solicitud de Patente de
U.S.A titulada "Producción de vacunas de virus atenuados de arn
de cadena negativa a partir de secuencias de nucleótidos
clonadas", ("PRODUCTION OF ATTENUATED NEGATIVE STRANDED RNA
VIRUS VACCINES FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCE"), presentada por
Murphy y otros el 13 de abril de 1999 e identificada por el
Expediente del Agente No. 17634-00060. Tal como
muestra esta descripción, es preferente modificar el genoma o
antigenoma del receptor para codificar una modificación en el sitio
objetivo de la mutación que corresponde de forma conservadora a la
modificación identificada en el virus mutante heterólogo. Por
ejemplo, si una sustitución de aminoácido marca un sitio de
mutación en el virus mutante comparado con la secuencia de tipo
salvaje correspondiente, entonces debería diseñarse una sustitución
similar en el residuo o residuos correspondientes en el virus
recombinante. La sustitución puede implicar un aminoácido idéntico
o conservador al residuo sustituto presente en la proteína viral
mutante. Sin embargo, también es posible modificar el residuo de
aminoácido nativo en el sitio de la mutación de forma no
conservadora con respecto al residuo sustituto en la proteína
mutante (por ejemplo, mediante la utilización de cualquier otro
aminoácido para interrumpir o alterar la función del residuo de tipo
salvaje). Entre los virus de RNA de cadena negativa a partir de los
cuales se identifican y transfieren mutaciones de ejemplo a un PIV
recombinante, se incluyen otros PIVs (por ejemplo, HPIV1, HPIV2,
HPIV3, BPIV o MPIV), RSV, virus Sendai (SeV), virus de la
enfermedad de Newcastle (NDV), el virus 5 de simio (SV5), el virus
del sarampión (MeV), el virus de la peste bovina, virus del
moquillo canino (CDV), virus de la rabia (RaV), y el virus de la
estomatitis vesicular (VSV), entre otros. Se describen una variedad
de mutaciones de ejemplo, que incluyen una sustitución de
aminoácido de fenilalanina en la posición 521 de la proteína L de
RSV, que corresponde a una sustitución de fenilalanina (o un
aminoácido relacionado de forma conservadora), y por lo tanto es
transferible a la misma, en la posición 456 de la proteína L de
HPIV3. En el caso de mutaciones marcadas por supresiones o
inserciones, éstas se pueden introducir como las supresiones o
inserciones correspondientes en el virus recombinante, sin embargo,
puede variar el tamaño particular y la secuencia de aminoácidos del
fragmento de proteína suprimido o
insertado.
insertado.
En las referencias anteriores también se
describen una variedad de tipos adicionales de mutaciones y se
pueden diseñar rápidamente en un PIV recombinante de la presente
invención para ajustar el crecimiento, atenuación, inmunogenicidad,
estabilidad genética o proporcionar otros efectos estructurales y/o
fenotípicos ventajosos. Por ejemplo, los marcadores de sitios de
restricción se introducen de forma rutinaria en el genoma o
antigenoma del mutante por supresión o knock out en uno o más ORFs
C, D y/o V para facilitar la construcción y manipulación del
ADNc.
También se describen métodos y composiciones que
permiten la producción del virus de vacuna PIV mutante por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V como un PIV
quimérico humano-bovino. Los recombinantes se
obtienen por sustitución o adición de un gen o genes heterólogos, un
segmento o segmentos de genoma, o nucleótidos solos o múltiples de
un PIV humano o bovino a un genoma o antigenoma de PIV bovino o
humano de background, parcial o completo, para producir un genoma o
antigenoma de PIV quimérico humano-bovino (véase,
la Solicitud de Patente Provisional U.S.A. titulada "Vacunas de
virus parainfluenza quimérico humano-bovino
atenuado", ("ATTENUATED HUMAN-BOVINE CHIMERIC
PARAINFLUENZA VIRUS VACCINES"), presentada por Bailey y otros,
el 9 de julio de 1999 e identificada por el Expediente del Agente
No. 15280-399000 US).
En un ejemplo, un PIV quimérico
humano-bovino contiene un genoma o antigenoma de PIV
de background bovino, parcial o completo, combinado con uno o más
genes o uno o más segmentos de genoma heterólogos de uno o más PIVs
humanos. De forma alternativa, los PIV quiméricos
humano-bovinos pueden incorporar un genoma o
antigenoma de PIV de background humano, parcial o completo,
combinado con un gen o segmento de genoma heterólogo de uno o más
PIVs bovinos. Entre los genes y segmentos de genoma que se
seleccionan para su utilización como inserciones o adiciones
heterólogas al genoma o antigenoma de background, se incluyen
cualquier gen o segmentos de genoma de tipo salvaje o mutante de N,
P, C, D, V, M, F HN o L. En un ejemplo, el ORF del gen N de un
receptor HPIV3 o genoma de background se sustituye por el ORF del
gen N de BPIV3, el cual dio como resultado un recombinante
infeccioso que mostró un fenotipo de variedad de huésped restringida
en un huésped primate no humano, que era similar al virus BPIV
parental. El gen o genes humanos o bovinos heterólogos pueden
codificar uno o más de los antígenos protectores de PIV,
preferentemente uno o más de las glicoproteínas HN y/o F o un
dominio o epítopo inmunogénico de las mismas, aunque otras
proteínas pueden contribuir a una respuesta inmune protectora y
también son objetivos preferentes para la construcción de virus
quiméricos de PIV humano-bovinos.
De forma alternativa, los PIVs quiméricos
humano-bovinos que contienen una mutación por
supresión o knock out en C, D y/o V pueden contener uno o más
segmentos de genoma que codifican un dominio citoplasmático, un
dominio de transmembrana, un ectodominio o un epítopo inmunogénico
de una proteína antigénica de PIV. Estas proteínas inmunogénicas,
dominios y epítopos también generan respuestas inmunes nuevas en un
huésped inmunizado. Por ejemplo, la adición o sustitución de uno o
más genes inmunogénicos o uno o más segmentos de genoma de un PIV
humano dentro del genoma o antigenoma de background bovino da como
resultado un virus o partícula subviral quimérico, recombinante,
capaz de generar una respuesta inmune dirigida contra una o más
cepas "donadoras" de PIV humano específicas, mientras que la
estructura bovina confiere un fenotipo atenuado que convierte a la
quimera en un candidato para el desarrollo de vacunas.
Los PIV quiméricos humano-bovino
que contienen una o más mutaciones en el ORF o los ORFs C, D y/o V
se pueden construir mediante la sustitución del gen o segmento de
genoma heterólogo por un gen o segmento de genoma homólogo en un
genoma o antigenoma de background de PIV parcial. De forma
alternativa, el gen o segmento de genoma heterólogo se puede
añadir, por ejemplo, a una región 3' o 5' no codificadora de un gen,
como un gen o segmento de genoma supernumerario en combinación con
un genoma o antigenoma de "background" de PIV completo (o
parcial si se suprime otro gen o segmento de genoma). El gen o
segmento de genoma heterólogo se puede añadir en una posición
intergénica dentro del genoma o antigenoma de background de PIV
parcial o completo, de forma que no interrumpa un marco de lectura
abierto dentro del genoma o antigenoma de background. De forma
alternativa, el gen o segmento de genoma heterólogo se puede añadir
o sustituir en una posición que corresponde a la posición de orden
del gen de tipo salvaje de un gen o segmento de genoma homólogo
dentro del genoma o antigenoma de background de PIV parcial o
completo, y el gen o segmento de genoma homólogo se sustituye o
desplaza de este modo (por ejemplo, a una posición más distal
respecto al promotor). En más ejemplos adicionales, el gen o
segmento de genoma heterólogo se añade o sustituye en una posición
que es más próxima o más distal respecto al promotor, comparado con
la posición de orden en el gen de tipo salvaje del gen o segmento de
genoma homólogo dentro del genoma o antigenoma de background, lo
cual potencia o reduce, respectivamente, la expresión del gen o
segmento de genoma heterólogo. Éstas y otras modificaciones
descritas en las referencias citadas son susceptibles de su
incorporación en los mutantes por supresión y knock out en uno o más
ORFs C, D y/o V de la presente
invención.
invención.
La introducción de proteínas, dominios y
epítopos inmunogénicos heterólogos para producir PIVs quiméricos es
particularmente útil para generar respuestas inmunes nuevas en el
huésped inmunizado. La adición o sustitución de un gen o segmento
de genoma inmunogénico de un PIV donador en un genoma o antigenoma
receptor de un PIV diferente, puede generar una respuesta inmune
dirigida contra el subgrupo donador o la cepa donadora, el subgrupo
receptor o la cepa receptora, o tanto contra el subgrupo o cepa
donador como contra el receptor. Para conseguir este objetivo, el
PIV mutante por supresión y knock out uno o más ORFs C, D y/o V se
puede construir también de forma que exprese una proteína
quimérica, por ejemplo, una glicoproteína inmunogénica que tiene una
cola citoplásmica y/o dominio de transmembrana específicos a un PIV
fusionado a un ectodominio de un PIV diferente, para proporcionar,
por ejemplo, una proteína de fusión humana-bovina, o
una proteína de fusión que contenga dominios de dos PIVs humanos
diferentes. En un ejemplo, un genoma o antigenoma de un PIV mutante
por supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V codifica una
glicoproteína quimérica en el virus o partícula subviral
recombinante que tiene dominios de glicoproteína o epítopos
inmunogénicos tanto humanos como bovinos. Por ejemplo, un segmento
de genoma heterólogo que codifica un ectodominio de glicoproteína de
una glicoproteína HN o F de PIV humano, se puede unir a una
secuencia de polinucleótidos (es decir, un segmento de genoma) que
codifica los correspondientes dominios citoplásmicos y/o de
transmembrana de la glicoproteína HN o F bovina, para formar el
genoma o antigenoma de PIV quimérico
humano-bovino.
En otros ejemplos los mutantes por supresión y
knock out uno o más ORF C, D y/o V útiles en una formulación de
vacuna se pueden modificar de forma conveniente para acomodar la
deriva antigénica en el virus circulante. Habitualmente, la
modificación se producirá en las proteínas HN y/o F. Un gen HN o F
completo, o un segmento de genoma que codifica una región
inmunogénica particular del mismo, de una cepa de PIV, se incorpora
en un ADNc de genoma o antigenoma de PIV quimérico mediante la
sustitución de una región correspondiente en un clon receptor de
una cepa o subgrupo de PIV diferente, o mediante la adición de una o
más copias del gen, de tal modo que se representen varias formas
antigénicas. El virus de la progenie producido a partir del clon de
PIV modificado se puede utilizar en protocolos de vacunación contra
cepas de PIV emergentes.
La sustitución de una secuencia codificadora o
no codificadora de PIV humano (por ejemplo, un promotor, un final
de gen, un inicio de gen, un elemento intergénico u otro elemento
que actúa en cis) con un homólogo heterólogo, por ejemplo, otro PIV
humano o una secuencia de PIV bovino o murino, da como resultado un
PIV quimérico que tiene una variedad de posibles efectos de
atenuación y otros efectos fenotípicos. En particular, la variedad
de huésped y otros efectos deseados surgen de la sustitución de un
gen de PIV bovino o murino importado dentro del background de PIV
humano, en el que el gen bovino o murino no funciona de forma
eficiente en una célula humana, por ejemplo, debido a la
incompatibilidad de la secuencia o proteína heteróloga con una
secuencia o proteína de PIV humano interactiva biológicamente (es
decir, una secuencia o proteína que, por lo común, colabora con la
secuencia o proteína sustituida para la transcripción, traducción,
ensamblaje viral, etc) o, de forma más habitual, en una restricción
de la variedad de huésped, con una proteína celular o algún otro
aspecto del entorno celular que es diferente entre el huésped más
permisivo y el menos permisivo.
Las secuencias de PIV bovino se seleccionan para
la introducción en PIV humano, en base a aspectos conocidos de la
estructura y función del PIV humano.
En ejemplos adicionales, los PIV mutantes por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V se producen de
modo que el genoma o antigenoma quimérico se vuelve a modificar
mediante la introducción de una o más mutaciones que determinan una
atenuación u otro fenotipo deseado en el virus o partícula subviral
quimérico resultante. Estas mutaciones se pueden generar de nuevo y
examinar sus efectos atenuantes, según una estrategia de mutagénesis
de diseño racional. De forma alternativa, las mutaciones atenuantes
se pueden identificar en PIV mutantes de origen biológico
existentes y, a continuación, se pueden incorporar en PIV mutantes
por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V. Estos PIV
recombinantes ofrecen características mejoradas de atenuación e
inmunogenicidad para su utilización como agentes de vacuna, tal como
se ha descrito anteriormente. En este contexto, las referencias
anteriores describen la construcción de recombinantes de PIV
quiméricos que tienen los genes HN y F de HPIV1 sustituidos en un
antigenoma de background de HPIV3 parcial que se vuelve a modificar
para contener una o más de las mutaciones atenuantes identificadas
en HPIV3 JS cp45. Un recombinante quimérico de este tipo contiene
todas las mutaciones atenuantes identificadas en el gen L de cp45.
Se ha demostrado que todas las mutaciones de cp45 fuera de los
genes HN Y F (HPIV1) heterólogos se pueden incorporar en un
recombinante de HPIV3-1 para proporcionar un
candidato a vacuna quimérico, atenuado.
Las mutaciones atenuantes en PIVs de origen
biológico para la incorporación dentro de los mutantes por supresión
y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V puede tener lugar de forma
natural o se puede introducir en cepas de PIV de tipo salvaje
mediante procedimientos de mutagénesis conocidos. Por ejemplo, las
cepas de PIV parentales atenuadas de forma incompleta se pueden
producir mediante mutagénesis química durante el crecimiento del
virus en cultivos celulares a los cuales se ha añadido un mutagén
químico, mediante la selección del virus que se ha sometido a los
pasos a temperaturas subóptimas, con el fin de introducir mutaciones
de restricción de crecimiento, o mediante la selección de un virus
mutagenizado que produce placas pequeñas (sp) en un cultivo celular,
tal como se describe en las referencias anteriores.
Con "PIV de origen biológico" se indica
cualquier PIV no producido mediante medios recombinantes. De este
modo, entre los PIV de origen biológico se incluyen los PIV que se
encuentran de forma natural, por ejemplo, los PIVs que se
encuentran de forma natural que tienen una secuencia genómica de
tipo salvaje y los PIVs que tienen variaciones genómicas alélicas o
mutantes a partir de una secuencia de PIV de tipo salvaje de
referencia, por ejemplo, PIVs que tienen una mutación que determina
un fenotipo atenuado. Asimismo, entre los PIV de origen biológico
se incluyen mutantes de PIV obtenidos a partir de un PIV parental
mediante, entre otros, mutagénesis artificial y procedimientos de
selección.
Tal como se ha indicado anteriormente, la
producción de un mutante de PIV de origen biológico suficientemente
atenuado se puede conseguir mediante varios métodos conocidos. Uno
de dichos procedimientos implica someter un virus parcialmente
atenuado a pases en cultivos celulares a temperaturas
progresivamente más bajas, atenuantes. Por ejemplo, los mutantes
parcialmente atenuados se producen por pases en cultivos celulares a
temperaturas subóptimas. De este modo, un mutante cp u otra cepa de
PIV parcialmente atenuada se adapta a un crecimiento eficiente a
una temperatura inferior mediante los pases en cultivo. Esta
selección de PIV mutante durante pases por frío reduce
sustancialmente cualquier virulencia residual en las cepas
derivadas, si se compara con el parental atenuado parcialmente.
De forma alternativa, se pueden introducir
mutaciones específicas en PIV de origen biológico sometiendo virus
parentales atenuados a mutagénesis química, por ejemplo, para
introducir mutaciones ts o, en el caso de virus que ya son ts,
mutaciones ts adicionales suficientes para conferir una atenuación
aumentada y/o estabilidad del fenotipo ts del derivado atenuado.
Entre los medios para la introducción de mutaciones ts en PIV se
incluyen la replicación del virus en presencia de un mutágeno, tal
como 5-fluorouridina, según procedimientos generales
conocidos. Se pueden utilizar otros mutágenos químicos. Una
mutación ts puede dar como resultado la atenuación en casi
cualquier gen de PIV, aunque se ha encontrado que el gen (L) de la
polimerasa es una diana particularmente susceptible para este
objetivo.
El nivel de sensibilidad a la temperatura de la
replicación en un PIV atenuado se determina mediante la comparación
de su replicación a una temperatura permisiva con aquélla a varias
temperaturas restrictivas. La temperatura más baja a la que se
reduce 100 veces o más la replicación del virus, comparada con su
replicación a la temperatura permisiva, se denomina temperatura de
corte. En animales y humanos experimentales, existe una correlación
tanto de la replicación como de la virulencia de PIV con la
temperatura de corte del mutante.
Se ha descubierto que el mutante JS cp45 HPIV3
es relativamente estable genéticamente, altamente inmunogénico, y
está satisfactoriamente atenuado. El análisis de la secuencia de
nucleótidos de estos virus de origen biológico y recombinantes que
incorporan varias de las mutaciones individuales y combinadas,
encontradas en los mismos, indica que cada nivel de atenuación
incrementada se asocia con sustituciones de ácido específicas de
nucleótidos y aminoácidos. Las referencias anteriores también
describen cómo distinguir de forma rutinaria entre mutaciones
accidentales silenciosas y aquéllas responsables de diferencias
fenotípicas, mediante la introducción de mutaciones, de forma
separada y en varias combinaciones, en el genoma o antigenoma de
clones de PIV infecciosos. Este proceso junto con la evaluación de
las características fenotípicas de virus derivados o parentales
identifica mutaciones responsables de las mencionadas
características deseadas, tales como atenuación, sensibilidad a la
temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa pequeño,
restricción de la variedad de huésped, etc.
Las mutaciones identificadas de este modo se
compilan en un "menú" y a continuación se introducen, tal como
se desee, una por una o combinadas, para ajustar un mutantes por
supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V a un nivel
adecuado de atenuación, inmunogenicidad, resistencia genética a la
reversión de un fenotipo atenuado, etc., tal como se desee. Según
la descripción anterior, la capacidad de producir PIV infecciosos a
partir de ADNc permite la introducción de cambios diseñados
específicamente en los mutantes por supresión y knock out en uno o
más ORFs C, D y/o V. En particular, los PIV infecciosos
recombinantes se utilizan para la identificación de una o más
mutaciones específicas en cepas de PIV de origen biológico,
atenuadas, por ejemplo, mutaciones que determinan fenotipos ts, ca,
att y otros. Las mutaciones deseadas que se identifican de este
modo se introducen en las cepas de vacuna de PIV recombinantes,
mutantes por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V. La
capacidad de producir virus a partir de ADNc permite la
incorporación rutinaria de estas mutaciones, individualmente o en
varias combinaciones seleccionadas, en un clon de ADNc de longitud
completa, en el que posteriormente los fenotipos de los virus
recombinantes rescatados que contienen las mutaciones introducidas
se pueden determinar rápidamente.
Mediante la identificación e incorporación de
mutaciones de origen biológico, específicas asociadas con los
fenotipos deseados, por ejemplo, un fenotipo cp o ts, en clones de
PIV infecciosos, se pueden proporcionar otras modificaciones,
específicas de sitio en la mutación identificada o muy próximas a
ella. Mientras la mayor parte de las mutaciones atenuantes
producidas en PIV de origen biológico son cambios de nucleótidos
únicos, también se pueden incorporar otras "mutaciones específicas
de sitio" mediante técnicas recombinantes en PIVs de origen
biológico o recombinantes. Tal como se utiliza en la presente
invención, entre las mutaciones específicas de sitio se incluyen
inserciones, sustituciones, supresiones o reordenamientos de 1 a 3,
hasta 5-15 aproximadamente, o más nucleótidos
modificados (por ejemplo, modificados a partir de una secuencia de
PIV de tipo salvaje, a partir de una secuencia de una cepa de PIV
mutante seleccionada o a partir de un clon de PIV recombinante
parental sujeto a mutagénesis). Las mencionadas mutaciones
específicas de sitio se pueden incorporar en la región, o dentro de
la misma, de una mutación puntual seleccionada, de origen biológico.
De forma alternativa, las mutaciones se pueden introducir en varios
contextos diferentes dentro del clon de PIV, por ejemplo, en una
secuencia reguladora o secuencia de nucleótidos que actúa en cis, o
cerca de ella, que codifica un sitio activo de proteína, un sitio
de enlace, un epítopo inmunogénico, etc. Los mutantes de PIV
específicos de sitio habitualmente mantienen un fenotipo de
atenuación deseado, pero también pueden mostrar características
fenotípicas modificadas, no relacionadas con la atenuación, por
ejemplo, inmunogenicidad potenciada o ampliada y/o crecimiento
mejorado. Entre otros ejemplos de mutantes deseados, específicos de
sitio, se incluyen PIVs recombinantes, diseñados para incorporar
mutaciones adicionales de nucleótidos, estabilizantes, en un codón
que determina una mutación puntual de atenuación. Donde sea posible,
se introducen dos o más sustituciones de nucleótidos en codones que
determinan cambios de aminoácidos atenuantes en un clon de PIV
parental, recombinante o mutante, dando como resultado un PIV de
origen biológico o recombinante que tiene resistencia genética a la
reversión de un fenotipo atenuado. En otros ejemplos, se introducen
sustituciones de nucleótidos específicas de sitio, adiciones,
supresiones o reordenamientos, más arriba (en la dirección del
extremo N-terminal) o más abajo (en la dirección
del extremo C-terminal), por ejemplo, de 1 a 3,
5-10 y hasta 15 nucleótidos o más, 5' o 3',
respecto a una posición de nucleótido diana, por ejemplo, para
construir o eliminar un elemento regulador que actúa en cis
existente.
Además de mutaciones puntuales simples o
múltiples y mutaciones específicas de sitio, entre los cambios en
los PIV mutantes por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D
y/o V se incluyen supresiones, inserciones, sustituciones o
reordenamientos de genes enteros o segmentos de genoma, fuera del
ORF o de los ORFs C, D y/o V o segmentos de genoma suprimidos o
eliminados. Estas mutaciones pueden modificar un pequeño número de
bases (por ejemplo, de 15-30 bases hasta
35-50 bases o más), grandes bloques de nucleótidos
(por ejemplo, de 50-100, 100-300,
300-500, 500-1.000 bases), o genes
casi completos o completos (por ejemplo, de
1.000-1.500 nucleótidos,
1.500-2.500 nucleótidos,
2.500-5.000, nucleótidos,
5.000-6.5000 nucleótidos o más) en el genoma o
antigenoma donador o receptor, dependiendo de la naturaleza del
cambio (es decir, un pequeño número de bases se puede cambiar para
insertar o eliminar un epítopo inmunogénico o cambiar un segmento de
genoma pequeño, mientras que uno o varios bloques grandes de bases
están implicados cuando se añaden, sustituyen, eliminan o reordenan
genes o grandes segmentos de genoma.
Otros ejemplos aseguran una complementación de
mutaciones adoptadas en un clon de PIV recombinante a partir de un
PIV de origen biológico, por ejemplo, mutaciones cp y ts, con tipos
adicionales de mutaciones que implican los mismos genes o
diferentes en un clon PIV modificado. Cada uno de los genes de PIV
se puede modificar selectivamente en términos de niveles de
expresión, o se pueden añadir, suprimir, sustituir o reordenar, en
su totalidad o en parte, solos o en combinación con otras
modificaciones deseadas, para dar como resultado un PIV mutante por
supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V que muestra
características de vacuna nueva. De este modo, además de las
mutaciones atenuantes o en combinación con ellas, adoptadas a partir
de mutantes de PIV de origen biológico, los ejemplos también
proporcionan una variedad de métodos adicionales para la atenuación
o, por otra parte, la modificación del fenotipo de los PIV mutantes
por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V basados en
el diseño por recombinación de clones de PIV infecciosos. Se pueden
producir una variedad de modificaciones en una secuencia de
polinucleótidos aislada que codifica un gen o genoma diana, que
incluye un gen o segmento de genoma donador o receptor en un genoma
o antigenoma de PIV quimérico para la incorporación en clones
infecciosos. Más específicamente, para conseguir los cambios
estructurales y fenotípicos deseados en PIVs recombinantes, los
ejemplos describen la introducción de modificaciones que suprimen,
sustituyen, introducen o reordenan un nucleótido seleccionado o
pluralidad de nucleótidos de un genoma o antigenoma parental, así
como mutaciones que suprimen, sustituyen, introducen o reordenan uno
o más genes o uno o más segmentos de genoma enteros, en un clon de
PIV mutante por supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o
V.
De este modo se describen modificaciones en los
PIV mutantes por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V
que simplemente modifican o eliminan la expresión de un gen
seleccionado además del segmento o segmentos de genoma o el ORF o
los ORFs C, D y/o V, suprimidos o eliminados, por ejemplo, mediante
la introducción de un codón de terminacion en una secuencia
codificadora seleccionada de PIV, el cambio de la posición de un
gen de PIV respecto a un promotor unido operativamente, la
introducción de un codón de iniciación de más arriba para alterar
los niveles de expresión, la modificación (por ejemplo, mediante el
cambio de posición, la modificación de una secuencia existente o la
sustitución de una secuencia existente con una secuencia heteróloga)
de señales de transcripción GS y/o GE para alterar el fenotipo (por
ejemplo, crecimiento, restricciones de temperatura durante la
transcripción, etc.) y diferentes supresiones, sustituciones,
adiciones y reordenamientos que determinan cambios cuantitativos o
cualitativos en la replicación viral, en la transcripción de uno o
varios genes seleccionados, o la traducción de una o varias
proteínas seleccionadas. En este contexto, cualquier gen de PIV que
no sea esencial para el crecimiento se puede eliminar, o de otra
manera, modificar en un PIV recombinante para dar como resultado
los efectos deseados de virulencia, patogénesis, inmunogenicidad y
otros caracteres fenotípicos.
Además, en un genoma o antigenoma de PIV se
pueden producir una variedad de otras modificaciones genéticas para
la incorporación en un PIV quimérico humano-bovino,
sólo o junto con una o más mutaciones atenuantes adoptadas de un
PIV mutante de origen biológico, por ejemplo, para ajustar el
crecimiento, la atenuación, la inmunogenicidad, la estabilidad
genética o proporcionar otros efectos estructurales y/o fenotípicos
ventajosos. Estos tipos adicionales de mutaciones también se
describen en las referencias anteriores y se pueden modificar de
forma rápida en PIV quiméricos humano-bovinos. Por
ejemplo, los marcadores de sitios de restricción se introducen de
forma rutinaria en el genoma o antigenoma del PIVs quimérico
humano-bovino para facilitar la construcción y
manipulación del ADNc.
En la presente invención también se describen
modificaciones genéticas en un PIV mutante por supresión o knock
out en uno o más ORFs C, D y/o V que modifica o elimina la expresión
de un gen o segmento de genoma seleccionado fuera del ORF o los
ORFs C, D y/o V diana sin quitar el gen o segmento de genoma del
clon de PIV. Por ejemplo, esto se puede conseguir mediante la
introducción de una mutación que cambie la asignación codificadora
de un codón de iniciación o introduzca un codón de terminación en
una secuencia codificadora seleccionada, cambiando la posición de
un gen o introduciendo un codón de iniciación aguas arriba para
modificar su velocidad de expresión, o cambiando las señales de
transcripción GS y/o GE para alterar el fenotipo (por ejemplo,
crecimiento, restricciones de temperatura durante la transcripción,
tec). En ejemplos más detallados, se proporcionan los PIV mutantes
por supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V en cuya
expresión de un gen fuera del ORF o los ORFs C, D y/o V diana se
elimina en el nivel de la traducción sin la supresión del gen o de
un segmento del mismo, mediante, por ejemplo, la introducción de
múltiples codones de terminación de traducción en un marco de
lectura abierto (ORF) traduccional. Esto da como resultado virus
viables en los que un gen seleccionado se ha silenciado en el nivel
de la traducción sin la supresión de su gen. En otros ejemplos se
introducen codones de terminación múltiples en el ORF o los ORFs
diana. De forma alternativa, se introduce una mutación en un sitio
de edición de ARN, o se introduce una mutación que modifica el
aminoácido determinado por un codón de iniciación. Estas formas de
virus knock out a menudo mostrarán velocidades de crecimiento
reducidas y tamaños de placa pequeños en cultivos de tejidos. De
este modo, estos métodos proporcionan aún más tipos nuevos de
mutaciones atenuantes que eliminan la expresión de un gen viral que
no es uno de los antígenos protectores virales principales. En este
contexto, los fenotipos de virus knock out producidos sin la
supresión de un gen o segmento de genoma se pueden producir
alternativamente mediante mutagénesis por supresión, tal como se
describe en la presente invención, para impedir las mutaciones
correctoras que pueden restablecer la síntesis de una proteína
diana. Se pueden hacer algunos otros knock outs de genes para los
mutantes por supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V
mediante diseños atenuados y métodos que son muy conocidos en la
técnica (tal como se describe, por ejemplo, en Kretschmer y otros,
Virology 216:309-316, 1996; Radicle y otros,
Virology 217:418-412, 1996; y Kato y otros,
EMBOSS J. 16:178-597, 1907; y Schneider y
otros, Virology 277:314-322, 1996).
Entre otras mutaciones para su incorporación en
los PIV mutantes por supresión y knock out en uno o más ORF C, D
y/o V se incluyen las mutaciones dirigidas hacia señales que actúan
en cis, que se pueden identificar, por ejemplo, mediante análisis
mutacional de los minigenomas de PIV. Por ejemplo, el análisis de
inserciones y supresiones de las secuencias delantera y posterior y
las secuencias contiguas identifica promotores virales y señales de
transcripción y proporciona series de mutaciones asociadas con
grados variables de reducción de la replicación o transcripción del
ARN. La mutagénesis por saturación (por la que cada posición
sucesivamente se modifica a cada una de las alternativas de
nucleótidos) de estas señales que actúan en cis también ha
identificado muchas mutaciones las cuales reducían (o en un caso,
aumentaban) la replicación o transcripción del ARN. Cualquiera de
estas mutaciones se puede insertar en un genoma o antigenoma de PIV
mutante por supresión o knock out en uno o más ORFs C, D y/o V, tal
como se ha descrito en la presente invención. La utilización de
minigenomas de PIV ayuda a evaluación y manipulación de proteínas
que actúan en trans y secuencias de ARN que actúan en cis mediante
el ADNc del antigenoma completo, tal como se ha descrito en las
referencias anteriores.
Otras mutaciones en los PIV mutantes por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V implican la
sustitución del extremo 3' del genoma con su homólogo del
antigenoma, el cual se asocia con cambios en la replicación y
transcripción del ARN. En un ejemplo, el nivel de expresión de
proteínas específicas de PIV, tales como los antígenos protectores
HN y/o F, se puede incrementar mediante la sustitución de las
secuencias naturales con otras que se han obtenido sintéticamente y
diseñado para ser coherentes con una traducción eficiente. En este
contexto, se ha demostrado que la utilización de un codón puede ser
un factor principal en el nivel de traducción de proteínas virales
de mamíferos (Haas y otros, Current Biol.
6:315-324, 1996). El examen de la utilización del
codón de los ARNms que codifican las proteínas HN y F de PIV, que
son los principales antígenos protectores, asegurará una mejora en
la utilización del codón mediante métodos recombinantes para
conseguir una expresión mejorada de estos genes.
En otro ejemplo una secuencia circundante a un
sitio de inicio de traducción (preferentemente que incluye un
nucleótido en la posición -3) de un gen de PIV seleccionado se
modifica, sola o combinada, con la introducción de un codón de
iniciación más arriba, para modular la expresión de un gen de PIV
mediante la determinación de una regulación más arriba o abajo de
la traducción. De forma alternativa, o combinada con otras
modificaciones de PIV descritas en la presente invención, la
expresión de genes de PIV mutantes por supresión y knock out en uno
o más ORFs C, D y/o V se puede modular mediante la modificación de
una señal GS o GE transcripcional de cualquier gen o genes
seleccionados del virus. En ejemplos alternativos, se modifican
niveles de expresión de genes en mutantes por supresión y knock out
en uno o más ORFs C, D y/o V en el nivel de la transcripción. En un
aspecto, se puede cambiar la posición de un gen seleccionado en el
mapa génico de PIV a una posición más proximal respecto al
promotor o más distal respecto al mismo, por la cual el gen se
expresará de forma más o menos eficiente, respectivamente. Según
este aspecto, se puede conseguir la modulación de la expresión para
genes específicos mediante la obtención de reducciones o incrementos
de la expresión génica de dos veces, más habitualmente de cuatro
veces, hasta de diez veces o más, en comparación con los niveles de
los virus de tipo salvaje que a menudo se acompañan de un
correspondiente descenso en los niveles de expresión para genes
sustituidos posicionalmente de forma recíproca. Estos y otros
cambios transposicionales dieron como resultado mutantes de PIV por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V que tenían
fenotipos atenuados, por ejemplo, debido a la expresión disminuida
de proteínas virales seleccionadas involucradas en la
replicación del ARN, o que tenían otras propiedades deseables, tales como una expresión antigénica incrementada.
replicación del ARN, o que tenían otras propiedades deseables, tales como una expresión antigénica incrementada.
Los clones de PIV infecciosos mutantes por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V también se pueden
diseñar, según el método y las composiciones descritas en la
presente invención, para aumentar la inmunogenicidad e inducir un
nivel de protección superior al proporcionado por la infección con
un PIV de tipo salvaje o un PIV parental. Por ejemplo, se puede
añadir un epítopo inmunogénico de una cepa o tipo de PIV heterólogo,
o de una fuente diferente a PIV, tal como un RSV, a un clon
recombinante mediante cambios de nucleótidos apropiados en la
secuencia de polinucleótidos que codifica el genoma o antigenoma. De
forma alternativa, el PIV mutante se puede diseñar para añadir o
eliminar (por ejemplo, mediante inserción, sustitución o supresión
de aminoácidos) proteínas, dominios de proteínas, o formas de
proteínas específicas inmunogénicas, asociadas con reacciones
inmunológicas deseables o no deseables.
En los métodos descritos en la presente
invención, se pueden insertar genes o segmentos de genoma dentro o
próximos al genoma o antigenoma de PIVs mutantes por supresión y
knock out en uno o más ORFs C, D y/o V. Estos genes pueden estar
bajo un control común con genes receptores, o pueden estar bajo el
control de un conjunto independiente de señales de transcripción.
Entre los genes de interés se incluyen los genes de PIV
identificados anteriormente, así como genes que no son de PIV.
Entre los genes que no son de PIV de interés se incluyen aquéllos
que codifican citoquinas (por ejemplo, IL-2 hasta
IL-18, especialmente IL-2,
IL-6 e IL-12, IL-18,
etc.), el interferón gamma y proteínas ricas en epítopos de células
T colaboradoras. Estas proteínas adicionales se pueden expresar
como una proteína separada o bien como una copia supernumeraria de
una proteína de PIV existente, tal como HN o F. Esto proporciona la
capacidad de modificar y mejorar las respuestas inmunes contra PIV,
tanto cuantitativa como cualitativamente.
Las supresiones, inserciones, sustituciones y
otras mutaciones que implican cambios de los genes virales enteros
o segmentos de genoma en mutantes por supresión o knock out en
el/los ORFs C, D y/o V dan lugar a candidatos a vacuna altamente
estables, que son particularmente importantes en el caso de
individuos inmunosuprimidos. Muchos de estos cambios darán como
resultado la atenuación de cepas de vacuna resultantes, mientras que
otros determinarán diferentes tipos de cambios fenotípicos
deseados. Por ejemplo, los genes accesorios (es decir, no
esenciales para el crecimiento in vitro) son excelentes
candidatos para codificar proteínas que interfieren específicamente
con la inmunidad del huésped (véase, por ejemplo, Kato y otros,
EMBO. J. 16:578-87, 1997).
La eliminación de los genes mencionados en virus
de vacuna se espera que reduzca la virulencia y patogénesis y/o
mejore la inmunogenicidad.
En ejemplos más detallados, los mutantes por
supresión y knock out en uno o más ORFs C, D y/o V se utilizan como
vectores para antígenos protectores de otros patógenos, en
particular patógenos del tracto respiratorio, tales como el RSV.
Por ejemplo, el PIV recombinante se puede diseñar de modo que
incorpore una secuencia que codifique antígenos protectores de RSV
para producir virus de vacuna atenuados, infecciosos. La clonación
del ADNc de RSV y otras materias se dan a conocer en la Solicitud de
Patente Provisional U.S.A. No.60/007,083, presentada el 27 de
septiembre de 1995; la Solicitud de Patente U.S.A. No. 08/720,132,
presentada el 27 de septiembre de 1996; la Solicitud de Patente
Provisional U.S.A. No. 60/021,773, presentada el 15 de julio de
1996; la Solicitud de Patente Provisional U.S.A. No. 60/046,141,
presentada el 9 de mayo de 1997; la Solicitud de Patente
Provisional U.S.A. No. 60/047,634, presentada el 23 de mayo de 1997;
la Solicitud de Patente U.S.A. No. 08/892,403, presentada el 15 de
julio de 1997 (correspondientes a la Publicación Internacional No.
WO 98/02530); la Solicitud de Patente U.S.A. titulada "Producción
de vacunas de virus sincitial respiratorio quimérico atenuado a
partir de secuencias de nucleótidos clonadas", ("PRODUCTION OF
ATTENUATED CHIMERIC RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINES FROM
CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES") presentada el 13 de abril de 1999 e
identificada por el Expediente del Agente No.
17634-000520; la Solicitud de Patente U.S.A.
titulada "Producción de vacunas de virus atenuados de ARN de
cadena negativa a partir de secuencias de nucleótidos clonadas",
("PRODUCTION OF ATTENUATED NEGATIVE STRANDED RNA VIRUS VACCINES
FROM CLONED NUCLEOTIDE SEQUENCES") presentada por Murphy y otros
el 13 de abril de 1999 e identificada por el Expediente del Agente
No. 17634-000600); Collins, y otros, Proc Nat
Acad Sci U.S.A. 92:11563-11567, 1995; Bukreyev,
y otros, J Virol. 70:6634-41, 1996, Juhasz y
otros, J. Virol. 71(8):5814-5819,
1997; Durbin y otros, Virology 235:323-332,
1997; He y otros, Virology 237:249-260, 1997;
Baron y otros, J. Virol. 71:1265-1271, 1997;
Whitehead y otros, Virology
247(2):32-9, 1998a; Whitehead y otros, J.
Virol. 72(5): 4467-4471, 1998b; Jin y
otros Virology 251:206-214, 1998; y Whitehead
y otros, J. Virol. 73:(4)3438-3442,
1999 y Bukreyev, y otros, Proc Nat Acad Sci U.S.A.
96:2367-72, 1999).
Según este ejemplo, se consiguen los PIV
mutantes por supresión y knock out en uno o más ORF C, D y/o V de
tal forma que inocorporan, como mínimo, una secuencia RSV. Por
ejemplo, los genes de HPIV3 individuales se pueden sustituir con
genes homólogos de RSV humano. De forma alternativa, un segmento de
genoma seleccionado, heterólogo, por ejemplo, que codifica una cola
citoplásmica, un dominio de transmembrana o un ectodominio de una
glicoproteína de RSV se sustituye por un segmento de genoma homólogo
en, por ejemplo, el mismo gen en HPIV3 o en un gen diferente en
HPIV3, o se añade a una secuencia no codificadora del genoma o
antigenoma de HPIV3 para dar como resultado una glicoproteína
PIV-RSV quimérica. En un ejemplo, un segmento de
genoma de un gen F de RSV humano se sustituye por un segmento de
genoma homólogo de HPIV3 para dar como resultado construcciones que
codifican proteínas quiméricas, por ejemplo, proteínas de fusión que
tienen una cola citoplásmica y/o un dominio de transmembrana de PIV
fusionado a un ectodominio de RSV para dar como resultado un virus
atenuado nuevo, y/o una vacuna multivalente inmunogénica tanto
contra PIV, como contra RSV.
Además de las modificaciones descritas
anteriormente en los mutantes por supresión o knock out en C, D y/o
V, se pueden hacer modificaciones diferentes o adicionales en clones
de PIV para facilitar la manipulación, tales como la inserción de
sitios de restricción únicos en varias regiones intergénicas (por
ejemplo, un único sitio Stul entre los genes G y F) o en cualquier
otro sitio. Las secuencias de genes no traducidas se pueden
eliminar para incrementar la capacidad de inserción de secuencias
foráneas.
En otro ejemplo, se proporcionan las
composiciones, (por ejemplo, polinucleótidos aislados y vectores que
incorporan ADNc que codifica PIV quiméricos
humano-bovinos) para producir un PIV infeccioso
aislado. Mediante la utilización de estas composiciones y métodos,
se generan PIVs infecciosos a partir de un genoma o antigenoma de
PIV, una proteína (N) de la nucleocápside, una fosfoproteína (P) de
la nucleocápside, y una proteína grande de la polimerasa (L). En
ejemplos relacionados, se proporcionan composiciones y métodos para
la introducción de los cambios fenotípicos y estructurales
mencionados anteriormente en un PIV recombinante, para dar como
resultado virus de vacuna atenuados, infecciosos.
La introducción de las mutaciones definidas
anteriormente en un clon infeccioso, mutante por supresión o knock
out en C, D y/o V, se puede conseguir por una variedad de métodos
bien conocidos. Se pretende que "clon infeccioso" con respecto
al ADN signifique ADNc o su producto, sintético o de cualquier otra
forma, que se puede transcribir en ARN genómico o antigenómico
capaz de servir como patrón para la producción del genoma de un
virus infeccioso o partícula subviral. De este modo, las mutaciones
definidas se pueden introducir mediante técnicas habituales (por
ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio) en una copia de ADNc del
genoma o antigenoma. La utilización de subfragmentos de ADNc de
genoma o antigenoma para organizar un ADNc de antigenoma o genoma
completo, tal como se describe en la presente invención, tiene la
ventaja de que cada región se puede manipular separadamente (los
ADNc más pequeños son más fáciles de manipular que los más grandes)
y se pueden organizar más fácilmente en un ADNc completo. De este
modo, el ADNc del antigenoma o genoma completo, o cualquier
subfragmento del mismo, se puede utilizar como patrón para
mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Esto puede realizarse
mediante el intermediario de una forma de fagémido de cadena
simple, tal como la utilización del equipo
Muta-gene® de Bio-Rad Laboratories
(Richmond, CA) o un método que utiliza un plásmido de doble cadena
directamente como patrón, tal como el equipo de mutagénesis de
Chameleon de Stratagene (La Jolla, CA), o mediante la reacción en
cadena de la polimerasa, utilizando un cebador de oligonucleótido o
bien un patrón que contiene la mutación o mutaciones de interés. Un
subfragmento mutado se puede organizar en el ADNc del antigenoma o
genoma completo. Es conocida una variedad de otras técnicas de
mutagénesis y están disponibles para su utilización en la producción
de mutaciones de interés en el ADNc del antigenoma o genoma de PIV.
Las mutaciones pueden variar desde cambios únicos de nucleótidos a
la sustitución de trozos grandes de ADNc que contienen uno o más
genes o regiones de
genoma.
genoma.
De este modo, en un ejemplo ilustrativo, las
mutaciones se introducen mediante la utilización del equipo de
mutagénesis in vitro del fagémido Muta-gene
disponible de Bio-Rad. En resumen, el ADNc que
codifica una parte de un genoma o antigenoma de PIV se clona en el
plásmido pTZ18U, y se utiliza para transformar células CJ236
(Life
Technologies). Las preparaciones de fagémido se preparan según recomendaciones del fabricante. Los oligonucleótidos se diseñan por mutagénesis mediante la introducción de un nucleótido modificado en la posición deseada del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el fragmento de genoma o antigenoma modificado genéticamente se amplifica a continuación y el trozo mutado se reintroduce en el clon con el genoma o antigenoma de longitud completa.
Technologies). Las preparaciones de fagémido se preparan según recomendaciones del fabricante. Los oligonucleótidos se diseñan por mutagénesis mediante la introducción de un nucleótido modificado en la posición deseada del genoma o antigenoma. El plásmido que contiene el fragmento de genoma o antigenoma modificado genéticamente se amplifica a continuación y el trozo mutado se reintroduce en el clon con el genoma o antigenoma de longitud completa.
También se describen métodos para la producción
de PIV infecciosos quiméricos humano-bovinos a
partir de uno o más polinucleótidos aislados, por ejemplo, uno o
más ADNcs. Se construye ADNc que codifica un genoma o antigenoma de
PIV para la coexpresión intracelular o in vitro con las
proteínas virales necesarias para formar PIV infecciosos. Con
"antigenoma de PIV" se indica una molécula aislada de
polinucleótido de sentido positivo que hace de patrón para la
síntesis del genoma del PIV de progenie. Se puede construir un ADNc
que es una versión de sentido positivo del genoma de PIV, que
corresponde al ARN intermediario replicativo, o antigenoma, de modo
que minimiza la posibilidad de hibridación con transcritos de
sentido positivo de las secuencias complementarias que codifican
proteínas necesarias para generar una nucleocápside que transcribe y
replica, es decir, secuencias que codifican las proteínas N, P y
L.
El genoma o antigenoma del PIV recombinante sólo
necesita contener aquéllos genes o partes de los mismos necesarios
para hacer infecciosas las partículas virales o subvirales
codificadas de este modo. Además, se puede proporcionar una
molécula de polinucleótido a los genes o partes de los mismos, es
decir, se puede proporcionar a un gen una molécula de nucleótido
separada, por medio de complementación o similar, o se puede
expresar directamente a partir del ADNc del genoma o
antigenoma.
Con PIV recombinante se indica un PIV o
partícula viral o subviral similar a PIV obtenida directa o
indirectamente a partir de un sistema de expresión recombinante o
propagada a partir de un virus o partículas subvirales producidas a
partir del mismo. El sistema de expresión recombinante utilizará un
vector de expresión recombinante que comprende una unidad
transcripcional unida operativamente que comprende una colección o,
como mínimo, un elemento o elementos genéticos que tienen un papel
regulador en la expresión de genes de PIV, por ejemplo, un
promotor, una secuencia estructural o codificadora que se transcribe
a ARN de PIV, y secuencias adecuadas de iniciación y terminación de
la transcripción.
Para producir PIV infecciosos a partir de genoma
o antigenoma expresado por ADNc, el genoma o antigenoma se
coexpresa con aquéllas proteínas de PIV necesarias para (i) producir
una nucleocápside capaz de la replicación del ARN, y (ii) dar
nucleocápsides de progenie aceptables tanto para la replicación como
para la transcripción del ARN. La transcripción mediante la
nucleocápside del genoma proporciona las otras proteínas de PIV e
inicia una infección productiva. Alternativamente, se pueden
suministrar mediante coexpresión otras proteínas de PIV necesarias
para una infección productiva.
Los PIV infecciosos se producen por coexpresión
intracelular o sin de células de una o más moléculas aisladas de
polinucleótidos que codifican un ARN del genoma o antigenoma de PIV,
junto con uno o más polinucleótidos que codifican proteínas virales
necesarias para generar una nucleocápside que transcribe y replica.
Entre las proteínas virales útiles para la coexpresión para dar
como resultado PIVs infecciosos, se encuentran la proteína (N) de
la nucleocápside, la fosfoproteína (P) de la nucleocápside, la
proteína grande (L) de la polimerasa, la proteína (F) de fusión, la
glicoproteína hemaglutinina-neuraminidasa (HN), y la
proteína (M) de matriz. En este contexto también son útiles los
productos de los ORFs C, D y V de PIV.
Los ADNcs que codifican un genoma o antigenoma
de PIV se construyen para la coexpresión intracelular o in
vitro con las proteínas virales necesarias para formar PIV
infecciosos. Con "antigenoma de PIV" se indica una molécula
aislada de polinucleótido de sentido positivo que hace de patrón
para la síntesis del genoma del PIV de progenie. Un ADNc puede ser
una construcción que es una versión de sentido positivo del genoma
de PIV, que corresponde al ARN intermediario replicativo, o
antigenoma, de modo que minimiza la posibilidad de hibridación con
transcritos de sentido positivo de las secuencias complementarias
que codifican proteínas necesarias para generar una nucleocápside
que transcribe y replica.
En algunos ejemplos el genoma o antigenoma de un
PIV recombinante (rPIV) sólo necesita contener aquéllos genes
o partes de los mismos necesarias para hacer infecciosas las
partículas virales o subvirales codificadas de este modo. Además,
se puede proporcionar una molécula de polinucleótido a los genes o
partes de los mismos, es decir, se puede proporcionar a un gen una
molécula de nucleótido separada por medio de complementación o
similar. En otras realizaciones, el genoma o antigenoma de PIV
codifica todas las funciones necesarias para el crecimiento,
replicación e infección viraL, sin la participación de un virus
colaborador o función viral colaboradora, proporcionada por un
plásmido o línea celular colaboradora.
Con "PIV recombinante" se indica un PIV o
partícula viral o subviral similar a PIV obtenida directa o
indirectamente a partir de un sistema de expresión recombinante o
propagada a partir de un virus o partículas subvirales producidas a
partir del mismo. El sistema de expresión recombinante utilizará un
vector de expresión recombinante que comprende una unidad
transcripcional unida operativamente que comprende una colección o,
como mínimo, un elemento o elementos genéticos que tienen un papel
regulador en la expresión de genes de PIV, por ejemplo, un
promotor, una secuencia estructural o codificadora que se transcribe
al ARN de PIV, y secuencias adecuadas de inicio y terminación de la
transcripción.
Para producir PIV infecciosos a partir de genoma
o antigenoma expresado por ADNc, el genoma o antigenoma se
coexpresa con aquéllas proteínas N, P y L de PIV necesarias para (i)
producir una nucleocápside capaz de la replicación del ARN, y (ii)
dar nucleocápsides de progenie aceptables tanto para la replicación
como para la transcripción del ARN. La transcripción mediante la
nucleocápside del genoma proporciona las otras proteínas de PIV e
inicia una infección productiva. Alternativamente, se pueden
suministrar mediante coexpresión otras proteínas de PIV necesarias
para una infección productiva.
La síntesis de antigenoma o genoma de PIV junto
con las proteínas virales mencionadas anteriormente se puede
conseguir in vitro (sin células), por ejemplo, mediante una
reacción de transcripción-traducción combinada,
seguida de la transfección en células. De forma alternativa, el ARN
del genoma o antigenoma se puede sintetizar in vitro y
transfectar a células que expresan proteínas de PIV.
En otro ejemplo, se proporcionan secuencias
complementarias que codifican proteínas necesarias para generar un
PIV que transcribe y replica, mediante uno o más virus
colaboradores. Dichos virus colaboradores pueden ser de tipo
salvaje o mutantes.
El virus colaborador se puede distinguir
fenotípicamente del virus codificado por el ADNc de PIV. Por
ejemplo, es deseable proporcionar anticuerpos monoclonales que
reaccionan inmunológicamente con el virus colaborador pero no con
el virus codificado por el ADNc de PIV. Dichos anticuerpos pueden
ser anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos se pueden utilizar
en cromatografía por afinidad para separar el virus colaborador del
virus recombinante. Para ayudar a la obtención de dichos
anticuerpos, se pueden introducir mutaciones en el ADNc de PIV para
proporcionar diversidad antigénica a partir del virus colaborador,
tal como en los genes de las glicoproteínas HN o F.
En ejemplos alternos, la proteínas N, P, L y
otras proteínas de PIV deseadas se codifican por uno o más vectores
de expresión no virales, los cuales pueden ser los mismos o
diferentes de los que codifican el genoma o antigenoma. Si se desea
se pueden incluir más proteínas cada una de las cuales está
codificada por su propio vector o por un vector que codifica una o
más de las proteínas N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas, o el
genoma o antigenoma completo. La expresión del genoma o antigenoma
y de las proteínas a partir de plásmidos transfectados se puede
conseguir, por ejemplo, mediante cada ADNc que está bajo el control
de un promotor para la ARN polimerasa T7, que a su vez se
suministra mediante infección, transfección o transducción con un
sistema de expresión para la ARN polimerasa T7, por ejemplo, una
cepa recombinante de virus de vacuna MVA que expresa la ARN
polimerasa T7 (Wyatt y otros, Virology,
210:202-205 (1995)).
Las proteínas virales y/o la ARN polimerasa T7
también se pueden proporcionar mediante células de mamífero
transformadas o mediante transfección de ARNm preformado o de
proteínas.
Un antigenoma de PIV se puede construir
mediante, por ejemplo, el ensamblaje de segmentos de ADNc clonados,
que representan en conjunto el antigenoma completo, mediante la
reacción en cadena de la polimerasa o similar (PCR; descrita en,
por ejemplo, las Patentes U.S.A. Nos. 4.693.195 y 4.683.202, y
Protocolos de PCR: Una guía para Métodos y Aplicación, ("PCR
Protocols: A Guide to Methods and Applications"), Innis y otros,
editores, Academic Press, San Diego (1990)) de copias de ARNm de
PIV o RNA de genoma transcritos a la inversa. Por ejemplo, se
genera una primera construcción que comprende ADNcs que contienen el
extremo izquierdo del antigenoma, que se extiende desde un promotor
apropiado (por ejemplo, un promotor de ARN polimerasa T7) y se
ensambla en un vector de expresión adecuado, tal como un plásmido,
cósmido, fago, o vector de virus de ADN. El vector se puede
modificar mediante mutagénesis y/o inserción de un poliligador
sintético que contiene sitios de restricción únicos diseñados para
facilitar el ensamblaje. Para facilitar la preparación, las
proteínas N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas se pueden
ensamblar en uno o más vectores separados. El extremo derecho del
plásmido de antigenoma puede contener secuencias adicionales, según
se desee, tales como un ribozima circundante y terminadores
transcripcionales T7 en tándem. El ribozima puede ser de tipo cabeza
de martillo ("hammerhead") (por ejemplo, Grosfeld y otros,
(1995), cita anterior), que daría como resultado un extremo 3' que
contiene un nucleótido no viral único, que puede ser cualquiera de
los otros ribozimas adecuados, tales como el del virus de la
hepatitis delta (Perrotta y otros, Nature
350:434-436 (1991)), que daría como resultado un
extremo 3' libre de nucleótidos que no son de PIV. Los extremos
derecho e izquierdo se unen a continuación, a través de un sitio de
restricción común.
Se pueden hacer una variedad de inserciones,
supresiones y reordenaciones de nucleótidos en el genoma o
antigenoma de PIV durante o después de la construcción del ADNc.
Por ejemplo, se pueden sintetizar secuencias de nucleótidos
específicas deseadas e insertar en regiones adecuadas en el ADNc,
mediante sitios de enzimas de de restricción convenientes.
Alternativamente, se pueden utilizar técnicas bien conocidas en la
materia, tales como mutagénesis específica de sitio, barrido de
alanina, mutagénesis por PCR, u otras técnicas semejantes, para
introducir mutaciones en el ADNc.
Entre los métodos alternativos para construir
ADNc que codifique el genoma o antigenoma se incluye la
transcripción reversa-PCR mediante condiciones de
PCR mejoradas (por ejemplo, tal como se describe en Cheng y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699
(1994)), para reducir el número de componentes de ADNc subunidad
hasta el punto de una o dos partes. Se pueden utilizar diferentes
promotores (por ejemplo, T3, SP6) o diferentes ribozimas (por
ejemplo, el del virus de la hepatitis delta). Se pueden utilizar
diferentes vectores de ADN (por ejemplo cósmidos) para la
propagación, para acomodar mejor el gran tamaño del genoma o
antigenoma.
Se pueden insertar polinucleótidos aislados (por
ejemplo, ADNc) que codifican el genoma o antigenoma en células
huésped adecuadas mediante transfección, electroporación, inserción
mecánica, transducción o similares, en células que son capaces de
soportar una infección por PIV productiva, por ejemplo,
HEp-2, FRhL-DBS2,
LLC-MK2, MRC-5, y células Vero. La
transfección de secuencias de polinucleótidos aislados se pueden
introducir en cultivos celulares mediante, por ejemplo,
transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler y otros,
Cell 14:725 (1978); Corsaro y Pearson, Somatic Cell
Genetics 7:603 (1981); Graham y Van der Eb, Virology
52:456 (1973)), electroporación (Neumann y otros, EMBO J.
1:841-845 (1982)), transfección mediada por
DEAE-dextrano (Ausubel y otros, (editores)
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons,
Inc., NY (1987), transfección mediada por lípido catiónico (Hawley
Nelson y otros, Focus 15:73-79 (1993)) o un
reactivo de transfección disponible comercialmente, por ejemplo,
LipofectACE® (Life Technologies, Gaithersburg, MD) o similares.
Tal como se ha destacado anteriormente, en
algunos ejemplos uno o más virus colaboradores que son distinguibles
fenotípicamente respecto a los que codifica el genoma o antigenoma,
codifican las proteínas N, P, L y otras proteínas de PIV deseadas.
Uno o más vectores de expresión que pueden ser iguales o diferentes
respecto a los que codifica el genoma o antigenoma, y varias
combinaciones de los mismos, codifican las proteínas N, P, L y
otras proteínas de PIV deseadas. Se pueden incluir otras proteínas,
tal como se desee, codificadas por su propio vector o por un vector
que codifica una o más de las proteínas N, P, L y otras proteínas de
PIV deseadas, o el genoma o antigenoma completo.
Mediante la aportación de clones infecciosos de
PIV, la presente invención permite una amplia variedad de
modificaciones para ser producidos recombinantemente en el genoma de
PIV (o antigenoma), dando como resultado mutaciones que determinan
cambios fenotípicos deseados. Con "clon infeccioso" se indica
ADNc o su producto, sintético o de otra manera, ARN capaz de
incorporarse en viriones infecciosos que se pueden transcribir en
ARN genómico o antigenómico, capaz de servir como patrón para
producir las partículas virales o subvirales infecciosas del
genoma. Tal como se ha destacado anteriormente, se pueden introducir
mutaciones definidas mediante una variedad de técnicas
convencionales (por ejemplo, mutagénesis dirigida a sitio) en una
copia de ADNc del genoma o antigenoma. La utilización de
subfragmentos de ADNc genómicos o antigenómicos para ensamblar un
ADNc de genoma o antigenoma completo, tal como se ha descrito, tiene
la ventaja de que cada región se puede manipular separadamente, en
la que pequeñas unidades de ADNc aportan una mayor facilidad de
manipulación que las unidades de ADNc grandes y, a continuación, se
ensamblan en un ADNc completo. De este modo, el antigenoma completo
o un subfragmento seleccionado del mismo se pueden utilizar como
patrón para la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Esto puede
ser a través del intermediario de un fagémido de cadena simple, tal
como la utilización del equipo de MUTA-gen® de
Bio-Rad Laboratories (Richmond, CA), o un método
mediante la utilización del plásmido de cadena doble directamente
como patrón, tal como la utilización del equipo de mutagénesis
Chameleon® de Strategene (La Jolla, CA), o mediante la reacción en
cadena de la polimerasa mediante un cebador de oligonucleótido o
bien un patrón que contiene la mutación o mutaciones de interés. Un
subfragmento mutado se puede ensamblar a continuación en el ADNc
completo del genoma o antigenoma. Es conocida una variedad de otras
técnicas de mutagénesis y se pueden adaptar de forma rutinaria para
la utilización en la producción de de mutaciones de interés en un
ADNc del antigenoma o genoma de PIV.
De este modo, en un ejemplo ilustrativo se
introducen mutaciones mediante la utilización del equipo de
mutagénesis in vitro por fagémido MUTA-gene®
disponible por Bio-Rad Laboratories. En resumen, el
ADNc que codifica un genoma o antigenoma de PIV se clonan en el
plásmido pTZ18U, y se utiliza para transformar las células CJ236
(Life Technologies). Se preparan preparaciones de fagémidos, tal
como recomienda el fabricante. Se diseñan los oligonucleótidos para
la mutagénesis mediante la introducción de un nucleótido modificado
en la posición deseada del genoma o antigenoma. A continuación, el
plásmido que contiene el genoma o antigenoma modificado se
amplifica.
Las mutaciones pueden variar desde cambios de
nucleótidos únicos hasta la introducción, supresión o sustitución
de grandes segmentos de ADNc que contienen uno o más genes o
segmentos de genoma. Los segmentos del genoma pueden corresponder a
dominios estructurales y/o funcionales, por ejemplo, citoplásmicos,
de transmembrana o ectodominios de proteínas, sitios activos, tales
como sitios que intermedian la unión u otras interacciones
bioquímicas con diferentes proteínas, sitios epitópicos, por
ejemplo, sitios que estimulan la unión de anticuerpos y/o
respuestas inmunes mediadas por anticuerpos (humoral) o células,
etc. En este sentido, los segmentos de genoma útiles oscilan entre
15-35 nucleótidos aproximadamente, en el caso de
segmentos de genoma que codifican dominios funcionales pequeños de
proteínas, por ejemplo, sitios epitópicos, hasta aproximadamente 50,
75, 100, 200-500, y 500-1.500 o más
nucleótidos.
La capacidad para introducir mutaciones
definidas en PIV infecciosos tiene muchas aplicaciones, entre las
que se incluyen la manipulación de mecanismos inmunogénicos y
patogénicos de PIV. Por ejemplo, las funciones de las proteínas de
PIV, entre las que se incluyen las proteínas N, P, M, F, HN, y L y
los productos de ORF C, D y V, se pueden manipular mediante la
introducción de mutaciones que eliminan o reducen el nivel de
expresión de proteínas, o las cuales dan como resultado una
proteína mutante. También se pueden manipular de forma rutinaria
varios aspectos estructurales del ARN del genoma, tales como
promotores, regiones intergénicas, y señales de transcripción.
Los efectos de las proteínas que actúan en trans
y las secuencias de ARN que actúan en cis se pueden determinar
rápidamente, por ejemplo, mediante ADNc del antigenoma completo en
ensayos paralelos utilizando minigenomas de PIV (Dimock, y otros,
J. Virol. 67:2772-8 (1993)), cuyo estado
dependiente del rescate es útil para caracterizar aquéllos mutantes
que puede ser demasiado inhibitorios para ser recuperados en virus
infecciosos independientes de la replicación.
Algunas sustituciones, inserciones, supresiones
o reordenaciones de genes o segmentos de genes en PIVs recombinantes
(por ejemplo, sustituciones de un segmento de gen que codifica una
proteína seleccionada o región de la proteína, por ejemplo, una
cola citoplásmica, un dominio de transmembrana o ectodominio, un
sitio o región epitópica, un sitio o región de unión, un sitio o
región activo que contiene un sitio activo, etc.) se hacen en
relación estructural o funcional a un gen o segmento de gen
"homólogo" existente a partir del mismo o diferente PIV u otra
fuente. Tales modificaciones dan como resultado recombinantes nuevos
que tienen los cambios fenotípicos deseados comparados con los PIV
de tipo salvaje o parentales u otras cepas virales. Por ejemplo, los
recombinantes de este tipo pueden expresar una proteína quimérica
que tiene una cola citoplásmica y/o dominio de transmembrana de un
PIV fusionado a un ectodominio de otro PIV. Otros recombinantes de
ejemplo de este tipo expresan regiones de proteínas duplicadas,
tales como regiones inmunogénicas duplicadas.
Tal como se utiliza en la presente invención,
los genes, segmentos de genes, proteínas o regiones de proteínas
"homólogos" provienen habitualmente de fuentes heterólogas (por
ejemplo, de genes de PIV diferentes, o que representan el mismo (es
decir, homólogos o alélicos) gen o segmento de gen en diferentes
tipos o cepas de PIV). Los homólogos habituales seleccionados en
este contexto comparten grandes aspectos estructurales, por
ejemplo, cada homólogo puede codificar una proteína o dominio
estructural de proteína comparable, tal como un dominio
citoplásmico, dominio de transmembrana, sitio de unión o región de
ectodominio, sitio o región epitópico, etc. Los dominios homólogos
sus segmentos de genes que los codifican abrazan un ensamblaje de
especies que tienen un conjunto de variaciones de tamaños y
secuencias definidas por una actividad biológica común entre las
variantes de dominio o segmento de gen.
Los genes y segmentos de genes homólogos, así
como otros polinucleótidos descritos en la presente invención para
la producción de PIV recombinantes, a menudo comparten identidad de
secuencia sustancial con un polinucleótido seleccionado
"secuencia de referencia", por ejemplo, con otra secuencia
homóloga seleccionada. Tal como se utiliza en la presente
invención, una "secuencia de referencia" es una secuencia
definida utilizada como base para la comparación de secuencias, por
ejemplo, un segmento de un ADNc de longitud completa o gen, o un
ADNc completo o secuencia de gen. Generalmente, una secuencia de
referencia tiene una longitud de, como mínimo, 20 nucleótidos,
frecuentemente, una longitud de, como mínimo, 25 nucleótidos, y a
menudo, como mínimo, una longitud de 50 nucleótidos. Dado que dos
polinucleótidos pueden cada uno (1) contener una secuencia (es
decir, una parte de la secuencia de polinucleótidos completa) que
es parecida para los dos polinucleótidos, y (2) pueden contener
además una secuencia que es divergente entre los dos
polinucleótidos, las comparaciones de secuencias entre dos (o más)
polinucleótidos se llevan a cabo habitualmente mediante la
comparación de secuencias de los dos polinucleótidos sobre una
"ventana de comparación" para identificar y comparar regiones
locales con similitud de secuencia. Una "ventana de
comparación", tal como se utiliza en la presente invención, se
refiere a un segmento conceptual de, como mínimo, 20 posiciones de
nucleótidos contiguas, en el que una secuencia de polinucleótidos
se puede comparar con una secuencia de referencia de, como mínimo,
20 nucleótidos contiguos y en el que la parte de secuencia de
polinucleótidos en la ventana de comparación puede contener
adiciones o supresiones (por ejemplo, espacios vacíos
("gaps")) del 20 por ciento o menos cuando se compara con la
secuencia de referencia (que no contiene adiciones o supresiones)
para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. El alineamiento
óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación se
puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de
Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), mediante
el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman &
Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante el método de
búsqueda de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:2444 (1988), mediante implementaciones
informatizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA
en the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics
Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, incorporado en la
presente como referencia), o mediante inspección, y se selecciona
el mejor alineamiento (es decir, el que resulta en el mayor
porcentaje de similitud de secuencia sobre la ventana de
comparación) generado por los diversos métodos. El término
"identidad de secuencia" significa que dos secuencias de
polinucleótidos son idénticas (es decir, en base a nucleótido por
nucleótido) sobre la ventana de comparación. El término
"porcentaje de identidad de secuencia" se calcula comparando
dos secuencias alineadas de forma óptima sobre la ventana de
comparación, determinando el número de posiciones en las cuales se
encuentra la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C,
G, U o I) en ambas secuencias para dar como resultado el número de
posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones
emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de
comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el
resultado por 100, para obtener el porcentaje de identidad de
secuencia. El término "identidad sustancial", tal como se
utiliza en la presente invención, denomina una característica de
una secuencia de polinucleótidos, en la que el polinucleótido
comprende una secuencia que tiene, como mínimo, el 85 por ciento de
identidad de secuencia, preferentemente, como mínimo, del 90 al 95
por ciento de identidad de secuencia, más habitualmente, como
mínimo, el 99 por ciento de identidad de secuencia comparada con una
secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de, como
mínimo, 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente sobre una
ventana de, como mínimo, 25-50 nucleótidos, en la
que el porcentaje de identidad de secuencia se calcula mediante la
comparación de la secuencia de referencia con la secuencia de
polinucleótidos que puede contener supresiones o adiciones, las
cuales suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia
sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede
ser un subconjunto de una secuencia más grande.
Además de estas relaciones de secuencias de
polinucleótidos, las proteínas y regiones de proteínas codificadas
por PIV recombinantes también se seleccionan habitualmente para
tener relaciones conservadoras, es decir, para tener identidad de
secuencia sustancial o similitud de secuencia con polipéptidos de
referencia seleccionados. Tal como se aplica a los polipéptidos, el
término "identidad de secuencia" significa que los péptidos
comparten aminoácidos idénticos en posiciones correspondientes. El
término "similitud de secuencia" significa que los péptidos
tienen aminoácidos idénticos o similares (es decir, sustituciones
conservadoras) en posiciones correspondientes. El término
"identidad de secuencia sustancial" significa que dos
secuencias de péptidos, cuando se alinean de forma óptima, tal como
mediante los programas GAP o BESTFIT, mediante pesos de espacios
vacíos por defecto, comparten, como mínimo, el 80 por ciento de
identidad de secuencia, preferentemente, como mínimo, el 90 por
ciento de identidad de secuencia, más preferentemente como mínimo,
el 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, el
99 por ciento de identidad de secuencia). El término "similitud
sustancial" significa que dos secuencias de péptidos comparten
porcentajes correspondientes de similitud de secuencia.
Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas
difieren por sustitución de aminoácidos conservadora. Las
sustituciones de aminoácidos conservadoras se refieren a la
capacidad de intercambio de residuos que tienen cadenas laterales
similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas
laterales alifáticas son la glicina, alanina, valina, leucina e
isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales
alifáticas con grupos hidroxilo son la serina y treonina; un grupo
de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es
la asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen
cadenas laterales aromáticas es la fenilalanina, tirosina y
triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales
básicas es la lisina, arginina e histidina; y un grupo de
aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la
cisteína y metionina. Los grupos de sustituciones de aminoácidos
conservadoras preferentes son:
valina-leucina-isoleucina,
fenilalanina-tirosina,
lisina-arginina, alanina-valina, y
asparagina-glutamina. Las abreviaturas para los 20
aminoácidos naturales utilizados en la presente invención siguen el
uso convencional (Inmunología - Síntesis ("Immunology - A
Synthesis") (2ª ed., E.S. Golub & D. R. Gren, editores,
Sinauer Associates, Sunderlands,
MA, 1991)).
MA, 1991)).
Los estereoisómeros (por ejemplo,
D-aminoácidos) de los 20 aminoácidos convencionales,
aminoácidos no naturales, tales como los aminoácidos
\alpha,\alpha-disustituidos, los
N-alquilo aminoácidos, el ácido láctico y otros
aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes
adecuados para polipéptidos de la presente invención. Entre algunos
ejemplos de aminoácidos no convencionales se incluyen:
4-hidroxiprolina,
\gamma-carboxiglutamato,
\varepsilon-N,N,N-trimetillisina,
\varepsilon-N-acetillisina, O-
fosfoserina, N-acetilserina,
N-formilmetionina, 3-metilhistidina,
5-hidroxilisina,
\omega-N-metilarginina, y otros
aminoácidos similares (por ejemplo,
4-hidroxiprolina). Además, los aminoácidos se pueden
modificar por glicosilación, fosforilación y similares.
Para seleccionar virus candidatos a vacuna el
criterio de viabilidad, atenuación e inmunogenicidad se determinan
según métodos bien conocidos. Los virus que serán más deseados para
vacunas de la presente invención deben mantener la viabilidad,
tener un fenotipo de atenuación estable, mostrar replicación en un
huésped inmunizado (aunque a niveles inferiores), y provocar, de
forma efectiva, la producción de una respuesta inmune en un
vacunado, suficiente para conferir protección contra enfermedades
graves causadas por la infección posterior de virus de tipo
salvaje. Los PIVs recombinantes de la presente invención no sólo son
viables y están atenuados más adecuadamente que los candidatos a
vacuna anteriores, sino que son más estables genéticamente y
mantienen la capacidad para estimular in vivo una respuesta
inmune protectora y, en algunos ejemplos, para expandir la
protección proporcionada mediante modificaciones múltiples, por
ejemplo, inducen protección frente a diferentes cepas o subgrupos
virales, o protección mediante una base inmunológica diferente, por
ejemplo, inmunoglobulinas secretoras frente a las séricas,
inmunidad celular, y similares.
Los PIVs recombinantes se pueden examinar según
varios modelos in vivo e in vivo bien conocidos y
generalmente aceptados para confirmar la atenuación adecuada, la
resistencia a reversión fenotípica y la inmunogenicidad para el uso
como vacuna. En ensayos in vitro, el virus modificado (por
ejemplo, un PIV de origen biológico o recombinante con múltiple
atenuación) se analiza, por ejemplo, según la sensibilidad a la
temperatura de la replicación del virus, es decir, el fenotipo ts,
y según la placa pequeña y otros fenotipos deseados. Los virus
modificados también es analizan en modelos animales de infección por
PIV. Se han descrito una variedad de modelos animales y se resumen
en varias referencias en la presente invención. Los sistemas modelo
de PIV, entre los que se incluyen roedores y primates no humanos,
para la evaluación de la atenuación y de la actividad inmunogénica
de candidatos a vacuna de PIV, se han aceptado ampliamente en la
técnica, y los datos obtenidos presentan una buena correlación con
la infección por PIV, atenuación e inmunogenicidad en humanos.
Según la descripción anterior, existen
composiciones virales descritas de PIV aislado, recombinante,
infeccioso para su uso como vacuna. El virus atenuado, que es un
componente de una vacuna, se encuentra en una forma aislada y
habitualmente purificada. Mediante aislado se pretende hacer
referencia a un PIV que se encuentra en un entorno diferente al
nativo de un virus de tipo salvaje, tal como el nasofaríngeo, de un
individuo infectado. De forma más general, mediante aislado se
pretende incluir el virus atenuado como un componente de un cultivo
celular u otro medio artificial, en el que se puede propagar y
caracterizar en un escenario controlado. Por ejemplo, los PIV
atenuados se pueden producir mediante un cultivo celular infectado,
separado del cultivo celular y añadido a un estabilizador.
Para el uso como vacuna, el PIV recombinante se
puede utilizar directamente en formulaciones de vacuna o
liofilizado, tal como se desee, mediante protocolos de
liofilización bien conocidos por el experto en la materia. Los virus
liofilizados se mantendrán, habitualmente, a 4ºC aproximadamente.
Cuando está listo para su uso, el virus liofilizado se reconstituye
en una solución estabilizante, por ejemplo, salino, SPG, Mg^{++} y
HEPES, con o sin adyuvante, tal como se describe más adelante.
Las vacunas de PIV contienen, como ingrediente
activo, una cantidad efectiva inmunogénicamente de PIV producido
tal como se describe en la presente invención. El virus modificado
se puede introducir en un huésped con un transportador y/o
adyuvante fisiológicamente aceptable. En la técnica son conocidos
transportadores adecuados y se incluyen, por ejemplo, agua, agua
tamponada, salino al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y
similares. Las soluciones acuosas resultantes se pueden envasar
para su utilización tal como se encuentran o liofilizadas,
combinándose la preparación liofilizada con una solución estéril
previamente a la administración, tal como se ha mencionado
anteriormente. Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares farmacéuticamente aceptables, tal como se requiere para
la aproximación a condiciones fisiológicas, tales como el ajuste del
pH y agentes de tamponado, agentes de ajuste de tonicidad, agentes
humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de
sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio,
monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina y similares.
Entre adyuvantes aceptables se incluyen el adyuvante Freund
incompleto, MPL^{TM} (monofosforil lípido A
3-o-desacilado; RIBI ImmunoChem
Research, Inc., Hamilton, MT) e IL-12 (Genetics
Institute, Cambridge MA), entre otros muchos adyuvantes adecuados
bien conocidos en la técnica.
Tras la inmunización con una composición de PIV,
tal como se describe en la presente invención, a través de una
aerosol, por goteo, por vía oral, por vía tópica u otra ruta, el
sistema inmune del huésped responde a la vacuna mediante la
producción de anticuerpos específicos para proteínas de virus PIV,
por ejemplo, glicoproteínas F y HN. Como resultado de la vacunación
con una cantidad efectiva inmunogénicamente de PIV producido tal
como se describe en la presente, el huésped se vuelve, como mínimo,
parcial o completamente inmune a la infección por PIV, o resistente
al desarrollo de infección por PIV grave o moderada, en particular,
del tracto respiratorio inferior.
El huésped al cual se administran las vacunas
puede ser cualquier mamífero que sea susceptible a la infección por
PIV, o un virus estrechamente relacionado y este huésped es capaz de
generar una respuesta inmune protectora a los antígenos de la cepa
de vacunación. Por consiguiente, se proporcionan métodos para crear
vacunas para una variedad de usos humanos y veterinarios.
Las composiciones de vacuna que contienen el PIV
se pueden administrar a un huésped susceptible o, de otra manera,
con riesgo de infección por PIV, para potenciar las propias
capacidades de respuesta inmune del huésped. Tal cantidad se define
como la "dosis efectiva inmunogénicamente". En este uso, la
cantidad precisa de PIV que debe administrarse en una dosis
efectiva dependerá del estado de salud del huésped y su peso, el
modo de administración, la naturaleza de la formulación, etc. pero
generalmente oscilará entre 10^{3} aproximadamente y 10^{7}
unidades formadoras de placa (PFU) o más virus por huésped, más
comúnmente, desde 10^{4} aproximadamente a 10^{6} PFU virus por
huésped. En cualquier caso, las formulaciones de vacuna deberán
proporcionar una cantidad de PIV modificado suficiente para
proteger efectivamente el paciente huésped contra la infección por
PIV grave o que supone una amenaza para la vida.
El PIV se puede combinar con virus de otros
serotipos o cepas de PIV para conseguir protección frente a
múltiples serotipos o cepas de PIV. De forma alternativa, la
protección frente múltiples serotipos o cepas de PIV se puede
conseguir mediante la combinación de epítopos protectores de
múltiples serotipos o cepas sometidos a la ingeniería genética en
un virus, tal como se describe en la presente invención.
Habitualmente, cuando se administran diferentes virus estarán en
una mezcla y se administrarán simultáneamente, pero también se
pueden administrar por separado. La inmunización con una cepa puede
proteger contra diferentes cepas del mismo o diferente
serotipo.
En algunos ejemplos puede ser deseable combinar
las vacunas de PIV con vacunas que inducen respuestas inmunes
protectoras a otros agentes, en particular otros virus infantiles.
En otro ejemplo, el PIV se puede utilizar como un vector para
antígenos protectores de otros patógenos, tales como el virus
sincitial respiratorio (RSV) o el virus del sarampión, mediante la
incorporación de secuencias que codifican esos antígenos protectores
en el genoma o antigenoma de PIV que se utiliza para producir PIV
infecciosos, tal como se describe en la presente invención.
En todos los individuos, la cantidad precisa de
vacuna de PIV recombinante administrada, y el momento y repetición
de la administración, se determinarán en base al estado del paciente
de salud y peso, el modo de administración, la naturaleza de la
formulación, etc. Las dosis oscilarán habitualmente entre 10^{3}
aproximadamente y 10^{7}, aproximadamente, unidades formadoras de
placa (PFU) o más virus por paciente, más comúnmente desde 10^{4}
aproximadamente a 10^{6} PFU virus por paciente. En cualquier
caso, las formulaciones de vacuna deberán proporcionar una cantidad
de PIV atenuado suficiente para estimular o inducir efectivamente
respuesta inmune anti-PIV, por ejemplo, tal como se
puede determinar mediante fijación complementaria, neutralización de
placa y/o ensayo inmunoabsorbente de unión a enzima
("enzyme-linked immunosorbent assay"), entre
otros métodos. En este sentido, los individuos también se controlan
para detectar señales y síntomas de enfermedad del sistema
respiratorio superior. Igual que en la administración a chimpancés,
el virus atenuado de la vacuna crece en la nasofaringe de los
vacunados a niveles aproximadamente 10 veces o más inferiores que el
virus de tipo salvaje, o aproximadamente 10 veces o más inferior
cuando se compara con niveles de PIV atenuado de forma
incompleta.
En neonatos y lactantes, puede requerirse que la
administración múltiple provoque niveles suficientes de inmunidad.
La administración debería comenzar en el primer mes de vida, y a
intervalos durante la infancia, tales como a los dos meses, seis
meses, un año y dos años, al ser necesario mantener niveles
suficientes de protección frente a la infección por PIV nativos (de
tipo salvaje). De forma similar, los adultos que son particularmente
susceptibles a infecciones por PIV repetidas o graves, tales como,
por ejemplo, trabajadores del sector sanitario, trabajadores de
guarderías, familiares de niños pequeños, ancianos, individuos con
la función cardiopulmonar comprometida, pueden requerir
inmunizaciones múltiples para establecer y/o mantener repuestas
inmunes protectoras. Se pueden controlar los niveles de inmunidad
inducida mediante la medición de cantidades de anticuerpos
neutralizantes secretores y séricos, y se pueden ajustar las dosis
o repetir las vacunaciones tal como sea necesario para mantener los
niveles deseados de protección. Además, diferentes tipos de virus de
vacuna pueden ser indicados para la administración a grupos
receptores. Por ejemplo, una cepa sometida a ingeniería genética que
expresa una citoquina o una proteína adicional rica en epítopos de
células T puede ser particularmente ventajosa para adultos, más que
para lactantes.
Los PIV se pueden combinar con virus que
expresan antígenos de otro subgrupo o cepa de PIV para conseguir
protección frente a múltiples subgrupos o cepas de PIV. De forma
alternativa, el virus de vacuna puede contener epítopos protectores
de múltiples cepas o subgrupos de PIV sometidos a ingeniería
genética en un clon de PIV, tal como se describe en la presente
invención.
Las vacunas de PIV de la presente invención
provocan la producción de una respuesta inmune que es protectora
frente la enfermedad grave del tracto respiratorio inferior, tal
como neumonía y bronquiolitis cuando el individuo se infecta
posteriormente con un PIV de tipo salvaje. Mientras el virus
circulante todavía es capaz de causar infección, en particular, en
el tracto respiratorio superior, existe una muy altamente reducida
posibilidad de rinitis, como resultado de la vacunación y posible
aumento de la resistencia, por infección posterior por el virus de
tipo salvaje. Después de la vacunación existen niveles detectables
de anticuerpos séricos y secretores engendrados en huéspedes que
son capaces de neutralizar virus de tipo salvaje homólogos (del
mismo subgrupo) in vitro e in vivo. En muchos
ejemplos, los anticuerpos también neutralizarán virus de tipo
salvaje de un subgrupo diferente, no incluido en la vacuna.
Los candidatos a vacuna de PIV preferentes
muestran una disminución muy sustancial de virulencia cuando se
comparan con un virus de tipo salvaje que circula naturalmente en
humanos. El virus está suficientemente atenuado como para que los
síntomas de la infección no tengan lugar en la mayor parte de los
individuos inmunizados. En algunos ejemplos el virus atenuado puede
todavía ser capaz de diseminación en los individuos no vacunados.
Sin embargo, su virulencia está suficientemente abrogada como para
que no tengan lugar infecciones graves del tracto respiratorio
inferior en los huéspedes vacunados o accidentales.
El nivel de atenuación de los candidatos a
vacuna de PIV se puede determinar mediante, por ejemplo, la
cuantificación de la cantidad de virus presente en el tracto
respiratorio de un huésped inmunizado y la comparación de la
cantidad producida en él por el PIV de tipo salvaje u otros PIV
atenuados que se han analizado como cepas candidatas a vacuna. Por
ejemplo, el virus atenuado tendrá un grado superior de restricción
de replicación en el tracto respiratorio superior de un huésped
altamente susceptible, tal como un chimpancé, comparado con los
niveles de replicación de un virus de tipo salvaje, por ejemplo, de
10 a 1000 veces menor. Para reducir más el desarrollo de rinorrea,
que está asociada con la replicación del virus en el tracto
respiratorio superior, un virus candidato a vacuna ideal debería
mostrar un nivel restringido de replicación tanto en el tracto
respiratorio superior como inferior. Sin embargo, los virus
atenuados deben ser suficientemente infecciosos e inmunogénicos en
humanos para conferir protección en individuos vacunados. Los
métodos para la determinación de niveles de PIV en la nasofaringe
de un huésped infectado son bien conocidos en la literatura.
Los niveles de inmunidad inducida proporcionados
por las vacunas también se pueden controlar mediante las mediciones
de cantidades de anticuerpos secretores y séricos neutralizantes. En
base a estas medidas, las dosis de vacunas se pueden ajustar o las
vacunaciones se pueden repetir tal como sea necesario para mantener
los niveles de protección deseados. Además, diferentes virus de
vacuna pueden ser ventajosos para diferentes grupos receptores. Por
ejemplo, una cepa de PIV sometida a ingeniería genética que expresa
una proteína adicional rica en epítopos de células T puede ser
particularmente ventajosa para adultos más que para niños.
Todavía en otro ejemplo, el PIV se utiliza como
vector para terapia génica transitoria del tracto respiratorio.
Según esto, el genoma o antigenoma de PIV recombinante contiene una
secuencia que es capaz de codificar un producto génico de interés.
El producto génico de interés está bajo el control del mismo
promotor o de uno diferente a ése, que controla la expresión de
PIV. El PIV de infección producido por el genoma o antigenoma de
PIV recombinante con las proteínas N, P, L y otras proteínas de PIV
deseadas, y que contienen una secuencia que codifica el producto
génico de interés, se puede administrar a un paciente. La
administración se realiza habitualmente mediante aerosol,
nebulizador u otra aplicación tópica al tracto respiratorio del
paciente que se está tratando. El PIV recombinante se administra en
una cantidad suficiente para dar como resultado la expresión de
niveles terapéuticos y profilácticos del producto génico deseado.
Los productos génicos representativos que se pueden administrar
según este método son adecuados preferentemente para la expresión
transitoria, y entre ellos se incluyen, por ejemplo,
interleuquina-2, interleuquina-4,
interferón gamma, GM-CSF, G-CSF,
eritropoyetina y otras citoquinas, glucocerebrosidasa, fenilalanina
hidroxilasa, regulador de la conductancia transmembranal de la
fibrosis cística (CFTR), hipoxantina-guanina
fosforribosil transferasa, citotoxinas, genes supresores de
tumores, ARNs sin sentido y antígenos de vacunas.
Se proporcionan los siguientes ejemplos a modo
de ilustración, no de limitación. Estos ejemplos documentan la
utilización de un sistema de ADNc recombinante para introducir una
mutación representativa dentro del ORF C que silencia completamente
su expresión. Como representativas también de la presente invención,
se construyeron y examinaron mutaciones que implican la
introducción de codones de terminación en los ORFs D y V para
silenciar la expresión de las proteínas correspondientes. Se
documentan los efectos de estas mutaciones sobre la replicación y
patogénesis viral, y, por consiguiente, se establece la utilidad de
estas mutaciones en el desarrollo de una vacuna viva atenuada
contra el PIV.
En un virus mutante que se describe a
continuación, designado como rC-KO, se abroga
la expresión de la proteína C mediante el cambio del codón C de
iniciación de metionina a treonina y la introducción de dos codones
de terminación en las posiciones de aminoácidos 7 y 26 del ORF C.
En un segundo virus mutante, el rC-KO mutante
está altamente atenuado in vivo e in vivo, tal como
se demuestra mediante la utilización tanto de modelos murino como
primates. El rC-KO confirió además protección
sustancial contra el ataque con HPIV3 de tipo salvaje.
Aunque la interrupción de los ORFs D y V
individualmente no afectó significativamente a la replicación del
virus in vitro o in vivo, la interrupción de ambos a
la vez atenuó la replicación in vivo. Estos resultados
indican que cada una de las proteínas C, D y V del HPIV3 tienen una
función en la replicación del virus, y que las mutaciones de
ejemplo definen armas poderosas para desarrollar candidatos a vacuna
de PIVs recombinantes.
Se mantuvieron en OptiMEM 1 (Life Technologies,
Gaithersburg, MD) cultivos monocapa de células humanas
HEp-2 y LLC-MK2 de simio,
complementados con suero bovino fetal al 2%, sulfato de gentamicina
(50 mg/ml), y glutamina 4 mM. El virus recombinante de la cepa
modificada de vacunas Ankara (MVA) que expresa la ARN polimerasa del
bacteriófago T7 fue proporcionado generosamente por los Drs. L.
Wyatt y B. Moss (Wyatt y otros, Virology
210:202-205, 1995). La cepa JS de tipo
salvaje (wt) del PIV3 y su derivado ts atenuado, JS cp45, se
propagaron en las células LLC-MK2 tal como se ha
descrito anteriormente (Hall y otros, Virus Res.
22:173-184, 1992)).
El clon de ADNc de longitud completa que
codifica el antigenoma de 15462 nt completo
{p3/7(131)2G} del virus JS wt se ha descrito
anteriormente (Acceso al Genebank #Z11575) [Durbin y otros,
Virology 235:323-332, 1997; véase
también, la Solicitud de Patente U.S.A. No. 09/083.793, presentada
el 22 de mayo de 1998; Solicitud de Patente Provisional U.S.A. No.
60/047.575, presentada el 23 de mayo de 1997 (correspondientes a la
Publicación de Patente Internacional No. WO 98/53078), y la
Solicitud de Patente Provisional U.S.A. No. 60/059, presentada el 19
de septiembre de 1997)].
Este clon se utilizó como patrón para la
construcción de cuatro ADNcs mutados, uno en el que la expresión
del ORF C se abrogó completamente, un segundo y un tercero en los
que se suprimió individualmente la expresión de los marcos de
lectura D y V, y un cuarto en el que se combinaron las mutaciones en
los marcos de lectura D y V (Tabla 1, figura 1).
El fragmento de Pm1 I a BamHI de
p3/7(131)2G (nt 1215-3903 del
antigenoma de PIV3) se subclonó dentro del plásmido
pUCl19{pUCl19(Pm1I-BamHI)} que se había
modificado para incluir un sitio PmlI en la región de clonación
múltiple. A continuación, se llevó a cabo una mutagénesis orientada
a sitio en el pUC119 (PmlI-BamHI) utilizando el
método de Kunkel (Kunkel y otros, Methods Enzymol.
154:367-382, 1987) para introducir mutaciones
en los ORFs C, D y V, que se describen a continuación.
Se utilizaron dos cebadores para introducir las
mutaciones que silenciarían la expresión del ORF C (véase la Tabla
1, figura 1C). El primer cebador mutagénico cambió el codón de
iniciación del ORF C de ATG a ACG (de metionina a treonina)
mediante la modificación de la posición nt
1795(T\rightarrowC) del antigenoma de longitud completa, y
cambió la posición de aminoácido 7 del ORF C de serina a un codón de
terminación mediante la modificación de la posición nt
1813(C\rightarrowA). El segundo cebador mutagénico
sustituyó la serina de la posición de aminoácido 26 del ORF C por
un codón de terminación mediante el cambio de la posición nt 1869
de C a A. Estas mutaciones introducidas dentro del ORF C fueron
silenciosas en el ORF P.
Se introdujeron mutaciones que interrumpirían la
expresión tanto del ORF D como del V, individualmente. El cebador
del knock out en D introdujo cambios de C a A en las posiciones nt
2692, 2695, y 2698 del antigenoma de longitud completa (Tabla 1,
figura 1). Estas mutaciones puntuales crearon tres codones de
terminación consecutivos en el supuesto ORF D que darían como
resultado la terminación prematura de la proteína D después del
codón 303, en la proteína D quimérica de 372 aminoácidos mostrada
en la figura 1C. No fue posible introducir anteriormente estos
codones de terminación en el D ORF sin provocar un cambio simultáneo
en la codificación del ORF P. Por lo tanto, la expresión del ORF
mutado no se abroga completamente sino que produciría una proteína D
truncada que contiene los 241 aminoácidos el extremo
N-terminal de P fusionados a 62 aminoácidos del
dominio D, en lugar de los 131. El cebador mutagénico de knock out
en V introdujo dos mutaciones puntuales en las posiciones nt 2845
(de A a T) y 2854 (de C a T) del antigenoma de longitud completa
(Tabla 1). Estas mutaciones crearon codones de terminación
prematura (posiciones de aa 17 y 20) en el supuesto ORF V. Estas
mutaciones fueron silenciosas en el ORF P, pero introdujeron dos
sustituciones de aminoácidos en la proteína D, en concreto Q354L y
A357V. Ambos cebadores se utilizaron conjuntamente en una reacción
única de mutagénesis para crear las mutaciones knock out combinadas
DV.
El fragmento de PmII a BamHI de cada uno de los
clones de longitud completa se secuenció en su totalidad para
confirmar la presencia de las mutaciones introducidas y para
confirmar que no se habían introducido otras mutaciones por
accidente. A continuación, estos fragmentos se clonaron
separadamente de nuevo dentro del clon de longitud completa
p3/7(131)2G, tal como se ha descrito anteriormente
(Durbin y otros, Virology 235:
323-332, 1997) para crear los cuatro clones de
ADNc antigenómicos diferentes.
Los ADNcs antígenómicos de longitud completa que
contenían alguna de las mutaciones knock out en C, D, V, o DV se
transfectaron dentro de las células HEp-2 en placas
de seis pocillos (Costar, Cambridge, MA) junto con los plásmidos de
apoyo {pTM(N), pTM(P no C), y pTM(L)} mediante
la utilización de LipofectACE (Life Technologies) y las células se
infectaron simultáneamente con MVA-T7, tal como se
ha descrito anteriormente en Durbin y otros, Virology
235:323-332, 1997; véase también, la
Solicitud de Patente U.S.A. No. de serie 09/083.793, presentada el
22 de mayo de 1998; Solicitud Provisional de Patente U.S.A. No.
60/047.575, presentada el 23 de mayo de 1997 (correspondientes a la
Publicación de Patente Internacional No. WO 98/53078), y la
Solicitud de Patente U.S.A. Provisional No. 60/059,385, presentada
el 19 de septiembre de 1997). El pTM(P no C) es idéntico al
plásmido pTM(P) descrito anteriormente (Id.) con la
excepción de que el sitio de inicio de traducción C se había mutado
de ATG a ACG, cambiando el primer aminoácido en el ORF C de
metionina a treonina. Después de la incubación a 32ºC durante tres
días, el cultivo de transfección se pasó a una monocapa de células
LLC-MK2 nueva en un frasco T25 y se incubó durante
5 días a 32ºC (designado como el pasaje 1). La cantidad de virus
presente en las recolecciones de knock out en D, V, y DV del pasaje
1 se determinó mediante la titulación de placas de los cultivos
monocapa de LLC-MK2 con placas visualizadas por
tinción con inmunoperoxidasa con anticuerpos monoclonales
específicos de HN de PIV3, tal como se ha descrito anteriormente
(Id.). Se observó que el virus knock out en C creció
pobremente y, por lo tanto, su cultivo del pasaje 1 se amplificó
posteriormente mediante un segundo pasaje en una monocapa de
células LLC-MK2 en un frasco T75.
La cantidad de virus presente en la recolección del pasaje 2 se determinó tal como se ha descrito anteriormente.
La cantidad de virus presente en la recolección del pasaje 2 se determinó tal como se ha descrito anteriormente.
A continuación, los virus de knock out en D, V,
y DV presentes en los sobrenadantes del cultivo de pasaje 1 se
purificaron en placa tres veces en células LLC-MK2,
tal como se ha descrito anteriormente (Hall y otros, Virus
Res. 22: 173-184, 1992).
El virus knock out en C no se pudo clonar
biológicamente mediante purificación en placa dado que fue incapaz
de formar placas identificables de forma sencilla. Por lo tanto,
éste se diluyó finalmente utilizando diluciones de dos veces en
placas de 96 pocillos (12 pocillos por dilución) de células
LLC-MK2. A continuación, los virus recombinantes
clonados biológicamente de la tercera ronda de purificación en placa
o de la dilución final se amplificaron dos veces en células
LLC-MK2 a 32ºC para producir virus para una
caracterización posterior.
El virus se concentró del medio clarificado de
monocapas de células infectadas mediante precipitación con
polietilen glicol, tal como se ha descrito anteriormente (Durbin y
otros, Virology 235:323-332, 1997). El
ARN se purificó con reactivo de TRIzol (LifeTechnologies) mediante
el procedimiento recomendado por el fabricante. Se llevó a cabo la
RT-PCR con el equipo Advantage
RT-for-PCR (Clontech, Palo Alto, CA)
siguiendo el protocolo recomendado. Las reacciones de control
fueron idénticas, excepto en que se omitió la transcriptasa inversa
de la reacción para confirmar que los productos de la PCR se
obtuvieron solamente a partir del ARN viral y no a partir de
posibles ADNc contaminantes. Se utilizaron cebadores para generar el
fragmento de PCR que se extiende de los nucleótidos
1595-3104 del antigenoma de longitud completa. Este
fragmento incluye los ORFs C, D y V completos de los virus
recombinantes. A continuación, los productos de PCR resultantes se
secuenciaron utilizando el análisis de secuencia con
dideoxinucleótidos mediante ciclos (New England Biolabs, Beverly,
MA).
Se hicieron crecer dos antisueros específicos de
C de PIV3 en conejos mediante la técnica de péptido antigénico
múltiple (MAP) contra dos péptidos C diferentes (Research Genetics,
Huntsville, AL). Los dos péptidos se extendían en las regiones de
los aminoácidos 30-44 y 60-74 de la
proteína C. Se introdujeron ocho copias de cada uno de los péptidos
C en un núcleo transportador ramificado y se inyectaron
separadamente en los conejos (dos conejos por péptido) con un
adyuvante de Freund. Los conejos se estimularon con el MAP diseñado
a las 2 y 4 semanas y se les extrajo sangre a las 4, 8, y 10
semanas. Cada uno de los antisueros reconoció el péptido C
utilizado como inmunógeno en una elevada titulación y precipitó la
proteína C de las células infectadas por HPIV3 en un ensayo de
radioinmunoprecipitación (RIPA). De forma similar, los presentes
inventores intentaron producir antisueros contra las proteínas D y
V, pero no se tuvo éxito; los antisueros que crecieron fueron de
baja titulación contra el péptido en sí mismo, y fueron incapaces de
detectar las proteínas D o V producidas supuestamente mediante
células infectadas con virus de tipo salvaje.
Se infectaron monocapas celulares T25 de células
LLC-MK2 a una multiplicidad de infección (MOI) de 5,
bien con rC-KO, con virus JS wt recombinante
(rJS) o bien se simuló su infección y se incubaron a 32ºC. A
las 24 horas después de la infección, la monocapa se lavó con DMEM
sin metionina (Life Technologies) y se incubó en presencia de 10
\muCi/u de metionina ^{35}S en DMEM sin metionina durante 6
horas más. A continuación, las células se recolectaron, se lavaron
3 veces, y se resuspendieron en 1 ml de solución tampón de RIPA
{deoxicolato sódico al 1% (p/v), Triton X-100 al 1%
(v/v), SDS al 0,2% (p/v), NaCl 150 mM, Tris-HCl 50
mM, pH 7,4}, se sometieron a ciclos de congelación y descongelación
y se peletizaron a 6500 x g. El extracto celular se transfirió a un
tubo eppendorf nuevo y se añadió una mezcla de ambos antisueros C (5
\mul de cada uno) a cada una de las muestras y se incubaron con
agitación constante durante 2 horas a 4ºC. Se añadieron 10 \mul de
una mezcla de mAb 454/11 y 101/1, que reconoce la glicoproteína HN
de HPIV3 (van Wyke Coelingh y otros, J Virol. 61:
1473-1477, 1987), a cada una de las muestras, para
confirmar que el virus recuperado era efectivamente HPIV3. Los
complejos inmunes se precipitaron mediante la adición de 200 \mul
de una suspensión al 10% de microesferas de proteína
A-sefarosa (Sigma, St. Louis, MO) a cada una de las
muestras seguido de agitación constante a 4ºC durante toda la
noche. Cada una de las muestras se desnaturalizó, se redujo, y se
analizó en un gel de poliacrilamida al 4-12%
(NuPAGE, Novex, San Diego, CA) según las recomendaciones del
fabricante. El gel se secó y analizó mediante autorradiografía.
Se infectaron monocapas de células
LLC-MK2 en frascos T25 por duplicado con
rCKO, rDV-KO, o rJS a una MOI
de 0,01 y se incubaron a 32ºC en CO_{2} al 5%. Se extrajeron
muestras de 250 \mul de cada uno de los frascos a intervalos de
24 horas durante 7 días consecutivos y se congelaron súbitamente. Se
sustituyó por un volumen equivalente de medio fresco en cada uno de
los puntos temporales. Se tituló cada una de las muestras en
monocapas celulares LLC-MK2 en placas de 96
pocillos incubadas durante 7 días a 32ºC. El virus se detectó
mediante hemadsorción y se describió como
log_{10}TCID_{50}/ml.
Se inocularon intranasalmente hámsteres sirios
dorados de 4-6 semanas de edad, en grupos de 21, con
0,1 ml de EMEM (Life Technologies) por animal, que contiene
10^{5} PFU de rC-KO,
rDV-KO, rJS, cp45 (el derivado
del virus JS wt de vida atenuada de origen biológico), o bien de
virus sincitial respiratorio (RSV). En los días 3, 4 y 5 después de
la inoculación, se sacrificaron 5 hámsteres de cada uno de los
grupos, excepto aquéllos que recibieron el RSV, y se cultivaron los
pulmones y los cornetes nasales. Los cornetes nasales y los pulmones
se homogeneizaron para preparar una suspensión al 10% o al 20% p/v
en L-15 (Quality Biologicals, Gaithersburg, MD)
respectivamente, y las muestras se congelaron rápidamente. Los virus
presentes en las muestras se titularon en placas de 96 pocillos de
monocapas celulares de LLC-MK2 incubadas durante 7
días a 32ºC. Se detectaron los virus mediante hemadsorción y se
calculó el log_{10}TCID_{50}/g medio de cada uno de los días
para cada una de los grupos de cinco hámsteres. Se recogieron
sueros de los 6 hámsteres restantes en cada uno de los grupos, los
días 0 y 28 después de la inoculación. Se evaluaron las respuestas
de anticuerpos del suero a cada uno de los virus mediante el ensayo
inhibición de la hemoaglutinación (HAI), tal como se ha descrito
anteriormente (van Wyke Coelingh y otros, Virology
143:569-582, 1985). En el día 28 los
hámsteres restantes en cada uno de los grupos, incluyendo los
inmunizados con RSV, se desafiaron intranasalmente con 10^{6} PFU
de virus PIV3 JS wt de origen biológico. Los animales se
sacrificaron el día 4 después del ataque y los pulmones y cornetes
nasales se cultivaron y procesaron tal como se ha descrito
anteriormente. La cantidad de virus presente en las muestras del
ataque se determinó tal como se ha descrito anteriormente. Se llevó
a cabo un estudio por separado en el que se administró a los
hámsteres rD-KO y rV-KO, tal
como se ha descrito anteriormente, excepto en que los animales no
fueron objeto del ataque.
Se inocularon monos verdes africanos (AGMs) con
10^{6} PFU de rC-KO,
rDV-KO, JSwt, o de cp45 intranasal e
intratraquealmente cada uno, en grupos de 4 animales tal como se
había descrito para estudios anteriores en monos Rhesus (Durbin y
otros, Vaccine 16:1324-30, 1998). Se
recogieron muestras de frotis nasofaríngeo diariamente durante 12
días consecutivos después de la inoculación y se recogieron muestras
de lavado traqueal los días 2, 4, 6, 8, y 10 después de la
inoculación. Los especímenes se congelaron súbitamente y se
almacenaron a -70ºC hasta que se hubieron recogido todos los
especimenes. Se titularon los virus presentes en las muestras en
monocapas celulares de LLC-MK2 en placas de 96
pocillos incubadas durante 7 días a 32ºC. Se detectaron los virus
mediante hemadsorción y se calculó el log_{10}TCID_{50}/ml medio
para cada uno de los días. Se recogió suero de cada uno de los
monos los días 0 y 28, y se determinó la respuesta de anticuerpos
HAI frente a PIV3 a la infección experimental con los diferentes
mutantes y con el PIV3 de tipo salvaje (JS). El día 28 después de
la inoculación, los AGMs se desafiaron con 10^{6} PFU del virus
PIV3 de tipo salvaje de origen biológico administrados en un 1 ml
de inóculo intranasal e intratraquealmente. Se recogieron muestras
de frotis nasofaríngeo los días 0, 1, 2, 4, 6, 8,10, y 12 después
del ataque y se recogieron muestras de lavados traqueales los días
2, 4, 6, 8, y 10 después del ataque. Los especímenes se congelaron
súbitamente, se almacenaron, y los virus presentes se titularon tal
como se ha descrito anteriormente.
Se prepararon ADNcs antígenómicos de HPIV3 para
codificar los siguientes cuatro virus mutantes (véase la Tabla 1,
figura 1): (i) rC-KO, en el que se había
modificado el ORF C para cambiar el codón de iniciación de M a T y
para introducir paradas de traducción en los codones 7 y 26; (ii)
rD-KO, en el que las paradas de traducción
se introdujeron en los codones 304, 305 y 306 en la proteína D
quimérica de 372 aminoácidos; (iii) rV-KO,
en el que se introdujeron codones de terminación en las posiciones
17 y 20 en el ORF V; y (iv) rDV-KO, en el
que se combinaron las mutaciones en ii y iii. Cada una de las
mutaciones fueron de traducción silenciosa en los ORFs que se
solapan, excepto en el caso de los dos codones de terminación
introducidos dentro del ORF V (iii), que dieron como resultado dos
sustituciones de aminoácidos en D, en concreto Q354L y A357V, que no
pudieron evitarse. Además, los codones de terminación en D no se
introdujeron antes en el ORF, dado que éstos hubieran modificado a
P. Cada una de las mutaciones se introdujo junto con un marcador de
sitio de restricción de traducción silenciosa (Tabla 1).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los ADNcs antigenómicos se transfectaron dentro
de las células HEp-2 junto con los tres plásmidos de
PIV3 de apoyo {pTM(P no C), pTM(N), pTM(L)} y
las células se infectaron simultáneamente con MVA que expresa la
ARN polimerasa T7. La eficiencia de recuperación de rPIV3 que
contenía las mutaciones en los ORFs C, D, o V se comparó con la de
un cultivo celular de HEp-2
transfectado-infectado de forma similar, mediante el
p3/7(131) 2G, plásmido que expresa el antigenoma de PIV3 de
longitud completa, cuyo recombinante JSwt PIV3 (rJS) se había
recuperado anteriormente (Durbin y otros, Virology
235:323-332, 1997). Después de incubación
durante 3 días a 32ºC, las células transfectadas se recolectaron, y
cada uno de los sobrenadantes se traspasó a una nueva monocapa de
células LLC-MK2 en un frasco T25 y se incubaron
durante 5 días a 32ºC (pasaje 1). Después de 5 días a 32ºC, las
monocapas de células LLC-MK2 de rJS,
rD-KO, rV-KO, y
rDV-KO mostraron efecto 3-4+
citopático (CPE). El correspondiente pasaje 1 del
rC-KO no mostró o sólo mostró un mínimo CPE.
Dado que no quedó claro si la falta de CPE en la muestra de
rC-KO se debía a un nivel elevado de
restricción de crecimiento del virus mutante o simplemente se debía
a una recuperación inicial muy baja virus, se recolectó el pasaje 1
y el sobrenadante se traspasó a una nueva monocapa de células
LLC-MK2 en un frasco T75 y se incubó durante 7 días
a 32ºC (pasaje 2). La monocapa de células LLC-MK2
en T75 mostró solamente CPE 1-2+ después de 7 días
de incubación, pero la presencia de HPIV3 se confirmó por
hemadsorción. Después de tres rondas de clonación biológica mediante
aislamiento de placa o dilución terminal, cada uno de los mutantes
recombinantes se amplificó dos veces en células
LLC-MK2 para producir una suspensión de virus para
una caracterización posterior.
Para confirmar que los virus recuperados fueran
efectivamente los mutantes rC-KO,
rD-KO, rV-KO, y
rDV-KO esperados, cada uno de los virus
clonados se analizó mediante RT-PCR utilizando una
pareja de cebadores que amplificaron un fragmento de ADN que se
extendía entre nt 1595-3104 del antigenoma de HPIV3,
que incluye la parte del gen P que contiene los ORFs C, D, y V. La
generación de cada uno de los productos de PCR dependió de la
inclusión de RT, indicando que cada uno se obtuvo a partir del ARN
y no del ADNc contaminado. A continuación, los productos de PCR de
rC-KO, rD-KO,
rV-KO, y rDV-KO se
digirieron con los enzimas de restricción introducidos como
marcadores (Tabla 1), y se confirmó la presencia de los sitios de
enzimas de restricción. Se realizó además la secuenciación de los
nucleótidos de los productos de RT-PCR para
confirmar la presencia de las mutaciones introducidas. Se confirmó
que todas las mutaciones introducidas estaban presentes en el
fragmento de RT-PCR que se extendía entre nt
1595-3104 amplificado a partir de cada uno de los
recombinantes clonados, y no se encontraron en este fragmentos
otras mutaciones accidentales.
Para confirmar que efectivamente se había
silenciado el ORF C, se llevaron a cabo ensayos de
radioinmunoprecipitación (RIPA) para comparar el virus
rC-KO mutante con el virus rJS wt. Se
infectaron células, se incubaron en presencia de metionina ^{35}S
de 24 a 30 h después de la infección, y se prepararon lisados
celulares. Se incubaron cantidades equivalentes de la proteína
total con anticuerpos anti-C y
anti-HN y, a continuación, el anticuerpo se enlazó
a microesferas de proteína A sefarosa. El rJS wt codificó
tanto las proteínas HN como las C mientras que el
rC-KO no pudo expresar la proteína C (figura
3).
Cultivos duplicados de monocapas de células
LLC-MK2 se infectaron con
rC-KO, rDV-KO o
rJS a una MOI de 0,01 y se incubaron durante 7 días a 32ºC.
Se recogieron muestras de medio de cada una de los cultivos a
intervalos de 24 horas y se tituló este material posteriormente
para evaluar la replicación de cada uno de los virus en los
cultivos celulares. La replicación del rDV-KO
fue esencialmente indistinguible de la del rJS wt parental,
con respecto tanto a la velocidad de producción de virus como al
pico de la titulación (figura 3), así como a la capacidad para
replicarse a temperatura elevada (datos no mostrados). Por contra,
el virus rC-KO se replicó más lentamente y
alcanzó un pico de titulación el día 6 que fue de 100 a 1.000 veces
inferior que el del rJS. De este modo, la ausencia de
expresión de la proteína C tuvo un efecto significativo en la
replicación del virus en cultivos celulares.
A continuación, los presentes inventores
compararon la capacidad de los virus mutantes y del rJS wt
parental para replicarse en el tracto respiratorio superior e
inferior de hámsteres. Un estudio preliminar mostró que en este
ensayo los virus rD-KO y
rV-KO eran indistinguibles del virus
rJS (datos no mostrados) y éstos se excluyeron de la
evaluación posterior. En un segundo estudio, se inocularon
intranasalmente grupos de hámsteres con 10^{5} pfu por animal de
rC-KO, rDV-KO,
rJS, o cp45, el candidato a vacuna de origen
biológico. En comparación con el rJS, la replicación del
rC-KO se redujo mil veces o más tanto en el
tracto respiratorio superior como en el inferior de los hámsteres
cada uno de los días examinados (Tabla 2) y se atenuó tanto como el
virus cp45 candidato a vacuna. Aunque la replicación del
rDV-KO no se redujo en el tracto respiratorio
superior de los hámsteres, ésta se redujo como mínimo, 20 veces en
el tracto respiratorio inferior (Tabla 2) cada uno de los tres días
examinados. Los hámsteres que se infectaron con
rC-KO, rDV-KO,
cp45, o rJS tuvieron una respuesta de anticuerpos a
HPIV3 significativa y mostraron un nivel elevado de restricción de
replicación de virus de ataque PIV3 (Tabla 3). La protección
proporcionada por el rC-KO en el tracto
respiratorio superior era incompleta, pero aún sustancial.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar adicionalmente el fenotipo de
atenuación y la eficacia protectora de rC-KO
y rDV-KO, se administró cada uno de estos
mutantes a un grupo de cuatro AGMs, y se comparó su replicación en
el tracto respiratorio superior e inferior con la del cp45 y
JSwt. La replicación del rC-KO se redujo 100
veces o más en el tracto respiratorio superior de los AGMs,
mientras que la del rDV-KO se redujo 10 veces
en este lugar. La atenuación observada para estos dos virus en el
tracto respiratorio superior es comparable a la del cp45
(Tabla 4). Aunque el rC-KO se atenuó en gran
medida (más de 10^{5} veces) en el tracto respiratorio inferior de
los AGMs, el rDV-KO solamente se restringió
modestamente (<10 veces) en este lugar. Ambos virus indujeron una
respuesta de anticuerpos HAI al HPIV3, aunque la respuesta HAI de
los AGMs al rC-KO, como la de los hámsteres,
fue significativamente menor que la de los otros virus (Tabla 4).
Los AGMs inmunizados se desafiaron el día 28 con 10^{6} PFU del
virus JS wt de origen biológico administrado IN (intranasal) e IT
(intratraquealmente). Los animales que habían recibido rJS,
rDV-KO o el virus candidato a vacuna
cp45 se protegieron completamente contra la replicación del
virus de ataque tanto en el tracto respiratorio superior como en el
inferior de los AGMs. La protección proporcionada por
rC-KO contra la replicación del virus de
ataque fue sustancial aunque no completa. Las titulaciones del pico
del virus del ataque se redujeron significativamente tanto en el
tracto respiratorio superior como en el inferior de los animales de
este grupo y la duración de la presencia del virus en el tracto
respiratorio superior e inferior se redujo de 10 días a 4 días y de
8 días a 6 días, respectivamente.
En el descubrimiento anterior, los resultados en
la presente descripción muestran la recuperación exitosa de HPIV3
infeccioso a partir de ADNc para construir un virus recombinante
nuevo en el que la expresión de los ORFs C, D, o V se interrumpió
individualmente mediante una técnica de eliminación de ejemplo que
implicaba mutaciones que modifican un aminoácido que determina un
codón de iniciación y/o la introducción de codones de terminación.
En otro clon viral de ejemplo, los ORFs D y V se interrumpieron
conjuntamente. Estos ejemplos muestran la importancia de los ORFs
C, D, y V accesorios del HPIV3 para la replicación del virus in
vitro e in vivo, y da a conocer candidatos a vacuna
útiles para la prevención y tratamiento de PIV. En particular, el
nivel de replicación de rC-KO en el tracto
respiratorio superior e inferior de AGMs fue ligeramente inferior a
la del cp45, la cepa candidato a vacuna de PIV3 más prometedora. A
pesar de su reducida replicación in vivo, el
rC-KO fue capaz de inducir una respuesta
inmune suficiente para restringir la replicación del virus de
ataque HPIV3, calificando a este recombinante como un candidato a
vacuna útil, aunque puede que se necesite una administración a
humanos en una dosis más elevada, tal como 10^{7,0} TCID o en
múltiple dosis, para conseguir un nivel más elevado de restricción
de replicación del virus wt.
Mediante la tecnología de ADN recombinante, se
habían introducido en el cp45 mutante de HPIV3 mutaciones
identificadas solas y combinadas, dentro de la secuencia del JS wt
(Skiadopoulos y otros, J Virol.
73:1374-1381, 1999; Solicitud de Patente
U.S.A. No de serie 09/083,793, presentada el 22 de mayo de 1998;
Solicitud de Patente Provisional U.S.A. No. 60/047,575, presentada
el 23 de mayo de 1997 (correspondientes a la Publicación de Patente
Internacional No. WO 98/53078), y Solicitud de Patente Provisional
U.S.A. No. 60/059,385, presentada el 19 de septiembre de 1997).
Esto ha permitido la identificación de las
mutaciones que contribuyen a fenotipos de atenuación, sensibles a
la temperatura (ts), y/o adaptados al frío de este candidato a
vacuna. Estas mutaciones, y otras modificaciones del PIV
recombinante dadas a conocer en la presente descripción, son
mutaciones adjuntivas útiles para ajustar el nivel de atenuación,
así como la inmunogenicidad y otras características fenotípicas
deseadas, del PIV recombinante de la presente invención que tiene
mutaciones knock out en los ORFs C, D, y/o V.
Las otras dos proteínas que potencialmente se
codifican dentro del locus P son las proteínas V y D. Con la
excepción de HPIV-1, todos los Respirovirus,
Morbillivirus y Rubulavirus contienen un ORF V intacto.
La parte del extremo C terminal rica en cisteína del ORF V es el
ORF más conservado del gen P en Paramyxovirinae y parece que
se expresa por todos estos virus a excepción de BPIV1 y HPIV3.
Aunque el HPIV3 contiene el ORF V, no está claro como se accede,
pero el hecho de que haya permanecido intacto sugiere que se
utiliza. A diferencia del cistrón V de los Paramyxoviridae,
la proteína D está únicamente en el PIV3 humano y bovino. La
proteína D es accesible mediante la inserción de dos residuos G no
secuenciados en el sitio de edición del ARNm P, dando como
resultado un proteína de fusión en la que los 241 aminoácidos del
extremo N-terminal de P se fusionan con los 131
aminoácidos del extremo C-terminal del ORF D. No se
conoce nada sobre la función de la proteína D, y aún no se ha
identificado en células o viriones infectados por HPIV3, aunque se
ha detectado un ARNm editado capaz de codificar D. (Galinski y
otros, Virology 186: 543-550, 1992.) En un
intento para abordar esta cuestión, los presentes inventores
recuperaron un mutante de HPIV3 recombinante que contenía tres
codones de terminación consecutivos en el ORF D que expresarían una
proteína de fusión truncada que contiene 61 aminoácidos codificados
por el ORF D. En ninguno de los recombinantes que tenían una
mutación knock out única en el ORF D o V se restringió
significativamente la replicación in vivo o in vivo.
No obstante, estas mutaciones son altamente útiles para el
desarrollo de candidatos a vacuna del PIV. Esto se ilustra mediante
la recuperación exitosa de un mutante de knock out en V y D
combinatorio, que se preparó mediante la combinación de los dos
conjuntos de mutaciones para crear múltiples codones de terminación
tanto en el ORF V como en el D. Este mutante, designado como
rDV-KO, se restringió en su replicación en el
tracto respiratorio inferior de hámsteres, así como en el tracto
respiratorio tanto superior como inferior de AGMs. Dado que el ORF P
no quedó afectado por las mutaciones introducidas, es razonable
asumir que los fenotipos observados por los presentes inventores
reflejan la pérdida de actividad V y D. Aunque se atenuó la
replicación de rDV-KO in vivo, la
replicación en cultivo celular no cambió esencialmente. Estos
resultados proporcionan pruebas convincentes de que las proteínas D
y V del HPIV3 de tipo salvaje se expresan y que la abrogación
funcional de ambas juntas es responsable del fenotipo de atenuación
in vivo mostrado por el rDV-KO. Es
posible que estas proteínas estén interactuando la una con la otra
a un nivel molecular que afecta a la replicación in vivo.
Aunque la invención anterior se ha descrito en
detalle por medio de ejemplos a efectos de claridad de comprensión,
se hará evidente a los técnicos en la materia que se pueden realizar
ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas que están presentes como medio de
ilustración y no de limitación.
Los siguientes materiales se han depositado en
la Colección Americana de Cultivos Tipo ("American Type Culture
Collection"), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia
20110-2209, bajo las condiciones del Tratado de
Budapest y se designan tal como se describe a continuación:
<110> EL GOBIERNO DE LOS ESTADOS UNIDOS DE
AMÉRICA
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<120> VACUNAS DE VIRUS PARAINFLUENZA
RECOMBINANTE ATENUADO MEDIANTE SUPRESIÓN O ELIMINACIÓN DE UN GEN NO
ESENCIAL
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<130> 15280-394000 PC
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<140>
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<141>
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<150> 09/350.821
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<151>
09-07-1999
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<160> 11
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<170> Ver. PatentIn 2.1
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<210> 1
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipatgctaaaaa ctatcaaatc atgg
\hfill24
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<210> 2
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
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\hfill24
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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<400> 3
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\hfill21
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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<400> 4
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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<400> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rD-KO
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<400> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de tipo salvaje adyacente al sitio de mutación
rV-KO
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia recombinante que incorpora una mutación
rV-KO
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<400> 8
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<210> 9
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia que incorpora un motivo de sitio de edición
del ARN
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<400> 9
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<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia que incorpora sitios de inicio de traducción
de marcos de lectura abiertos P y C
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<400> 10
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<211> 13
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia parcial de ARNm P que tiene una inserción de
dos residuos de G en el sitio de edición
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<400> 11
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<110> EL Gobierno De Los Estados Unidos De
América
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<120> Vacunas De Virus Parainfluenza
Recombinante Atenuado Mediante La Supresión O Eliminación De Un Gen
No Esencial
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<130> Nih-0299
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/350.821
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<151>
09-07-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US00/18523
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-07-2000
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión PatentIn 3.1
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<210> 1
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
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<400> 1
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\hfill24
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<210> 2
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
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<400> 5
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rD-KO
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<400> 6
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de tipo salvaje adyacente
al sitio de mutación rV-KO
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<400> 7
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\hfill30
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<210> 8
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<211> 30
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia recombinante que incorpora
una mutación rV-KO
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 8
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<211> 11
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que incorpora un motivo de
sitio edición del ARN
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagggg g
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<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia que incorpora sitios de
inicio de traducción de P y C
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 10
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\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de ARNm P que
tiene una inserción de dos residuos G en el sitio de edición
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaaaaagggg ggg
\hfill13
Claims (29)
1. Virus parainfluenza (PIV) recombinante
infeccioso que comprende un genoma o antigenoma de PIV, una proteína
de nucleocápside (N), una fosfoproteína (P), y una proteína grande
de polimerasa (L), en el que se introduce una modificación en el
genoma o antigenoma que comprende una supresión parcial o completa
de uno o más ORFs C, D o V o uno o más cambios de nucleótidos
seleccionados entre (i) la introducción de uno o más codones de
terminación, (ii) una mutación en un sitio de edición del ARN, (iii)
una mutación que modifica un aminoácido determinado por un codón de
iniciación y (iv) la introducción de una mutación con desplazamiento
del marco de lectura, por lo cual se reduce o elimina la expresión
de los mencionados uno o más ORFs C, D o V, caracterizado
porque la modificación en el genoma o antigenoma determina uno o más
cambios fenotípicos deseados en el PIV recombinante, seleccionados
entre (i) la atenuación en un cultivo celular, (ii) la atenuación en
el tracto respiratorio superior y/o inferior de un huésped
mamífero.
2. PIV recombinante infeccioso, según la
reivindicación 1, en el que la modificación introducida en el genoma
o antigenoma comprende una supresión parcial o completa de, como
mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V o uno o más cambios de
nucleótidos que reducen o eliminan la expresión de, como mínimo, dos
de los mencionados ORFs C, D o V.
3. PIV recombinante infeccioso, según la
reivindicación 2, en el que los ORFs D Y V se modifican ambos
mediante una supresión parcial o completa o uno o más cambios de
nucleótidos, lo cual reduce su expresión.
4. PIV recombinante infeccioso, según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que se introducen tres
codones de terminación mediante un cambio de nucleótido en las
posiciones 2692, 2695 y 2698 del antigenoma del ORF D.
5. PIV recombinante infeccioso, según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que se introducen dos
codones de terminación mediante un cambio de nucleótido en las
posiciones 2845 y 2854 del antigenoma del ORF V.
6. PIV recombinante infeccioso, según la
reivindicación 1, en el que el codón de iniciación de ORF C se
cambia a un codón de treonina mediante un cambio de nucleótido en
la posición 1795 del mencionado genoma o antigenoma y se introducen
dos codones de terminación mediante un cambio en los nucleótidos
1813 y 1869.
7. PIV recombinante infeccioso, según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que el crecimiento viral
en un cultivo celular se atenúa sustancialmente 5-10
veces o más, comparado con el crecimiento de la correspondiente
cepa de PIV parental de tipo salvaje o mutante.
8. PIV recombinante infeccioso, según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que el crecimiento viral
en el tracto respiratorio superior e inferior se atenúa
sustancialmente 10-100 veces o más, comparado con
el crecimiento de la correspondiente cepa de PIV parental de tipo
salvaje o mutante.
9. PIV recombinante infeccioso, según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que el crecimiento viral
en el tracto respiratorio superior e inferior se atenúa
sustancialmente 100-1.000 veces o más, comparado
con el crecimiento de la correspondiente cepa de PIV parental de
tipo salvaje o mutante.
10. PIV recombinante infeccioso, según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma
o antigenoma se modifica además mediante la introducción de una o
más mutaciones atenuantes identificadas en un PIV humano mutante de
origen biológico.
11. PIV recombinante infeccioso, según la
reivindicación 10, en el que el genoma o antigenoma incorpora, como
mínimo, dos mutaciones atenuantes.
12. PIV recombinante infeccioso, según una de
las reivindicaciones 10 u 11, en el que el genoma o antigenoma
incluye, como mínimo, una mutación atenuante estabilizada mediante
cambios de nucleótidos múltiples en un codón que determina la
mutación.
13. PIV recombinante infeccioso, según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que el genoma o
antigenoma incorpora, como mínimo, uno y hasta un complemento
completo de mutaciones atenuantes presentes en PIV3 JS cp45.
14. PIV recombinante infeccioso, según
cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el genoma o
antigenoma incorpora, como mínimo, una y hasta un complemento
completo de mutaciones atenuantes que determinan una sustitución de
aminoácido en Tyr 942, Leu 992 y/o Thr l558 en el gen L de PIV3; Val
96 y Ser 389 en N; Ile 96 en C; Ile 420 y/o Ala 550 en F; Val 384
en HN, y/o una sustitución de nucleótido en el líder 3' en la
posición 23, 24, 28 y/o 45 y/o en la posición 62 en la secuencia de
inicio de gen de N.
15. PIV recombinante infeccioso, según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma
o antigenoma comprende una modificación de nucleótido adicional que
determina un cambio fenotípico seleccionado entre un cambio en las
características de crecimiento, atenuación, sensibilidad a la
temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa, restricción de la
variedad de huésped o un cambio en la inmunogenicidad.
16. Composición inmunogénica para provocar una
respuesta inmune contra PIV, composición que comprende una cantidad
inmunogénicamente suficiente de PIV recombinante, según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 15, en un transportador
fisiológicamente aceptable.
17. Composición inmunogénica, según la
reivindicación 16, formulada en una dosis de 10^{3} a 10^{7}
PFU.
18. Composición inmunogénica, según una de las
reivindicaciones 16 ó 17, formulada para la administración al
tracto respiratorio superior mediante pulverización, aerosol o en
forma de gotas.
19. Composición inmunogénica, según cualquiera
de las reivindicaciones 16 a 18, en la que el PIV recombinante
provoca una respuesta inmune contra uno o más virus seleccionados
entre HPIV1, HPIV2 y HPIV3.
20. Composición inmunogénica, según la
reivindicación 19, en la que el PIV recombinante provoca una
respuesta inmune contra HPIV3 y otro virus seleccionado entre HPIV1
y HPIV2.
21. Molécula de polinucleótido aislada, que
comprende un genoma o antigenoma de PIV recombinante que incorpora
una modificación de nucleótido que comprende una supresión completa
o parcial de uno o más ORFS C, D o V o uno o más cambios de
nucleótidos, lo cual reduce o elimina la expresión de los
mencionados uno o más ORFS C, D o V, caracterizada porque la
modificación en el genoma o antigenoma determina uno o más de los
cambios fenotípicos deseados en el PIV recombinante, seleccionados
entre (i) la atenuación en un cultivo celular, (ii) la atenuación
en el tracto respiratorio superior y/o inferior de un huésped
mamífero.
22. Molécula de polinucleótido aislada, según la
reivindicación 21, en la que la expresión de los mencionados uno o
más ORFS C, D o V se reduce o elimina mediante la introducción de
uno o más codones de terminación, una mutación en un sitio de
edición del ARN, una mutación que modifica los aminoácidos
determinados por un codón de iniciación, o la supresión de uno o
más ORFS C, D o V en su totalidad o en parte.
23. Molécula de polinucleótido aislada, según la
reivindicación 21 ó 22, en la que la modificación introducida en el
genoma o antigenoma comprende una supresión parcial o completa de,
como mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V o uno o más
cambios de nucleótidos, lo cual reduce o elimina la expresión de,
como mínimo, dos de los mencionados ORFs C, D o V.
24. Molécula de polinucleótido aislada, según la
reivindicación 23, en la que se modifica tanto el ORF D como el V,
mediante una supresión parcial o completa o mediante uno o más
cambios de nucleótidos, lo cual reduce o elimina su expresión.
25. Molécula de polinucleótido aislada, según
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en la que se modifica
también el genoma o el antigenoma recombinante mediante una o más
mutaciones atenuantes.
26. Molécula de polinucleótido aislada, según
cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que comprende además
una modificación de nucleótido que especifica un cambio fenotípico
seleccionado entre un cambio de las características de crecimiento,
la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, la adaptación al
frío, el tamaño de la placa, la restricción de variedad de huésped,
o un cambio en la inmunogenicidad.
27. Método para la producción de una partícula
infecciosa de PIV recombinante atenuado, a partir de unas o más
moléculas aisladas de polinucleótido que codifican dicho PIV,
comprendiendo dicho método:
- la expresión en una célula o un lisado libre de células de un vector de expresión que comprende un polinucleótido aislado, según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, y las proteínas N, P, y L de PIV.
28. Método, según la reivindicación 27, en el
que el genoma o el antigenoma de PIV quimérico y las proteínas N,
P, y L se expresan por dos o más vectores de expresión
diferentes.
29. Vector de expresión, que comprende un
promotor de transcripción enlazado operativamente, una secuencia de
polinucleótidos, según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26, y
un finalizador de transcripción.
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