ES2283653T3 - Tratamiento de glioblastoma con timosin alfa 1. - Google Patents

Abstract

El uso de una cloroetilnitrosourea en combinación con un péptido de timosina-alfa1 (TA1) para la fabricación de un medicamento para tratar el glioblastoma.

Description

Tratamiento del glioblastoma con timosin \alpha-1.

Datos de solicitud relacionados

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional 60/337.149, depositada el 10 de diciembre de 2001.

Antecedentes de la invención

El glioblastoma es la neoplasia maligna más común del SNC en adultos, y supone casi el 75% de los casos. Aunque se ha producido un progreso continuo en su tratamiento debido a mejoras en el neurodiagnóstico por imagen, microcirugía y radiación, los glioblastomas siguen siendo incurables (McDonald, 2001; Burton, 2000; Prados, 2000). La esperanza de vida media es de menos de un año desde el diagnóstico, y la tasa de supervivencia a cinco años tras una terapia agresiva que incluye una tumorectomía total es menor del 10% (Burton, 2000; Nieder, 2000; Napolitano, 1999; Dazzi, 2000). Los glioblastomas provocan la muerte debido a un crecimiento rápido, agresivo e infiltrante en el cerebro. El patrón de crecimiento infiltrante es responsable de la naturaleza no extirpable de estos tumores. Los glioblastomas también son relativamente resistentes a la radiación y la quimioterapia, y por lo tanto las tasas de metástasis tras el tratamiento son altas. Además, la respuesta inmune a las células neoplásicas es en su mayor parte ineficaz para erradicar completamente las células neoplásicas residuales tras la tumorectomía y la terapia de radiación (Roth, 1999; Dix, 1999; Sablotzki, 2000).

Las células malignas del glioma eluden la detección por parte del sistema inmune del hospedador produciendo péptidos inmunodepresores que alteran la proliferación de linfocitos T y la producción de IL-2 (Dix, 1999). El SNC es también un tanto inmunoprivilegiado, lo que permite que las células neoplásicas malignas crezcan sin ser detectadas. La búsqueda de un tratamiento eficaz de los glioblastomas en pacientes todavía continúa hoy en día. La inmunoterapia, o el tratamiento mediante la implicación del sistema inmune para luchar contra estas células neoplásicas, se ha investigado en muchos modelos. La fracción 5 de la timosina (TF5), la timosina \alpha-1 (timalfasina), el IFN-\alpha y la IL-2 son algunos de los muchos componentes inmunes que han sido estudiados por su capacidad para luchar contra las neoplasias malignas.

La carmustina (biscloroetilnitrosurea, BCNU o BiCNU) es un agente quimioterapéutico de la familia de las cloroetilnitrosoureas, que incluye otros agentes antineoplásicos tales como clorozotocina (DCNU) (Anderson, 1975), lomustina (CCNU) (Carter, 1968), nimustina (Saijo, 1980) y ranimustina (Sekido, 1979). Las cloroetilnitrosoureas se han utilizado como tratamiento de quimioterapia individualizado durante muchos años sobre tumores cerebrales primarios; sin embargo, la estadística histórica no siempre parece apoyar la eficacia de estos compuestos como terapia única en tumores cerebrales (por ejemplo, Aquafedda, y col.). La combinación de carmustina más radioterapia produjo un modesto beneficio en la supervivencia a largo plazo (18 meses) en pacientes afectados por un glioblastoma maligno, en comparación con la radioterapia sola, aunque la diferencia entre las curvas de supervivencia no era significativa en el nivel de 0,05 (Walker, 1980).

La timosina \alpha-1 (timalfasina) es un péptido de 28 aminoácidos, una forma sintética de un compuesto natural que se encuentra en la circulación (Bodey, 2000; Bodey, 2001). La timalfasina estimula el crecimiento y la diferenciación de los timocitos, la producción de IL-2, receptores de IL-2 en linfocitos T, IFN-\gamma e IFN-\alpha (Andreone, 2001; Sztein, 1989; Knutsen, 1999; Spangelo, 2000; Tijerina, 1997; Garbin, 1997; Attia, 1993; Cordero, 1992; Baxevamis, 1994 & 1990; Beuth, 2000). La timalfasina se ha usado ensayos clínicos para tratar infecciones por el virus de la hepatitis B (Chan, L-Y, 2001), infecciones por hepatitis C (Chan, H. L., 2001; Sherman, 1998; Schinazi), carcinomas del pulmón o de cabeza y cuello, melanomas (Bodey, 2000 & 2001; Garaci, 2000) y SIDA (Billich, 2002). Los prometedores resultados de estas investigaciones, combinados con la evidencia de una reactividad reducida de los linfocitos T frente a los glioblastomas, dieron lugar al presente trabajo para evaluar el potencial beneficio terapéutico de la inmunoterapia con timalfasina para el tratamiento de gliomas malignos, y determinar los mecanismos a través de los cuales la timalfasina ejerce sus efectos antineoplásicos.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere al uso de cloroetilnitrosourea en combinación con un péptido de timosina-\alpha1 (TA1) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de glioblastomas. Los glioblastomas son neoplasias malignas de alto nivel del sistema nervioso central (SNC) que casi siempre son fatales en los 12 meses después del diagnóstico. Estudios recientes mostraron que la inmunoterapia usando citocinas proinflamatorias tales como IL-2 o IL-12 puede prolongar la supervivencia de los pacientes con glioblastomas. La timosina-\alpha1 (timalfasina) es un péptido del timo que actúa como inmunomodulador, aumentando la producción de IL-2 y la proliferación de linfocitos T. El presente trabajo mostró una carga tumoral significativamente reducida y un aumento en la respuesta de las células inflamatorias linfomononucleares en sujetos tratados con timalfasina + BCNU con respecto a todos los demás grupos. Los experimentos in vitro demostraron que el tratamiento con timalfasina no tenía un efecto directo sobre la viabilidad o la función mitocondrial en células 9L cultivadas. Sin embargo, el tratamiento con timalfasina dio como resultado un aumento significativo de los niveles de expresión de genes proapoptóticos, incluyendo FasL, FasR y TNF\alpha-IR (65,89%, 44,08% y 22,18%, respectivamente). Además, el tratamiento con timalfasina hizo a las células 9L más sensibles al estrés oxidativo, de forma que dosis habituales no letales de H_{2}O_{2} destruyeron al 30-50% de las células 9L que habían sido tratadas con timalfasina. Estudios adicionales revelaron que la timalfasina aumenta la sensibilidad de las células 9L a la destrucción mediada por granzima B (linfocito T) o BCNU. Los resultados muestran que la timalfasina aumenta la eliminación mediada por cloroetilnitrosurea del glioblastoma in vivo y que la timalfasina media sus efectos activando mecanismos proapoptóticos, haciendo a las células neoplásicas más sensibles al estrés oxidativo y a la destrucción por parte de granzima B (linfocitos T) o quimioterapia.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra que la timalfasina tiene un efecto mínimo sobre la viabilidad de las células 9L y la función mitocondrial.

La Fig. 2 muestra un aumento en la expresión de los genes proapoptóticos en células 9L expuestas a timalfasina durante 72 horas.

La Fig. 3 muestra que la timalfasina (TIM) hace a las células 9L de glioblastoma más sensibles a la destrucción por estrés oxidativo o por el quimioterapia BCNU.

La Fig. 4 muestra que la timalfasina hace a las células 9L de glioblastoma más sensibles a la destrucción mediada por granzima B; el panel A muestra el efecto sobre células expuestas a vehículo o a timalfasina (24 h aguda, 72 h crónica), después se dividieron durante 1hora adicional de tratamiento con vehículo, y el panel (B) muestra el efecto sobre células expuestas a vehículo o a timalfasina (24 h aguda, 72 h crónica), y después divididas durante 3 horas adicionales de tratamiento con vehículo.

La Fig. 5 muestra el desarrollo temporal de las anomalías clínico-neuropatológicas tras la implantación de 10.000 células 9L de glioblastoma en los lóbulos frontales derechos de ratas adultas Long Evans.

La Fig. 6 muestra el efecto de BCNU y de BCNU + timalfasina (TIM) sobre la progresión del glioblastoma in vivo.

La Fig. 7 muestra una carga de glioblastoma reducida y un 25% de curación en ratas tratadas con BCNU + timalfasina (TIM).

Descripción detallada

Ahora se ha descubierto que la timalfasina puede potenciar la destrucción inmune de células de glioblastoma, haciendo de su uso, como coadyuvante en combinación con un compuesto quimioterapéutico de cloroetilnitrosurea, una terapia antiglioblastoma eficaz.

La invención es aplicable a péptidos de timalfasina (TA1), incluyendo TA1 naturales, así como TA1 sintéticos y TA1 recombinantes con la secuencia de aminoácidos de la TA1 natural, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a esta, o una forma de secuencia abreviada de la misma, y sus análogos biológicamente activos con sus secuencias sustituidas, delecionadas, elongadas, reemplazadas o de otro modo modificadas, que poseen una bioactividad sustancialmente similar a la del TA1, por ejemplo, un péptido derivado de TA1 con la suficiente homología de aminoácidos con la TA1 como para que funcione sustancialmente de la misma forma con sustancialmente la misma actividad que la TA1.

Los estudios in vivo usando un modelo experimental de glioblastoma demostraron que mientras que el tratamiento con BCNU redujo significativamente la carga tumoral, las respuestas eran heterogéneas, no mostrando en muchos casos una respuesta detectable. Sin embargo, el tratamiento con timalfasina + BCNU proporcionó un beneficio terapéutico significativo, tanto con respecto a una reducción en la carga tumoral media como a la curación de los tumores en aproximadamente el 25% de los casos. Las reducciones en la carga tumoral mediada por timalfasina + BCNU se asociaron con un aumento en los infiltrados celulares linfomononucleares en el interior y alrededor de las células neoplásicas del cerebro. En los casos en los que no pudo encontrarse ningún tumor residual, sólo se detectó tejido cicatrizal gliótico y una escasa inflamación asociada con los infiltrados iniciales de células tumorales. La curación de los glioblastomas se observó en aproximadamente el 25% de los grupos tratados con bajas dosis y altas dosis de timalfasina + BCNU.

Un hallazgo un tanto inesperado fue que los grupos tratados sólo con timalfasina se desarrollaron igual que el control o peor. Frecuentemente, los cerebros de las ratas tratadas con timalfasina se hinchaban y se herniaban debido a la inflamación y el edema, combinados con la masa tumoral en crecimiento. A este respecto es digno de mención que las ratas tratadas con la menor concentración de timalfasina \pm BCNU tenían mejores resultados que las tratadas con la mayor concentración de timalfasina \pm BCNU dado que la destrucción de las células tumorales fue similar en los dos grupos, pero el edema y la hernia fueron más prevalentes en el grupo que recibió la mayor concentración de timalfasina.

Por lo tanto, el tratamiento sólo con timalfasina no eliminó los glioblastomas, y fue probablemente perjudicial debido al exceso de hinchamiento en ausencia de una destrucción concomitante de las células tumorales. Los resultados sugieren adicionalmente que la timalfasina tuvo poco o ningún efecto citotóxico directo sobre las células neoplásicas malignas, y que la destrucción adicional de células tumorales observada con el tratamiento con timalfasina +

\hbox{BCNU}

estuvo mediada por acciones indirectas de la timalfasina. En los cerebros de las ratas tratadas con timalfasina, el hallazgo de un aumento en la densidad de las células inflamatorias linfomononucleares, que se caracterizaron como predominantemente linfocitos T y macrófagos, sugiere que la timalfasina desempeña un papel importante en la implicación de células inmunes efectoras ante neoplasias malignas.

Se llevó a cabo una serie de experimentos in vitro para determinar el mecanismo mediante el cual la timalfasina media en sus efectos antiglioblastoma. Estudios iniciales determinaron que la timalfasina no tenía efectos citotóxicos directos significativos sobre las células de glioblastoma. Esto mismo era cierto para otros tipos celulares, incluyendo células de neuroblastoma y neuronas corticales postmitóticas. Para ampliar estas investigaciones, se evaluó si la timalfasina afectaba negativamente a la función celular, y quizá hacía a las células más susceptibles a la apoptosis. Para hacer esto se examinaron los niveles de expresión de los genes proapoptóticos y prosupervivencia, así como de genes de crecimiento y de mantenimiento. Esos estudios revelaron que el tratamiento con timalfasina durante 24 ó 72 horas daba como resultado un aumento significativo en los niveles de genes proapoptóticos en células 9L de glioblastoma. Se obtuvieron unos resultados similares para las células Sy5y de neuroblastoma. En las células 293 se advirtió el mismo fenómeno, salvo que los mecanismos prosupervivencia estaban inhibidos y los genes proapoptóticos no estaban afectados. Estos hallazgos sugieren que aunque la timalfasina no tiene efectos citotóxicos directos, puede hacer a las células más sensibles ante los agentes citotóxicos, aumentando la expresión basal de los genes proapoptóticos o reduciendo la expresión basal de los genes de supervivencia. Para probar esta hipótesis se determinó si las células tratadas con timalfasina eran más sensibles al estrés oxidativo o a la destrucción mediada por cloroetilnitrosurea. Los estudios mostraron que después de 24 ó 72 horas de tratamiento con timalfasina, concentraciones subletales de H_{2}O_{2} o de BCNU destruían respectivamente el 25% o el 40% de las células 9L. Por lo tanto, al menos algunos de los efectos de la timalfasina estaban mediados por sus acciones sobre las células neoplásicas, en lugar de ser íntegramente debidos a la modulación inmune y la implicación de los linfocitos T y los macrófagos.

Se han establecido las propiedades inmunomoduladoras de la timalfasina y las moléculas relacionadas. Sus principales efectos son aumentar la producción de citocinas proinflamatorias y la proliferación de linfocitos. Los linfocitos T activados destruyen las células objetivo mediante interacciones FasL-FasR, y activando el sistema perforina-granzima. El hallazgo de un aumento en la expresión de FasL/FasR en las células 9L de glioblastoma tratadas con timalfasina sugiere que los linfocitos T activados podrían destruir eficazmente estas células objetivo mediante interacciones FasL/FasR. Sin embargo, utilizando un nuevo ensayo in vitro concebido con SLO (agente permeabilizante) y granzima B recombinante en lugar de linfocitos T activados, demostramos que las células 9L de glioblastoma tratadas con timalfasina eran rápidamente destruidas mediante la exposición al SLO y a la granzima B. Estos hallazgos sugieren que la timalfasina puede promover eficazmente la destrucción inmune de las células de glioblastoma de varias formas: 1) aumentando los niveles basales de expresión de genes proapoptóticos, haciendo a las células más sensibles al estrés oxidativo y a los agentes citotóxicos/quimioterapéuticos; 2) aumentando los niveles de FasR, que podría interaccionar con FasL sobre linfocitos T activados y dar lugar a un aumento de la apoptosis; y 3) implicando a linfocitos T activados y macrófagos, y aumentando la destrucción mediada por perforina-granzima de las células tumorales objetivo. Además, los resultados indican contundentemente que el tratamiento de los glioblastomas con timalfasina es eficaz cuando se usa en combinación con cloroetilnitrosoureas, pero no en terapia única. Los resultados proporcionaron pruebas sustanciales de que la timalfasina administrada sola puede ser perjudicial debido a un aumento en el hinchamiento y la inflamación, con una eliminación mínima de las células tumorales. Por lo tanto, el papel más adecuado para la timalfasina en el tratamiento de glioblastomas es como un agente coadyuvante para impulsar la respuesta inmune del hospedador y eliminar las células tumorales residuales que sobreviven al tratamiento quimioterapéutico
convencional.

En conclusión, el trabajo descrito en este documento demuestra que la timalfasina muestra sus efectos antiglioblastoma que están mediados a través de varios canales que incluyen: 1) modulación de los genes proapoptóticos/de supervivencia, que da lugar a un aumento en la sensibilidad de las células tumorales ante el estrés oxidativo y los agentes citotóxicos/quimioterapéuticos; 2) promover las cascadas de destrucción celular inmune mediadas por FasR-FasL; y 3) aumentar la sensibilidad de la célula objetivo para la destrucción celular inmune mediada por perforina-granzima. Sin embargo, los efectos terapéuticos de la timalfasina con respecto a sus propiedades antiglioblastoma dependían de la administración simultánea de cloroetilnitrosoureas, enfatizando que la timalfasina sería más adecuada como un coadyuvante modulador inmune que como un agente antineoplásico definitivo. También es probable que, cuando se combine con otros compuestos quimioterapéuticos, la timalfasina tenga similares efectos positivos para ayudar a reducir la carga tumoral, la progresión y las metástasis a unas tasas significativamente mayores a las observadas actualmente con el tratamiento convencional con quimioterapia.

La invención es aplicable a la timalfasina natural (es decir, que aparece de forma natural), así como a la timalfasina sintética y a la timalfasina recombinante con la secuencia de aminoácidos de la timosina natural, secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a la misma o una secuencia abreviada a partir de la misma, y sus análogos biológicamente activos con secuencias sustituidas, delecionadas, elongadas, reemplazadas o de otro modo modificadas, que poseen una bioactividad sustancialmente similar a la de la timalfasina.

El aislamiento, la caracterización y el uso de la timalfasina se describen en, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.079.127, la patente de EE.UU. nº 4.353.821, la patente de EE.UU. nº 4.148.788 y la patente de EE.UU. nº 4.116.951. La cantidad de timalfasina necesaria para desencadenar el grado deseado de potenciación del efecto quimioterapéutico de la BCNU puede determinarse mediante experimentos rutinarios de ajuste de la dosis. Se ha averiguado que la timalfasina es segura para los seres humanos cuando se administra en dosis tan altas como 16 mg/kg de peso corporal/día. Una dosis preferida de timalfasina está en el intervalo de 0,001 mg/kg de peso corporal/día hasta 10 mg/kg de peso corporal/día, siendo la más preferida una dosis de aproximadamente 0,02 mg/kg de peso corporal/día.

La cloroetilnitrosourea puede administrarse a una dosis de aproximadamente 90-250 mg/m^{2}, mediante inyección, por vía oral, mediante una oblea biodegradable o cualquier otro medio conveniente conocido en la materia. Puede administrarse como una dosis única o dividirse en inyecciones diarias, tales como de 75 a 100 mg/m^{2} durante dos días sucesivos. La subsiguiente dosificación a partir de la dosis inicial debería ajustarse según la respuesta hematológica del paciente desde la dosis anterior. Debe realizarse semanalmente un hemograma y no deberían administrarse ciclos repetidos antes de 6 semanas debido a que la toxicidad hematológica es retardada y acumulativa. Una cloroetilnitrosourea preferida es, que puede administrarse a una dosis de 150-200 mg/m^{2} por vía intravenosa cada 6 semanas. La BCNU también puede administrarse mediante la implantación de obleas biodegradables (por ejemplo, Gliadel, Guilford Pharmaceuticals) directamente en el lecho tumoral. Si la administración es a través de una oblea biodegradable, la timalfasina coadministrada puede combinarse convenientemente con la BCNU directamente en la oblea.

Ejemplo 1 Tratamiento con timosina-\alpha1 de las líneas celulares tumorales 9L y 293

Líneas celulares tumorales: las células 9L de glioblastoma de rata y las células 293 de riñón humano se mantuvieron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 5% de FCS, L-glutamina 2 mM y 100 \muM de aminoácidos no esenciales (Gibco-BRL, Grand Island, NY). Todas las líneas celulares se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada que contenía un 5% de CO_{2}. Las líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection y se certificó que no contenían patógenos.

Tratamiento con timosina-\alpha1: para el tratamiento agudo con timalfasina, las células sembradas en placas de 96 pocillos a una densidad celular de 20.000 células/pocillo se trataron con timalfasina 10^{-5} M durante 24 horas. Las células tratadas de forma crónica con timalfasina se hicieron crecer en matraces y se trataron cada 24 horas con timalfasina 10^{-5} M (añadida al medio nuevo) durante la duración del tratamiento (3 días). Además, para la determinación de una curva dosis-respuesta a la timalfasina para las células 9L, las células se trataron con cantidades diluidas sucesivamente de timalfasina, produciendo unas concentraciones de timalfasina que varían desde 50 \muM hasta 0,022 \muM.

Se usó H_{2}O_{2} para inducir un estrés oxidativo en las células. Las células que habían sido tratadas con timalfasina o con vehículo durante 24 horas se expusieron a H_{2}O_{2} con una concentración variable desde 9 \muM hasta 1,8 mM, y después se evaluó la viabilidad y la función mitocondrial usando los ensayos de CV y MTT según se describió. En los experimentos, en los que se administraron cantidades diluidas sucesivamente de timalfasina a las células, se usó una cantidad constante de H_{2}O_{2} 1,8 mM para tratar las células. Para las células 9L se desarrolló una curva de H_{2}O_{2} con objeto de determinar la concentración correcta de H_{2}O_{2} con la que tratar a las células.

Los ensayos de MTT se realizaron sobre las líneas celulares 9L y 293 para determinar los efectos del tratamiento con timalfasina y/o el estrés oxidativo inducido por el H_{2}O_{2} sobre la función mitocondrial de las células. Después del tratamiento se añadieron 10 \mul de disolución de MTT a cada pocillo que contenía 100 \mul de medio. Las placas se incubaron con el colorante MTT en la estufa a 37ºC durante 15 min-1 hora, dependiendo del tipo celular. Entonces se retiró el medio y se añadieron 200 \mul de isopropanol acidificado a cada pocillo. Entonces las placas se agitaron a temperatura ambiente hasta que se produjo la lisis celular, y después se leyeron en un aparato Packard SpectraCount^{TM} a 540 nm.

También se usó violeta cristal (CV) para teñir las células en placas de 96 pocillos. Tras desechar el medio se añadieron 20 \mul de violeta cristal a cada pocillo y se agitaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Entonces las placas se lavaron varias veces con agua templada y se secaron. Se añadieron 100-200 \mul (dependiendo de la densidad celular) de PBS con un 1% de SDS a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente en un agitador hasta que las células estaban lo suficientemente lisadas. Las placas se leyeron a 540 nm para detectar diferencias en la viabilidad celular entre los diversos grupos probados.

Se realizaron Ensayos ELISA de Microtitulación Inmunocitoquímica (MICE, Microtiter Immunocytochemical ELISA Assays) (de la Monte, 1999) en células 9L y 293. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos, se trataron con timalfasina 10^{-5} M durante 24 horas y se histofijaron hasta el día siguiente antes del análisis usando el ensayo MICE. Las células fijadas se permeabilizaron con un 0,05% de saponina en disolución salina tamponada con Tris (Tris 50 mM, pH 7,5, 0,9% de NaCl; TBS), se bloquearon con Superblock-TBS (Pierce, Rockford, IL), y después se incubaron hasta el día siguiente a 4ºC con anticuerpos primarios contra el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), bcl-2, p21/Wwaf-1, p53, FasL, FasR, TNF-R1 o GAPDH, cada uno diluido a 0,5-1 \mug/ml en TBS que contenía un 0,05% de Tween-20 y un 0,5% de albúmina sérica bovina (TEST-BSA). La inmunorreactividad se detectó usando un anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante (Pierce, Rockford, IL) y el sustrato soluble TMB (Pierce, Rockford, IL). Las reacciones se detuvieron mediante la adición de H_{2}SO_{4} 1 M y las absorbancias se midieron a 450 nm en un lector de microplacas Spectracount (Packard Instrument Co., Meriden, CT). Subsiguientemente se midió la densidad celular tiñendo las células adherentes con colorante azul de Coomassie y midiendo la absorbancia del colorante eluido (de la Monte, 1999). El índice MICE era la proporción calculada entre la absorbancia de TMB y Coomassie medida en el mismo pocillo de cultivo. Se usó la media \pm DT de los resultados obtenidos a partir de 16 pocillos de cultivo replicados para las comparaciones estadísticas entre grupos.

Los experimentos primarios en los que se trataron células 9L durante 24 horas con diversas concentraciones de timalfasina mostraron una disminución significativa en la función mitocondrial celular, según se observa a través de los ensayos MTT (Fig. 1). La función mitocondrial se midió porque la muerte celular puede estar mediada por una disfunción en lugar de por una apoptosis o una necrosis. Los estudios mostraron niveles similares de viabilidad y actividad MTT en los cultivos de control tratados con vehículo y en los tratados con timalfasina (Fig. 1), lo que indica que la timalfasina no tiene efectos citotóxicos directos sobre las células 9L de glioblastoma, lo que es coherente con los resultados in vivo. Se obtuvieron unos resultados similares con respecto a otras líneas celulares, incluyendo células 293 de riñón y células SH-Sy5y neuronales (datos no mostrados).

Dado que la timalfasina no tenía efectos citotóxicos directos, se exploraron otros mecanismos potenciales mediante los cuales la timalfasina puede actuar inhibiendo el crecimiento de los glioblastomas. A este respecto, se examinó la expresión de los productos del gen que promueve la apoptosis o la supervivencia de las células, usando la expresión de un gen de mantenimiento como control. Los estudios se realizaron en placas de 96 pocillos usando el ensayo ELISA de microtitulación inmunocitoquímica (MICE) para producir los datos a partir de múltiples cultivos replicados. El tratamiento con timalfasina durante 24 horas dio como resultado un aumento significativo en los niveles de FasR (44,08%), FasL (65,89%) y TNF-R1 (22,18%) con respecto a los controles tratados con vehículo (P<0.01; Fig. 2). Por el contrario, los niveles de expresión de bcl-2 y GAPDH no estuvieron significativamente afectados por el tratamiento con timalfasina. Los estudios también se realizaron usando células 293 que mostraban reducciones significativas en los niveles de expresión de bcl-2 (36,67%; P<0.01), pero ningún cambio significativo en los de FasR, FasL o TNF-R1 (datos no mostrados). Por lo tanto, los resultados de los ensayos MICE indican que para las dos líneas celulares, la timalfasina funciona a través de diferentes vías para aumentar la susceptibilidad de las células a la muerte celular por apoptosis.

La validación de la capacidad de la timalfasina para aumentar la susceptibilidad de las células 9L y 293 a la apoptosis se determinó probando un estrés oxidativo inducido por H_{2}O_{2}. Según se determinó mediante los ensayos MTT, las células 9L tratadas con timalfasina durante 24 horas y subsiguientemente con H_{2}O_{2} durante 24 horas mostraron de hecho una pérdida significativa en la viabilidad en comparación con las células 9L tratadas únicamente con H_{2}O_{2} durante 24 horas (Fig. 3). Las células 9L tratadas con timalfasina y H_{2}O_{2} 270 \muM mostraron una disminución del 26,6% en el funcionamiento mitocondrial, según se observa mediante MTT, en comparación con las células 9L tratadas únicamente con H_{2}O_{2} 270 \muM (Fig. 3). Se obtuvieron unos resultados similares usando células 293 como objetivo en los ensayos (datos no mostrados).

Ejemplo 2 Estudios de apoptosis inducida por granzima

Los estudios de los ensayos MICE descritos anteriormente mostraron la expresión inducida por la timalfasina de TNF-R1, FasL y FasR en glioblastomas de 9L. Con objeto de determinar la susceptibilidad diferencial de las células 9L de glioblastoma tratadas (o no) con timalfasina para una apoptosis citotóxica inducida por linfocitos T (CTL), se realizaron ensayos experimentales en los que las células 9L se trataban tanto de forma aguda durante 24 horas como de forma crónica durante 72 horas con timalfasina, tras lo cual se recogían, se resembraban en placas negras de 96 pocillos (7,5 x 10^{5} células/75 \mul/pocillo), y se exponían a 20.000 unidades/ml de estreptolisina O (SLO) más 100 ng de granzima B recombinante (volumen de reacción de 100 \mul) durante 1 ó 3 horas a 37ºC. La SLO se usó en lugar de la perforina para permeabilizar las células, y la granzima B recombinante se usó para estandarizar el ensayo. Los estudios de control incluían reacciones paralelas en las que se omitían la SLO, la granzima B o ambas. La densidad celular viable se midió usando el ensayo ATPlite (Packard Instrument Company, Meriden, CT) que tiene un amplio intervalo dinámico lineal que correlaciona unidades de luz relativas con densidades celulares de entre 10^{3} y 10^{6} células por pocillo de cultivo.

In vivo, las células neoplásicas malignas son destruidas por los linfocitos T citotóxicos y los macrófagos, que son implicados por citocinas proinflamatorias tales como IL-2 e IL-12. Los linfocitos T citotóxicos destruyen liberando la perforina, que produce agujeros en las membranas celulares objetivo, y la granzima B, que provoca la destrucción enzimática y la muerte de las células objetivo. Para estudiar el papel potencial de la timalfasina para aumentar la destrucción mediada por linfocitos T de células 9L de glioblastoma, se usó un ensayo in vitro en el que las células 9L tratadas con timalfasina o con vehículo se incubaban con granzima B en presencia o ausencia de estreptolisina O (agente permeabilizante) durante 1 ó 3 horas. La viabilidad se midió usando el ensayo de luminiscencia de ATP, y se realizaron comparaciones entre los grupos para determinar la destrucción relativa asociada al tratamiento con SLO + granzima B. Los estudios mostraron unas reducciones significativas en la viabilidad celular en los cultivos tratados con timalfasina expuestos a SLO + granzima B con respecto a los cultivos tratados con timalfasina expuestos a SLO, granzima B o vehículo solo (p<0,001; Figuras 4A y 4B). Además, la destrucción inmediata por la granzima B progresaba con el tiempo, según evidenciaban los niveles sustancialmente mayores de pérdida celular observados en los ensayos realizados después de 3 horas, en comparación con una incubación de 1 hora con SLO + granzima B (Figuras 4A y 4B). Por el contrario, los cultivos de control tratados con vehículo mostraron unos niveles similares de viabilidad cuando se expusieron a SLO, granzima B, vehículo o SLO + granzima B. En estos estudios, la exposición aguda (24 horas) a timalfasina estaba asociada con grados significativamente mayores de destrucción celular mediada por granzima B + SLO, en comparación con los cultivos incubados con timalfasina durante 72 horas (crónica) antes de los ensayos (Fig. 4).

Ejemplo 3 Efectos de la timalfasina sobre la viabilidad celular de cultivos celulares neuronales primarios

Se estudiaron cultivos de neuronas corticales primarias para permitir la selección de las dosis de timalfasina que no serían tóxicas para las células cerebrales no neoplásicas. Se midieron la viabilidad celular y la función mitocondrial usando los ensayos de violeta cristal (CV) y MTT, dado que estudios previos mostraron que las absorbancias de CV y MTT aumentan linealmente con la densidad celular desde 1 x 10^{4} hasta 5 x 10^{5} células por pocillo (de la Monte, 2001 y 2000).

Las células corticales neuronales primarias tratadas en placas de 96 pocillos con diluciones sucesivas de timalfasina (concentraciones finales en el intervalo de 3,3 x 10^{-5} M hasta 1 x 10^{-9} M) no mostraron una disminución en la viabilidad celular a las dosis experimentales usadas. La mayor concentración de timalfasina usada (3,3 x 10^{-7} M) mostró una disminución del 30% en la viabilidad, según se observa mediante el ensayo MTT. Sin embargo, esta dosis es mayor que las dosis experimentales y clínicas establecidas.

Ejemplo 4 Tratamiento coadyuvante con timalfasina in vivo de glioblastoma de rata

Se obtuvieron células 9L de glioblastoma de rata de la American Type Culture Collection (Washington, D. C.) y se certificó que no contenían patógenos. Las células se mantuvieron en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con un 5% de suero bovino fetal (FCS) y glutamina 2 mM. No se añadieron antibióticos al medio. Antes de la inyección, las células se aclararon con disolución salina tamponada con fosfato (PBS), se desprendieron de las superficies de cultivo y se disociaron en suspensiones celulares individuales con un 0,25% de tripsina/0,05% de EDTA. Las células disociadas se lavaron 3 veces con DMEM sin suero y finalmente se suspendieron en DMEM sin suero a una densidad de 5 x 10^{6} células viables/ml. La densidad celular viable se determinó usando una exclusión con azul de tripano y una cámara hemocitométrica.

Se diseñaron experimentos para determinar si la timalfasina administrada sola o en combinación con la BCNU podría reducir significativamente la carga de glioblastoma, en comparación con el tratamiento con biscloroetilnitrosurea (BCNU). Se produjo un modelo in vivo de glioblastoma en ratas Long Evans adultas (250-300 gramos). Las ratas se anestesiaron con una única inyección intraperitoneal de un cóctel que contiene 100 mg/kg de ketamina y 100 mg/kg de xilazina en etanol al 50%. Tras la anestesia, la cabeza se afeitó y se preparó con povidona yodada, y la rata se colocó en un inmovilizador estereotáctico de la cabeza. Se realizó una incisión en la línea media y se taladró un agujero de 3 mm sobre el lóbulo frontal, y se inyectaron 2 \mul de una suspensión de células 9L de glioma (10.000 células en total) directamente en el cerebro usando una jeringa Hamilton con una aguja de 0,45 mm (26-gauge) de diámetro colocada a una profundidad de 3,5 mm. Después de retirar la aguja, la herida se lavó con disolución salina estéril, el animal se retiró del inmovilizador y la piel se cerró con suturas reabsorbibles. Las ratas fueron devueltas a sus jaulas y se observó cualquier signo de deterioro, incluyendo pérdida de peso, una reducción en la ingesta de comida y agua, hemiparesia, espasmos o inactividad. Si se observaba cualquier grado de sufrimiento, los animales se sacrificaban con 120 mg/kg de pentobarbital sódico. Los animales se observaban diariamente y se pesaban semanalmente. Empíricamente, la inyección de 10.000 células 9L mataba al 100% de los animales en los 26 días desde el implante.

El tumor se dejó desarrollar durante 5 días, seguido por un tratamiento antineoplásico. Las ratas se dividieron en seis grupos de tratamiento: control con vehículo; baja (45 \mug/kg) timalfasina; alta (200 \mug/kg) timalfasina; baja timalfasina + BCNU; alta timalfasina + BCNU; y BCNU (9,4 mg/kg) sola. La BCNU se administró como una única inyección intraperitoneal (I.P.) el día 6 tras la inoculación intracerebral del tumor. A las ratas tratadas con timalfasina se les administraron inyecciones individuales I.P. de timalfasina durante 3 días consecutivos, comenzando el día 6 tras la inoculación de las células tumorales. Las ratas se sacrificaron el día 20 tras la inoculación del tumor. Las ratas se sacrificaron mediante una inyección I.P. de 120 mg/kg de pentobarbital sódico. Los cerebros se recogieron, se seccionaron, se fijaron por inmersión en Histochoice (Amresco Co., Solon, Ohio) y se trataron para su inclusión en parafina. La carga tumoral se evaluó a partir de los bloques globales de tejido, y las secciones histológicas se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones histológicas también se usaron en estudios de tinción inmunohistoquímica para detectar infiltrados celulares inflamatorios.

Modelo de glioblastoma: la inoculación intracerebral de 10.000 celulas 9L de glioblastoma de rata a ratas adultas Long Evans produjo tumores de forma reproducible, que se fueron agrandando progresivamente y provocaron la muerte en los 21 días. La progresión temporal del crecimiento del tumor y los signos clínicos asociados se caracterizaron como sigue: 1) aumento en la actividad física con un diámetro del tumor de 4-5 mm en el día 7; 2) hiperreactividad alrededor del día 14 con un diámetro del tumor de 7-8 mm y frecuentes hemorragias intratumorales asociadas; y 3) somnolencia con masas tumorales de 10-12 mm acompañada por una hernia cerebral alrededor del día 21 (Fig. 5). Las secciones histológicas teñidas con hematoxilina y eosina confirmaron la presencia de grandes masas tumorales formadas por células neoplásicas malignas infiltrantes. Los estudios histopatológicos de secciones en corona a lo largo de todo el cerebro demostraron que a los 5 días desde la inoculación de las células 9L, las células neoplásicas formaban pequeñas masas tumorales que estaban localizadas en la corteza superficial y en las leptomeninges superyacentes. A los 14 días, las masas tumorales se extendían hacia estructuras más profundas, que incluían los ganglios basales y las paredes del ventrículo lateral, y estaban asociadas con un edema moderado pero no con una hernia (cambian las estructuras de la línea media). Alrededor del día 21, las masas tumorales ocupaban prácticamente todo el lóbulo frontal derecho con grados de extensión variables hacia el hemisferio contralateral (Fig. 3). La gran masa tumoral estaba asociada con un marcado edema, hemorragia y hernia cerebrales.

Se usó una escala de clasificación histológica semicuantitativa para evaluar la carga tumoral para las comparaciones entre grupos: 0 - curación, ningún tumor residual; 1 - tumor microscópico (<1 mm) limitado a la corteza superficial; 2 - masa tumoral que ocupa menos del 25% de la sección transversal del hemisferio (1-2 mm); 3 - masa tumoral que ocupaba hasta el 50% de la sección transversal del hemisferio (2-3 mm) y que se extiende hacia estructuras más profundas; 4- carga tumoral masiva con una implicación del 50-90% de la sección transversal del hemisferio, con hernia. Las secciones fueron marcadas y clasificadas simultáneamente por dos individuos separados sin conocimiento del grupo de tratamiento. Para verificar la coherencia de la clasificación, todas las muestras se desordenaron y se volvieron a revisar por marcas.

Efectos de la timalfasina y la BCNU sobre el crecimiento del glioblastoma (Fig. 6): dado que no se observaron rechazos espontáneos al tumor en los estudios preliminares, todos los experimentos finalizaron el día 20 tras la implantación de las células 9L de glioblastoma. Las ratas tratadas con vehículo mostraron la misma progresión temporal de crecimiento de los tumores y signos clínicos a los observados en los animales no tratados. Las ratas tratadas con BCNU mostraron reducciones significativas en la masa del tumor con respecto a los controles tratados con vehículo. Sin embargo, las respuestas fueron heterogéneas, no manifestando prácticamente la mitad del grupo ninguna respuesta terapéutica aparente. En el resto de los animales, las cargas tumorales se redujeron en hasta un 50%. Las ratas tratadas sólo con timalfasina tuvieron un crecimiento tumoral y unas tasas de deterioro clínico que eran similares a las de control. Además, las ratas tratadas con timalfasina tuvieron un edema intracerebral extremo y sustancialmente mayores grados de hernia (tejido cerebral que protruye a través del agujero Burr) en comparación con todos los demás grupos, incluyendo los controles. Por el contrario, el grupo con timalfasina + BCNU mostró la menor carga tumoral global, con claras pruebas de regresión del tumor. Usando el esquema de clasificación estandarizado para evaluar la carga tumoral, se demostró que el tratamiento sólo con BCNU redujo significativamente la carga tumoral con respecto al tratamiento con vehículo o con timalfasina (bajas o altas dosis) (P<0,001), y que las ratas tratadas con bajas (45 \mug/kg) o altas (200 \mug/kg) dosis de timalfasina + BCNU tenían las menores cargas tumorales medias (Fig. 6). Estudios adicionales confirmaron la mejora clínica y patológica adicional, con cargas tumorales reducidas más un 25% de tasas de curación en el grupo de tratamiento con timalfasina + BCNU (P<0,001; Fig. 7).

Los análisis histopatológicos también mostraron la presencia de células inflamatorias linfomononucleares adyacentes a y dentro de los focos tumorales. En los cerebros de las ratas tratadas con vehículo o tratadas con BCNU, los infiltrados eran escasos y principalmente se distribuían en los espacios perivasculares. En las ratas tratadas con timalfasina, con o sin BCNU, los infiltrados de células inflamatorias eran evidentes y estaban asociados con las masas tumorales, así como con el parénquima adyacente y las leptomeninges superyacentes. Los estudios de tinción inmunohistoquímica identificaron las células como linfocitos T y macrófagos. Las ratas tratadas con altas dosis de timalfasina, con o sin BCNU, tenían más edema cerebral que las ratas tratadas con bajas dosis de timalfasina. Los estudios de tinción histopatológica e inmunohistoquímica confirmaron la presencia de un edema más amplio y una inflamación asociada con las masas tumorales en el grupo con timalfasina alta.

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Claims (5)

1. El uso de una cloroetilnitrosourea en combinación con un péptido de timosina-\alpha1 (TA1) para la fabricación de un medicamento para tratar el glioblastoma.

2. El uso de la reivindicación 1 en el que la cloroetilnitrosourea es BCNU.

3. El uso de la reivindicación 2 en el que la BCNU se administra a una dosis de 150-200 mg/m^{2}.

4. El uso de la reivindicación 1 en el que el péptido (TA1) es timosina-\alpha1, y se administra a una dosis de 0,001 mg/kg de peso corporal/día a 10 mg/kg de peso corporal/día.

5. El uso de la reivindicación 4 en el que la timosina-\alpha1 se administra a una dosis de 0,02 mg/kg de peso corporal/día.