ES2283368T3 - Anticuerpos biespecificos anti-cd19 y anti-cd16 y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo multivalente multimérico, caracterizado por las características siguientes: (a) tiene al menos dos especificidades; (b) al menos un dominio de unión de antígenos es específico de C19 humana; y (c) al menos un dominio de unión de antígenos es específico de C16 humana.

Description

Anticuerpos biespecíficos anti-CD19 y anti-CD16 y usos de los mismos.

La presente invención se refiere a anticuerpos multivalentes multiméricos que comprenden al menos dos sitios de unión específicos para el marcador de células B humanas CD19 y receptor III Fc\gamma humano (CD16). La presente invención se refiere también a polinucleótidos que codifican dichos anticuerpos así como a vectores que comprenden dichos polinucleótidos, células hospedadoras transformadas con ellos y su uso en la producción de dichos anticuerpos. Finalmente, la presente invención se refiere a composiciones, preferentemente composiciones farmacéuticas y de diagnóstico, que comprenden cualquiera de los polinucleótidos, anticuerpos o vectores mencionados anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son útiles para inmunoterapia, preferentemente frente a malignidades de células B como linfoma no hodgkiniano.

El linfoma no hodgkiniano (LNH) abarca un grupo heterogéneo de malignidades hematológicas de origen de células B y T que se producen en la sangre, los nódulos linfáticos y la médula ósea, que se diseminan normalmente por todo el cuerpo. El LNH es una de las pocas malignidades que han aumentado de frecuencia por encima del aumento de la población, con aproximadamente 53.000 nuevos casos aparecidos anualmente en los Estados Unidos. Las formas más comunes de LNH se derivan del linaje de las células B. Aunque el LNH puede tratarse con éxito razonable en las fases tempranas e intermedias, los resultados de la quimioterapia y radioterapia convencionales en fases avanzadas siguen siendo decepcionantes. Esto es cierto sobre todo en los linfomas prevalentes de grado bajo. Un número bastante grande de pacientes recaen y la mayoría de las remisiones no pueden extenderse más allá de la enfermedad residual mínima. Esta situación desalentadora ha estimulado la búsqueda de estrategias terapéuticas alternativas, como activación de mecanismos inmunitarios del hospedador usando anticuerpos biespecíficos (AcBe) (van Spriel y col., Immunol. Today 21 (2000), 391-397). El AcBe forma un puente entre la célula tumoral y la célula efectora inmunitaria seguido por el desencadenamiento de las respuestas citotóxicas que incluyen liberación de perforina y granzima, apoptosis mediada por Fas y producción de citocina. Como los LNH expresan normalmente uno o más marcadores de células B, por ejemplo CD19 o CD20, estos marcadores pueden usarse para redirigir las células efectoras hacia células B malignas. Aunque las células B normales también se destruirán, se repueblan a partir de células madre que carecen de los antígenos diana. Para mediar la lisis redirigida, un AcBe debe unir una célula diana directamente a una molécula desencadenante en el efector. Los receptores desencadenantes citotóxicos mejor estudiados son complejos de señalización multicadena, como complejo de receptor de células T (TCR)/CD3 en la célula T, Fc\gammaRIIIa (CD16) una célula asesina natural (NK), Fc\gammaRI (CD64) y Fc\gammaRI (CD89) expresados por monocitos, macrófagos y granulocitos. Los AcBe dirigidos al complejo TCR/CD3 tienen el potencial de dirigirse a todas las células T, con independencia de su especificidad HCM natural. Así, se han generado y usado diferentes formas de AcBe CD19 x CD3 en una serie de estudios terapéuticos in vitro y in vivo. Estos AcBe se han producido principalmente usando hibridomas híbridos de roedores o mediante reticulación química de dos anticuerpos monoclonales. Sin embargo, la respuesta de anticuerpo antimurino humano (HAMA) y la liberación de citocinas inflamatorias son los principales inconvenientes de AcBe obtenidos de anticuerpos de roedores en uso clínico. Por otra parte, la inmunoterapia basada en CD3 requiere estimulación adicional de la población de células T a través de una señal suministrada por un correceptor distinto. Por tanto, los AcBe disponibles hasta ahora adolecen de baja citotoxicidad de células T y de la necesidad de agentes coestimuladores con el fin de mostrar una actividad biológica satisfactoria.

Así, el problema técnico que subyace a la presente invención era proporcionar medios adecuados para terapia de malignidades de células B que superasen las desventajas de los medios de la técnica anterior.

La solución a dicho problema técnico se consigue proporcionando las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones. La presente invención se basa en la observación de que la generación de anticuerpos que se basan en la redirección de células NK tiene un efecto terapéutico positivo, ya que, a diferencia de las células T, los mediadores celulares portadores de FcR de inmunidad innata como, por ejemplo, las células NK (y los monocitos, macrófagos y granulocitos) tienden a existir en estados constitutivamente activados y no necesitan (pre)estimulación
adicional.

Además, los AcBe monoclonales usados hasta ahora para terapia tienen dominios constantes de inmunoglobulina, que son responsables de reacciones inmunitarias no deseadas (respuesta HAMA). Así, una forma de realización preferida de los anticuerpos de la presente invención es AcBe que sólo comprenden los dominios variables de inmunoglobulina, denominados módulos F_{v}, por medio de los cuales pueden evitarse las respuestas inmunitarias no deseadas. Además, tienen una estabilidad que los hace útiles para usos terapéuticos. El módulo F_{v} está formado por asociación de los dominios variables de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera, V_{H} y V_{L}, respectivamente. La molécula biespecífica, denominada diabody específico (DcBe), puede formarse por la asociación no covalente de dos productos de fusión monocatenarios, consistente en el dominio V_{H} de un anticuerpo conectado por un corto espaciador al dominio V_{L} de otro anticuerpo. Alternativamente, puede formarse AcBe, diabody tándem (AcTan) por homodimerización de moléculas monocatenarias que comprenden cuatro dominios variables de anticuerpos (V_{H} y V_{L}) de dos especificidades diferentes, en una orientación que evita la formación de Fv formación intra-
molecular.

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Breve descripción de los dibujos

Fig. 1

Organización genética de operón que codifica CD19 x CD16 bivalente DcBe (A) y modelo de proteína de DcBe (B)

His_{6}: seis restos de histidina en el extremo C terminal; L: espaciador peptídico de 10 aminoácidos corto
SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta dominios V_{H} y V_{L}; líder, secuencia líder bacteriana (por ejemplo, líder PeIB) para secreción de producto recombinante en periplasma; p/o: promotor/operador; rbs, sitio de unión a ribosoma; Stop: codón de parada (TAA); etiqueta: epítopo en el extremo C terminal para inmunodetección; V_{H} y V_{L}: regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras específicas de CD16 o de CD19.

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Fig. 2

Organización genética de operón que codifica CD19 x CD16 tetravalente AcTan (A) y modelo de proteína de AcTan (B)

His_{6}: seis restos de histidina en el extremo C terminal; L: espaciador peptídico de 10 aminoácidos corto
SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta dominios V_{H} y V_{L}; líder, secuencia líder bacteriana (por ejemplo líder PeIB) para secreción de producto recombinante en periplasma; p/o: promotor/operador; rbs, sitio de unión a ribosoma; SL: espaciador peptídico de 12 aminoácidos ArgAlaAspAlaAlaAlaAlaGlyGlyProGlySer entre dominios en la mitad de la molécula; Stop: codón de parada (TAA); etiqueta: epítopo en el extremo C terminal para inmunodetección; V_{H} y V_{L}: regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras específicas de CD16 o de CD19.

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Fig. 3

Diagrama del plásmido de expresión pKID19x16

6xHis: secuencia que codifica seis restos de histidina en el extremo C terminal; bla: gen de beta-lactamasa responsable de resistencia a ampicilina; pb: pares de bases; epítopo c-myc: secuencia que codifica para un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; ColE1: origen de la replicación de ADN; f1 IR: región intergénica de bacteriófago f1; Lac P/O: promotor/operador de Lac-operón de tipo natural; Espaciador L: secuencia que codifica el péptido de 10 aminoácidos SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; líder PeIB: secuencia peptídica de señal de la pectatoliasa bacteriana; RBS: sitio de unión a ribosoma LacZ; V_{H} y V_{L}: secuencia que codifica para la región variable de la cadena pesada y ligera de inmunoglobina, respectivamente. Se indican los sitios de restricción únicos.

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Fig. 4

Diagrama del plásmido de expresión pSKID19x16

6xHis: secuencia que codifica seis restos de histidina en el extremo C terminal; bla: gen de beta-lactamasa responsable de resistencia a ampicilina; pb: pares de bases; epítopo c-myc: secuencia que codifica para un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; hok-sok: locus de ADN de estabilización de plásmido; LacI: gen que codifica Lac-represor; Lac P/O: promotor/operador Lac-operón de tipo natural; Espaciador L: secuencia que codifica el péptido de 10 aminoácidos SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; M13 IR: región intergénica de bacteriófago M13; pBR322ori: origen de la replicación de ADN; líder PeIB: secuencia peptídica de señal de la pectatoliasa bacteriana; SDI: secuencia de Shine-Dalgarno (sitio de unión a ribosoma) obtenida de gen Lacz de E. coli (IacZ); SD2, SD2 y SD3: secuencia de Shine-Dalgarno para el gen 10 fuertemente expresado de bacteriófago T7 (T7g10); gen skp: gen que codifica factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tHP: terminador transcripcional fuerte; tLPP: terminador de lipoproteína de transcripción; V_{H} y V_{L}: secuencia que codifica para la región variable de la cadena pesada y ligera de inmunoglobina, respectivamente. Se indican los sitios de restricción únicos.

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Fig. 5

Secuencias de nucleótidos y aminoácidos deducidas del DcBe CD19 x CD16 en el plásmido de expresión pSKID19x16

6xHis: secuencia que codifica seis restos de histidina en el extremo C terminal; CDR: región determinante de complementariedad de la cadena pesada (H) o ligera (L) de inmunoglobina; epítopo c-myc: secuencia que codifica para un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; Lac P/O: promotor/operador de Lac-operón de tipo natural; LacZI: gen que codifica el péptido amino terminal de beta-galactosidasa; Espaciador L: secuencia que codifica el péptido de 10 aminoácidos SerAlaLysThrThrProLysLeuGlyGly que conecta los dominios V_{H} y V_{L}; líder peIB: secuencia peptídica de señal de la pectatoliasa bacteriana; SDI: secuencia de Shine-Dalgarno (sitio de unión a ribosoma) obtenida del gen LacZ de E. coli (IacZ); SD2, SD2 y SD3: secuencia de Shine-Dalgarno para el gen 10 fuertemente expresado de bacteriófago T7 (T7g10); V_{H} y V_{L}: secuencia que codifica para la región variable de la cadena pesada y ligera de inmunoglobina, respectivamente. Se indican los sitios de restricción usados para reordenamiento génico. Los codones de inicio y parada de traducción se muestran en negrita.

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Fig. 6

Análisis de DcBe CD19 x CD16 purificado por cromatografía de exclusión de tamaño en una columna Superdex 200 calibrada

Se indican las posiciones de elución de patrones de masa molecular.

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Fig. 7

Análisis de DcBe CD19 x CD16 purificado por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) al 12% en condiciones reductoras

Ruta 1, marcadores M_{r} (kDa, M_{r} en millares); Ruta 2, DcBe CD19 x CD16. El gel se tiñó con Coomassie. Se indican las posiciones de scFv V_{H}16-V_{L}19 y V_{H}19-V_{L}16 híbridos.

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Fig. 8

Análisis de Lineweaver-Burk de dependencia de fluorescencia en concentración de diabodys CD19 x CD16 según se determina por citometría de flujo

Se midió la unión de diabodys a células JOK-1 CD19^{+} y células 293-CD16 CD16^{+}.

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Fig. 9

Retención de DcBe CD19 x CD16 en la superficie de células JOK-1 CD19^{+} y células 293-CD16 CD16^{+} a 37ºC

Los valores se expresan como un porcentaje de la intensidad de fluorescencia media inicial.

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Fig. 10

Lisis de células CD19^{+} Raji por LSP humanos a diferentes relaciones efector:diana (E:T) en presencia de DcBe CD19 x CD16 a concentración de 0,5, 1 y 5 mg/ml

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Fig. 11

Lisis de células CD19^{+} Raji por células NK humanas a diferentes relaciones E:T en presencia de DcBe CD19 x CD16 a concentración de 0,5, 1 y 5 mg/ml

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Fig. 12

Tratamiento de ratones con inmunodeficiencia combinada severa (IDCS) portadores de xenoinjertos de linfoma de Burkitt humanos

Los ratones recibieron PBS (cuadrados blancos), LSP humanos en solitario (cuadrados negros), o LSP humanos seguido 4 h más tarde de la administración de DcBe CD19 x CD16 (círculos negros). El tamaño del tumor se midió cada segundo día. Se presentan las curvas de crecimiento tumoral de animales individuales hasta el día 30 de experimento.

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Fig. 13

Supervivencia de ratones con IDCS portadores de xenoinjertos de linfoma de Burkitt humanos

Los ratones recibieron PBS (cuadrados blancos), LSP humanos en solitario (cuadrados negros) o LSP humanos seguido 4 h más tarde por la administración de DcBe CD19 x CD16 (círculos negros).

En consecuencia, la presente invención se refiere a un anticuerpo multivalente multimérico, caracterizado por las características siguientes:

(a) tiene al menos dos especificidades;

(b) al menos un dominio de unión de antígenos es específico para C19 humana; y

(c) al menos un dominio de unión de antígenos es específico para C16 humana.

El anticuerpo de la presente invención es específico para C19 humana en células B malignas y para C16 humana en células NK citotóxicas. Dicho anticuerpo es capaz de destruir células tumorales positivas para CD19 por reclutamiento de células NK humanas sin ninguna necesidad de pre- y/o co-estimulación. Esto se encuentra en intenso contraste con cualquier célula efectora de redirección de moléculas biespecíficas conocida para células diana positivas para CD19, como AcBe CD19 x CD3 o CD19 x CD28. La independencia con respecto a pre- y/o co-estimulación de la población de células efectoras puede contribuir sustancialmente al efecto terapéutico de dichos anticuerpos por aumento de los efectos secundarios adversos, como síndrome de liberación de citocina.

Los anticuerpos de la presente invención pueden prepararse por procedimientos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, por los procedimientos siguientes:

(a) Acoplamiento químico de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos específicos para C19 y CD16 humanas, respectivamente, por medio de espaciadores heterobifuncionales.

(b) Fusión de líneas celulares de hibridomas que están ya disponibles y que secretan anticuerpos monoclonales específicos para C19 y C16 humanas respectivamente

(c) Transfección de los genes de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina de al menos dos especificidades diferentes en células de mieloma murino u otros sistemas de expresión eucariotas y aislamiento de los anticuerpos multiespecíficos polivalentes.

También es objeto de la presente invención proporcionar un anticuerpo por medio del cual pueden evitarse respuestas inmunitarias no deseadas, como una respuesta HAMA.

Así, en una forma de realización preferida, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención está desprovisto de regiones constantes. Esto se consigue, por ejemplo, construyendo una molécula recombinante, que consiste sólo en dominios variables de inmunoglobulina (V_{H} y V_{L}) no inmunogénicos. Esto puede conseguirse también usando los dominios de anticuerpo de origen humano. Dichos anticuerpos pueden prepararse por procedimientos conocidos para los expertos en la materia, por ejemplo, por los procedimientos siguientes:

(a) Construcción de los anticuerpos Fv monocatenarios multivalentes multiméricos combinando los genes que codifican al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobina variables, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador, en un único constructo genético y expresándolo en bacterias u otros sistemas de expresión apropiados.

(b) Heterodimerización no covalente de dos fragmentos scFv híbridos, cada uno consistente en dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad (frente a CD19 o CD16), ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador, como consecuencia de coexpresión de genes correspondientes o co-replegamiento de precursores correspondientes expresados por separado.

(c) Homodimerización no covalente de anticuerpos Fv monocatenarios que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad (frente a CD19 o CD16) ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador, en una orientación que impide su apareamiento intramolecular.

En una forma de realización preferida, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un anticuerpo Fv monocatenario que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobina variables, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador.

El término "anticuerpo Fv" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un anticuerpo que contiene dominios variables pero no dominios constantes. El término "espaciador peptídico" según se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a cualquier péptido capaz de conectar dos dominios variables con su longitud dependiente de las clases de dominios variables que se vayan a conectar. El espaciador peptídico puede contener cualquier resto de aminoácido, prefiriéndose los restos de aminoácidos glicina, serina y prolina.

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un anticuerpo Fv monocatenario que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobina variables, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador. Dicho anticuerpo puede generarse, por ejemplo, combinando los genes que codifican al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobina variables, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador, en un único constructo genético y expresándolo en bacterias u otro sistema de expresión apropiado.

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En una forma de realización más preferida adicional, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un heterodímero de dos anticuerpos Fv monocatenarios híbridos, cada uno consistente en dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad frente a CD19 o CD16, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador. Dicho anticuerpo puede generarse, por ejemplo, por heterodimerización no covalente de dos anticuerpos Fv monocatenarios híbridos, cada uno consistente en dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad (frente a CD19 o CD16), ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador, como consecuencia de co-expresión de genes correspondientes o co-replegamiento de precursores correspondientes expresados por separado.

En una forma de realización alternativa, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un homodímero de anticuerpos Fv monocatenarios que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad frente a CD19 o CD16, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo multivalente multimérico, en el que dicho dominio de unión de antígenos imita o corresponde a regiones V_{H} y V_{L} de un anticuerpo natural. Preferentemente, dicho anticuerpo natural es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo sintético o anticuerpo humanizado.

En una forma de realización preferida adicional, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un anticuerpo, en el que (a) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}16-V_{L}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}19-V_{L}16; o (b) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}16-V_{H}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}19-V_{H}16.

Preferentemente, el espaciador peptídico que conecta los dominios variables V_{H} y V_{L} comprende de 0 a 12 aminoácidos, preferentemente 10 aminoácidos.

En una forma de realización preferida adicional, los dominios variables V_{H} o V_{L} del anticuerpo multivalente multimérico están acortados por al menos un resto de aminoácido en su extremo N y/o C terminal.

En una forma de realización más preferida, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención es un anticuerpo en el que (a) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}16-V_{L}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}19-V_{L}16; o (b) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}16-V_{H}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}19-V_{H}16 y en el que los dos anticuerpos Fv monocatenarios híbridos están conectados por medio de un espaciador peptídico. Una longitud preferida de este espaciador peptídico es de 0 a 30 aminoácidos, siendo más preferida una longitud de 12 aminoácidos.

Los espaciadores peptídicos de los anticuerpos multivalentes multiméricos de la presente invención pueden comprender cualquier resto de aminoácido; sin embargo, se prefieren restos de alanina, glicina, serina y prolina.

La unión no covalente del anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención puede reforzarse por la introducción de al menos un puente de disulfuro entre al menos un par de dominios V. Esto puede conseguirse modificando las secuencias de ADN que codifican los dominios variables consiguientemente, es decir, insertando en cada una de las secuencias de ADN que codifican los dos dominios un codón que codifica un resto de cisteína o sustituyendo un codón por un codón que codifica un resto de cisteína.

Finalmente, el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención puede modificarse además usando convencional técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, usando deleción(es), inserción(es), sustitución(es), adición(es) y/o recombinación(es) de aminoácidos y/o cualquier otra modificación o modificaciones conocidas en la técnica ya sea en solitario o en combinación. Los procedimientos para introducir dichas modificaciones en la secuencia de ADN subyacente a la secuencia de aminoácidos de un dominio variable o espaciador peptídico son bien conocidos para los expertos en la materia; véase, por ejemplo, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.

Los anticuerpos multivalentes multiméricos de la presente invención pueden comprender al menos un compuesto más, por ejemplo, un dominio de proteínas, estando dicho dominio de proteínas unido por enlaces covalentes o no covalentes. La unión puede basarse en fusión genética según los procedimientos conocidos en la técnica y descritos anteriormente o puede realizarse, por ejemplo, por reticulación química según se describe, por ejemplo, en el documento WO-94/04.686. El dominio adicional presente en la proteína de fusión que comprende el anticuerpo empleado de acuerdo con la invención puede unirse preferentemente mediante un espaciador flexible, ventajosamente un espaciador peptídico, en el que dicho espaciador peptídico comprende varios aminoácidos hidrófilos de unión peptídica de una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C terminal de dicho dominio de proteínas adicional y el extremo N terminal del anticuerpo o viceversa. La proteína de fusión descrita anteriormente puede comprender además un espaciador de escisión o un sitio de escisión para proteinasas. Así, por ejemplo, al menos un monómero del anticuerpo puede unirse a una molécula efectora que tiene una conformación adecuada para actividad biológica o unión selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa (por ejemplo, una citocina u hormona del crecimiento), un agente químico (por ejemplo, doxorrubicina, ciclosporina), un péptido (por ejemplo, \alpha-amanitina), una proteína (por ejemplo, granzima A y B) o un fármaco.

Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la preparación de un anticuerpo Fv multimérico multivalente según la presente invención, en el que (a) secuencias de ADN que codifican los espaciadores peptídicos están ligadas con las secuencias de ADN que codifican los dominios variables de modo que los espaciadores peptídicos conectan los dominios variables dando como resultado la formación de una secuencia de ADN que codifica a monómero del anticuerpo Fv multimérico multivalente y (b) las secuencias de ADN que codifican los diversos monómeros se expresan en un sistema de expresión adecuado. Las diversas etapas de este procedimiento pueden efectuarse según procedimientos estándar, por ejemplo procedimientos descritos en Sambrook y col., o descritos en los Ejemplos, más adelante.

La presente invención también se refiere a un polinucleótido que codifica el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención y vectores, preferentemente vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos.

Puede usarse una diversidad de sistemas de vector de expresión/hospedador que contengan y expresen secuencias que codifican el anticuerpo multimérico multivalente. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos recombinantes; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células vegetales transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322); o sistemas de células animales. La invención no está limitada por la célula hospedadora empleada.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" son esas regiones no traducidas de los potenciadores de vector, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' que interaccionan con proteínas celulares del hospedador para efectuar la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su fuerza y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y el hospedador usados, puede usarse cualquier serie de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles como el promotor LacZ híbrido del fagémido Bluescript.RTM. (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido pSport1.TM. (Gibco BRL) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus puede usarse en células de insecto. Los promotores o potenciadores obtenidos de los genomas de células vegetales (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO; y genes de proteínas de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores o líderes de secuencia virales) pueden clonarse en el vector. En sistemas de células de mamífero son preferibles promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario generar una línea celular que contenga copias múltiples de la secuencia que codifica el anticuerpo multivalente multimérico, pueden usarse vectores basados en SV40 o VEB con un marcador seleccionable apropiado.

En sistemas bacterianos, puede seleccionarse una serie de vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para el anticuerpo multivalente multimérico. Los vectores adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pSKK para expresión en bacterias.

En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, puede usarse una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles como factor alfa, alcohol-oxidasa y PGH. Para revisión, véase Grant y col. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544.

En casos en que se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de secuencias que codifican el anticuerpo multivalente multimérico puede impulsarse por cualquiera de una serie de promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores virales como los promotores 35S y 19S de CaMV en solitario o en combinación con la secuencia líder omega a partir de TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). Alternativamente, pueden usarse promotores vegetales como la pequeña subunidad de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi, G. y col. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. y col. (1984) Science 224:838-843; y Winter, J. y col. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). Estos constructos pueden introducirse en células vegetales por transformación directa de ADN o transfección mediada por patógeno. Dichas técnicas se describen en una serie de revisiones disponibles generalmente (véase, por ejemplo, Hobbs, S. y Murry, L. E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, Nueva York, N.Y.; pág. 191-196).

También puede usarse un sistema de insecto para expresar el anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención. Por ejemplo, en un sistema semejante, se usa virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en Trichoplusia larvae. Las secuencias que codifican el anticuerpo multivalente multimérico pueden clonarse en una región no esencial del virus, como el gen polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa del gen que codifica el anticuerpo multivalente multimérico volverá inactivo el gen polihedrina y producirá virus recombinante carente de cubierta proteínica. A continuación pueden usarse los virus recombinantes para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o Trichoplusia larvae en las que puede expresarse APOP (Engelhard, E. K. y col. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).

En las células hospedadoras de mamífero puede usarse una serie de sistemas de expresión de base viral. En casos en que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican el anticuerpo multivalente multimérico pueden ligarse en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus consistente en el promotor tardío y secuencia líder tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral puede usarse para obtener un virus viable que es capaz de expresar el anticuerpo multivalente multimérico en células hospedadoras infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). Además, los potenciadores de transcripción, como el potenciador del virus del sarcoma de Rous (VSR), pueden usarse para aumentar la expresión en células hospedadoras de mamífero.

Pueden emplearse también cromosomas artificiales humanos (CAH) para suministrar mayores fragmentos de ADN que pueden contenerse y expresarse en un plásmido. Los CAH de 6 a 10 M se construyen y suministran por medio de procedimientos de suministro convencionales (liposomas, polímeros amino policatiónicos o vesículas) para fines terapéuticos.

También pueden usarse señales de inicio específicas para conseguir una traducción más eficaz de secuencias que codifican el anticuerpo multivalente multimérico. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En casos en que se insertan secuencias que codifican el anticuerpo multivalente multimérico, su codón de inicio, y secuencias en sentido ascendente en el vector de expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control transcripcional o traduccional adicionales. Sin embargo, en el caso en que sólo se inserta la secuencia codificadora, deberían proporcionarse señales de control traduccional incluyendo el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción del inserto completo. Los elementos traduccionales exógenos y los codones de inicio pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede potenciarse por la inclusión de potenciadores que son apropiados para el sistema celular particular que se use, como los descritos en la bibliografía (Scharf, D. y col. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).

Además, puede elegirse una cepa de células hospedadoras por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar las cadenas de anticuerpo expresado en la forma deseada. También puede usarse un procesamiento post-traduccional que escinde una forma "prepro" de la proteína para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Hay disponibles diferentes células hospedadoras que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para actividades post-traduccionales (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, REH293 y W138), en la American Type Culture Collection (ATCC; Bethesda, Md.) y pueden elegirse para asegurar la correcta modificación y procesamiento de las cadenas de anticuerpos extraños.

Para la producción a largo plazo de alto rendimiento de anticuerpos recombinantes, se prefiere expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable el anticuerpo multivalente multimérico pueden transformarse usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógena y un gen marcador seleccionable en los mismos o en un vector separado. Después de la introducción del vector, puede dejarse crecer las células durante 1-2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de manera estable pueden proliferarse usando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de células.

Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, genes de timidincinasa del virus del herpes simple (Wigler, M. y col. (1977) Cell 11:223-32) y adenin-fosforribosiltransferasa (Lowy, I. y col. (1980) Cell 22:817-23) que pueden emplearse en células tk.sup. o aprt.sup., respectivamente. También puede usarse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler, M. y col. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. y col. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14) y als o pat, que confieren resistencia a clorsulfuron y fosfinotricin-acetiltransferasa, respectivamente (Murry, anteriormente). Se han descrito genes seleccionables adicionales como, por ejemplo, trpB, que permite que las células usen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células usen histinol en lugar de histidina (Hartman, S. C. y R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). Recientemente, el uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores como antocianinas, beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, siendo ampliamente usados no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína temporal o estable atribuible a un sistema de vectores específico (Rhodes, C. A. y col. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).

Un vector de expresión preferido en particular es pSKID19x16 depositado en DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellen, colección alemana de microorganismos y células) según el Tratado de Budapest como DSM 14529 el 24 de septiembre de 2001.

La presente invención también se refiere a una composición que contiene un anticuerpo multivalente multimérico de la presente invención, un polinucleótido o un vector de expresión. Preferentemente, dicha composición es una composición farmacéutica combinada preferentemente con un vehículo farmacéutico aceptable o una composición de diagnóstico que comprende opcionalmente además medios adecuados para detección. Los ejemplos de vehículo farmacéutico aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas con tampón de fosfato, agua, emulsiones, como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes de humectación, soluciones estériles, etc. Dichos vehículos pueden formularse mediante procedimientos convencionales y pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse por diferentes medios, por ejemplo, por administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La ruta de administración depende, naturalmente, de la naturaleza de la enfermedad, por ejemplo un tumor, y de la clase de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación estará determinado por el médico que atiende al paciente y otros factores clínicos. Como es bien conocido en las artes médicas, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, el área superficial del cuerpo, la edad, el sexo, el compuesto en particular que se administrará, el tiempo y la ruta de administración, la clase del trastorno, la salud general y otros fármacos que se estén administrando de forma concurrente.

Los usos médicos preferidos de los compuestos de la presente invención descritos anteriormente son el tratamiento de una malignidad de células B, preferentemente enfermedad no hodgkiniana, una enfermedad autoinmune de células B o un agotamiento de células B.

Otro asunto tratado en la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico, que comprende: (a) un anticuerpo multivalente multimérico según la invención, (b) un vector de expresión según la invención, y, opcionalmente, (c) agentes auxiliares convencionales, como tampones, disolventes y controles.

El anticuerpo multivalente multimérico puede marcarse de forma detectable. En una forma de realización preferida, dicho kit permite diagnóstico por ELISA y contiene el anticuerpo unido a un soporte sólido, por ejemplo, una placa de microvaloración de poliestireno o papel de nitrocelulosa, usando técnicas conocidas en la técnica. Alternativamente, dicho kit se basa en un RIA y contiene dicho anticuerpo marcado con un isótopo radioactivo. En una forma de realización preferida del kit de la invención, el anticuerpo multivalente multimérico se marca con enzimas, compuestos fluorescentes, compuestos luminiscentes, sondas ferromagnéticas o compuestos radiactivos.

Los ejemplos expuestos a continuación explican la invención en más detalle.

Ejemplo 1 Construcción de los plásmidos pKID19x16 y pSKID19x16 para la expresión de diabody CD19 x CD16 biespecífico bivalente en bacterias

Se construyeron genes que codifican para scFv híbridos V_{H}16-V_{L}19 y V_{H}19-V_{L}16 por intercambio de los genes anti-CD3 V_{H} y V_{L} en plásmidos pHOG3-19 y pHOG19-3 (Kipriyanov y col., 1998, Int. J. Cancer 77, 763-772) para sus contrapartidas humanas de anti-C16 (Amdt y col., 1999, Blood 94:2562-2568) usando sitios de restricción NcoI/HindIII e HindIII/XbaI, respectivamente. El plásmido de expresión pKID19x16 que contiene operón discitrónico para cosecreción de dos scFv híbridos se construyó por ligamiento del fragmento de restricción Bg/II/XbaI a partir de pHOG16-19 que comprende la estructura central del vector y el fragmento Bg/II/XbaI de pHOG19-16 (fig. 3).

Para aumentar el rendimiento de DcBe CD19 x CD16 funcional en el periplasma bacteriano, se generó un vector de expresión optimizado pSKID19x16 (fig. 4). Este vector se construyó sobre la base de plásmido pHKK (Horn y col., 1996, Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532) que contenía sistema suicida de células sin plásmido hok/sok (Thisted y col., 1994, EMBO J. 13, 1960-1968). Primero, se amplificó el gen que codifica para scFv V_{H}3-V_{L}19 híbrido por PCR a partir del plásmido pHOG3-19 (Kipriyanov y col., 1998, Int. J. Cancer 77, 763-772) usando los cebadores 5-NDE, 5'-GATATACATATGAAATACCTATTGCCTACGGC-3' y 3-AFL, 5'-CGAATTCTTAAGTTAG
CACAGGCCTCTAGAGACACACAGATCTTTAG-3'. El fragmento de PCR de 921 pb resultante se digirió con NdeI y AflII y se clonó en el plásmido linealizado NdeI/AflII pHKK que genera el vector pHKK3-19. Para suprimir un sitio XbaI adicional, se amplificó un fragmento de plásmido pHKK que contenía la parte 3'-terminal del gen LacI (codifica el represor Lac), el t_{HP} de terminador transcripcional fuerte tHP y el promotor/operador Lac de tipo natural por PCR usando cebadores 5-NAR, 5'-CACCCTGGCGCCCAATACGCAAACCGCC-3' y 3-NDE, 5'-GGTATTTCA
TATGTATATCTCCTTCTTCAGAAATTCGTAATCATGG-3'. El fragmento de ADN de 329 pb resultante se digirió con NarI y NdeI y se clonó en plásmido pHKK3-19 linealizado de NarI/NdeI que genera el vector pHKKDXba. Para introducir un gen que codifica el factor periplásmico Skp/OmpH para producción de anticuerpos recombinantes superiores (Bothmann y Plückthun, 1998, Nat. Biotechnol., 16, 376-380), el gen skp gen se amplificó por PCR con cebadores skp-3, 5'-CGAATTCTTAAGAAGGAGATATACATATGAAAAAGTGGTTATTAGCTGCAGG-3' y skp-4, 5'-CGAATTCTCGAGCATTATTTAACCTGTTTCAGTACGTCGG-3' usando como plantilla el plásmido pGAH317 (Holck y Kleppe, 1988, Gene 67, 117-124). El fragmento de PCR de 528 pb resultante se digirió con AflII y XhoI y se clonó en el plásmido pHKKDXba digerido AflII/XhoI dando como resultado el plásmido de expresión pSKK2.

El gen que codifica el scFv V_{H}16-V_{L}19 híbrido se aisló como un fragmento de ADN de 820 pb después de digestión de pHOG16-19 con NcolI y XbaI. Este gen se clonó en vector linealizado pSKK2 de NcoI/XbaI dando como resultado plásmido pSKK16-19. El gen que codifica el segundo scFv V_{H}19-V_{L}16 híbrido se amplificó a partir del plásmido pHOG19-16 por PCR con los cebadores 5-BGL, 5'-GCACACAGATCTGAGAAGGAGATATACATATGAAATACC
TATTGCCTACGGC-3', y pSEXBn, 5'-GGTCGACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG-3'. El fragmento de PCR resultante se digirió con BgIII y XbaI y se clonó en el plásmido linealizado pSKK16-19 de BgIII/XbaI que genera el vector de expresión pSKID19x16 (fig. 4). Este vector contiene varias características que mejoran el rendimiento del plásmido y conducen a una acumulación aumentada de producto bivalente funcional en el periplasma de E. coli en condiciones de cultivo de matraz vibrante y fermentación de alta densidad celular. Estos son el sistema de eliminación post-segregación hok/sok, que evita la pérdida de plásmidos, sitios de unión fuerte a ribosoma en tándem y un gen que codifica el factor periplásmico Skp/OmpH que aumenta el rendimiento funcional de fragmentos de anticuerpo en bacterias. La casete de expresión está bajo el control traduccional del promotor/sistema operador Lac wt e incluye una breve secuencia que codifica para el péptido de beta-galactosidasa en el extremo N terminal (IacZI) con un primer rbs obtenido del gen LacZ de E. coli, seguido por genes que codifican los dos scFv híbridos y el factor periplásmico Skp/OmpH bajo el control traduccional de fuerte rbs a partir de gen 10 de fago T7 (T7g10).

Las secuencias de nucleótidos y proteínas del DcBe CD19 x CD16 en plásmido pSKID19x16 se indican en la
fig. 5.

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Ejemplo 2 Producción en bacterias y purificación de diabody CD19 x CD16 biespecífico bivalente

Las células XL1-Blue de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) se transformaron con el plásmido de expresión
pKID19x16 o cepa RV308 de E. coli (Maurer y col.,1980, J. Mol. Biol., 139, 147-161) transformada con el plásmido de expresión pSKID19x16 se cultivaron durante toda la noche en medio 2xYT con 50 \mug/ml de ampicilina y glucosa 100 mM (2xYTGA) a 37ºC ó 26ºC, respectivamente. Se cultivaron diluciones (1:50) de los cultivos de toda la noche en 2xYTGA como cultivos de matraz a 37ºC (XL1-Blue) o a 26ºC (RV308) con agitación vigorosa (180 a 220 rpm) hasta que la densidad óptica (DO) a 600 nm alcanzó de 0,8 a 0,9. Se recogieron las bacterias por centrifugado a 5.000 g durante 10 min a 20ºC y se resuspendió en el mismo volumen de medio YTBS fresco (2xYT que contenía 1 M sorbitol, glicina-betaína 2,5 mM y ampicilina 50 \mug/ml. Se añadió isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,2 mM y se continuó el crecimiento a 20ºC durante 16 a 18 h. Se recogieron células por centrifugado a 9.000 g durante 20 min y 4ºC. En caso de usar RV308/pSKID19x16, se desechó el sobrenadante del cultivo. En contraste, se conservó el sobrenadante y se guardó en hielo para XL1-Blue/pKID19x16. Para aislar proteínas periplásmicas solubles, se resuspendieron las bacterias sedimentadas en el 5% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM enfriado en hielo, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, pH 8,0. Después de 1 h de incubación en hielo con agitación ocasional, se centrifugaron los esferoplastos a 30.000 g durante 30 min y 4ºC dejando el extracto periplásmico soluble como el sobrenadante y esferoplastos más el material periplásmico insoluble como el sedimento. Para RV308/pSKID19x16, se dializó minuciosamente el extracto periplásmico frente a Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0, y se usó como un material de partida para aislar DcBe CD19 x CD16. Para XL1-Blue/pKID19x16, se combinaron el sobrenadante de cultivo y el extracto periplásmico soluble y se aclararon por centrifugado adicional (30.000 g, 4ºC, 40 min). El producto recombinante se concentró por precipitado de sulfato de amonio (concentración final 70% de saturación). Se recogió el precipitado de proteína por centrifugado (10.000 g, 4ºC, 40 min) y se disolvió en el 10% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0 (material de partida). Se realizó cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) a 4ºC usando una columna de 5 ml de Sefarosa de Quelación (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania) cargada con Cu^{2+} y equilibrada con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0 (tampón de partida). La muestra se cargó haciendo pasar la muestra sobre la columna. A continuación se lavó con veinte volúmenes de columna de tampón de partida seguido por tampón de partida que contenía imidazol 50 mM hasta que la absorbancia (280 nm) del efluente fue mínima (aproximadamente treinta volúmenes de columna). El material absorbido se eluyó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, imidazol 250 mM, pH 7,0. La purificación final se consiguió por cromatografía de intercambio iónico en una columna Mono Q HR 5/5 (Amersham Pharmacia) en Tris-HCl 20 mM, pH 8,5 con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 1 M. Se concentraron las fracciones que contenían diabody con intercambio de tampón simultáneo para PBS que contenía imidazol 50 mM, pH 7,0 usando dispositivo de filtro centrífugo Ultrafree-15 (Millipore, Eschborn, Alemania). Se determinaron las concentraciones de proteínas mediante el ensayo de tinción-unión de Bradford (Bradford, 1976, Anal. Biochem., 72, 248-254) usando el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad (Munich, Alemania). El DcBe CD19 x CD16 purificado fue principalmente una forma dimérica con una masa molecular (M_{r}) de 60 kDa aproximadamente, según se demuestra por filtración de gel en una columna Superdex 200 HR 10/30 calibrada (Amersham Pharmacia) (fig. 6). El análisis SDS-PAGE demostró que el DcBe podía resolverse en dos bandas de proteínas correspondientes a la M_{r} calculada de 28.730 para scFv V_{H}16-V_{L}19 y M_{r} de 29.460 para scFv V_{H}19-V_{L}16 (fig. 7).

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Ejemplo 3 Determinación de afinidad de diabodys por resonancia de plasmón de superficie (RPS)

Las constantes cinéticas de interacción de DcBe CD19 x CD16 con dominio extracelular (DEC) de C16 humana se determinaron por RPS usando sistema biosensor BIAcore 2000 (Biacore, Uppsala, Suecia). Para inmovilización en un chip de sensor recubierto con estreptavidina SA (Biacore), el DEC de CD16 se biotiniló según un protocolo modificado del módulo de biotinilación de proteína ECL (Amersham Pharmacia). Como control negativo, se usó tubulina porcina biotinilada. Se aplicaron antígenos biotinilados diluidos en tampón HBS-EP (10 mM HEPES, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, polioxietilensorbitan al 0,005%; Biacore) a una concentración de 10 \mug/ml a un chip sensor a una velocidad de flujo de 5 \mul/min durante 4 min dando como resultado inmovilización de 800 unidades de resonancia (UR) de DEC de CD16 y 900 UR de tubulina. Todas las medidas de RPS se efectuaron a una velocidad de flujo de 20 \mul/min en HBS-EP a 25ºC. Los análisis se realizaron en ocho concentraciones de diabodys desde 6,25 a 800 nM. Cada muestra inyectada (100 \mul) estuvo en contacto con antígeno inmovilizado durante 5 min. La disociación se siguió durante 10 min después de cada ciclo, la superficie del chip sensor se lavó con el tampón. Las constantes cinéticas se calcularon según el modelo de unión 1:1 (Langmuir) usando el software BIAevaluation versión 3.0 (Biacore). DcBe CD19 x CD16 exhibió una constante de disociación bastante alta constante de disociación a partir del chip sensor recubierto con CD16, haciendo así innecesaria la regeneración de la superficie del biosensor. Las constantes de disociación y asociación fueron de 2,3 x 10^{-2} s^{-1} y 2,7 x 10^{4} s^{-1} M^{-1}, respectivamente, dando como resultado una K_{d} de 8,5 x 10^{-7} M (Tabla 1). De la evaluación de los niveles de unión en estado estacionario (Tabla 1) se deduce una constante de afinidad casi idéntica.

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TABLA 1 Afinidad y cinética de unión de DcBe CD19 x CD16 a DEC de CD16 según se determina por RPS

k_{on} (M^{-1} s^{-1})	k_{off} (s^{-1})	t_{1/2} (min)	K_{d} (M)	K_{eq} (M)
2,7 x 10^{4}	2,3 x 10^{-2}	0,5	8,5 x 10^{-7}	8,7 x 10^{-7}

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Se midieron los valores de k_{off} y k_{on} por RPS usando DEC de CD16 biotinilado inmovilizado. Se calcularon las constantes de afinidad ya sea mediante la relación k_{off}/k_{on} (K_{d}) o a partir del análisis de estado estacionario de datos RPS (K_{eq}). Se dedujo la semivida (t_{1/2}) para disociación de complejo diabody-antígeno a partir de la relación ln 2/k_{off}.

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Ejemplo 4 Medidas de unión a células

Se usó la línea de células B de CD19^{+} humana JOK-1 y células de riñón embrionario humano (REH) 293 transfectadas de manera estable con células de ADNc de CD16B humana (293-CD16) para experimentos de citometría de flujo. En breve, se incubaron 5 x 10^{5} células en 50 \mul de medio RPMI 1640 (GIBCO BRL, Eggestein, Alemania) suplementadas con FCS al 10% y azida sódica al 0,1% (referido como medio completo) con 100 ml de preparado de diabody durante 45 min en hielo. Después de lavado con medio completo, se incubaron las células con 100 \mul de 10 \mug/ml de AcM anti-c-myc 9E10 en el mismo tampón durante 45 min en hielo. Después de un segundo ciclo de lavado, se incubaron las células con 100 \mul de IgG antirratón marcado con FITC (GIBCO BRL) en las mismas condiciones que antes. A continuación se lavaron de nuevo las células y se resuspendieron en 100 \mul de 1 \mug/ml de solución de yoduro de propidio (Sigma, Deisenhofen, Alemania) en medio completo para excluir células muertas. Se midió la fluorescencia de células teñidas usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Se calculó la fluorescencia media (F) usando software Cellquest (Becton Dickinson) y se restó la fluorescencia de fondo. Se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (K_{eq}) ajustando los valores experimentales a la ecuación de Lineweaver-Burk: 1/F = 1/F_{max} + (K_{eq}/F_{max}) (1/[DcBe]) usando el programa de software GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA). Los experimentos de citometría de flujo demostraron una interacción específica de DcBe CD19 x CD16 con células JOK1 de CD19+ y células 293-CD16 que expresan DEC de C16 humana en su superficie. Sin embargo, las intensidades de fluorescencia obtenidas para interacción con células JOK-1 fueron significativamente superiores que las de células 293-CD16 que reflejan la diferencia de seis veces en valores de afinidad para los dos sitios de unión a antígeno (fig. 8, Tabla 2).

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Ejemplo 5 Retención superficial de células in vitro

Para investigar la relevancia biológica de las diferencias en los experimentos de unión directa, la retención in vitro del DcBe CD19 x CD16 en la superficie de células CD19^{+} y CD16^{+} a 37ºC se determinó por citometría de flujo (fig. 9). Se realizaron ensayos de superficie celular a 37ºC en condiciones que evitan la internalización de los antígenos de superficie celular, según se ha descrito (Adams y col., 1998, Cancer Res. 58, 485-490), con la salvedad de que la detección de diabody retenido se realizó usando AcM anti-c-myc 9E10 (IC Chemikalien) seguido por IgG antirratón marcada con FITC (GIBCO BRL). Los valores de constante de disociación cinética (k_{off}) y semivida (t_{1/2}) para disociación de diabodys se dedujeron a partir de un ajuste de desintegración exponencial de una fase de datos experimentales usando GraphPad Prism (GraphPad Software). DcBe CD19 x CD16 tenía una semivida (t_{1/2}) de retención relativamente corta en células 293-CD16 (3,6 min) y t_{1/2} 3 veces más larga en la superficie de células JOK1 de CD19^{+}, lo que se correlaciona bien con la afinidad de unión CD16 inferior deducida de experimentos de unión directa (Tabla 2). Para determinar si la actividad de CD19 de diabody está influida por la segunda fracción de la molécula biespecífica, DcBe CD19 x CD3 (Cochlovius y col., 2000, J. Inmunol. 165, 888-895; Kipriyanov y col., 1998, Int. J. Cancer 77, 763-772) se usó como control en todos los experimentos de citometría de flujo. Las células de unión directa y JOK-1 de CD19^{+} de retención de superficie celular fueron prácticamente indistinguibles para los dos diabodys. Los valores calculados de K_{eq}y t_{1/2} fueron 5,7 nM y 10,8 min, respectivamente, para DcBe CD19 x CD3, y 6,1 nM y 10,6 min para DcBe CD19 x CD16. Estos resultados indican que la segunda especificidad presente en el diabody biespecífico no afecta significativamente a la afinidad para unión a CD19.

TABLA 2 Afinidad y cinética de unión de DcBe CD19 x CD16 a antígenos de superficie celular

Células	k_{off} (s-1)	t_{1/2} (min)	K_{eq} (M)
JOK-1 (CD19+)	1,1 x 10^{-3}	10,6	6,1 x 10^{-9}
293-CD16 (CD16+)	3,2 x 10^{-3}	3,6	3,9 x 10^{-8}

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Los valores de k_{off} se dedujeron experimentos de retención de superficie de células JOK-1 y 293-CD16. Las constantes de disociación en equilibrio (K_{eq}) se dedujeron de gráficas de Lineweaver-Burk mostradas en la fig. 8. Los valores de semivida (t_{1/2}) para disociación de complejos diabody-antígeno se dedujeron de la relación ln 2/k_{off}.

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Ejemplo 6 Células tumorales asesinas in vitro

La eficacia del DcBe CD19 x CD16 en la mediación de lisis de células tumorales por linfocitos de sangre periférica (LSP) humana o células NK células se determinó usando la prueba JAM, que se basa en la medida de la fragmentación de ADN en la célula diana como consecuencia de apoptosis (Matzinger y col., 1991, J. Immunol. Meth. 145, 185-192). Se usó la línea celular Raji de linfoma de Burkitt que expresa CD19 como células diana. Como células efectoras se usaron LSP humanas activadas preparadas según se ha descrito (Kirpiyanov y col., 1998, Int. J. Cancer 77, 763-772) o células NK humanas. Las células NK se aislaron de sangre periférica por clasificación celular magnética usando el kit de aislamiento celular NK (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). Para el ensayo de eliminación de células, se mezclaron 10^{5} células efectoras en placas de microvaloración de base redonda con 10^{4} células diana marcadas con [^{3}H]-timidina en 100 \mul de medio más 50 \mul de muestra de diabody. Después de incubar la placa a 37ºC, CO_{2} al 50% durante 4 h, se recogieron las células y se midió la radioactividad con un contador beta de centelleo líquido (LKB, Wallach, Alemania). Se calculó la citotoxicidad relacionada con la fragmentación de ADN inducida por apoptosis como % asesinas específicas = (S-E)/S x 100, en la que E es ADN marcado retenido experimentalmente en presencia de asesinas (en cpm) y S es ADN retenido en ausencia de asesinas (espontáneo). La diferencia de medio se evaluó por prueba T en pares usando GraphPad Prism (GraphPad Software). La muerte de células Raji de CD19 en presencia de LSP recién preparado a partir de un donante sano se desencadenó específicamente por DcBe CD19 x CD16 de un modo dependiente de la dosis dando como resultado el 45% de eliminación específica para una concentración de DcBe de 5 \mug/ml y relación E:T de 50:1 (fig. 10). La sustitución de LSP por células NK aisladas de la sangre del mismo donante aumentó más el efecto citotóxico de DcBe CD19 x CD16 hasta el 60% en las mismas condiciones
(fig. 11).

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Ejemplo 7 Tratamiento de linfoma de Burkitt en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (IDCS)

Los ratones IDCS se obtuvieron de Charles River (Sulzfeld, Alemania) y se guardaron en condiciones específicas libres de patógenos en las Instalaciones Centrales de Animales del Centro Alemán de Investigación del Cáncer. En cada experimento, se usaron cohortes de cinco animales para permitir comparaciones precisas entre grupos tratados diferentemente. Se irradió a los ratones (300 rad) y recibieron inyecciones i.p. de 10 RI de anticuerpo monoclonal anti-asialo-GMi (Wako, Neuss, Alemania) según las sugerencias de los fabricantes. Un día más tarde, se inyectaron 10^{7} células Raji s.c. dorsolateralmente lo que llevó al desarrollo local de tumores. El tratamiento se inició después de que los tumores alcanzaran un tamaño de 5 mm de diámetro (día 0). En los días 0, 7, y 15, los animales recibieron inyecciones i.v. de PBS (grupo de control) o 5 x 10^{6} LSP humanas. Cuatro horas después de cada inoculación de LSP, se trató a los ratones con solución salina con tampón de fosfato (PBS) o con 50 \mug de DcBe CD19 x CD16 administrados por la vena caudal. Se midió el tamaño del tumor usando un calibre cada 2º día. Se siguió a los animales hasta que los tumores s.c. alcanzaron un tamaño máximo tolerado de 15 mm de diámetro y se les mató por dislocación cervical. Los días de sacrificio se registraron y se usaron para análisis de tiempo de supervivencia. Se llevó un seguimiento de los animales supervivientes hasta 60 días después del primer tratamiento. Para evaluación estadística, la duración de seguimiento del experimento de tratamiento tumoral fue de 30 días (fin de experimento). Los tiempos de supervivencia media se estimaron por el procedimiento descrito por Kaplan y Meier (1958, J. Am. Statist. Assoc. 53, 457-481). Se compararon las diferencias entre curvas de supervivencia usando una prueba de rango logarítmico (Mantel y Haenszel, 1959, J. Natl. Cancer Inst. 22, 719-748).

Todos los animales de los grupos de control que recibieron PBS o LSP en solitario no mostraron ninguna supresión de tumor y desarrollaron tumores mayores de 1,5 cm de diámetro en menos de 3 semanas (fig. 12). No hubo diferencia significativa entre el crecimiento tumoral en ratones que recibían PBS y ratones que recibían LSP activos en solitario, lo que indicó que en las condiciones usadas, podría ignorarse cualquier reacción alogénica de las células efectoras hacia el tumor. Los animales se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron el tamaño máximo tolerado de 15 mm de diámetro. Se registraron las fechas de sacrificio, y se calculó la supervivencia media para cada grupo (fig. 13). Los tiempos de supervivencia media no fueron significativamente diferentes en los grupos de control que recibieron PBS y LSP humanos en solitario a 21,5 y 23 días, respectivamente (P = 0,4469). En contraste con los grupos de control, todos los ratones que recibieron un DcBe CD19 x CD16 demostraron una significativa regresión tumoral. Los animales que recibieron tres inyecciones de diabody mostraron un tamaño de tumor mínimo en los días 15 a 20, cuando 2 de 5 ratones estaban libres de tumor. Posteriormente, sin embargo, los tumores empezaron de nuevo a crecer con velocidades comparables en todos los animales de este grupo (fig. 12). El tiempo de supervivencia media calculado para el grupo que recibió DcBe CD19 x CD16 (32,5 días) fue significativamente diferente de los grupos de control (P < 0,01). Estos datos in vivo confirman claramente el fuerte efecto antitumoral de DcBe CD19 x CD16, que recluta células NK humanas para el tumor diana.

<110> Afimed Therapeutics AG

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<120> Anticuerpos biespecíficos anti-CD19 y anti-CD16 y usos de los mismos

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<130> A 3017EU

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<140> EP 01127061.8

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<141> 2001-11-14

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<160> 15

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 1897

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<400> 1

1

2

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<210> 2

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<211> 264

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

3

4

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<210> 3

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<211> 272

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 3

5

6

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<210> 4

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: LacZ

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<400> 4

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\sa{Met Ile Thr Asn Phe}

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<210> 5

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<211> 22

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: líder PeIB

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala}

\sac{Ala Gln Pro Ala Met Ala}

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<210> 6

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Espaciador peptídico

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<400> 6

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\sa{Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly}

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<210> 7

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Espaciador peptídico

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<400> 7

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\sa{Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser}

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<210> 8

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatatacata tgaaatacct attgcctacg gc

\hfill

32

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<210> 9

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<211> 47

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaattctta agttagcaca ggcctctaga gacacacaga tctttag

\hfill

47

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 28

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

caccctggcg cccaatacgc aaaccgcc

\hfill

28

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<210> 11

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<211> 46

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtatttcat atgtatatct ccttcttcag aaattcgtaa tcatgg

\hfill

46

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgaattctta agaaggagat atacatatga aaaagtggtt attagctgca gg

\hfill

52

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

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<211> 40

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

cgaattctcg agcattattt aacctgtttc agtacgtcgg

\hfill

40

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 14

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcacacagat ctgagaagga gatatacata tgaaatacct attgcctacg gc

\hfill

52

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 15

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggtcgacgtt aaccgacaaa caacagataa aacg

\hfill

34

Claims (28)

1. Un anticuerpo multivalente multimérico, caracterizado por las características siguientes:

(a) tiene al menos dos especificidades;

(b) al menos un dominio de unión de antígenos es específico de C19 humana; y

(c) al menos un dominio de unión de antígenos es específico de C16 humana.

2. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 1, que está desprovisto de regiones constantes.

3. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 2, que es un anticuerpo Fv monocatenario que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de inmunoglobina variables, cada uno separado por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador.

4. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 2, que es un heterodímero de dos anticuerpos Fv monocatenarios híbridos, cada uno consistente en dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad frente a CD19 o CD16, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador.

5. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 2, que es un homodímero de anticuerpos Fv monocatenarios que comprende al menos cuatro dominios V_{H} y V_{L} de diferente especificidad frente a CD19 o CD16, ya sea separados por espaciadores peptídicos o por ningún espaciador.

6. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos dominios de unión de antígenos imitan o corresponden a regiones V_{H} y V_{L} de un anticuerpo natural.

7. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo natural es un anticuerpo monoclonal, anticuerpo sintético o anticuerpo humanizado.

8. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 4, en el que:

(a) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}16-V_{L}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{H}19-V_{L}16; o

(b) el primer anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}16-V_{H}19 y el segundo anticuerpo Fv monocatenario híbrido es V_{L}19-V_{H}16.

9. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que dicho espaciador peptídico comprende de 0 a 12 aminoácidos.

10. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 9, en el que dicho espaciador peptídico comprende 10 aminoácidos.

11. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en el que los dominios variables V_{H} o V_{L} están acortados por al menos un resto de aminoácido en su extremo N y/o C terminal.

12. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 8, en el que dos anticuerpos Fv monocatenarios híbridos están conectados mediante un espaciador peptídico.

13. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 12, en el que dicho espaciador peptídico tiene una longitud de 0 a 30 aminoácidos.

14. El anticuerpo multivalente multimérico según la reivindicación 13, en el que dicho espaciador peptídico tiene una longitud de 12 aminoácidos.

15. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, en el que dichos espaciadores peptídicos comprenden restos de alanina, glicina, serina y prolina.

16. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15, en el que la unión no covalente de al menos un par de dominios V está reforzada por al menos un puente de disulfuro.

17. El anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 16, en el que al menos un monómero está ligado a una molécula efectora que tiene una conformación adecuada para actividad biológica o unión selectiva a un soporte sólido, una sustancia biológicamente activa, un agente químico, un péptido, una proteína o un fármaco.

18. Un polinucleótido, que codifica un anticuerpo multivalente multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18.

20. El vector de expresión de la reivindicación 19, que es pSKID19x16 DSM 14529.

21. Una célula hospedadora que contiene el vector de expresión de la reivindicación 19 ó 20.

22. Un procedimiento para la preparación de un anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 17, en el que (a) secuencias de ADN que codifican los espaciadores peptídicos están ligadas con las secuencias de ADN que codifican los dominios variables de modo que los espaciadores peptídicos conectan los dominios variables para dar como resultado la formación de una secuencia de ADN que codifica un monómero del anticuerpo multivalente multimérico y (b) las secuencias de ADN que codifican los diversos monómeros se expresan en un sistema de expresión adecuado.

23. Una composición que contiene el anticuerpo multivalente multimérico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el polinucleótido de la reivindicación 18 o el vector de expresión de la reivindicación 19 ó 20.

24. La composición de la reivindicación 23, que es una composición farmacéutica que comprende además opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable o una composición de diagnóstico que comprende además opcionalmente medios adecuados para detección.

25. Uso del anticuerpo multivalente multimérico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, el polinucleótido de la reivindicación 18 o el vector de expresión de la reivindicación 19 ó 20 para la preparación de una composición farmacéutica para tratamiento de malignidades de células B, enfermedades autoinmunes mediadas por células B o la reducción del número de células B.

26. Uso según la reivindicación 25, en el que dicha malignidad de células B es linfoma no hodgkiniano.

27. Uso del polinucleótido de la reivindicación 18 o el vector de expresión de la reivindicación 19 ó 20 para la preparación de una composición para terapia génica.

28. Kit de diagnóstico, que comprende:

(a) un anticuerpo multivalente multimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17; y/o

(b) un vector de expresión según la reivindicación 19 ó 20.