ES2284087T3 - Generacion de imagenes de señales de fluorescencia mediante opticas telecentricas de excitacion y de generacion de imagenes. - Google Patents
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Abstract
Un instrumento óptico para la generación de imágenes de señales de fluorescencia de un conjunto de múltiples puntos individuales que consta de los elementos siguientes: un medio de sujeción (1) para sujetar un soporte plano (2) con un conjunto de múltiples puntos individuales (3); como mínimo una fuente emisora de luz (4) que incluye como mínimo una frecuencia de excitación; un transductor (5) instalado para que pueda recibir señales de fluorescencia del citado conjunto de múltiples puntos individuales (3) y para que genere datos primarios informatizables; una lente de campo (6) instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa (4) hasta el conjunto de múltiples puntos individuales (3) antes citado y señales de fluorescencia desde dicho conjunto de múltiples puntos individuales (3)hasta el citado transductor (5); una disposición de lentes de excitación (10) instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa (4) hasta dicha lente de campo (6); y una disposición de lentes de generación de imágenes (11) instalada para transferir señales de fluorescencia desde dicha lente de campo (6) hasta el citado transductor (5), en el que el camino de la luz de excitación y el camino de la luz de generación de imágenes de fluorescencia son telecéntricos en el lado del objeto de la citada lente de campo (6).
Description
Generación de imágenes de señales de
fluorescencia mediante ópticas telecéntricas de excitación y de
generación de imágenes.
El presente invento hace referencia al ámbito
del análisis de ADN. En particular, el objeto del presente invento
consiste en proporcionar un dispositivo para la generación paralela
de imágenes de intensidades de fluorescencia en múltiples
puntos.
Las personas expertas en la técnica conocerán
diversas aplicaciones de técnicas de fluorescencia para el análisis
de muestras biológicas. En el caso de técnicas electroforéticas, las
proteínas o el ADN se marcan con una sonda de fluorescencia para
visualizar sus bandas electroforéticas en geles o columnas. Además,
la mayoría de aplicaciones de micromatrices multigénicas
desarrolladas hasta la actualidad se basan en una lectura de la
fluorescencia, en la que se realiza un seguimiento de la unión
específica de una molécula diana marcada con fluorescencia a una
molécula de la sonda inmovilizada en un soporte sólido. Las
aplicaciones para el análisis de ADN en la fase líquida incluyen
las sondas de hibridación con fluorescencia como el tinte que se une
al ADN bicatenario SybrGreen I o las sondas FRET (del inglés
Fluorescent Resonance Energy Transfer, transferencia de
energía por resonancia de fluorescencia) que se sirven de dos sondas
fluorescentes y de la transferencia de energía. Una aplicación muy
importante para las técnicas de fluorescencia en la fase líquida es
la cuantificación en tiempo real de productos de la PCR (del inglés
Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la
polimerasa), la denominada PCR en tiempo real.
En todos estos casos, se necesita un dispositivo
de lectura de fluorescencia que proporcione luz con una determinada
longitud de onda para excitar el marcador fluorescente del ensayo y
pueda detectar la luz fluorescente que emite dicho marcador a una
longitud de onda un tanto distinta. Uno de los principales problemas
de los dispositivos de lectura de fluorescencia es la enorme
intensidad de la luz de excitación en comparación con la luz de
fluorescencia que emite el tinte y, por lo tanto, se debe
garantizar que el haz de excitación no incida en el detector para
poder realizar un seguimiento preciso de las señales de
fluorescencia. En otras palabras, el camino óptico de la luz de
excitación debe ser distinto al de la luz de fluorescencia, por lo
menos en parte.
La puesta en práctica del principio de
fluorescencia es bastante sencilla cuando se debe realizar el
seguimiento de una única sonda de fluorescencia en la fase líquida
de, por ejemplo, un capilar. En este caso, y a modo de ejemplo,
basta con una fuente luminosa y un conjunto de filtros y espejos
dicroicos para cumplir los requisitos. Sin embargo, si en la
muestra se encuentra más de un marcador fluorescente o bien se debe
realizar un seguimiento de una distribución lateral de puntos en un
soporte sólido o de la fluorescencia de una placa de
microvaloración, entonces resulta más complicado cumplir los
requisitos del dispositivo de lectura de fluorescencia.
En principio, existen dos estrategias distintas
para excitar la fluorescencia de una distribución lateral de puntos
y realizar un seguimiento de la misma. La primera estrategia
consiste en explorar la distribución lateral de puntos, por la que
se analiza sucesivamente cada uno de los puntos de uno en uno. La
segunda estrategia consiste en iluminar el conjunto de la
distribución de puntos de forma simultánea y generar una imagen de
la fluorescencia correspondiente, por ejemplo en un chip de carga
acoplada (CCD, del inglés Charged-Coupled
Device). Por un lado, la estrategia de exploración presenta un
claro inconveniente: el soporte se debe mover en dos dimensiones
(patente WO 03/069391 y patente alemana DE 102 00 499) o bien el
detector se debe mover respecto al soporte (patente estadounidense
US 2002/159057). Por otro lado, la principal dificultad de la
estrategia basada en iluminar el conjunto del soporte de forma
simultánea consiste en garantizar una iluminación homogénea en toda
la distribución de puntos. Una alternativa a la iluminación
homogénea consiste en utilizar una matriz de fuentes luminosas, en
la que cada punto está iluminado por su propia fuente. En la patente
alemana DE 101 31 687 se describe esta estrategia para la
evaluación de una PCR en un termociclador con múltiples pocillos
mediante un divisor de haz y una matriz de LED para la iluminación.
En la patente DE 101 55 142 se describe el seguimiento en campo
oscuro de señales de fluorescencia, en el que la micromatriz
multigénica también se ilumina mediante una matriz de LED, pero en
esta forma de realización no se requiere un divisor de haz.
En cuanto a la necesidad de separar el camino
óptico del haz de excitación y la luz de fluorescencia, como mínimo
parcialmente, de nuevo existen dos posibilidades distintas. La
primera posibilidad es la denominada
epi-iluminación, en la que se utilizan divisores de
haz y la luz de fluorescencia y el haz de excitación comparten,
como mínimo, parte del tren óptico. La segunda posibilidad consiste
en utilizar iluminación oblicua. En este caso, el haz de excitación
está dispuesto de tal modo que presenta cierto ángulo respecto a la
normal de la superficie de soporte y la correspondiente reflexión
del haz de excitación se encuentra fuera del ángulo de admisión del
sistema de detección (como por ejemplo, en la patente estadounidense
US 2002/0005493 A1 y en la patente europea EP 1 275 954 A2).
En la patente estadounidense US 2003/0011772 A1
se describe un equipo óptico que permite observar de forma
simultánea múltiples tintes fluorescentes de una sonda mediante un
divisor de haz. En la patente alemana DE 197 48 211 A1 se presenta
un sistema para realizar un seguimiento de las señales de
fluorescencia que se generan en los pocillos de una placa de
microvaloración de simultáneamente mediante un divisor de haz, una
lente de campo y una matriz de lentes que enfocan la luz al
interior de cada pocillo. La detección se lleva a cabo mediante la
generación de imágenes de la luz en una matriz de fotodiodos o en un
chip CCD. La luz fluorescente recogida en esta forma de realización
del sistema viene determinada por la cantidad de tintes que se
excitan mediante el cono de luz de las lentes que enfocan y, por lo
tanto, depende del nivel de llenado del pocillo. En la patente WO
99/60381 se reivindica un instrumento para realizar un seguimiento
de las reacciones de PCR de forma simultánea en múltiples frascos
de un bloque con temperatura controlada. De nuevo, los componentes
ópticos de este instrumento incluyen un divisor de haz, una lente de
campo, una matriz de lentes que enfoca cada uno de los haces de luz
al interior de cada frasco y un medio de detección que enfoca la luz
de emisión hacia, por ejemplo, un detector CCD. Habida cuenta de
que se debe disponer de una matriz de lentes para cada frasco, el
tamaño y la densidad lateral de cada uno de los puntos están
limitados. En la patente japonesa JP 2002014044 se describe un
equipo fluorométrico para realizar un seguimiento de la
fluorescencia que se genera en múltiples pocillos. Los componentes
ópticos incluyen un divisor de haz y un sistema de lentes para
iluminar el conjunto de pocillos cuando la luz es paralela a la
dirección de los pocillos. Sin embargo, el sistema óptico que forma
la imagen condensa la luz en un medio de detección. En la patente
estadounidense US 6.498.690 B1 se presenta un método para la
generación de imágenes de ensayos con un objetivo que incluye una
lente telecéntrica. En la patente estadounidense US 6.246.525 B1 se
reivindica un dispositivo para la generación de imágenes de un
portamuestras que incluye una lente Fresnel. En la patente europea
EP 0 987 540 A se presenta un generador de imágenes de
fluorescencia con un camino de haz para la generación de imágenes
telecéntricas. En la patente europea EP 1 406 082 A se describe un
lector de fluorescencia con un camino de haz de excitación
telecéntrico.
Así pues, uno de los objetos del presente
invento es proporcionar un dispositivo mejorado para realizar un
seguimiento simultáneo de las señales de fluorescencia desde una
distribución lateral de puntos mediante la optimización del camino
óptico para conseguir una iluminación homogénea y una detección
precisa. En un aspecto del presente invento, el problema que se
debe solucionar está relacionado con la mejora en el seguimiento de
una PCR en tiempo real multiplexada en un formato de placa de
microvaloración.
Por lo tanto, el objeto del invento consiste en
proporcionar un instrumento óptico para la generación de imágenes
de la fluorescencia de un conjunto de diversos puntos individuales,
que incluye la excitación de toda la zona del conjunto así como la
generación de imágenes precisas de las correspondientes señales de
fluorescencia.
De forma más precisa, el objeto del invento
consiste en proporcionar un instrumento óptico para el análisis
simultáneo de múltiples amplificaciones mediante PCR que se producen
en los pocillos de una placa de microvaloración en tiempo real o
bien para la generación de imágenes de la intensidad de la
fluorescencia de una micromatriz multigénica como medida de
interacciones específicas diana/sonda.
Uno de los aspectos del presente invento
consiste en un instrumento óptico para la generación de imágenes de
fluorescencia de múltiples puntos individuales que consta de los
elementos siguientes:
- -
- un medio de sujeción para sujetar un soporte plano con un conjunto de múltiples puntos individuales;
- -
- como mínimo una fuente emisora de luz que incluye como mínimo una frecuencia de excitación;
- -
- un transductor instalado para que pueda recibir señales de fluorescencia del citado conjunto de múltiples puntos individuales y para que genere datos primarios informatizables;
- -
- una lente de campo instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa hasta el conjunto de múltiples puntos individuales antes citado y señales de fluorescencia desde dicho conjunto de múltiples puntos individuales hasta el citado transductor;
- -
- una disposición de lentes de excitación instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa hasta dicha lente de campo; y
- -
- una disposición de lentes de generación de imágenes instalada para transferir señales de fluorescencia desde dicha lente de campo hasta el citado transductor;
en el que el camino de la luz de
excitación y el camino de la luz de generación de imágenes de
fluorescencia son telecéntricos en el lado del objeto de la citada
lente de
campo.
En el contexto del presente invento, un conjunto
de múltiples puntos individuales comprende objetos formados por dos
o más puntos espacialmente separados y lateralmente distribuidos.
Estos puntos pueden ser, por ejemplo, pocillos de una placa de
microvaloración o áreas superficiales funcionalizadas de un
portaobjetos de cristal. En la mayoría de casos, el conjunto de
múltiples puntos individuales estará dispuesto de forma uniforme y
el contenido de cada punto será distinto para llevar a cabo un
análisis multiplexado. En el ámbito del presente invento, el
soporte plano del conjunto es una fase sólida plana. En el caso de
una micromatriz multigénica, el soporte plano del conjunto es la
superficie de esta fase sólida plana, en la que los puntos están
dispuestos. En el caso de una placa de microvaloración, el soporte
plano del conjunto es el plano en el que están dispuestas las
aberturas de los pocillos. El soporte plano del conjunto está fijado
mediante un medio de sujeción para así estabilizar la posición de
cada punto individual en la posición que se desee en el camino
óptico.
En el ámbito del presente invento, el término
"fuente luminosa" (LS) incluye iluminantes que emiten luz a
una única frecuencia o a múltiples frecuencias distintas. Además, la
fuente luminosa puede ser una disposición de más de uno de los
citados iluminantes.
En el contexto del presente invento, un
transductor (Det) es un dispositivo capaz de convertir luz visible
en señales eléctricas que un ordenador puede procesar, como por
ejemplo, un chip CCD.
En el ámbito del presente invento, una óptica
telecéntrica es una óptica con una abertura muy pequeña que, por lo
tanto, proporciona una elevada profundidad de enfoque. En otras
palabras, la luz telecéntrica de una óptica telecéntrica es casi
paralela a los rayos principales de todos los puntos del objeto
paralelo al eje óptico del espacio de la imagen y/u objeto. En
consecuencia, la calidad de una óptica de excitación o de generación
de imágenes que utiliza la telecentricidad en el espacio del objeto
se mantiene constante con independencia de la distancia de un
determinado punto del objeto respecto a la óptica. La abertura de
una óptica telecéntrica se refleja en el infinito. Asimismo, al
utilizar una luz telecéntrica se garantiza una buena homogeneidad
lateral en todo el haz luminoso y los puntos que se encuentran en la
parte central del conjunto son comparables a los situados en los
extremos. En el presente invento, una óptica telecéntrica siempre
incluye una lente de campo. En el contexto del invento, una lente
de campo es una única lente situada lo más cerca posible del
objetivo que determina el campo de visión del instrumento, que
consta de uno o varios componentes (acromáticos) y que contribuye a
la telecentricidad del espacio de la imagen y/u objeto en
combinación con componentes ópticos adicionales del equipo.
La lente de campo del presente invento
transfiere luz de excitación desde la fuente luminosa hasta el
conjunto de múltiples puntos individuales y transfiere señales de
fluorescencia desde el conjunto de múltiples puntos individuales
hasta el transductor. Esta secuencia no excluye la introducción de
componentes ópticos adicionales en el camino del haz, como por
ejemplo, entre la fuente luminosa y la lente de campo, entre la
lente de campo y el transductor o entre la lente de campo y el
conjunto de múltiples puntos individuales.
Otro aspecto del presente invento es un
instrumento para la realización de PCR en tiempo real que consta de
los siguientes elementos:
- -
- un instrumento óptico de conformidad con el invento; y
- -
- medios para calentar y refrigerar un soporte con uno o varios pocillos que contienen una mezcla de reacción capaz de realizar una reacción de PCR.
En el ámbito del presente invento, los medios
para calentar y refrigerar incluyen cualquier medio capaz de
controlar y modificar la temperatura del conjunto de múltiples
puntos individuales de forma cíclica para realizar una
amplificación cíclica de ácidos nucleicos mediante PCR.
Preferiblemente, el medio de sujeción se puede calentar y
refrigerar al estar en contacto térmico con el soporte plano del
conjunto de múltiples puntos individuales.
Otro aspecto del presente invento es un sistema
para llevar a cabo de forma simultánea múltiples reacciones de PCR
en tiempo real así como para realizar un seguimiento de las mismas
que consta de los siguientes elementos:
- -
- una placa con múltiples pocillos y diversos puntos individuales, cada uno de los cuales contiene una mezcla de reacción capaz de realizar una reacción de PCR;
- -
- entidades fluorescentes de unión al ADN; y
- -
- un instrumento para la realización de PCR en tiempo real de conformidad con el presente invento, que consta de un instrumento óptico con arreglo al invento para iluminar el conjunto de la placa con múltiples pocillos con luz telecéntrica y para detectar las señales de fluorescencia procedentes de cada pocillo de la citada placa con múltiples pocillos mediante un transductor instalado para recibir las correspondientes señales de fluorescencia y así generar datos primarios informatizables.
En el presente invento, las entidades
fluorescentes de unión al ADN son todos los tintes fluorescentes o
conjuntos de tintes fluorescentes que las personas expertas en la
técnica saben que se pueden utilizar para la detección de ADN
amplificado, es decir, tintes de unión al ADN bicatenario, sondas
TaqMan, balizas moleculares, sondas con un único marcador o sondas
de hibridación FRET.
Otro aspecto adicional del presente invento
consiste en un método para amplificar, detectar o cuantificar
múltiples secuencias de ADN diana que:
- -
- proporciona una mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones de PCR;
- -
- somete dicha mezcla de reacción a un protocolo de termociclado de modo que se pueda llevar a cabo la amplificación de las múltiples secuencias de ADN diana antes citadas; y
\global\parskip0.950000\baselineskip
- -
- realiza un seguimiento de la presencia y cantidad de cada secuencia de ADN como mínimo una vez tras múltiples ciclos de amplificación mediante entidades fluorescentes de unión al ADN y un instrumento de PCR en tiempo real de conformidad con el presente invento.
La mezcla de reacción o composición capaz de
realizar reacciones de PCR incluye en el presente invento tampones,
nucleótidos, enzimas, cebadores y las entidades fluorescentes de
unión al ADN.
Un protocolo de termociclado es el protocolo que
define el tratamiento térmico cronológico al que se somete la
composición de la PCR, las temperaturas de fusión e hibridación, el
número de ciclos de amplificación así como los períodos dedicados a
calentamiento y refrigeración.
En la figura 1 se muestra una representación
esquemática de una forma de realización del instrumento óptico de
conformidad con el invento;
En la figura 2 se muestra una representación
esquemática de otra forma de realización del instrumento óptico de
conformidad con el invento.
Un aspecto del presente invento consiste en un
instrumento óptico para la generación de imágenes de señales de
fluorescencia procedentes de múltiples puntos individuales que
consta de los siguientes elementos:
- -
- un medio de sujeción para sujetar un soporte plano con un conjunto de múltiples puntos individuales;
- -
- como mínimo una fuente emisora de luz que incluye como mínimo una frecuencia de excitación;
- -
- un transductor instalado para que pueda recibir señales de fluorescencia del citado conjunto de múltiples puntos individuales y para que genere datos primarios informatizables;
- -
- una lente de campo instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa hasta el conjunto de múltiples puntos individuales antes citado y señales de fluorescencia desde dicho conjunto de múltiples puntos individuales hasta el citado transductor;
- -
- una disposición de lentes de excitación instalada para transferir luz de excitación desde la citada fuente luminosa hasta dicha lente de campo; y
- -
- una disposición de lentes de generación de imágenes instalada para transferir señales de fluorescencia desde dicha lente de campo hasta el citado transductor;
en el que el camino de la luz de
excitación y el camino de la luz de generación de imágenes de
fluorescencia son telecéntricos en el lado del objeto de la citada
lente de
campo.
Los expertos en la técnica conocerán un gran
número de instrumentos que permiten generar imágenes de señales de
fluorescencia. Si el instrumento óptico debe permitir la generación
simultánea de imágenes de señales de fluorescencia de un conjunto
de múltiples puntos individuales, como por ejemplo los pocillos de
una placa de microvaloración o los puntos de una micromatriz
multigénica, se debe garantizar que la excitación de los tintes y
la generación de imágenes de las señales de fluorescencia del centro
del conjunto y de los extremos sean comparables. Además, incluso
aunque se cumplan los requisitos de distribución homogénea de la
intensidad en todo el haz luminoso, la alineación del soporte plano
sigue teniendo una importancia capital para garantizar que el
conjunto del soporte se encuentra en el plano focal de la óptica de
generación de imágenes así como de la óptica de excitación. Además,
surgen algunos problemas específicos cuando el soporte presenta
profundidad, como en el caso de las placas de microvaloración.
Una solución a los problemas antes mencionados
consiste en el uso de ópticas telecéntricas. En una óptica
telecéntrica, el plano focal está situado en el infinito y el rayo
principal que emana de cada punto del objeto es paralelo al eje
óptico. En consecuencia, todos los puntos del objeto de un campo de
visión finito se observan con la misma perspectiva e intensidad; en
otras palabras, la óptica telecéntrica presenta una gran profundidad
de campo y un perfil homogéneo de excitación o generación de
imágenes.
Una óptica telecéntrica se puede caracterizar
por su apertura numérica (AN), que debe ser lo más reducida posible
para conseguir una elevada profundidad de enfoque:
NA = n sin
A,
donde n es el índice de refracción
del medio y A el ángulo de apertura. Una elevada profundidad de
enfoque es de suma importancia si el conjunto de puntos
individuales tiene una cierta profundidad, como en el caso de las
placas de
microvaloración.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Para diseñar un instrumento óptico para la
excitación telecéntrica de una distribución lateral de puntos y la
generación de imágenes telecéntricas de señales de fluorescencia
procedentes de dichos puntos, se deben tener en cuenta diversos
aspectos. En cuanto a la profundidad de enfoque, el valor de la AN
debe ser lo más pequeño posible. Por otro lado, un valor de AN
reducido para la óptica de generación de imágenes corresponde a una
resolución deficiente para la generación de imágenes, mientras que
un valor de AN reducido para la óptica de excitación corresponde a
un derroche de energía de iluminación para la excitación.
Si el instrumento de la óptica telecéntrica se
debe poder utilizar para una amplia gama de frecuencias, la óptica
también debe ser acromática. Para la propia generación de imágenes
fluorescentes, se debe abordar un número todavía mayor de
requisitos, puesto que la generación de imágenes de fluorescencia
debe presentar la escala adecuada para una correcta reproducción de
la distribución lateral de los puntos en el transductor. Además,
los errores en la generación de imágenes, como las aberraciones
cromáticas o esféricas, los halos, el astigmatismo o la curvatura
del campo, se deben controlar.
Existen distintos modos para crear ópticas
telecéntricas. En general, una óptica telecéntrica es un diseño de
lente con múltiples elementos, en el que se disponen sucesivamente
diversas lentes en el camino del haz. Una óptica telecéntrica se
puede preparar como telecéntrica en el plano del objeto, en el plano
de generación de imágenes o bien en ambos planos. Además, existe la
posibilidad de iluminar un objeto con una luz telecéntrica o
realizar el seguimiento de un objeto de forma telecéntrica. En
general, basta con proporcionar una óptica con telecentricidad en
el plano del objeto, puesto que de este modo ya se garantiza una
iluminación homogénea del conjunto del objeto tanto lateralmente
como en la tercera dimensión así como una recogida precisa de la
luz que irradia el objeto.
El estado de la técnica proporciona ejemplos de
instrumentos que utilizan ópticas telecéntricas para la generación
de imágenes de señales de fluorescencia, pero la excitación se suele
realizar de forma no telecéntrica, por ejemplo, mediante
retroiluminación, iluminación oblicua o bien mediante un campo
evanescente. En el presente invento, tanto la excitación de
múltiples puntos individuales como la generación de imágenes de
señales de fluorescencia procedentes de múltiples puntos
individuales se lleva a cabo de forma telecéntrica.
En la figura 1 y la figura 2 se muestran
representaciones esquemáticas de dos instrumentos ópticos de
conformidad con formas de realización preferentes del invento que
se explican detalladamente a continuación.
Una parte capital de todas las ópticas
telecéntricas es la lente de campo. Este lente es la que está
situada más cerca del objeto y determina el diámetro del campo de
visión del instrumento. En consecuencia, el diámetro de esta lente
tiende a aumentar su tamaño cuando el conjunto de múltiples puntos
individuales está distribuido en una zona de gran tamaño. Las
lentes de campo existen como singuletes (una única lente) o como
acromáticas que constan, por ejemplo, de dos lentes unidas. Una
lente de campo especial que se puede utilizar en el presente
invento es una lente Fresnel. Una lente Fresnel presenta una
curvatura compleja especial con múltiples regiones ahusadas en,
como mínimo, una superficie óptica efectiva que proporciona las
mismas propiedades telecéntricas que una lente de campo. En la
mayoría de casos, las lentes Fresnel sólo presentan una superficie
con múltiples regiones ahusadas sujeta por una superficie plana
perpendicular al eje óptico y, por lo tanto, son más delgadas en
comparación con las lentes de campo normales. En casos especiales,
se proporcionan lentes Fresnel que disponen de una superficie curva
de soporte adicional o bien de múltiples regiones ahusadas en ambos
lados de la lente. Además, a veces estas lentes están fabricadas en
plástico y, en consecuencia, son más baratas que las grandes lentes
de campo fabricadas en cristal. Sin embargo, la calidad de la
generación de imágenes de las lentes Fresnel, en especial en lo que
a contraste e interferencias se refiere, es inferior en
comparación
con las lentes de campo normales a causa de la difusión de la luz en los puntos de la lente con curvatura discontinua.
con las lentes de campo normales a causa de la difusión de la luz en los puntos de la lente con curvatura discontinua.
En una forma de realización preferente, el
instrumento óptico de conformidad con el presente invento incluye
también un divisor de haz 7 transparente para, como mínimo, una
frecuencia de excitación y reflectante para las frecuencias de las
citadas señales de fluorescencia o un divisor de haz reflectante
para, como mínimo, una frecuencia de excitación y transparente para
las frecuencias de dichas señales de fluorescencia.
Un divisor de haz suele ser un espejo dicroico
que deja pasar o refleja la luz en función de su longitud de onda
y, por lo tanto, se puede utilizar para separar dos componentes de
un haz luminoso en distintas direcciones espaciales. Estos espejos
dicroicos pueden estar fabricados en plástico o cristal y, si
resulta necesario, se pueden incorporar determinados revestimientos
ópticamente activos. Se encuentran en forma de láminas delgadas o
prismas.
Para su aplicación en un instrumento óptico con
la finalidad de generar imágenes de señales de fluorescencia, este
espejo dicroico debe reflejar la luz de excitación y ser
transparente para la luz fluorescente (figura 2) o bien al revés
(figura 1). La separación de la luz emitida desde la fuente luminosa
en un haz luminoso que contiene una o varias frecuencias de
excitación y un haz luminoso con el resto de frecuencias ayuda a
garantizar que los tintes fluorescentes no se destruyan como
consecuencia de longitudes de onda cortas y a que se reduzca la
irradiación de fondo no deseada, como por ejemplo, a causa de la
excitación del soporte. La separación de la luz procedente de los
múltiples puntos individuales de un componente que contiene como
mínimo una frecuencia de excitación del componente que contiene las
señales de fluorescencia evita que la reflexión de la luz de
excitación, con su elevada intensidad, alcance el transductor. De
este modo se mejora drásticamente la razón
señal-ruido.
En otra variante preferente adicional del
invento, la lente de campo produce un haz luminoso de excitación
perpendicular al soporte del conjunto de múltiples puntos
individuales.
El haz luminoso de excitación perpendicular al
soporte del conjunto de múltiples puntos individuales genera un haz
de reflexión que también es perpendicular al soporte del conjunto.
Sin embargo, a causa de la acción del divisor de haz, este haz de
reflexión se separa de las señales de fluorescencia y no alcanza el
transductor. Por ejemplo, en el caso de que una placa de
microvaloración sea el conjunto de múltiples puntos individuales,
el haz luminoso de excitación perpendicular presenta la ventaja de
que puede penetrar en la profundidad de los pocillos. Por otro
lado, si un haz de excitación alcanzara el soporte con un ángulo de
incidencia superior a 0º, las paredes de los pocillos dificultarían
la iluminación completa del interior de los pocillos y sólo se
podría excitar una parte de los tintes fluorescentes. Asimismo,
cuando se utilice un haz de excitación oblicuo, la cantidad de
excitación del tinte de fluorescencia que se encuentre en los
pocillos dependerá del nivel de llenado.
En otra variante preferente adicional, el
instrumento óptico de conformidad con el presente invento incluye
también un sistema de filtros de excitación 8 capaz de transferir
como mínimo una frecuencia de excitación desde la citada fuente
luminosa hasta el conjunto de múltiples puntos individuales y, a su
vez, bloquear múltiples frecuencias distintas.
Un sistema adicional de filtros de excitación de
este tipo puede bloquear determinadas frecuencias de la fuente
luminosa incluso antes que el divisor de haz. Este sistema puede
resultar necesario si la fuente luminosa genera luces con
frecuencias que no se pueden separar de las frecuencias de
excitación mediante un divisor de haz. Un sistema de filtros de
excitación adecuado es, por ejemplo, la denominada rueda de filtros,
que incluye un determinado número de filtros individuales, cada uno
de ellos con distintas propiedades ópticas. El uso de una rueda de
este tipo proporciona un método sencillo para cambiar las
frecuencias de excitación. Un sistema especial de filtros de
excitación es, por ejemplo, un filtro que absorba las frecuencias
infrarrojas (IR) o la luz ultravioleta (UV). Un sistema especial de
filtros de excitación de este tipo se puede llevar a la práctica en
forma de componente óptico independiente, como un filtro de película
delgada o bien en forma de revestimiento óptico activo aplicado
sobre otros componentes ópticos del equipo.
En otra forma de realización preferente, el
instrumento óptico de conformidad con el presente invento incluye
un sistema de filtros para la generación de imágenes 9 capaz de
transferir las señales de fluorescencia de dicho conjunto de
múltiples puntos individuales hasta el citado transductor y, al
mismo tiempo, bloquear la luz con las frecuencias de
excitación.
Un sistema adicional de filtros de generación de
imágenes de este tipo puede bloquear determinadas frecuencias
generadas en los múltiples puntos individuales o procedentes de la
reflexión de excitación incluso después del divisor de haz. Esto
puede resultar necesario si en los múltiples puntos individuales se
genera luz con frecuencias que no se pueden separar de las
frecuencias de excitación mediante el divisor de haz. Nuevamente,
un sistema adecuado de filtros para la generación de imágenes es una
rueda que contenga filtros distintos. De forma similar a lo
comentado en el caso del sistema de filtros de excitación, un
sistema especial de filtros para la generación de imágenes puede
ser, por ejemplo, un filtro infrarrojo (IR) o un filtro ultravioleta
(UV). Los sistemas especiales de filtros para la generación de
imágenes se pueden llevar a la práctica en forma de componente
óptico independiente, como un filtro de película delgada o bien en
forma de revestimiento óptico activo aplicado sobre otros
componentes ópticos del equipo. Otro sistema de filtros
para la generación de imágenes es un sistema de filtros que evite la detección de luz difundida por parte del detector.
para la generación de imágenes es un sistema de filtros que evite la detección de luz difundida por parte del detector.
Tal y como ya se ha mencionado con anterioridad,
el instrumento óptico de conformidad con el presente invento
incluye una disposición de lentes de excitación 10 que transfiere la
luz de dicha fuente luminosa 4 a la citada lente de campo 6.
Esto significa que se genera una imagen de la
luz de la fuente luminosa en el conjunto de múltiples puntos
individuales mediante una óptica de excitación que consta de la
lente de campo 6 y de una disposición de lentes de excitación 10.
Dicha óptica de excitación proporciona una luz de excitación
telecéntrica en el lado del objeto de la lente de campo 6 y, por lo
tanto, es una óptica de excitación telecéntrica. La disposición de
lentes de excitación incorpora como mínimo una lente y,
preferiblemente, un mínimo de tres lentes para incrementar la
apertura de la excitación para lograr una mejor utilización de la
energía de la fuente luminosa. La disposición de lentes de
excitación puede incluir una asfera si se debe reducir la cantidad
de lentes. Preferiblemente, la óptica de excitación telecéntrica
está diseñada para ser acromática y así conseguir una distribución
homogénea de la intensidad en el conjunto de múltiples puntos
individuales con independencia de la longitud de onda de la
excitación.
En otra forma de realización del invento, la
citada fuente luminosa emite luz que incluye múltiples frecuencias;
preferiblemente, dicha fuente luminosa emite luz blanca y, de forma
todavía más preferible, es una lámpara de descarga de gas, como una
lámpara de xenón, de mercurio o bien una lámpara de filamentos, como
una de tungsteno.
En una nueva forma de realización preferente, la
citada fuente luminosa emite luz con una única frecuencia;
preferiblemente, dicha fuente luminosa es un láser y, de forma
todavía más preferente, es un LED.
La ventaja de utilizar una fuente luminosa que
emita luz con distintas frecuencias consiste en que entonces se
puede utilizar para distintos tintes fluorescentes al tener que
cambiar únicamente el conjunto de filtros formado por el divisor de
haz y, si resulta necesario, el sistema de filtros de excitación y/o
el sistema de filtros de generación de imágenes. Resulta preferible
utilizar ruedas de filtros como sistema de filtros de excitación
y/o sistema de filtros de generación de imágenes con una determinada
cantidad de filtros para pasar de un tinte fluorescente a otro con
total facilidad. Por otro lado, si la fuente luminosa emite luz con
una única frecuencia, los requisitos que impone el conjunto de
filtros son fáciles de cumplir, pero el instrumento óptico se
limita a un número determinado de tintes fluorescentes.
En una forma de realización del presente
invento, la ventana de la fuente luminosa tiene un revestimiento
óptico activo que actúa como sistema especial de filtros de
excitación para absorber luz UV y/o IR.
En otra variante preferente del invento, dicha
fuente luminosa incluye una combinación de más de un iluminante,
preferiblemente, más de un láser y, de forma todavía más preferente,
más de un LED.
En esta forma de realización preferente, se
utiliza un conjunto de iluminantes distintos para proporcionar un
instrumento óptico de conformidad con el presente invento con más de
una frecuencia de excitación. En la figura 2 se muestra una forma
de realización con arreglo al presente invento con dos fuentes
luminosas distintas, cada una de las cuales dispone de su propio
sistema de filtros de excitación 8, una disposición de lentes de
excitación 10 y un divisor de haz 7.
En otra variante de conformidad con el presente
invento, la citada fuente luminosa también incorpora un dispositivo
para seleccionar uno o varios de los iluminantes antes citados.
Un dispositivo de este tipo se puede llevar a la
práctica de diversos modos. Una posibilidad consiste en utilizar
espejos giratorios para inyectar la luz de un determinado iluminante
en el camino óptico. Otra posibilidad consiste en mover la
disposición de iluminantes para inyectar la luz de un determinado
iluminante en el camino óptico.
La óptica de excitación telecéntrica de
conformidad con el presente invento puede incluir diversos
componentes adicionales además de la lente de campo 6, el sistema
de filtros de excitación 8, la disposición de lentes de excitación
10 y el divisor de haz 7. En una forma de realización, la óptica de
excitación telecéntrica también incorpora una guía de luz, y la luz
de la fuente luminosa se une a dicha guía para así transferir la
luz de la fuente luminosa a los componentes ópticos del sistema. El
uso de una guía de luz permite unir la luz de distintas fuentes
luminosas y transferir simultáneamente la luz combinada resultante a
los componentes ópticos. Para el objetivo del presente invento, se
puede emplear cualquier tipo de guía de luz. A modo de ejemplo,
puede ser una guía de luz fluida, guías de luz de fibra óptica o
haces de guías de luz de fibra óptica. En una forma de realización
del presente invento, un extremo de dicha guía, o bien ambos
extremos, tiene un revestimiento óptico activo que actúa como
sistema especial de filtros de excitación para absorber luz UV y/o
IR.
En otra forma de realización de conformidad con
el presente invento, la óptica de excitación telecéntrica también
incluye un mezclador de luz para mezclar la luz de la citada fuente
luminosa y generar una imagen de la superficie iluminada de dicho
mezclador sobre el conjunto de múltiples puntos individuales.
Un mezclador de luz es un dispositivo con una
superficie iluminada de forma muy homogénea que se puede utilizar
como fuente luminosa que proporciona luz con una distribución de
intensidad homogénea en toda la sección transversal. Un mezclador
de luz es un objeto alargado fabricado en material óptico
transparente cuyos límites son paralelos al camino óptico. En otras
palabras, un mezclador de luz es un tipo de fibra óptica. La luz que
se inyecta en dicho mezclador experimenta múltiples reflexiones
totales en el punto de contacto interior del material óptico
transparente, con lo que se crea un área de sección transversal en
el extremo de la fibra óptica que está iluminada de forma muy
homogénea. Las reflexiones totales que se producen en el punto de
contacto interior del material óptico transparente se basan
simplemente en el cambio del índice de refracción en dicho punto o
bien pueden contar con la ayuda de revestimientos reflectantes. La
razón entre la longitud del citado mezclador de luz y su área de
sección transversal es importante para la homogeneidad de la
iluminación. Preferiblemente, esta razón será superior a 2.
Mediante la óptica de excitación telecéntrica,
que incluye la lente de campo 6 y una disposición de lentes de
excitación 10, se genera una imagen de la luz de la fuente luminosa,
en especial del área de sección transversal del extremo del
mezclador de luz, en el conjunto de múltiples puntos individuales.
En consecuencia, en esta forma de realización del invento, la
excitación de múltiples puntos individuales se efectúa con una
óptica de excitación que es telecéntrica en el punto del objeto de
la lente de campo 6.
El instrumento óptico de conformidad con el
presente invento también se puede adaptar para generar imágenes de
quimioluminiscencia y bioluminiscencia. Puesto que en estos casos no
se requiere luz de excitación, la fuente luminosa 4, la disposición
de lentes de excitación 10 y el sistema de filtros de excitación 8
se pueden omitir.
En una variante preferente adicional, el
instrumento óptico de conformidad con el presente invento también
incluye una unidad para plegar el haz luminoso que contiene uno, dos
o más espejos para plegar la luz y que pliega la luz de la fuente
luminosa y las señales de fluorescencia del citado conjunto de
múltiples puntos individuales.
En el ámbito del presente invento, una unidad
para plegar el haz luminoso es una unidad que proporciona un camino
óptico largo que, a su vez, sólo requiere una cantidad reducida de
espacio. Para ajustar la apertura numérica de la óptica de
excitación, un parámetro que se puede modificar es el camino óptico
que la luz debe recorrer.
Al extender el camino óptico se reduce la
apertura numérica. En consecuencia, si se desea una pequeña apertura
óptica para cumplir los requisitos de profundidad de campo y una
distribución homogénea de la intensidad, el camino óptico será
largo. Puesto que los instrumentos de grandes dimensiones no son
aptos, los espejos para plegar la luz se pueden utilizar para
conseguir un camino óptico largo y, a su vez, limitar el tamaño del
instrumento.
Tal y como se ha mencionado con anterioridad, el
instrumento óptico de conformidad con el presente invento incluye
una disposición de lentes de generación de imágenes 11, disposición
que transfiere la luz de la lente de campo 6 hasta el citado
transductor 5.
Esto significa que, mediante una óptica
telecéntrica de generación de imágenes que consta de la lente de
campo 6 y de una disposición de lentes de generación de imágenes
11, en el transductor 5 se generan imágenes de las señales de
fluorescencia que se originan en el conjunto de múltiples puntos
individuales. En otras formas de realización del invento, la óptica
telecéntrica de generación de imágenes también incluye, por ejemplo,
una unidad para plegar el haz luminoso y/o sistemas especiales de
filtros de generación de imágenes 9.
La óptica telecéntrica de generación de imágenes
se debe optimizar en cuanto al tamaño del transductor y al tamaño
espacial del conjunto de múltiples puntos individuales. Como en el
caso de la disposición de lentes de excitación 10, la disposición
de lentes de generación de imágenes 11 incluye como mínimo una lente
y, preferiblemente, un conjunto de cómo mínimo cinco lentes. Se
requiere un elevado número de lentes para la disposición de lentes
de generación de imágenes, puesto que para la óptica de generación
de imágenes se deben abordar requisitos incluso más exigentes que
para la óptica de excitación. La escala para la generación de
imágenes de fluorescencia debe ser la adecuada para conseguir una
correcta reproducción de la distribución lateral de los puntos en
el transductor. Además, se deben controlar los errores en la
generación de imágenes, como las aberraciones cromáticas o
esféricas, los halos, el astigmatismo, los errores especiales o la
curvatura del campo. A causa de la generación de imágenes de
señales de fluorescencia en el transductor, la generación de
imágenes de fluorescencia se realiza con una óptica de generación
de imágenes que es telecéntrica sólo en el lado del objeto de la
lente de campo 6.
En otra variante preferente del instrumento
óptico de conformidad con el presente invento, la citada disposición
de lentes de generación de imágenes 11 está conectada al
transductor 5 antes mencionado para conformar una unidad de
generación de imágenes 12.
Es importante recordar que, en esta forma de
realización preferente del presente invento, la óptica telecéntrica
de generación de imágenes es distinta a los objetivos estándar, en
los que todas las lentes están dispuestas y fijadas de una forma
concreta para formar el objetivo, que se coloca como un conjunto
entre el transductor y el objeto. Bien al contrario, en esta forma
de realización preferente del presente invento, la disposición de
lentes de generación de imágenes 11 está conectada al transductor 5
para conformar una unidad de generación de imágenes 12. Para
cumplir los requisitos relativos a la resolución y precisión de la
generación de imágenes, la colocación del transductor y de la
disposición de lentes de generación de imágenes es especialmente
importante. En esta forma de realización, estos requisitos se
cumplen al optimizar la posición entre la disposición de lentes de
generación de imágenes y el transductor antes de que se fije la
posición optimizada. Esta conexión entre el transductor y la
disposición de lentes de generación de imágenes se mantiene a lo
largo de todo el uso previsto, y dichos elementos sólo se separan
si resulta necesario volver a optimizar su posición.
En una forma de realización del instrumento
óptico de conformidad con el presente invento, el citado transductor
incluye un dispositivo semiconductor o, preferiblemente, un
dispositivo de carga acoplada.
En el contexto del presente invento, un
transductor es un dispositivo capaz de convertir la luz en señales
eléctricas que un ordenador puede procesar. Este proceso se puede
llevar a cabo mediante dispositivos semiconductores con una banda
prohibida menor que la energía correspondiente a las señales de
fluorescencia que se deben detectar. Los electrones que se generan
en la banda conductora del semiconductor mediante la iluminación del
dispositivo producen una señal cuantificable que se puede traducir
en datos informatizables. Algunos ejemplos de estos dispositivos
semiconductores son los fotodiodos o un dispositivo de carga
acoplada (CCD).
Otra variante preferente del instrumento óptico
de conformidad con el presente invento es un instrumento óptico en
el que los puntos individuales del citado conjunto son pocillos, la
luz de excitación es paralela a las paredes laterales de dichos
pocillos y la solución que llena estos pocillos incluye tintes
fluorescentes.
Un ejemplo de esta variante preferente adicional
del instrumento óptico es un dispositivo para realizar un
seguimiento simultáneo de las amplificaciones mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) que se producen en cada uno de los
pocillos de una placa de microvaloración. La luz de excitación es
paralela a las paredes laterales para así iluminar todo el interior
de los pocillos con independencia del nivel de llenado del interior
de los pocillos. Puesto que se utiliza una óptica telecéntrica tanto
para la excitación como para la generación de imágenes de
fluorescencia, los resultados que se obtienen de un pocillo del
centro de la placa son comparables a los que se consiguen de
pocillos de los extremos.
En el caso de amplificaciones mediante PCR
efectuadas en pocillos individuales, todas las entidades
fluorescentes se pueden aplicar como tintes fluorescentes que se
unen específicamente a ácidos nucleicos bicatenarios. En el
contexto del presente invento, estos tintes fluorescentes se
denominan entidades fluorescentes de unión al ADN. Una entidad
fluorescente de unión al ADN es una molécula o un par de moléculas
que proporcionan una luz fluorescente característica si se unen a
un ADN bicatenario. En el ámbito del seguimiento de la PCR en
tiempo real, son bien conocidos los siguientes formatos de
detección: los formatos de tinte de unión al ADN (por ejemplo,
SybrGreen I), las sondas Taqman, las balizas moleculares, los
formatos de sonda con un único marcador (SLP, del inglés Single
Labeled Probe) o las sondas de hibridación FRET.
Una forma de realización del instrumento óptico
de conformidad con el presente invento también preferente es un
instrumento óptico en el que los puntos individuales del citado
conjunto son puntos situados en un soporte plano y los tintes
fluorescentes se unen a dichos puntos.
Un ejemplo de esta forma de realización
preferente del instrumento óptico es un dispositivo para la
generación simultánea de imágenes de señales de fluorescencia de
distintos puntos de una matriz plana. En una forma de realización
específica, esta matriz es una matriz de ADN, en la que las áreas
laterales reducidas se funcionalizan con sondas de ADN que tienen
distintas secuencias. En este caso, el instrumento óptico de
conformidad con el presente invento puede realizar un seguimiento
de eventos de hibridación con muestras que contienen ácidos
nucleicos si, por ejemplo, la cadena complementaria de ADN se marca
con un tinte fluorescente. Como alternativa al marcado de las
moléculas de ADN de la muestra, los eventos de hibridación también
se pueden ver mediante la unión de tintes fluorescentes al ácido
nucleico bicatenario.
El presente invento también hace referencia a un
instrumento para la PCR en tiempo real que consta de los elementos
siguientes:
- -
- un instrumento óptico de conformidad con el presente invento; y
- -
- medios para calentar y refrigerar un soporte con uno o varios pocillos cada uno de los cuales contiene una mezcla de reacción capaz de realizar una reacción de PCR.
En el ámbito del presente invento, los medios
para calentar y refrigerar el soporte incluyen cualquier medio
capaz de controlar y modificar la temperatura del conjunto de
múltiples puntos individuales de forma cíclica para realizar
amplificaciones cíclicas de ácidos nucleicos mediante PCR. Cada
ciclo de PCR incluye diversas fases distintas: una fase de
hibridación con temperatura descendente, una fase de amplificación
enzimática a temperaturas relativamente bajas junto con una fase de
detección en la que se emplean tintes fluorescentes y una fase de
fusión a temperaturas elevadas.
Otro aspecto del presente invento hace
referencia a un sistema para llevar a cabo de forma simultánea
múltiples reacciones de PCR en tiempo real y realizar un
seguimiento de las mismas que consta de los elementos
siguientes:
- -
- una placa con diversos pocillos con múltiples puntos individuales cada uno de los cuales contiene una mezcla de reacción capaz de realizar una reacción de PCR;
- -
- entidades fluorescentes de unión al ADN; y
- -
- un instrumento para la realización de PCR en tiempo real que incluye un instrumento óptico de conformidad con el presente invento que ilumina el conjunto de la placa con múltiples pocillos con luz telecéntrica y detecta las señales de fluorescencia de cada pocillo de dicha placa mediante un transductor instalado para recibir las correspondientes señales de fluorescencia y así generar datos primarios informatizables.
En general, existen distintos formatos de
entidades fluorescentes de unión al ADN para la detección en tiempo
real de ADN amplificado; los que se recogen a continuación son de
uso habitual en la técnica y son bien conocidos para los expertos
en la materia:
Puesto que, por lo general, la cantidad del
producto de una amplificación bicatenaria supera la cantidad de
ácido nucleico presente en un principio en la muestra objeto de
análisis, se pueden utilizar tintes específicos para ADN
bicatenario que, cuando se excitan con una longitud de onda
adecuada, muestran una mayor fluorescencia sólo si están unidos al
ADN bicatenario. Preferiblemente, sólo se pueden utilizar esos
tintes que, por ejemplo, como el SybrGreen I, no afectan a la
eficiencia de la reacción de PCR.
El resto de formatos conocidos en la técnica
requieren el diseño de una sonda de hibridación marcada con
fluorescencia que sólo emita fluorescencia cuando esté unida a su
ácido nucleico diana.
Una sonda de hibridación monocatenaria se marca
con dos componentes. Cuando el primer componente se excita con luz
con una longitud de onda adecuada, la energía absorbida se
transfiere al segundo componente, el denominado extintor de
fluorescencia, de conformidad con el principio de transferencia de
energía de la resonancia fluorescente. Durante la fase de
hibridación de la reacción de PCR, la sonda de hibridación se une el
ADN diana y se degrada mediante la actividad de la exonucleasa
5’-3’ de la Taq polimerasa durante la posterior fase de elongación.
Como consecuencia, el componente fluorescente excitado y el extintor
de fluorescencia se separan espacialmente el uno del otro y, por lo
tanto, se puede medir una emisión de fluorescencia del primer
componente (patente estadounidense US 5.538.848).
Estas sondas de hibridación también se marcan
con un primer componente y con un extintor de fluorescencia;
preferiblemente, los marcadores están situados en ambos extremos de
la sonda. Como consecuencia de la estructura secundaria de la
sonda, ambos componentes se encuentran espacialmente próximos en la
solución. Tras la hibridación con los ácidos nucleicos diana, ambos
componentes se separan el uno del otro de modo que, tras la
excitación con luz con una longitud de onda adecuada, se puede
medir la emisión de fluorescencia del primer componente (patente
estadounidense US 5.118.801).
Este formato de detección consta de un único
oligonucleótido marcado con un único tinte fluorescente en el
extremo 5’ o 3’ (patente WO 02/14555). Se pueden emplear dos diseños
distintos para el oligomarcado: sondas de extinción en G y sondas
de incremento de la fluorescencia de nitroindol.
En la forma de realización de extinción en G, el
tinte fluorescente se une a un C en el extremo 5’ o 3’ del
oligonucleótido. La fluorescencia se reduce notablemente cuando la
sonda se hibrida con la diana, en caso de que se encuentren dos G
en la cadena diana opuesta a C y en la posición 1 al lado de la
sonda oligonucleótida complementaria.
En la forma de realización de incremento de la
fluorescencia de nitroindol, el tinte fluorescente se une al
nitroindol en el extremo 5’ o 3’ del oligonucleótido. El nitroindol
reduce la señalización de fluorescencia de la sonda libre. La
fluorescencia se incrementa cuando la sonda se hibrida con el ADN
diana a causa de un efecto de desextinción.
El formato de prueba de la sonda de hibridación
FRET es especialmente útil para todos los tipos de ensayos de
hibridación homogénea (Matthews, J. A. y Kricka, L. J., Anal.
Biochem. 169 (1988) 1-25). Se caracteriza por
un par de dos sondas de hibridación monocatenaria que se utilizan de
forma simultánea y son complementarias para puntos adyacentes de la
misma cadena del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas se
marcan con componentes fluorescentes distintos. Cuando se excita
con luz con una longitud de onda adecuada, un primer componente
transfiere la energía absorbida al segundo componente de conformidad
con el principio de transferencia de energía de la resonancia
fluorescente, de modo que se puede medir una emisión de
fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas de
hibridación se unen a posiciones adyacentes de la molécula diana que
se debe detectar.
Cuando se hibrida a la secuencia diana, las
sondas de hibridación deben estar asentadas una muy cerca de la
otra en una disposición cabeza-cola. Por lo general,
la distancia de separación entre el extremo 3’ marcado de la
primera sonda y el extremo 5’ de la otra sonda es lo más reducida
posible, esto es, entre 1 y 5 bases. Esto permite que el compuesto
donador y el compuesto aceptor de la FRET sean muy próximos, por lo
general entre 10 y 100 angstroms.
Como alternativa a la realización de un
seguimiento del incremento de la fluorescencia del componente
aceptor de la FRET, también se puede llevar a cabo un seguimiento
de la reducción de la fluorescencia del componente donador de la
FRET como medida cuantitativa del evento de hibridación.
En particular, el formato de sonda de
hibridación FRET se puede utilizar en la realización de PCR en
tiempo real con la finalidad de detectar el ADN diana amplificado.
Entre todos los formatos de detección conocidos en la técnica de la
PCR en tiempo real, se ha demostrado que el formato de sonda de
hibridación FRET es muy sensible, exacto y fiable (patentes WO
97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). A pesar de ello, a veces el
diseño de sondas de hibridación FRET adecuadas se puede ver
limitado por las características especiales de la secuencia de
ácido nucleico diana que se debe detectar.
Como alternativa al uso de dos sondas de
hibridación FRET, también existe la posibilidad de utilizar un
cebador marcado con fluorescencia y sólo una sonda oligonucleótida
marcada (Bernard, P. S., et al., Anal. Biochem. 255
(1998) 101-107). En este sentido, se puede escoger
indistintamente entre marcar el cebador con el compuesto donador o
el compuesto aceptor de la FRET.
Asimismo, el invento también consta de un método
para amplificar, detectar y/o cuantificar múltiples secuencias de
ADN diana que:
- -
- proporciona una mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones de PCR;
- -
- somete dicha mezcla de reacción a un protocolo de termociclado de modo que se pueda llevar a cabo la amplificación de las citadas múltiples secuencias de ADN diana; y
- -
- realiza un seguimiento de la presencia y cantidad de cada secuencia de ADN como mínimo una vez después de múltiples ciclos de amplificación mediante el uso de entidades fluorescentes de unión al ADN y un instrumento de PCR en tiempo real de conformidad con el presente invento.
\newpage
Ejemplo
Un instrumento óptico como el que se explica en
la descripción detallada y se muestra en la figura 2 (con una única
fuente luminosa) se configuró del modo siguiente. La óptica de
excitación telecéntrica se ajustó para trabajar en frecuencias que
oscilaban entre 450 y 650 nm y la óptica telecéntrica de generación
de imágenes para frecuencias que oscilaban entre 500 y 740 nm. La
fuente luminosa era una lámpara de xenón y como transductor se
empleó un chip CCD refrigerado de 1,7 cm con una resolución de 1.024
x 1.344 píxeles. El instrumento óptico se diseñó para generar
imágenes de un área de 83 mm x 117 mm, de modo que se podían
utilizar placas de microvaloración (PMV) con 96 (distancia de 9 mm;
diámetro de 5 mm) y 384 pocillos (distancia de 4,5 mm; diámetro de 3
mm). La longitud de onda adecuada para la excitación y la
generación de imágenes de determinados tintes fluorescentes se
ajustó mediante ruedas de filtros.
La apertura numérica de la óptica de excitación
telecéntrica en el lado de la fuente luminosa era de 0,35, y en el
lado de la PMV, de 0,014. La fuente luminosa se dispuso de forma
perpendicular al chip CCD y el haz luminoso de excitación se
orientó hacia la PMV con un divisor de haz reflectante para la
frecuencia de excitación necesaria y transparente para el resto de
frecuencias que contenía la luz de la fuente luminosa. El haz
luminoso de excitación del divisor de haz era perpendicular a la
PMV y la variación de la intensidad a lo largo del campo del objeto
(88 mm x 122 mm) fue inferior al 10%. La apertura de la óptica de
generación de imágenes en el lado del objeto fue de 0,014, y la
escala de reproducción de -0,075, con una distancia
objeto-imagen de 800 mm. Esta larga distancia se
consiguió mediante dos espejos para plegar el haz. La óptica de
generación de imágenes presentaba una profundidad de campo de
\pm3 mm. El divisor de haz empleado era transparente para las
señales de fluorescencia generadas en los pocillos de la PMV a causa
de la excitación.
Bernard, P. S., et al., Anal.
Biochem. 255 (1998) 101-107
DE 101 31 687
DE 101 55 142
DE 102 00 499
DE 197 48 211 A1
EP 1 275 954 A2
JP 2002014044
Matthews, J. A. y Kricka, L. J., Anal.
Biochem. 169 (1988)1-25
US 2002/0005493 A1
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WO 97/46707
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Claims (8)
1. Un instrumento óptico para la generación de
imágenes de señales de fluorescencia de un conjunto de múltiples
puntos individuales que consta de los elementos siguientes: un medio
de sujeción (1) para sujetar un soporte plano (2) con un conjunto
de múltiples puntos individuales (3); como mínimo una fuente emisora
de luz (4) que incluye como mínimo una frecuencia de excitación; un
transductor (5) instalado para que pueda recibir señales de
fluorescencia del citado conjunto de múltiples puntos individuales
(3) y para que genere datos primarios informatizables; una lente de
campo (6) instalada para transferir luz de excitación desde la
citada fuente luminosa (4) hasta el conjunto de múltiples puntos
individuales (3) antes citado y señales de fluorescencia desde
dicho conjunto de múltiples puntos individuales (3)hasta el
citado transductor (5); una disposición de lentes de excitación
(10) instalada para transferir luz de excitación desde la citada
fuente luminosa (4) hasta dicha lente de campo (6); y una
disposición de lentes de generación de imágenes (11) instalada para
transferir señales de fluorescencia desde dicha lente de campo (6)
hasta el citado transductor (5), en el que el camino de la luz de
excitación y el camino de la luz de generación de imágenes de
fluorescencia son telecéntricos en el lado del objeto de la citada
lente de campo (6).
2. Un instrumento óptico de conformidad con la
reivindicación 1 que, además, incluye un divisor de haz (7)
transparente para como mínimo una frecuencia de excitación y
reflectante para las frecuencias de las citadas señales de
fluorescencia o un divisor de haz reflectante para como mínimo una
frecuencia de excitación y transparente para las frecuencias de las
citadas señales de fluorescencia.
3. Un instrumento óptico de conformidad con
cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que la citada
disposición de lentes de generación de imágenes (11) está conectada
al citado transductor (5) para formar una unidad de generación de
imágenes (12).
4. Un instrumento óptico de conformidad con
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que los
puntos individuales del citado conjunto son pocillos, la luz de
excitación es paralela a las paredes laterales de dichos pocillos y
la solución que llena los citados pocillos incluye tintes
fluorescentes.
5. Un instrumento óptico de conformidad con
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 en el que los
puntos individuales del citado conjunto son puntos en un soporte
plano y los tintes fluorescentes están unidos a dichos puntos.
6. Un instrumento de PCR en tiempo real que
consta de los elementos siguientes: un instrumento óptico de
conformidad con cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5;
medios para calentar y refrigerar un soporte con uno o varios
pocillos que contienen una mezcla de reacción capaz de realizar una
reacción de PCR.
7. Un sistema para llevar a cabo de forma
simultánea múltiples reacciones de PCR en tiempo real y realizar un
seguimiento de las mismas que consta de los elementos siguientes:
una placa con múltiples pocillos y diversos puntos individuales,
cada uno de los cuales contiene una mezcla de reacción capaz de
realizar una reacción de PCR; entidades fluorescentes de unión al
ADN; y un instrumento para la realización de PCR en tiempo real de
conformidad con la reivindicación 6 que consta de un instrumento
óptico de conformidad con las reivindicaciones de la 1 a la 5 para
iluminar el conjunto de la placa con múltiples pocillos con luz
telecéntrica y para detectar las señales de fluorescencia
procedentes de cada pocillo de la citada placa con múltiples
pocillos mediante un transductor instalado para recibir las
correspondientes señales de fluorescencia y así generar datos
primarios informatizables.
8. Un método para amplificar, detectar y/o
cuantificar múltiples secuencias de ADN diana que: proporciona una
mezcla de reacción o composición capaz de realizar reacciones de
PCR; somete dicha mezcla de reacción a un protocolo de termociclado
de modo que se pueda llevar a cabo la amplificación de las citadas
múltiples secuencias de ADN diana; y realiza un seguimiento de la
presencia y cantidad de cada secuencia de ADN como mínimo una vez
después de múltiples ciclos de amplificación mediante el uso de
entidades fluorescentes de unión al ADN y un instrumento de PCR en
tiempo real de conformidad con la reivindicación 6.
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