ES2283799T3 - Peptidos vegf y su utilizacion. - Google Patents
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Abstract
Péptido que muestra la secuencia aminoácida SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR o un fragmento de la misma que conserva sustancialmente la actividad antagonista de NP-1, en forma cíclica.
Description
Péptidos VEGF y su utilización.
La presente invención se refiere a péptidos que
son fragmentos de VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular)
y que muestran beneficios terapéuticos potenciales.
VEGF-A es un polipéptido
secretado que es esencial para la formación del sistema vascular en
la embriogénesis y que desempeña una función importante en la
angiogénesis en diversos estados patológicos. La expresión de VEGF
es aumentada por la hipoxia y varias citoquinas en diversos tipos
celulares y da lugar a múltiples actividades biológicas in
vivo e in vitro que incluyen la diferenciación,
proliferación, migración y supervivencia de las células
endoteliales, aumento de la permeabilidad vascular, migración de
monocitos, y aumento de la producción endotelial de factores
vasodilatadores NO y de prostaciclina.
El VEGF-A humano existe en
isoformas múltiples, de 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos,
generadas por el corte y empalme alternativo del ARNm, del cual se
sabe que VEGF_{121}, VGEF_{145} y VGEF_{165} se secretan y
son biológicamente activos. Se han identificado dos receptores
proteintirosinaquinásicos distintos para VEGF, es decir,
Flt-1 (VEGFR1) y KDR/Flk-1 (VEGFR2).
Se cree que KDR/flk-1 es el receptor que media
principalmente los efectos mitogénicos de VEGF en las células
endoteliales y la angiogénesis in vivo, siendo desconocida
la función en las células endoteliales de Flt-1. Una
proteína transmembranosa no tirosinaquinasa, la
neuropilina-1 (NP-1), se ha
identificado como un receptor adicional para VEGF, que se une
específicamente a VEGF_{165}. VEGF promueve la supervivencia de
células tumorales que expresan NP-1, que incluyen
algunas células carcinomatosas mamarias (Bachelder et al,
Cancer Res 61:5736-5740,2001). El papel de
NP-1 en la mediación de los efectos biológicos de
VEGF es todavía ampliamente desconocida.
La NP-1 es un receptor para una
familia de moléculas denominadas semaforinas o colapsinas que
desempeñan una función clave en la orientación de los axones
neuronales durante el desarrollo de los mamíferos. En particular,
se sabe que NP-1 media la actividad quimiorrepelente
y de colapso del desarrollo del cono (neuronal) de la semaforina
3.
Soker et al, J. Biol. Chem. 271
(10):5761-5767 (1996), da a conocer que una proteína
de fusión GST que contiene los 44 aminoácidos codificados por el
exón 7 de VEGF se une a NP-1.
Soker et al, J. Biol. Chem. 272
(10):31582-31588 (1997), da a conocer que una región
del exón 7 es necesaria para la inhibición de la unión de VEGF a
HUVEC. El péptido activo más corto (SEC ID nº 1) es
CSCKNTDSRCKARQLELNERTCRC
es decir VEGF
(137-160), o los aminoácidos 22-44
del exón 7 y el aminoácido 1 del exón 8. El residuo cisteína
terminal (C^{137} en VEGF) es esencial aparentemente para la
actividad y la estructura tridimensional de la molécula. Se sugiere
que pueden existir uniones intra disulfuro en el interior del
monómero de
VEGF.
Sorprendentemente, se ha descubierto que ciertos
péptidos tienen actividad antagonista de NP-1. Un
péptido nuevo según la presente invención posee SEC ID nº 2, es
decir la secuencia aminoácida
SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
o un fragmento de la misma que
conserva sustancialmente la actividad antagonista de
NP-1, en forma
cíclica.
La secuencia dada corresponde a los aminoácidos
138 a 165 en el interior de VEGF, es decir, incluyendo parte por lo
menos del exón 8. Sorprendentemente, se ha descubierto actividad en
péptidos a los que les falta el residuo Cys indicado por Soker
et al como esencial.
La invención comprende asimismo variantes de la
secuencia dada, en los que la actividad nueva, es decir, el
antagonismo de lNP-1 se conserva sin variación
estructural inesperada. Así, la secuencia dada puede incluir
reemplazamientos homólogos o isostéricos o derivatizaciones que
hacen que el péptido sea relativamente estable.
Los péptidos de la invención pueden sintetizarse
mediante procedimientos conocidos. A continuación se proporcionan
ejemplos. En particular, un péptido lineal puede conseguirse
mediante síntesis automática de los péptidos, seguida por
ciclización. Procedimientos de ciclización conocidos incluyen los
descritos por Tam et al, JACS 113:6657-62
(1991). Pueden utilizarse también otras ciclizaciones, por ejemplo
Mitsunobuo el cierre del anillo de la metatesis de las
olefinas.
Un péptido de la presente invención tiene
preferentemente 4 residuos Cys. Es preferentemente bicíclico.
Tal como se ha indicado anteriormente, los
péptidos de la invención pueden incluir modificaciones de la
secuencia dada. Dichas modificaciones son bien conocidas por los
expertos en la materia. Los reemplazamientos isostéricos incluyen
Abu por Cys (esto puede ser deseable si el péptido debe conservar un
numero igual de residuos Cys para la ciclización), Phe por Tyr y
distintos sustituyentes alquilo/arílicos. Los cambios de
sustituyentes en el interior de un residuo aminoácido, desde un
átomo C a un átomo N, para producir peptoides que tengan una
resistencia mayor a la proteólisis, y otras modificaciones, son
conocidos y se incluyen en el alcance de la presente invención. Un
péptido específico al que se hace alusión en la presente memoria
está N-acetilado; y otras modificaciones terminales
serán conocidas asimismo por los expertos en la materia. Dichos
péptidos modificados pueden actuar como promedicamentos, y/o tener
una inmunogenicidad modificada.
Las propiedades antagonistas
NP-1 de un péptido de la presente invención pueden
estar determinadas por el procedimiento que se describe a
continuación. El nivel de actividad es preferentemente por lo menos
25 ó 50% tan elevado como para el polímero bicíclico de 28 unidades
que se ha sintetizado.
La actividad de los péptidos de la invención
significa que pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades
en las que NP-1 puede tener un papel significativo
en la patología. Para la utilización terapéutica, los péptidos de
la invención pueden formularse y administrarse mediante
procedimientos utilizando componentes conocidos por los expertos en
la materia. La dosis apropiada del péptido puede seleccionarse por
el experto en la materia con respecto a factores habituales, tales
como la situación del individuo que va a ser tratado, la potencia
del compuesto, la vía de administración, etc. Las vías apropiadas de
administración incluyen la intramuscular, intranasal y
subcutánea.
Un antagonista de NP-1 puede
competir con la semaforina 3 para unirse al NP-1, y
por tanto, antagonizan los efectos de la semaforina sobre la
expansión axonal y la migración en las células nerviosas. Las
aplicaciones potenciales de éstos se encuentran en la promoción de
la expansión de las neuritas, en la estimulación de la reparación
nerviosa o en el tratamiento de la neurodegeneración. Además, un
antagonista de NP-1 puede promover la supervivencia
de las neuronas sensibles a la semaforina 3, un efecto que
confirmará o potenciará su utilidad en las aplicaciones
proporcionadas anteriormente, y puede ampliar estas aplicaciones,
por ejemplo, para tratar la muerte neuronal causada por episodios
de isquemia en el ictus y en algunas enfermedades oculares.
La NP-1 juega un papel
importante en la angiogénesis y puede resultar esencial para la
angiogénesis inducida por VEGF en el cáncer, enfermedades oculares,
artritis reumatoidea y otras enfermedades Por tanto, los
antagonistas de NP-1 pueden tener aplicaciones en
la inhibición de la angiogénesis dependiente de VEGF en la
enfermedad.
Los antagonistas de NP-1 pueden
desempeñar asimismo un papel en la inmunosupresión. Por tanto, puede
ser útil administrar un péptido de la invención antes, durante o
después de un trasplante.
Además, un antagonista de NP-1
puede competir con VEGF para la unión a NP-1 en las
células tumorales y promover la muerte celular en las células
tumorales que expresen NP-1.
Las aplicaciones potenciales de éstos se
encuentran en la terapia anticancerígena.
Los Ejemplos siguientes ilustran la
invención.
MBHA, metilbencidrilamina; Fmoc,
9-fluorenilmetoxi-carbonilo; Ala,
alanina; Arg, arginina; Asn, asparagina; Asp, ácido aspártico; Abu,
ácido amino butírico; Cys, cisteína; Gln, glutamina; Glu, ácido
glutamínico, Gly, glicina; His, histidina; Ile, isoleucina; Leu,
leucina; Lys, lisina; Met, metionina; Phe, fenilalanina; Pro,
prolina; Ser, serina; Thr, treonina; Trp, triptófano; Tyr, tirosina;
Val, valina; Pbf,
2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo;
Pmc,
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonil;
Trt, tritilo; tBu, terc-butilo; Boc, butoxicarbonilo; Pybop,
benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-hexafluorofosfato
de fosfonio; NMM, N-metilmorfolina, DCM,
diclorometano; DMF, dimetilformamida; TBME,
t-butilmetiléter; TFA, ácido trifluoroacético;
HPLC, cromatografía líquida de alta resolución;
LC-MS, espectrometría de
masas-cromatografía líquida; \ring{A}, Angstrom;
AAA, análisis de aminoácidos; DMSO, dimetilsulfóxido; VEGF, factor
de crecimiento endotelial vascular.
Los péptidos que se muestran en la Fig 1 se
sintetizaron en un Sintetizador múltiple automático AMS422 de
Péptidos que utiliza el fundamento de la fase sólida. Se aplicaron
la resina Rink Ami de MBHA (carga de 0,59 y 0,68 mmol/g) y la
estrategia N-Fmoc con protección ortogonal (Acm,
t-Bu) de las cadenas laterales Cys de los derivados
que iban a ser sometidos a ciclicización. El péptido deseado se
sintetizó a una escala de 25 \muM y se unió entonces utilizando
un tiempo básico de unión de 30 minutos. La resina y los derivados
aminoácidos, Fmoc-Ala-OH.H_{2O},
Fmoc-Arg (Pbf/Pmc)-OH,
Fmoc-Asn-(Trt)-OH,
Fmoc-Asp (OtBu)-OH,
Fmoc-Cys (Trt)-OH,
Fmoc-Gln-(Trt)-OH,
Fmoc-Glu (OtBu)-OH,
Fmoc-Gly-OH,
Fmoc-His (Trt)-OH,
Fmoc-Ile-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc)-OH,
Fmoc-Met-OH,
Fmoc-Phe-OH,
Fmoc-ProH_{2}O, Fmoc-Ser
(tBu)-OH, Fmoc-Thr
(tBu)-OH, Fmoc-Trp
(Boc)-OH, Fmoc-Tyr
(tBu)-OH y
Fmoc-Val-OH se obtuvieron de
Calbiochem-Novabiochem UK Ltd, (Nottingham, UK), o
de Alexis (Nottingham, UK).
Cada aminoácido se asoció secuencialmente a la
cadena peptídica en crecimiento a partir del extremo C al N,
aplicando Pybop (Calbiochem-Novabiochem) y NMM
(Rathburn Chemicals, Walkerburn, UK) como agentes de unión mediante
el procedimiento del éster activo. La eliminación del grupo
protector N-Fmoc se llevó a cabo con piperidina al
20% en DMF (Rathburn Chemicals, Walkerburn, Scotland) seguido por
lavados secuenciales con DMF y DCM. Después de la síntesis de cada
péptido se llevó a cabo la acetilación automática con un exceso
cuádruple de ácido acético (0,7 molar, Rathburn Chemicals,
Winterburn Scotland) basada en la sustitución de la resina
Rink-Amide-MBHA. El reactivo de
asociación, Pybop, NMM y todos los derivados aminoácidos se
disolvieron en DMF (0,7 M, exceso cuádruple basado en la
sustitución de la resina
Rink-Amide-MBHA), excepto para los
aminoácidos Fmoc-His (Trt)-OH y
Fmoc-Phe-OH. Estos derivados
aminoácidos protegidos se disolvieron en
N-metilpirrolidona. Todos los disolventes
utilizados serán de calidad de grado HPLC (cromatográfico). Los
péptidos se liberaron de la resina con desprotección simultánea
utilizando TFA al 90% a temperatura ambiente durante 3 horas en
presencia de tioanisol al 5%, agua 2,5% y etanoditiol al 2,5% como
fagocito de los cationes reactivos generados. La mezcla de
liberación (o fragmentación) se filtró y precipitó en TBME enfriado
en hielo. La resina restante se lavó una vez con el reactivo de
fragmentación, se filtró y se combinó con las fracciones anteriores.
Los precipitados se recuperaron después de centrifugación, se
lavaron tres veces con TBME enfriado en hielo y se permitió que se
secaran por la noche a temperatura ambiente. Los péptidos en bruto
se disolvieron en ácido acético acuoso al 15% y se liofilizaron
durante 2 días (-40ºC, 6 mbar).
Los péptidos en bruto se analizaron mediante
LC-MS analítico en un Espectrómetro de Masa Quattro
LC de Micromass con un instrumento HPLC (cromatográfico) de
Hewlett-Packard modelo 1100 utilizando una columna
analítica de fase inversa (columna de fase inversa Alltech Hypersil
PEP, 100 \ring{A}, C_{8}, 5 \mu (250 x 4,6 mm) 0% a 50% de
acetonitrilo en 20 minutos. Las separaciones se controlaron con una
longitud de onda de 215 nm para la absorbancia de enlace amídico
con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Los péptidos en bruto se
purificaron mediante HPLC (cromatografía líquida de alta
resolución) preparativa (Gilson), controlada a una longitud de onda
de 215 nm, eluyéndose con una velocidad de flujo de 20 ml/min. Se
utilizó la misma fase móvil que la expuesta para el análisis
LC-MS de los péptidos en bruto. Los péptidos en
bruto se purificaron utilizando una columna de fase inversa
(columna de fase inversa Alltech Hypersil PEP, 100 \ring{A},
C_{8}, 8 \mu (250 x 22 mm). Se eluyeron con acetonitrilo entre
0% y 50% en 20 minutos. Los análogos mostraban una pureza mayor que
el 95% utilizando cromatografía líquida de alta resolución
(LC-MS) y mostraron el análisis aminoácido
esperado.
Se aplicaron varios distintos gradientes para la
elución de los péptidos que se controlaron a 215 nm. Ambos, la fase
orgánica, acetonitrilo, y la fase acuosa, contienen TFA al 0,1% y
1-propanol al 3%. Los gradientes y las velocidades
de flujo se incluyen a continuación. El porcentaje indica la
proporción de la fase orgánica 0% a 50% en 20 minutos, velocidad
del flujo de 1 ml/min.
La SEC. ID nº 2 se sintetizó mediante un
procedimiento automatizado de fase sólida única (sintetizador de
péptidos 433A de Applied Biosystems), utilizando la resina de
alcohol Fmoc-Arg
(Pbf)-p-alcoxibencílico (carga de
0,59 mmol/g). Los aminoácidos se añadieron mediante la estrategia
Fmoc a una escala de 0,25 mmol utilizando el procedimiento químico
Fastmoc^{TM} con un tiempo único de unión de 21 minutos. La resina
y los derivados aminoácidos,
Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Arg (Pbf)-OH,
Fmoc-Asn-(Trt)-OH,
Fmoc-Asp (OtBu)-OH,
Fmoc-Cys (Trt)-OH (posiciones 9 y
23), Fmoc-Cys-(Acm)-OH, (posiciones
2 y 21), Fmoc-Gln (Trt)-OH,
Fmoc-Glu-(OtBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc)-OH,
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Ser (tBu)-OH,
Fmoc-Thr-(tBu)-OH y
Fmoc-Tyr-(tBu)-OH se obtuvieron de
Bachem AG, Bubendorf, Suiza. Cada aminoácido se añadió
secuencialmente a la cadena peptídica en crecimiento a partir del
extremo C al extremo N, aplicando 0,45 M
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluroniohexafluorofosfato
(HBTU)/1-hidroxibenzotriazol (HOBt) en DMF (Applied
Biosystems, Warrington, UK) y
N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals,
Loughborough, UK), como reactivos de unión. La eliminación del grupo
protector N-Fmoc se llevó a cabo con piperidina al
20% (Romil, Cambridge, UK) en N-metilpirrolidona
(NMP, M56 Chemicals, Runcom, UK), seguido por lavados secuenciales
con NMP. El reactivo de unión, HBTU/HOBt se encuentra 3,6 veces en
exceso (0,9 mmol) y todos los derivados aminoácidos 4 veces en
exceso (1,0 mmol). Todos los disolventes utilizados eran de una
calidad de grado HPLC.
La AC-SEC ID nº 2 se sintetizó
mediante un procedimiento automatizado de fase sólida múltiple
(sintetizador peptídico múltiple Rainin Symphony), utilizando la
resina de alcohol Fmoc-Arg
(Pbf)-p-alcoxibencílico (carga de
0,59 mmol/g). Los aminoácidos se añadieron mediante la estrategia
Fmoc a una escala de 0,2 mmol (péptido 3) utilizando la química Fmoc
con un tiempo único de unión de 20 minutos. La resina y los
derivados aminoácidos, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Abu-OH,
Fmoc-Arg (Pbf)-OH,
Fmoc-Asn-(Trt)-OH,
Fmoc-Asp (OtBu)-OH,
Fmoc-Cys (Trt)-OH (péptido 3,
posiciones 9 y 23), Fmoc-Cys-(Acm) (péptido 3,
posiciones 2 y 21), Fmoc-Gln
(Trt)-OH,
Fmoc-Glu-(OtBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc)-OH,
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Ser (tBu)-OH,
Fmoc-Thr-(tBu) OH y
Fmoc-Tyr-(tBu)-OH se obtuvieron de
Bachem AG, Bubendorf, Suiza. Cada aminoácido se añadió
secuencialmente a la cadena peptídica en crecimiento a partir del
extremo C al extremo N terminal, aplicando
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluroniotetrafluoroborato
(TBTU, Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK) y
N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals,
Loughborough, UK), como reactivos de unión. La eliminación del
grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con
piperidina al 20% (Romil, Cambridge, UK) en
N-metilpirrolidona (NMP, M56 Chemicals Runcom, UK),
seguido por lavados secuenciales con NMP. El reactivo de unión,
TBTU (en exceso cuádruple), se disolvió en DMF (Apollo Scientific,
Stockport, UK) y todos los derivados aminoácidos (en exceso
cuádruple) y DIEA (en exceso óctuplo) en NMP. La acetilación
N-terminal automática se llevó a cabo después de la
síntesis (péptido 3) utilizando un exceso de una mezcla de
recubrimiento de anhídrido acético/lutidina/DMF/DCM (2:1:9:8) Todos
los disolventes utilizados fueran de calidad de grado HPLC.
La Ac-SEC ID nº
2-NH_{2} se sintetizó utilizando un procedimiento
semiautomatizado de fase sólida (sintetizador peptídico Labortec AG
SP4000), utilizando la resina de engarce amídico tricíclico (carga
de 0,63 mmol/g). Los aminoácidos se añadieron mediante la
estrategia Fmoc a una escala de 4 mmol utilizando la química Fmoc
con un tiempo único de unión de 60 minutos. El cumplimiento de cada
etapa de unión se controló utilizando el ensayo colorimétrico
Kaiser. Las reuniones se llevaron a cabo hasta que se obtuvo un
ensayo colorimétrico negativo. La resina y los derivados
aminoácidos, Fmoc-Ala-OH,
Fmoc-Arg (Pbf)-OH,
Fmoc-Asn-(Trt)-OH,
Fmoc-Asp (OtBu)-OH,
Fmoc-Cys (Trt)-OH (posiciones 9 y
23), Fmoc-Cys-(Acm)-OH (posiciones
2 y 21), Fmoc-Gln (Trt)-OH,
Fmoc-Glu-(OtBu)-OH,
Fmoc-Leu-OH,
Fmoc-Lys (Boc)-OH,
Fmoc-Pro-OH,
Fmoc-Ser (tBu)-OH,
Fmoc-Thr-(tBu)-OH y
Fmoc-Tyr-(tBu)-OH se obtuvieron de
Bachem AG, Bubendorf, Suiza. Cada aminoácido se añadió
secuencialmente a la cadena peptídica en crecimiento a partir del
extremo C al extremo N terminales, aplicando
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3,-tetrametiluroniotetrafluoroborato
(TBTU, Severn Biotech Ltd, Kidderminster, UK) y
N,N-diisopropiletilamina (DIEA, Fisher Chemicals,
Loughborough, UK), como reactivos de unión. La eliminación del
grupo protector N-Fmoc se llevó a cabo con
piperidina al 20% (Romil, Cambridge, UK) en DMF, seguido por
lavados secuenciales con DMF y
propan-2-ol. El reactivo de unión,
TBTU, todos los derivados aminoácidos (en exceso triple) y DIEA (en
exceso séxtuple), se disolvieron en DMF. La acetilación
N-terminal se llevó a cabo después de la síntesis,
utilizando un exceso de una mezcla de recubrimiento de anhídrido
acético/lutidina/DMF/DCM (2:1:9:8). Todos los disolventes utilizados
fueran de calidad de grado HPLC.
Los péptidos se dividieron a partir de la
resina, con una desprotección simultánea, utilizando TFA a 82,5% a
temperatura ambiente durante 3 horas en presencia de tioanisol al
5%, agua al 5%, etanoditiol al 2,5% y fenol al 6% (peso/vol). La
mezcla de división se filtró y se precipitó en éter dietílico
enfriado en hielo. La resina restante se lavó una vez con TFA, se
filtró y se combinó con las fracciones previas. Los precipitados se
guardaron a 4ºC por la noche y se recuperaron mediante filtración,
se lavaron con éter dietílico enfriado en hielo, y se dejaron secar
a temperatura ambiente. Los péptidos en bruto se disolvieron en
TFA/acetonitrilo/agua y se sometieron a liofilización durante la
noche (-50ºC, 6 mbar).
Los péptidos se caracterizaron mediante HPLC de
fase inversa (Gilson) utilizando una columna analítica
C-18 (Vydac 218TP54, 250 x 4,6 mm, tamaño de
partícula de 5 \mum, y tamaño de poro de 300 \ring{A}) y un
gradiente AB lineal de 0-100% para B durante 40
minutos con una velocidad de flujo de 1 ml/min, en el que el
eluyente A era TFA al 0,1%/agua y el eluyente B era TFA al 0,1% en
CH_{3}CN al 60%/agua. Se confirmó la masa utilizando
MALDI-MS, y el ensayo colorimétrico de Ellman
confirmó si resultaba aplicable la presencia de grupos sulfhidrilo
libres.
Los precursores lineales en bruto se disolvieron
en el TFA mínimo y se diluyeron hasta 2 l/0,25 mmol con agua. El
primer enlace disulfuro se formó entre residuos Cys no protegidos,
utilizando K_{3}Fe(CN)_{6}. La solución peptídica
se ajustó a pH 7,5 con hidróxido amónico acuoso. A esta solución, se
le añadió gota a gota hasta exceso 0,01
MK_{3}
Fe(CN)_{6}, hasta que se produjo un ligero color amarillo que permaneció. La finalización de la reacción se confirmó mediante muestreo HPLC después de acidificación. El pH de la solución se ajustó a 4 utilizando ácido acético acuoso al 50%. La mezcla reactiva en bruto se agitó con la resina de intercambio catiónica débil Bio-Rex70 (BioRad, CA) durante la noche, y se empaquetó en una columna de vidrio. Después de un lavado acuoso de la totalidad del péptido, éste se eluyó utilizando ácido acético acuoso al 50% y se detectó mediante TLC empleando ninhidrina. Las fracciones positivas a la ninhidrina se juntaron y se sometieron a liofilización. El material en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones purificadas se recuperaron, combinaron y liofilizaron. El segundo enlace de hidrógeno se formó mediante la oxidación l_{2} entre los residuos protegidos Cys (Acm). Una solución del péptido (5 mg/ml) en TFA acuoso al 10% se mezcló vigorosamente con 8 equivalentes de yodo. El curso de la reacción se siguió utilizando muestreo HPLC. Al finalizar la reacción (habitualmente 0,5 horas después), el yodo en exceso se extinguió utilizando 1M ácido ascórbico. La mezcla reactiva se diluyó x 2 con el eluyente A, se filtró a través de un filtro disponible de 0,45 \mum, y se purificó directamente mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones importantes se recuperaron, evaporaron, liofilizaron y guardaron 4ºC.
Fe(CN)_{6}, hasta que se produjo un ligero color amarillo que permaneció. La finalización de la reacción se confirmó mediante muestreo HPLC después de acidificación. El pH de la solución se ajustó a 4 utilizando ácido acético acuoso al 50%. La mezcla reactiva en bruto se agitó con la resina de intercambio catiónica débil Bio-Rex70 (BioRad, CA) durante la noche, y se empaquetó en una columna de vidrio. Después de un lavado acuoso de la totalidad del péptido, éste se eluyó utilizando ácido acético acuoso al 50% y se detectó mediante TLC empleando ninhidrina. Las fracciones positivas a la ninhidrina se juntaron y se sometieron a liofilización. El material en bruto se purificó mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones purificadas se recuperaron, combinaron y liofilizaron. El segundo enlace de hidrógeno se formó mediante la oxidación l_{2} entre los residuos protegidos Cys (Acm). Una solución del péptido (5 mg/ml) en TFA acuoso al 10% se mezcló vigorosamente con 8 equivalentes de yodo. El curso de la reacción se siguió utilizando muestreo HPLC. Al finalizar la reacción (habitualmente 0,5 horas después), el yodo en exceso se extinguió utilizando 1M ácido ascórbico. La mezcla reactiva se diluyó x 2 con el eluyente A, se filtró a través de un filtro disponible de 0,45 \mum, y se purificó directamente mediante HPLC preparativa de fase inversa. Las fracciones importantes se recuperaron, evaporaron, liofilizaron y guardaron 4ºC.
Se obtuvieron tres péptidos de la invención. A
continuación, se hace referencia a ellos como EG3287 (forma
bicíclica de SEC ID nº 2), EG3307 (forma bicíclica de
Ac-SEC ID nº 2), y EG3315 (forma bicíclica de
Ac-SEC ID
nº 2-NH_{2}.).
nº 2-NH_{2}.).
Se llevó a cabo un control completo de calidad
sobre la totalidad del material purificado, Mediante HPLC, se
mostró que tenía una pureza superior al 95% en dos sistemas tampón
(TFA y TEAP). El análisis de los aminoácidos (Beckman 6300),
después de la hidrólisis ácida, confirmó la composición aminoácida.
MALDI-MS (Sonda Kompact Kratos) mostró el ion
molecular esperado. El ensayo de coloración de Ellman se utilizó
para confirmar la ausencia de grupos sulfhidrilo libres en los
péptidos monocíclicos y bicíclicos.
Las células se pretrataron con los péptidos a
10, 30 y 100 mM durante 15 minutos, seguido por tratamiento con 25
ng/ml de VEGF durante 10 minutos, y las células se extrajeron
inmediatamente mediante tampón de lisis (64 mM
Tris-HCl pH 6,8, 0,2 mM Na_{3}VO_{4}, SDS al 2%,
glicerol al 10%, 0,1 mM AEBSF, 5 mg/ml leupeptina). La fosforilación
de KDR se determinó sometiendo extractos celulares a
inmunotransferencia con anticuerpos que reconocen, bien el KDR
fosforilado en las Tirosinas 1054 y 1059 (obtenidos de Oncogene
Research Products Inc.) o el KDR total (obtenido de Santa Cruz Inc.)
Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante
quimioluminiscencia utilizando IgG anticonejo conjugada con
peroxidasa de rábano y reactivo ECL.
Puede hacerse referencia a los dibujos adjuntos.
Brevemente, la Fig 1 muestra los efectos de los péptidos derivados
del Exon 7 del VEGF ciclizado (100 \muM) sobre ^{125}I. Unión de
VEGF_{165} a las células PAE/NP1. En particular, muestra la
inhibición de la unión del ligando marcado radioactivamente de VEGF
a las células endoteliales aórticas porcinas (PAE) que expresan sólo
la Neuropilina-1 (NP-1) mediante
EG3287, y la ausencia de efecto de algunos otros péptidos cíclicos
relacionados. F9 y F10 se refieren a dos fracciones de la misma
preparación peptídica.
La Fig 2 muestra la inhibición selectiva y
específica de la unión de ^{125}I-VEGF_{165} a
las células PAE/NP^{-1}, pero no muestra efecto sobre la unión a
las células que expresan sólo KDR (PAE/KDR) o Flt-1
(PAE/Flt-1), los otros dos receptores principales de
VEGF. EG3287 inhibió asimismo la unión del VEGF marcado
radioactivamente a las células endoteliales venosas umbilicales en
el hombre (HUVEC), que expresan NP-1, KDR y
Flt1-1 (Fig. 2), e inhibió la fosforilación de KDR
inducida por VEGF (Fig 3).
La Figura 4 muestra que el péptido EG3287
inhibió asimismo la unión del VEGF marcado radioactivamente a la
progenie celular carcinomatosa mamaria
MDA-MB-231, que sólo expresa
naturalmente los receptores NP-1 para VEGF.
<110> Ark Therapeutics Ltd.
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<120> Péptidos VEGF y su utilización
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys
Ala Arg Gln Leu Glu}
\sac{Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 28
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido
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<400> 2
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\sa{Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala
Arg Gln Leu Glu Leu}
\sac{Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro
Arg Arg}
Claims (6)
1. Péptido que muestra la secuencia
aminoácida
SCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
o un fragmento de la misma que
conserva sustancialmente la actividad antagonista de
NP-1, en forma
cíclica.
2. Péptido según la reivindicación 1, que
presenta la secuencia dada, en forma bicíclica.
3. Péptido según la reivindicación 1 ó 2,
para su utilización terapéutica.
4. Utilización de un péptido según la
reivindicación 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para
estimular la reparación nerviosa.
5. Utilización de un péptido según la
reivindicación 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para el
tratamiento de la neurodegeneración.
6. Utilización de un péptido según la
reivindicación 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para su
utilización en la terapia anticáncer.
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