ES2284197T3 - Transferencia nuclear con celulas donadoras fetales y adultas diferenciadas. - Google Patents

Abstract

Un método para clonar un mamífero bovino, que comprende: (i) insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT); (ii) activar la unidad de transferencia nuclear resultante; (iii) cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y (iv) transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, de tal manera que la unidad de NT desarrolle un feto.

Description

Transferencia nuclear con células donadoras fetales y adultas diferenciadas.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de clonación en los que los núcleos celulares derivados de células bovinas diferenciadas, fetales o de adultos, se transplantan a oocitos bovinos enucleados. Los núcleos se reprograman para dirigir el desarrollo de embriones clonados, que a continuación pueden ser transferidos a hembras receptoras para producir fetos y descendencia, o se usan para producir células de la masa celular interna cultivada (en lo sucesivo abreviadamente CICM, por la expresión inglesa Cultured Inner Cell Mass). Los embriones clonados también pueden combinarse con embriones fertilizados para producir embriones quiméricos, fetos y/o descendencia.

2. Fundamento de la invención

Son muy conocidos los métodos para obtener in vitro líneas de células madre embrionarias (en lo sucesivo abreviadamente ES, por la expresión inglesa Embryonic Stem) a partir de embriones de ratón en la fase de preimplantación temprana (Véase, por ejemplo, Evans et al., Nature, 29:154-156 (1981); Martin, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:7634-7638 (1981)). Las células ES pueden ser sometidas a pases en un estado no diferenciado, siempre que esté presente una capa alimentadora de fibroblastos (Evans et al., Id.) o una fuente inhibidora de la diferenciación (Smith et al., Dev. Biol.; 121:1-9 (1987)).

Previamente se ha descrito que las células ES poseían numerosas aplicaciones. Por ejemplo, se sabe que las células ES pueden usarse como modelo in vitro para diferenciación, especialmente para el estudio de genes que están implicados en la regulación del desarrollo temprano. Las células ES de ratón pueden dar lugar a quimeras de línea germinal cuando se introducen en embriones de ratones en la fase de preimplantación, demostrando así su pluripotencia (Bradley et al., Nature, 309:255-256 (1984)).

Debido a su capacidad para transferir su genoma a la siguiente generación, las células ES tienen utilidad potencial para la manipulación de la línea germinal de ganado usando células ES con o sin modificación genética deseada. Además, en el caso del ganado, por ejemplo, de los ungulados, los núcleos de embriones de ganado similares en la fase de preimplantación mantienen hasta el final el desarrollo de los oocitos enucleados (Smith et al., Biol. Reprod., 40:1027-1035 (1989); y Keefer et al., Biol. eprod., 50:935-939 (1994)). Estos está en contraste con los núcleos de embriones de ratón, que más allá de la etapa de ocho células después de la transferencia no apoyan, según se informa, el desarrollo de oocitos enucleados (Cheong et al Biol. Reprod.,, 48:958 (1993)). Por consiguiente, las células ES del ganado son muy deseables debido a que proporcionan una fuente potencial de núcleos donantes totipotentes, manipuladas genéticamente o de otra forma, para procedimientos de transferencia nuclear.

Algunos grupos de investigación han descrito el aislamiento de líneas celulares embrionarias aparentemente pluripotentes. Por ejemplo, Notarianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 43:255-260 (1991), describen el establecimiento de líneas celulares pluripotentes, aparentemente estables de cerdo y blastocistos de oveja que presentan algunas características morfológicas y de crecimiento similares a las de las células en cultivos primarios de la masa celular interna aisladas inmunoquirúrgicamente de blastocistos de oveja. También, Notarianni et al., J. Reprod. Fert. Suppl., 41:51-56 (1990) describen el mantenimiento y diferenciación en el cultivo de supuestas líneas celulares embrionarias pluripotentes de blastocistos de cerdo. Gerfen et al., Anim. Biotech, 6(1):1-14 (1995) describen el aislamiento de líneas celulares embrionarias de blastocistos porcinos. Estas células se mantienen establemente en capas alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón sin el uso de medio acondicionado y se ha descrito que durante el cultivo se diferencian en diversos tipos de células diferentes.

Además, Saito et al., Roux's Arch. Dev. Biol., 201:134-141 (1992) describen líneas celulares similares a citoblastos embrionarias bovinas que sobreviven tres pases, pero que se perdieron después del cuarto pase. Handyside et al., Roux's Arch. Dev. Biol., 196:185-190 (1987) describen el cultivo de masas celulares internas aisladas inmunoquirúrgicamente de embriones de oveja en condiciones que permitan el aislamiento de líneas de células ES de ratón procedentes de la ICM de ratón. Handyside et al. describen que en dichas condiciones, las ICM de oveja atacan, se extienden y desarrollan áreas de células tanto similares a las células ES como al endodermo, pero que después de cultivo prolongado sólo son evidentes las células similares al endodermo.

Recientemente, Cherny et al., Theriogenology, 41:175 (1994) describieron líneas celulares derivadas de células germinativas primordiales de bovino aparentemente pluripotentes mantenidas en cultivo a largo plazo. Estas células, después de aproximadamente siete días de cultivo, produjeron colonias similares a células ES que se teñían positivamente con fosfatasa alcalina (AP), presentaban la capacidad de formar cuerpos embrioides y diferenciarse espontáneamente en al menos dos tipos de células diferentes. Estas células se cree que también expresan el mRNA para los factores de trascripción OCT4, OCT6 y HES1, un modelo de genes de homeosecuencia que se cree que son expresados exclusivamente por células ES.

También recientemente, Campbell et al., Nature, 380:64-68 (1996) describieron la producción de corderos vivos por transferencia nuclear de las células del disco embrionario (ED) de embriones ovinos de nueve días cultivados en condiciones que promueven el aislamiento de líneas de células ES en el ratón. Los autores llegaron a la conclusión de que las células ED de embriones ovinos de nueve días son totipotentes por transferencia nuclear y que su totipotencia se mantiene en el cultivo.

Van Stekelenburg-Hamers et al., Mol. Reprod. Dev., 40:444-454 (1995), describieron el aislamiento y la caracterización de líneas celulares supuestamente permanentes procedentes de células de la masa celular interna de blastocistos bovinos. Los autores aislaron y cultivaron la masa celular interna (en lo sucesivo abreviadamente ICM, por la expresión inglesa Inner Cell Mass) de blastocistos bovinos de 8ó 9 días en diferentes condiciones para determinar que células alimentadoras y medios de cultivo apoyan más eficazmente la unión y producción de células de la ICM bovina. Llegaron a la conclusión de que la unión y producción de las células cultivadas de la ICM se mejora por el uso de células alimentadoras (fibroblasto de ratón) STO (en lugar de células epiteliales de útero bovino) y por el uso de suero tratado con carbón (en lugar de suero normal) para complementar el medio de cultivo. Van Stekelenburg et al. describieron, sin embargo, que sus líneas celulares parecían células epiteliales más que células pluripotentes de la ICM.

Smith et al., en el documento WO 94/24274, publicado el 27 de Octubre de 1994, Evans et al., en el documento WO 90/03432, publicado el 5 de Abril de 1990 y Wheeler et al., en el documento WO 94/26889, publicado el 24 de Noviembre de 1994, describen el aislamiento, la selección y propagación de células madre de animales que aparentemente pueden usarse para obtener animales transgénicos. Evans et al. describieron también la derivación de células madre embrionarias aparentemente pluripotentes de especies porcinas y bovinas que se supone son útiles para la producción de animales transgénicos. Además, Wheeler et al., en el documento WO 94/26884, publicado el 24 de Noviembre de 1994, describieron células madre embrionarias que se supone son útiles para la fabricación de ungulados quiméricos y transgénicos.

De este modo, basándose en lo anterior, es evidente que muchos grupos han intentado producir líneas de células ES, por ejemplo, debido a su aplicación potencial en la producción de embriones clonados o transgénicos y en el transplante nuclear.

También se ha descrito el uso de células de la masa celular interna (ICM) de ungulados para el transplante nuclear. Por ejemplo, Collas et al., Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994) describe el transplante nuclear de las ICM bovinas por microinyección de las células donantes lisadas en oocitos maduros enucleados. Collas et al. describieron el cultivo in vitro de embriones durante siete días produciendo quince blastocistos que, por transferencia a receptores bovinos, dieron como resultado cuatro embarazos y dos nacimientos. También, Keefer et al., Biol. Reprod., 50:935-939(1994), describieron el uso de células de la ICM bovinas como núcleos donantes en procedimientos de transferencia nuclear, para producir blastocistos que, por transplante a receptores bovinos, dieron como resultado diversa descendencia viva. Además, Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993), describieron la producción de terneros por transferencia de núcleos procedentes de células de la ICM bovinas cultivadas in vitro a corto plazo en oocitos maduros enucleados.

También se ha descrito la producción de corderos vivos por transferencia nuclear de células del disco embrionario cultivadas (Campbell et al., Nature, 380:64-68(1996)). Aún más, se ha descrito el uso de células embrionarias pluripotentes bovinas en la transferencia nuclear y la producción de fetos quiméricos (Stice et al., Biol. Reprod., 54:100-110 (1996); Collas et al, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994)). Collas et al. demostraron que podrían usarse células de la granulosa (células adultas) en un proceso de clonación de bovinos para producir embriones. Sin embargo, no se demostró el desarrollo más allá de las etapas embrionarias tempranas (etapa de blastocisto). Por otra parte, las células de la granulosa no se cultivan fácilmente y se obtienen sólo a partir de las hembras. Collas et al. no intentaron propagar las células de la granulosa en cultivo ni intentaron modificar genéticamente dichas células.

Aunque son posibles las multiplicaciones de genotipos con células embrionarias como donantes, los métodos actuales plantean algunos problemas. Por ejemplo, por los métodos actuales, la clonación del embrión sólo puede realizarse con un número limitado de núcleos donantes embrionarios (menos de 100) o con líneas celulares in vitro. Se desconoce si el genoma embrionario codifica un genotipo superior hasta que el animal clonado se hace adulto.

También se plantean problemas en el área de producción de mamíferos transgénicos. Por los métodos actuales, se introduce DNA heterólogo en embriones tempranos o líneas celulares embrionarias que se diferencian en diversos tipos de células en el feto y finalmente se desarrollan en un animal transgénico. Sin embargo, se requieren muchos embriones tempranos para producir un animal transgénico y, por lo tanto, este proceso es muy poco eficaz. Tampoco hay ningún método sencillo y eficaz para seleccionar un embrión transgénico antes de que transcurra el tiempo y aumente el gasto para colocar los embriones en las hembras receptoras. Además, las técnicas de direccionamiento a genes específicos no pueden realizarse fácilmente con procesos transgénicos de embriones tempranos.

Las células madre embrionarias en ratones han permitido a los investigadores seleccionar células transgénicas y realizar procesos de direccionamiento a genes. Esto permite aplicar más ingeniería genética que la que es posible con otras técnicas transgénicas. Sin embargo, las líneas de células madre embrionarias y otras líneas celulares embrionarias deben mantenerse en un estado no diferenciado lo que requiere capas alimentadoras y/o la adición de citoquinas a los medios. Incluso aunque se tomen estas precauciones, estas células experimentan con frecuencia una diferenciación espontánea y no pueden emplearse para producir descendencia transgénica por los métodos actualmente disponibles. Además, algunas líneas celulares embrionarias han de ser propagadas de modo que no conduzcan a procesos de direccionamiento a genes.

No obstante, a pesar de lo que se ha descrito en la bibliografía, se necesitan métodos mejorados de clonación de células de mamíferos.

Objetos y sumario de la invención

Un objeto de la invención es proporcionar métodos nuevos y mejorados para producir células bovinas clonadas.

Un objeto más específico de la invención es proporcionar un nuevo método para clonar células bovinas que implica el transplante del núcleo de una célula bovina diferenciada propagadora en un oocito enucleado de la misma especie.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método para multiplicar mamíferos bovinos adultos que hayan demostrado una superioridad genética u otros rasgos deseables.

Otro objeto de la invención es proporcionar un método mejorado para producir mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o transgénicos (es decir, embriones, fetos, descendencia).

Un objeto más específico de la invención es proporcionar un método para producir mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o transgénicos por el que se inserta, elimina o modifica un gen deseado en un fibroblasto bovino diferenciado o un núcleo celular antes del uso de dicho fibroblasto bovino o núcleo celular para la formación de una unidad de transferencia nuclear (en lo sucesivo abreviadamente NT, por la expresión inglesa Nuclear Transfer).

Otro objeto de la invención es proporcionar mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o transgénicos (es decir, embriones, fetos, descendencia) obtenidos por transplante del núcleo de un fibroblasto bovino diferenciado propagador en un oocito enucleado de la misma especie como la célula diferenciada.

Otro objeto de la invención es proporcionar un nuevo método para producir células de la CICM de mamífero que implica el transplante de un núcleo de un fibroblasto bovino diferenciado propagador en un oocito enucleado de la misma especie como la célula diferenciada.

Otro objeto de la invención es proporcionar células de la CICM producidas por transplante del núcleo de un fibroblasto bovino diferenciado propagador a un oocito enucleado de la misma especie como la célula diferenciada.

Otro objeto de la invención es usar dichas células de la CICM para terapia o diagnosis.

Un objeto específico de la invención es usar dichas células de la CICM para tratamiento o diagnosis de cualquier enfermedad en la que el transplante de células, tejidos u órganos sea terapéuticamente o diagnósticamente beneficioso. Las células de la CICM pueden usarse en la misma especie o en otras especies.

Otro objeto de la invención es usar tejidos procedentes de embriones, fetos o descendencia de NT para el tratamiento o diagnosis de cualquier enfermedad en la que el transplante de células, tejidos u órganos sea terapéuticamente o diagnósticamente beneficioso. Los tejidos pueden usarse en la misma especie o en otras especies.

Otro objeto específico de la invención es usar las células de la CICM producidas de acuerdo con la invención para la producción de células, tejidos u órganos diferenciados.

Otro objeto específico de la invención es usar in vitro las células de la CICM producidas de acuerdo con la invención, por ejemplo para el estudio de la diferenciación celular y para ensayos, por ejemplo para estudios de fármacos.

Otro objeto de la invención es usar las células, tejidos u órganos isogénicos o singénicos obtenidos de las células de la CICM producidas de acuerdo con la invención en métodos mejorados de terapia de transplante. Dichas terapias incluyen, como ejemplo, tratamiento de enfermedades y lesiones que incluyen las enfermedades de Parkinson, Huntington, Alzheimer, ALS, lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes, enfermedades hepáticas, enfermedades cardiacas, sustitución de cartílagos, quemaduras, enfermedades vasculares, enfermedades del tracto urinario, así como para el tratamiento de defectos inmunes, transplante de médula ósea, cáncer, entre otras enfermedades.

Otro objeto de la invención es proporcionar células de la CICM transformadas por ingeniera genética o transgénicas producidas insertando, eliminando o modificando un gen deseado en un fibroblasto bovino diferenciado propagador o núcleo celular antes de usar dicha célula diferenciada o núcleo celular en la formación de una unidad de NT.

Otro objeto de la invención es usar las células de la CICM transformadas por ingeniería genética o transgénicas producidas de acuerdo con la invención en terapia génica, en particular en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades y lesiones antes citadas.

Otro objeto de la invención es usar las células de la CICM producidas de acuerdo con la invención o células de la CICM transgénicas o transformadas por ingeniería genética producidas de acuerdo con la invención como donantes nucleares para el transplante nuclear.

De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para clonar un mamífero bovino (por ejemplo, embriones, fetos, descendencia). El método comprende:

(i)

insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador o un núcleo celular en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de NT;

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y

(iv)

transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, tal que la unidad de NT se desarrolle en un feto.

Las células, tejidos y/u órganos del feto se usan ventajosamente en la zona del transplante de células, tejidos y/u órganos.

La presente invención incluye también un método de clonación de un mamífero transformado por ingeniería genética o transgénico, por el que se inserta, elimina o modifica un gen deseado en el fibroblasto bovino diferenciado o núcleo celular antes de la inserción de la célula de mamífero diferenciada o núcleo celular en el oocito enucleado.

La presente invención también proporciona mamíferos obtenidos de acuerdo con el método anterior y la descendencia de dichos mamíferos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir células de la CICM bovina. El método comprende:

(i)

insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador o un núcleo celular en un oocito bovino, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y

(iv)

cultivar células obtenidas de dicha unidad de NT cultivada para obtener células de la CICM bovinas.

Las células de la CICM se usan ventajosamente en la zona del transplante de células, tejidos y órganos.

De acuerdo con lo antes expuesto y otros objetos, ventajas y aspectos de la invención que serán evidentes de aquí en adelante, la naturaleza de la invención puede comprenderse más claramente con referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y a las reivindicaciones que se acompañan.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona procedimientos mejorados para clonar mamíferos bovinos por transferencia nuclear o transplante nuclear. En la presente solicitud de patente, se usa de forma intercambiable transferencia nuclear o transplante nuclear o NT.

De acuerdo con la invención, los núcleos celulares derivados de fibroblastos bovinos, fetales o de adultos, diferenciados propagadores se transplantan a oocitos de mamíferos enucleados de la misma especie que la de los núcleos donantes. Los núcleos se reprograman para dirigir el desarrollo de los embriones clonados, que a continuación pueden ser transferidos a hembras receptoras para producir fetos y descendencia, o ser usados para producir células de la CICM. Los embriones clonados pueden combinarse también con embriones no humanos fertilizados para producir embriones, fetos y/o descendencia quiméricos.

Los métodos de la técnica anterior han usado tipos de células embrionarias en procedimientos de clonación. Estos incluyen el trabajo de Campbell et al., (Nature, 380:64-68, 1996)y Stice et al., (Biol. Reprod., 54:100-110, 1996). En ambos estudios, las líneas celulares embrionarias se obtuvieron de embriones de menos de 10 días de gestación. En ambos estudios, se mantuvieron las células sobre una capa alimentadora para evitar una clara diferenciación de la célula donante que se va a usar en el procedimiento de clonación. La presente invención usa células diferenciadas.

No se esperaba que los embriones clonados con núcleos donantes diferenciados pudieran desarrollarse hasta etapas embrionarias y fetales avanzadas. El dogma científico ha sido que sólo los tipos de células embrionarias o no diferenciadas podían dirigir este tipo de desarrollo. No se esperaba que pudiera ser producido un gran número de embriones clonados a partir de estos tipos de células diferenciadas. Tampoco se esperaba el hecho de que pudieran obtenerse fácilmente nuevas líneas celulares embrionarias transgénicas a partir de embriones clonados transgénicos.

De este modo, de acuerdo con la presente invención, es posible la multiplicación de genotipos superiores de mamíferos bovinos. Esto permitirá la multiplicación de animales adultos con superioridad genética demostrada u otros rasgos deseables. Se acelerará el progreso, por ejemplo, en muchas especies importantes de ungulados. Por la presente invención, existen potencialmente mil millones de células fetales o de adultos que pueden recogerse y usarse en el procedimiento de clonación. Esto dará potencialmente como resultado un gran número de descendencia idéntica en un corto periodo de tiempo.

La presente invención permite también la simplificación de los procedimientos transgénicos trabajando con una fuente celular diferenciada que puede ser propagada clonalmente. Esto elimina la necesidad de mantener las células en un estado no diferenciado, y de este modo, realizar más fácilmente las modificaciones genéticas, tanto la integración aleatoria como el direccionamiento a genes. También, combinando la transferencia nuclear con la capacidad de modificar y seleccionar estas células in vitro, este procedimiento es más eficaz que las técnicas anteriores con embriones transgénicos. De acuerdo con la presente invención, estas células pueden propagarse clonalmente sin citoquinas, medios acondicionados y/o capas alimentadoras, simplificando y facilitando más el procedimiento transgénico. Cuando en los procedimientos de acuerdo con la invención se usan células transfectadas, se producen embriones transgénicos que pueden desarrollarse en los fetos y la descendencia. Estos embriones clonados transgénicos también pueden usarse para producir líneas celulares de la CICM u otras líneas celulares embrionarias. Por consiguiente, la presente invención elimina la necesidad de obtener y mantener in vitro una línea celular no diferenciada que es apropiada para las técnicas de ingeniería genética.

La presente invención también puede aplicarse para producir células de la CICM, fetos o descendencia que pueden usarse, por ejemplo, en el transplante de células, tejidos y órganos. Tomando una célula fetal o de adulto de un animal y usándola en el procedimiento de clonación, pueden obtenerse una variedad de células, tejidos y posiblemente órganos a partir de fetos clonados como los desarrollados por organogénesis. También pueden aislarse células, tejidos y órganos de la descendencia clonada. Este proceso puede proporcionar una fuente de "materiales" para muchas terapias médicas y veterinarias incluyendo la terapia celular y génica. Si las células se vuelven a transferir al animal del que proceden, se evita el rechazo inmunológico. Además, debido a que de estos clones pueden aislarse muchos tipos de células, pueden aplicarse otras metodologías, tales como quimerismo hematopoyético, para evitar el rechazo inmunológico entre animales de la misma especie así como entre diferentes especies.

De este modo, en un aspecto, la presente invención proporciona un método para clonar un mamífero bovino. En general, el mamífero bovino se obtendrá por un proceso de transferencia nuclear que comprende las siguientes etapas:

(i)

obtener fibroblastos bovinos diferenciados propagadores deseados para ser usados como fuente de núcleos donantes;

(ii)

obtener oocitos a partir de un mamífero de la misma especie como las células que son la fuente de los núcleos donadores;

(iii)

enuclear dichos oocitos;

(iv)

transferir la célula diferenciada o el núcleo celular deseados al oocito enucleado, por ejemplo por fusión o inyección, para formar unidades de NT;

(v)

activar las unidades de NT resultantes;

(vi)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y

(vii)

transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, tal que la unidad de NT desarrolle un feto.

La presente invención incluye también un método para clonar un mamífero bovino transgénico o transformado por ingeniería genética, por el que se inserta, elimina o modifica un gen deseado en el fibroblasto bovino diferenciado o un núcleo celular antes de la inserción del fibroblasto bovino diferenciado o el núcleo celular en el oocito enucleado.

La presente invención también proporciona mamíferos bovinos obtenidos de acuerdo con el método anterior y la descendencia de dichos mamíferos.

La presente invención proporciona además el uso de fetos de NT y descendencia de NT y quimérica en el campo de transplantes de células, tejidos y órganos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir células de la CICM bovinas. El método comprende:

(i)

insertar un fibroblasto bovino diferenciado propagador deseado o un núcleo celular en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa superior a la etapa de desarrollo de 2 células; y

(iv)

cultivar las células obtenidas a partir de dicha unidad de NT cultivada para obtener las células de la CICM bovinas.

Las células de la CICM se usan ventajosamente en el campo de transplantes de células, tejidos y órganos, o en la producción de fetos o descendencia, incluyendo fetos o descendencia transgénicos.

Preferiblemente, las unidades de NT se cultivarán hasta un tamaño de al menos 2 a 400 células, preferiblemente de 4 a 128 células, y más preferiblemente hasta un tamaño de al menos aproximadamente 50 células.

Las técnicas de transferencia nuclear o las técnicas de transplante nuclear son conocidas en la bibliografía y están descritas en muchas de las referencias citadas en el Fundamento de la invención. Véanse, en particular, Campbell et al., Theriogenology, 43:181 (1995); Collas et al., Mol. Report Dev., 38:264-267(1994); Keefer et al., Biol. Reprod., 50:935-939(1994); Sims et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274 y WO 90/03432, que se incorporan en su totalidad en la presente memoria como referencia. También las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.944.384 y 5.057.420 describen procedimientos para el transplante nuclear bovino.

Las células de mamífero diferenciadas son las células que han pasado la etapa embrionaria temprana. Más particularmente, las células diferenciadas son aquellas que al menos han pasado la etapa de disco embrionario (día 10 de la embriogénesis bovina). Las células diferenciadas pueden obtenerse del ectodermo, mesodermo o endodermo.

Los fibroblastos pueden obtenerse por métodos muy conocidos.

Los fibroblastos son un tipo de células ideales debido a que pueden obtenerse en grandes cantidades desarrollando fetos y animales adultos. Los fibroblastos están algo diferenciados y, por consiguientes, antes se consideraban un tipo de células no adecuada para usar en los procesos de clonación. En gran medida, estas células pueden propagarse fácilmente in vitro en el doble de tiempo y pueden propagarse clonalmente para uso en procesos de direccionamiento a genes. De nuevo la presente invención presenta la novedad de usar tipos de células diferenciadas. La presente invención es ventajosa debido a que las células pueden propagarse, modificarse genéticamente y seleccionarse in vitro
fácilmente.

Los oocitos se obtendrán de animales bovinos.

Los métodos para aislar los oocitos son muy conocidos en la técnica. Esencialmente, comprenderán aislar oocitos de los ovarios o tracto reproductor de un animal bovino. Una fuente fácilmente disponible de oocitos bovinos son los materiales de los mataderos.

Para el uso satisfactorio de técnicas tales como la ingeniería genética, la transferencia nuclear y la clonación, los oocitos deben madurarse generalmente in vitro antes de que puedan usarse como células receptoras para la transferencia nuclear, y antes que puedan ser fertilizadas por la célula espermática para desarrollarse en un embrión. Este proceso requiere generalmente recoger oocitos inmaduros (profase I) de ovarios bovinos obtenidos en un matadero y madurar los oocitos en un medio de maduración antes de fertilización o enucleación hasta que el oocito alcanza la etapa de metafase II, que en el caso de oocitos bovinos tiene lugar generalmente alrededor de 18-24 horas después de la aspiración. Para los fines de la presente invención, este periodo de tiempo se conoce como "periodo de maduración." Como se usa en la presente memoria para el cálculo de periodos de tiempo, "aspiración" se refiere a la aspiración del oocito inmaduro de folículos ováricos.

Adicionalmente, los oocitos en la etapa metafase II, que han sido madurados in vivo, se han usado satisfactoriamente en las técnicas de transferencia nuclear. Esencialmente, los oocitos maduros en la metafase II, se extraen quirúrgicamente de vacas o vaquillas no superovuladas o superovuladas 35 a 48 horas después del comienzo del estro o después de inyección de gonadotropina coriónica humana (hCG) o una hormona similar.

Se ha descrito que la etapa de maduración del oocito en la enucleación y transferencia nuclear es significativa para el éxito de los métodos de NT. (Véase, por ejemplo,Prather et al., Differentiation, 48, 1-8, 1991). En general, las prácticas de clonación de embriones de mamífero satisfactorias utilizan el oocito en la etapa metafase II como oocito receptor debido a que se cree que en esta etapa el oocito puede ser o está suficientemente "activado" para tratar el núcleo introducido como lo hace un esperma fertilizante. En animales domésticos, y especialmente en el ganado, el periodo de activación del oocito varía generalmente entre aproximadamente 16-52 horas, preferiblemente alrededor de 28-42 horas después de la aspiración.

Por ejemplo, los oocitos inmaduros puede lavarse en medio de cultivo de embriones de hámster (HECM) tamponado con HEPES como ha sido descrito por Seshagine et al., Biol. Reprod., 40, 544-606, 1989, y a continuación ponerse en forma de gotas en un medio de maduración que consiste en 50 microlitros de medio de cultivo tisular (en lo sucesivo abreviadamente TCM, de la expresión inglesa Tissue Culture Medium) 199 que contiene 10% de suero de ternero fetal que contiene gonadotropinas apropiadas, tales como hormona luteinizante (LH) y hormona estimulante del folículo (FSH), y estradiol bajo una capa de parafina ligera o silicona a 39ºC.

Después de un periodo de maduración fijado, que varía de aproximadamente 10 a 40 horas, y preferiblemente alrededor de 16-18 horas, se enuclearán los oocitos. Antes de la enucleación preferiblemente se separarán los oocitos y se colocaran en HECM que contenga 1 miligramo por mililitro de hialuronidasa antes de la retirada de las células cúmulo. Esto puede efectuarse pipeteando repetidamente con pipetas de orificio muy fino o mezclando brevemente con vórtice. A continuación se seleccionan los oocitos separados con relación a los cuerpos polares, y los oocitos que están en la metafase II seleccionados, determinados por la presencia de cuerpos polares, se usan a continuación para la transferencia nuclear. Sigue después la enucleación.

La enucleación puede realizarse por métodos conocidos, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.994.384, que se incorpora en la presente memoria como referencia. Por ejemplo, se colocan oocitos en la metafase II en HECM, que contiene opcionalmente 7,5 microgramos por mililitro de citocalasina B, para enucleación inmediata, o puede colocarse en un medio adecuado, por ejemplo un medio de cultivo de embriones, tal como CR1aa, más 10% de suero de vaca en estro, y a continuación enuclearse más tarde, preferiblemente no más de 24 horas más tarde, y más preferiblemente 16-18 horas más tarde.

La enucleación puede realizarse microquirúrgicamente usando una micropipeta para extraer el cuerpo polar y el citoplasma adyacente. A continuación pueden seleccionarse los oocitos para identificar los que se han enucleado satisfactoriamente. Esta selección puede efectuarse tiñendo los oocitos con 1 microgramo por mililitro de colorante 33342 de Hoechst en HECM, y a continuación examinando los oocitos con irradiación ultravioleta durante menos de 10 segundos. Los oocitos que han sido enucleados satisfactoriamente pueden colocarse a continuación en un medio de cultivo adecuado, por ejemplo, CR1aa más 10% de suero.

En la presente invención, los oocitos receptores serán enucleados preferiblemente en un momento que varía desde aproximadamente 10 horas hasta aproximadamente 40 horas después de la iniciación de la maduración in vitro, más preferiblemente desde aproximadamente 16 horas hasta aproximadamente 24 horas después de la iniciación de la maduración in vitro, y más preferiblemente alrededor de 16-18 horas después de la iniciación de la maduración in vitro.

A continuación se transferirá un único fibroblasto bovino al espacio perivitelino del oocito bovino enucleado usado para producir la unidad de NT. El fibroblasto bovino y el oocito enucleado se usarán para producir las unidades de NT de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden fusionarse por electrofusión. La electrofusión se realiza proporcionando un impulso de electricidad que sea suficiente para provocar una rotura transitoria de la membrana plasmática. Esta rotura de la membrana plasmática es muy pequeña debido a que la membrana se reconstituye rápidamente. Por tanto, si se induce la rotura de dos membranas adyacentes y por reconstitución se entremezclan las bicapas lipídicas, se abrirán pequeños canales entre las dos células. Debido a la inestabilidad termodinámica de dicha abertura pequeña, se ampliará hasta que las dos células sean una. Véase como referencia la Patente de EE.UU. 4.997.384 de Prather et al., (incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia) para un estudio adicional de este proceso. Puede usarse una variedad de medios de electrofusión incluyendo, por ejemplo, sacarosa, manitol, sorbitol y solución tampón de fosfato. La fusión también puede efectuarse con el virus Sendai como agente fusógeno (Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969).

Además, en algunos casos (por ejemplo, con núcleos donantes pequeños) puede ser preferible inyectar el núcleo directamente en el oocito en lugar de usar la fusión por electroporación. Dichas técnicas están descritas por Collas y Barnes, Mol. Reprod. Dev., 38:264-267(1994), e incorporadas en su totalidad en la presente memoria como referencia.

Preferiblemente, el fibroblasto bovino y el oocito se electrofusionan en una cámara de 500 \mum por aplicación de un impulso eléctrico de 90-120 V durante aproximadamente 15 \mus, aproximadamente 24 horas después de la iniciación de la maduración del oocito. Después de la fusión, las unidades de NT fusionadas resultantes se colocan a continuación en un medio adecuado hasta activación, por ejemplo, el medio CR1aa. Típicamente la activación se efectuará lo más pronto posible, típicamente antes de 24 horas, y preferiblemente antes de alrededor de 4-9 horas.

La unidad de NT puede activarse por métodos conocidos. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, cultivar la unidad de NT a temperatura sub-fisiológica, esencialmente aplicando a la unidad de NT un choque de temperatura fría o realmente fresca. Esto puede realizarse convenientemente cultivando la unidad de NT a la temperatura ambiente, que es fría con relación a las condiciones fisiológicas de temperatura a la que están expuestos normalmente los embriones.

Alternativamente, la activación puede conseguirse por aplicación de agentes de activación conocidos. Por ejemplo, se ha demostrado que la penetración de oocitos por el esperma durante la fertilización activa la perfusión de los oocitos proporcionando mayores números de embarazos viables y multiplicando genéticamente vacas idénticas después de la transferencia nuclear. También pueden usarse tratamientos tales como choque eléctrico y químico para activar los embriones de NT después de la fusión. Los métodos adecuados de activación de oocitos son el objeto de la Patente de EE.UU. Nº 5.496.720, de Susko-Parrish et al., incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia.

Además, la activación puede efectuarse simultánea o secuencialmente:

(i)

aumentando los niveles de cationes divalentes en el oocito, y

(ii)

reduciendo la fosforilación de las proteínas celulares en el oocito.

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Esto se efectuará generalmente introduciendo cationes divalentes en el citoplasma del oocito, por ejemplo, magnesio, estroncio, bario o calcio, por ejemplo en forma de un ionóforo. Otros métodos para aumentar los niveles de cationes divalentes incluyen el uso de choque eléctrico, tratamiento con etanol y tratamiento con agentes quelantes enjaulados.

La fosforilación puede producirse por métodos conocidos, por ejemplo por adición de inhibidores de quinasas, por ejemplo inhibidores de serina-treonina-quinasa, tales como 6-dimetil-aminopurina, estaurosporina, 2-aminopurina y esfingosina.

Alternativamente, la fosforilación de las proteínas celulares puede ser inhibida por introducción de una fosfatasa en el oocito, por ejemplo, fosfatasa 2A y fosfatasa 2B.

En una realización, la activación por NT se efectúa exponiendo brevemente la unidad de NT fusionada a un medio TL-HEPES que contiene ionomicina 5 \muM y 1 mg/ml de BSA, seguido por lavado en TL-HEPES que contiene 30 mg/ml de BSA aproximadamente 24 horas después de la fusión y preferiblemente alrededor de 4 a 9 horas después de la fusión.

Las unidades de NT activadas pueden cultivarse a continuación en un medio de cultivo in vitro adecuado hasta la generación de células y colonias de células de la CICM. Los medios de cultivo adecuados para cultivar y madurar los embriones son muy conocidos en la técnica. Ejemplos de medio conocidos, que pueden usarse para el cultivo y mantenimiento de embriones bovinos, incluyen Ham's F-10 + 10% de suero de ternero fetal (FCS), Medio de Cultivo Tisular -199 (TCM-199) + 10% de suero de ternero fetal, Tirodes-Albúmina-Lactato-Piruvato (TALP), solución salina tamponada de fosfato (PBS) de Dulbecco, medios de Eagle y Whitten. Uno de los medios más comunes usados para la recogida y maduración de oocitos es TCM-199 y 1 a 20% de suplemento de suero que incluye suero de ternero fetal, suero de neonato, suero de vaca estrual, suero de cordero o suero de novillo. Un medio de mantenimiento preferido incluye TCM-199 con sales de Earl, 10% de suero de ternero fetal, piruvato de Na 0,2 mM y 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina. Cualquiera de lo anterior puede también implicar el cultivo conjunto con una variedad de tipos de células, tales como células de la granulosa, células del oviducto, células BRL y células uterinas y células STO.

Otro medio de mantenimiento está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.096.822 de Rosenkrans, Jr. et al., que se incorpora en la presente memoria como referencia. Este medio de embriones, denominado CR1, contiene las sustancias nutritivas necesarias para mantener un embrión.

El medio CR1 contiene L-lactato de hemicalcio en cantidades que varían de 1,0 mM a 10 mM, preferiblemente de 1,0 mM a 5,0 mM. El L-lactato de hemicalcio es L-lactato al que se ha incorporado una sal de hemicalcio. El uso de L-lactato de hemicalcio es significativo porque un único componente satisface dos requisitos importantes en el medio de cultivo: (i) el requisito del calcio necesario para la compactación y disposición del citoesqueleto; y (ii) el requisito del lactato para el metabolismo y transporte de electrones. El L-lactato de hemicalcio sirve también como mineral valioso y fuente de energía para el medio necesario para la viabilidad de los embriones.

Ventajosamente, el medio CR1 no contiene suero, tal como suero de ternero fetal, ni requiere el uso de un cultivo conjunto de células animales u otros medios biológicos, es decir medios que comprenden células animales, tales como células oviductales. Los medios biológicos pueden ser algunas veces desventajosos porque pueden contener microorganismos o factores traza que pueden ser perjudiciales para los embriones y que son difíciles de detectar, caracterizar y eliminar.

Ejemplos de los componentes principales en el medio CR1 incluyen L-lactato de hemicalcio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, bicarbonato de sodio y una cantidad menor de seroalbúmina bovina exenta de ácidos grasos (Sigma A-6003).

Adicionalmente, puede añadirse al medio una cantidad definida de aminoácidos esenciales y no esenciales. El CR1 con aminoácidos es conocido por la abreviatura "CR1aa."

El medio CR1 contiene preferiblemente los siguientes componentes en las siguientes cantidades:

cloruro de sodio

114,7 mM

cloruro de potasio

3,1 mM

bicarbonato sódico

26,2 mM

L-lactato de hemicalcio

5 mM

BSA exenta de ácidos grasos

3 mg/ml.

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En una realización, la unidad de embriones de NT activados se colocan en un medio CR1aa que contiene DMAP 1,9 mM durante aproximadamente 4 horas seguido por lavado en HECM y a continuación se cultivan en CR1aa que contiene BSA.

Por ejemplo, las unidades de NT activadas pueden ser transferidas al medio de cultivo CR1aa que contiene DMAP (Sigma) 2,0 mM y cultivadas en condiciones ambientales, por ejemplo, a aproximadamente 38,5ºC, 5% de CO_{2} durante un tiempo adecuado, por ejemplo, aproximadamente de 4 a 5 horas.

A continuación, se lavan preferiblemente la unidad o unidades de NT cultivadas y se colocan a continuación en un medio adecuado, por ejemplo medio CR1aa que contiene 10% de FCS y 6 mg/ml contenidos en placas de pocillos que contienen preferiblemente una capa alimentadora confluente adecuada. Las capas alimentadoras adecuadas incluyen, como ejemplo, fibroblastos y células epiteliales, por ejemplo fibroblastos y células epiteliales uterinas de ungulados, fibroblastos de pollo, fibroblastos de múridos (por ejemplo, ratón o rata), líneas celulares alimentadoras STO y SI-m220 y células BRL.

En una realización, las células alimentadoras comprenden fibroblastos embrionarios de ratón. La preparación de una capa alimentadora de fibroblastos adecuada se describe en el ejemplo siguiente y es conocida por los expertos en la técnica.

Las unidades de NT se cultivan sobre la capa alimentadora hasta que las unidades de NT alcanzan un tamaño adecuado para ser transferidas a una hembra receptora o para obtener células que pueden usarse para producir células o colonias de células de la CICM. Preferiblemente, estas unidades de NT se cultivarán hasta al menos aproximadamente 2 a 400 células, más preferiblemente alrededor de 4 a 128 células y más preferiblemente al menos alrededor de 50 células. El cultivo se efectuará en condiciones adecuadas, es decir, aproximadamente a 38,5ºC y 5% de CO_{2}, cambiando el medio de cultivo para optimizar el crecimiento aproximadamente cada 2-5 días, preferiblemente cada 3 días.

Los métodos para la transferencia de embriones y el tratamiento del animal receptor en la presente invención son los procedimientos estándares usados en la industria de la transferencia de embriones. Para el éxito de la presente invención son importantes transferencias sincrónicas, es decir, la etapa del embrión de NT está en sincronía con el ciclo estral de la hembra receptora. Esta ventaja y cómo mantener los receptores están revisados por Siedel, G.E., Jr. ("Critical review of embryo transfer procedures with cattle" en Fertilization and Embryonic Development in Vitro (1981) L. Mastroianni, Jr. y J.D. Biggers, ed., Plenum Press, New York, NY, página 323), cuyo contenido se incorpora en la presente memoria como referencia.

La presente invención también puede usarse para clonar mamíferos bovinos transformados por ingeniería genética o transgénicos. Como se ha explicado anteriormente, la presente invención es ventajosa porque los procesos transgénicos pueden simplificarse trabajando con una fuente celular diferenciada que puede propagarse por clonación. En particular, las células diferenciadas usadas para núcleos donantes tienen un gen insertado, eliminado o modificado deseado. Las células diferenciadas genéticamente alteradas se usan a continuación para el transplante nuclear con oocitos enucleados.

Cualquier método conocidos para insertar, suprimir o modificar un gen deseado a partir de una célula de mamífero puede usarse para alterar el fibroblasto bovino diferenciado que se usa como donante nuclear. Estos procedimientos pueden eliminar todo el gen o parte de él, y el gen puede ser heterólogo. Está incluida la técnica de recombinación homóloga, que permite la inserción, supresión o modificación de un gen o genes en un sitio o sitios específicos en el genoma celular.

La presente invención puede usarse por consiguiente para proporcionar mamíferos adultos con genotipos deseados. La multiplicación de bovinos adultos con superioridad genética comprobada u otros rasgos deseables es particularmente útil, incluyendo animales transgénicos o transformados por ingeniería genética, y animales quiméricos. Además, las células y los tejidos procedentes del feto de NT, incluyendo fetos transgénicos y/o quiméricos, pueden usarse en transplante de células, tejidos y órganos para el tratamiento de numerosas enfermedades como las descritas a continuación con relación al uso de células de la CICM.

Para la producción de células y líneas celulares de la CICM, después que se obtienen las unidades de NT del tamaño deseado, las células se retiran mecánicamente de la zona y a continuación se usan. Esto se efectúa preferiblemente recogiendo el grupo de células que comprende la unidad de NT, que contendrá típicamente al menos alrededor de 50 células, lavando dichas células y extendiendo dichas células sobre una capa alimentadora, por ejemplo fibroblastos irradiados. Típicamente, las células usadas para obtener las células madre o colonias de células se obtendrán de la porción interna de la unidad de NT cultivada que tienen un tamaño de al menos preferiblemente 50 células. Sin embargo, también pueden usarse unidades de NT de menores o mayores números de células así como células de otras porciones de la unidad de NT para obtener células ES y colonias de células. Las células se mantienen en la capa alimentadora en un medio de crecimiento adecuado, por ejemplo, alfa-MEM complementado con 10% de FCS y \beta-mercaptoetanol (Sigma) 0,1 mM y L-glutamina. El medio de crecimiento se cambia tan frecuentemente como sea necesario para optimizar el crecimiento, por ejemplo, aproximadamente cada 2-3 días.

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Este proceso de cultivo da como resultado la formación de células o líneas de células de la CICM. El experto en la técnica puede variar como desee las condiciones de cultivo para optimizar el crecimiento de las células de la CICM particular. También, las células de la CICM bovinas transformadas por ingeniería genética o transgénicas pueden producirse de acuerdo con la presente invención. Es decir, los métodos antes descritos pueden usarse para producir unidades de NT en los que se ha introducido un gen o genes deseados o a partir de los cuales todo o parte de un gen o genes endógenos han sido eliminados o modificados. Las unidades de NT transformadas por ingeniería genética o transgénicas pueden usarse a continuación para producir células de la CICM transformadas por ingeniería genética o transgénicas.

Las células y líneas de células de la CICM resultantes tienen numerosas aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Más especialmente, dichas células de la CICM pueden usarse para terapias de transplantes de células. Las células de la CICM tienen aplicación en el tratamiento de numerosos estados morbosos. Las unidades de NT pueden también usarse tal cual en el tratamiento de estados morbosos.

A este respecto, se sabe que las células madre embrionarias (ES) son capaces de diferenciarse en casi cualquier tipo de células, por ejemplo, células madre hematopoyéticas. Por consiguiente, las células de la CICMproducidas de acuerdo con la invención deben poseer similar capacidad de diferenciación. Las células de la CICM de acuerdo con la invención serán inducidas a diferenciarse para obtener los tipos de células deseados de acuerdo con los métodos conocidos. Por ejemplo, las células de la CICM objeto pueden ser inducidas a diferenciarse en células madre hematopoyéticas, células de músculos, células del músculo cardíaco, células hepáticas, células de cartílagos, células epiteliales, células del tacto urinario, etc., cultivando dichas células en un medio de diferenciación y en condiciones que proporcionen la diferenciación celular. El medio y los métodos que dan como resultado la diferenciación de las células de la CICM son conocidas en la técnica así como las condiciones de cultivo adecuadas.

Por ejemplo, Palacios et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92:7530-7537 (1995) describen la producción de células madre hematopoyéticas a partir de una línea de células embrionarias sometiendo las células madre a un procedimiento de inducción que comprende cultivar inicialmente agregados de dichas células en un medio de cultivo en suspensión que carece de ácido retinoico seguido por el cultivo en el mismo medio que contiene ácido retinoico, seguido por transferencia de agregados celulares a un sustrato que proporciona la unión celular.

Por otra parte, Pedersen, J. Reprod. Fertil. Dev., 6:543-552 (1994) en un artículo de recapitulación hace referencia a numerosos artículos que describen métodos para la diferenciación in vitro de células madre embrionarias que producen diversos tipos de células diferenciadas que incluyen células hematopoyética, células de los músculos, células del músculo cardiaco, células nerviosas entre otras.

Además, Bain et al., Dev. Biol., 168:342-357 (1995) describen la diferenciación in vitro de células madre embrionarias produciendo células neurales que poseen propiedades neuronales. Estas referencias son ilustrativas de los métodos estudiados para obtener células diferenciadas de las células madre embrionarias. Estas referencias y en particular las descripciones que se refieren a métodos para diferenciar las células madre embrionarias se incorporan en la presente memoria en su totalidad como referencia.

De este modo, usando métodos y medios de cultivos conocidos, un experto en la técnica puede cultivar las células de la CICM objeto de la invención, incluyendo células de la CICM transformadas por ingeniería genética o transgénicas, para obtener tipos de células diferenciadas deseadas, por ejemplo, células neurales, células de los músculos, células hematopoyéticas, etc.

Las células de la CICM objeto de la invención pueden usarse para obtener cualquier tipo de células diferenciadas deseadas. Los usos terapéuticos de dichas células diferenciadas no son paralelos. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas pueden usarse en tratamientos médicos que requieran transplante de médula ósea. Dichos procedimientos se usan para tratar muchas enfermedades, por ejemplo, cánceres en estado tardío, tales como cáncer de ovario y leucemia, así como enfermedades que comprometen el sistema inmune, tal como el SIDA. Las células madre hematopoyéticas pueden obtenerse, por ejemplo, fusionando células somáticas adultas de un paciente con cáncer o SIDA, por ejemplo células epiteliales o linfocitos con un oocito enucleado, obteniendo células de la CICM como se ha descrito antes, y cultivando dichas células en condiciones que favorezcan la diferenciación, hasta que se obtienen células madre hematopoyéticas. Dichas células hematopoyéticas pueden usarse en el tratamiento de enfermedades como el cáncer y el SIDA.

Alternativamente, las células somáticas adultas de un paciente con un trastorno neurológico pueden fusionarse con un oocito enucleado, obteniendo células de la CICM, y dichas células pueden cultivarse en condiciones de diferenciación para producir líneas celulares neurales. Las enfermedades específicas tratables por transplante de dichas células neurales humanas incluyen, como ejemplo, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, ALS y parálisis cerebral infantil, entre otras. En el caso específico de la enfermedad de Parkinson, se ha demostrado que las células neurales de cerebro fetal transplantadas realizan las conexiones apropiadas con las células circundantes y producen domapina. Esto puede dar como resultado la reversión a largo plazo de los síntomas de la enfermedad de Parkinson.

La mayor ventaja de la presente invención es que proporciona un suministro esencialmente ilimitado de células isógenas o singénicas humanas adecuadas para transplante. Por consiguiente, se evitará el importante problema asociado con los métodos de transplante actuales, es decir el rechazo del tejido transplantado que puede plantearse debido al rechazo del hospedante frente al injerto o del injerto frente al hospedante. Tradicionalmente, el rechazo se evita o reduce por la administración de fármacos anti-rechazo, tal como ciclosporina. Sin embargo, dichos fármacos presentan efectos secundarios adversos importantes, por ejemplo inmunodepresión, propiedades carcinógenas, así como el hecho de ser muy caros. La presente invención debe eliminar, o al menos reducir en gran parte, la necesidad de fármacos anti-rechazo.

Otras enfermedades y estados tratables por terapia con células isógenas incluye, como ejemplo, lesiones de la médula espinal, esclerosis múltiple, distrofia muscular, diabetes, enfermedades hepáticas, es decir, hipercolesterolemia, enfermedades cardiacas, sustitución de cartílagos, quemaduras, úlceras de pie, enfermedades gastrointestinales, enfermedades vasculares, enfermedades nefríticas, enfermedades del tracto urinario y enfermedades y estados relacionados con el envejecimiento.

Esta metodología puede usarse para sustituir genes defectuosos, por ejemplo, genes defectuosos del sistema inmune, genes de fibrosis quística, o para introducir genes que den como resultado la expresión de proteínas terapéuticamente beneficiosas, tales como factores del crecimiento, linfoquinas, citoquinas, enzimas, etc. Por ejemplo, el gen que codifica el factor del crecimiento derivado del cerebro puede introducirse en células humanas de la CICM, diferenciarse las células en células neurales y transplantarse estas células a un paciente con enfermedad de Parkinson para retardar la perdida de células neurales durante dicha enfermedad.

Anteriormente, los tipos de células transfectadas con BDNF variaban desde las células primarias hasta las líneas de células inmortalizadas, células derivadas neurales o no neurales (mioblasto y fibroblasto). Por ejemplo, ya se habían transfectado astrocitos con el gen del BDNF usando vectores retrovirales, y las células se habían injertado en un modelo de rata con la enfermedad de Parkinson (Yoshimoto et al., Brain Research, 691:25-36, (1995)).

Esta terapia ex vivo redujo hasta un 45% los síntomas similares a la enfermedad de Parkinson en las ratas 32 días después de la transferencia. También, el gen de la tirosina-hidroxilasa ha sido colocado en astrocitos con resultados similares (Lundberg et al., Develop. Neurol., 139:39-53 (1996) y citados en la presente memoria como referencia).

Sin embargo, dichos sistemas ex vivo plantean algunos problemas. En particular, los vectores retrovirales usados actualmente son regulados por disminución in vivo y el transgen es sólo expresado transitoriamente (revisado por Mulligan, Science, 260:926-932(1993)). También, dichos estudios usaron células primarias, astrocitos, que tienen una vida útil finita y se replican lentamente. Dichas propiedades afectan adversamente a la velocidad de transfección e impiden la selección de células transfectadas establemente. Por otra parte, es casi imposible propagar una gran población de células primarias con un gen diana para utilizar en técnicas de recombinación homólogas. En contraste, las dificultades asociadas a sistemas retrovirales deben eliminarse por el uso de células de la CICM de mamífero.

Los genes que pueden introducirse en las células de la CICM objeto del invento incluyen, como ejemplo, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento neutrófico derivado de células gliales, factor de crecimiento similar a la insulina (I y II), neurotrofina-3, neurotrofina-4/5, factor neutrófico ciliar, AFT-1, genes de las citoquinas (interleuquinas, interferones, factores estimuladores de colonias, factores de necrosis tumoral (alfa y beta), etc.), genes que codifican enzimas terapéuticas, etc.

Además del uso de las células de la CICM en el transplante de células, tejidos y órganos, la presente invención incluye también el uso de células bovinas en el tratamiento de enfermedades humanas. De este modo, las células de la CICM, los fetos de NT y la descendencia de NT y quimérica (transgénica o no transgénica) de especies bovinas puede usarse en el tratamiento de estados morbosos humanos en los que está justificado el transplante de células, tejidos u órganos. En general, las células de la CICM, los fetos y la descendencia de acuerdo con la presente invención pueden usarse en la misma especie (autóloga, sinérgica o aloinjertos) o en otras especies distintas (xenoinjertos). Por ejemplo, las células del cerebro de fetos de NT bovinos puede usarse para tratar la enfermedad de Parkinson.

Además, las células de la CICM objeto de la invención pueden usarse como modelo in vitro de diferenciación, en particular para el estudio de genes que están implicados en la regulación de un desarrollo temprano. También, los tejidos y órganos con células diferenciadas que utilizan las células de la CICM objeto de la invención pueden usarse en estudios de fármacos.

Además, las células de la CICM pueden usarse como donantes nucleares para la producción de otras células y colonias de células de la CICM.

Con el fin de describir más claramente la presente invención, se proporcionan los siguientes Ejemplos.

Ejemplo 1 Aislamiento de cultivos primarios de fibroblastos embrionarios y adultos bovinos y porcinos

Se obtuvieron cultivos primarios de fibroblastos bovinos y porcinos de fetos (45 días de embarazo para los fetos de ganado y 35 días para los fetos de cerdo). Se extrajeron asépticamente la cabeza, el hígado, el corazón y el tracto alimentario, los fetos se desmenuzaron e incubaron durante 30 minutos a 37ºC en solución de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY). Los fibroblastos se extendieron sobre cápsulas de cultivos tisulares y se cultivaron en el medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y estreptomicina (50 \mul/ml). Los fibroblastos se dejaron crecer y se mantuvieron en una atmósfera humidificada de aire con 5% de CO_{2} a 37ºC.

Se aislaron fibroblastos adultos del pulmón de una vaca (de aproximadamente cinco años). El tejido de pulmón desmenuzado se incubó durante la noche a 10ºC en solución de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY). El tejido recogido al día siguiente y las células separadas se incubaron durante una hora a 37ºC en solución de tripsina-EDTA precalentada (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY) y se trataron con tres lavados e incubaciones en tripsina consecutivos (una hora). Los fibroblastos se extendieron sobre cápsulas de cultivo tisular y se cultivaron en un medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y estreptomicina (50 \mul/ml). Los fibroblastos pueden aislarse prácticamente en cualquier momento del desarrollo, variando desde aproximadamente después de la etapa del disco embrionario hasta la vida adulta del animal (bovinos, desde el día 12 a 15 después de la fertilización hasta una edad de 10 a 15 años). Este procedimiento puede usarse también para aislar fibroblastos de otros mamíferos, incluyendo ratones.

Introducción de un gen marcador (DNA heterólogo extraño) en fibroblastos embrionarios y adultos

El siguiente procedimiento de electroporación se realizó tanto para fibroblastos embrionarios (ganado y cerdos) como adultos (ganado). También pueden usarse procedimientos estándares de microinyección para introducir el DNA heterólogo en los fibroblastos, sin embargo, en este ejemplo se usó la electroporación debido a que es un procedimiento más fácil.

Las placas de cultivo que contenían fibroblastos propagadores se incubaron en solución de tripsina-EDTA (0,05% de tripsina/0,02% de EDTA; GIBCO, Grand Island, NY) hasta que las células formaron una suspensión de una única célula. Las células se centrifugaron a 500 g y se volvieron a poner en suspensión a 5 millones de células por ml con solución salina tamponada de fosfato (PES).

La construcción del gen informador contenía el promotor de citomegalovirus y el gen de fusión de beta-galactosidasa y neomicina-fosfotransferasa (beta-GEO). A la cámara de electroporación se añadieron el gen informador y las células a una concentración final de 50 \mug/ml. Después del impulso de electroporación, los fibroblastos se volvieron a transferir al medio de crecimiento (medio alfa-MEM (BioWhittaker, Walkersville, MD) complementado con 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone, Logen, UT), penicilina (100 U.I./ml) y estreptomicina (50 \mul/mi)).

El día después de la electroporación, se seleccionaron los fibroblastos unidos para la integración estable del gen informador. Se añadió G418 (400 \mug/ml) al medio de crecimiento durante 15 días (intervalo: 3 días hasta el final de la vida útil de las células cultivadas). Este fármaco mata las células que carecen del gen de beta-GEO, puesto que no expresan el gen de resistencia a la neomicina. Al final de este tiempo, estaban presentes colonias de células transgénicas estables. Cada colonia se propagó independientemente de las otras. Se tiñeron los fibroblastos transgénicos con X-gal para observar la expresión de beta-galactosidasa, y se confirmó que daba una integración positiva usando la amplificación por PCR del gen de beta-GEO y se sometió a desplazamiento sobre gel de agarosa.

Uso de fibroblastos transgénicos en procedimientos de transferencia nuclear para crear líneas de células de la CICM y fetos transgénicos

En el procedimiento de transferencia nuclear (NT) se usó una línea de células (CL-1) procedentes de una colonia de fibroblastos embrionarios bovinos como núcleos donantes. Los procedimientos de NT generales son los descritos anteriormente.

Oocitos de matadero se maduraron in vitro. Se separaron los oocitos de las células cúmulo y se enuclearon con una micropipeta biselada aproximadamente 18 a 20 horas post maduración (hpm). La enucleación se confirmó en un medio TL-HEPES más Hoechst 33342 (3 \mug/ml; Sigma). A continuación las células donantes individuales (fibroblastos) se colocaron en el espacio perivitelino del oocito receptor. Se fusionaron el citoplasma del oocito bovino y el núcleo donante (unidad de NT) usando técnicas de electrofusión. A la unidad de NT se aplicó un impulso de fusión que consistía en 120 V durante 15 \mus en una cámara de 500 \mum. Esto ocurrió a las 24 hpm. Las unidades de NT se colocaron en el medio CR1aa hasta 26 a 27 hpm.

El procedimiento general usado para activar artificialmente los oocitos ha sido descrito anteriormente. La activación de la unidad de NT se inició entre 26 y 27 hpm. En resumen, las unidades de NT se expusieron durante cuatro minutos a ionomicina (5 gM; CalBiochem, La Jolla, CA) en TL-HBPES complementado con 1 mg/ml de BSA y se lavaron a continuación durante cinco minutos en TL-HEPBS complementado con 30 mg/ml de BSA. Durante todo el tratamiento con ionomicina, las unidades de NT también se expusieron a DMAP 2 mM (Sigma). Después del lavado, las unidades de NT se transfirieron a una microgota del medio de cultivo CR1aa que contenía DMAP 2 mM (Sigma) y se cultivaron a 38,5ºC en 5% de CO_{2} durante cuatro a cinco horas. Los embriones se lavaron y colocaron a continuación en un medio CR1aa más 10% de FCS y 6 mg/ml de BSA en cuatro placas de pocillos que contenían una capa alimentadora confluente de fibroblasto embrionario de ratón. Las unidades de NT se cultivaron tres días más a 38,5ºC y 5% de CO_{2}. El medio de cultivo se cambió cada tres días hasta 5 a 8 días después de la activación. En este momento pueden usarse embriones de NT en la etapa de blastocistos para producir las líneas de células de la CICM (masa celular interna cultivada) o los fetos transgénicos. La masa celular interna de estas unidades de NT puede aislarse y colocarse sobre una capa alimentadora. Además, las unidades de NT se transfirieron a hembras receptoras. Los embarazos fueron abortados a los 35 días de gestación. Esto dió como resultado dos fetos transgénicos clonados que tenían el gen de beta-GEO en todos los tejidos comprobados. De esta manera, este es un método rápido y fácil de preparar líneas de células de la CICM y fetos transgénicos. Este procedimiento conduce en general a líneas de células de la CICM y fetos con el gen diana.

La Tabla siguiente resume los resultados de estos experimentos.

1

Ejemplo 2 Fetos quiméricos procedentes de células de la CICM transgénicas. La línea de células de la CICM transgénica procedía originalmente de una unidad de NT transgénica (célula diferenciada)

Se usó una línea de la CICM procedente de embriones de NT transgénicos (una célula CL-1 transferida a un oocito enucleado) para producir embriones y fetos quiméricos. Se desagregaron colonias de células de la CICM transgénicas usando 1-5 mg/ml de pronasa o 0,05% de tripsina/EDTA combinado con métodos de desagregación mecánica de modo que se produjeran grupos de cinco o menos células. Se inactivó la actividad de tripsina o pronasa haciendo pasar la células por múltiples lavados de 30 a 100% de suero de ternero fetal. Las células desagregadas se colocaron en placas de micromanipulación que contenían un medio TL-HEPES. También se colocaron embriones fertilizados en estas placas y se usaron herramientas de micromanipulación para producir los embriones quiméricos. Se inyectaron ocho a diez células de la CICM transgénicas en embriones fertilizados en la etapa de 8-16 células. Estos embriones se cultivaron in vitro hasta la etapa de blastocistos y a continuación se transfirieron a animales receptores.

Un total de 6 embriones quiméricos en la etapa de blastocistos fueron transferidos no quirúrgicamente a dos hembras receptoras. Después de cinco semanas de gestación se recuperaron 3 fetos. Diversos tejidos de los tres fetos, incluyendo las células reproductoras de la gónada (que sugiere quimeras de la línea reproductora), se seleccionaron por amplificación por PCR e hibridación por transferencia Southern del producto amplificado a un fragmento de beta-galactosidasa. De los tres fetos, dos fueron positivos a la contribución debido a las células de la CICM transgénicas. Ambos fetos tuvieron una contribución de la CICM transgénica a la gónada.

Embriones de NT transgénicos procedentes de líneas de células de la CICM transgénicas. Las células de la CICM transgénicas procedían originalmente de una unidad de NT transgénica (célula diferenciada)

Se usaron las mismas líneas de células de la CICM transgénicas para producir embriones de NT. Se usaron procedimiento de NT descritos en el Ejemplo 1 excepto que se usaron células de la CICM en lugar de fibroblastos como la célula donante fusionadas con el oocito enucleado. Se desagregaron las colonias de células de la CICM transgénicas usando 1-5 mg/ml de pronasa o 0,05% de tripsina-EDTA combinada con métodos de desagregación mecánica de modo que se produjeran grupos de cinco o menos células. La actividad de tripsina o pronasa se inactivó haciendo pasar las células a través de múltiples lavados de 30 a 100% de suero de ternero fetal antes de transferir las células a oocitos enucleados. Los resultados se recogen en la Tabla 1 (grupo tercero). Se produjeron cinco embriones en la etapa de blastocistos.

Claims (19)

1. Un método para clonar un mamífero bovino, que comprende:

(i)

insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y

(iv)

transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero hospedante bovino, de tal manera que la unidad de NT desarrolle un feto.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se inserta, elimina o modifica un DNA deseado en dicho fibroblasto o núcleo celular diferenciado, dando como resultado la producción de una unidad de NT genéticamente alterada.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se usa microinyección o electroporación para insertar un DNA heterólogo.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado procede del mesodermo, ectodermo o endodermo.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fibroblasto o núcleo células bovino diferenciado es una célula adulta o núcleo celular.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado es una célula o núcleo celular fetal o embrionario.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el oocito enucleado es madurado antes de la enucleación.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad de transferencia nuclear fusionada se activa por exposición a ionomicina y 6-dimetilaminopurina.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además combinar la unidad de NT clonada con un embrión no humano fertilizado para producir un embrión quimérico.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además desarrollar los fetos hasta obtener la descendencia.

11. Un método para producir una línea de células de la CICM [masa celular interna cultivada] bovina, que comprende:

(i)

insertar un fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuada para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y

(iv)

cultivar las células procedentes de dicha unidad de NT para obtener una línea de células de la CICM bovina.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que se inserta, elimina o modifica un DNA deseado en dicho fibroblasto o núcleo celular bovino diferenciado, dando como resultado la producción de una unidad de NT genéticamente modificada.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el que la línea de células de la CICM bovina resultante es inducida a diferenciarse.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, que comprende además combinar la unidad de NT clonada con un embrión no humano fertilizado para producir una quimera.

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15. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además desarrollar la línea de células de la CICM bovina quimérica hasta un embrión bovino quimérico.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende además desarrollar el embrión quimérico hasta un feto quimérico.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, que comprende además desarrollar el feto quimérico hasta una descendencia bovina quimérica.

18. Un método para clonar un mamífero bovino, que comprende:

(i)

insertar una célula o núcleo celular de la CICM bovino diferenciado propagador deseado en un oocito bovino enucleado, en condiciones adecuadas para la formación de una unidad de transferencia nuclear (NT);

(ii)

activar la unidad de transferencia nuclear resultante;

(iii)

cultivar dicha unidad de transferencia nuclear activada hasta una etapa de desarrollo superior a la etapa de 2 células; y

(iv)

transferir dicha unidad de NT cultivada a un mamífero bovino hospedante, de tal manera que la unidad de NT se desarrolle hasta obtener un feto.

19. Un método de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además desarrollar el feto hasta obtener una descendencia.