ES2284666T3 - Una enzima de citocromo p450 asociada con la sintesis de grupos delta-12-epoxi en acidos grasos de plantas. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de ácidos grasos delta- 12 epoxi en donde dicho polipéptido tiene al menos una identidad del 50% en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2; y (b) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende un complemento de la primera secuencia de nucleótidos.

Description

Una enzima de citocromo P450 asociada con la síntesis de grupos de \Delta^{12}-epoxi en ácidos grasos de plantas.

Campo de la invención

Esta invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular de las plantas. De forma más específica, esta invención pertenece a fragmentos de ácido nucleico que codifican una enzima del citocromo P450 que cataliza la síntesis de los grupos \Delta^{12}-epoxi en ácidos grasos de plantas y semillas. Los productos de esta enzima pueden incluir ácidos grasos epoxi tales como el ácido vernólico.

Antecedentes de la invención

Los ácidos grasos que tienen modificaciones químicas además de los dobles enlaces comunes se encuentran en los lípidos de reserva de muchas semillas aceitosas (R. C. Badami, y K. B. Patil (1981) Prog. Lipid Res. 19: 119-153). Algunas de estas modificaciones funcionalizan el ácido graso para producir productos que son útiles en aplicaciones industriales; esto está en oposición al uso más común de los lípidos derivados de plantas como alimentos. Son ejemplos de ello el uso del ácido graso hidroxilado ácido ricinoleico en lubricantes, y los ácidos grasos de longitud de cadena carbonada corta o media del aceite de palma en detergentes. En algunos casos, la composición de ácidos grasos de los lípidos de reserva de semillas aceitosas producidas en climas templados puede ser modificada mediante la adición de genes de fuentes exóticas de modo que se produzcan grandes cantidades de ácidos grasos únicos (J. B. Ohlrogge (1994) Plant Physiol. 104, 821-826).

La epoxidación se encuentra entre las modificaciones conocidas para almacenar ácidos grasos en las plantas. El ácido vernólico (ácido cis-12-epoxioctadeca-cis-9-enoico) es un ejemplo de un ácido graso epoxi encontrado en los aceites de semillas de especies tales como Vernonia galamensis y Euphorbia lagascae (M. Bafor y col., (1993) Arch. Biochem. Biophys 303: 145-151; y en la patente U.S. No. 5.846.784. El ácido vernólico puede componer hasta un 60% de los ácidos grasos de los aceites de las semillas de estas plantas. Los ácidos grasos tales como el ácido vernólico que contiene la modificación epoxi pueden tener uso como plastificantes, en aplicaciones de recubrimientos por reticulación, y en tintas de fijación de la impresión (R. E. Perdue, y col. (1986) Econ. Bot. 40: 54-68).

Los resultados de los estudios metabólicos previos indican que la actividad catalítica responsable de la introducción de la mitad \Delta^{12}-epoxi del ácido vernólico, encontrado en abundancia en las semillas de Euphorbia lagascae, está en la fracción de la membrana microsomal, lo más probable en el retículo endoplásmico (Bafor y col., supra). Este estudio sugiere que la actividad catalítica responsable de la formación de epóxido en esta planta es una enzima de la clase de la mono-oxigenasa del citocromo P450. Se han aislado los genes de Vernonia galamensis y de Crepis palaestina, y cuando se expresan en plantas o levaduras, las proteínas codificadas son capaces de convertir el ácido linoleico en ácido vernólico (Lee y col., (1998) Science 280: 915-918, y patente U.S. No. 5.846.784). Seither y col. (Physiology, Biochemistry and Molecular Biology of Plant Lipids, XX, XX, 1997, págs. 389-391) se refieren al aislamiento de los genes del citocromo P-450 de Vernonia galamensis.

La solicitud de patente WO 98/46762 se refiere a secuencias genéricas que codifican las enzimas de la \Delta^{12}-epoxigenasa del ácido graso que comprenden enzimas de mono-oxigenasa de función mixta. En particular, describe secuencias de cADN que codifican epoxigenasas de ácidos grasos de plantas, en particular la \Delta^{12}-epoxigensa de Crepis palaestina y homólogos, análogos y derivados de la misma, y dos enzimas de Euphorbia lagascae con actividad de epoxigenasa putativa. Sin embargo, las actividades de epoxigenasa de estas otras plantas que producen ácido vernólico han mostrado ser diferentes de la enzima Euphorbia lagascae. A diferencia de la enzima Euphorbia lagascae, estas enzimas están relacionadas con las desaturasas de ácidos grasos localizadas en el retículo endoplásmico (publicación de la solicitud de patente PCT No. WO 94/11516, publicada el 26 de Mayo de 1994). Aparentemente estas enzimas de epoxidación de ácidos grasos están relacionadas en secuencia a la clase de enzimas unidas a la membrana que son responsables de la desaturación del ácido graso y la hidroxilación del ácido graso (P. Broun y C. Somerville (1997) Plant Physiol 113: 933-942). Por consiguiente, hay dos clases distintas de genes que codifican las enzimas capaces de la formación del grupo epóxido del ácido vernólico, una que es dependiente del citocromo P450, y la otra que está relacionada con las desaturasas e hidroxilasas del ácido graso. Parece que la epoxigenasa responsable de la producción del ácido vernólico en las semillas que desarrollan E. lagascae es una nueva y por consiguiente proteína no caracterizada. El aislamiento y la caracterización de enzimas adicionales responsables de la producción de ácido graso \Delta^{12}-epoxidado ampliarán la capacidad de manipular ácidos grasos modificados en las plantas. Con el consiguiente trabajo esto servirá para producir de forma industrial aceites importantes en cultivos comercialmente importantes.

Resumen de la invención

La presente invención describe una enzima de la clase mono-oxigenasa del citocromo P450 que está codificada por un ácido nucleico aislado de una Euphorbia lagascae desarrollada de una biblioteca de cADN de semillas. Uno de los clones, eel1c.pk002.i4, cuando se expresa en levaduras o en plantas no relacionadas, es suficiente para producir nuevos ácidos grasos conteniendo nuevos epóxidos, tales como ácido vernólico. Esto se cree que es la primera caracterización de un polinucleótido de plantas que codifica una enzima de la clase del citocromo P450 capaz de producir ácidos grasos \Delta^{12}-epoxidados.

En una primera realización, un polinucleótido aislado de la invención reivindicada codifica un polipéptido que es una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de los ácidos grasos delta 12-epoxi en donde dicho polipéptido tiene al menos un 50% de identidad basado en el método Clustal de alineación cuando se comparó con un con un polipéptido de SEC ID No.: 2. En otro aspecto, esta invención también se refiere al complemento, en donde el complemento contiene el mismo número de nucleótidos que la secuencia de polinucleótido aislada y es complementaria en un 100% a la secuencia de polinucleótido aislada.

En una realización adicional, esta invención se refiere a una construcción quimérica que comprende el polinucleótido aislado de la presente invención que está unido de forma operable a al menos una secuencia reguladora adecuada.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una célula huésped aislada que comprende un gen quimérico de la presente invención o un polinucleótido aislado de la presente invención. La célula huésped puede ser eucariótica, tal como una levadura o una célula de planta, o procariótica, tal como una célula bacteriana.

En una realización adicional, la invención también se refiere a un método de selección de un polinucleótido que afecta el nivel de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en una célula huésped, el método que comprende las etapas de (a) preparar un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de la presente invención, (b) introducir el polinucleótido aislado en una célula huésped, y (c) determinar la presencia o ausencia de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en la célula huésped. Se cree que muchos organismos pueden servir como células huésped adecuadas. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, bacterias, levaduras, plantas, virus, y animales. Un polinucleótido aislado consiste en una secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1.

En una realización adicional, esta invención se refiere a un método de obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi que comprenden las etapas de: (a) sondar un cADN o biblioteca genómica con un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1 y un complemento de dichas secuencias de nucleótidos; (b) identificar un clon de ADN que hibrida con un polinucleótido aislado de (a) o complemento del mismo; (c) aislar el clon de ADN identificado; y (d) secuenciar el cADN o fragmento genómico que comprende el clon de ADN aislado.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método para la producción de ácido grasos \Delta^{12}-epoxi en una célula huésped que comprende, (a) la transformación de una célula huésped con la construcción quimérica de la presente invención, (b) el crecimiento de células huésped transformadas de la etapa (a), y (c) la determinación de la presencia o ausencia de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en las células transformadas de (b). Tal como se ha mencionado previamente, puede utilizarse cualquier célula huésped, siendo los huéspedes preferidos las bacterias, levaduras, o plantas.

Breve descripción de los dibujos y listado de secuencias

La invención puede ser totalmente entendida a partir de la siguiente descripción detallada y de los dibujos que la acompañan y los Listados de Secuencias forman una parte de esta solicitud.

La Figura 1 muestra una comparación de las secuencias de amino ácidos de la enzima de Euphorbia lagascae de la presente invención (SEC ID No.: 2) y de la enzima del citocromo P450 de la pimienta (Capsicum annuum) implicadas en la incompatibilidad fúngica.

La Figura 2 muestra el análisis de cromatografía de gas de los ésteres de metilo del ácido graso preparado a partir de células de S. cerevisiae que expresan el cADN de E. lagascae para EST eel1c.pk002.i4 en medios suplementados con ácido linoleico o ácido \alpha-linoleico. Los cromatogramas de gas en A y C muestran los ésteres de metilo de ácidos grasos de células de S. cerevisiae que contienen el vector de expresión sin el inserto de cADN y crecen en presencia de ácidos linoleico y \alpha-linoleico exógenos, respectivamente. Los cromatogramas de gases mostrados en B y D corresponden a ésteres de metilo de ácidos grasos de células de S. cerevisae que expresan el cADN de E. lagascae para EST eel1c.pk002.i4 en medios conteniendo ácidos linoleico y \alpha-linoleico, respectivamente. El cromatograma de gases en E corresponde a ésteres de metilo de ácido grasos preparados de semillas de E. lagascae. En base a los análisis de los espectros de masas que se muestran en la Figura 3, el pico señalado como "Epoxi1" en B es identificado como el éster metílico del ácido vernólico y el pico señalado como "Epoxi2" en D es identificado de forma tentativa como el éster metílico del ácido \Delta^{12}-epoxi-octadeca-9,15-dienoico. Los picos señalados con números corresponden a los ésteres metílicos de los siguientes ácidos grasos: pico 1, ácido palmítico (16:0); pico 2, ácido palmitoleico (16: 1\Delta^{9}); pico 3, ácido esteárico (18:0); pico 4, ácido oleico (18:1\Delta^{9}); pico 5, ácido linoleico (18:2\Delta^{9,12}); y pico 6, ácido \alpha-linoleico (18:3\Delta^{9,12,15}).

Figura 3. Espectros de masas de derivados de ésteres metílicos de ácido vernólico (A, B) y ácidos grasos epoxi de células de S. cerevisiae expresando el cADN de E. lagascae para EST eel1c.pk002.i4 en medios conteniendo ácido linoleico (C, D) o ácido \alpha-linoleico (E, F). Los ésteres metílicos de ácidos grasos se hicieron reaccionar en primer lugar en ácido sulfúrico metanólico, que genera un producto \Delta^{12}-hidroxi/ \Delta^{13}-metoxi y un producto \Delta^{13}-metoxi/\Delta^{12}-hidroxi de apertura del anillo epoxi. Los dos productos obtenidos de un éster metílico de ácido graso epoxi dado se convirtieron a continuación en derivados trimetilsililo (TMS) para producir los espectros de masas que se muestran en esta figura. Se obtuvieron los espectros de masas en A y B de derivados de ácido metil vernólico de semillas de E. lagascae. Los espectros de masas en C y D se obtuvieron de derivados de éster metílico del ácido graso identificado como "Epoxi1" en la Figura 2. Estos derivados se prepararon a partir de extractos de células de S. cerevisiae que expresan el cADN de E. lagascae para EST eel1c.pk002.i4 en medios conteniendo ácido linoleico. Se obtuvieron los espectros de masas en E y F a partir de derivados de éster metílico de ácido graso identificado como "Epoxi2" en la Figura 2. Estos derivados se prepararon a partir de extractos de células de S. cerevisiae que expresan el cADN de E. lagascae en medios que contienen ácido \alpha-linoleico. Tal como se ha indicado, estos espectros de masas son consistentes con los derivados de \Delta^{12}-epoxi-octadeca-9,15-dienoato.

Figura 4. Análisis de cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácidos grasos preparados a partir de callo de tabaco transformado con el vector de expresión (pART/35S) sólo (A) o con el vector de expresión que contiene la estructura de lectura abierta del cADN para EST eel1c.pk002.i4 bajo control del promotor del virus 35S del mosaico de la coliflor (B). En el Panel C se muestran los ésteres metílicos del ácido graso de las semillas de Euphorbia lagascae. Tal como se ha descrito en el Ejemplo 8, los picos en el panel B que son marcados como "Epoxi1" y "Epoxi2" corresponden a los ésteres metílicos del ácido vernólico y al \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}, respectivamente. Los picos marcados con asteriscos (*) corresponden al fitol. Otros picos marcados corresponden a los ésteres metílicos de los siguientes ácidos grasos: 16:0, ácido palmítico; 18:0, ácido esteárico; 18:1, ácido oleico; 18:2, ácido linoleico; 18:3, ácido \alpha-linoleico; 20:0, ácido eicosanoico; y 20:1, ácido eicosenoico.

Figura 5. Análisis de cromatografía de gases de ésteres metílicos de ácido graso preparado a partir de un embrión de haba de soja somática no transformada (A) y un embrión de haba de soja somática transgénica que expresa la \Delta^{12}-epoxigenasa del citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4 (B). En el Panel C se muestran ésteres de metilo de ácido graso de semillas de Euphorbia lagascae. Tal como se ha descrito en el Ejemplo 9, los picos en el panel B que están marcado como "Epoxi1" y "Epoxi2" corresponden a los ésteres metílicos del ácido vernólico y al \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,}15, respectivamente. Los picos marcados corresponden a ésteres de metilo de los siguientes ácidos grasos: 16:0, ácido palmítico; 18:0, ácido esteárico; 18:1, ácido oleico; 18:2, ácido linoleico; 18:3, ácido \alpha-linoleico.

La Tabla 1 lista los polipéptidos que se han descrito en la presente invención, la designación de los clones de cADN que comprenden los fragmentos de ácido nucleico que codifican los polipéptidos que representan toda o una parte sustancial de estos polipéptidos, y el correspondiente identificador (SEC ID No.:) tal como se ha utilizado en el Listado de Secuencia anexo.

TABLA 1 Una Enzima del Citocromo P450 Asociada con la Síntesis del Grupo Epoxi del Ácido Vernólico

1

Las SEC ID Nos: 4-7 adicionales representna los prímeros de la PCR útiles para la clonación de la región de codificación de la SEC ID No.: 1. Los detalles de la estrategia pueden ser encontrados en los Ejemplos 7 y 8.

El Listado de la Secuencia contiene el código de una letra para los caracteres de la secuencia de nucleótidos y los tres códigos de letras para los amino ácidos tal como se ha definido de conformidad con los estándares de la IUPAC-IUBMB descritos en Nucleic Acids Res 13: 3021-3030 (1985) y en el Biochemical J. 219 (No. 2): 345-373 (1984).

Descripción detallada de la invención

Los términos "grupo epoxi", "ácidos grasos epoxigenados", o "el producto de una epoxigenasa" hacen referencia todos ellos a la introducción de un puente epóxido (un átomo de oxígeno unido de forma covalente a los átomos de carbono que están unidos sucesivamente de forma covalente entre sí, para formar un anillo de tres miembros que es parte de una estructura molecular mayor) en el sitio del doble enlace en la cadena acilo de un ácido graso.

"Ácido vernólico" hace referencia al ácido graso ácido 12-epoxioctadeca-9cis-enoico que contiene dieciocho átomos de carbono, un doble enlace cis entre los átomos de carbono 9 y 10, y un grupo epoxi entre los átomos de carbono 12 y 13. El término "ácido graso \Delta^{12}-epoxi" hace referencia a un ácido graso tal como el ácido vernólico que contiene un grupo epoxi entre los átomos de carbono 12 y 13. El término "enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi" o "epoxigenasa de plantas" son utilizados de forma intercambiable y se pretende que definan una enzima que cataliza la inserción de un grupo epoxi en un doble enlace existente entre los átomos de carbono 12 y 13 de una cadena de ácido graso. Los sustratos para esta enzima pueden incluir ácidos linoleico y \alpha-linoleico, que pueden estar unidos a un lípido tal como la fosfatidilcolina. Los productos de esta enzima pueden incluir ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi tales como el ácido vernólico y el ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienoico. Dichos ácidos grasos modificados se encuentran en las semillas y aceites de un número limitado de plantas incluyendo la Euphorbia lagascae, Vernonia, y Crepis. De estas tres plantas se conoce que las especies de Vernonia, y Crepis utilizan una enzima divergente desaturasa o hidroxilasa para llevar a cabo la epoxidación (patente U.S. No. 5.846.784, solicitud de patente PCT WO 98/46762, publicada el 22 de Octubre de 1998). En la Euphorbia lagascae, la conversión de ácido linoleico en ácido vernólico se ha descrito que requiere una epoxigenasa dependiente del citocromo P450 (Bafor y col., (1993) Arch Bioch Biophys 303: 145-151).

Los términos "polinucleótido", "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de ácidos nucleicos", y "fragmento de ácido nucleico" / "fragmento de ácido nucleico aislado" son utilizados en la presente memoria de forma intercambiable. Estos términos incluyen las secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ARN o de ADN que es de única o doble hebra, que contiene de forma opcional bases de nucleótidos sintéticos, no naturales o alterados. Un polinucleótido en la forma de un polímero o ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de cADN, ADN genómico, ADN sintético, o mezclas de los mismos. Un polinucleótido aislado de la presente invención puede incluir al menos uno de los 30 nucleótidos contiguos, preferiblemente al menos uno de los 40 nucleótidos contiguos, más preferiblemente uno de los al menos 60 nucleótidos contiguos derivados de la SEC ID No.: 1, o el complemento de dichas secuencias.

Tal como se utiliza en la presente invención, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un polímero de ARN o de ADN que es de único o doble hebra, que contiene de forma opcional bases de nucleótidos sintéticos, no naturales o alterados. Un fragmento de ácido nucleico aislado en la forma de un polímero de ADN puede estar comprendido de uno o más segmentos de cADN, ADN genómico o ADN sintético. Se hace referencia a los nucleótidos (que normalmente se encuentran en su forma de 5'-monofosfato) por su designación por una única letra, del modo siguiente: "A" para el adenilato o deoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para el citidilato o deoxicitidilato, "G" para el guanilato o deoxiguanilato, "U" para el uridilato, "T" para el deoxitimidilato, "R" para las purinas (A o G), "Y" para las pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inopina, y "N" para cualquier nucleótido.

El término "recombinante" significa, por ejemplo, que una secuencia de ácido nucleico es preparada por una combinación artificial de dos segmentos separados de otro modo de secuencia, por ej., por síntesis química o por la manipulación de ácidos nucleicos aislados por técnicas de ingeniería genética.

Los términos "sub-fragmento que es funcionalmente equivalente" y "sub-fragmento funcionalmente equivalente" se utilizan en la presente memoria de forma intercambiable. Estos términos hacen referencia a una parte o sub-secuencia de un fragmento de ácido nucleico aislado en el que la capacidad para alterar la expresión del gen o producir un cierto fenotipo es retenida tanto si el fragmento o sub-fragmento codifica una enzima activa como si no lo hace. Por ejemplo, el fragmento o sub-fragmento puede ser utilizado en el diseño de construcciones quiméricas para producir el fenotipo deseado en una planta transformada. Las construcciones quiméricas pueden ser diseñadas para uso en la co-supresión o antisentido por unión a un fragmento de ácido nucleico o sub-fragmento del mismo, tanto si éste codifica una enzima activa como si no lo hace, en la orientación apropiada relativa a una secuencia promotor de la planta.

Los términos "homología", "homólogo", "substancialmente similar" y "sustancialmente correspondiente" se utilizan en la presente invención de forma intercambiable. Hacen referencia a fragmentos de ácido nucleico en los que los cambios en una o más bases de nucleótidos no afectan la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar la expresión del gen o producir un cierto fenotipo. Estos términos también se refieren a modificaciones de los fragmentos del ácido nucleico de la presente invención tales como la supresión o inserción de uno o más nucleótidos que no alteran de forma sustancial las propiedades funcionales del fragmento resultante de ácido nucleico en relación con el fragmento inicial, no modificado. Por consiguiente se entiende, y los expertos en la materia apreciarán, que la invención abarca más que las secuencias específicas de los ejemplos.

Los fragmentos de ácidos nucleicos sustancialmente similares pueden ser seleccionados por selección de fragmentos de ácido nucleico representando subfragmentos o modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, en donde uno o más nucleótidos están sustituidos, suprimidos y/o insertados, por su capacidad para afectar el nivel del polipéptido codificado por el fragmento de ácido nucleico no modificado en una planta o célula de planta. Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico sustancialmente similar que representa al menos uno de los 30 (preferiblemente 40, y más preferiblemente 60) nucleótidos contiguos derivados del fragmento de ácido nucleico presente puede ser construido e introducido en una planta o célula de planta. A continuación, el nivel del polipéptido codificado por el fragmento de ácido nucleico no modificado presente en una planta o célula de planta expuesta por el fragmento nucleico sustancialmente similar puede ser comparado al nivel del polipéptido en una planta o célula de planta que no está expuesta al fragmento de ácido nucleico sustancialmente similar.

Por ejemplo, es bien conocido en el estado de la técnica que la supresión antisentido y la co-supresión de la expresión del gen puede ser conseguida utilizando fragmentos de ácido nucleico que representan menos que la región entera que codifica un gen, y por utilización de fragmentos de ácido nucleico que no comparten la identidad de secuencia en un 100% con el gen a suprimir. Además, son bien conocidas en el estado de la técnica, las alteraciones en un fragmento de ácido nucleico que resultan en la producción de un amino ácido químicamente equivalente en un sitio dado, pero que no afectan las propiedades funcionales del polipéptido codificado. De este modo, un codón para el amino ácido alanina, un amino ácido hidrofóbico, puede ser sustituido por un codón que codifica otro residuo menos hidrofóbico, tal como la glicina, o un residuo más hidrofóbico, tal como la valina, leucina o isoleucina. De forma similar, también puede esperarse que los cambios que dan lugar a la sustitución de un residuo cargado negativamente por otro, tal como el ácido aspártico por el ácido glutámico, o un residuo cargado positivamente por otro, tal como la lisina por la arginina, produzcan un producto funcionalmente equivalente. Tampoco sería de esperar que los cambios de nucleótidos que dan lugar a la alteración de las partes del N-terminal y C-terminal de la molécula de polipéptido alteraran la actividad del polipéptido. Cada una de las modificaciones propuestas se encuentra dentro de la rutina del experto en la materia, así como la determinación de la retención de la actividad biológica de los productos codificados. De forma consecuente, un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos uno de 30 (preferiblemente al menos uno de 40, más preferiblemente al menos uno de 60) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1, y el complemento de dichas secuencias de nucleótidos puede ser utilizado en métodos de selección de un polinucleótido aislado que afecta la expresión de un polipéptido de epoxigenasa de planta en una célula huésped. Un método de selección de un polinucleótido aislado que afecta el nivel de expresión de un polipéptido en un virus o en una célula huésped (eucariótica, tal como planta o levadura, procariótica tal como bacteria) puede comprender las etapas de: construcción de un polinucleótido aislado de la presente invención o un gen quimérico aislado de la presente invención; introducción del polinucleótido aislado o del gen quimérico aislado en una célula huésped; medición del nivel de un polipéptido o actividad de la enzima en la célula huésped que contiene el polinucleótido aislado; y comparación del nivel de actividad de un polipéptido o enzima en la célula huésped conteniendo el polinucleótido aislado con el nivel de actividad de un polipéptido o enzima en una célula huésped que no contiene el polinucleótido aislado.

Además, el experto en la materia reconoce que las secuencias de ácido nucleico sustancialmente similares incluidas en esta invención son también definidas por su habilidad para hibridar, bajo condiciones moderadamente severas (por ejemplo, 0,5 X SSC, 0,1% de SDS, 60ºC) con las secuencias ejemplificadas en la presente memoria, o a cualquier parte de las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria y que son funcionalmente equivalentes al promotor de la invención. Las condiciones severas pueden ser ajustadas para seleccionar fragmentos moderadamente similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de los organismos más estrechamente relacionados. Los lavados post-hibridación determinan las condiciones de severidad. Un grupo de condiciones preferidas implica una serie de lavados que empiezan con 6 X SSC, 0,5% SDS a temperatura ambiente durante 15 min, a continuación repetición con 2 X SSC, 0,5% SDS a 45ºC durante 30 min, y a continuación dos repeticiones con 0,2 X SSC, 0,5% de SDS a 50ºC durante 30 min. Un grupo más preferido de condiciones severas implica el uso de mayores temperaturas en las que los lavados son idénticos a los anteriores excepto en cuanto a la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en 0,2 X SSC, 0,5% SDS que se incrementó a 60ºC. Otro grupo preferido de condiciones altamente severas implica el uso de dos lavados finales en 0,1 X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC.

Con respecto al grado de semejanza sustancial entre el mARN objetivo (endógeno) y la región de ARN en la construcción que tiene homología con el mARN objetivo, dichas secuencias deben tener una longitud de al menos 25 nucleótidos, preferiblemente al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, o 1500 nucleótidos en longitud; y deben ser al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idénticas.

Los fragmentos de ácido nucleico sustancialmente similares de la presente invención también pueden estar caracterizados por el porcentaje de identidad de las secuencias de amino ácidos que codifican las secuencias de amino ácidos descritas en la presente invención, tal como se determina por los algoritmos comúnmente utilizados por los expertos en la materia. Los fragmentos de ácido nucleico adecuados (polinucleótidos aislados de la presente invención) codifican polipéptidos que son al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idénticos a las secuencias de amino ácidos descritas en la misma. Se cree que cualquier porcentaje de identidad entero entre el 50% y el 100% sería adecuado para uso en la presente invención. Los fragmentos de ácido nucleico no sólo tienen las identidades anteriores sino que codifican de forma típica un polipéptido que tenga al menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, o 500 amino ácidos. Las alineaciones de secuencia y los cálculos del porcentaje de identidad se realizaron utilizando el programa Megalign del juego de computación de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Se realizó la alineación múltiple de las secuencias utilizando el método Clustal de alineación (Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153) con los parámetros omitidos (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Los parámetros omitidos para la alineaciones emparejadas utilizando el método Clustal fueron KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3,
WINDOW = 5 y DIAGONALS SAVED = 5.

Una "parte sustancial" de una secuencia de amino ácido o de nucleótido comprende una secuencia de amino ácidos o de nucleótidos que es suficiente para proporcionar una identificación putativa de la proteína o del gen que comprende la secuencia de amino ácidos o de nucleótidos. Las secuencia se amino ácidos y de nucleótidos pueden ser evaluadas tanto manualmente por un experto en la materia, o por utilización de la comparación de secuencias con una base computarizada y la identificación de herramientas que utilizan algoritmos tales como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y col. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). En general, una secuencia de diez o más amino ácidos contiguos o de treinta o más nucleótidos contiguos es necesaria con el fin de identificar de forma putativa una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homóloga a una proteína o gen conocidos. Además, con respecto a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas de genes que comprenden 30 o más nucleótidos contiguos pueden ser utilizadas en métodos dependientes de la secuencia de identificación de genes (por ej., hibridación Southern) e aislamiento (por ej., hibridación in situ de colonias bacterianas o de placas de bacteriófagos). Además, pueden utilizarse los oligonucleótidos cortos de 12 o más nucleótidos como prímeros de amplificación en PCR con el fin de obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los prímeros. De acuerdo con ello, una "parte sustancial" de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que proporcionará una identificación y/o aislamiento específicos de un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La inmediata especificación enseña las secuencias de amino ácidos y de nucleótidos que codifican los polipéptidos que comprenden una o más proteínas de plantas particulares. El experto en la materia, que tiene el beneficio de las secuencias tal como se describen en la presente memoria, puede utilizar ahora toda o una parte sustancial de las secuencias descritas para los objetivos de los expertos en la
materia.

"Degeneración del codón" hace referencia a la divergencia en el código génico que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de amino ácidos de un polipéptido codificado. De acuerdo con ello, la presente invención se refiere a cualquier fragmento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las secuencias de amino ácidos establecidas en la presente invención. El experto en la materia es bien consciente de la "tendencia del codón" mostrada por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar una amino ácido dado. Por consiguiente, cuando se sintetiza un fragmento de ácido nucleico para mejorar la expresión de una célula huésped, es deseable diseñar el fragmento de ácido nucleico de modo que su frecuencia de uso del codón se aproxime a la frecuencia del uso del codón preferido de la célula huésped.

Los "fragmentos de ácido nucleico sintético" pueden ser juntados a partir de bloques de construcción que son químicamente sintetizados utilizando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Estos bloques de construcción están ligados y templados para formar mayores fragmentos de ácidos nucleicos que entonces pueden ser juntados de forma enzimática para construir el fragmento entero de ácido nucleico deseado. "Químicamente sintetizado", relacionado con un fragmento de ácido nucleico, significa que los componentes de nucleótidos se reunieron in vitro. La síntesis química manual de fragmentos de ácidos nucleicos puede conseguirse utilizando procedimientos bien establecidos, o la síntesis química automatizada puede llevarse a cabo utilizando una de las diferentes máquinas comercialmente asequibles. De acuerdo con ello, los fragmentos de ácido nucleico pueden ser adaptados para la expresión óptima del gen en base a la optimización de la secuencia de nucleótidos para reflejar la tendencia del codón de la célula huésped. El experto en la materia apreciará la probabilidad de éxito de la expresión del gen si el uso del codón está predispuesto hacia aquellos codones favorecidos por el huésped. La determinación de los codones preferidos puede estar basada en una investigación de genes derivada de la célula huésped cuando la información de la secuencia esté disponible.

"Gen" hace referencia a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica, incluyendo las secuencias reguladoras precedentes (secuencias 5' no codificantes) y siguientes (secuencias 3' no codificantes) de la secuencia de codificación. "Gen nativo" hace referencia a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen endógeno" hace referencia a un gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo. Un "gen extraño" hace referencia a un gen que normalmente no se encuentra en el organismo huésped, pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia de gen. Genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que ha sido introducido en el genoma por un procedimiento de transformación.

"Secuencia de codificación" hace referencia a una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de amino ácidos específicos. "Secuencias reguladoras" hacen referencia a secuencias de nucleótidos localizadas contra corriente (secuencia 5' no codificantes), dentro de, o en el sentido de la corriente (secuencias 3' no codificantes) de una secuencia de codificación, y que influencian la transcripción, procesado o estabilidad del ARN, o traducción de la secuencia de codificación asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, transcripciones, secuencias del líder, intrones, y secuencias de reconocimiento de poliadenilación.

"Promotor" hace referencia a una secuencia de nucleótidos capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o ARN funcional. En general, una secuencia de codificación está localizada 3' a una secuencia del promotor. La secuencia de promotor consiste en elementos contra corriente proximales y más distales, los últimos elementos son a menudo referidos como intensificadores. De acuerdo con ello, un "intensificador" es una secuencia de nucleótidos que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para intensificar el nivel o especificidad del tejido de un promotor. Los promotores pueden ser derivados en su totalidad a partir de un gen nativo, o pueden estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza, o pueden incluso comprender segmentos de nucleótidos sintéticos. Se entiende por los expertos en la materia que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos de células, o en diferentes etapas del desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales. Los promotores que causan que un fragmento de ácido nucleico se exprese en la mayoría de tipos de células en la mayor parte del tiempo son normalmente referidos como "promotores constitutivos". Constantemente se están descubriendo nuevos promotores de varios tipos útiles en las células de las plantas; numerosos ejemplos pueden encontrarse en la compilación de Okamuro y Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15: 1-82. Se reconocerá además que, ya que en la mayoría de los casos no se han definido completamente los límites exactos de las secuencias reguladoras, fragmentos de ácidos nucleicos de diferentes longitudes pueden tener una actividad del promotor idéntica.

"Secuencia del líder de traducción" hace referencia a una secuencia de nucleótido localizada entre la secuencia de promotor de un gen y la secuencia de codificación. La secuencia líder de traducción está presente en el mARN contracorriente totalmente procesado de la secuencia de inicio de la traducción. La secuencia del líder de traducción puede afectar el procesado de la copia exacta primaria del mARN, la estabilidad del mARN o la eficiencia de la traducción. Se han descrito ejemplos de secuencias del líder de traducción (Turner y Foster (1995) Mol. Biotechnol. 3: 225-236).

Las "secuencias 3' no codificantes" hacen referencia a las secuencias de nucleótidos localizadas en el sentido de la corriente de una secuencia de codificación e incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias de codificación de señales reguladoras capaces de afectar el procesado de mARN o de la expresión del gen. Normalmente la señal de poliadenilación está caracterizada por afectar la adición de extensiones de ácido poliadenílico al terminal 3' del precursor de mARN. El uso de diferentes secuencias 3' no codificantes está ejemplificado por Ingelbrecht y col. (1989) Plant Cell 1: 671-680.

La "copia exacta del ARN" hace referencia al producto resultante de la transcripción catalizada por polimerasa de ARN de una secuencia de ADN. Cuando la copia exacta del ARN es una copia complementaria perfecta de la secuencia de ADN, se hace referencia a la misma como la copia exacta primaria o puede ser una secuencia de ARN derivada del procesado posttranscripcional de la copia exacta primaria y se hace referencia a la misma como ARN maduro. "ARN mensajero (mARN)" hace referencia al ARN que está sin intrones y que puede ser traducido en los polipéptidos por la célula. "cADN" hace referencia al ADN que es complementario a y derivado de un patrón de mARN. El cADN puede ser de hebra única o puede ser convertido en forma de doble hebra utilizando, por ejemplo, el fragmento Klenow de polimerasa I de ADN. "ARN con sentido" hace referencia a una copia exacta de ARN que incluye el mARN y de este modo puede ser traducida en un polipéptido por la célula. "ARN antisentido" hace referencia a una copia exacta de ARN que es complementaria para todo o parte de una copia exacta primaria objetivo o mARN y que bloquea la expresión de un gen objetivo (ver patente U.S. No. 5.107.065, que se incorpora a la presente memoria por referencia). La complementariedad de un ARN antisentido puede ser con cualquier parte de la secuencia de nucleótidos específica, es decir, en la secuencia de no codificación 5', la secuencia de no codificación 3', los intrones, o la secuencia de codificación. "ARN funcional" hace referencia al ARN con sentido, al ARN antisentido, al ARN de ribozima, o a otros ARN que pueden no ser traducidos pero que aún tienen un efecto en los procedimientos celulares. El término "complemento" y "complemento reverso" se utilizan en la presente invención de forma intercambiable con respecto a los transcritos de mARN, y pretenden definir el ARN antisentido del mensaje.

El término "unido de forma operable" hace referencia a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un fragmento de ácido nucleico único de modo que la función de uno esté regulada por el otro. Por ejemplo, un promotor es unido de forma operable con una secuencia de codificación cuando es capaz de regular la expresión de dicha secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden ser unidas de forma operable a las secuencias reguladoras en una orientación con sentido o antisentido. En otro ejemplo, las regiones de ARN complementario de la invención pueden ser unidas de forma operable, tanto directamente como de forma indirecta, 5' al mARN objetivo, o 3' al mARN objetivo, o dentro del mARN objetivo, o una primera región complementaria es 5' y su complemento es 3' al mARN objetivo.

El término "expresión", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la transcripción y a la acumulación estable de ARN con sentido (mARN) o antisentido derivado del fragmento de ácido nucleico de la invención. Expresión también puede hacer referencia a la traducción del mARN en un polipéptido. "Inhibición antisentido" hace referencia a la producción de copias exactas de ARN antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína objetivo. "Sobreexpresión" hace referencia a la producción de un producto de gen en organismos transgénicos que exceden los niveles de producción en organismos normales o no transformados. "Co-supresión" hace referencia a la producción de copias exactas de ARN con sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (patente U.S. No. 5.231.020).

Una "proteína" o "polipéptido" es una cadena de amino ácidos organizada en un determinado orden específico por la secuencia de codificación en un polinucleótido que codifica el polipéptido. Cada proteína o polipéptido tiene una función única.

"Niveles alterados" o "expresión alterada" hace referencia a la producción de producto(s) de gen en organismos transgénicos en cantidades o proporciones que difieren de las de los organismos normales o no transformados.

"Proteína madura" o el término "madura" cuando se utiliza en la descripción de una proteína hace referencia a un polipéptido procesado de modo post-traduccional, es decir, uno a partir del cual se haya eliminado cualquier pre- o propéptido presente en el producto de traducción primaria. "Proteína precursora" o el término "precursor" cuando se utiliza en la descripción de una proteína hace referencia al producto primario de traducción de mARN; es decir, con pre- y propéptidos todavía presentes. Los pre- y los pro-péptidos pueden ser, pero no están limitados a, señales de localización intracelular.

Un "péptido de tránsito de cloroplasto" es una secuencia de amino ácidos que es traducida en conjunción con una proteína y dirige la proteína al cloroplasto u otros tipos de plástidos presentes en la célula en la que se hace la proteína. "Secuencia de tránsito de cloroplasto" hace referencia a una secuencia de nucleótido que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto. Un "péptido señal" es una secuencia de amino ácidos que es traducida en conjunción con una proteína y dirige la proteína al sistema secretor (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant. Mol. Biol. 42: 21-53). Si la proteína va a ser dirigida a una vacuola, puede añadirse además una señal de dirección vacuolar (supra), o si va a ser dirigida al retículo endoplásmico, puede añadirse una señal de retención del retículo endoplásmico (supra). Si la proteína va a ser dirigida al núcleo, debe eliminarse cualquier péptido señal y en su lugar incluirse una señal de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632).

\newpage

"Transformación" hace referencia a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un organismo huésped, resultando en una herencia genéticamente estable. Los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados son referidos como organismos "transgénicos". Ejemplos de métodos de transformación de plantas incluyen la transformación mediada por Agrobacterium (De Blaere y col. (1987) Meth. Enzymol. 143: 277) y la tecnología de partículas aceleradas o de transformación "cañón de genes" (Klein y col. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73; Patente U.S. No. 4.945.050. De este modo, los polinucleótidos aislados de la presente invención pueden ser incorporados en construcciones recombinantes, típicamente construcciones de ADN, capaces de la introducción en y la replicación en una célula huésped. Dicha construcción puede ser un vector que incluye un sistema de replicación y secuencias que son capaces de transcripción y traducción de una secuencia que codifica un polipéptido en una célula huésped dada. Se han descrito un número de vectores adecuados para la transfección estable de células de plantas o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ej., Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academia Press, 1989; y Flevin y col., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. De forma típica, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes de plantas clonados bajo el control transcripcional de las secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador dominante seleccionable. Dichos vectores de expresión de plantas también pueden contener una región reguladora del promotor (por ej., una región reguladora que controla de forma inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o por el desarrollo, o expresión específica de la célula o del tejido), un sitio de comienzo del inicio de la transcripción, un sitio de unión del ribosoma, una señal de procesado del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y/o una señal de poliadenilación. Las técnicas de ADN recombinante estándar y de clonación molecular utilizadas en la presente invención son bien conocidas en el estado de la técnica y son descritas completamente en mayor detalle en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (de aquí en adelante "Maniatis").

La "PCR" o "reacción de la cadena de polimerasa" es bien conocida por los expertos en la material como una técnica utilizada para la amplificación de segmentos de ADN específicos (patentes U.S. Nos. 4.683.195 y U.S. 4.800.159).

Los términos "construcción recombinante", "construcción de expresión", "construcción de expresión recombinante", "construcción quimérica" y "gen quimérico" se utilizan de forma intercambiable en la presente invención. Dicha construcción puede ser ella misma o puede ser utilizada en conjunción con un vector. Si se utiliza un vector, entonces la selección del vector es dependiente del método que se utilizará para transformar las plantas huésped tal como es bien conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, puede utilizarse un vector plásmido. El experto en la materia sabe muy bien que los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector con el fin de transformar, seleccionar y propagar con éxito las células huésped que comprenden cualquiera de los fragmentos de ácido nucleico aislados de la invención. El experto en la materia también reconocerá que los diferentes sucesos de transformación independientes darán lugar a diferentes niveles y modelos de expresión (Jones y col., (1985) EMBO J. 4: 2411-2418; De Almeida y col., (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86), y de este modo que pueden seleccionarse múltiples sucesos con el fin de obtener líneas que muestren el nivel de expresión deseado y objetivo. Dicha selección puede conseguirse por análisis Southern de ADN, análisis Northern de la expresión de mARN, análisis Western de la expresión de la proteína, o análisis fenotípico.

La presente invención concierne a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en: (a) una primera secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido que es una enzima del citocromo P450 asociado con la síntesis de ácido grasos delta 12-epoxi en donde dicho polipéptido tiene al menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad en base al método Clustal de alineación cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2, o (b) una segunda secuencia de nucleótido que comprende el complemento de la primera secuencia de nucleótido.

De forma preferible, la primera secuencia de nucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada entre el grupo que consiste en la SEC ID No.: 1, que codifica para el polipéptido de SEC ID No.: 2.

La presente invención sugiere que la actividad catalítica responsable de la formación del grupo epoxi en la Euphorbia lagascae es una enzima de la clase mono-oxigenasa del citocromo P450. Se cree que no se ha caracterizado ninguno de los genes que codifican este tipo de actividad, antes de la presente solicitud. Se ha demostrado que las actividades de epoxigenasa de otras plantas que producen ácido vernólico es diferente de la enzima Euphorbia lagascae. Se han aislado los genes de Vernonia galamensis y de Crepis palaestina, y, cuando se expresan en plantas o levaduras, las proteínas codificadas son capaces de convertir el ácido linoleico en ácido vernólico (Lee y col. (1998) Science 280: 915-918, y Patente U.S. No. 5.846.784). A diferencia de la enzima de Euphorbia lagascae, estas enzimas no son dependientes del citocromo P450 pero en su lugar están relacionadas con las desaturasas de ácidos grasos localizadas en el retículo endoplásmico (publicación de la patente PCT No. WO 94/11516, publicada el 26 de Mayo de 1994). De forma aparente estas enzimas que epoxidan los ácidos grasos están relacionadas en secuencia con la clase de enzimas unidas a la membrana responsables de la desaturación de ácido grasos y la hidroxilación de ácido grasos (P. Broun y C. Somerville (1997) Plant Physiol 113: 933-942). Por consiguiente, hay dos clases distintas de genes que codifican enzimas capaces de formar un grupo \Delta^{12}-epoxi de ácido vernólico: uno que es dependiente del citocromo P450 y el otro que está relacionado con las desaturasas e hidroxilasas del ácido graso.

Se identificaron los clones para tres diferentes enzimas del citocromo P450 entre aproximadamente 1000 identificadores de secuencia totalmente expresados (ESTs) generados de una biblioteca de cADN de semillas desarrolladas de E. lagascae. Uno de los clones, eellc.pk002.i4, se expresó detrás de un promotor GALI en una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) que contiene una reductasa del citocromo P450 de planta integrada en su genoma, Se proporcionaron las células con ácido linoleico exógeno (18:2) que se cree que es el sustrato de ácido graso para la síntesis del ácido vernólico. En cultivos mantenidos a 28ºC, se detectó el ácido vernólico en cantidades de 1 al 5% en peso del total de ácido graso. Este ácido graso normalmente no es detectado en Saccharomyces cerevisiae. La presencia de ácido vernólico en células que expresan el eel1c.pk002.i4 se confirmó por análisis de GC-MS (espectroscopia de masas acoplada a cromatografía de gases) de los ésteres de metilo del ácido graso preparados por procedimientos de transesterificación tanto básica (metóxido sódico) como ácida (ácido sulfúrico/metanol). Este descubrimiento es consistente con la implicación de una enzima del citocromo P450 (correspondiente al eel1c.pk002.i4) en la síntesis de ácido vernólico en semillas de Euphorbia lagascae.

Se cree que esta es la primera caracterización de un gen de planta que codifica una enzima de la clase del citocromo P450 capaz de producir ácidos grasos \Delta^{12}-epoxidados.

Se han aislado e identificado los fragmentos de ácidos nucleicos que codifican al menos una parte de diferentes enzimas del citocromo P450 con la síntesis de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi de plantas por comparación al azar de secuencias de cADN de plantas de las bases de datos públicas que contienen secuencias de nucleótidos y de proteínas utilizando los algoritmos BLAST bien conocido por los expertos en la materia. Los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizados para aislar cADNs y genes que codifican proteínas homólogas de la misma o de otras especies de plantas. El aislamiento de genes homólogos utilizando protocolos dependientes de la secuencia es bien conocido en el estado de la técnica, Ejemplos de protocolos dependientes de la secuencia incluyen, pero no están limitados a, métodos de hibridación de ácido nucleico, y métodos de amplificación de ADN y ARN tal como se ha ejemplificado por diferentes usos de las tecnologías de amplificación de ácido nucleico (por ej., reacción de la cadena de polimerasa, reacción de la cadena de ligasa).

Por ejemplo, los genes que codifican otras epoxigenasas de plantas, así como los cADNs o ADNs genómicos, pueden ser aislados directamente por utilización de todos o una parte de los presentes fragmentos de ácido nucleico como sondas de hibridación de ADN para seleccionar bibliotecas de cualquier metodología deseada de utilización de plantas bien conocida por los expertos en la materia. Las sondas de oligonucleótidos específicas basadas en las presentes secuencias de ácido nucleico pueden ser designadas y sintetizadas por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (Maniatis). Además, puede utilizarse una secuencia entera directamente para sintetizar sondas de ADN por métodos conocidos por los expertos en la materia tales como marcaje del ARN del prímero al azar, traducción del pseudónimo, técnicas de marcaje terminal, o sondas de ARN utilizando sistemas de transcripción in vitro. Además, los prímeros específicos pueden ser designados y utilizados para amplificar una parte o todas las presentes secuencias. Los productos de amplificación resultantes pueden ser marcados directamente durante las reacciones de amplificación o marcados después de las reacciones de amplificación, y utilizados como sondas para aislar la longitud total de cADN o fragmentos genómicos bajo condiciones severas apropiadas.

Además, pueden utilizarse dos segmentos cortos de los fragmentos de ácido nucleico inmediatos en los protocolos de la reacción de la cadena de polimerasa para amplificar los fragmentos de ácido nucleico más largos que codifican los genes homólogos para el ADN o el ARN. La reacción de la cadena de polimerasa también puede llevarse a cabo en una biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonado en donde la secuencia de un prímero es derivada de los inmediatos fragmentos de ácido nucleico, y la secuencia de los otros prímeros tiene la ventaja de la presencia de los tractos de ácido poliadenílico en el terminal 3' del precursor de mARN que codifica los genes de las plantas. De forma alternativa, la segunda secuencia del prímero puede estar basada en las secuencias derivadas del vector de clonación. Por ejemplo, el experto en la materia puede seguir el protocolo RACE (Frohman y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-9002) para generar cADNs mediante la utilización de la PCR para amplificar copias de la región entre un punto único en la copia exacta y el terminal 3' o 5'. Los prímeros orientados en las direcciones 3' y 5' pueden ser designados de las presentes secuencias. Utilizando los sistemas disponibles 3' RACE o 5'RACE (BRL), pueden aislarse los fragmentos específicos de cADN 3' o 5' (Ohara y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5673-5677; Loh y col. (1989) Science 243: 217-220). Los productos generados por los procedimientos RACE 3' y 5' pueden ser combinados para generar cADNs de longitud completa (Frohman y Martin (1989) Techniques 1: 165). Consecuentemente, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos uno de 60 (preferiblemente uno de al menos 40, más preferiblemente uno de al menos 30) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1, y el complemento de dichas secuencias de nucleótidos puede ser utilizado en dichos métodos para obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte sustancial de una secuencia de amino ácidos de un polipéptido.

La especificación describe un método de obtención de un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte sustancial de un polipéptido de epoxigenasa de planta, preferiblemente una parte sustancial de un polipéptido de epoxigenasa de planta, que comprende las etapas de: sintetizar un prímero de oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de al menos uno de 60 (preferiblemente al menos uno de 40, más preferiblemente al menos uno de 30) nucleótidos contiguos derivados de una secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1, y el complemento de dichas secuencias de nucleótidos; y amplificación de un fragmento de ácido nucleico (preferiblemente un cADN insertado en un vector de clonación) utilizando el prímero del oligonucleótido. El fragmento de ácido nucleico amplificado codificará preferiblemente una parte de un polipéptido de epoxigenasa de plantas.

La disponibilidad del nucleótido inmediato y de las secuencias de amino ácidos deducidas facilita la selección inmunológica de las bibliotecas de expresión de cADN. Pueden sintetizarse los péptidos sintéticos que representan partes de las presentes secuencias de aminoácidos. Estos péptidos pueden ser utilizados para inmunizar animales para producir anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidad para péptidos o proteínas que comprenden las secuencias de amino ácidos. Estos anticuerpos pueden ser utilizados, entonces, para seleccionar bibliotecas de expresión de cADN para aislar clones de cADN de longitud completa de interés (Lerner (1984) Adv. Immunol. 36: 1-34; Maniatis).

En otra realización, esta invención se refiere a células huésped que comprenden tanto los genes quiméricos de la invención tal como se describen en la misma como un polinucleótido aislado de la invención tal como se describe en la misma. Ejemplos de células huésped que pueden ser utilizadas para practicar la invención incluyen, pero no están limitadas a, levaduras, bacterias, y plantas.

Tal como se ha señalado anteriormente, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizados para crear plantas transgénicas en la que los polipéptidos descritos están presentes a niveles mayores o menores de los normales o en tipos de células o estadios de desarrollo en los que normalmente no se encuentran. Esto tendrá el efecto de alterar el nivel de ácidos grasos que contienen los grupos epóxido en aquellas células.

La sobre-expresión de las proteínas de la presente invención puede conseguirse por construcción en primer lugar de un gen quimérico en el que la región de codificación está unida de forma operable a un promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en los tejidos deseados en el estado deseado de desarrollo. El gen quimérico puede comprender secuencias de promotor y secuencias del líder de traducción derivadas de los mismos genes. También pueden proporcionarse las secuencias de no codificación 3' que codifican señales de terminación de la transcripción. El presente gen quimérico también puede comprender uno o más intrones con el fin de facilitar la expresión del gen.

Pueden construirse los vectores de plásmido que comprenden el presente polinucleótido aislado (o gen quimérico). La selección del vector del plásmido es dependiente del método que será utilizado para transformar las células huésped. El experto en la materia sabe muy bien cuales son los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector del plásmido con el fin de transformar, seleccionar y propagar de forma exitosa las células huésped que contienen el gen quimérico. El experto en la materia también reconocerá que diferentes sucesos de transformación darán lugar a diferentes niveles y modelos de expresión (Jones y col. (1985) EMBO J 4: 2411-2418; De Almeida y col. (1989) Mol. Gen. Genetics 218: 78-86), y de este modo que deben seleccionarse múltiples sucesos con el fin de obtener líneas que desplacen el nivel y el modelo de expresión deseado. Dicha selección puede conseguirse por el análisis Southern de ADN, el análisis Northern de la expresión del mARN, el análisis Western de la expresión de la proteína, o el análisis fenotípico.

Para algunas aplicaciones puede ser útil dirigir el presente polipéptido a diferentes compartimientos celulares, o facilitar su secreción de la célula. De este modo se imagina que el gen quimérico descrito anteriormente puede ser adicionalmente suplementado por dirección de la secuencia de codificación para codificar el presente polipéptido con secuencias de dirección intracelular apropiadas (Keegstra (1989) Cell 56: 247-253), las secuencias de señal o las secuencias que codifican la localización del retículo endoplásmico (Chrispeels (1991) Ann. Rev. Plant Phys. Plant Mol. Biol. 42: 21-53), o las señales de localización nuclear (Raikhel (1992) Plant Phys. 100: 1627-1632) con o sin separación de las secuencias objetivo que ya están presentes. Aunque las referencias citadas dan ejemplos de cada uno de estos, la lista no es exhaustiva y en el futuro pueden descubrirse más señales objetivas de uso.

También puede ser deseable reducir o eliminar la expresión de genes que codifican los presentes polipéptidos en plantas para algunas aplicaciones. Con el fin de conseguir esto, puede construirse un gen quimérico diseñado para la co-supresión del presente polipéptido por unión de un gen o fragmento de gen que codifica dicho polipéptido a las secuencias del promotor de la planta. De forma alternativa, puede construirse un gen quimérico diseñado para expresar el ARN antisentido para todo o parte del presente fragmento de ácido nucleico por unión del gen o fragmento del gen en orientación reversa a las secuencias del promotor de la planta. Pueden introducirse tanto los genes quiméricos de co-supresión como antisentido en plantas por medio de transformación en donde la expresión de los correspondientes genes endógenos es reducida o eliminada.

Las soluciones genéticas moleculares para la generación de plantas con expresión del gen alterada tienen una decidida ventaja respecto las aproximaciones de reproducción de plantas tradicionales. Los cambios en los fenotipos de la planta pueden ser producidos por la expresión de inhibición específica de uno o más genes por inhibición antisentido o co-supresión (patentes U.S. Nos. 5.190.931, 5.107.065 y 5.283.323). Una construcción antisentido o de co-supresión actuará como un regulador negativo dominante de la actividad del gen. Aunque las mutaciones convencionales pueden dar lugar a una regulación negativa de la actividad del gen estos efectos son más probablemente recesivos. La regulación negativa dominante disponible con una aproximación transgénica puede ser ventajosa desde una perspectiva de reproducción. Además, la capacidad de restringir la expresión de un fenotipo específico a los tejidos reproductivos de la planta por el uso de promotores específicos de tejido puede conferir ventajas agronómicas relativas a las mutaciones convencionales que pueden tener un efecto en todos los tejidos en los que un gen mutante se expresa de forma ordinaria.

El experto en la materia conocerá que las consideraciones especiales están asociadas con el uso de tecnologías antisentido o de co-supresión con el fin de reducir la expresión de genes particulares. Por ejemplo, el nivel adecuado de expresión de los genes con sentido o antisentido puede requerir el uso de diferentes genes quiméricos utilizando diferentes elementos reguladores conocidos para el experto en la materia. Una vez se han obtenido las plantas transgénicas por uno de los métodos descritos anteriormente, será necesario seleccionar transgénicos individuales para aquellos que muestran de forma más efectiva el fenotipo deseado. De acuerdo con ello, el experto en la materia desarrollará métodos para la selección de un gran número de transformados. Se seleccionará, de forma general, la naturaleza de estas selecciones, sobre una base práctica. Por ejemplo, se puede seleccionar por observación de los cambios en la expresión del gen utilizando anticuerpos específicos para la proteína codificada por el gen a suprimir, o se pueden establecer ensayos que midan de forma específica la actividad de la enzima. Un método preferido será el que permita que grandes números de muestras puedas ser procesadas de forma rápida, ya que se esperaría que un gran número de transformantes sean negativos para el fenotipo deseado.

Puede producirse un polipéptido (o partes del mismo) en las células huésped heterólogas, de forma particular en las células de los huéspedes microbianos, y pueden ser utilizados para preparar anticuerpos de esta proteína por métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Los anticuerpos son útiles para la detección del polipéptido de la presente invención en células in situ o en extractos de células in vitro. Las células huésped heterólogas preferidas para la producción del presente polipéptido son huéspedes microbianos. Los sistemas de expresión microbianos y los vectores de expresión que contienen secuencias reguladoras que dirigen la expresión del nivel alto de las proteínas extrañas son bien conocidos por los expertos en la materia. Cualquiera de estos puede ser utilizado para construir un gen quimérico para la producción de un polipéptido. Este gen quimérico puede entonces ser introducido en microorganismos apropiados por medio de transformación para proporcionar expresión de nivel alto de los enzimas del citocromo P450 codificado asociado con la síntesis de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi de plantas. Se proporciona un ejemplo de un vector para la expresión de nivel alto del presente polipéptido en un huésped bacteriano (Ejemplo 6).

Todos o una parte sustancial de los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser utilizados como sondas para trazar un mapa genético y físico de los genes que son parte de, y utilizados como marcadores para los rasgos unidos por dichos genes. Dicha información puede ser útil en la reproducción de plantas con el fin de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Por ejemplo, los presentes fragmentos de ácido nucleico pueden ser utilizados como marcadores del polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP). Las manchas Southern (Maniatis) de ADN genómico de planta digerido por restricción puede ser sondado con los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención. Los modelos agrupados resultantes pueden ser sometidos, entonces a análisis genético utilizando programas de ordenador tales como MapMaker (Lander y col. (1987) Genomics 1: 174-181) con el fin de construir un mapa genético. Además, los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención pueden ser utilizados para sondar las manchas Southern que contienen los ADNs genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un grupo de individuos que representan el origen y la progenie de un cruce genético definido. Es célebre la segregación de los polimorfismos de ADN y se utilizan para calcular la posición de la secuencia de ácido nucleico presente en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botsein y col. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32: 314-331).

La producción y el uso de las sondas derivadas de genes de plantas para uso en el trazado de mapas genéticos está descrito en Bernatzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reportes 4: 37-41. Numerosas publicaciones describen los mapas genéticos de clones de cADN específicos utilizando la metodología señalada anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, las poblaciones de inter-cruces F2, las poblaciones de retro-cruces, las poblaciones apareadas al azar, las líneas isogénicas próximas, y otros grupos de individuos pueden ser utilizados para el mapa. Tales métodos son bien conocidos por un experto en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico derivadas de las secuencias de acido nucleico de la invención también pueden utilizarse para un mapa físico (es decir, la situación de secuencias en mapas físicos; ver Hoheisel y col. en: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, págs. 319-346, y referencias citadas en el mismo).

Las sondas de ácido nucleico derivadas de las presentes secuencias de ácido nucleico pueden ser utilizadas en el mapa de hibridación de fluorescencia directa in situ (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7: 149-154). Aunque los métodos actuales de de trazado de mapas FISH favorecen el uso de grandes clones (varios a varios cientos KB; ver Laan y col. (1995) Genome Res. 5: 13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización de mapas FISH utilizando sondas más cortas.

Puede llevarse a cabo una variedad de métodos basados en la amplificación de ácido nucleico de trazado de mapas genético y físico utilizando las presentes secuencias de ácidos nucleicos. Ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11: 95-96), el polimorfismo de fragmentos amplificados de la PCR (CAPS; Sheffield y col. (1993) Genomics 16: 325-332), unión específica del alelo (Landegren y col. (1988) Science 241: 1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18: 3671), trazado de mapas de híbridos de radiación (Walter y col. (1997) Nat. Genet. 7: 22-28) y trazado de mapas Happy (Dear y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un fragmento de ácido nucleico para diseñar y producir pares de prímeros para uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión del prímero. El diseño de dichos prímeros es bien conocido por los expertos en la materia. En los métodos que utilizan el trazado de mapas genéticos basados en la PCR, puede ser necesario identificar las diferencias de secuencias de ADN entre los orígenes del cruce del mapa en la región correspondiente a la presente secuencia de ácido nucleico. Sin embargo, esto no es generalmente necesario para los métodos de trazado de mapas.

En una realización adicional, la presente invención hace referencia a un método de selección de un polinucleótido aislado que afecta el nivel de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en una célula huésped adecuada, comprendiendo el método las etapas de, (a) hacer un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótido de la presente invención, (b) introducir el polinucleótido aislado en una célula huésped adecuada y (c) determinar la presencia o ausencia de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en la células huésped de (b).

En todavía otra realización, la presente invención se refiere a un método para la producción de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en una célula huésped adecuada que comprende, (a) la transformación de una célula huésped adecuada con la construcción quimérica de la presente invención, (b) crecimiento de las células huésped transformadas de la etapa (a), y (c) determinación de la presencia o ausencia de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi en las células transformadas de (b).

Ejemplos

La presente invención se define además en los Ejemplos siguientes, en los que las partes y los porcentajes son en peso y los grados son Celsius, a no ser que se establezca de otro modo. Debe entenderse que estos Ejemplos, aunque indican las realizaciones preferidas de la invención, se dan solo por vía de ilustración. De la anterior discusión y de estos Ejemplos un experto en la materia puede establecer las características esenciales de esta invención, y sin desviarse del espíritu y del alcance de la misma, puede hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla para diferentes usos y condiciones. De este modo, varias modificaciones de la invención además de los que se muestran y describen en la misma se harán aparentes para los expertos en la materia a partir de la siguiente descripción.

Ejemplo 1 Composición de Bibliotecas de cADN: Aislamiento y Secuenciación de Clones de cADN

Se preparó una biblioteca de cADN representando mARNs a partir de semillas de Euphorbia lagascae. A continuación se describen las características de la biblioteca.

TABLA 2 Biblioteca de cADN de Euphorbia lagascae

2

Las bibliotecas de cADN pueden ser preparadas por uno de los muchos métodos disponibles. Por ejemplo, los cADNs pueden ser introducidos en vectores de plásmidos por preparación en primer lugar de bibliotecas de cADN en vectores Uni-ZAP^{R}XR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Las bibliotecas de Uni-ZAP^{R}XR son convertidas en bibliotecas de plásmidos de acuerdo con el protocolo proporcionado por Stratagene. Con la conversión, los insertos de cADN estarán contenidos en el vector del plásmido pBluescript. Además, los cADNs pueden ser introducidos directamente en los vectores Bluescript II SK (+) precortados (Stratagene) utilizando la ligasa de T4 ADN (New England Biolabs), seguido por transfección en células DH10B de acuerdo con el protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products). Una vez los insertos de cADN están en los vectores del plásmido, los ADNs del plásmido son preparados de colonias bacterianas elegidas al azar conteniendo plásmidos pBluescript recombinantes, o las secuencias de cADN del inserto son amplificadas a través de la reacción de la cadena de polimerasa utilizando prímeros específicos para las secuencias del vector que flanquean las secuencias de cADN insertado. Los ADNs del inserto amplificados o los ADNs del plásmido son secuenciados en reacciones de secuenciación del prímero teñido para generar secuencias de cADN parcial (identificadores de la secuencia expresada o "ESTs"; ver Adams y col., (1991) Science 252: 1651-1656). Los ESTs resultantes son analizados utilizando un secuenciador de fluorescencia Perkin Elmer Modelo 377.

Los datos de la secuencia de inserto completo (FIS) son generados utilizando un protocolo de transposición modificado. Los clones identificados por la FIS son recuperados de reservas de glicerol archivadas como colonias únicas, y los ADNs de plásmido son aislados por lisis alcalina. Se hacen reaccionar los patrones de ADN aislados con los oligonucleótidos de vector cebado M13 delantero y reverso en una reacción de secuenciación basada en la PCR y cargado en secuenciadores automáticos. La confirmación de la identificación de los clones se lleva a cabo por alineación a la secuencia EST original a partir de la que se hace el requerimiento de la FIS.

Los patrones confirmados son transpuestos por medio del kit de transposición Primer Island (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) que está basado en el elemento transpuesto de Saccharomyces cerevisiae Tyl (Devine y Boeke (1994) Nucleic Acids Res. 22: 3765-3772). El sistema de transposición in vitro coloca sitios de unión únicos al azar en toda la población de las grandes moléculas de ADN. A continuación el ADN transpuesto es utilizado para transformar las células electro-competentes de DH10B (Gibco BRL/Life Technologies, Rockville, MD) via electrofiltración. El elemento que puede transponerse contiene un marcador seleccionable adicional (llamado DHFR; Fling y Richards (1983) Nucleic Acids Res. 11: 5147-5158), permitiendo una selección dual en placas de agar de sólo aquellos subclones que contienen el transposón integrado. Se seleccionan al azar múltiples subclones de cada reacción de transposición, se prepararon los ADNs de plásmido por medio de la lisis alcalina, y se secuenciaron los patrones (mezcla ABI Prism exterminador de tinte Ready Reaction) hacia fuera del sitio del suceso de transposición, utilizando prímeros únicos específicos a los sitios de unión en el transposón.

Se recogieron los datos de la secuencia (ABI Prism Collections) y se reunieron utilizando Phred/Phrap (P. Green, Universidad de Washington, Seattle). Phred/Phrap es un programa de software de dominio público que re-lee los datos de la secuencia de ABI, re-llama las bases, asigna valores de calidad, y escribe las células de base y los valores de calidad en archivos de producción editables. El programa de montaje de la secuencia Phrap utiliza valores de calidad para incrementar la exactitud de los contigs de secuencia reunidos. Los montajes se vieron mediante el editor de secuencias Consed (D. Gordon, Universidad de Washington, Seattle).

Ejemplo 2 Identificación de los Clones de cADN

Se identificaron los clones de cADN que codifican las enzimas del citocromo P450 asociados con la síntesis de los ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi de plantas por realización del BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul y col. (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; ver también www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) que busca la semejanza de las secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (comprendiendo todas las traducciones GenBank CDS no redundantes, secuencias derivadas de la estructura de 3-dimensiones Brookhaven Protein Data Bank, la última liberación mayor de las bases de datos de secuencias de proteínas SWISS-PROT, EMBL, y las bases de datos DDBJ). Se analizaron las secuencias de cADN obtenidas en el Ejemplo 1 para determinar la semejanza de todas las secuencias de ADN públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN proporcionado por el National Center for Biotechnology Information (NCBI). Se tradujeron las secuencias de ADN en todas las estructuras de lectura y se compararon para determinar la semejanza a todas las secuencias de proteína disponibles públicamente contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish y Status (1993) Nat. Genet. 3: 266-272) proporcionada por el NCBI. Por comodidad, el valor de P (probabilidad) de observar una combinación de una secuencia de cADN a una secuencia contenida en las bases de datos investigadas simplemente por casualidad tal como se calcularon por BLAST se describen en la presente invención como valores de "pLog", que representa el negativo del logaritmo del valor de P descrito. De acuerdo con ello, cuanto mayor sea el valor de pLog, mayor es la probabilidad de que la secuencia de cADN y el "hit" de BLAST representan las proteínas homólogas.

Se compararon los ESTs presentados para análisis con las bases de datos de genbank tal como se describieron anteriormente. Los ESTs que contienen secuencias más 5- o 3-primo pueden encontrarse utilizando el algoritmo de BLASTn (Altschul y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) frente a la base de datos registrada por Du Pont comparando secuencias de nucleótidos que compartes regiones comunes o de solapamiento de homología de secuencia. Cuando las secuencias comunes o de solapamiento existen entre dos o más fragmentos de ácido nucleico, las secuencias pueden ser reunidas en una secuencia de nucleótidos contiguos, extendiendo de este modo el fragmento original tanto en la dirección 5- o 3- primo. Una vez e identificó el EST más 5-primo, puede determinarse su secuencia completa por secuenciación Full Insert tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Pueden encontrarse genes homólogos que pertenecen a especies diferentes por comparación de la secuencia de amino ácidos de un gen conocido (tanto de una fuente registrada como una base de datos pública) frente una base de datos EST utilizando el algoritmo tBLASTn. El algoritmo tBLASTn busca un amino ácido desconocido frente a una base de datos de nucleótidos que es traducida en todas las 6 estructuras de lectura. Esta investigación permite encontrar las diferencias en el codón de nucleótidos utilizado entre las diferentes especies, y para la degeneración del codón.

Ejemplo 3 Caracterización de los Clones de cADN que Codifica las Epoxigenasas de Plantas

La búsqueda de BLASTX utilizando las secuencias EST de los clones listados en la Tabla 3 reveló semejanza de los polipéptidos codificados por los cADNs a un polipéptido conteniendo heme- citocromo P450 implicado en las interacciones de incompatibilidad fúngica de la pimienta (Capsium annuum NCBI Identificador General No. gi 6739506). En la Tabla 3 se muestran los resultados BLAST de la secuencia del inserto de cADN entero que comprende el clon de cADN indicado ("FIS"), que también comprende la secuencia del gen completa para una epoxigenasa de Euphorbia:

TABLA 3 Resultados de BLASY para las Secuencias que Codifican Polipéptidos con Actividad Epoxigenasa de Plantas

3

La Figura 1 presenta una alineación de la secuencia de amino ácidos establecida en la SEC ID No.: 2 y la secuencia de la pimienta (SEC ID No.: 3). Los datos en la Tabla 4 representan un cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de amino ácidos establecidas en la SEC ID No.: 2 y la secuencia de la pimienta (Capsium annuum) (SEC ID No.: 3).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Porcentaje de Identidad de las Secuencias de Amino ácidos Deducido de las Secuencias de Nucleótidos de los Clones de cADN que Codifican Polipéptidos con Actividad Epoxigenasa de Planta

4

Se llevaron a cabo las alineaciones de secuencia y los cálculos del porcentaje de identidad utilizando el programa Megalign del paquete de aplicaciones integrado bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc, Madison, WI). La alineación múltiple de las secuencias se llevó a cabo utilizando el método de alineación de Clustal (Higgins y Sharp (1989) CABIOS 5: 151-153) con los parámetros por defecto (GAP PENALTY = 10, GAP LENGTH PENALTY = 10). Los parámetros por defecto para las alineaciones apareadas utilizando el método Clustal fueron KTUPLE 1, GAP PENALTY = 3, WINDOW = 5 y DIAGONALS SAVED = 5. Las alineaciones de secuencia y las puntuaciones y probabilidades BLAST indican que los fragmentos de ácido nucleico comprenden los clones de cADN presentes que codifican una parte sustancial de una epoxigenasa de plantas. Estas secuencias representan las primeras secuencias del citocromo P450 que codifica una enzima asociada con la formación del grupo \Delta^{12} epoxi en plantas conocidas por el Solicitante.

Ejemplo 4 Expresión de los Genes Quiméricos en Células Monocot

Puede construirse un gen quimérico que comprende el cADN que codifica el presente polipéptido en orientación en el mismo sentido con respecto al promotor de maíz de 27kD que está localizado en 5' respecto al fragmento de cADN, y el 3' de maíz de 10 kD que está localizado en 3' respecto al fragmento de cADN. El fragmento de cADN de este gen puede ser generado por la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) del clon de cADN utilizando apropiados prímeros de oligonucleótidos. Los sitios de clonación (NcoI o SmaI) pueden ser incorporados en los oligonucleótidos para proporcionar una adecuada orientación del fragmento de ADN cuando se inserta en el vector digerido pML103 tal como se describe más adelante. A continuación se lleva a cabo la amplificación en una PCR estándar. A continuación el ADN amplificado es digerido con las enzimas de restricción NcoI y SmaI y fraccionado en un gel de agarosa. Puede aislarse la banda adecuada del gel y combinarse con un fragmento de 4,9 kb de NcoI-SmaI del plásmido pML103. El plásmido pML103 ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest a ATCC (American Type Culture Collection, 10801 Universidad Blvd., Manassas, VA 20110-2209), y tiene el número de acceso ATCC 97366. El segmento de ADN del pML103 contiene un fragmento promotor SaII-NcoI de 1,05 kb del gen de maíz de 27 kD y un fragmento SmaI-SaII de 0,96 kb de la terminación 3' del gen de maíz de 10 kD en el vector pGem9Zf(+) (Promega). El vector y el inserto de ADN pueden ser ligados a 15ºC durante toda la noche, esencialmente tal como ha sido descrito (Maniatis). A continuación el gen ligado puede ser utilizado para transformar el XL1-Blue de E. coli (Epicurian Coli XL-1 Blue^{R}, Stratagene). Los transformantes bacterianos pueden ser seleccionados por digestión de la enzima de restricción del ADN del plásmido y limitado el análisis de la secuencia de nucleótidos utilizando el método de terminación de la cadena dideoxi (kit de secuenciación de ADN de Sequenase^{R}; U.S. Biochemical). La construcción del plásmido resultante comprende un gen quimérico que codifica, en la dirección 5' a 3', el promotor de maíz de 27 kD, un fragmento de cADN que codifica el presente polipéptido, y la región 3' del maíz de 10 kD.

El gen quimérico descrito anteriormente puede entonces ser introducido en células de maíz por el procedimiento siguiente. Los embriones de maíz no maduros pueden ser diseccionados de las cariopses en desarrollo derivadas de cruces de las líneas H99 y LH132 de maíz innatas. Se aislaron los embriones entre 10 y 11 días después de la polinización cuando tenían entre 1,0 y 1,5 mm de largo. A continuación los embriones fueron situados con el lado del eje hacia abajo y en contacto con el medio N6 solidificado en agarosa (Chu y col. (1975) Sci. Sin. Peking 18: 659-668). Los embriones se mantuvieron en la oscuridad a 27ºC. El callo embriogénico friable que consiste en masas no diferenciadas de células con terminales de pro-embrioides y embrioides somáticos en estructuras del suspensor que proliferan del escutelo de estos embriones no maduros. El callo embriogénico aislado de explante primario puede ser cultivado en un medio N6 y sub-cultivado en este medio cada 2 o 3 semanas.

El plásmido, p35S/Ac (obtenido del Dr. Meter Eckes, Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) puede ser utilizado en experimentos de transformación con el fin de proporcionar un marcador seleccionable. Este plásmido contiene el gen Pat (ver la publicación de la patente europea 0 242 236) que codifica la fosfinotricin acetil transferasa (PAT). La enzima PAT confiere resistencia a los inhibidores herbicidas de la glutamina sintetasa tales como la fosfinotricina. El gen Pat en p35S/Ac está bajo el control del promotor 35S del Virus Mosaico de la coliflor (Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812) y la región 3' del gen de la nopalina sintasa a partir del T-ADN del plásmido Ti del Agrobacterium tumefaciens.

El método del bombardeo de partículas (Klein y col. (1987) Nature 327: 70-73) puede ser utilizado para transferir genes a las células de cultivo del callo. De acuerdo con este método, se recubren partículas de oro (1 \mum de diámetro) con ADN utilizando la técnica siguiente. Diez \mug de ADNs de plásmido se añadieron a 50 \muL de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mL). Se añadieron a las partículas cloruro de calcio (50 \muL de una solución 2,5 M) y spermidina base libre (20 \muL de una solución 1,0 M). La suspensión se agitó durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugaron brevemente (5 seg a 15.000 rpm) y se eliminó el sobrenadante. El etanol se separó de nuevo y las partículas se volvieron a suspender en un volumen final de 30 \muL de etanol. Puede colocarse una alícuota (5 \muL= de las partículas de oro recubiertas de ADN en el centro de un disco de vuelo Kapton^{R} (Bio-Rad Labs). A continuación se aceleraron las partículas en el tejido del maíz con un PDS-1000/He de Biolistic^{R} (Bio-rad Instruments, hercules CA), utilizando una presión de helio de 1000 psi, una distancia de intervalo de 0,5 cm y una distancia de vuelo de 1,0 cm.

Para el bombardeo, se colocó el tejido embriogénico en un papel de filtro sobre un medio N6 de agarosa solidificada. Se distribuyó el tejido como una capa fina y se cubrió un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La cápsula petri conteniendo el tejido puede situarse en la cámara del PDS-1000/He aproximadamente a 8 cm de la pantalla de parada. A continuación se evacuó el aire de la cámara a un vacío de 28 pulgadas de Hg. Se aceleró el macrosoporte con una reserva de helio utilizando una membrana de ruptura que estalla cuando la presión de He en el tubo de reserva alcanza los 1000 psi.

Siete días después del bombardeo el tejido puede ser transferido a un medio N6 que contiene glufosinato (2 mg por litro)y que no tiene caseína ni prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de un periodo adicional de 2 semanas el tejido puede ser transferido a un medio N6 recién preparado conteniendo glufosinato. Después de 6 semanas, pueden identificarse áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro del callo de crecimiento activo en algunas de las placas conteniendo el medio suplementado con glufosinato. Estos callos pueden continuar creciendo cuando se hace un sub-cultivo en el medio selectivo.

Las plantas pueden ser regeneradas a partir del callo transgénico por transferencia en primer lugar de agrupaciones de tejido a un medio N6 suplementado con 0,2 mg por litro de 2,4-D. después de dos semanas el tejido puede ser transferido al medio de regeneración (Fromm y col., (1990) Bio/Technology 8: 833-839).

Ejemplo 5 Expresión de los Genes Quiméricos en Células Dicot

Puede utilizarse un casete de expresión específico de las semillas compuesto del promotor y del finalizador de transcripción a partir del gen que codifica la subunidad \beta de la proteína de reserva de las semillas faseolina a partir del haba Phaseolus vulgaris (Doyle y col. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228-9238) para la expresión del presente polipéptido en las habas de soja transformadas. La casete de faseolina incluye aproximadamente 500 nucleótidos aguas arriba (5') del codón del inicio de traducción y aproximadamente 1650 nucleótidos aguas abajo (3') del codón de parada de la traducción de la faseolina. Entre las regiones 5' y 3' están los sitios de la endonucleasa de restricción única NcoI (que incluye el codón de inicio de la traducción ATG), Sma I, Kpn I y Xba I. El casete entero está flanqueado por los sitios Hind III.

El fragmento de cADN de este gen puede ser generado por la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) del clor de cADN utilizando apropiados prímeros de oligonucleótidos. Los sitios de clonación pueden ser incorporados en los oligonucleótidos para proporcionar una orientación adecuada del fragmento de ADN cuando se inserta en el vector de expresión. A continuación se lleva a cabo la amplificación tal como se ha descrito anteriormente, y el fragmento aislado es insertado en un vector pUC18 que lleva el casete de expresión de la semilla.

\newpage

Los embriones de habas de soja pueden entonces ser transformados con el vector de expresión que comprende las secuencias que codifican el presente polipéptido. Para inducir embriones somáticos, cotiledones, de 3-5 mm de longitud diseccionados de la superficie esterilizada, pueden cultivarse semillas no maduras de cultivos de habas de soja A2872, en luz o en oscuridad a 26ºC en un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios son entonces escindidos y situados en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida de agrupaciones de embriones somáticos que se multiplican como embriones de estadio temprano, globular, las suspensiones se mantuvieron tal como se describe a continuación.

Los cultivos de la suspensión embriogénica de habas de soja pueden mantenerse en 35 ml de un medio líquido en un agitador rotatorio, a 150 rpm, a 26ºC con luz fluorescente en un ciclo de 16:8 horas días/noche. Los cultivos fueron sub-cultivados cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de un medio líquido.

Los cultivos de las suspensiones embriogénicas de habas de soja pueden ser transformados a continuación por el método de bombardeo por disparo de partículas (Klein y col. (1987) Nature (Londres) 327: 70-73, patente U.S. No. 4.945.050). Para estas transformaciones puede utilizarse un instrumento DuPont Biolisitc^{R} PDS1000/HE (retroalimentación de helio).

Un gen marcador seleccionable que puede ser utilizado para facilitar la transformación de las habas de soja es un gen quimérico compuesto del promotor 35S del Virus Mosaico de la Coliflor (Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812), el gen higromicin fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz y col. (1983) Gene 25: 179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintasa del T-ADN del plásmido Ti del Agrobacterium tumefaciens. El casete de expresión de la semilla que comprende la región 5' de la faseolina, el fragmento que codifica el presente polipéptido y la región 3' de la faseolina puede ser aislado como un fragmento de restricción. Este fragmento puede entonces ser insertado en un único sitio de restricción del vector que lleva el gen marcador.

Se añadieron a 50 \muL de una suspensión de 60 mg/mL de partículas de oro de 1 \mum (en este orden): 5 \muL de ADN (1 \mug/\muL), 20 \muL de espermidina (0,1 M), y 50 \muL de CaCl_{2} (2,5 M). A continuación se agitó la preparación de partículas durante tres minutos, se centrifugó en una microfuga durante 10 segundos y se separó el sobrenadante. A continuación se lavaron las partículas recubiertas de ADN una vez en 400 \muL de etanol al 70% y se suspendieron de nuevo en 40 \muL de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas puede ser sonicada tres veces durante un segundo cada vez. A continuación se cargaron cinco \muL de partículas de oro recubiertas de ADN en cada disco de macro soporte.

Se colocaron aproximadamente 300-400 mg del cultivo de la suspensión de preparada dos semanas antes en una placa de petri vacía de 60 x 15 mm y se eliminó el líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardearon aproximadamente 5-10 placas de tejido. Se estableció una presión de ruptura de la membrana a 1100 psi y se evacuó la cámara a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. Se colocó el tejido aproximadamente a 3,5 pulgadas de la pantalla de retención y se bombardeó tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede ser dividido por la mitad y colocado de nuevo en el líquido y cultivado tal como se ha descrito anteriormente.

Entre cinco y siete días después del bombardeo, se intercambiaron los medios líquidos con medios recién preparados, y entre once y doce días después del bombardeo con medios frescos conteniendo 50 mg/mL de higromicina. Estos medios selectivos pueden ser preparados de nuevo cada semana. Entre siete y ocho semanas después del bombardeo, puede observarse tejido verde, transformado, en crecimiento a partir del las agrupaciones embriogénicas, necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado es separado e inoculado en frascos individuales para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos, trasformados, propagados de forma clónica. Cada nueva línea puede ser tratada como un suceso de transformación independiente. Estas suspensiones pueden ser subcultivadas y mantenidas como agrupaciones de embriones inmaduros o regeneradas en plantas enteras por maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Ejemplo 6 Expresión de los Genes Quiméricos en Células Microbianas

Los cADNs que codifican el presente polipéptido pueden ser insertados en el vector de expresión de la T7 E. coli pBT430. Este vector es un derivado de pET-3a (Rosenberg y col. (1987) Gene 56: 125-135) que utiliza el sistema polimerasa del T7 ARN del bacteriófago / promotor T7. Se construyó el plásmido pBT430 por destrucción en primer lugar de los sitios EcoR I y Hind III en sus posiciones originales pET-3a. Se insertó un adaptador de oligonucleótidos conteniendo EcoR I y Hind III en el sitio BamH I del pET-3a. Este creó el pET-3aM con los sitios de clonación únicos adicionales para la inserción de genes en el vector de expresión. Entonces, el sitio Nde I en la posición de inicio de la traducción se convirtió en un sitio de utilización de la mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. La secuencia de ADN del pET-3aM en esta región, 5'-CATATGG, se convirtió en 5'-CCCATGG en pBT430.

El ADN del plásmido conteniendo cADN puede ser digerido de forma apropiada para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifica la proteína. Este fragmento puede entonces ser purificado en un gel de agarosa de baja fusión al 1%. El tampón y la agarosa contienen 10 \mug/ml de bromuro de etidio para la visualización del fragmento de ADN. El fragmento puede entonces ser purificado a partir del gel de agarosa por digestión con GELasa^{R} (Epicentro Technologies, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, precipitado de etanol, secado y suspendido de nuevo en 20 \muL de agua. Los adaptadores de oligonucleótidos apropiados pueden ser ligados al fragmento utilizando la ligasa de T4 ADN (New England Biolabs (NEB), Beverly, MA). El fragmento conteniendo los adaptadores ligados puede ser purificado a partir de los adaptadores en exceso utilizando agarosa de bajo punto de fusión tal como se ha descrito anteriormente. El vector pBT430 es digerido, defosforilado con fosfatasa alcalina (NEB) y desproteinizado con fenol/cloroformo tal como se ha descrito anteriormente. El vector pBT430 preparado y el fragmento pueden entonces estar ligados a 16ºC durante 15 horas seguido por transformación en células electro-competentes DH5 (GIBCO BRL). Los transformantes pueden ser seleccionados en placas de agar conteniendo medio LB y 100 \mug/mL de ampicilina. Los transformantes conteniendo el gen que codifica el presente polipéptido son entonces seleccionados para la correcta orientación con respecto al promotor T7 por el análisis de restricción de enzima.

Para la expresión del nivel alto, puede transformarse un clon de plásmido con el inserto de cADN en la orientación correcta en relación con el promotor T7 en la cepa BL21 de E. coli (DE3) (Studier y col. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130). Los cultivos se hacen crecer en un medio LB conteniendo ampicilina (100 mg/L) a 25ºC. A una densidad óptica de 600 nm de aproximadamente 1, puede añadirse IPTG (isopropiltio-\beta-galactósido, el inductor) a una concentración final de 0,4 mM y la incubación puede continuarse durante 3 h a 25ºC. A continuación las células son separadas por centrifugación y suspendidas de nuevo en 50 \muL de Tris-HCl 50 mM a pH 8,0 conteniendo 0,1 mM de DTT y 0,2 mM de fluoruro de fenil metilsulfonilo. Puede añadirse una pequeña cantidad de bolitas de vidrio de 1 mm y la mezcla sonicarse 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microsonda. La mezcla es centrifugada y se determina la concentración de proteína del sobrenadante. Puede separarse un \mug de la fracción soluble del cultivo por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Los geles pueden ser observados para la migración de las bandas de proteína al peso molecular esperado.

Ejemplo 7 Expresión de EST eel1c-pk002.i4 de Euphorbia lagascae en Saccharomyces cerevisiae

Se valoró la función de la enzima del citocromo P450 correspondiente al EST eel1c.pk002.i4 por expresión en la cepa WHT1 de Saccharomyces cerevisiae [W. Jung, y col. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208-212]. La línea celular WHT contiene el gen para la reductasa de NADPH del citocromo P-450 de Helianthus tuberosum por intensificación de la actividad del citocromo P450 recombinante tal como se ha descrito previamente [W. Jung y col. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208-212. Se amplificó la secuencia de codificación de EST eel1c.pk002.i4 por PCR utilizando el kit de polimerasa de cADN Advantage (Clontech) y el par de prímero 5'-TCAAGGAGAAAAAACCCCGGATCCATG
GAGCAGAAAAATCTCTCTTTTCCG-3' (SENTIDO; SEC ID No.: 4) y 5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACT
CACTATAGGGCG-3' (ANTISENTIDO; SEC ID No.: 5). Además de la homología a la región de codificación del citocromo P450, estos prímeros comparten homología con el vector pRS315 [Sikorski y Heiter (1989) Genetics 122: 19-27] que se modificó tal como se había descrito previamente [Jung y col. (2000) Nature Biotechnol. 18: 208-212] por la inserción de los promotores bi-direccionales GAL1/GALI0. Se hibridó el producto de amplificación resultante al vector digerido, y se transformó en la cepa WHT1 de Saccharomyces cerevisiae en donde la expresión del plásmido se forma por reparación del hueco [Hua y col. (1997) Plasmad 38: 91-96]. Se confirmó la integración adecuada de la secuencia de codificación de EST eel1c.pk002.i4 en el vector de expresión por secuenciación de ADN parcial del plásmido resultante. Se seleccionaron las células de levadura transformadas por su capacidad para crecer en ausencia de leucina.

Se hicieron crecer las colonias seleccionadas durante 3 días a 28ºC en un medio carente de leucina [0,17% (peso/volumen) de bases de nitrógeno de levadura sin amino ácidos (Disco), 0,5% (peso/volumen) de sulfato amónico, 0,01% (peso/volumen) de adenina, y 0,07% (peso/volumen) de CSM-Leu (bio101)] suplementado con glicerol y glucosa a una concentración final del 5% (v/v) u del 0,5% (peso/volumen), respectivamente. A continuación, se lavaron las células dos veces en el medio descrito anteriormente que contenía un 2% de galactosa en lugar de glicerol y glucosa como fuente de carbono. A continuación se diluyeron las células lavadas a OD_{600} \approx 0,4 en un medio consistiendo en 1% (peso/volumen) de extracto de levadura, 2% (peso/volumen) de peptona, 2% (peso/volumen) de galactosa, 0,04% (peso/volumen) de adenina, y 0,2% (peso/volumen) de Tergitol NP-40. El medio también se suplementó con 0,45 mM tanto de ácido linoleico (18:2\Delta^{9cis,12cis}) o ácido linoleico (18:3\Delta^{9cis,12cis,15cis}). Estos ácidos grasos se añadieron para servir como potenciales sustratos in vivo para el citocromo P450 de E. lagascae. Los cultivos se mantuvieron con agitación (250 rpm) a 28ºC y se hicieron crecer a OD_{600} \approx 12. Se recogieron las células de cultivos de 3 ml por centrifugación y a continuación se secaron a vacío. Subsecuentemente se prepararon los ésteres de metilo de ácidos grasos a partir de los pellets de células secadas por transesterificación directa en metóxido sódico/metanol al 1% (peso/volumen) utilizando métodos previamente descritos [Cahoon y col. (2001) J. Biol. Chem. 276: 2637-2643]. A continuación se analizaron los ésteres metílicos de los ácidos grasos utilizando un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 6890 equipado con una columna de Omegawax 320 (30 m x 0,32 mm de diámetro interior, Supelco). Se programó la temperatura del horno entre 220ºC (2 min de mantenimiento) a 240ºC a una velocidad de 20ºC/min. Se compararon los tiempos de retención de los ésteres de metilo de los ácidos grasos a los del éster metílico del ácido vernólico preparado a partir de semillas de E lagascae.

Para confirmar las identidades de cualquier ácido graso \Delta^{12}-epoxi producido por células de levadura recombinante, se analizaron los ésteres metílicos de ácidos grasos tal como se ha descrito anteriormente por espectrometría de masas después de la derivatización del ácido, que proporciona una caracterización estructural más diagnóstica. La reacción ácida de los ésteres metílicos de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi (por ej. ácido vernólico) da lugar a la apertura del anillo epoxi y a la generación de dos productos: (1) un derivado \Delta^{12}-hidroxi/\Delta^{13}-metoxi y (2) un derivado \Delta^{12}-metoxi/\Delta^{13}-hidroxi. Se calentaron los ésteres metílicos de ácidos grasos obtenidos de la transesterificación con metóxido sódico (tal como se ha descrito anteriormente) de cultivos de S. cerevisiae a 70ºC en 1 ml de ácido sulfúrico al 2,5% (v/v) en metanol durante 20 min. Después de enfriar, se añadió 1 ml de agua, y se extrajeron los ésteres metílicos de los ácidos grasos con 2 ml de hexano. A continuación se secaron los ésteres metílicos de los ácidos grasos y se secaron bajo nitrógeno, y a continuación se hicieron reaccionar con 0,5 ml de reactivo de sililación bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida:trimetilclorosilano (99:1, v/v) (Supelco) a 50ºC durante 30 min para generar los derivados del éter trimetilsililo (TNS) de los grupos hidroxilo. Se secaron los ésteres metílicos de los ácidos grasos bajo nitrógeno, se suspendieron de nuevo en hexano y se analizaron a continuación utilizando una interfase de cromatografía de gas HP6890 con un detector selectivo de masas HP5973 (Hewlett-Packard) operando a un potencial de ionización de impacto electrónico de 70 eV. Los derivados de tipo éster metílico de epoxi ácidos grasos se resolvieron parcialmente utilizando una columna HP-INNOWax de 0,25 mm de diámetro interior (Hewlett-Packard) con la temperatura del horno programada entre 185ºC (mantenida 5 min) y 240ºC (mantenida 10 min) a 7,5ºC/min.

Utilizando un medio suplementado con ácido linoleico, se detectó un nuevo ácido graso en células WHT de S. cerevisiae expresando el citocromo P450 de E. lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4. El éster metílico de este ácido graso es indicado como "Epoxy1" en la Fig. 1B. Este ácido graso no se detectó en las células que contenían sólo el vector de expresión y que crecieron bajo condiciones similares [Figura 1A]. El "Epoxy1" mostró el mismo tiempo de retención que el éster metílico del ácido vernólico [Figura 1E]. Además, los derivados ácidos de metanol de este éster metílico de ácido graso mostraron espectros de masas [Figura 2C-D] idénticos a los de los derivados preparados de forma similar del metil ácido vernólico [Figura 2A-B]. En base a estos datos. Se identificó el "Epoxy1" en la Fig. 1B como el éster metílico del ácido vernólico. Este descubrimiento demuestra de este modo que el citocromo P450 de E. lagascae correspondiente al EST eel1c.pk002.i4 funciona como una epoxigenasa de ácido \Delta^{12}-linoleico en la biosíntesis de ácido vernólico.

La suplementación del medio de crecimiento con ácido \alpha-linoleico dio lugar a la producción de un segundo nuevo ácido graso por células que expresan el citocromo P450 de E. lagascae correspondientes a EST eel1c.pk002.i4. Este éster metílico de este ácido graso, que es marcado como "Epoxy2" en la Figura 1D, muestra un tiempo de retención mayor que el del ácido metil vernólico [Figura 1E]. Además, los espectros de masas de los derivados trimetilsililo de los productos ácidos de metanol del "Epoxy2" fueron consistentes con los que provenían del éster metílico del ácido graso de C_{18} conteniendo un grupo \Delta^{12} epoxi y dos dobles enlaces [Figura 2E-F]. Dado que el precursor de este producto es el 18:3\Delta^{9,12,15} (ácido \alpha-linoleico), el "Epoxy2" es de este modo identificado de forma tentativa como el éster metílico del ácido \Delta^{12}-epoxioctadeca-9,15-dienoico (\Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}). Este resultado demuestra que el citocromo P450 de E. lagascae correspondiente al EST eel1c.pk002.i4 también es capaz de catalizar la \Delta^{12} epoxidación del ácido \alpha-linoleico.

Ejemplo 8 Expresión del cADN para la EST eel1c.pk002.i4 de Euphorbia lagascae en Células de Tabaco Transgénicas

La enzima del citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente al cADN para la EST eel1c.pk002.i4 se expresó en callo de tabaco (Nicotiana tabacum) bajo el control del promotor del virus mosaico de la coliflor 35S con el fin de valorar su funcionamiento en células de plantas transgénicas. Para estos estudios, se amplificó inicialmente la estructura de lectura abierta del cADN para EST eel1c.pk002.i4 por PCR para generar sitios de flanqueo EcoRI y BamHI para la clonación en el vector de expresión de la planta. La secuencia del oligonucleótido con sentido utilizado en la reacción de amplificación fue el 5'-gcggccgcgaattcGGAAAATGGAGCAGAAAAATC-3', SEC ID No.:6; y la secuencia del oligonucleótido antisentido fue 5'-gcggccgcggatccTTAGAACATCGTTAATTAAAG-3', SEC ID No.: 7 (Nota: las bases en el caso menor contienen los sitios de restricción añadidos y la secuencia de flaqueo para facilitar la digestión de la enzima de restricción). El diseño de los prímeros de la PCR se basó en la secuencia del cADN para EST eel1c.pk002.i4 mostrada en la SEC ID No.: 1. Se llevaron a cabo treinta ciclos de la amplificación de la PCR en un volumen de 100 \mul utilizando la polimerasa Pfu (Stratagene), y el patrón que consiste en el cADN para EST eel1c.pk002.i4 en pBluescript SK (-). Se subclonó el producto de esta reacción en pCR-Script AMP (Stratagene). Siguiendo la digestión de restricción con EcoRI y BamHI, se movió el producto de la PCR del pCR-Script AMP a los sitios correspondientes del vector pART7 [A. P. Gleave (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1203-1207]. La construcción resultante consistió en la estructura de lectura abierta del cADN para el EST eel1c.pk002.i4 fusionado a su terminal 5' del promotor del virus mosaico de la coliflor 35S y en su terminal 3' a la parte de la terminación transcripcional del gen de la sintasa octopina. Estos tres elementos de la secuencia (promotor/estructura de lectura abierta del EST eel1c.pk002.i4/secuencia de terminación de 3' ocs) se movieron a continuación a un fragmento NotI en el sitio correspondiente del vector binario pART27, que contiene un marcador de resistencia de kanamicina para selección de las células de plantas transformadas [A. P. Gleave (1992) Plant Mol. Biol. 20: 1203-1207]. El plásmido resultante se designó pElCytP450. Se preparó un vector control por la inserción del promotor y los elementos de terminación de pART7 en el sitio NotI de pART27. El plásmido resultante se designó como pART27/35S. A continuación se transformaron los plásmidos pElCytP450 y pART27/35S en células de Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Los cultivos derivados de estas células se utilizaron para la transformación de discos de hojas del tabaco (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) de acuerdo con el protocolo descrito por S. G. Rogers, R. B. Horsch y R. T. Fraley (1986) Methods Enzymol 118: 627-648. Se seleccionó el callo transgénico derivado de estas transformaciones en base a la resistencia a la kanamicina conferida por el vector binario. Además, se confirmó la presencia del transgen en este tejido por el análisis de manchas Northern.

\newpage

Se examinó la composición de ácidos grasos del callo del tabaco resistente a la kanamicina obtenido de transformaciones de discos de hojas por cromatografía de gas (GC). El tejido utilizado en estos análisis fue callo que había sido transferido al medio de selección recién preparado y crecido durante un periodo adicional de 3 a 4 semanas. Para obtener ésteres metílicos de ácidos grasos para el análisis de GC, se homogenizaron aproximadamente 150 mg de callo de tabaco transgénico en 1 ml de metóxido sódico al 1% (peso/volumen) en metanol utilizando los métodos descritos por Hitz y col. (1994) Plant Physiol. 105: 635-641. Se analizaron los ésteres metílicos de los ácidos grasos utilizando un cromatográfo de gases Hewlett-Packard 5890 equipado con una columna Omegawax 320 (30 m x 0,32 mm de diámetro interior, Supelco). Se programó la temperatura del horno de 180ºC (mantenida 4 min) a 215ºC a una velocidad de 5ºC/min y a continuación a 240ºC a una velocidad de 20ºC/min (mantenida 0,5 min). Para proporcionar una caracterización estructural adicional, se determinaron los espectros de masas de los ésteres metílicos de ácidos grasos derivados del ácido a partir del callo de tabaco transgénico utilizando cromatografía de gases acoplada con espectroscopia de masas (CG-MS) tal como se ha descrito en el Ejemplo 7. Utilizando estos métodos analíticos, se detectaron dos ésteres metílicos de ácidos grasos en el callo de tabaco transformado con pEICytP450 que estaban ausentes en el callo del control del vector (pART/35S) [Figura 3]. Los picos correspondientes a estos ácidos grasos se etiquetaron como "Epoxy1" y "Epoxy2" en el cromatograma de gases que se muestra en la [Figura 3B]. El éster metílico del Epoxy 1 mostró un tiempo de retención en la cromatografía de gases idéntico al del ácido metil vernólico (\Delta^{12}-epoxi-18:1\Delta^{9cis}) en extractos de semillas de Euphorbia lagascae (Fig. 3C). Además, la derivatización del ácido y la sililación del éster metílico del Epoxy1 rindieron dos compuestos con espectros de masas idénticos a los obtenidos de una derivatización similar del ácido metil vernólico (ver Ejemplo 7). De este modo se identificó el Epoxy1 como ácido vernólico. El éster metílico del ácido graso correspondiente al Epoxy2 en la Fig. 3B mostró el mismo tiempo de retención que el éster metílico del ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienoico (\Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}) descrito en el Ejemplo 7. Los espectros de masas de los compuestos formados de la derivatización del ácido metabólico y de la sililación del éster metílico del Epoxy2 fueron idénticos a los de los derivados del 12-epoxioctadeca-9,15-dienotato de metilo preparados de forma similar, tal como se detalla en el Ejemplo 7. El Epoxy2 se identificó de este modo como el ácido 12-epoxioctadeca-9,15-dienoico. En base a los estudios de alimentación de sustrato con Saccharomyces cerevisiae descritos en el ejemplo 7, el ácido vernólico y el \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15} en las células de tabaco transgénicas resultaron de la actividad \Delta^{12} epoxigenasa en ácidos linoleico (18:2\Delta^{9,12}) y \alpha-linoleico (18:3\Delta^{9,12,15}), respectivamente.

Tal como se ha resumido en la Tabla 5, el callo de tabaco que expresa el citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4 acumuló ácidos grasos \Delta^{12} epoxi (ácido vernólico y \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}) hasta cantidades que exceden el 15% en peso del total de ácidos grasos de las muestras transgénicas (Tabla 5).

Estos resultados demuestran que la enzima del citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4 puede ser expresado de forma funcional en células de plantas transgénicas para producir ácidos grasos \Delta^{12} epoxi.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Composiciones de Ácidos Grasosde callo de tabaco Transformado con el Vector pART27/35S Carente del inserto de cADN (pART27/35S) o con el cADN de Euphorbia lagascae para EST eel1c.pk002.i4 Cerca del Promotor 35S (pELCvtP450)

5

6

Ejemplo 9 Producción de Ácidos Grasos \Delta^{12} Epoxi en Embriones de Habas de Soja Somáticos

La enzima del citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente al cADN para EST eel1c.pk002.i4 se expresó en embriones de habas de soja somáticos (Glycine max) con el fin de examinar su actividad en especies de cosechas tansgénicas. La estructura de lectura abierta del cADN para EST eel1c.pk002.i4 fue inicialmente amplificada por la PCR utilizando la misma metodología y los prímeros de oligonucleótidos [SEC ID No.: 6 y SEC ID No.: 7] tal como se ha descrito en el Ejemplo 8. El producto resultante de la PCR se subclonó en el vector pCR-Script AMP (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación se movió el producto de la PCR como un fragmento de NotI a partir del pCR-Script AMP en los sitios correspondientes del vector de expresión del haba de soja pKS123 para generar el plásmido pKR31. El vector pKS123 es idéntico al vector previamente descrito pKS67 [Publicación de la patente mundial No. WO 00/11176] excepto que se añadieron dos sitios de la enzima de restricción AscI que flanquearon el promotor y los elementos de terminación del casete de expresión de la planta. El plásmido pKR31 contiene la estructura de lectura abierta del cADN para EST eel1c.pk002.i4 fusionada en su terminación 5' con el promotor del gen para la subunidad-\alpha' de la \beta-conglicinina [R. N. Beachy y col. (1985) EMBO J. 4: 3047-3053] y su terminación 3' con los elementos de terminación del gen de faseolina [J. J. Doyle y col. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9228-9238]. El promotor del gen para la subunidad-\alpha' de la \beta-conglicinina utilizado en pKR31 dirige la fuerte expresión específica de la semilla de los transgenes. La selección bacteriana en el vector pK31 es otorgada por un segundo gen de higromicina B fosfotransferasa [L. Gritz y J. Davies (1983) Gene 25: 179-188] bajo control del promotor de la polimerasa de T7 ARNm y la selección de plantas es otorgada por un segundo gen de la higromicina B fosfotransferasa bajo control del promotor 35S del virus mosaico de la coliflor. Se utilizó el plásmido pKR31 para la transformación de embriones de habas de soja somáticos tal como se describe a continuación.

Para inducir embriones somáticos, se diseccionaron los cotiledones, de 3-5 mm de longitud desde la superficie esterilizada, se cultivaron las semillas no maduras de un cultivo de habas de soja A2872 en la luz o la oscuridad a 26ºC en un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios fueron escindidos a continuación y colocados en un medio líquido adecuado. Después de la selección repetida de agrupaciones de embriones somáticos que se multiplican como embriones tempranos, embriones representados de forma globular, las suspensiones se mantuvieron tal como se describe a continuación.

Se mantuvieron los cultivos embriogénicos de habas de soja en suspensión en 35 mL de un medio líquido en un agitador rotatorio, a 150 rpm, a 26ºC con luz fluorescente en un programa de 16:8 horas de luz/oscuridad. Los cultivos fueron sub-cultivados cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido.

A continuación los cultivos embriogénicos de habas de soja en suspensión se transformaron con pKR31 por el método de bombardeo por disparo de partículas (T. M. Klein y col. (1987) Nature (Londres) 327:70, patente U.S. No. 4.945.050). Para estas transformaciones se utilizó un instrumento de Du Pont Biolisticä PDS1000/HE (retroalimentación de helio).

Se añadieron a 50 mL de una suspensión de 60 mg/mL de partículas de oro de 1 mm (en orden): 5 mL de ADN (1 mg/mL), 20 mL de espermidina (0,1 M), y 50 mL de CaCl_{2} (2,5 M). A continuación se agitó la preparación de partículas durante tres minutos, se agitó en una microfuga durante 10 segundos y se separó el sobrenadante. A continuación se lavaron las partículas recubiertas de ADN una vez en 400 mL de etanol al 70% y se suspendieron de nuevo en 40 mL de etanol anhidro. Se sonicó la suspensión de ADN/partículas tres veces durante un segundo cada vez. A continuación se cargaron cinco mL de partículas de oro recubiertas de ADN en cada disco de soporte macro.

Se colocaron en una placa petri vacía de 60 x 15 mm aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión preparado hacía dos semanas y se separó el líquido residual del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, se bombardearon aproximadamente de 5 a 10 placas de tejido. Se fijó la presión de ruptura de la membrana a 1100 psi y se evacuó la cámara a un vacío de 28 pulgadas de mercurio. Se colocó el tejido aproximadamente 3,5 pulgadas fuera de la pantalla de retención y se bombardeó tres veces. Después del bombardeo, se dividió el tejido por la mitad y se colocó de nuevo en líquido y se cultivó tal como se ha descrito anteriormente.

Entre cinco y siete días después del bombardeo, se intercambió el medio líquido con medio fresco, y entre once y doce días después del bombardeo con medio recién preparado conteniendo 50 mg/mL de higromicina. Este medio selectivo se preparó de nuevo cada semana. Entre siete y ocho semanas después del bombardeo, se observó el crecimiento del tejido verde, transformado, a partir de agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. Se separó el tejido verde aislado y se inoculó en frascos individuales para generar nuevos cultivos, de la suspensión embriogénica transformada, clónicamente propagados. Se trató cada nueva línea como un suceso de transformación independiente. A continuación se sub-cultivaron estas suspensiones y se mantuvieron como agrupaciones de embriones no maduros. Los embriones no maduros en este estadio produjeron productos de reserva, incluyendo lípidos de reserva que son similares en composición a los embriones zigóticos en un estadio similar de desarrollo (ver la publicación de la patente mundial No. WO 94/11516). Se confirmó la expresión del transgen del citocromo P450 de Euphorbia lagascae en las líneas de embriones seleccionadas por la higromicina por amplificación de la PCR utilizando los prímeros específicos de la secuencia y cADN de primera hebra preparado a partir del ARN total aislado de los embriones transgénicos.

Los embriones de habas de soja somáticas transgénicas seleccionados y mantenidos de este modo fueron analizados para determinar la acumulación de ácidos grasos \Delta^{12}-epoxi utilizando cromatografía de gas (GC) o espectroscopia de masas acoplada a cromatografía de gases (GC-MS). Los embriones individuales que expresan la epoxigenasa del citocromo P450 de la Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4 se homogenizaron en metóxido sódico al 1% (peso/volumen) en metanol (tal como se ha descrito en el Ejemplo 7) para generar ésteres metílicos de ácidos grasos a partir de los lípidos totales en estos tejidos. Los ésteres metílicos de ácidos grasos resultantes de esta etapa de transesterificación se analizaron por GC y GC-MS utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 7. Se detectaron dos nuevos ésteres metílicos de ácidos grasos, en embriones somáticos que expresan el cADN para EST eel1c.pk002.i4, que estaban ausentes en los embriones no transformados [Figura 4]. Los picos de cromatografía de gases correspondientes a estos ésteres metílicos de ácidos grasos son designados como "Epoxy1" y "Epoxy2" en la [Figura 4B]. Los ésteres metílicos de los ácidos grasos correspondientes a Epoxy1 y Epoxy2 tuvieron tiempos de retención idénticos a los del ácido vernólico y al \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}, respectivamente. Además, los espectros de masas obtenidos siguiendo la derivatización de ácido sulfúrico metabólico (tal como se ha descrito en el Ejemplo 7) de estos ésteres metílicos de ácidos grasos fueron idénticos a los de los derivados del ácido metil vernólico y \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15} preparados de un modo similar. De este modo, los dos nuevos ácidos grasos producidos por embriones de habas de soja somáticos que expresan el cADN para EST eel1c.pk002.i4 se identificaron como ácido vernólico (\Delta^{12}-epoxi-18:1\Delta^{9}) y \Delta^{12}-epoxi-18:2\Delta^{9,15}. En base a los estudios de alimentación de sustrato descritos en el Ejemplo 7, estos ácidos grasos surgen de la modificación del doble enlace en \Delta^{12} de los ácidos linoleico y \alpha-linoleico. Estos resultados también muestran que el citocromo P150 de la encima codificada por el cADN para EST eellc.pk002.i4 funciona en la planta como un acido graso \Delta^{12} de epoxigenasa. Estos resultados también demuestran la capacidad para producir ácidos grasos epoxi en especies de cosecha, tal como habas de soja, por medio de la expresión del cADN para ESR eel1c.pk002.i4.

La tabla 6 muestra una comparación de las composiciones de ácidos grasos de embriones de habas de soja somáticos no transformados y embriones de la línea transgénica MSE578-6-9 transformados con el cADN del citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4. Tal como se ha indicado, los ácidos grasos epoxi acumulan hasta cantidades > del 7% en peso del total de los ácidos grasos de las líneas de embriones transgénicos pero no son detectados en líneas no transformadas.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Composiciones de Ácidos Grasos de Embriones de Habas de Soja Somáticos No Transformados y de la Línea de Embriones de Habas de Soja Somáticos Transgénicos MSE578-6-9 que Expresan el cADN del Citocromo P450 de Euphorbia lagascae correspondiente a EST eel1c.pk002.i4

7

<110> E. I. du Pont de Nemours and Company

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de grupos delta-12-epoxi en ácidos grasos de plantas.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> BB1465 PCT

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140>

\vskip0.400000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 60/219833

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 21 Julio 2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> Microsoft Office 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1733

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Euphorbia lagascae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 500

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Euphorbia lagascae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 502

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Capsicum annuum

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

11

12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Construcción sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaaggagaa aaaaccccgg atccatggag cagaaaaatc tctcttttcc g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Construcción sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggcg

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Construcción sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggccgcga attcggaaaa tggagcagaa aaatc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Construcción sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcggccgcgg atccttagaa catcgttaat taaag

\hfill

35

Claims (18)

1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en:

(a)

una primera secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de ácidos grasos delta- 12 epoxi en donde dicho polipéptido tiene al menos una identidad del 50% en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2; y

(b)

una segunda secuencia de nucleótidos que comprende un complemento de la primera secuencia de nucleótidos.

2. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 55% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

3. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 60% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

4. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 65% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

5. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 70% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

6. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 75% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

7. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 80% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

8. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 85% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

9. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 90% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

10. Un polinucleótido aislado tal como se ha reivindicado en la reivindicación 1, en donde en la parte (a), el polipéptido tiene al menos un 95% de identidad en base al método de alineación Clustal cuando se compara con un polipéptido de SEC ID No.: 2.

11. Una construcción quimérica que comprende el polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 unido de forma operable a al menos una secuencia reguladora adecuada.

12. Una célula huésped aislada que comprende la construcción quimérica de la Reivindicación 11.

13. Una célula huésped aislada que comprende un polinucleótido aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. La célula huésped de la Reivindicación 13 en donde la célula huésped está seleccionada entre el grupo que consiste en levadura, bacteria, y plantas.

15. Un método de seleccionar un polinucleótido aislado que afecta el nivel de ácidos grasos delta-12 epoxi en una célula huésped, comprendiendo el método las etapas de:

(a)

preparar un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10;

(b)

introducir el polinucleótido aislado en una célula huésped;

(c)

determinar la presencia o ausencia de ácidos grasos delta-12 epoxi en la célula huésped de (b).

16. El método de la Reivindicación 15 en donde el polinucleótido aislado consiste en una secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1.

17. Un método de obtener un fragmento de ácido nucleico que codifica una enzima del citocromo P450 asociada con la síntesis de ácidos grasos delta-12 epoxi que comprende las etapas de:

(a)

sondar un cADN o biblioteca genómica con un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos de SEC ID No.: 1 y un complemento de dichas secuencias de nucleótidos;

(b)

identificar un clon de ADN que hibrida con el polinucleótido de (a) o el complemento del mismo;

(c)

aislar el clon de ADN identificado; y

(d)

secuenciar un cADN o fragmento genómico que comprende el clon de ADN aislado.

18. Un método de producir ácidos grasos delta-12 epoxi en una célula huésped que comprende:

(a)

transformar una célula huésped con la construcción quimérica de la Reivindicación 11;

(b)

crecer las células huésped transformadas de la etapa (a); y

(c)

determinar la presencia o ausencia de ácidos grasos delta-12 epoxi en las células transformadas de (b).