ES2284514T3 - Gen erg8 de fosfomevalonato-quinasa (pmk) de candida albicans. - Google Patents
Gen erg8 de fosfomevalonato-quinasa (pmk) de candida albicans. Download PDFInfo
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Abstract
Un polipéptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO. 7, o una secuencia que posee al menos 80% de identidad total de secuencia con ella, polipéptido que posee actividad de fosfomevalonato-quinasa (PMK).
Description
Gen ERG8 de
fosfomevalonato-quinasa (PMK) de Candida
albicans.
Esta invención se refiere a polinucleótidos
identificados recientemente, polipéptidos codificados por estos
polinucleótidos, a la producción de tales polinucleótidos y
polipéptidos, y a los usos de dichos polinucleótidos y
polipéptidos. Más específicamente, la invención se refiere al gen de
fosfomevalonato-quinasa (PMK) (gen ERG8) de
Candida albicans (C. albicans), a métodos para su
expresión que producen la proteína
fosfomevalonato-quinasa, a nuevos organismos
híbridos para uso en tales métodos de expresión, a métodos para
purificación de la proteína, a métodos y herramientas para
diagnosticar infección por C. albicans y a ensayos para
identificar inhibidores de la enzima, inhibidores que tienen
potencial como agentes anti-fúngicos.
C. albicans es un patógeno fúngico humano
importante y el organismo diana más importante para investigación
antifúngica. PMK es una enzima requerida para la biosíntesis de las
subunidades isopreno que se utilizan como precursores en la
síntesis de esteroles, dolicoles y ubiquinonas. Dado que PMK es una
enzima biosintética esencial, los inhibidores de PMK deberían
encontrar aplicación como agentes antifúngicos. Todas las especies
sintetizan una proteína con actividad PMK; sin embargo, a lo largo
de las especies, las enzimas difieren considerablemente en su
secuencia de aminoácidos. Debido a problemas de selectividad (por
ejemplo fúngica versus humana) es extremadamente importante
optimizar inhibidores potenciales específicamente contra las enzimas
diana fúngicas (es decir C. albicans o Aspergillus
fumigatus) y no contra la enzima humana. Tales inhibidores de
especies fúngicas cruzadas poseen especificidad amplia.
Alternativamente, puede ser deseable utilizar un inhibidor que sea
más selectivo, por ejemplo, uno que inhiba la PMK de C.
albicans, pero no una proteína PMK fúngica homóloga pero no
idéntica, tal como la de Saccharomyces cerevisiae (S.
cerevisiae).
Teniendo en cuenta la incidencia incrementada de
resistencia de los hongos a los agentes
anti-fúngicos existentes y habida cuenta del
estímulo ocasionado por el número creciente de infecciones fúngicas
particularmente en personas con trastornos de inmunodeficiencia,
trasplantes de órganos y cáncer, existe necesidad de medios nuevos
de identificación de agentes anti-fúngicos
potenciales.
Los autores de la presente invención han clonado
ahora con éxito el gen ERG8 de C. albicans (al que se hace
referencia en lo sucesivo como gen ERG8) y determinado su secuencia
de nucleótidos de longitud total y la secuencia del polipéptido
correspondiente (PMK) (al que se hace referencia en lo sucesivo como
proteína ERG8) como se indica en la Figura 1 y en SEQ ID NO. 7 de
esta solicitud, respectivamente. La secuencia de DNA codificante
(SEQ ID NO. 6) del gen ERG8 de C. albicans aislada tiene una
longitud de 1299 nucleótidos y la secuencia de la proteína
correspondiente tiene una longitud de 433 aminoácidos (SEQ ID NO.
7). La proteína exhibe aproximadamente 45% de homología con la
proteína correspondiente de S. cerevisiae y sólo
aproximadamente 10% de homología con la de la proteína humana
equivalente. El término homología, tal como se utiliza en esta
memoria, adquiere la definición conocida y utilizada habitualmente
por los biólogos moleculares. Dicho término se refiere a la
identidad de secuencia entre dos secuencias tal como se evalúa por
análisis de alineación ajustada óptimamente por ordenador
utilizando un soporte lógico adecuado tal como Blast, Blast2, NCBI
Blast2, WashU Blast2, FastA, Fasta3 y PILEUP, utilizando una matriz
de registro tal como Blosum62. Tales paquetes de soporte lógico
procuran aproximarse estrechamente al algoritmo de alineación
"patrón oro" de Smith-Waterman. Así pues, el
programa soporte lógico/motor de investigación preferido para uso en
la evaluación del porcentaje de identidad o semejanza, es decir del
modo en que se alinean dos secuencias de polipéptidos primarias es
Smith-Waterman. La identidad se refiere a
coincidencias directas, y la semejanza permite sustituciones
conservadoras.
De acuerdo con un primer aspecto de la
invención, se proporciona un polipéptido aislado o purificado que es
proteína ERG8, así como variantes de la misma. La secuencia de
polipéptidos preferida es la que se indica en SEQ ID NO. 7. El
polipéptido de la enzima fosfomevalonato-quinasa de
C. albicans completo tiene la secuencia de aminoácidos que
se representa en SEQ ID NO. 7 en esta memoria. Los polipéptidos de
la presente invención incluyen el polipéptido de SEQ ID NO. 7 así
como polipéptidos que tienen, por orden creciente de preferencia,
al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, y 99% de identidad
con el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos se representa en
SEQ ID NO. 7.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"aislada" se refiere a moléculas, sean secuencias de ácido
nucleico o de aminoácidos, que están separadas de su entorno natural
y se purifican o separan de al menos otro componente con el cual
están asociadas naturalmente. Este término abarca también moléculas
que se sintetizan artificialmente y se separan luego por
purificación de sus materiales de síntesis. Así, se dice que un
polinucleótido se aísla cuando el mismo se separa sustancialmente
de otros polinucleótidos o nucleótidos contaminantes.
Aunque el polipéptido natural de SEQ ID NO. 7 y
un polipéptido variante pueden poseer únicamente por ejemplo 80% de
identidad, es probable que los mismos posean realmente un grado
mayor de semejanza, dependiendo del número de codones disimilares
que son cambios conservadores. La semejanza entre dos secuencias
incluye coincidencias directas así como sustitutos de aminoácidos
conservados que poseen propiedades estructurales o químicas
similares, v.g. carga similar. Ejemplos de cambios conservadores
(sustitutos de aminoácidos conservados) son, inter alia:
alanina a glicina, isoleucina, valina o leucina; tirosina a
fenilalanina o triptófano; y lisina a arginina o histidina.
\newpage
Las sustituciones conservadoras de aminoácidos
adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden
producirse sin alterar la actividad biológica del polipéptido
resultante, cualquiera que sea el método de síntesis elegido. La
expresión "sustitución conservadora" incluye el uso de un
residuo derivatizado químicamente en lugar de un residuo no
derivatizado con tal que dicho polipéptido exhiba la actividad de
fijación deseada. Isómeros D así como otros derivados conocidos
pueden emplearse también en sustitución de los aminoácidos
existentes naturalmente. Véase, v.g., la patente U.S. No.
5.652.369, Amino Acid Derivatives, expedido el 29 de Julio
de 1997. Las sustituciones se hacen preferiblemente, aunque no con
carácter exclusivo, de acuerdo con las expuestas en la Tabla 1 como
sigue:
Las secuencias de nucleótidos de la presente
invención pueden modificarse también por ingeniería genética a fin
de alterar una secuencia codificante por una diversidad de razones,
que incluyen, pero sin carácter limitante, alteraciones que
modifican la clonación, el procesamiento y/o la expresión del
producto génico. Por ejemplo, pueden introducirse mutaciones
utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica, v.g.
mutagénesis orientada para insertar nuevos sitios de restricción,
alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de
codones, etc.
Dentro del alcance de la presente invención se
incluyen alelos de la molécula ERG8 de la presente invención. Como
se utiliza en esta memoria, un "alelo" o "secuencia
alélica" es una forma alternativa de la molécula de quinasa
descrita en esta memoria. Los alelos resultan de mutaciones de ácido
nucleico y variantes de corte y empalme de mRNA que producen
polipéptidos cuya estructura o función puede estar alterada o no.
Cualquier gen dado puede tener ninguna, o una o muchas formas
alélicas. Los cambios mutacionales comunes que dan lugar a alelos
se adscriben generalmente a deleciones, adiciones o sustituciones
naturales de aminoácidos. Cada uno de estos tipos de cambios puede
existir aisladamente, o en combinación con los otros, una o más
veces en una secuencia dada.
Así, de acuerdo con una realización preferida,
se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia
representada en SEQ ID NO. 7 o una secuencia que posee al menos 80%
de semejanza con ella. Realizaciones más preferidas son aquéllas
que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 85, 90, 95,
96, 97, 98, y 99% de semejanza con la secuencia representada en SEQ
ID NO. 7. Se prefieren variantes funcionales biológicamente
activas.
Fragmentos de tales polipéptidos que comprenden
al menos 15, preferiblemente al menos 30 y más preferiblemente al
menos 50 aminoácidos contiguos están abarcados también por la
presente invención. Tales fragmentos pueden utilizarse como
compuestos intermedios para generar fragmentos de polipéptidos más
largos que incluyen preferiblemente la secuencia del polipéptido de
longitud total que se representa en SEQ ID NO. 7, o una variante
funcional de la misma. Tales fragmentos polipeptídicos pueden
utilizarse también para generar anticuerpos contra o específicos
para partes de la proteína ERG8.
La invención se refiere también a secuencias de
polipéptidos variantes codificadas por un ácido nucleico capaz de
hibridarse con el ácido nucleico codificante del polipéptido natural
(SEQ ID NO. 6, o su cadena antisentido complementaria) (o podría
hacerlo excepto por la degeneración del código genético), por
ejemplo en condiciones severas (tales como a 35ºC hasta 65ºC en una
solución salina de aproximadamente 0,9 M). Tales polinucleótidos
hibridables forman también parte de la invención. La presente
invención se refiere particularmente a polinucleótidos que se
hibridan a la secuencia del polinucleótido ERG8 representada en SEQ
ID NO. 6, su secuencia complementaria, o fragmento de la misma, en
condiciones severas. Como se utiliza en esta memoria, condiciones
severas son aquellas condiciones que permiten que secuencias que
poseen al menos 80%, preferiblemente al menos 90% y más
preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia se hibriden
unas a otras. Así, ácidos nucleicos que pueden hibridarse
selectivamente al ácido nucleico de SEQ ID NO. 6, o la cadena
antisentido complementaria de la misma, incluyen ácidos nucleicos
que tienen al menos 80%, preferiblemente al menos 90%, más
preferiblemente al menos 95%, todavía más preferiblemente al menos
98% de identidad de secuencia y muy preferiblemente 100%, sobre al
menos una porción del ácido nucleico codificante del gen ERG8
descrito en esta memoria. Hibridarse selectivamente significa que
la molécula tiene que ser capaz de hibridarse específicamente con la
secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO. 6 o su complemento, con
exclusión de otras secuencias existentes naturalmente. Al igual que
las secuencias génicas de longitud total, fragmentos de ácido
nucleico más pequeños, por ejemplo iniciadores oligonucleotídicos
que pueden utilizarse para amplificar el gen ERG8 utilizando
cualquiera de los sistemas de amplificación bien conocidos tales
como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o fragmentos que
pueden utilizarse como sondas de diagnóstico para identificar
secuencias de ácido nucleico correspondientes, forma también parte
de esta invención. La invención incluye por tanto polinucleótidos de
longitud más corta que la secuencia del gen ERG8 de longitud total
representada en SEQ ID NO. 6, que son capaces de hibridarse
específicamente al ácido nucleico que codifica el gen ERG8 de C.
albicans descrito en esta memoria. Tales polinucleótidos pueden
tener una longitud de al menos 10 nucleótidos, con preferencia al
menos 15, más preferiblemente al menos 20 y muy preferiblemente al
menos 30 nucleótidos de longitud y pueden ser de cualquier tamaño
hasta la secuencia nucleotídica de ERG8 de longitud total
inclusive. La presencia de nucleótidos de desapareamiento en los
polinucleótidos de hibridación no es perjudicial para la utilidad de
tales polinucleótidos, con tal que los mismos sean capaces de
hibridarse selectivamente a la secuencia nucleotídica ERG8
diana.
Un ejemplo de una solución de hibridación
adecuada cuando un ácido nucleico está inmovilizado sobre una
membrana de nailon y el ácido nucleico sonda es mayor que 500 bases
o pares de bases es; 6 x SSC (solución salina de citrato sódico),
0,5% SDS (dodecil-sulfato de sodio), 100 \mug/ml
de DNA de esperma de salmón tratado por ultrasonidos y
desnaturalizado); realizándose la hibridación a 68ºC durante al
menos una hora, y lavándose luego los filtros a 68ºC en 1 x SSC, o
para mayor severidad, 0,1 x SSC/0,1% SDS.
Un ejemplo de una solución de hibridación
adecuada cuando un ácido nucleico está inmovilizado sobre una
membrana de nailon y la sonda es un oligonucleótido de una longitud
comprendida entre 12 y 50 bases es; cloruro de trimetilamonio
(TMACl) 3M, fosfato de sodio 0,01 M (pH 6,8), EDTA 1 mM (pH 7,6),
0,5% de SDS, 100 \mug/ml de DNA de esperma de salmón tratado por
ultrasonidos y desnaturalizado, y 0,1% de leche desnatada desecada.
La temperatura óptima de hibridación (Tm) se elige usualmente de
modo que sea 5ºC inferior al Ti de la cadena híbrida. Ti es la
temperatura de fusión irreversible del híbrido formado entre la
sonda y su diana. Si existen cualesquiera desapareamientos entre la
sonda y la diana, la Tm será menor. Como orientación general, la
temperatura de hibridación recomendada para
17-meros en TMACl 3M es 48-50ºC;
para 19-meros, es 55-57ºC; y para
20-meros, es 58-66ºC.
Un protocolo de hibridación adecuado se describe
en el Ejemplo 5 de esta memoria; sin embargo, variaciones
operativas de este método serán evidentes para personas expertas en
la técnica.
Tal como se utiliza en esta memoria, el término
"variante" incluye variantes alélicas existentes naturalmente
así como variantes que no existen naturalmente, fragmentos y
análogos de las secuencias representadas en SEQ ID Nos. 6 ó 7.
Tales variantes incluyen variantes truncadas en C o en N, variantes
de deleción, variantes de sustitución así como variantes de adición
e inserción. El término "análogo" hace referencia a
proproteínas que pueden activarse por escisión de la porción
proproteínica para liberar el polipéptido o la proteína
biológicamente activo(a). El término "derivado" hace
referencia a un polipéptido codificado por un gen ERG8 modificado
químicamente, por ejemplo uno en el cual el hidrógeno se ha
reemplazado por un grupo acilo o amino, así como polipéptidos que
poseen uno o más aminoácidos no naturales. Cuando se hace referencia
a una secuencia de polipéptido o proteína, una variante funcional
es una que ha retenido al menos algo de la actividad enzimática de
PMK. Los polipéptidos variantes de la presente invención pueden
comprender secuencias flanqueantes internas, pero preferiblemente
terminales (proteínas de fusión) para facilitar la purificación de
la proteína. Tales secuencias de "dominios adicionales"
(secuencias Bandera) pueden comprender por ejemplo, polipéptidos
formadores de quelatos metálicos tales como módulos
histidina-triptófano (con inclusión de marcadores
6-his) que permiten la purificación del polipéptido
sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la
purificación de inmunoglobulina inmovilizada, o dominios peptídicos
que permiten la purificación sobre anticuerpos inmovilizados
específicos para el péptido. Otros "dominios de purificación
adicionales" adecuados serán conocidos por las personas expertas
en la técnica.
\newpage
De acuerdo con una realización preferida de la
invención, la secuencia del polipéptido ERG8 nativa (que tiene la
secuencia representada en SEQ ID NO. 7) está fusionada en su término
amino a 6 residuos histidina que sirven para permitir que el
polipéptido, una vez expresado por la célula hospedadora, se aísle y
purifique por cromatografía de afinidad utilizando una resina de
quelato de Ni.
Un dominio de purificación flanqueante puede
estar separado del polipéptido ERG8 por una secuencia de escisión
tal como la reconocida por trombina o Factor Xa a fin de facilitar
la liberación del polipéptido de la secuencia flanqueante que puede
estar unida o no a un soporte inmovilizado. Alternativamente, puede
emplearse bromuro de cianógeno, que escinde en los residuos
metionina para liberar el polipéptido deseado de su secuencia
flanqueante.
Los polipéptidos de la invención pueden
sintetizarse químicamente. Por ejemplo, por la técnica de Merryfield
(J. Amer. Chem. Soc. 85; 2149-2154, 1968).
Numerosos sintetizadores automáticos de polipéptidos, tales como el
Sintetizador de Péptidos Applied Biosystems 431A existen también
actualmente. Alternativamente, y de modo preferible, los
polipéptidos de la invención se producen a partir de una secuencia
de nucleótidos que codifica el polipéptido utilizando tecnología de
expresión recombinante.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporcionan polinucleótidos aislados (con inclusión de DNA
genómico, RNA genómico, cDNA y mRNA; tanto bicatenarios como
cadenas +ve y -ve) que codifican los polipéptidos de la invención.
Las moléculas de DNA monocatenarias de la totalidad o parte del gen
ERG8, sean cadena +ve o -ve, encuentran utilidad, entre otras
cosas, como sondas de hibridación o iniciadores de amplificación
PCR. La cadena de sentido de la secuencia génica completa de ERG8
nativo se representa en la Figura 1 (SEQ ID NO. 5) más adelante en
esta memoria. Se apreciará que un polinucleótido de la invención
puede comprender cualquiera de los códigos degenerados para un
aminoácido particular, con inclusión del uso de codones raros. De
hecho, cuando se produce el polipéptido por expresión recombinante
en cepas hospedadoras heterólogas, puede ser deseable adoptar el
uso de codones (preferencia) del organismo hospedador (Murray,
N.A.R. 17; 477-508, 1989).
Así pues, de acuerdo con un aspecto adicional de
la invención, se proporciona un polinucleótido aislado que
comprende ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos
representada en SEQ ID NO. 7 o una variante de la misma, tal como
uno que posee al menos 80% de identidad con dicha secuencia.
La invención comprende adicionalmente fragmentos
convenientes de una cualquiera de las secuencias
polinucleótido/ácido nucleico anteriores. Fragmentos convenientes
pueden definirse por materiales digeridos con endonucleasas de
restricción de ácido nucleico que comprenden la secuencia del gen
ERG8. Tales fragmentos son útiles entre otras cosas para expresar
fragmentos de polipéptidos cortos de la proteína ERG8 de la
invención así como para uso como sondas de hibridación. La presente
invención proporciona también una sonda polinucleotídica que
comprende una cualquiera de las secuencias o fragmentos anteriores
junto con un identificador o marcador conveniente, preferiblemente
un identificador o marcador no radiactivo. Siguiendo procedimientos
bien conocidos en la técnica, las sondas pueden utilizarse para
identificar y aislar no sólo secuencias de ácido nucleico
correspondientes (es decir secuencias del ERG8 de C.
albicans) sino que pueden utilizarse también, en caso de ser
suficientemente homólogas, para identificar el gen análogo a partir
de otros organismos utilizando métodos bien conocidos por las
personas expertas en la técnica. Tales secuencias pueden estar
incluidas en genotecas, tales como genotecas genómicas o genotecas
de cDNA. La presente invención proporciona también transcritos de
RNA correspondientes a cualquiera de las secuencias o fragmentos
ERG8 de C. albicans anteriores. Pueden utilizarse transcritos
de RNA para preparar un polipéptido de la invención por técnicas de
traducción in vitro de acuerdo con métodos conocidos
(Sambrook et al. "Molecular Cloning - A Laboratory Manual,
2ª edición, 1989"). La invención comprende adicionalmente la
longitud total o longitudes de segmentos del gen ERG8 (secuencia
codificante) flanqueadas por secuencia no codificante que puede
incluir secuencias naturales o no naturales que contienen motivos
de secuencias de reconocimiento por enzimas de restricción. La
incorporación de sitios de reconocimiento por enzimas de
restricción adecuadas a cualquier lado de la región codificante de
ERG8, o de hecho cualquier secuencia polinucleotídica de ERG8,
facilita la clonación del gen o secuencia polinucleotídica ERG8 en
un vector adecuado. Un polinucleótido adecuado comprende un gen
ERG8 de C. albicans de longitud total (codificante del
polipéptido que comienza con metionina en la posición 1 y termina
con la leucina que precede al codón TAA de parada en la posición
1299 de la Figura 1) flanqueado por sitios de restricción singulares
HindIII (extremo 5')-XhoI (extremo 3'). Ejemplos de
iniciadores oligonucleotídicos que son adecuados para uso en la
amplificación de ERG8 por PCR, y que incorporan sitios de enzimas de
restricción útiles para facilitar la clonación, se describen como
SEQ ID Nos. 10 y 11. Pueden introducirse cambios o mutaciones de
nucleótidos en una secuencia polinucleotídica por síntesis de
polinucleótidos de novo, por mutagénesis orientada utilizando
iniciadores polinucleotídicos diseñados adecuadamente o por
cualquier otro medio conveniente conocido por las personas expertas
en la técnica.
Para propósitos de expresión, puede ser
ventajoso modificar por ingeniería genética un sitio de restricción
en el extremo 5' que es también capaz de reconstituir la metionina
amino-terminal nativa de la proteína. La secuencia
de reconocimiento por escisión para la enzima de restricción Nco1
incluye no sólo una secuencia que codifica metionina, sino también
una que es capaz de retener una secuencia de consenso Kozak
funcional, permitiendo que el gen ERG8 se clone en el extremo 3' de
un elemento promotor adecuado en un vector de expresión.
Los polinucleótidos pueden sintetizarse
químicamente, o aislarse por uno de varios métodos conocidos por las
personas expertas en la técnica tales como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) o la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o
por clonación a partir de una genoteca genómica o genoteca de
cDNA.
Una vez aisladas o sintetizadas, pueden
utilizarse una diversidad de sistemas vector de expresión/hospedador
pueden utilizarse para expresar secuencias codificantes de ERG8.
Estas incluyen, pero sin carácter limitante, microorganismos tales
como bacterias expresadas con plásmidos, cósmidos o bacteriófago;
levaduras transformadas con vectores de expresión; sistemas de
células de insecto transfectados con sistemas de expresión de
baculovirus; sistemas de células vegetales transfectados con
sistemas de expresión de virus de plantas, tales como el virus del
mosaico de la coliflor; o sistemas de células de mamífero (por
ejemplo los transfectados con vectores de adenovirus); la selección
del sistema más apropiado es una cuestión de elección.
Los vectores de expresión incluyen usualmente un
origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de la
traducción, opcionalmente un péptido de señal, un sitio de
poliadenilación, y un sitio de terminación de la trascripción.
Estos vectores contienen también usualmente uno o más genes
marcadores de resistencia a antibióticos para selección. Como se ha
indicado arriba, vectores de expresión adecuados pueden ser
plásmidos, cósmidos o virus tales como fago o retrovirus. La
secuencia codificante del polipéptido se pone bajo el control de un
promotor apropiado, elementos de control y terminador de la
trascripción a fin de que la secuencia de ácido nucleico que
codifica el polipéptido se transcriba en RNA en la célula
hospedadora transformada o transfectada por el constructo del
vector de expresión. La secuencia codificante puede contener o no un
péptido de señal o secuencia conductora para secreción del
polipéptido fuera de la célula hospedadora. La expresión y
purificación de los polipéptidos de la invención puede realizarse
fácilmente utilizando métodos bien conocidos en la técnica (por
ejemplo como se describe en Sambrook et al. "Molecular
Cloning - A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989").
Los vectores que contienen el DNA codificante de
los polipéptidos ERG8 de la invención pueden introducirse (es decir
transformarse o transfectarse) en E. coli, S. cerevisiae, Pichia
pastoris o cualquier otro hospedador adecuado para facilitar su
manipulación (es decir para mutagénesis, clonación o expresión). La
eficiencia de la invención no depende de ni está limitada a ninguna
cepa particular de célula hospedadora o vector. Los adecuados para
uso en la invención serán evidentes para y cuestión de elección por
la persona experta en la técnica.
Células hospedadoras transformadas o
transfectadas con un vector que contiene una secuencia de
nucleótidos de ERG8 pueden cultivarse en condiciones adecuadas para
la expresión y recuperación de las proteínas codificadas a partir
del cultivo de células. Tales proteínas/polipéptidos expresados
pueden secretarse en el medio de cultivo o pueden estar contenidos
intracelularmente dependiendo de las secuencias utilizadas, es decir
de si estaban presentes o no secuencias de señal de secreción
adecuadas.
La proteína ERG8 nativa de longitud total
aislada de C. albicans (enzima PMK) de la presente invención,
o una variante funcional de la misma, es útil como diana en ensayos
bioquímicos, particularmente para uso en la identificación de
inhibidores de la enzima. Sin embargo, para proporcionar enzima
suficiente para ensayos bioquímicos (por ejemplo, para uso en una
selección de alta potencia para inhibidores enzimáticos) la enzima
tiene que expresarse a niveles altos y debe ser purificada. Dos
limitaciones principales dificultan la expresión y purificación de
ERG8; (i) ERG8 no es expresada a niveles altos por C.
albicans, y (ii) la metodología de expresión y purificación de
proteínas no está muy avanzada para C. albicans.
Los autores de la invención han conseguido ahora
resolver estos problemas por una sobre-expresión
controlada de la ERG8 de C. albicans en una cepa de
Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae es un sistema
modélico para expresión y purificación de proteínas recombinantes.
El uso de S. cerevisiae para expresar ERG8 de C.
albicans significa que la metodología de transformación,
expresión y purificación utilizada para producir y aislar la
proteína ERG8 puede seguir procedimientos publicados. Como se ha
expuesto anteriormente, la invención no se limita al uso de S.
cerevisiae como el hospedador para la expresión de ERG8 de C.
albicans.
De acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona una célula hospedadora adaptada para
expresar el polipéptido ERG8 de C. albicans o una variante
del mismo. La levadura S. cerevisiae es la célula
hospedadora de elección preferida. De acuerdo con un aspecto
adicional de la invención, se proporciona un nuevo sistema de
expresión para la expresión del gen ERG8 de C. albicans,
sistema que comprende una cepa hospedadora de S. cerevisiae
que tiene el gen ERG8 de C. albicans en lugar del gen ERG8
nativo de S. cerevisiae, con lo cual se expresa el gen ERG8
de C. albicans. Cepas preferidas de S. cerevisiae
incluyen JK9-3Da\alpha y sus segregantes
haploides.
El gen ERG8 de C. albicans se
sobre-expresa preferiblemente con relación a la
expresión derivada de su propio promotor. Esto se consigue
convenientemente reemplazando el promotor de ERG8 de C.
albicans por un promotor más fuerte y preferiblemente inducible
tal como el promotor GAL1 de S. cerevisiae, factor alfa o
alcohol-oxidasa (para revisiones, véase Ausubel
et al. "Current Protocols in Molecular Biology", John
Wiley & Sons, Nueva York).
El nuevo sistema de expresión se prepara
convenientemente por transformación de una cepa de deleción
heterocigótica de ERG8 de un hospedador S. cerevisiae
conveniente por un plásmido adecuado que comprende el gen ERG8 de
C. albicans utilizando métodos bien conocidos en la técnica
(Ito et al. J. Bacteriol. 153;
163-168, 1983; Schiestl y Grietz, Current Genetics
16; 339-346, 1989).
El plásmido que comprende el ERG8 de C.
albicans representa un aspecto adicional de la invención.
Plásmidos particularmente adecuados para expresión de ERG8 de C.
albicans en S. cerevisiae incluyen pYES2 (Invitrogen) y
plásmidos derivados de pYES2 que llevan un promotor de S.
cerevisiae nativo tal como el promotor
gliceraldehído-3-deshidrogenasa.
La cepa de deleción heterocigótica de ERG8 de un
hospedador S. cerevisiae diploide se obtiene convenientemente
por disgregación utilizando preferiblemente una casete de
resistencia a antibióticos tal como la casete de resistencia a la
kanamicina descrita por Wach et al (Yeast, 10;
1793-1808, 1994).
Como se ha descrito anteriormente, la enzima
ERG8 de C. albicans puede utilizarse en ensayos bioquímicos
para identificar agentes que modulan la actividad de la enzima. El
diseño y la implementación de tales ensayos será evidente para el
bioquímico con experiencia ordinaria. La enzima puede utilizarse
para renovar un sustrato conveniente incorporando/perdiendo al
mismo tiempo un componente marcado que define un sistema de test.
Los compuestos de test se introducen en el sistema de test y se
realizan las medidas para determinar su efecto sobre la actividad
de la enzima. Dichos ensayos son útiles para identificar inhibidores
de la enzima que pueden resultar luego valiosos como agentes
antifúngicos.
Así, en un aspecto adicional de la invención se
proporciona el uso de un gen de ERG8 de C. albicans y/o
enzima PMK de C. albicans en un ensayo para identificar
inhibidores de la enzima. En particular. Se proporciona su uso en
investigación farmacéutica o agroquímica.
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un método de identificar compuestos que
modulan, preferiblemente inhiben, la actividad de
fosfomevalonato-quinasa (PMK), que comprende poner
en contacto un compuesto de test con un polipéptido de la invención
y determinar el efecto que el compuesto de test tiene sobre la
actividad del polipéptido.
La proteína PMK (ERG8) cataliza la conversión de
fosfomevalonato + ATP en pirofosfomevalonato + ADP. A modo de
ejemplo no limitante, la actividad de la enzima ERG8 puede
determinarse por (i) medida del aumento en la producción de ADP,
(ii) seguimiento de la pérdida de ATP, o (iii) monitorización de la
transferencia del marcador radiactivo (a saber, H^{3}, C^{14},
P^{32}) en fosfomevalonato.
Un ensayo adecuado que mide la producción de ADP
implica el acoplamiento del ADP producido por la acción de PMK
sobre sustrato de fosfomevalonato + ATP con
piruvato-quinasa y fosfoenolpiruvato para formar
piruvato y ATP. El piruvato se reduce luego a lactato con
lactato-deshidrogenasa, que convierte NADH en NAD.
La producción de NAD (ligada directamente a la producción de ADP
indicativa de la acción de PMK) se mide convenientemente por
detección del cambio en absorbancia a 340 nm (producto de oxidación
de NADH). En este ensayo, los compuestos de test que inhiben la
actividad de PMK se identifican por determinación de la aptitud de
un compuesto para inhibir la actividad de MPK como se evalúa por
una reducción en la producción de ADP calibrada por una reducción
en la producción de NAD a partir de NADH utilizando
piruvato-quinasa y
lactato-deshidrogenasa como enzimas de acoplamiento
como se ha descrito arriba. La persona experta en la técnica será
capaz de desarrollar otros ensayos para medir la actividad de PMK
sin aporte de inventiva.
El ATP puede ser ensayado convenientemente
utilizando kits disponibles comercialmente (a saber, de Boehringer
Mannheim) para monitorizar la luminiscencia resultante de la
oxidación de luciferina a luciferasa (Ford et al. J.
Biolumin. Chemilumin. 11; 149-167, 1996).
Una reacción adecuada que mide la producción de
fosfomevalonato marcado radiactivamente implica la incubación de la
enzima PMK con cofactores, ATP sustrato y fosfomevalonato, uno de
los cuales lleva un marcador radiactivo. Después de la reacción, el
pirofosfomevalonato puede separarse del sustrato que no ha
reaccionado por electroforesis de alto voltaje a pH 3,5 sobre papel
3MM y la cantidad de radiactividad incorporada en el
pirofosfomevalonato puede medirse por recuento de centelleo (Lee y
O'Sullivan, J. Biol. Chem. 260; 13909-13915,
1985).
Cualquier compuesto de test conveniente o
genoteca de compuestos de test puede ser utilizado(a) en
asociación con el ensayo de test. En particular, compuestos de test
incluyen compuestos químicos de peso molecular bajo
(preferiblemente con un peso molecular menor que 1500 daltons)
adecuados como agentes farmacéuticos o veterinarios para uso humano
o animal, o compuestos para uso no administrado tales como agentes
de limpieza/esterilización o para uso agrícola.
La enzima ERG8 de la invención, y fragmentos
convenientes de la misma puede(n) utilizarse para producir
anticuerpos. Tales anticuerpos tienen numerosos usos que serán
evidentes para el biólogo o inmunólogo molecular con experiencia
ordinaria. Tales usos incluyen, pero sin carácter limitante,
monitorización de la expresión enzimática, desarrollo de ensayos
para medir actividad enzimática, precipitación o purificación de la
enzima y como herramienta de diagnóstico para detectar C.
albicans. Los ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISAs)
son bien conocidos en la técnica y podrían ser particularmente
adecuados para detectar el polipéptido ERG8 o fragmentos del mismo.
Los anticuerpos producidos contra los polipéptidos de la invención
pueden ser policlonales, obtenidos por ejemplo por inyección del o
de los polipéptidos en un mamífero seleccionado (a saber, conejo,
ratón, cabra o caballo), y recogida posterior del suero inmunizado
a partir del animal y tratamiento de éste de acuerdo con
procedimientos conocidos en la técnica. Dependiendo de la especia
hospedadora, pueden utilizarse diversos adyuvantes para mejorar la
respuesta inmunológica contra el polipéptido inyectado. Adyuvantes
adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, Freud's, hidróxido
de aluminio y SAF. Los anticuerpos pueden ser también anticuerpos
monoclonales producidos por células de hibridoma, genotecas de
presentación de fago u otra metodología. Los anticuerpos
monoclonales pueden derivarse, entre otros, de humano, rata o ratón.
Para la producción de anticuerpos monoclonales humanos, pueden
prepararse células de hibridoma por fusión de células del bazo de un
animal inmunizado, v.g. un ratón, con una célula tumoral. Células
que secretan adecuadamente hibridoma pueden seleccionarse después
(Koehler & Milstein, Nature, 256;
495-497, 1975; Cole et al., ``Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, Nueva York, N.Y., pp
77-96). Los anticuerpos de roedor pueden estar
humanizados utilizando tecnología de DNA recombinante de acuerdo
con métodos conocidos en la técnica. Alternativamente, pueden
desarrollarse también anticuerpos quiméricos, anticuerpos
monocatenarios, o fragmentos Fab contra los polipéptidos de la
invención (Huse et al, Science, 256;
1275-1281, 1989), utilizando métodos conocidos en la
técnica.
Los polinucleótidos y anticuerpos de la
invención pueden utilizarse en metodologías
gen-sonda o proteína-sonda, con o
sin amplificación (por ejemplo, por PCR o por detección de segundo
anticuerpo) a fin de detectar o diagnosticar la presencia de C.
albicans. Esto es particularmente valioso en el diagnóstico de
infecciones clínicas. De acuerdo con ello, la invención proporciona
kits de diagnóstico para detección de ERG8 de C. albicans o
fragmentos del mismo, y proporciona el uso de proteína ERG8,
fragmentos polipeptídicos de la misma y/o anticuerpos producidos
contra ellos como control positivo. Los reactivos en el kit pueden
estar compartimentados y el kit puede comprender también
instrucciones para uso.
Los diagnósticos de DNA están basados en
tecnología de hibridación DNA/RNA, es decir la fijación específica
in vitro de ácido nucleico monocatenario complementario con
la formación de ácido nucleico bicatenario. Las dobles cadenas
DNA/DNA o DNA/RNA formadas se denominan híbridos. Para detectar la
presencia de C. albicans en un fluido corporal tal como
sangre, se aísla el ácido nucleico total de la muestra del fluido de
test utilizando técnicas estándar y se detecta la presencia de
ácido nucleico de ERG8 de C. albicans en la muestra
utilizando por ejemplo sondas marcadas detectablemente que
comprenden uno o más de los polinucleótidos de la invención. Las
sondas pueden ser sondas cortas de oligonucleótidos sintetizados
químicamente con una longitud de aproximadamente
10-50 nucleótidos, o pueden ser fragmentos
expresados recombinantemente del gen ERG8 de 0,3-1,5
Kb de tamaño aproximado. Se prefieren sondas oligonucleotídicas
monocatenarias que son específicas para C. albicans. La
sonda puede estar provista de un marcador molecular informador
detectable adecuado tal como un radioisótopo (P^{32}, tritio,
C^{14} o S^{35}), o un marcador no radiactivo tal como
digoxigenina o biotina, utilizando métodos disponibles para las
personas expertas en la técnica. Antes de la reacción de
hibridación, la totalidad o alguna parte del DNA de ERG8 de C.
albicans que contiene la secuencia a la que puede hibridarse la
sonda, presente en la muestra de test, se amplifica utilizando por
ejemplo PCR (reacción en cadena de la polimerasa) o LCR (reacción
en cadena de la ligasa). Para la reacción de hibridación específica,
el ácido nucleico de test y, en caso necesario, el DNA sonda se
convierte en cadenas simples por desnaturalización (calor o álcali)
y se hibridan luego de modo muy específico uno a otro en condiciones
severas. En condiciones apropiadas, la sonda génica se hibrida
únicamente a las secuencias complementarias del DNA o RNA a
detectar. El ensayo de hibridación y detección puede llevarse a
cabo en varios formatos diferentes conocidos por las personas
expertas en la técnica, que incluyen hibridación en fase sólida del
DNA o sonda diana acoplado(a) a un soporte sólido tal como
nitrocelulosa o cuentas magnéticas. El complejo de hibridación puede
determinarse luego cuantitativamente, después de la separación de
la sonda sin marcar o el ácido nucleico de test, por la vía del
marcador de molécula informadora (v.g. fluorescente o radiactivo)
empleado.
La sensibilidad del test de este método de
diagnóstico simple gen-sonda puede aumentarse por
combinación con técnicas de amplificación de DNA o RNA tales como
PCR o LCR. Utilizando dichas técnicas de amplificación, el DNA a
detectar puede multiplicarse por hasta 10^{9}.
Pueden existir solamente
100-1000 organismos por ml de sangre en asociación
con infecciones de Candida. Dichos pequeños números de células son
fácilmente detectables cuando se combinan las técnicas de
amplificación y detección DNA-sonda ofreciendo la
posibilidad de detección precoz de una infección.
Así, de acuerdo con un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un método de diagnóstico de la presencia
del gen ERG8 de C. albicans en una muestra de test, que
comprende; poner en contacto una sonda polinucleotídica de al menos
15 nucleótidos de longitud, sonda que es capaz de hibridarse
específicamente con la secuencia representada en SEQ ID NO. 6, con
la muestra de test en condiciones que permiten la formación de
dúplex entre dicha sonda polinucleotídica y el ácido nucleico
contenido en la muestra de test; y detectar la formación de dúplex.
En una realización preferida, la sonda polinucleotídica se marca
detectablemente. En otra realización, la sonda polinucleotídica es
monocatenaria. En otra realización, la sonda polinucleotídica es
completamente complementaria a la secuencia diana a detectar. De
acuerdo con un aspecto adicional de la invención, la sonda
polinucleotídica se sustituye por un par de iniciadores
oligonucleotídicos capaces de amplificación específica por PCR de
la totalidad o una parte del gen ERG8 en la muestra de test, con
identificación subsiguiente del producto de amplificación.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un kit de diagnóstico para diagnosticar o
detectar la presencia de C. albicans, que comprende una o más
sondas de diagnóstico y/o iniciadores de diagnóstico y/o
anticuerpos capaces de hibridarse selectivamente o fijarse al
polinucleótido de SEQ ID NO. 6 o el polipéptido de SEQ ID NO. 7, o
a secuencias variantes de los mismos como se definen en esta
memoria.
En una realización preferida, las sondas de
diagnóstico (detección) se proporcionan en una microrred.
Tales kits pueden comprender adicionalmente uno
o más tampones y/o polimerasas apropiados(as) tales como
polimerasas termoestables, por ejemplo la polimerasa taq. Aquéllos
pueden comprender también iniciadores asociado/constantes y/o
iniciadores de control o sondas. Un iniciador asociado/constante es
uno que forma parte del par de iniciadores utilizados para realizar
la PCR. Dicho iniciador complementa usualmente la cadena molde con
precisión.
En otra realización, el kit es un kit ELISA que
comprende uno o más anticuerpos específicos para el polipéptido
representado en SEQ ID NO. 7, o una variante del mismo como se
define en esta memoria.
Los ejemplos y la figura siguientes describen e
ilustran la invención. Los mismos no deben interpretarse como
limitantes del alcance de la invención en modo alguno;
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
del gen de C. albicans codificante de
fosfomevalonato-quinasa. Los codones de inicio de
la traducción (ATG) y parada (TAA) están subrayados.
Se encontró que dos secuencias separadas de
ácido nucleico clonadas y secuenciadas de una genoteca de C.
albicans (SEQ ID Nos. 1 & 3) tenían homología con la del gen
ERG8 de S. cerevisiae. Los complementos de regiones
específicas en SEQ ID Nos. 1 y 3 se sintetizaron como
oligonucleótidos (SEQ ID Nos. 2 & 4) para uso en el aislamiento
de un clon que contenía el gen ERG8 de C. albicans.
Utilizando los dos iniciadores
oligonucleotídicos (SEQ ID Nos. 2 y 4) se aisló el gen ERG8 de C.
albicans como clon plasmídico a partir de una genoteca de DNA
genómico de C. albicans en el vector lanzadera de levadura
YEp24 utilizando PCR. La genoteca de C. albicans se mantuvo
en E. coli y se dejaron crecer colonias bacterianas
independientes en pocillos individuales de cada una de 15 placas de
microtitulación de 384 pocillos. Las propiedades de los plásmidos
de la genoteca son tales que este sistema cuadriculado contiene
aproximadamente 2,5 veces la cantidad de DNA en el genoma de C.
albicans.
Se mezclaron pequeñas partes alícuotas de
células de cada uno de los pocillos para producir una agrupación de
células que se derivaban de la totalidad de los pocillos de una sola
placa. Se prepararon agrupaciones similares para la totalidad de
las filas y la totalidad de las columnas de cada una de las placas.
Muestras de cada una de las agrupaciones de las células para cada
placa completa se utilizaron en reacciones PCR con iniciadores
oligonucleotídicos de SEQ ID Nos. 2 y 4 a fin de identificar la o
las placas en la red que contenían ERG8 de C. albicans.
Reacciones PCR subsiguientes con agrupaciones de células de filas de
pocillos y columnas de pocillos definían el o los pocillos
específicos que llevaban un clon de ERG8 de C. albicans.
Las reacciones PCR contenían en un volumen total
de 0,05 ml; Tris-HCl 75 mM (pH 8,8 a 25ºC),
(NH_{4})_{2}SO_{4} 20 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 0,01% de
Tween 20, 0,2 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, 1,25
unidades de DNA-polimerasa Taq, 100 picomoles de
cada iniciador oligonucleotídico y 0,005 ml de suspensión de células
de E. coli. Las reacciones PCR se incubaron a 94ºC durante 1
minuto y luego durante 30 ciclos de lo siguiente; 94ºC durante 1
min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min. Los productos PCR se
analizaron por electroforesis en agarosa y se visualizaron bajo luz
UV después de tinción con bromuro de etidio.
Clones que albergaban supuestamente el gen ERG8
se seleccionaron, se purificaron los DNAs plasmídicos en estos
clones y se determinó la secuencia completa del gen ERG8 de C.
albicans en ambas cadenas utilizando iniciadores
oligonucleotídicos específicos de la secuencia flanqueante o la
secuencia de inserción. La longitud total del gen ERG8 de C.
albicans, con inclusión del ATG "de inicio" y el TAA "de
parada" se muestra en la Figura 1. La traducción en proteínas
del gen se representa en SEQ ID NO. 7.
Dado que PMK es una enzima esencial, únicamente
un alelo de una célula diploide puede delecionarse sin pérdida de
viabilidad. Una cepa diploide del gen ERG8 de S. cerevisiae
(JK9-3daa; Kunz et al., Cell 73;
585-596 (1993)) se disgregó utilizando una casete
de resistencia a la kanamicina como ha sido descrito por Wach et
al. (Yeast 10; 1693-1808, 1994)
utilizando el protocolo descrito en dicho lugar con los
oligonucleótidos representados en SEQ ID Nos. 8 y 9. La
esporulación del diploide heterocigótico (ERG8/erg8::KanMX) produce
únicamente dos esporas viables que son sensibles ambas a la
kanamicina, demostrando que ERG8 es esencial, y el fenotipo de
parada característico para las dos esporas inviables.
La cepa heterocigótica ERG8/erg8::KanMX se
transformó con el plásmido que llevaba el gen ERG8 de C.
albicans de longitud total dentro de un fragmento de DNA
genómico de C. albicans de tal modo que la expresión del gen
dependerá de la funcionalidad del promotor de C. albicans en
el hospedador S. cerevisiae heterólogo. Sorprendentemente,
el gen transportado en el plásmido fallaba en lo referente a
complementar la deleción del gen como se demostraba por un fallo en
la recuperación de células haploides resistentes a la kanamicina
después de la esporulación. Esto se debía probablemente a una
expresión inadecuada de ERG8 de C. albicans en S.
cerevisiae.
Para hacer posible la expresión de ERG8 de C.
albicans en S. cerevisiae y facilitar la purificación de
la proteína ERG8 como resultado de la
sobre-expresión en un hospedador adecuado, se
reemplazó el promotor de C. albicans por el promotor
eficiente e inducible GAL1 de S. cerevisiae. La secuencia
codificante de ERG8 de C. albicans se amplificó por PCR
utilizando los polinucleótidos que se muestran en SEQ ID Nos. 10 y
11, que contienen sitios convenientes de enzimas de restricción para
clonación del producto de PCR en un vector de expresión apropiado
tal como pYES2 (Invitrogen). La identidad del gen amplificado por
PCR clonado en pYES2 se confirmó por secuenciación del DNA. Después
de transformación en la cepa heterocigótica ERG8/ergB::KanMX, el
plásmido era capaz de complementar el alelo erg8::KanMX en S.
cerevisiae, dado que las esporas haploides resistentes a la
kanamicina era viables en medio que contenía galactosa pero no
glucosa. Esta cepa de S. cerevisiae es una fuente útil de la
proteína ERG8 de C. albicans biológicamente activa para
ensayos in vitro.
Puede sobreexpresarse también convenientemente
ERG8 de C. albicans en bacterias tales como E. coli.
La secuencia codificante de ERG8 de C. albicans se amplifica
por PCR utilizando oligonucleótidos que contienen sitios de
restricción convenientes para clonación en vectores de expresión
tales como pT7#3.3. Es particularmente conveniente que se incorpore
el codón de iniciación para ERG8 en uno de los sitios de
restricción. Oligonucleótidos adecuados para esto se muestran en
SEQ ID Nos. 12 y 13. Los oligonucleótidos pueden incorporar también
secuencias extra que codifican una pequeña "etiqueta" que
ayuda a la purificación subsiguiente de la proteína. Etiquetas de
este tipo incluyen por ejemplo las etiquetas "His_{6}" que
pueden incorporarse en el término N o C de ERG8 utilizando los
oligonucleótidos representados en SEQ ID Nos. 14 y 15. La proteína
ERG8 etiquetada expresada recombinantemente puede purificarse
conveniente por metodología de purificación por cromatografía de
afinidad utilizando kits de purificación disponibles comercialmente
(a saber, de Qiagen) (Borsig et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 240; 586-589, 1997).
Se describe un método para detección de ácidos
nucleicos variantes que contienen secuencias afines a secuencias
específicas de ERG8 tales como alelos naturales. Estos ácidos
nucleicos variantes pueden estar presentes en una diversidad de
formas tales como en plásmidos u otros vehículos similares que
pueden fijarse a una membrana de hibridación, tal como un filtro de
nitrocelulosa o nailon listo para detección utilizando una sonda
marcada. Pueden realizarse también ensayos de hibridación para
identificar secuencias variantes dentro de genotecas genómicas o
genotecas de DNA. La tecnología de hibridación está muy avanzada.
Será evidente para las personas expertas en la técnica que el
protocolo descrito a continuación es solamente un ejemplo de un
protocolo de hibridación adecuado para identificar secuencias
variantes de ERG8.
Pueden generarse sondas de hibridación a partir
de cualquier fragmento de DNA o RNA que codifique la secuencia
nucleica específica de ERG8 de interés. Tales fragmentos pueden ser,
por ejemplo, fragmentos de restricción aislados después de
digestión con enzimas de restricción de ácido nucleico que contenga
la secuencia de nucleótidos de ERG8 u oligonucleótidos sintéticos
específicos para una región del gen ERG8 o una secuencia
complementaria del mismos.
Puede generarse una sonda de hibridación a
partir de un oligonucleótido sintético o una secuencia de un
fragmento de restricción desfosforilado por adición de un grupo
radiactivo 5'-fosfato a partir de
[\gamma-^{32}P]ATP por la acción de
polinucleótido-quinasa T4. Se añaden 20 picomoles
del oligonucleótido a una reacción de 20 \mul que contiene Tris
100 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, espermidina 0,1 mM, ditiotreitol
(DTT) 20 mM, ATP 7,55 \muM, 55 \muCi
[\gamma-^{32}P]ATP y 2,5 u de
polinucleótido-quinasa T4 (Pharmacia Biotechnology
Ltd., Uppsala, Suecia). La reacción se incuba durante 30 minutos a
37ºC y luego durante 10 minutos a 70ºC antes de utilizarla en
hibridación. Métodos para la generación de sondas de hibridación a
partir de oligonucleótidos o de fragmentos de DNA y RNA (Capítulos
11 y 10 respectivamente en Sambrook et al. ibid).
Cierto número de kits patentados están disponibles también para
estos procedimientos.
Filtros que contienen el ácido nucleico se
pre-hibridan en 100 ml de una solución que contiene
6 x SSC, 0,1% de SDS y 0,25% de leche desnatada seca
(Marvel^{TM}) a 65ºC durante un mínimo de una hora en un
recipiente cerrado adecuado. Un aparato de hibridación patentado
tal como el modelo HB-1 (Techne Ltd) proporciona
condiciones reproducibles para el experimento.
La solución de pre-hibridación
se reemplaza luego por 10 ml de una solución sonda que contiene 6 x
SSC, 0,1% SDS, 0,25% de leche desnatada seca (v.g. Marvel^{TM}) y
la sonda oligonucleotídica generada anteriormente. Los filtros se
incuban en esta solución durante 5 minutos a 65ºC antes de dejar que
la temperatura descienda gradualmente hasta por debajo de 30ºC. La
solución sonda se desecha luego y los filtros se lavan en 100 ml de
6 x SSC, 0,1% SDS a la temperatura ambiente durante 5 minutos. Se
realizan luego lavados adicionales en lotes nuevos de la misma
solución a 30ºC y después en incrementos de 10ºC hasta 60ºC durante
5 minutos por lavado.
Después del lavado, se secan los filtros y se
utilizan para exponer una película de rayos X tal como
Hyperfilm^{TM} MP (Amersham International) a -70ºC en una casete
de película resistente a la luz utilizando un filtro de
intensificación rápido de wolframato para mejorar la imagen
fotográfica. La película se expone durante un periodo adecuado
(normalmente una noche) antes del desarrollo para revelar la imagen
fotográfica de las áreas radiactivas en los filtros. Las secuencias
de ácido nucleico afines se identifican por la presencia de una
imagen fotográfica comparada con las secuencias totalmente no afines
que no deben producir imagen alguna. Generalmente, las secuencias
afines aparecerán positivas a la temperatura de lavado más alta
(60ºC). Sin embargo, las secuencias afines pueden resultar
únicamente positivas a las temperaturas de lavado más bajas (50, 40
ó 30ºC).
Estos resultados dependerán también de la
naturaleza de la sonda utilizada. Las sondas de fragmentos de ácido
nucleico más largas precisarán ser hibridadas durante periodos más
largos a temperatura elevada, pero pueden quedar fijadas a
secuencias afines a temperaturas de lavado más altas y/o a
concentraciones menores de sal. Las sondas oligonucleotídicas más
cortas, mixtas o degeneradas pueden requerir condiciones de lavado
menos severas tales como temperaturas inferiores y/o
concentraciones más altas de Na^{+}. Una exposición de las
consideraciones para protocolos de hibridación se proporciona en
Sambrook et al. (Capítulo 11).
Para preparar 20 x SSC, se disuelven 175,3 g de
NaCl y 88,2 g de citrato de sodio en aproximadamente 800 ml de
agua, se ajusta el pH a 7,0 utilizando solución 10 N de NaOH y se
ajusta el volumen a 1 litro con agua, antes de tratamiento en
autoclave.
<110> ASTRAZENECA AB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROTEÍNA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> LDSG/PHM70579/WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> GB 9919766.7
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-08-21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 547
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Candida albicans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 21
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido monocatenario
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<212> DNA
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<213> Candida albicans
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<212> DNA
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido monocatenario
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Candida albicans
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<213> Secuencia Artificial
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\hfill36
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Claims (12)
1. Un polipéptido purificado que comprende la
secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO. 7, o una
secuencia que posee al menos 80% de identidad total de secuencia con
ella, polipéptido que posee actividad de
fosfomevalonato-quinasa (PMK).
2. Un polipéptido aislado de al menos 50
aminoácidos contiguos del polipéptido de la reivindicación 1.
3. Un anticuerpo específico para el polipéptido
de la reivindicación 1 ó 2.
4. Un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 3, que es un anticuerpo monoclonal.
5. Un polinucleótido purificado que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido
representado en SEQ ID NO. 7 o una secuencia que posee al menos 80%
de identidad total de secuencia con ella, polipéptido que posee
actividad de fosfomevalonato-quinasa (PMK).
6. Un polinucleótido purificado que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 2.
7. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido de la reivindicación 5.
8. Una célula hospedadora que contiene un vector
de expresión de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un método para producir el polipéptido de la
reivindicación 1, que comprende;
- (a)
- cultivar una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 8 en condiciones adecuadas para la expresión de dicho polipéptido, y
- (b)
- recuperar dicho polipéptido de la célula hospedadora o cultivo de células.
10. Uso del polipéptido de la reivindicación 1
en un ensayo para identificar compuestos que inhiben la actividad
de fosfomevalonato-quinasa (PMK).
11. Un método de identificación de compuestos
que modulan la actividad de PMK, que comprende;
- (a)
- poner en contacto un compuesto de test con un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, y
- (b)
- determinar el efecto que el compuesto de test tiene sobre la actividad del polipéptido.
12. Un método para detectar o diagnosticar la
presencia de Candida albicans en una muestra de test, que
comprende poner en contacto la muestra con una fuente capaz de
detectar un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos
representada en SEQ ID NO. 7 o una secuencia que posee al menos 80%
de identidad total de secuencia con ella, o una secuencia de ácido
nucleico que codifica el polipéptido representado en SEQ ID NO. 7 o
una secuencia que posee al menos 80% de identidad total de
secuencia con ella.
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