ES2283331T3 - Metodo para mejorar la secrecion de los compuestos de beta-lactama. - Google Patents
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Abstract
Método para mejorar la secreción de un compuesto de beta-lactama a partir de un microorganismo, capaz de producir compuestos de beta-lactama que comprende el paso de mejorar una actividad transportadora ABC de dicho microorganismo, que comprende el paso de transformar dicho microorganismo con al menos un casete de expresión que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO. 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 46 y 47 o un polinucleótido el cual muestra un porcentaje de similitud de al menos el 60% con estas secuencias de polinucleótidos, que codifican un transportador ABC homólogo o heterólogo.
Description
Método para mejorar la secreción de los
compuestos de \beta-lactama.
Históricamente, los antibióticos
\beta-lactámicos constituyen el grupo más
importante de compuestos antibióticos, que tienen un largo y
exitoso registro de uso clínico. Los miembros prominentes dentro de
este grupo son las penicilinas y las cefalosporinas. Estos
compuestos son naturalmente producidos por hongos filamentosos, tal
como el Penicillium chrysogenum y el Acremonium
chrysogenum, y por bacterias filamentosas.
Como resultado de las técnicas de mejoramiento
de las cepas clásicas, los niveles de producción de estos
antibióticos en P. chrysogenum y A. chrysogenum han
aumentado dramáticamente durante las pasadas décadas. El aumento del
entendimiento de las vías biosintéticas que conducen a las
penicilinas y las cefalosporinas ha impulsado el advenimiento de la
tecnología del ADN recombinante, proporcionando nuevas herramientas
para el mejoramiento de las cepas de producción de
\beta-lactamas y para la derivatización in
vivo de los compuestos de \beta-lactama.
La mayoría de las enzimas involucradas en la
biosíntesis de las \beta-lactamas han sido
identificadas (Ingolia y Queener, Med. Res. Rev. 9:
245-264, 1989), y sus genes correspondientes han
sido clonados (Aharonowitz, y otros, (Ann. Rev. Microbiol.
46: 461-495, 1992).
Los primeros dos pasos en la biosíntesis de la
penicilina en P. chrysogenum son la condensación de los tres
aminoácidos ácido
L-5-amino-5-carboxipentanóico
(ácido L-\alpha-aminoadípico) (A),
L-cisteína (C) y L-valina (V) en el
tripéptido LLD-ACV, seguido por la ciclización de
este tripéptido para formar la isopenicilina N. El compuesto
intermedio de la isopenicilina N contiene la estructura de la
\beta-lactama característica de la penicilina.
Estos primeros dos pasos en la biosíntesis de las penicilinas son
comunes para las bacterias y hongos que producen penicilina, que
producen cefamicina y que producen cefalosporinas.
El tercer paso de la síntesis involucra el
intercambio de la cadena lateral del ácido
\alpha-aminoadípico hidrofílico derivada del
ácido
L-5-amino-5-carboxipentanóico
con una cadena lateral hidrofóbica, a través de la acción de la
enzima aciltransferasa (AT). La reacción del intercambio enzimático
mediada por la AT tiene lugar dentro de un orgánulo celular, el
microcuerpo, como ha sido descrito en
EP-A-0448180.
Las penicilinas fermentadas industriales como la
penicilina V y la penicilina G, son producidas añadiendo al caldo
de cultivo ácido fenoxiacético o ácido fenilacético,
respectivamente, durante la fermentación de P. chrysogenum,
reemplazando de esta manera las cadenas laterales de las
\beta-lactamas naturales con el ácido
fenoxiacético o el ácido fenilacético. Para reemplazar la cadena
lateral del ácido \alpha-aminoadípico en la
reacción catalizada por la aciltransferasa, el grupo de ácido
carboxílico de la nueva cadena lateral primero debe ser activado,
ya que la enzima AT requiere la cadena lateral en una forma
activada. La forma activada es un derivado de la coenzima A (CoA),
sintetizado por una CoA ligasa.
Dos CoA ligasas han sido clonadas a partir de
P. chrysogenum. El gen que codifica una
acetil-coenzima A sintetasa ha sido caracterizado
por Van Hartingsveldt y otros (WO92/07079), Gorka y otros (Appl.
Microbiol. Biotechnol., 38:514-519 (1993) y
Martínez-Blanco y otros (Gene,
130:265-270 (1993); J. Biol. Chem.
267:5474-5481 (1992)). La enzima no solo
acepta el ácido acético sino también el ácido fenilacético como un
sustrato en la síntesis del éster acil-coenzima A
correspondiente, aunque la especificidad para el ácido fenilacético
es muy baja en comparación con la especificidad para el ácido
acético. Más recientemente, un gen que codifica un homólogo del
ácido fenilacético CoA ligasa de Pseudomonas putida ha sido
clonado, el gen pcl (WO 97/02349). La proteína mostró ser
activa con ambos, el ácido fenilácetico y el fenoxiacético.
En los procesos de fermentación novedosos para
la producción de cefalosporinas intermedias, las cepas de P.
chrysogenum que portan los genes biosintéticos de las
cefalosporinas heterólogas, tal como el gen de la expandasa de
S. clavuligerus o el gen de la expandasa/hidroxilasa de A.
chrysogenum, son usadas para la producción de las
adipoil-cefalosporinas correspondientes alimentando
ácido adípico a estas cepas recombinantes. Las cefalosporinas
intermedias producidas de esta forma incluyen el ácido
7-aminodeacetoxicefalosporánico
(7-ADCA), el ácido
7-aminodeacetilcefalosporánico
(7-ADAC) y el ácido
7-aminocefalosporánico (7-ACA). La
remoción subsiguiente de la cadena lateral adipoil de las
adipoil-cefalosporinas puede ser lograda usando una
amidasa (EP 532341 y Crawford y otros, Bio/Technology 13:
58-62 (1995)).
Durante las últimas etapas de los procesos de
fermentación de la penicilina industrial son encontrados títulos
extremadamente altos de \beta-lactama, que usan el
Penicillium chrysogenum como el hospedero para la producción
(estimada que sea de 120 mM por Hillenga (1999) tesis de doctorado,
Universidad de Groningen, Holanda). De la literatura es conocido
que el contenido de ergosterol de las membranas del plasma de P.
chrysogenum es de alrededor del 50% (Hillenga, 1999). A esta
concentración la membrana es casi impermeable para la difusión
pasiva de las penicilinas. Por lo tanto, permanece sin aclarar como
el hongo puede exportar tal cantidad de antibióticos
\beta-lactámicos. Especial-
mente al final de la fermentación esto debe ser un sistema eficiente para exportar contra una alta concentración externa.
mente al final de la fermentación esto debe ser un sistema eficiente para exportar contra una alta concentración externa.
Recientemente, se sugirió que transportadores
péptido/catión orgánico estaban involucrados en la transportación
de los antibióticos \beta-lactámicos en humanos
(Ganapathy y otros, J. Biol. Chem. (2000)
275:1699-1707). Hasta ahora tales proteínas no han
sido reportadas en los hongos filamentosos.
Las cepas industriales del hongo filamentoso
Penicillium chrysogenum han sido seleccionadas por su
capacidad para producir y segregar grandes cantidades de una
variedad de compuestos de \beta-lactama en un
medio de cultivo. Varias líneas de evidencia indican que la
secreción de la \beta-lactama es un proceso
activo, posiblemente a través de las proteínas de transporte.
Durante las últimas etapas de los procesos de fermentación son
encontrados títulos de \beta-lactama
extremadamente altos en las fermentaciones a escala industrial. Sin
embargo, a pesar de la selección genética tradicional de las cepas
fúngicas para la producción de \beta-lactamas y
la evidencia de cómo los compuestos de
\beta-lactama son segregados, los microorganismos
tienen que ser aún optimizados para obtener la máxima secreción de
los compuestos de \beta-lactama. Además, el
proceso de transportación pudiera ser optimizado para cada
organismo y cada antibiótico. Por ejemplo, el índice de producción
de las cefalosporinas heterólogas producidas en P.
chrysogenum estará limitado debido al hecho de que el
transportador de la penicilina tendrá baja afinidad para el
producto. Esto pudiera superarse clonando uno o más transportadores
de la \beta-lactama homólogos a partir de
productores de cefalosporinas naturales como A. chrysogenum
con la ayuda del transportador objeto de esta invención o,
alternativamente, realizando la mutagénesis del transportador de la
penicilina de acuerdo a la presente invención en un derivado más
apto para la transportación de las cefalosporinas.
EP-A-0908516
describe un polipéptido transportador del tipo casete de unión a ATP
(ABC) de Staphylococcus, un polinucleótido transportador ABC
y materiales y métodos para su producción. El polipéptido
transportador de EP-A-0908516 puede
ser usado para determinar la presencia de bacterias resistentes a
fármacos en un hospedero mamífero. El polipéptido de
EP-A-0908516 puede ser obtenido a
partir de otros organismos, pero no tiene relación con la
transportación de los compuestos de
\beta-lactama.
Ciertos transportadores han sido descritos en
mohos y levadura eucariótica, pero ninguno aparece relacionado al
mejoramiento de la producción de \beta-lactamas a
partir de cepas industriales de hongos. Por ejemplo, un
transportador de histidina (Tanaka y Fink, Gene 38:
205-214 (1985) y un transportador de prolina
(Vandenbol y otros, Gene 83: 153-159 (1989))
han sido identificados en Saccharomyces cerevisiae. La sobre
expresión del gen de resistencia multifármaco de la levadura CDR1
en Candida albicans puede otorgar resistencia a la
cicloheximida, el cloramfenicol, y el miconazol (Prasad y otros,
Curr. Genet., 27 (4): 320-329 (1995)). Una
g-glicoproteína transportadora del tipo casete de
unión a ATP codificada por un gen de resistencia multifármaco de
Penicillium es sobre expresado en cepas de Penicillium
digitatum resistente al fungicida, sugiriendo que el sistema de
flujo tóxico del hongo está directamente involucrado con la
resistencia al fungicida (Nakaune y otros, Appl. Environ.
Microbiol. 64:3983-3988 (1998)). Sin embargo,
tales portadores de proteínas no están asociados con la secreción
de la \beta-lactama a partir de los hongos.
De esta forma, existe una necesidad de mejorar
las cantidades segregadas de los compuestos de
\beta-lactama recuperables a partir de las cepas
industriales de microorganismos. La invención soluciona el problema
antes mencionado mediante la manipulación del sistema de proteínas
de transporte ABC, que proporciona un medio para mejorar la
secreción de \beta-lactama a partir de
microorganismos en los cuales estos compuestos están o pueden ser
sintetizados.
La presente invención por lo tanto proporciona
un método para producir compuestos de
\beta-lactama que comprende el paso de mejorar la
actividad transportadora ABC de un microorganismo y
subsiguientemente cultivar dicho microorganismo bajo condiciones
que permitan la producción de dichos compuestos de
\beta-lactama. En otra realización de la presente
invención es proporcionado un método para mejorar la secreción de un
compuesto de \beta-lactama a partir de un
microorganismo que comprende el paso de mejorar la actividad
transportadora ABC de dicho microorganismo.
La presente invención proporciona adicionalmente
un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido tranportador
ABC seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO. 10, 13,
16, 20, 23, 28, 31, 36, 39 y 48 incorporadas en la presente
solicitud, o una secuencia la cual muestra un porcentaje de
similitud de al menos el 95% con estas secuencias.
La presente invención también proporciona
transportadores ABC aislados codificados por un gen transportador
ABC que comprende la secuencia de nucleótidos de acuerdo a la SEQ ID
NO seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NO. 7, 8, 9,
11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 34, 35, 37,
38, 40, 46 y 47 o una secuencia de polinucleótidos la cual muestra
una similitud de al menos el 95% con estas secuencias de
nucleótidos.
Una proteína transportadora ABC utiliza el ATP
para accionar los procesos de transportación de un rango diverso de
sustratos incluyendo varios antibióticos, oligopéptidos,
polisacáridos y fármacos tóxicos no relacionados (analizado por
Schneider y otros (Schneider, E. y Hunde, S. FEMS Microbiol. Rev.
22: 1-20, 1998), Méndez y otros (Méndez, C.
y Salas, J.A. FEMS Microbiol. Lett. 158: 1-8,
1998); van Veen y otros (Veen, H.W van y Konings, W.N.
Biochim.Biophys. Acta 1365: 31-36,
1998)).
Una realización de la invención proporciona un
método para mejorar la secreción de un compuesto de
\beta-lactama a partir de un microorganismo cuyo
método comprende el paso de mejorar una actividad transportadora ABC
como es definida en la página 6 de dicho microorganismo. La
secreción de acuerdo a la invención comprende cualquier paso
involucrado en la transportación de los compuestos de
\beta-lactama o intermediarios de los mismos que
ocurre dentro del microorganismo y desde dentro hacia fuera del
microorganismo. Los compuestos de \beta-lactama
de acuerdo a la invención comprenden las Penicilinas, las
Cefalosporinas, las Amoxicillinas, el ácido Calvulánico y los
intermediarios de los mismos tal como la PenV, la PenG, el
6-APA, el 7-ADCA, el
7-ACA, el 7-ADCA.
\newpage
En una realización preferida de la invención, el
paso de mejorar la actividad transportadora ABC comprende el paso
de transformar dicho microorganismo con al menos un vector que
comprende un polinucleótido que codifica una proteína
transportadora ABC homóloga o heteróloga como es definido en la
página 6. De acuerdo a otra realización de la invención el método
comprende el uso de polinucleótidos que codifican un polipéptido
transportador ABC seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID
NO. 10, 13, 16, 20, 23, 28, 31, 36, 39 y 48 o un polipéptido que
muestra al menos 60% de similitud con estas secuencias de
polipéptidos. El microorganismo útil como fuente para un
polinucleótido de acuerdo a la presente invención, pueden ser
microorganismos capaces de producir compuestos de
\beta-lactama tanto de manera natural como por
inducción o mutación de acuerdo a los métodos conocidos en el arte.
En una realización preferida de la invención, los microorganismos
son hongos que producen \beta-lactamas, hongos
filamentosos o bacterias filamentosas, más preferiblemente cepas de
Penicillium, Acremonium, Saccharomyces, Hansenula, Pichia y
Aspergillus. Las más preferidas las de Penicillium
chrysogenum, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia
pastoris, Acremonium chrysogenum o Aspergillus nidulans,
o Actinomicetos como el Streptomyces clavuligerus, Nocardia
lactamdurans, Flavobacterium sp.
El polinucleótido aislado de acuerdo a la
invención comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido transportador ABC que puede ser apropiadamente de origen
genómico o a partir de ADNc, por ejemplo obtenido preparando una
biblioteca genómica o de ADNc y seleccionando las secuencias de ADN
que codifican para todo o parte del polipéptido por hibridación
usando al menos parte de la secuencia de nucleótidos novedosa aquí
descrita como una sonda que aplica técnicas estándares (ver Sambrook
y otros, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, 2da
Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York,
1989). Los polinucleótidos aislados de la invención que comprenden
el gen o el ADNc que codifica un polipéptido transportador ABC
pueden también ser preparado por reacción en cadena de la polimerasa
usando cebadores específicos, ventajosamente el cebador derivado de
la secuencia de nucleótidos aquí descrita. Con este fin puede
usarse, por ejemplo el método descrito en US 4,683,202 o de Saiki
y otros (Science, 239 (1988):
487-491).
El polinucleótido aislado de acuerdo a la
invención puede ser seleccionado del grupo que consiste de los
polinucleótidos definidos en la página 7.
Un polinucleótido transportador ABC homólogo
comprende un polinucleótido que es obtenido a partir de
microorganismos que pertenecen a la misma especie que el
microorganismo al cual dicho polinucleótido es transformado,
mientras un transportador ABC heterólogo comprende un
polinucleótido que es obtenido a partir de un microorganismo que
pertenece a otra especie que el microorganismo al cual dicho
polinucleótido es transformado.
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos
que son sustancialmente homólogas a las secuencias de
polinucleótidos y polipéptidos pueden ser determinadas usando el
método descrito en el experimento 2. En este experimento se
describe como el porcentaje de identidad de secuencias y el
porcentaje de similitud pueden ser determinados. Básicamente, una
comparación de las secuencias de dos polinucleótidos (o más de dos)
puede estar restringida a una "ventana de comparación" para
determinar la similitud de secuencias en una región local de los dos
polinucleótidos. Una "ventana de comparación" es definida como
una serie continua de al menos 20 nucleótidos en una secuencia del
primer polinucleótido, la cual cuando esta alineada con una
secuencia referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos, permite
una comparación de la secuencia del primer polinucleótido y la de
referencia. El segmento de los nucleótidos contiguos en la
"ventana de comparación" del primer polinucleótido puede
comprender adiciones y/o eliminaciones tales como, por ejemplo,
huecos, de hasta el 20% de la secuencia de referencia. La homología
local o identidad de secuencias dentro de la "ventana de
comparación" del primer polinucleótido y el polinucleótido de
referencia puede ser lograda a través de la alineación de las
secuencias de acuerdo al algoritmo de Smith y Waterman (Appl. Math.
2:482 (1981), o por otro algoritmo o método apropiado de alineación
(Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443 (1970); Pearson y Lipman,
Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988).
La identidad de secuencias es establecida cuando
el primer polinucleótido y el polinucleótido de referencia exhiben
similitud de secuencias completa sobre la base de nucleótido por
nucleótido a lo largo de toda la extensión de la "ventana de
comparación". Sin embargo, polinucleótidos que tengan identidad
sustancial con un polinucleótido de referencia pueden ser
contemplados, cuando un polinucleótido que tiene identidad
sustancial con el polinucleótido de referencia exhibe la misma
función que el polinucleótido de referencia. Por "identidad
sustancial" se entiende que un polinucleótido tiene bases de
ácidos nucleicos casi idénticas en una "ventana de
comparación" localizadas en las posiciones correspondientes a
aquellas del polinucleótido de referencia. El número de las
posiciones bases de coincidencia dividido por el número total de
posiciones comparadas, multiplicado por 100 por ciento, produce lo
que es conocido como porcentaje de identidad de secuencias (también
conocido como porcentaje de homología de secuencias) entre los
polinucleótidos comparados. Una secuencia de referencia que tiene
una "ventana de comparación" de al menos 20 nucleótidos
(preferiblemente 20-50 nucleótidos) es contemplada.
La secuencia de referencia es obtenida a través de una reacción PCR
en unos recuadros homólogos en las así llamadas proteínas con
Casete de Unión a ATP (ABC): los dominios Walker A y B. Aunque las
similitudes de estas secuencias con los transportadores ABC
conocidos pueden ser bastante altas, esto está concentrado en estas
regiones conservadas. La variabilidad en la identidad de secuencias
dentro de las secuencias conocidas es debida a la existencia de dos
subclases de secuencias, determinadas a través de la alineación de
secuencias del tipo clustal. El procedimiento antes esbozado es
aplicable a todas las secuencias que son partes de esta
invención.
Para los propósitos de esta invención, el método
BlastP y el método Blast N (versión 2.0.6, fecha de puesta en
circulación Septiembre 1998, que corre bajo el software de Biomax
Bioinformatics GMBH, Martinsried, GE) son preferidos para
determinar el grado de identidad entre dos secuencias de
polipéptidos o secuencias de polinucleótidos, usando los siguientes
parámetros:
| Valor de expectación (E) | : | 10 |
| Costo de abrir un hueco | : | 11 |
| Costo de extender un hueco | : | 1 |
| Matriz | : | Blosum 62 |
Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos
que son sustancialmente homólogas pueden mostrar un porcentaje de
similitud de al menos el 60%, preferiblemente al menos el 80%, más
preferiblemente el 90%, y más preferido al menos el 95%, 96%, 97%,
98%, 99% con la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos
representada por las SEQ ID NO. 7-48 incorporadas
en la presente solicitud.
Los equivalentes funcionales de la proteína
transportadora ABC incluyen las secuencias de nucleótidos que
codifican un polipéptido transportador ABC el cual puede tener una o
más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos
comparado con sus contrapartes naturales y aún resultar un
polipéptido transportador ABC funcional.
Los fragmentos de la proteína transportadora ABC
pueden incluir fragmentos biológicamente activos del polipéptido
que comprende secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a
o derivadas de la secuencia de aminoácidos de la proteína
transportadora ABC, la cual incluye menos aminoácidos que la
proteína de longitud completa. Típicamente, los fragmentos
biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con al menos
una actividad de la proteína transportadora ABC. Las sustituciones
abarcan cambios hechos en base a la similitud en polaridad, carga,
solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza
amfipática de los residuos involucrados. Estos cambios son
preferiblemente de una naturaleza menor (o sea sustituciones de
aminoácidos conservativas que no afectan de manera adversa la
actividad o el plegamiento de la proteína), pequeñas eliminaciones
(típicamente de uno hasta alrededor de 30 aminoácidos), pequeñas
extensiones amino- o carboxil terminal (tal como un residuo de
metionina amino terminal), un pequeño péptido enlazador de hasta
alrededor de 20-25 residuos, o una pequeña
extensión que facilite la purificación (tal como un tracto de
histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión). Ver en
general Ford y otros (Purificación y Expresión de Proteínas,
2 (1991), 95-107).
Ejemplos de sustituciones conservativas son las
sustituciones dentro de los grupos respectivos de
\blacklozenge aminoácidos básicos (tales como
la arginina, la lisina, la histidina)
\blacklozenge aminoácidos ácidos (tales como
el ácido glutámico y el ácido aspártico)
\blacklozenge aminoácidos polares (tales como
la glutamina y la asparagina)
\blacklozenge aminoácidos hidrofóbicos (tales
como la leucina, la isoleucina, la valina)
\blacklozenge aminoácidos aromáticos (tales
como la fenilalanina, el triptofan, la tirosina) y
\blacklozenge aminoácidos pequeños (tales como
la glicina, la alanina, la serina, la treonina, la metionina)
Será evidente para las personas expertas en el
arte que tales sustituciones pueden ser hechas fuera de las
regiones críticas para la función de la molécula y aún resultarán en
un polipéptido activo. Una prueba que puede ser aplicada para
determinar la actividad transportadora ABC de un polipéptido es
descrita en el ejemplo 12.
Aminoácidos esenciales para la actividad del
polipéptido transportador ABC de la invención , y por lo tanto
preferiblemente no sometido a sustitución, pueden ser identificados
de acuerdo a los procedimientos conocidos en el arte, tales como
mutagénesis dirigida o mutagénesis mediante alanina (Cunningham y
Wells, Science, 244 (1989): 1081-1085). En
la última técnica las mutaciones son introducidas en cada residuo en
la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son analizadas
para la actividad biológica para identificar residuos de
aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Los
sitios de la interacción ligando-receptor pueden
también ser determinados por análisis de la estructura cristalina
determinada por tales técnicas como la resonancia magnética
nuclear, la cristalografía o el marcado por fotoafinidad. Ver, por
ejemplo, de Vos y otros (Science, 255 (1992):
306-312), Smith y otros (J. Mol. Biol.,
224 (1992): 899-904) y Wlodaver y
otros (FEBS Lett., 309 (1992):
59-64).
Otra realización de la invención proporciona un
microorganismo transformado con al menos un vector que comprende al
menos un polinucleótido que codifica un transportador ABC microbiano
como es definido en la página 6. Dicho polinucleótido pudiera estar
operablemente unido a una secuencia regulatoria, tal como un
promotor homólogo o heterólogo, o un promotor regulable o
constitutivo. El término "operablemente unido" indica que la
secuencia que codifica al menos parte de un transportador ABC
microbiano y la secuencia regulatoria están dispuestas de manera
que funcionen de conformidad para sus propósitos pretendidos, por
ejemplo la transcripción se inicia en un promotor y procede a
través de la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido.
Un análisis de los promotores fúngicos puede ser
encontrado en, por ejemplo, Genética Molecular Aplicada de los
hongos filamentosos (Kinghorn, Turner (eds), Blackie, Glasgow, UK,
1992). Promotores apropiados para el uso en células hospederas de
hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor ADH3
(McKnight y otros, EMBO J., 4 (1985):
2093-2099) o el promotor tpiA. Ejemplos de
otros promotores útiles son aquellos derivados del gen que codifica
la TAKA amilasa de A. oryzae, la proteinasa aspártica de
Rhizomucor miehei, la \beta-amilasa
neutral de A. niger, la a-amilasa estable
ácida de A. niger, la glucoamilasa (gluA) de A. niger
o A. awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la
proteasa alcalina de A. oryzae, la triosa fosfato isomerasa
de A. oryzae, la acetamidasa de A. nidulans, la ACV
sintetasa de P. chrysogenum, la isopenicilina N sintetasa de
P. chrysogenum, la aciltransferasa de P. chrysogenum,
la fosfoglicerato quinasa de P. chrysogenum, el gen Y de
P. chrysogenum. Preferido son los promotores de P.
chrysogenum o la glucoamilasa de A. niger.
La secuencia de ADN de la invención que codifica
el polipéptido transportador ABC de acuerdo con la invención puede
también, si es necesario, estar operablemente conectada a un
terminador apropiado.
El vector puede convenientemente ser sometido a
procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector
dependerá frecuentemente de la célula hospedera en la cual va a ser
introducido. De esta forma, el vector puede ser un vector de
replicación de manera autónoma, es decir un vector el cual existe
como una entidad extra-cromosómica, la replicación
del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo
un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno el cual,
cuando es introducido en una célula hospedera, es integrado en el
genoma de la célula hospedera y replicado conjuntamente con el (los)
cromosoma(s) en el (los) cual(es) ha sido
integrado.
El vector recombinante puede también comprender
un marcador seleccionable, por ejemplo un gen el producto del cual
complementa un defecto en la célula hospedera, o uno en cual
confiere resistencia a un fármaco. Ejemplos de esto último son la
pleomicina o la higromicina. Para los hongos filamentosos, los
marcadores seleccionables adicionales incluyen amdS,
pyrG, argB, niaD, facA, y sC
(Genética Molecular Aplicada de los Hongos Filamentosos
(ibid), Biotecnología de Hongos Filamentosos, Finkelstein,
Ball (eds), Butterworth-Heinemann, Boston,
1992).
Es también posible introducir el vector que
comprende la secuencia de ADN de la invención que codifica un
polipéptido transportador ABC en una célula hospedera en un
fragmento de ADN separado del vector que comprende un marcador
seleccionable, por un así llamado proceso de
co-transformación.
En otra realización la invención se relaciona
con la célula hospedera transformada que comprende el vector que
contiene el polinucleótido de acuerdo con la SEQ ID NO seleccionada
del grupo que consiste de: 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22,
24, 25, 26, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 46 y 47 o un polinucleótido que
tiene al menos 95% de similitud con ese.
Una realización preferida de la invención es un
proceso para mejorar la actividad transportadora ABC que comprende
la expresión desde la célula hospedera bajo condiciones suficientes
para la producción del polipéptido de acuerdo a la SEQ ID 10, 13,
16, 20, 23, 28, 31, 36, 39, o 48 o un polipéptido que tiene al menos
60% de similitud con ese.
Otra realización es el uso de un polinucleótido
aislado de acuerdo a la invención o un vector que comprende dicho
polinucleótido en un método para la producción de compuestos de
\beta-lactama en un microorganismo.
Otra realización de la invención proporciona un
método para producir compuestos de \beta-lactama
en un microorganismo que comprende el paso de mejorar la actividad
transportadora ABC de dicho microorganismo y subsiguientemente
cultivar dicho microorganismo bajo condiciones que permiten la
producción de dichos compuestos de
\beta-lactama.
La invención también proporciona un
transportador ABC aislado codificado por un gen transportador ABC
que comprende al menos parte de la secuencia de nucleótidos
definida en la página 7.
La invención también proporciona un método para
producir un compuesto de \beta-lactama a partir de
un microorganismo cultivado que comprende transformar un
microorganismo que produce \beta-lactama con un
polinucleótido aislado que codifica el transportador ABC microbiano
de acuerdo a la invención bajo el control de un promotor apropiado,
y cultivar subsiguientemente el microorganismo que produce
\beta-lactama bajo condiciones que permitan
(i) la síntesis de un compuesto de
\beta-lactama,
(ii) la expresión del polinucleótido aislado que
codifica el transportador ABC microbiano bajo el control de un
promotor apropiado, y
(iii) la secreción mediada por el transportador
ABC del compuesto de \beta-lactama por el
microorganismo en el medio de cultivo, y a continuación, recuperar
el compuesto de \beta-lactama segregado del medio
de cultivo.
Otra realización es el uso de un polinucleótido
aislado que codifica la proteína transportadora ABC microbiana de
acuerdo con la invención bajo el control de un promotor apropiado en
la producción de un compuesto de \beta-lactama
microbiano segregado.
P. chrysogenum fue cultivado en frascos
de agitación de 100 ml con 25 ml de medio definido que contenía
lactosa como la fuente de carbono para asegurar condiciones de no
represión para la producción de penicilina (280 rpm a 25 grados
Celsius).
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}[t]{145mm} ^{1} Fluoruro de berilio fue
añadido en una concentración final de 400 \mu m de BeSO_{4} y 2
mM de NaF; conjuntamente con 400 \mu m de ATP, 4 mM de MgSO_{4}
y 0.1 mM de EDTA.\end{minipage} \cr
\begin{minipage}[t]{145mm}El verapamil y la ciclosporina A
fueron añadidos en una concentración final de 20 \mu m y 2 \mu
m, respectivamente; conjuntamente con 40 \mu m de benadato, 4 mM
de MgCl_{2} y 4 mM de ATP.\end{minipage} \cr ^{2} En
unidades
arbitrarias\cr}
El precursor de la penicilina G, el ácido fenil
acético, fue añadido como una sal de potasio 48 horas después de la
inoculación. Los inhibidores de los transportadores ABC fueron
añadidos en el comienzo de la producción de penicilina (48 horas) o
al final de la fermentación (144 horas). En el último caso 100 mM de
penicilina G fueron añadidos después que los cultivos fueron
incubados por una hora con los inhibidores. Exactamente 1 hora
después todos los cultivos fueron cosechados mediante filtración y
lavados tres veces con sal fisiológica fría (0.9%).
Estos pasos de lavado son muy críticos; ellos
debes ser hechos cuidadosamente. Los granulados miceliales fueron
congelados en nitrógeno líquido, criodisecados y la concentración
interna de la penicilina G fue determinada por NMR.
Hubo un claro incremento de la penicilina G
intracelular cuando el organismo fue incubado con los inhibidores
de los transportadores ABC (ver Tabla I). Los mejores resultados
fueron obtenidos con el verapamil y la ciclosporina A, donde fue
encontrado un incremento de dos a tres veces en la penicilina G
intracelular.
Esto es una indicación clara de que los
transportadores ABC están directamente involucrados en la
exportación de los antibióticos \beta-lactámicos
como la penicilina G.
Oligonucleótidos degenerados complementarios a
los motivos Walker A y Walker B
C-terminales relativamente conservados (presentes
en el dominio que une los nucleótidos de los transportadores ABC)
fueron diseñados (ver Figura 1). Como resultado, los cebadores
sentido (complementarios al motivo Walker A, SGA/CGKT/ST),
5’-TCI GGI G/TG/CI GGI AAA/G A/TCI AC-3’ (SEQ ID
NO. 3) y 5’-TCI GGI G/TG/CI GGI AAA/G AGC/T AC-3’
(SEQ ID NO. 4) y los cebadores antisentido (complementarios al
motivo Walker B, DEA/PTSA/GLD), 5’-TCI AA/GI G/CCI GAI GTI
GG/CC/T TCA/G TC-3’ (SEQ ID NO. 5) y 5’-TCI AA/GI
G/CCA/G CTI GTI GG/CC/T TCA/G TC-3’ (SEQ ID NO. 6)
fueron aplicados.
El ARN total fue aislado de una cepa de alta
producción de penicilina de P. chrysogenum (por ejemplo
Panlabs P2) bajo condiciones de producción de la penicilina para
aumentar la presencia de los transcritos de los transportadores de
la penicilina putativos en el acervo de ARN total. La
RT-PCR fue realizada en estos aislados de ARN total
usando los anteriormente mencionados cebadores degenerados. El ADNc
fue sintetizado con transcriptasa inversa AMV (Boehringer Mannheim)
usando los cebadores (Walker B) antisentido (incubación por 1
hora a 50ºC). Este material de ADNc fue subsiguientemente usado en
un procedimiento PCR que usa el siguiente programa. Como los
programas PCR estándares (con un ciclo estándar) no dieron
resultados satisfactorios, aplicamos un programa "escalera"
especial para obtener buenos productos PCR. Un "arranque en
caliente" fue hecho por 3 min a 95ºC después de lo cual 10
ciclos de 0.15 min a 95ºC, 0.30 min a 55ºC y 0.40 min a 72ºC fueron
realizados. Esto fue seguido por 20 ciclos en los cuales el último
paso a 72ºC fue extendido en cada ciclo por 20 seg., seguido por 5
min a 72ºC.
Los productos de la reacción PCR fueron
analizados por electroforesis en geles de agarosa que contienen
bromuro de etidio. Los productos PCR de tamaño apropiado (alrededor
de 400 bp) fueron aislados del gel, purificados y clonados en el
vector pGEM-T easy (Promega). Este vector contiene
residuos de timidina protuberantes en 3’ los cuales realizan la
ligadura con los fragmentos PCR que contienen los residuos de
adenosina protuberantes en 3’ (cuando son generados con
Taq-polimerasa, por ejemplo) posibles.
Las técnicas PCR como se describieron
anteriormente restringen la selección a un conjunto de genes. Como
otro enfoque para obtener genes involucrados en la exportación de
\beta-lactamas una técnica de impresión digital
del ADN llamada AFLP (amplificación del fragmento de restricción
selectiva) es empleada.
La técnica de AFLP está basada en la
amplificación PCR selectiva de fragmentos de restricción a partir de
una digestión total del ADN genómico.
La técnica involucra tres etapas:
(i) restricción del ADN y ligadura de los
adaptadores de oligonucleótidos,
(ii) amplificación selectiva de conjuntos de
fragmentos de restricción, y
(iii) análisis en gel de los fragmentos
amplificados.
La amplificación PCR de fragmentos de
restricción es lograda usando la secuencia del sitio de restricción
y el adaptador como sitios diana para el templado de los cebadores.
La amplificación selectiva es lograda por el uso de cebadores que
se extienden a los fragmentos de restricción, amplificando solo
aquellos fragmentos en los cuales las extensiones de los cebadores
coinciden con los nucleótidos que flanquean los sitios de
restricción. Usando este método, conjuntos de fragmentos de
restricción pueden ser visualizados mediante PCR sin tener
conocimiento de su secuencia de nucleótidos. Este método permite la
co-amplificación específica de un alto número de
fragmentos de restric-
ción.
ción.
El número de fragmentos que puede ser analizado
simultáneamente, sin embargo, es dependiente de la resolución del
sistema de detección. Típicamente 50-100 fragmentos
de restricción son amplificados y detectados en geles de
poliacrilamida bajo condiciones de desnaturalización.
La técnica AFLP proporciona una técnica de
impresión digital del ADN novedosa y muy potente para los ADN de
cualquier origen o complejidad. Puede también ser usada en
combinación con el ARN y de esta forma aplicada a diferencias
puntuales en los niveles de ARNm entre dos cepas o dos condiciones.
Esto es llamado: Despliegue Diferencial. Aplicamos esta técnica
para identificar genes que están expresados más fuertemente con los
títulos de penicilina incrementados.
Después de determinar las secuencias de los
fragmentos PCR, las búsquedas de homología y las comparaciones de
secuencias fueron ejecutadas como sigue. Los términos usados aquí
para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más
polinucleótidos son bien conocidos en el arte, como es ejemplificado
en las Patentes de U.S. Nos. 5,912,120 y 5,914,393.
Las secuencias de polinucleótidos aquí
discutidas se refieren a polímeros de cadena sencilla o doble de
bases de deoxiribonucleótidos o ribonucleótidos como se lee a
partir de sus respectivos extremos 5’ y 3’. Una secuencia de
referencia en este aspecto es definida como una secuencia de
polinucleótidos, al menos 20 nucleótidos en longitud, usada como
base para una comparación entre frecuencias. La secuencia de
referencia comprende una secuencia de genes o ADNc de longitud
completa en una lista de secuencias, o la secuencia de referencia
comprende una porción de una secuencia de genes o ADNc de longitud
completa.
Una comparación de las secuencias de dos
polinucleótidos (o más de dos) puede estar restringida a una
"ventana de comparación" para determinarla la similitud de
secuencias en una región local de los dos polinucleótidos. Una
"ventana de comparación" es definida como una serie continua de
al menos 20 nucleótidos en una secuencia del primer polinucleótido,
la cual cuando está alineada con una secuencia de referencia de al
menos 20 nucleótidos contiguos, permite una comparación de las
secuencias del primer polinucleótido y la de referencia. El segmento
de nucleótidos contiguos en la "ventana de comparación" del
primer polinucleótido puede comprender adiciones y/o eliminaciones
tales como, por ejemplo, huecos, de hasta 20% de la secuencia de
referencia. La identidad de secuencias u homología local dentro de
la "ventana de comparación" del primer polinucleótido y el
polinucleótido de referencia puede ser lograda a través de la
alineación de las secuencias de acuerdo al algoritmo de Smith y
Waterman (Appl. Math. 2:482 (1981), o mediante otro algoritmo o
método de alineación apropiado (Needleman y Wunsch, J. Mol. Bio.
48:443 (1970); Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad, Sci. (USA)
85:2444 (1988)).
La identidad de secuencias es establecida cuando
el primer polinucleótido y el polinucleótido de referencia exhiben
similitud completa de secuencias en base a nucleótido por nucleótido
a lo largo de toda la extensión de la "ventana de
comparación". Sin embargo, polinucleótidos que tienen identidad
sustancial con un polinucleótido de referencia pueden ser
contemplados, donde un polinucleótido que tiene identidad sustancial
con un polinucleótido de referencia exhibe la misma función que el
polinucleótido de referencia. Por "identidad sustancial" se
entiende que un polinucleótido tiene bases de ácido nucleico casi
idénticas en una "ventana de comparación" localizadas en
posiciones que corresponden a aquellas del polinucleótido de
referencia. El número de posiciones bases de coincidencia dividido
por el número total de posiciones comparadas, multiplicado por 100
por ciento, produce lo que es conocido como porcentaje de identidad
de secuencias (también conocido como porcentaje de homología de
secuencias) entre los polinucleótidos comparados.
La secuencia de referencia es obtenida a través
de una reacción PCR en recuadros homólogos en las así llamadas
proteínas de Casete de Unión a ATP (ABC): los dominios Walker A y B.
Aunque la similitud de estas secuencias con los transportadores ABC
conocidos puede ser bastante alta, esto está concentrado en estas
regiones conservadas. La variabilidad en la identidad de secuencias
dentro de las secuencias conocidas es debida a la existencia de dos
subclases de secuencias, determinadas a través de la alineación de
secuencias del tipo clustal. Los transportadores ABC de levadura
han sido analizados en cuanto a la relación de la función (sustrato)
y la secuencia con otros transportadores ABC conocidos, y
clasificados como transportadores ABC y transportadores ABC tipo
MDR involucrados en la secreción de sustancias (Decottignies y
Goffeau, Nature Gen. 15: 137-145 (1998)). La
especificidad del sustrato de estas proteínas es en parte conferida
a las regiones fuera de los dominios conservados.
El procedimiento anteriormente esbozado es
aplicable a todas las secuencias que son partes de esta
invención.
\newpage
Para los propósitos de esta invención, el método
BlastP y BlastN (Versión 2.0.6, fecha de puesta en circulación
Septiembre de 1998, que corre bajo el software de Biomax
Bioinformatics GmbH, Martinsried, GE) son preferidos para
determinar el grado de identidad entre dos secuencias de
aminoácidos, usando los siguientes parámetros:
| Valor de expectación (E) | : | 10 |
| Costo de abrir un hueco | : | 11 |
| Costo de extender un hueco | : | 1 |
| Matriz | : | Blosum 62 |
Oligonucleótidos degenerados complementarios a
los motivos Walker A y Walker B relativamente
conservados, presentes en el dominio de unión a nucleótidos (NBD)
de los transportadores ABC, fueron usados en las reacciones
RT-PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa con
Transcriptasa Inversa) en aislados de ARN total a partir de cepas
de P. chrysogenum (por ejemplo Wisconsin
54-1255 y Panlabs P2). Para aumentar la presencia de
los transcritos de los transportadores de la penicilina putativos
en los acervos de ARN total, las cepas antes mencionadas fueron
cultivadas bajo condiciones de producción de penicilina. La
RT-PCR resultó en la formación de un fragmento de
ADN de alrededor de 400 bp, el cual es el tamaño esperado. El
fragmento fue clonado en el vector pGEM-T Easy
(Promega) y 32 clones individuales fueron analizados. 10 secuencias
diferentes fueron obtenidas (debido a que dos clones múltiples que
contenían secuencias idénticas). Las secuencias de estos fragmentos
(ver las SEQ ID NO. 7, 11, 14, 17, 21, 24, 29, 32, 37 y 40)
mostraron una alta identidad de secuencias para varios genes
transportadores ABC de otros organismos.
Muestras de un cultivo de alimentación en lotes
que produce \beta-lactama de Penicillium
chrysogenum fueron usadas para aislar el ARN. Un análisis AFLP
como fue descrito anteriormente entre las muestras A y B (ver
Figura 2) fue realizado. Fueron encontrados dos transcritos que se
incrementaron aproximadamente 8-10 veces durante la
fermentación. Sorprendentemente, estas dos secuencias de
polinucleótidos (ver las SEQ ID NO. 43 y 46) mostraron una alta
identidad de secuencias para varios genes transportadores ABC de
otros organismos.
Esto indica que existe la necesidad de una alta
actividad transportadora ABC cuando la concentración de penicilina
G es alta, lo que confirma el papel directo de estos transportadores
en la exportación de penicilina G.
Los clones de los transportadores ABC de
Penicillium chrysogenum aislados fueron sometidos a un
estudio de expresión para determinar las condiciones bajo las
cuales los genes transportadores son regulados. El análisis
Northern fue conducido en muestras de ARN obtenidas de un organismo
sometido a dos condiciones diferentes de cultivo. El ARN total fue
aislado de una cepa de producción elevada cultivada en glucosa o
bajo condiciones óptimas para la producción de penicilina V. Las
hibridaciones, blotting y electroforesis del ARN fueron realizadas
como se describió por Schuurs y otros, 1997 (Genetics 147:
589-596).
El análisis Northern mostró una expresión
remarcablemente elevada de los 5 genes transportadores ABC
analizados (aa1, aa5, aa6, aa7 y aa10) durante las
condiciones de fermentación de la penicilina V (ver Figura 3). De
esta forma, durante la fermentación de la penicilina, el P.
chrysogenum expresó de manera específica genes transportadores
ABC cuyo producto proteína demostró ser un transportador de la
\beta-lactama.
Todos los clones de los transportadores ABC de
Penicillium chrysogenum aislados por PCR fueron sometidos a
un estudio de expresión usando un chip de ADN. Por el contrario del
análisis Northern aquí el ADN está unido a un filtro e hibridado
con ARNm marcado. Además, nosotros aplicamos la técnica de tal
manera que es posible omitir el paso de RT-PCR
normalmente aplicado en los experimentos de ADN y directamente
marcamos el ARNm.
\newpage
El filtro fue preparado salpicando 12 \mug del
vector pGEM-Easy desnaturalizado que contiene el
fragmento amplificado por PCR (como se describió en el ejemplo 3)
sobre un filtro Hybond-N^{+} (Amersham Pharmacia
Biotech); esto significa que aproximadamente 1 \mug de cada
fragmento del transportador ABC está en el filtro.
Las muestras de ARN fueron obtenidas a partir de
la cepa Wisconsin54-1255 sometida a dos condiciones
diferentes de cultivo. El ARN total fue aislado del cultivo del
hongo en glucosa o bajo condiciones óptimas para la producción de
la penicilina G. El ARN fue preparado argamasando el granulado
fúngico congelado y lavado con trizol. Los pasos siguientes fueron
realizados esencialmente como es descrito en los manuales de
laboratorio (por ejemplo Sambrook y otros (1989) Clonación
Molecular: un manual de laboratorio (2da ed), Cold Spring Harbor
Press, CSH, NY). El ARNm fue aislado de 3 \mug de ARN total con
el Kit Oligotex mRNA Midi (Qiagen).
Antes de la hibridación 1 \mug de ARNm fue
marcado de acuerdo con el kit ECL (Pharmacia Amersham Biotech):
- \bullet
- 1 \mug/20 \mul de ARNm fue desnaturalizado bullendo por 5 minutos en un baño de agua
- \bullet
- después de 5 minutos el ARNm fue directamente colocado en hielo por 5 minutos
- \bullet
- 20 \mul de reactivo de marcación fueron añadidos y suavemente mezclados
- \bullet
- 20 \mul de solución de glutaraldehido fueron añadidos y mezclados
- \bullet
- la mezcla fue incubada por 15 minutos a 37ºC
El blot fue primero
pre-hibridado por 30-45 minutos con
buffer de hibridación (500 ml de buffer de hibridación ECL + 25 mg
de reactivo bloqueador ECL + 14 g de NaCl) a 42ºC en un tubo en un
horno rostizador. La sonda marcada fue añadida a 50 ml del buffer
de hibridación después de la pre-hibridación. La
hibridación fue llevada a cabo durante toda la noche a 42ºC en un
tubo en un horno rostizador. Posteriormente, el blot fue lavado dos
veces durante 20 minutos a 42ºC con buffer de lavado primario
(ureum 6 M, 0.4% SDS, 0.2 x SSC) en un tubo en un horno rostizador
y lavado dos veces durante 5 minutos a temperatura ambiente con
buffer de lavado secundario (2 x SSC) en un receptáculo con
agitación suave. La detección comenzó mezclando 10 ml de reactivo 1
de detección ECL con 10 ml de reactivo 2 de detección ECL. Los blots
lavados fueron colocados en la mezcla de detección por un minuto,
enrollados en bolsas plásticas y colocados en un casete con una
película fotográfica.
Como es representado en la Figura 4 todos los
genes transportadores ABC muestran claramente una expresión elevada
durante las condiciones de fermentación de la penicilina G.
El Penicillium chrysogenum fue
pre-cultivado durante toda la noche en un medio rico
(por ejemplo YEPD) y luego diluido en un medio definido que
contenía lactosa como la única fuente de carbono para asegurar las
condicione de derepresión. Después de 24 horas el cultivo fue
lavado y resuspendido en un medio fresco que contenía 100 mM de
penicilina V, 10 mM de ácido 7-amino
deacetoxicefalosporánico (7-ADCA) y 100 mM de
adipoil-7-ADCA, respectivamente. En
diferentes puntos de tiempo fueron tomadas muestras para el
aislamiento del ARN con trizol. Este material fue usado como un
patrón para una RT-PCR semi cuantitativa, usando
perlas de RT-PCR de Amersham/Pharmacia. El programa
PCR fue como sigue: 30 minutos a 42ºC (el paso RT); 5 minutos a
95ºC; seguido por 20 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 30 segundos a
59ºC y 45 segundos a 72ºC; seguido por un paso final de 7 minutos a
72ºC y enfriamiento a 4ºC. Los cebadores usados fueron: cebador
sentido aa7 (SEQ ID. 49): 5’-ATT GGC TGA GAC AGC AAA TCT
CGC-3’. cebador antisentido aa7 (SEQ ID. 50):
5’-AGG ATC GGA AAT GAG GGC GC-3’. cebador sentido
aa10 (SEQ ID. 51): 5’-AGC GGT TCT ATC TCC CAG TCG GAG
G-3’. cebador antisentido aa10 (SEQ ID. 52):
5’-CAC GAG CGA TGG CAA TAC GTT GC-3’. cebador
sentido dd062 (SEQ ID. 53): 5’-TGG AGT GCC CGA TGA TGT
ATG-3’. cebador antisentido dd062 (SEQ ID.
54): 5’-CGC GAG GTT GCT ACC TGG AGA G-3’.
De los tres transportadores ABC analizados
(aa7, aa10 y dd062) todos respondieron de manera
positiva a la adición de \beta-lactamas (ver
respectivamente la Figura 5, 6 y 7).
El Penicillium chrysogenum fue
precultivado hasta la fase semi-logarítmica en un
medio rico (por ejemplo YEPD) cuando 100 mM de penicilina G fueron
añadidos al cultivo. En diferentes puntos de tiempo fueron tomadas
muestras para el aislamiento del ARN con trizol. Este material fue
analizado con un Northern blot (como se describió en el ejemplo 5)
usando el fragmento PCR clonado en el vector pGEM-T
Easy (como se describió en el ejemplo 3) como una sonda.
La inducción de la penicilina G en la
transcripción del gen transportador ABC tiene lugar en presencia de
altas concentraciones de glucosa y subsiguientemente la ausencia de
producción de penicilina (ver la Figura 8).
\vskip1.000000\baselineskip
Una biblioteca de ADN genómico de P.
chrysogenum en fago lambda fue evaluada de manera exitosa usando
fragmentos de 400 bp del vector pGEM-T Easy (ver
ejemplo 3) como sondas. La hibridación fue llevada a cabo durante
toda la noche en: 1 mM de EDTA; Na_{2}HPO_{4} 0,5 M, pH 7.2;
SDS 7%, Agente bloqueador 1% (Cat. No. 1096176, Roche Molecular
Biochemicals). El lavado fue efectuado 2x 30 minutos en: 1 mM de
EDTA; 40 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7.2; SDS 5%, seguido por 2x 30
minutos en: 1 mM de EDTA; 40 mM de Na_{2}HPO_{4}, pH 7.2; SDS
1%. Todos los pasos fueron realizados a la temperatura astringente
de 65ºC. Las muestras fueron marcadas con 32P a través de PCR (25
microCi 32P dCTP, Oligolabelling Kit de protocolo estándar
(27-9520-01, Pharmacia Biotech). El
ADN de clones positivos fue extirpado in vivo recogiendo el
fago núcleo de las placas de interés; transferirlo a 500 \mul de
buffer y 20 \mul de cloroformo; la incubación subsiguiente de 2
horas a temperatura ambiente libera las partículas del fago. 200
\mul de células XL-1 Blue (cultivadas en medio LB
hasta una OD600=1) fueron mezcladas con 200\mul de las partículas
de fago y 10 \mul del fago auxiliador R408 (Cloning Kit ZAP
II/EcoRI en Lambda Predigerida; Catálogo #236211,
Stratagene). Esto fue incubado por 15 minutos a 37ºC, y
posteriormente 5 ml del medio 2XTrypton fueron añadidos para otra
incubación de 3 horas a 37ºC. La temperatura fue incrementada hasta
70ºC durante 20 min, la mezcla fue revuelta durante 5 minutos a 4000
g y transformada a células hospederas XL-1
Blue.
Estos clones fueron secuenciados (ver las SEQ ID
NO. 25 y 34). El gen aa7 contiene un intrón putativo,
mientras el aa10 no contiene intrones (ver las SEQ ID NO. 26
y 35).
Estos clones fueron aislados directamente a
partir de la biblioteca en el fago lambda. Los métodos empleados
fueron los mismos descritos para aa7 y aa10. Las
secuencias genómicas de aa1 y aa5 son representadas en
las SEQ ID No. 8 y 18. Como es presentado en las SEQ ID NO. 9 y 19
estos genes contienen mucho más intrones: 8 y 4,
respectivamente.
El ADN cromosómico de una cepa de alta
producción de Penicillium chrysogenum (por ejemplo Panlabs
P2) fue digerido con 5 enzimas de restricción diferentes;
EcoRI, HindIII, SalI, BamHI y
PstI. 3 \mug del ADN cromosómico digerido fue separado en
un gel de agarosa al 0.4% con bromuro de etidio y el ADN fue
transferido en un filtro hybond-N^{+} (Pharmacia
Amersham Biotech) mediante blotting al vacío y posteriormente
reticulado por medio de luz UV.
Como sondas amplificamos los fragmentos de
aproximadamente 400 bp de los genes transportadores ABC mediante
PCR a partir de vectores pGEM-T easy (ver ejemplo
3). Los productos PCR fueron purificados a partir de gel con el Gel
Extraction Kit (Qiagen). La hibridación fue esencialmente la misma
que se describió en el ejemplo 6. Señales de hibridación fueron
obtenidas para todas las sondas.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia de proteína más larga derivada de
cada gen transportador descrito en esta invención fueron analizadas
usando el software blastP con ajustes como los descritos en el
ejemplo 2.
El gen genómico total descrito anteriormente fue
usado como un ADN patrón para una reacción PCR con dos cebadores
homólogos, los cuales insertan un sitio de restricción NdeI
solo 5’ del codón de inicio y un sitio de restricción NsiI
solo 3’ del codón de parada. El fragmento resultante fue clonado en
un vector de expresión. Para esto el vector pISEWA, como es
descrito en PC/EP99/03455, fue digerido con NdeI y
NsiI. El promotor pcbC fue reemplazado por uno de los
promotores apropiados mencionados en el texto. Los plásmidos
resultantes fueron transformados a Penicillium chrysogenum
(usando la co-transformación con el gen amdS
de A. nidulans bajo el control del promotor gpdA de
A. nidulans) y la producción de penicilina fue analizada como
se describió anteriormente y se encontró que había mejorado.
Los genes genómicos totales anteriormente
descritos de aa7 y aa10 fueron alterados insertando un marcador de
selección heterólogo como el gen amdS de Aspergillus
nidulans bajo el control del promotor gpdA de A.
nidulans. Los transformantes que crecieron en las placas de
agar con acetamida como la única fuente de nitrógeno fueron
seleccionados. La colonia PCR fue empleada para seleccionar los
integrantes homólogos a partir de transformantes aleatorios. El
análisis Southern confirmó la disrupción del gen aa7 y aa10 descrito
en esta invención.
Representación esquemática del dominio de unión
a nucleótidos C-terminal (NBD) encontrado en los
transportadores ABC. Se ofrecen ejemplos de algunas secuencias
Walker A y Walker B encontradas en una variedad de transportadores
ABC. Las secuencias de aminoácido encerradas en los cuadros fueron
usadas para desarrollar cebadores degenerados. (AtrA y
AtrB de A. nidulans; MDR1 de humano;
CDR1 de C. albicans; ATM1 y STE6 de
S. cerevisiae, MalK e HisP de E.
coli).
Representación esquemática de una curva típica
de la producción de penicilina con Penicillium chrysogenum.
Las muestras en los puntos de tiempo indicados A y B fueron usadas
para el aislamiento de ARNm y el análisis AFLP subsiguiente.
Análisis Northern que muestran la expresión de
varios fragmentos de los genes transportadores ABC aislados, a
partir de una cepa de alta producción (por ejemplo Panlabs P2 o
Wisconsin54-1255) cultivada en un medio que
contiene glucosa o bajo condiciones óptimas para la producción de
penicilina V. La expresión del gen pcbC (que codifica la enzima
biosintética de la penicilina isopenicilina N sintetasa) fue usada
como un control positivo; expresión específica bajo las condiciones
de producción de la penicilina. El 18S ARNr y el gen
actA (gen de actina, aislado a partir de una biblioteca de
ADNc mediante PCR) fueron usados para verificar la carga igual de
gel.
Análisis del filtro de ADN que muestra la
expresión de varios fragmentos de los genes transportadores ABC
aislados. El ARNm fue aislado a partir de
Wisconsin54-1255 cultivada en un medio que contiene
glucosa o bajo condiciones óptimas para la producción de penicilina
G. Todos los genes mostraron expresión elevada cuando se producía
penicilina G. Panel-superior:
Wisconsin54-1255 que produce penicilina G. Panel
inferior: Wisconsin54-1255 cultivada en glucosa
(que no produce penicilina G).
Experimentos al paso del tiempo después de la
adición de los antibióticos \beta-lactámicos al
cultivo de crecimiento de los mutantes del aa7 de Penicillium
chrysogenum. En el experimento el gen de actina fue usado como
un control para las cantidades iguales del material de partida. El
tiempo es indicado en minutos.
Como en la figura 5, pero ahora para los mutante
del aa10 de Penicillium chrysogenum.
Como en la figura 5, pero ahora para los mutante
del DD062 de Penicillium chrysogenum.
El análisis al paso del tiempo de la
transcripción del aa5 después de la adición de la penicilina G a un
cultivo de Penicillium chrysogenum.
(SEQ ID NO. 3) Cebador sentido degenerado I
(complementario al motivo Walker A)
5'-TCI GGI KSI GGI AAT WCI
AC-3'
(SEQ ID NO. 4) Cebador sentido degenerado II
(complementario al motivo Walker A)
5'-TCI GGI KSI GGI AAT AGY
AC-3'
(SEQ ID NO. 5) Cebador antisentido degenerado I
(complementario al motivo Walker B)
5'-TCI ARI SCI GAI GTI GSY TCR
TC-3'
(SEQ ID NO. 6) Cebador antisentido degenerado II
(complementario al motivo Walker B)
5'-TCI ARI SCR CTI GTI GSY TCR
TC-3'
(SEQ ID NO. 7) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa1 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 8) Secuencia de ADN genómico
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa1
(Mostradas en negrita están las secuencias complementarias a los
cebadores de los motivos Walker, la secuencia de ADNc de la (SEQ ID
NO. 7) está subrayada):
(SEQ ID NO. 9) Traducción de la secuencia de ADN
genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa1 (La secuencia de ADN es mostradas por encima de
la línea discontinua, mostradas en negrita están las secuencias
intrón putativas que son empalmadas durante el procesamiento de ARN;
la secuencia de aminoácidos derivada es mostrada por debajo de la
línea discontinua, el codón de inicio y el de parada son mostrados
en letra itálica):
(SEQ ID NO. 10) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa1 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la (SEQ ID NO. 8)):
(SEQ ID NO. 11) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3 (Mostrado en
negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de los
motivos Walker usadas para la PCR):
(SEQ ID NO. 12) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3 de
la SEQ ID NO. 11:
(SEQ ID NO. 13) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3 (derivada de
la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO. 11):
(SEQ ID NO. 14) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4 (Mostrado en
negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de los
motivos Walker usadas para la PCR):
(SEQ ID NO. 15) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4 de
la SEQ ID NO. 14:
(SEQ ID NO. 16) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4 (derivada de
la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO. 14):
(SEQ ID NO. 17) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa5 (Mostrado en
negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de los
motivos Walker usadas para la PCR):
(SEQ ID NO. 18) Secuencia de ADN genómico
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum
aa5:
(SEQ ID NO. 19) Traducción de la secuencia de
ADN genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa5 (La secuencia de ADN es mostradas por encima de
la línea discontinua, mostradas en negrita están las secuencias
intrón putativas que son empalmadas durante el procesamiento de ARN;
la secuencia de aminoácidos derivada es mostrada por debajo de la
línea discontinua, el codón de inicio y el de parada son mostrados
en letra itálica):
(SEQ ID NO. 20) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa5 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la (SEQ ID NO. 18)):
(SEQ ID NO. 21) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 22) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6 de
la SEQ ID NO. 21:
(SEQ ID NO. 23) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 21):
(SEQ ID NO. 24) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 24) Secuencia de ADNc parcial,
grande del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7
(Mostradas en negrita están las secuencias complementarias a los
cebadores de los motivos Walker; la secuencia de ADNc más pequeña
de la SEQ ID NO. 23 está subrayada):
(SEQ ID NO. 25) Secuencia de ADN genómico
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7
(Mostradas en negrita están las secuencias complementarias de los
motivos Walker; la secuencia de ADNc de la figura 23 está
subrayada; la secuencia de ADNc del la SEQ ID NO. 24 está en letra
itálica):
(SEQ ID NO. 26) Traducción de la secuencia de
ADN genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa7 (La secuencia de ADN es mostradas por encima de
la línea discontinua, mostradas en negrita están las secuencias
intrón putativas que son empalmadas durante el procesamiento de ARN;
la secuencia de aminoácidos derivada es mostrada por debajo de la
línea discontinua, el codón de inicio y de parada son mostrados en
letra itálica):
(SEQ ID NO. 28) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 26):
(SEQ ID NO. 29) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 30) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8 de
la SEQ ID NO. 29:
(SEQ ID NO. 31) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 29):
(SEQ ID NO. 32) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 33) Secuencia de ADNc parcial,
grande del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10
(Mostradas en negrita están las secuencias complementarias a los
motivos Walker; la secuencia de ADNc más pequeña de la SEQ ID NO.
23 está subrayada):
(SEQ ID NO. 34) Secuencia de ADN genómico
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum
aa10 (Mostradas en negrita están las secuencias complementarias
a los motivos Walker; la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO. 32 está
subrayada; la secuencia de ADNc de la SEQ ID NO. 33 está en letra
itálica):
(SEQ ID NO. 35) Traducción de la secuencia de
ADN genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa10 (La secuencia de ADN es mostradas por encima
de la línea discontinua, la secuencia de aminoácidos derivada es
mostrada por debajo de la línea discontinua, el codón de inicio y de
parada son mostrados en letra itálica):
(SEQ ID NO. 36) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 34):
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO. 37) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO. 38) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20 de
la SEQ ID NO. 37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO. 39) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 37):
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(SEQ ID NO. 40) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32 (Mostradas
en negrita están las secuencias complementarias a los cebadores de
los motivos Walker usados para la PCR):
(SEQ ID NO. 41) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32 de
la SEQ ID NO. 40:
(SEQ ID NO. 42) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 42):
(SEQ ID NO. 43) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034 (La
secuencia es derivada del experimento AFLP):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO. 44) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034
de la SEQ ID NO. 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(SEQ ID NO. 45) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 43):
(SEQ ID NO. 46) Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062 (La
secuencia es derivada del experimento AFLP):
(SEQ ID NO. 47) Traducción de la secuencia de
ADNc del transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062
de la SEQ ID NO. 46:
(SEQ ID NO. 45) Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 46):
<110>
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA MEJORAR LA SECRECIÓN DE
COMPUESTOS DE \beta-LACTAMA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> WC 2958
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm 0000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm 0000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sentido degenerado I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcnggnksng gnaarwcnac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sentido degenerado II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcnggnksng gnaaragyac
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador antisentido degenerado I
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcnarnscng angtngsytc rtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador antisentido degenerado
II
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcnarnscrc tngtngsytc rtc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de AND genómico completa
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7744
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 0141k
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1383)............(1694)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1748).........(2404)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2460).........(3638)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3695).........(3871)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3926).........(4027)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4093).........(4452)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4538).........(4690)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4770).........(4901)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5000).........(5671)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia genómica
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum
aa1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1248
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia genómica
completa del transportador ABC de Penicillium chrysogenum
aa1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 387
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).........(387)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3 de la
SEQ ID NO. 11
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 129
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa3 (derivada de
la secuencia de ADN mostrada en la (SEQ ID NO. 11))
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).........(408)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4 de la
SEQ ID NO. 14
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa4 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 14)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 402
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de AND genómica completa
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa5
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7529
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (119).........(796)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (852).........(1535)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1603).........(2862)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2882).........(4195)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADN
genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa5 derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 408
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).........(408)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6 de la
SEQ ID NO. 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 136
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa6 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 21)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de AND genómico completa
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7476
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2072).........(5506)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5560).........(5907)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADN
genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3416
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial, grande
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1261
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa7 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 26)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADC parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).........(405)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8 de la
SEQ ID NO. 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 135
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa8 (derivada de
la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 29)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 411
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial, grande
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de AND genómico completa
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> 8777
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADN
genómico completa del transportador ABC de Penicillium
chrysogenum aa10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2227).........(6225)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1333
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa10 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 34)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)............(396)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20 de la
SEQ ID NO. 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa20 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 37)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia parcial de ADNc del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1).........(396)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32 de la
SEQ ID NO. 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 132
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum aa32 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 40)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 184
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2).........(181)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034 de la
SEQ ID NO. 43
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd034 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 43)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de ADNc parcial del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 459
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5).........(457)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Traducción de la secuencia de ADNc
del transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062 de la
SEQ ID NO. 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 151
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Penicillium chrysogenum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la proteína del
transportador ABC de Penicillium chrysogenum dd062 (derivada
de la secuencia de ADN como es mostrada en la SEQ ID NO. 46)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido aa7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipattggctgag acagcaaatc tcgc
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido aa7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggatcggaa atgagggcgc
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido aa10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcggttcta tctcccagtc ggagg
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido aal0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcacgagcgat ggcaatacgt tgc
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador sentido dd062
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptggagtgccc gatgatgtat g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador antisentido dd062
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcgaggttg ctacctggag ag
\hfill22
Claims (13)
1. Método para mejorar la secreción de un
compuesto de \beta-lactama a partir de un
microorganismo, capaz de producir compuestos de
\beta-lactama que comprende el paso de mejorar una
actividad transportadora ABC de dicho microorganismo, que comprende
el paso de transformar dicho microorganismo con al menos un casete
de expresión que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo
que consiste de las SEQ ID NO. 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21,
22, 24, 25, 26, 27, 29, 30, 34, 35, 37, 38, 46 y 47 o un
polinucleótido el cual muestra un porcentaje de similitud de al
menos el 60% con estas secuencias de polinucleótidos, que codifican
un transportador ABC homólogo o heterólogo.
2. Método de acuerdo a la reivindicación 1,
donde dicho polinucleótido codifica un transportador ABC el cual
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste de las SEQ ID NO. 10, 13, 16, 20, 23, 28, 31, 36, 39, y 48
o un polipéptido el cual muestra un porcentaje de similitud de al
menos el 60% con estas secuencias de polipéptidos.
3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 o
2, donde dicho microorganismo es un hongo.
4. Método de acuerdo a la reivindicación 3,
donde dicho hongo es seleccionado del grupo que consiste de
Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum, Aspergillus
nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha y Pichia
pastoris.
5. Método de acuerdo a la reivindicación 1 o
2, donde dicho microorganismo es una bacteria, preferiblemente un
actinomiceto, aún más preferiblemente un actinomiceto seleccionado
del grupo que consiste de Streptomyces clavuligerus, Nocardia
lactamdurans, Flavobacterium sp.
6. Un polinucleótido aislado que codifica una
secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las
SEQ ID NO. 10, 13, 16, 20, 23, 28, 31, 36, 39, y 48 o una secuencia
la cual muestra un porcentaje de similitud de al menos el 95% con
estas secuencias de aminoácidos.
7. Un polinucleótido aislado que comprende una
secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste de las
SEQ ID NO. 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27,
29, 30, 32, 33, 34, 35, 37, 38, 46 y 47, o un polinucleótido el
cual muestra una similitud de al menos el 95% con estas secuencias
de polinucleótidos.
8. Un vector que comprende un polinucleótido
de acuerdo a la reivindicación 7.
9. Un vector de acuerdo a la reivindicación 8
donde la secuencia de polinucleótidos codifica un transportador ABC
y donde dicho polinucleótido esta operablemente unido a las
secuencias regulatorias apropiadas para la expresión del
transportador ABC en una célula hospedera apropiada.
10. Una célula hospedera transformada que
comprende el vector de la reivindicación 8 o 9.
11. Uso de un polinucleótido aislado de acuerdo
a la reivindicación 6 o 7 y un vector de acuerdo a la reivindicación
8 o 9 en un método para mejorar la producción de compuestos de
\beta-lactama en un microorganismo capaz de
producir compuestos de \beta-lactama.
12. Método para mejorar la producción de un
compuesto de \beta-lactama en un microorganismo
capaz de producir compuestos de \beta-lactama que
comprende el paso de mejorar la actividad transportadora ABC de
dicho microorganismo, que comprende el paso de transformar dicho
microorganismo con al menos un casete de expresión que comprende un
polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NO.
7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26, 27, 29, 30,
34, 35, 37, 38, 46 y 47 o un polinucleótido el cual muestra un
porcentaje de similitud de al menos el 60% con estas secuencias de
polinucleótidos, que codifican un transportador ABC homólogo o
heterólogo, y subsiguientemente cultivar dicho microorganismo bajo
condiciones que permitan la producción de dichos compuestos de
\beta-lactama.
13. Un transportador ABC aislado codificado por
un gen transportador ABC que comprende una secuencia de nucleótidos
de acuerdo a una SEQ ID NO seleccionada del grupo que consiste de
las SEQ ID NO. 7, 8, 9, 11, 12, 14, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 26,
29, 30, 32, 33, 34, 37, 38, 46 y 47.
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| EP99203691 | 1999-11-03 | ||
| EP99203690 | 1999-11-03 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2283331T3 true ES2283331T3 (es) | 2007-11-01 |
Family
ID=27582989
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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