ES2284681T3 - Epitopos de oligosacaridos del nucleo de lipopolisacaridos de maemophilus influenzae como vacunas para la prevencion de infecciones por haemophilus influenzae. - Google Patents
Epitopos de oligosacaridos del nucleo de lipopolisacaridos de maemophilus influenzae como vacunas para la prevencion de infecciones por haemophilus influenzae. Download PDFInfo
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Abstract
Un resto de lipopolisacárido aislado que consta de un resto del núcleo interno de triheptosilo que tiene la estructura II:** er fórmula** en la que R1 es hidrógeno, beta-D-Glcp (1 - 4); o PCho- 6) -beta-D-Glcp (1- 4); R2 es fosfato (P) o pirofosfoetanolamina (P-PEtn); R3 es hidrógeno, beta-D-Glcp o a-D-Galp, y cuando R1 es hidrógeno obeta-D-Glcp (1 - 4), entonces R3 también puede serbeta-D-Galp (1 - 4) -beta-D-Glcp, a-D-Galp (1 - 4) beta-D-Galp (1 - 4)beta-D-Glcp beta-D-GalpNac- (1- 3)-a-D-Galp (1 - 4) beta-D-Galp (1 - 4)-beta-D-Glcp, o a-NeuAc (2 - 3)- beta-D-Galp (1 - 4)-beta-D-Glcp (1- 3), en la que R3 está unido a o bien la posición O-3 u O-2 de Hep III; y Kdo es ácido 3-desoxi-D-mano-2-octulosónico; y Lípido A está destoxificado.
Description
Epítopes de oligosacáridos del núcleo interno de
lipopolisacáridos de Haemophilus influenzae como vacunas para
la prevención de infecciones por Haemophilus influenzae.
La presente invención se refiere a mutaciones
definidas en la maquinaria biosintética para la expresión de
lipopolisacáridos (LPS) en Haemophilus influenzae. La
invención también se refiere al uso de conjugados de los LPS a
partir de cepas mutantes así obtenidas para inducir una respuesta
inmune heteróloga contra un amplio intervalo de cepas de H.
influenzae que provocan enfermedad. Más específicamente, la
invención se refiere a vacunas para la prevención de infecciones
bacterianas que comprenden lipopolisacáridos centrales de
Haemophilus influenzae.
Haemophilus influenzae es una causa
principal de enfermedad en todo el mundo. Se conocen seis serotipos
capsulares ("a" a "f") y un número indeterminado de capas
capsulares (no tipificables) de H. influenzae. Las cepas
capsulares de tipo b están asociadas a enfermedades invasivas,
incluyendo meningitis y neumonía, mientras que el H.
influenzae no tipificable (NTHi) es una causa principal de
otitis media en niños e infecciones del tracto respiratorio en
adultos. La otitis media es una enfermedad común de la infancia que
es responsable de la mayor frecuencia de visitas pediátricas en los
Estados Unidos (Stool y col., Pediatr. Infect. Dis. Suppl.; 8:
S11-S14, 1989).
El desarrollo de una vacuna para las
enfermedades de NHTi se ha comprobado que es difícil debido a una
falta de entendimiento de los antígenos que confieren inmunidad
protectora. Se han enfocado esfuerzos en el desarrollo de una
vacuna de NTHi en los antígenos de superficie tales como proteínas
de la membrana externa y pelos o fimbria (Kyd y col., Infect.
Immun., 63: 2931-2940, 1995; Deich y col., Vaccine
Res., 2: 31-39, 1995).
Recientes avances en genética molecular,
análisis de estructura molecular e inmunoquímica proporcionan
herramientas poderosas que han permitido la identificación de
estructuras de carbohidrato como antígenos de vacuna candidatos.
Las bacterias Gram-negativas
tienen una membrana externa constituida por componentes incluyendo
proteínas, lipoproteínas, fosfolípidos, y glicolípidos. Los
glicolípidos comprenden principalmente lipopolisacáridos (LPS) de
endotoxinas. Los LPS son moléculas constituidas por a) una parte de
Lípido A que consta de un disacárido de glucosalina que está
sustituida con grupos fosfatos y ácidos grasos de cadena larga en
enlaces éster y amida; b) un polisacárido central que está unido a
Lípido A mediante un azúcar de ocho carbonos, Kdo
(cetodesoxioctonato), y heptosa, glucosa, galactosa, y
N-acetilglucosamina; y, opcionalmente c) cadenas
laterales específicas de O constituidas por repetición de unidades
de oligosacáridos que, dependiendo del género y especie de bacteria,
puede contener manosa, galactosa, D-glucosa,
N-acetilgalactosamina,
N-acetilglucosamina, L-ramnosa, y
una didesoxihexosa (abecuosa, colitosa, tivelosa, paratosa,
trehalosa). Los LPS que carecen de repetición de cadenas laterales
O se refieren algunas veces a lipopolisacárido de cadena corta, o a
lipooligosacárido (LOS). En esta solicitud el término
lipopolisacárido (o LPS) incluye lipopolisacárido de cadena corta y
lipooligosacárido (y LOS).
Los determinantes principales antigénicos de
bacterias Gram-negativas se cree que residen en la
estructura compleja de carbohidratos de los LPS. Estas estructuras
de carbohidratos varían significativamente, incluso entre
diferentes especies del mismo género de bacterias
Gram-negativas, principalmente debido a variaciones
en uno o más de la composición de azúcar, la secuencia de
oligosacáridos, el enlace entre las unidades monómeras de los
oligosacáridos y entre los propios oligosacáridos, y
sustituciones/modificaciones de los oligosacáridos (particularmente
el oligosacárido terminal). Por esta razón, el desarrollo de una
vacuna que tiene un efecto de amplio espectro contra Haemophilus
influenzae (particularmente contra NTHi) ha sido
infructuoso.
El LPS es un componente bacteriano que tiene
potencial como un inmunógeno de vacuna debido a los determinantes
antigénicos ("epítopes") que residen en sus estructuras
carbohidratos. Sin embargo, la naturaleza química de los LPS
disminuye su uso en las formulaciones de vacunas, es decir, la
inmunización activa con LPS es inaceptable debido a su toxicidad
inherente, en algunos animales, de la parte de Lípido A. Los efectos
patofisiológicos inducidos (directa o indirectamente) por el Lípido
A de LPS en el torrente sanguíneo incluyen fiebre, leucopenia,
leucocitosis, la reacción de Shwartzman, coagulación intravascular
diseminada, aborto, y en dosis mayores, choque y muerte.
Se ha establecido que las vacunas compuestas por
polisacáridos capsulares son eficaces en al prevención de
enfermedades humanas provocadas por las bacterias encapsuladas
homólogas. Estos antígenos carbohidratos a menudo son escasamente
inmunogénicos en seres humanos debido a la falta de respuesta
dependiente de células T. Sin embargo, conjugando el antígeno
polisacárido específico a un vehículo de proteína adecuado, la
inmunogenicidad del antígeno carbohidrato se puede potenciar en
gran medida en pacientes que no responden al polisacárido solo. Las
vacunas glicoconjugadas basadas en el polisacárido capsular
específico de tipo H. influenzae (Hib), por ejemplo
ProHibit™, y ActHib™, han probado éxito en el control de
enfermedades invasivas de Hib en niños. Las vacunas de Hib de
conjugados de polisacárido capsular-proteína no
proporcionan protección contra la enfermedad provocada por cepas
acapsulares (no tipificables) de H. influenzae (es decir,
contra la enfermedad provocada por NTHi) debido a que solamente
protegen contra infecciones provocadas por cepas de H.
influenzae que llevan la cápsula de tipo b.
El lipopolisacárido (LPS) es un antígeno de la
superficie celular de NTHi. El LPS de Haemophilus influenzae
se ha encontrado que solamente contiene los componentes del lípido A
y oligosacárido (OS). Debido a que el componente del lípido A de
LPS es tóxico, se debe destoxificar antes de la conjugación a un
vehículo inmunógeno, como se ha descrito anteriormente.
Barenkamp y col., (Pediatr. Infect. Dis. J., 9:
333-339, 1990) demostraron que los LPS estimulaban
la producción de anticuerpos bactericidas dirigidos contra NTHi.
McGehee y col. (Am. Journal Respir. Cell Biol., 1:
201-210, 1989) mostraron que la inmunización pasiva
de ratones con anticuerpos monoclonales dirigidos contra LOS a
partir de NTHi potenciaba la eliminación pulmonar de NTHi.
Green y col., (Vaccines, 94:
125-129, 1994) describen una vacuna de NTHi que
comprende un conjugado de oligosacárido de NTHi y la proteína de
difteria no tóxica mutante CRM. Sub. 197. El resto del lípido A se
retiró se LOS mediante tratamiento con ácido, seguido de la
derivatización del Os resultante con dihidrazida de ácido atípico
(ADH) y acoplamiento a CRM. Sub. 197. A pesar que Barenkamp y col.,
muestran que LOS estimulaba la producción de anticuerpos
bactericidas contra NTHi; los conjugados de Green y col. Se
determinaron que eran escasamente inmunogénicos después de la
inyección en ratones. Además, los conjugados no indujeron
anticuerpos bactericidas contra NTHi.
Gu y col. (Patente de Estados Unidos Nº
6.207.157) se refiere a la destoxificación de los LOS de NTHi
mediante la eliminación de ácidos grasos unidos a éster de ellos,
de manera que puede ser adecuado para la preparación de vacunas.
Sin embargo, Gu no describe cualesquiera otras modificaciones de o
atributos químicos deseados de los LOS de NTHi.
Actualmente no existe ninguna vacuna disponible
para proporcionar protección de amplio espectro contra las
infecciones provocadas por Haemophilus influenzae. De este
modo, existe una necesidad de una vacuna que tenga eficacia de
amplio espectro contra Haemophilus influenzae,
particularmente NTHi.
Con el fin de utilizar un antígeno para el
desarrollo de vacuna, se deben cumplir cuatro criterios esenciales.
Es decir el epítope inmunogénico debe ser:
1. genéticamente estable;
2. conservada en todas las cepas clínicamente
relevantes a través de las especies;
3. accesible (in vitro e in vivo)
a mecanismos inmunes de huéspedes; y
4. capaz de inducir anticuerpos protectores
in vivo.
existe una necesidad de identificar epítopes de
carbohidratos de LPS de H. influenzae, particularmente NTHi,
que satisface estos criterios.
La presente descripción se refiere a la
inmunidad proporcionada por las moléculas activadoras de las células
b derivadas de lipopolisacárido (LPS) de H. influenzae,
comprendiendo dichas moléculas uno o más epítopes de una parte de
oligosacáridos de núcleo interno conservado del lipopolisacárido.
También se describe una estrategia para identificar y caracterizar
dichos epítopes que son representativos de los LPS expresados por
cepas de H. influenzae a través de los aislamientos que
provocan enfermedad. También se describen procedimientos para
obtener tales epítopes, tanto sintéticamente como mediante técnicas
de ingeniería genética, y conjugados de moléculas que comprenden
dichos epítopes con vehículos adecuados, opcionalmente en
formulaciones de liposomas.
En un aspecto, la invención proporciona un resto
lipopolisacárido aislado de acuerdo con la reivindicación 1.
En un aspecto, la invención proporciona una
composición farmacéutica para comprender el resto de
lipopolisacárido de la invención de la reivindicación 1.
En otro aspecto, la invención proporciona un
anticuerpo que se une específicamente al resto de lipopolisacárido
de la reivindicación 1.
En otro aspecto, la invención proporciona el uso
de una composición farmacéutica de la invención para la preparación
de un medicamento en el tratamiento de una enfermedad provocada por
infección con Haemophilus influenzae.
También se proporciona un glicoconjugado que
comprende el resto de lipopolisacárido de la invención, de acuerdo
con la reivindicación 18.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para la producción y recogida de un anticuerpo de
reactividad cruzada contra Haemophilus influenzae que
comprende: (a) generar anticuerpos para el resto de
lipopolisacárido descrito anteriormente, (b) ensayar dichos
anticuerpos contra una pluralidad de cepas de Haemophilus
influenzae, y (c) seleccionar aquellos anticuerpos que son de
reactividad cruzada.
La presente invención también proporciona cepas
de Haemophilus influenzae Rd lic1lps A y 1003 lic1lpsA,
depositadas bajo los números de acceso ISAC 250801-1
e ISAC 250801-2, respectivamente.
En otro aspecto, la invención también
proporciona un procedimiento para preparar un resto de
lipopolisacárido de acuerdo con la reivindicación 12.
La invención también proporciona, en un aspecto
adicional, una composición de vacuna que comprende uno o más
glicoconjugados de acuerdo con la invención y un adyuvante.
La Figura A es un diagrama del resto
triheptosilo de núcleo interno conservado de lipopolisacárido de
Haemophilus influenzae.
La Figura B es una verificación estructural de
la forma de alto peso molecular RM 118.
La Figura C es un esquema para la conjugación de
una vacuna a una proteína vehículo.
Figura 1. Los patrones de migración en gel
electroforética después de
T-SDS-PAGE de LPS purificado a
partir de RM 118 de tipo salvaje y cepas mutadas en genes supuestos
de glicosiltransferasa. RM 118 corresponde al LPS de tipo salvaje y
los mutantes isogénicos se enumeran mediante el gen de LPS
relevante.
Figura 2. IEP-EM de ión negativo
del LPS O-desacilado del mutante lpsA de RM 118 de
H. influenzae que muestra iones doble y triplemente cargados
de la glicoforma Hex 1 principal (ESTRUCTURA 3).
Figura 3. Espectro 1H RMN del LPS
O-desacilado del mutante lpsA de la cepa RM 118 de
H. influenzae que muestra la región de protón
\alpha-anomérico entre 5,0 y 6,0 ppm. Se indican
las resonancias anoméricas correspondientes a Hep
3,4-disustituida (Hepl), Hep 6-PEtn
sustituida (Hepll), Hep terminal (Heplll) y
\alpha-GlcN fosforilada en la región del Lípido
A.
Figura 4. Análisis de electroforesis capilar de
la actividad de LgtD en la cepa RM 118 de H. influenzae.
Panel A, Señal 1 es una mezcla de reacción completa que usa el
gránulo 100.000 x g de un sonicado como fuente de enzima; la señal 2
es similar a la mezcla de reacción en 1, excepto que no se encuentra
UDP-GalNAc; la señal 3 es una mezcla de reacción
completa del RM 118 : IgtD mutante; la señal 4 es similar a la señal
3 excepto que no se encuentra UDP-GalNAc. El pico A
es una impureza en la preparación de FCHASE-P^{k},
el pico b es FCHASE-Globotetraosa, el pico c es
FCHASE-P^{k}. El panel B, señal 1 es el producto
purificado por TLC a partir de una reacción como se describe para el
Panel A señal 1. La señal 2 es el mismo material que la señal 1,
pero tratada con \beta-hexosaminidasa.
Figura 5. IEP-EM de ion negativo
de la región de ion molecular triplemente cargado del LPS
O-desacilado del mutante lgtF de RM 118 de H.
influenzae. Se indican los picos que aparecen de la Hex 2
(\beta-D-Galp-(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp),
Hex 3 (\alpha-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp),
y Hex 3\cdotHexNAc
(\beta-D-GalpNAc-(1 \rightarrow
3)-\alpha-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp).
Figura 6. Una representación esquemática de la
estructura de LPS de la cepa RM 118 de H. influenzae
basándose en los resultados del análisis de Risberg y col., (16). Se
muestra el sitio propuesto de acción en la biosíntesis de LPS de los
loci caracterizados en este estudio, unidos por flechas al enlace
sacárido relevante. Los loci de fase variable están subrayados.
Representado en la estructura de LPS: KDO, ácido
2-ceto-3-desoxioctulosónico;
Hep,
L-glicero-D-mano-heptosa;
Glc, D-glucosa; Gal, D-galactosa,
GalNAc, N-acetilgalactosamina; PEtn,
fosfoetanolamina; P, fosfato; Pcho, fosfocolina. Para los restos de
heptosa, enumerados de arriba abajo son heptosa I, heptosa II
después heptosa III.
Figura 7. Genes implicados en la extensión de
cadena del núcleo interno de LPS de la cepa Rd^{-} de H.
influenzae. Los genes orf3 y lic2b en el locus lic2 controlan la
extensión de la cadena desde Hep II en las cepas de tipo b: estos
genes no se encuentran en la cepa Rd^{-}. Lic1 controla la
incorporación de PCho.
Figura 8. Parte del espectro de
IEP-EM de ión negativo del LPS
O-desacilado de la cepa 486 de NTHi. Se indican las
composiciones propuestas de las glicoformas principales. Los aductos
con sodio se indican mediante un asterisco (*).
Figura 9. Estructura de la principal glicoforma
de LPS Hex1 observada en NTHi 285.
Figura 10. Estructura tentativa de la principal
glicoforma de LPS en NTHi 1158.
Figura 11. El cromatograma en Biogel
P-4 de LPS (100 mg) de NTHi 176 después de la
hidrólisis ácida suave. Se indican Fr.1 (1 mg), Fr.2 (10 mg) y Fr.3
(6,4 mg).
Figura 12. Espectro de ^{1}H RMN a 270 MHz de
Fr.2 derivado de NTHi 176 (a) y Fr.3 (b).
Figura 13. Partes del espectro de 2D NOESY a 500
MHz de Fr.2 de NTHi 176.
Figura 14. Estructuras de oligosacáridos
derivados de NTHi 176 LPS.
Figura 15. Estructura de la glicoforma de LPS
que contiene NeuAc principal de NTHi 486.
El lipopolisacárido (LPS) es un antígeno de
superficie expuesta esencial y característico de H.
influenzae. (Como se ha descrito anteriormente, los términos
lipopolisacárido y LPS como se usan en esta memoria descriptiva
abarcan lipopolisacárido de cadena corta y lipooligosacárido (LOS)).
Las cepas de H. influenzae expresan poblaciones heterogéneas
de LPS de bajo peso molecular que puede mostrar diversidad
antigénica extensiva entre múltiples epítopes de oligosacárido. Las
estructuras de carbohidratos de LPS de H. influenzae
descritas por el solicitante en esta memoria descriptiva pueden
proporcionar una fuente de antígenos protectores cuando se
presentan al sistema inmune humano de una manera apropiada, por
ejemplo, como un conjugado de proteína o en una formulación de
liposomas. Los anticuerpos contra ciertos LPS de NTHi han mostrado
actividad bactericida in vitro (Sun y col., Vaccine 18:
1264-1272). Un estudio reciente (Gu y col., patente
de Estados Unidos Nº 6.207.157 ha indicado que la inmunización con
conjugados a base de LPS puede reducir la incidencia de otitis
media inducida por NTHi debida a una cepa homóloga en un modelo
animal. El LPS probó utilidad como un candidato de vacuna en el
estudio de los solicitantes, sorprendentemente, porque se
identificaron antígenos de carbohidratos expresados en superficie
que poseen epítopes de oligosacáridos que son genética y
fisiológicamente estables, que se conservan a través de una gama de
cepas clínicamente relevantes, y que son accesibles para los
mecanismos de eliminación de huésped.
Las regiones carbohidrato de las moléculas de
LPS de H. influenzae proporcionan dianas para el
reconocimiento por las respuestas inmunes de huésped. La expresión
de ciertos epítopes de oligosacáridos se sabe que contribuyen a la
patogénesis de infecciones pro H. influenzae. La
determinación de la estructura es crucial para entender la biología
de LPS de H. influenzae y su papel en la virulencia
bacteriana. Los LPs de H. influenzae comprenden una mezcla
heterogénea de moléculas que constan de un resto oligosacárido
variable y un componente del Lípido A que se ancla a la membrana
(Zamze, S. E., y Moxon, E. R. (1987) J. Gen. Microbiol. 133,
1443-14511). Basándose en los experimentos descritos
en esta memoria descriptiva, se desarrolló un modelo estructural
para LPS de Haemophilus constituido por 3 restos de núcleo
interno triheptosilo conservado que se une mediante un resto
cetodesoxioctonato fosforilado a un componente de Lípido A. En todas
las cepas investigadas por el solicitante hasta la fecha este resto
triheptosilo consta del siguiente elemento estructural.
L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow
2)-L-\alpha-D-Hepp-[\beta-D-Glcp-
\rightarrow 1 (4)]-(1 \rightarrow
3)-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow
5)-Kdo
Adicionalmente, en cada cepa investigada por el
solicitante hasta la fecha, el resto heptosa unido en 1,2 (Hep II)
está sustituido con un resto fosfoetanolamina en la posición 6.
Cada uno de los restos heptosa dentro de la
región del núcleo interno puede proporcionar un sitio para la
elongación por las cadenas de oligosacáridos que contienen hexosa o
para la unión de sustituyentes no carbohidrato. Los datos
publicados (H. Masoud y col., Biochem. 36:
2091-2103, 1997; Risberg y col., Eur. J. Biochem.
261: 171-180, 1999) indican que el resto heptosa
distal (Hep III) en este resto de núcleo interno conservado puede
estar sustituido con un resto
\beta-D-Glcp o
\beta-D-Galp en la posición
O-2. Son también posibles las sustituciones en Hep
II, específicamente con una
\alpha-D-Glucosa o una
\alpha-D-Glucosa sustituida en la
posición 3. El resto
\beta-D-glucosa que está 1,4 unido
al resto heptosa proximal (Hep l) puede él mismo estar además
sustituido con una
\beta-D-glucosa, una
\beta-D-galactosa, una heptosa
(incluyendo
L-glicero-D-mano-heptosa
y
D-glicero-D-mano-heptosa),
o los oligosacáridos de las mismas. Adicionalmente a estos restos
de azúcar, las extensiones de la cadena de oligosacárido pueden
comprender \beta-D-galactosa,
\beta-D-glucosamina,
\beta-D-galactosamina, y ácido
5-N-acetilneuramínico (ácido
siálico).
El grado de sustitución, y extensión de cadena
del resto triheptosilo varía dentro y entre las cepas (Masoud, H.,
Moxon, E. R., Martín, A., Krajcarski, D., y Richards, J. C. (1996)
Biochem. 36, 2091-2103; Risberg, A., Masoud, H.,
Martín, A., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999)(1999) Eur. J.
Biochem. 261, 171-180). Los sustituyentes que
contienen fosfato que incluyen grupos fosfato libre (P),
fosfoetanolamina (PEtn), pirofosfoetanolamina (PPEtn), y
fosfocolina (PCHo) contribuyen a la variabilidad estructural de
estas moléculas. Además, los sustituyentes éster (incluyendo
O-acetilo y O-glicilo) también
contribuyen a la variabilidad estructural de LPS. Son posibles
otras modificaciones de LPS tales como la adición de restos de ácido
siálico. Los oligosacáridos sialilados se encuentran comúnmente en
el tejido de mamíferos y esta modificación se cree que mejora el
mimetismo de las estructuras de tejido humano.
Los estudios estructurales detallados de LPS de
mutantes definidos de la cepa RM 7004 de tipo b (Scheweda, E. K.
M., Hegedus, O. E., Borrell, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W.,
Makell, D. J., y Moxon, E. R. (1993) carbohydr. Res. 246,
319-330; Scheweda, E. K. H., Jansson, P. E., Moxon,
E. R., y Lindberg, A. A. (1995) Carbohydr. Res. 272,
213-224), variantes transformadas de la cepa RM 118
derivada del tipo d (Risberg, A., Scheweda, E. K. H., y Jansson, P.
E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707; Risberg,
A., Alvelius, G., y Scheweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 265,
1067-1074), y mutantes transposones de la cepa a2
del tipo b (Phillips, N. J., McLaughlin, R., Miller, T. J.,
Apicella, M. A. y Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35,
5937-5947) proporcionan evidencia adicional para la
presencia de un resto de núcleo interno trisacárido que contiene
heptosa en LPs de H. influenzae. Se ha enseñado previamente
(Risberg y col., Eur. J. Biochem, 261: 171-180,
1999) la estructura de un LPS de la cepa RM 118 de H.
influenzae que contiene globotetraosa
(\beta-D-GalpNAc-(1 \rightarrow
3)-\alpha-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp)
(Risberg, A., Masoud, H., Martín A., Richards, J. C., Moxon, E. R.
y Scheweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-180), la cepa (Rd) para la que se ha determinado
la secuencia del genoma completa (Fleischmann, R. D., Adams, M. D.,
White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F., Kerlavage; A. R., Butt,
C.J., Tomb, J-F-., Dogherty, B. A., Merrick, J. M.,
McKenney, K., Sutton, G., Fitzhugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D.,
Scott, J. Shirley, R., Liu, L-I., Glodek, A.,
Kelley, J. M., Weidman, J. F., Phillips, C. A., Spriggs, T.,
Hedblom, E., Cotton, M. D., Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen,
D. T., Saudek, D. M., Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritcman, J. L.,
Fuhrmann, J. L., Geoghagen, N. S. M., Gnhem, C. L., McDonald, L. A.,
Small, K. V., Fraser, C. M., Smith, H. C., y venter, J. C. (1995)
Science 269, 496-512). En este estudio, se
identificaron tres poblaciones principales de glicoformas de LPS,
conteniendo todas un grupo PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp
fuera de la Hep unida al resto Kdo (Hep I), pero diferenciándose en
la longitud de las cadenas de oligosacáridos fuera de la Hep distal
(Hep III) del elemento del núcleo interno. Además de las glicoformas
de LPS que expresan una cadena lateral de globotetraosa totalmente
unida, glicoformas secuencialmente truncadas que contienen
globósido (\alpha-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp) y
lactosa (\beta-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp)
se han caracterizado (Risberg,
A., H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180).
A., H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180).
La disponibilidad de la secuencia del genoma
completa de la cepa Rd de H. influenzae facilitaba un estudio
comprensivo de los loci múltiples biosintéticos de LPS en cepas Hi
representativas.
Las cepas no tipificables se obtuvieron del
Prof. estola como parte de un estudio de cohorte de otitis media
finlandesa y se obtienen aislados principalmente del oído interno de
niños. Estas cepas se describen adicionalmente en D. W. Hood y
col., Mol. Microbiol. 33: 679-792, 1999. Se enviaron
cepas de otitis media de 102 NTHi a Richard Goldstein en Boston a
incluir en una inspección de la diversidad de sobre 600 cepas
capsulazas de H. influenzae y de NTHi, obtenidas de
alrededor del mundo y durante un período de 35 años, mediante
análisis de ribotipificación. Cuando se dibujó un dendrograma a
partir de los resultados del ribotipificado, los aislados de otitis
media de NTHi se encontraron que estaban presentes en casi todas las
ramas obtenidas. Las 25 cepas representativas se seleccionaron
entre ramas que se extienden sobre el dendrograma y de este modo
representan la diversidad conocida asociada a la especie de H.
influenzae. Se incluyen en las 25 cepas algunas seleccionadas
entre el mismo racimo que permite una determinación de la diversidad
de los aislamientos estrechamente relacionados.
Muchas funciones de genes predichas estaban
correlacionadas con las etapas particulares en la síntesis del LPS
mediante análisis de la estructura de LPS de las cepas mutantes
apropiadas (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H.,
Martín, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C.,
Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965). La base genética para la expresión de la
estructura de globotetraosa no se ha reseñado previamente.
Como se describe en un ejemplo, el solicitante
empleó una estrategia de huella estructural para determinar y
comparar las estructuras de LPS obtenidas de una serie de mutantes
definidos en los genes biosintéticos de LPS en la cepa RM 118 de
H. influenzae. (Para una descripción de la cepa RM 118, véase
Risberg y col., 1999, supra.) Mediante el examen de LPS de
las cepas en las que están activados genes específicos, el
solicitante presenta la evidencia definitiva que conduce a la
identificación de las glicosiltransferasas implicadas en la
biosíntesis de la región del núcleo interno de la molécula de LPS.
El solicitante también ha identificado los genes implicados en el
conjunto de la cadena lateral de lactosa dializada, como se describe
adicionalmente más adelante. Además, las funciones transferasa de
los genes implicados en la adición de Neu5Ac
\alpha-2,3 unida (lic3A),
\alpha-1,4-unida Galp (lgtC) y
\beta-1,3-unida-GalpNAc
(IgtD) proporcionando las estructuras de globotriosa y
globotetraosa, respectivamente, se determinaron de manera ambigua
mediante ensayos enzimáticos con aceptores sintéticos. esto es el
primer estudio para identificar un plan detallado genético para la
biosíntesis de un resto de oligosacárido de LPS para una cepa de
H. influenzae.
En la investigación del inventor del núcleo
interno de LPS de H. influenzae, intentos para eliminar Kdo,
el primer azúcar añadido al Lípido A, han fracasado repetidamente
presumiblemente ya que Kdo se requiere para completar la síntesis
del Lípido A y de esta manera probablemente esencial para la
viabilidad celular. La función de Kdo transferasa de kdtA se ha
demostrado mediante experimentos de complementación en E.
coli (White, K. A., y Raetz, C. R. H. (1998) FASEB J. 12, L44).
Los estudios del solicitante indican que opsx, rfaF y orfH son los
genes que codifican las enzimas que añaden la primera, segunda y
tercera heptosas (Hep I, Hep II, y Hep III), respectivamente, al
Kdo para formar el núcleo interno. OpsX tiene alguna homología a
las heptosil transferasas de las bacterias entéricas (Hood, D. W.,
Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martín, A., Brisson, J. R.,
Fleischmann, R., venter; J. C., Richards, J. C., y Moxon, E. R.,
(1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965) y corresponde a
un gen responsable de la adición de Hep I a kdo. El rfaF mutante
tiene un gen opsX funcional y su LPS tiene una sola Hep unida a
Kdo-Lípido A. El gen rfaF de RM 118 (Rd) tiene
homología a otras heptosil transferasas (Allen, A. G., Isobe, T., y
Maskell, D. J., (1998) J. bacterial. 180, 35-40).
LPS de RM 118 orfH que tiene genes opsX y rfaA funcionales
comprenden estructuras que contienen dos restos heptosa
(estructuras 1 y 2). Los datos en análisis estructurales de LPS de
los mutantes RM 118 opsX, rfaF, y orfH es consistente con los
obtenidos con las mismas mutaciones en las cepas RM 153 de tipo b
(también conocidas como cepa Eagan) y RM 7004 (Hood, D. W.,
Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martín, A., Brisson, J. R.,
Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C. y Moxon, E. R. Mol.
Microbiol. 22, 951-965). En las cepas de tipo b
opsX, rfaF y orfH se proponen como los genes que codifican las Hep
I, Hep II y Hep III transferasas respectivamente.
El solicitante ha mostrado que LPS de H.
influenzae tiene el resto del núcleo interno de triheptosilo
anteriormente mencionado en el que cada resto heptosa proporciona un
punto para la elongación por las cadenas de oligosacáridos (Masoud,
H., Moxon, E. R., Martín, A., Richards, A., Krajcarski, D., y
Richards, J. C. (1996) Biochem. 36, 2091-2103;
Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R. y
Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-180). Cada uno de los genes IPsA, lic2A, lic3A,
IgtC, IgtD e IgtF codifican las enzimas glicosiltransferasa en al
elongación de oligosacáridos.
Los resultados indican que el producto génico
lpsA juega un papel en el control de la extensión de la cadena de
oligosacáridos desde Hep III. Una mutación en el gen lpsA produce un
LPS truncado en el que Hep III está desprovista de extensiones de
la cadena de oligosacáridos. El análisis de IEP-EM
de LPS O-desacilado derivado de RM 118AlpSA
indicaba una glicoforma que contiene Pcho que contiene un solo resto
hexosa como la especie principal de LPS (Estructura 2), confirmando
que Hep I puede estar sustituida en la ausencia de la extensión de
hexosa desde hep III. Los mutantes lic2A, lgtC y lgtD que contienen
un gen lpsA funcional son capaces de añadir un resto
\beta-D-Glcp en un enlace 1,2 para
iniciar la extensión de la cadena desde Hep III (tabla 4). lpsA es
un homólogo del gen que codifica una glicosiltransferasa en
Pasteurella haemolytica (Potter, M. D. y Lo, R. Y. (1995)
FEMS Microbiol. Lett. 129, 75-81), cuya proteína
tiene homología con el grupo de galactosiltransferasas tipificadas
por Lic2A y LgtB de Haemophilus y Neisseria respectivamente.
en la cepa RM 153, también se encontró que LPS de un mutante lpsa
carecía de cualquier extensión de cadena desde la tercera heptosa
(Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martín, A.,
Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C., Richards, J. C., y
Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965).
Además, el solicitante ha confirmado que los mutantes de LpsA en
varias cepas de NTHi carecen de extensiones de cadenas desde Hep
III. De este modo, LpsA es la transferasa para la adición del primer
azúcar a Hep III en la biosíntesis de LPS de H.
influenzae.
Los mutantes RM 118lic2A mostraban una
glicoforma de hex 2 que contiene Pcho como una especie de LPS
principal (estructura 4) y RM 118 lgtC, que contiene un gen lic2A
funcional, elabora LPS que contiene una cadena lateral de lactosa
en Hep III (estructura 5). Esto es consistente con la implicación
del gen lic2A para añadir la unidad
\beta-D-galp en un enlace 1,4 al
resto terminal \beta-D-Glcp unido
a hep III. Los homólogos de Lic2A en las cepas de tipo b RM 153 y
RM 7004 se ha mostrado que están implicadas en la expresión del
epítope p^{k} que contienen digalactósido (el globósido
trisacárido que tiene la estructura
\alpha-D-Galp-(1 \rightarrow
4)-\beta-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp).
El papel de lic2A, en la expresión de fase variable de este epítope
se ha demostrado previamente (High, N. J., Deadman, M. E., y Moxon,
E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9, 1275-1282). Las
comparaciones de homología con otras secuencias del banco de datos
apoyan la función de Lic2A como una
\beta-galactosiltransferasa. De manera importante
tiene una homología significativa con las proteínas LgtB y LgtE de
Neisseria, ambas son galactosil transferasas (Wakarchuk, W.
Martín, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R., y Richards, J. C. (1996)
J. Biol. Chem. 271, 19166-1917).
El análisis estructural de LPS de una cepa RM
118, mutada en lgtC, confirmó la pérdida de
\alpha-D-galp que soporta la
función \alpha-galactosil transferasa para este
gen. Un homólogo de este gen en N. meningitidis se ha
demostrado que es una \alpha-galactosil
transferasa (Gotschlich, E. C. (1994) J. Exp. Med. 180,
2181-2190; White, K. A., y Raetz, C. R. H. (1998)
FASEB J. 12, L44; Wakarchuk, W. W., Cunningham, A. M., Watson, D.
C. y Young, N. M. 1998. El papel de los residuos básicos pareados en
al expresión de galactosiltransferasas recombinantes activas del
patógeno bacteriano Neisseria meningitidis. Protein
Eng. 11: 295-302; Wakarchuk y col., 1998, Protein
Engineering) lgtC de H. influenzae tiene una repetición de
tetranucleótidos asociada (5`-GACA-3') justo dentro
del extremo 5' y el marco de lectura (44) y / por lo tanto
contribuye al fenotipo variable del oligosacárido en RN 118 LPS.
Correspondientemente, el mutante lgtD y la cepa precursora que
contienen un gen lgtC funcional son capaces de añadir un
\alpha-D-Galp en un enlace 1,4 al
\beta-D-galp terminal del epítope
de lactosa (Estructura 6). La función de LgtC se confirmó mediante
la demostración de la actividad
\alpha-galactosiltransferasa con la proteína LgtC
recombinante y un aceptor FCHASE-Lac sintético. De
esto se deduce que el gen lgtC codifica la
\alpha-galactosiltransferasa específica para la
síntesis del \alpha-D-galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-galp de
la glicoforma de LPS RM 118 Hex4 (Figura 6).
El gen lgtD de H. influenzae es un
homólogo de dos genes de Neisseria, lgtA y lgtD, que añaden
GlcNAc y GalNAc respectivamente LPS de N. gonorrhoeae
(Gotschlich, E. C. (1994) J. Exp. Med. 180,
2181-2190). El producto génico lgtA ha demostrado
que es una glicosil transferasa en N. meningitidis
(Wakarchuk, W., Martín, A., Jennings, M. P., Moxon, E. R., y
Richards, J. C. (1996) J. Biol. Chem. 271,
19166-1917). Existe una homología significativa
entre los genes lgtA y lgtD de Neisseria y la mejor
coincidencia de las bases de datos de RM 118 HI1578 es al gen lgtD
de N. gonorrhoeae. Los ensayos de enzimas con extractos de RM
118 y el mutante lgtD de RM118 establecía la presencia de la
actividad de la \beta-D-galpNAc
transferasa. La cepa precursora RM 118 que contiene un gen lgtD
funcional es capaz de elaboración de la unidad globotetraosa
completa que es indicativa de su papel en la adición de
\beta-D-GalpNAc terminal. El gen
lgtD se ha investigado previamente (llamado lgtA en 6) y se
encontró que no estaba presente en las cepas de tipo b RM 153 y RM
7004. Correspondientemente, el LPS elaborado por la cepa RM 153 no
contiene un resto GalNAc (Masoud, H., Moxon, E, R., Martín, A.,
Krajcarski, D., y Richards, J. C. (1996) Biochem. 36,
2091-2103). Muchas cepas de NTHi se ha encontrado
que contienen el gen LgtD y las cadenas laterales del oligosacárido
de LPS de estas cepas se ha encontrado que contienen un resto
GalNAc.
Es digno de mención que, mientras las
actividades de glicosiltransferasa codificadas por los genes que
implican la adición de los restos distales de las cadenas laterales
de oligosacáridos globotetrosa (lgtD) y globósido se puede
confirmar en un ensayo enzimático con el aceptor sintético
apropiado, los experimentos para ensayar la actividad transferasa
de los genes implicados en al síntesis del resto lactosa (lic2A y
lpsA) no tenían éxito. Es probable que las dos últimas enzimas
tengan más especificidades rigurosas que requieren que el aceptor
de azúcar esté unido a los restos heptosa del núcleo interno,
evitando con lo cual el reconocimiento de los aceptores
FHASE-glicósido sintético sencillo.
La caracterización del conjunto inicial de genes
y cepas mutantes disponibles para el estudio de la biosíntesis de
LPS de RM 118 no proporcionó candidato obvio responsable para la
adición de la unidad -D-GGicp para Hep I. Los genes
de LPS candidatos adicionales se investigaron investigando la
secuencia del genoma de la cepa Rd para coincidencias de baja
homología a los genes que añaden azúcares hexosa a los restos
heptosa en el LPS de otros organismos. Las secuencia de
investigación incluyen los genes rtaK e IgtF de Neisseria,
los genes implicados en la adición de restos hexosa a heptosa
(Kahler, C. M., Carlson, R. W., Rahman, M. M., Martín, L. E. y
Stephens, D. S., (1996). J. Bacterial. 178,
6677-6684). Se identificó un homólogo IgtF en la
cepa RM 118 y análisis del LPS de la cepa mutada en este gen era
indicativo del papel de LgtF en la extensión de cadena a partir de
Hep I. El IEP-EM mostró iones moleculares
correspondientes a una mezcla de glicoformas que tienen extensiones
de cadena a partir de Hep III de un resto del núcleo interno de
triheptosilo, que carece de PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp en
Hep I (Fig. 3).
Los genes IgtF e IpsA son claves para las
extensiones de hexosa a partir de la unidad del núcleo interno que
contiene heptosa de LPS de RM 118, que codifican las enzimas
glicosil transferasa responsables de la adición de la primera
glucosa a Hep I y Hep III, respectivamente. Los procedimientos de
extensión de cadena a partir de tanto Hep I como Hep III parece ser
independiente en gran medida en el LPS de la cepa RM 118. La cepa
mutante RM 118 lpsA produce LPS que incluye el resto
\beta-D-Glcp de Hep I. La cepa RM
118 lgtF produce un LPS heterogéneo que contiene extensiones de
oligosacárido a partir de Hep III que incluyen cadenas lactosa y
globotetrosa. En la cepa RM 153, lpsA aparentemente juega un papel
ligeramente diferente siendo responsable de la adición de galactosa
como la única extensión a partir de la tercera heptosa (Hood,
D-W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H.,
Martín, A., Brisson, C. R., Fleischmann, R., Venter, J. C.,
Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol, 22,
951-965). Sorprendentemente, se determinó que en
ciertas cepas no tipificables, lpsA puede añadir o bien glucosa o
galactosa en la posición O-3 en lugar de la posición
O-2.
La heterogeneidad de la estructura de LPS de
H. influenzae puede ser debida en parte a la variación
intrínseca en la biosíntesis de tal estructura compleja mediante la
que no se sintetizará ninguna molécula hasta la finalización. Sin
embargo, la mayoría de la variación observada parece ser debida a
los genes biosintéticos de LPs específicos capaces de la expresión
variable (variación de fase). El análisis estructural de LPS
derivado delas cepas de RM 118 de tipo salvaje y mutante han
permitido a los inventores por primera vez confirmar los genes
implicados en al síntesis de un epítope variable de fase importante
de LPS de H. influenzae, el digalactósido. En la cepa RM
118, Lic2A añade el \beta-D-Galp
proximal y LgtC el \alpha-D-Galp
terminal al digalactósido
(\alpha-D-galp-(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Galp)
como parte de la extensión de oligosacárido a partir de Hep III
mientras que el mismo epítope se expresa como la extensión terminal
a partir de la segunda heptosa en la cepa RM 118 de tipo b (Masoud,
H., Moxon, E. R., Martín, A., Krajcarski, D., y Richards, J. C.
(1996) Biochem. 36, 2091-2103). Tanto lic2A como
lgtC son genes de fase variable, haciendo la expresión del epítope
altamente variable dentro y entre organismos. El epítope
digalactósido se expresa en el LPS de muchas de las cepas de NTHi
descritas en la presente invención así como en las bacterias
relacionadas, incluyendo Neisseria (Virji, M., Weiser, J.
N., Lindberg, A. A., y Moxon, E. R., (1990) Microb. Pathogen. 9,
441-450). El epítope es potencialmente
inmunodominante y es de interés en la patogénesis ya que su
presencia ofrece el potencial para el mimetismo de estructuras de
huéspedes y pueden influenciar la supervivencia de Haemophilus
influenzae con sistemas experimentales (Weiser, J. N., y Pan, N.
(1998) Mol. Microbiol. 30, 767-775; Hood, D. W.,
Deadman, M. E., Jennings, M. P., Bisceric, M., Fleischmann, R. D.,
Venter, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93,
11121-11125).
La sialilación de oligosacáridos es una
modificación que se cree que mejora el mimetismo de estructuras de
tejidos humanos, ya que, los oligosacáridos dializados se encuentran
comúnmente en tejido de mamíferos. Como se describe en los
ejemplos, el solicitante ha identificado LPS dializado en las cepas
375, 486 y la cepa RD de NTHi, induciendo un papel para lic3A en la
síntesis de LPS (D. W. Hood y col., Mol. Microbiol. 39:
341-350, 2001). Una inspección de 25 cepas de NTHi
representativas de la diversidad de las extensiones de cadenas de
oligosacáridos de LPS dializados de especies identificadas en todas
menos en una. La mutación de lic3A en algunas cepas de NTHi, tal
como NTHi 486, se ha demostrado que tiene una influencia principal
en la resistencia al efecto de muerte del suero humano normal. Una
comparación de las estructuras de LPS de NTHi 486 y su lic3A y su
mutante lic3A reveló la presencia de glicoformas dializadas
(sialilo-lactosa) solamente en la cepa precursora,
que apunta a la importancia de Lic3A para la resistencia en suero en
esta cepa . La adición del resto de ácido siálico cargado a LPS en
Haemophilus influenzae parece modular el mimetismo antigénico
de los epítopes de LPS.
Además del orden y estereoquímica de los restos
azúcar que constituyen la parte oligosacárido de las moléculas de
LPS, localización, tipo y frecuencia de sustituyentes tales como P,
PEtn y PCho pueden tener un efecto profundo en al estructura y la
función biológica. El locus licl se ha mostrado que es esencial para
la adición en fase variable de PCho a la molécula de LPs de H.
influenzae (Weiser, J. N., Shchepetov, M., y Chong, S. T. H.
(1997) Infect. Immun. 65, 943-950; Lysenko, E.,
Richards, J. C., Cox, A. D., Stewart, A., Martín, A., Kapoor, M., y
Weiser, J. N. (2000) Mol. Microbiol. 35, 234-245).
Se ha demostrado que PCho contribuye a la resistencia de H.
influenzae para la inmunidad humoral innata (Weiser, J. N., y
Pan, N. (1998) Mol., Microbiol. 30, 767-775;
Lysenko, E., Richards, J. C., Cox, A. D., Stewart, A., Martín, A.,
Kapoor, M., y Weiser, J. N. (2000) Mol. Microbiol. 35,
234-245). Se ha identificado el gen que codifica una
Kdo quinasa, kdkA, responsable de de la fosforilación de Kdo
(White, K. A., Lin, S., Cotter, R. J., y Raetz, C. H. R. (1999) J.
Biol. Chem. 274, 31391-31400). Este gen se ha
investigado previamente por el solicitante como orfZ y cuando muta
se mostró que altera la supervivencia bacteriana en un modelo de
rata infantil de infección (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T.,
Masoud, H., Martín, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J.
C., Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
952-965). Los únicos sustituyentes restantes en el
oligosacárido del núcleo, cuyo control genético permanece
desconocido, por lo tanto, son los residuos de PEtn que están
unidos a la posición 6 del resto Hep II estequiométricamente y
algunas veces al grupo fosfato en Kdo.
En resumen, se ha aclarado el plan detallado
para la síntesis completa de las extensiones de cadena del
oligosacárido principal de Haemophilus influenzae.
El solicitante ha investigado en exceso 25 cepas
representativas de la diversidad conocida de Haemophilus
influenzae. El solicitante ha confirmado que el resto del núcleo
interno de triheptosilo de LPS (Hep I-Hep III
marcadas) se conserva en todas las cepas ensayadas. esta
determinación permite la síntesis de oligosacáridos adecuados del
resto del núcleo interno de LPS para uso en la preparación de
vacunas que producen protección de amplio espectro contra principal
de Haemophilus influenzae, incluyendo NTHi. También permite
la selección y modificación de cepas de principal de Haemophilus
influenzae que sintetizan los oligosacáridos adecuados del
resto del núcleo interno de LPS para uso en la preparación de
vacunas.
La tabla 1 resume los genes implicados en la
biosíntesis de los principales oligosacáridos que contienen
globotetraosa de LPS en H. influenza Rd que se han
identificado. El solicitante ha identificado los genes que son
responsables para la extensión de cadena a partir de Hep I (lgtF) y
Hep III (lpsA). Además, algunas cepas de Haemophilus
influenzae (por ejemplo, Eagan y RM 7004) elaboran LPS que
pueden mostrar extensión de cadena a partir de Hep II. El
solicitante ha mostrado que un gen en el locus lic2 (orf3) inicia la
extensión de cadena a partir de Hep II. La expresión diferencial de
estos genes puede conducir a un número de epítopes de oligosacáridos
variables que emanan del resto del núcleo interno de triheptosilo
conservado. Mediante mutaciones definidas en estos genes, el
solicitante puede controlar no solamente el grado de complejidad que
una cepa particular de Haemophilus influenzae expresa, sino
también los epítopes disponibles sobre la región central del LPS.
De este modo, LPS de cepas de H. influenzae con mutaciones
definidas en su maquinaria biosintética proporcionó candidatos
adecuados para desarrollar una vacuna de amplio espectro a base de
LPS. El solicitante ha determinado que esta estrategia es útil para
el diseño de vacunas debido a que proporciona reactividad cruzada
contra una diversidad de cepas patogénicas de Haemophilus
influenzae, incluyendo cepas no tipificables que han mostrado
hasta ahora tal variabilidad de LPS ya que desalientan en el
desarrollo de vacunas.
La variación en los patrones de sustitución en
Hep II y Hep III en el núcleo interno de triheptosilo conduce a
epítopes de oligosacáridos del núcleo interno alternativos. Los
siguientes son ejemplos de sustituciones y modificaciones de la
región central interna de LPS de Haemophilus influenzae que
ilustran la invención. Éstas no se pretenden que sean limitantes y
los expertos en la técnica apreciarán que otras sustituciones y
modificaciones son posibles manteniendo las enseñanzas de la
invención.
Basándose en el análisis genómico y genotípico
de LPS de una colección de cepas de NTHi, el solicitante ha
identificado, al mismo tiempo, cepas de Haemophilus
influenzae que expresan LPS con una estructura del núcleo
interno alternativa en la que se produce la extensión de cadena a
partir de O-3 de Hep III en lugar de
O-2. Los genes lpsA homólogos median la adición
específica de \beta-D-Gal o
\beta-D-Glc a la posición
O-2 u O-3 de Hep III dependiendo de
la cepa. Además, algunas cepas de Haemophilus influenzae
expresan LPS, en el que Hep III no está sustituida por cadenas de
oligosacáridos. Estos hallazgos se detallan en los ejemplos.
Los resultados de los ejemplos confirman la
presencia de un elemento del núcleo interno conservado en NTHi.
Estos resultados también proporcionan al mismo tiempo evidencia para
un nuevo motivo estructural, a saber un sitio de sustitución
alternativo en Hep III. La Hep III se ha encontrado anteriormente
que está sustituida por restos hexosa en la posición
O-2, y esto se ha encontrado que es el caso en NTHi,
por ejemplo en las cepas 285 y 1158. En otras cepas de NTHi, por
ejemplo 175 y 486, este patrón de sustitución no se observa. En su
lugar, se produce sustitución en al posición O-3 de
Hep III. Sorprendentemente, se ha mostrado que el gen lpsA puede
añadir un \beta-D-Glcp en algunas
cepas (la cepa RD, Fig. 1) o un
\beta-D-Galp en otras (tipo b,
por ejemplo la cepa Eagan) en un enlace 1,2 para iniciar la
extensión de cadena a partir de Hep III. El solicitante ha
encontrado que un homólogo de lpsA es responsable de la adición de
un resto \beta-D-Glcp o un resto
\beta-D-galp en un enlace 1,3 a
Hep III.
Otra modificación útil de la región del núcleo
interno se refiere al epítope PCho. Esta es una característica
común en las estructuras de superficie de patógenos que residen en
el tracto respiratorio humano incluyendo H. influenzae. En
la cepa de H. influenzae Rd, PCHo está unido a
O-6 de un resto terminal
\beta-D-Glcp en Hep I (estructura
1; R_{1} = PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp;
Fig. 1). En otras cepas de H. influenzae, por ejemplo la
cepa Eagan de tipo b, PCho se une a O-6 de un resto
\beta-D-Galp terminal en Hep III.
(Estructura 1; R_{3} = PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Galp)
(E. K. H. Schweda y col., Eur. J. Biochem., 267 (2000)
3902-3913). Ambos patrones de sustituciones se han
encontrado en las cepas de NTHi. Además, PCho se ha encontrado en
el resto \alpha-D-Glcp terminal.
(Estructura 1, R_{2} = PCho \rightarrow
6)-\alpha-D-Glcp).
La expresión y variación de fase del epítope PCho en el LPS de H.
influenzae requieren los cuatro genes del locus lic1 (J. N.
Weiser y col., Infect. Immun., 65 (1997) 943-950).
Estos genes se han encontrado en cada cepa de NTHi investigada. El
solicitante ha determinado que el polimorfismo en el gen licD afecta
al sitio en el que se añade el PCho.
La naturaleza del patrón de sustitución al resto
del núcleo interno de triheptosilo es relevante a la forma en la
que los epítopes del núcleo interno se presentan al sistema inmune y
son reconocidos por los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, el
solicitante ha encontrado que un anticuerpo monoclonal IgG2a de tipo
murino (L6A9) reconoce un epítope de oligosacárido del núcleo
interno de LPS en cepas que contienen un resto
\beta-D-Galp en
O-2 de hep III; pero no cuando el resto
\beta-D-Galp está ausente o unido
a la posición O-3. La verificación estructural de
la forma de alto peso molecular se muestra en la figura B.
Como se ha establecido anteriormente se han
identificado los genes biosintéticos claves implicados en la
expresión de LPS de H. influenzae. Esto proporcionó al
solicitante la capacidad de construir de cepas mutantes de H.
influenzae que comprenden el resto del núcleo interno
conservado, pero no extensiones de oligosacáridos que imitan las
estructuras de tejidos humanos. Los ejemplos establecen los
resultados de este procedimiento.
El solicitante ha encontrado que los
oligosacáridos que contienen el resto del núcleo interno conservado
de triheptosilo de LPS de H. influenzae son inmunogénicos
cuando se formulan como, por ejemplo, conjugados de proteína,
usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica
(patente de Gu, anteriormente). Por ejemplo, el solicitante ha
mostrado que el de ratones con un conjugado de
oligosacárido-proteína constituido por LPS
O-desacilado del conjugado de la cepa Rdlic1lpsA de
Hi con albúmina sérica bovina (BSA) produce suero inmune que es de
reactividad cruzada con una mayoría de muestras de LPS de un
conjunto genéticamente diversos de las cepas de NTHi (Tabla 7) la
O-desacilación del LPS se logra mediante el uso de
hidracina anhidra. esto tiene el efecto de solubilizar el
oligosacárido de LPS durante la reacción de conjugación posterior
con proteína y conduce a la destoxificación significativa de
componente del Lípido A (patente de Gu, anteriormente). El LPS
O-desacilado se conjuga mediante el grupo carboxilo
del resto Kdo de acuerdo con los procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica (patente de Gu, anteriormente). Los ratones
se proporcionaron con una reinmunización intraperitoneal final con
LPS O-desacilado de la cepa 1003lic1lpsA de Hi
(véanse los ejemplos) El suero inmune de ratón de este experimento
reaccionó con LPs de cepas de NTHi que tienen múltiples extensiones
de cadena del núcleo interno.
LPS de Rdirc1-lpsA elabora el
LPS que es representativo del resto del núcleo interno de
triheptosilo conservado, y contiene glicoformas minoritarias que
tienen extensiones de cadena de oligosacárido que contienen
lacto-N-neotetraosa (LNnT). Esto es
evidente a partir de la reactividad con Mab LLA5 (Tabla 8). El
conjugado LPS O-desacilado-BSA de
Rdlic1lpsA también mostró reactividad con Mab LLA5 así como Mab del
núcleo interno, LLA4. La cepa 1003 de NTHi no elabora LPS que tiene
cadenas de oligosacáridos que contienen LNnT. El solicitante
determinó esto mediante análisis estructural, genético e
inmunoquímico. LPS de esta cepa no reacciona con LLA5, no contiene
el locus genético rfb (Derek Hood, anteriormente). El doble mutante,
1003lic1lpsA expresa LPS que tiene el resto del núcleo interno
conservado sin extensiones de cadena. Es reconocido por Mab
LLA4.
Lo anterior muestra que el resto del núcleo
interno conservado del LPs de H. influenzae (que se presenta
en Rdlic1lpsA por ejemplo) puede inducir una respuesta inmune que es
de reactividad cruzada con LPS de cepas representativas de la
diversidad de la bacteria. La lactosa, LNnT y su análogo dializado
son estructuras de oligosacáridos que se encuentran en tejidos
humanos. Para desarrollar una vacuna basada en LPS, es por lo tanto
preferible asegurar que estas extensiones de oligosacáridos no estén
presentes en la formulación de vacunas. Los experimentos anteriores
proporcionan evidencia que estas extensiones de oligosacáridos son
comunes para todas las cepas de H. influenzae, y el
solicitante ha enseñado la metodología para identificarlas y para
construir las cepas sin ellas.
Por los mismos medios, otras cepas mutantes de
Hi se pueden construir con sustituciones a o modificaciones del
resto del núcleo interno de triheptosilo conservado de LPS que da
como resultado epítopes que inducen una respuesta inmune de amplio
espectro a Hi, incluyendo NTHi, y/o que inducen una respuesta inmune
mejorada debido al mimetismo de, o anulación del mimetismo de
tejidos animales.
Los procedimientos de vacunación para tratar o
prevenir la infección en un mamífero comprende el uso de una
formulación de vacuna de la invención a administrar mediante
cualquier vía convencional, particularmente a una superficie
mucosal (por ejemplo, ocular, intranasal, oral, gástrica, pulmonar,
intestinal, rectal, vaginal, o trato urinario) o mediante la vía
parenteral (por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular,
intravenosa, o intraperitoneal). Las vías preferidas dependen de la
elección de la formulación de vacuna. El tratamiento se puede
efectuar en una sola dosis o repetida a intervalos. La dosificación
apropiada depende de diversos parámetros entendidos por los
expertos en la técnica tal como la propia formulación de vacunas, la
vía de administración o la condición del mamífero a vacunar (por
ejemplo, peso, edad y similares).
Se usan técnicas de laboratorio convencionales
para preparar y purificar lipopolisacáridos en la preparación de
los lipopolisacáridos terapéuticos de la invención. Para uso como
una vacuna, un lipopolisacárido de la invención se formula de
acuerdo con los diversos procedimientos indicados más adelante.
Ya que el componente del lípido A de LPS puede
hacerlo tóxico, preferiblemente el inmunógeno de LPS se destoxifica.
Aunque el uso de hidracina para la destoxificación de LPS de NTHi
se describe en esta memoria descriptiva, el uso de cualquier
reactivo o enzima capaz de eliminar los ácidos grasos unidos por
éster del Lípido A está dentro del alcance de la presente
invención. El LPS seco de la cepa seleccionada de NTHi se suspende
en hidracina líquida anhidra a una temperatura de entre 1ºC y
100ºC; preferiblemente durante un período de aproximadamente
2-3 horas. después de la eliminación de ácidos
grasos unidos a éster. dLPS es conjuga a la hidracida del ácido
adípico de engarce (ADH) antes de la conjugación a las proteínas
vehículo inmunogénicas TT o NTHiHMPs. Aunque ADH es el engarce
preferido, se contempla el uso de cualquier engarce capaz de
establecer y conjugar de manera eficaz dLPS a una proteína
inmunogénica. El uso de engarces se conoce bien en el campo de
vacunas conjugadas (véase Dick y col., Conjugate vaccines, J. M.
Cruse y R. E. Lewis, Jr., eds., karger, Nueva York, p.
48-114).
dLPS se puede unir de manera covalente
directamente al vehículo. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo,
mediante el uso del reactivo glutaraldehído de reticulación. Sin
embargo, en una realización preferida, dLPS y el vehículo se
separan mediante un engarce. La presencia de un engarce promueve la
inmunogenicidad óptima del conjugado y acoplamiento más eficaz del
dLPS con el vehículo. Los engarces separan los dos componentes
antigénicos mediante cadenas cuya longitud y flexibilidad se pueden
ajustar según se desee. Entre los sitios bifuncionales, las cadenas
pueden contener una diversidad de características estructurales,
incluyendo heteroátomos y sitios de escisión. Los engarces también
permiten incrementos correspondientes en las características de
traslación y rotación de los antígenos, incrementando el acceso de
los sitios de unión a los anticuerpos solubles. Además de ADH, los
engarces adecuados incluyen, por ejemplo, engarces
heterodifuncionales tales como ácido epsilon aminohexanoico,
clorohexanol dimetil acetal, D-glucuronolactona y
p-nitrofenil amina. Los reactivos de acoplamiento
contemplados para uso en la presente invención incluyen
hidroxisuccinimidas y carbodiimidas. Muchos otros engarces y
reactivos de acoplamiento conocidos por los expertos en la técnica
son también adecuados para uso en la invención. Tales compuestos se
describen en detalle por Dick y col., anteriormente.
La presencia de un vehículo incrementa la
inmunogenicidad del polisacárido. Además, los anticuerpos inducidos
contra el vehículo son médicamente beneficiosos. Los vehículos
inmunogénicos poliméricos pueden ser material natural o sintético
que contienen un grupo amino primario y/o secundario, un grupo azido
o un grupo carboxi. el vehículo puede ser soluble en agua o
insoluble.
Se puede usar cualquiera de una diversidad de
proteínas vehículo inmunogénicas en la vacuna de conjugado de la
presente invención. Tales clases de proteínas incluyen pelos,
proteínas de la membrana externa y toxinas excretadas de bacterias
patógenas, formas no tóxicas o formas "toxoides" de tales
toxinas excretadas, proteínas no tóxicas antigénicamente similares
a las toxinas bacterianas (materiales de reacción cruzada o CRMs) y
otras proteínas. Los ejemplos no limitantes de los toxoides
bacterianos contemplados para uso en al presente invención incluyen
toxina/toxoide de tétanos, toxina A de P. aeruginosa
destoxificada, toxina/toxoide de cólera, toxina/toxoide de
tosferina y exotoxinas/toxoide de Clostridium perfringens. Se
prefieren las formas toxoides de estas toxinas bacterianas. También
se contempla el uso de las proteínas virales (es decir, antígenos
de superficie/núcleo de la hepatitis B; proteína de rotavirus VP 7 y
proteínas de virus sincitial respiratorio F y G)
Los CRM incluyen CRM.sub.197, equivalente
antigénicamente a la toxina de difteria (Pappenheimer y col.,
Inmunochem, 9: 891-906, 1972) y CRM3201, una
variante genéticamente manipulada de la toxina de tosferina (Black y
col., Science, 240: 656-659, 1988). El uso de las
proteínas vehículo inmunogénicas de fuentes no mamífero incluyen la
hemocianina de la lapa de ojo de cerradura, hemocianina de cangrejo
de herradura y edestina de plantas también está dentro del alcance
de la invención.
Existen muchos procedimientos de acoplamiento
que se pueden vislumbrar para los conjugados de
dLPS-proteína. dLPS se puede activar selectivamente
mediante derivatización de ADH mediada por
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)
carbodiimida (EDC) del grupo del ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico
(KdO) terminal de dLPS, seguido del acoplamiento mediado por EDC a
TT. Como alternativa, otro procedimiento para producir los
conjugados presentes implica la derivatización de cistamina de
dLPS, mediante, por ejemplo, derivatización mediada por EDC, seguida
de la conjugación de disulfuro a proteína derivatizada de
N-succinidil-3-(2-piridilditio)
propionato. Otros procedimientos bien conocidos en al técnica para
efectuar la conjugación de oligosacáridos a proteínas vehículo
inmunogénicas están también dentro del alcance de la invención.
tales procedimientos se describe en, por ejemplo, la patente de
Estados Unidos números 5.153.312 y 5.204.098; documentos EP 0 497
525; y EP 0 245 045.
La relación molar de ADH a dLPS en la mezcla de
reacción está típicamente entre aproximadamente 10 : 1 y
aproximadamente 250 : 1. Un exceso molar de ADH se usa para
asegurar el acoplamiento más eficaz y limitar el acoplamiento de
dLPS-dLPS. En una realización preferida, la relación
molar está entre aproximadamente 50 : 1 y aproximadamente 150 : 1;
en una realización más preferida, la relación molar es
aproximadamente 100 : 1. También se contemplan relaciones similares
de AH-dLPS a tanto TT como HMP en la mezcla de
reacción. En una realización preferida, un ADH por dLPS está
presente en el conjugado AH-dLPS. En otra
realización preferida, en el conjugado final
dLPS-proteína vehículo, la relación molar de dLPS a
vehículo está entre aproximadamente 15 y aproximadamente 75,
preferiblemente entre aproximadamente 25 y aproximadamente 50.
La inmunogenicidad de los conjugados tanto en
ratones como en conejos se potencia mediante el uso de monofosforil
lípido A más trehalosa dimicolato (Ribi-700™; Ribi
Immunochemical Research, Hamilton, Mont) como un adyuvante. Aunque
este adyuvante no está aprobado para uso en seres humanos, los
expertos en la técnica apreciarán que otros adyuvantes
convencionales bien conocidos se pueden usar en la invención,
incluyendo compuestos de aluminio (es decir, alumbre),
lipopolisacárido modificado químicamente, suspensiones de
Bordetella pertussis,
N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina
y otros adyuvantes conocidos por los expertos en la técnica. Se
prefiere particularmente el uso de compuestos de aluminio. tales
adyuvantes se describen por Warren y col. (Ann. Rev. Biochem., 4:
369-388, 1986).
Los conjugados de dLPS-proteína
vehículo para la administración parenteral pueden estar en al forma
de una preparación inyectable estéril, tal como una suspensión
acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión se puede
formular de acuerdo con los procedimientos bien conocidos en la
técnica que usan agentes de dispersión o humectación y agentes de
suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también
puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un
diluyente o disolvente parenteralmente aceptables, tales como una
solución en 1,3-butanodiol. Los diluyentes
adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución de Ringer y solución
de cloruro de sodio. además, aceites estables estériles se pueden
emplear de manera convencional como un medio disolvente o de
suspensión. Para este propósito, cualquier aceite estable blando se
puede emplear incluyendo mono- o diglicéridos. Además, se pueden
usar de manera similar ácidos grasos en la preparación de
preparaciones inyectables.
La vacuna de conjugado de la invención puede
estar en forma soluble o en forma microparticular, o se puede
incorporar en microesferas o microvesículas, incluyendo liposomas.
Aunque se contemplan diversas vías de administración de vacuna que
incluyen, por ejemplo, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal e
intraarterial, la vía preferida es al administración intramuscular.
En una realización preferida, la dosificación del conjugado
administrado variará entre aproximadamente 10 \mug y
aproximadamente 50 \mug. En una realización más preferida, la
cantidad administrada estará entre aproximadamente 20 \mug y
aproximadamente 40 \mug. En una realización más preferida, la
cantidad administrada es aproximadamente 25 \mug. Se pueden
administrar dosis mayores en base al peso corporal. La dosis exacta
se puede determinar mediante protocolos de dosis/respuesta de rutina
conocidos por los expertos en la técnica.
La vacuna de la invención se puede administrar a
mamíferos de sangre caliente de cualquier edad y se adaptan para
inducir la inmunización activa en mamíferos jóvenes, particularmente
seres humanos contra otitis media e infecciones respiratorias
provocadas por NTHi. Como una vacuna de la infancia, el conjugado se
administra a aproximadamente 2 a 4 meses de edad. Típicamente, dos
inyecciones de recuerdo de entre aproximadamente 10 \mug y
aproximadamente 25 \mug se administran a aproximadamente 2 y otra
vez aproximadamente 13 meses después de la inyección inicial. Como
alternativa, estas inyecciones de recuerdo se proporcionan a los 2,
4 y 16 meses después de la inyección
inicial.
inicial.
Los anticuerpos IgG inducidos por la
administración sintética de la vacuna de conjugado se transferirán a
la mucosa local e inactivarán el inóculo de NTHi en las superficies
mucosales (es decir, fosas nasales): El IgA secretor también jugará
un papel en la inmunidad mucosal si la vacuna de conjugado se
administra a la mucosa (es decir, por vía intranasal). De este
modo, la vacuna de conjugación evitará la infección local, así como
sistémica de NTHi.
Los ejemplos describen vacunas de conjugado
usando NTHiRdlic1lpsA. Las vacunas de otras cepas de NTHI están
dentro del alcance de la presente invención y se preparan usando las
mismas técnicas. La cepa Rdlic1lpsA de NYHi. Otras cepas
clínicamente relevantes de NTHi contempladas como fuentes de dLPS
para la generación de una vacuna de conjugado
dLPS-vehículo incluyen las cepas 9274, 2019, 1479,
5657 y 7502 (tipo III, II , I , IV y V, respectivamente) así como
las cepas de la Colección Finlandesa mencionada en esta memoria
descriptiva. estas cepas, así como la cepa 2019, se describen por
Campagnari y col. (Infect. Immun., 55: 882-887,
1987), y Patrick y col. (Infect. Immun., 55:
2902-2911, 1987), y Hood Mol. Microbiol 33:
679-692, 1999, y están generalmente disponibles de
la comunidad de investigación.
Una vacuna multivalente que comprende una mezcla
de conjugados, que tiene cada una un dLPS de una cepa diferente de
NTHi, está también dentro del alcance de la invención. Los expertos
en la técnica apreciarán que LPS de estas otras cepas clínicamente
relevantes se pueden destoxificar mediante la eliminación de ácidos
grasos de ellas, por ejemplo como se describe en Gu y col. (patente
de estados unidos nº 6.207.157). En una realización preferida,
estos dLPS así obtenidos son al menos aproximadamente 5.000 veces
menos tóxicos que el propio LPS. en una realización particularmente
preferida, el dLPS son al menos aproximadamente 10.000 veces menos
tóxicas que dLPS. la determinación de la toxicidad se puede
realizar, por ejemplo, como se describe en Gu y col., (Patente de
estados Unidos Nº 6.207.157).
Las vacunas vivas disponibles en la técnica
incluyen vectores virales tales como adenovirus, alfavirus y
poxvirus así como vectores bacterianos, por ejemplo., Shigella,
Salmonella, Vibrio cholerae, Lactobacillus, Bacille bilié de
Calmette-Guérin (BCG), y Streptococcus.
En el documento WO 92/11361 se describen cepas
de Salmonella typhimurium atenuadas, modificadas por
ingeniería genética para la expresión recombinante de antígenos
heterólogos o no, y su uso como vacunas orales. Las vías preferidas
de administración incluyen todas las vías mucosales; más
preferiblemente, estos vectores se administran por vía intranasal u
oral.
Otras cepas bacterianas usadas como vacunas se
describen para Shigella flexneri en High y col., EMBO (1992)
11: 1991 y Sizemore y col., Science (1995) 270: 299; para
Streptococcus gordonii en Medaglini y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1995) 92: 6868; y para Balille Calmette Guerin en
Flynn J. L. Cell. Mol. Biol (1994) 40 (supl. I): 31, documentos
88/06626, WO 90/00594, WO 91/13157, WO 92/01796, y WO 92/21376.
Una formulación alternativa utiliza la vacuna en
asociación con agentes que asisten en la captación celular. Los
ejemplos de tales agentes son (i) compuestos químicos que modifican
la permeabilidad celular, tal como bupivacaína (véase, por ejemplo,
el documento WO 94/16737), (ii) liposomas para la encapsulación de
los lipopolisacáridos, la vacuna, o LPS parcialmente desacilado, o
(iii) lípidos catiónicos o micropartículas de sílice, oro, o
tungsteno que se asocian ellos mismos con los lipopolisacáridos.
Los liposomas aniónicos y neutros se conocen
bien en la técnica (véase, por ejemplo, Liposomes: A practical
Approach, RPC New Ed, IRL press (1990), para una descripción de los
procedimientos para la preparación de liposomas) y son útiles para
la distribución de un amplio intervalo de productos, incluyendo
vacunas a base de lipopolisacáridos. Para uso en una composición de
la invención, en una realización, una vacuna a base de
lipopolisacárido o derivado de la misma se formula en o con
liposomas, preferiblemente liposomas aniónicos o neutros,
microesferas, ISCOMS, o partículas de tipo virus (VLP) para
facilitar la distribución y/o potenciar la respuesta inmune.
También se conocen en la técnica lípidos
catiónicos. Tales lípidos incluyen Lipofectin™ también conocido
como DOTMA (cloruro de
N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio),
DOTAP
(1,2-bis-(oleiloxi)-3-(trimetilamo-
nio)propano, DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio), DOGS (dioctadecilamidologlicil espermina) y derivados de colesterol tal como DC-Col (3-\beta-(N-(N',N'-dimetilaminometano)-carbamoil) colesterol). Una descripción de estos lípidos catiónicos se pueden encontrar en los documentos EP 187.702, WO 90/11092, patente de estados Unidos Nº 5.283.185, documento 91/15501, documento WO 95/26356, y patente de Estados unidos Nº 5.527.928.
nio)propano, DDAB (bromuro de dimetildioctadecilamonio), DOGS (dioctadecilamidologlicil espermina) y derivados de colesterol tal como DC-Col (3-\beta-(N-(N',N'-dimetilaminometano)-carbamoil) colesterol). Una descripción de estos lípidos catiónicos se pueden encontrar en los documentos EP 187.702, WO 90/11092, patente de estados Unidos Nº 5.283.185, documento 91/15501, documento WO 95/26356, y patente de Estados unidos Nº 5.527.928.
La vía de administración es cualquier vía
convencional usada en el campo de vacunas. Como guía general, una
vacuna basada en lipopolisacáridos de la invención se administra
mediante una superficie mucosal, por ejemplo, una ocular,
intranasal, pulmonar, oral, intestinal, rectal, vaginal, y
superficie del tracto urinario, mediante una vía parenteral por
ejemplo, mediante una vía intravenosa, subcutánea, intraperitoneal,
intradérmica, intraepidérmica, o intramuscular. La elección de la
vía de administración depende de un número de parámetros, tal como
la formulación que se selecciona, y el adyuvante asociado al
lipopolisacárido. una vacuna basada en lipopolisacáridos formulada
en asociación con bupivacaína se puede administrar de manera
ventajosa en los músculos. Cuando se usa un liposoma neutro o
catiónico o un lípido catiónico, tal como DOTMA o
DC-Col, la formulación se puede inyectar de manera
ventajosa mediante las vías intravenosa, intranasal (por aerosol),
intramuscular, intradérmica, y subcutánea. Un lipopolisacárido en
una forma desnuda se puede administrar de manera ventajosa mediante
las vías intramuscular, intradérmica, o subcutánea. Si se usa un
adyuvante mucosal, se prefiere la vía intranasal u oral. Si se usa
una formulación de lípidos o un compuesto de aluminio, se prefiere
la vía parenteral siendo la vía subcutánea o intramuscular la más
preferida. la elección también depende de la naturaleza del agente
de vacuna.
La eficacia terapéutica o profiláctica de una
formulación de vacuna de la invención se puede evaluar como se
describe más adelante. otro aspecto de la invención proporciona (i)
una composición de vacuna que comprende una vacuna basada en
lipopolisacáridos de la invención junto con un diluyente o vehículo;
específicamente (ii) una composición farmacéutica que contiene una
cantidad terapéuticamente eficaz o profiláctica eficaz de una
vacuna basada en lipopolisacáridos de la invención; (iii) un
procedimiento para inducir una respuesta inmune contra
Haemophilus influenzae en un mamífero, mediante la
administración al mamífero de una cantidad inmunológicamente eficaz
de un lipopolisacárido de la invención para inducir una respuesta
inmune contra Haemophilus influenzae en un mamífero,
mediante la administración al mamífero de una cantidad inmunogénico
eficaz de un lipopolisacárido de la invención para inducir una
respuesta inmune protectora a Haemophilus influenzae; y en
particular, (iv) un procedimiento para prevenir y/o tratar infección
por Haemophilus influenzae, mediante la administración de
una cantidad profiláctica o terapéutica de un lipopolisacárido de la
invención a un individuo infectado. De manera adicional, la
invención abarca el uso de una vacuna basada en lipopolisacáridos
de la invención en la preparación de un medicamento para la
prevención y/o tratamiento de infección por Haemophilus
influenzae.
Como se usa en esta memoria descriptiva, la
composición de la invención contiene uno o varios lipopolisacáridos
o derivados de la invención. La composición opcionalmente contiene
al menos un antígeno, o una subunidad, fragmento, homólogo, mutante
o de Haemophilus influenzae o derivado de los mismos.
En una realización, la vacuna a base de
lipopolisacáridos, composición o tratamiento está libre de
adyuvante, específicamente adyuvantes usados comúnmente o
específicamente en roedores. La composición, tratamiento o vacuna
basada en lipopolisacáridos se puede usar para tratar trastornos
cuyos síntomas están provocados o agravados al menos en parte por
infección por Haemophilus influenzae, e incluye trastornos
tales como otitis media, infección respiratoria, meningitis y
neumonía. Las composiciones de lipopolisacáridos preferidas
incluyen las formuladas para la administración in vivo a un
animal, preferiblemente un ser humano, para conferir protección o
tratamiento contra la enfermedad provocada por Haemophilus
influenzae. También se prefieren composiciones formuladas en
forma de micropartículas, cápsulas o liposomas.
Como alternativa, la formulación de vacuna puede
además contener un adyuvante, preferiblemente un adyuvante
apropiado para uso humano o veterinario y que preferiblemente
excluye adyuvantes específicos de roedores. Si es así, es
preferible un adyuvante sistémico que no requiere la administración
simultánea con el fin de mostrar un efecto adyuvante tal como, por
ejemplo, QS21, que se describe en la patente de estados Unidos nº
5.057.546. Se conocen por los expertos en la técnica numerosos
adyuvantes. Loas adyuvantes preferidas se seleccionan como se indica
más adelante.
En una realización, los adyuvantes distintos de
los liposomas y similares también se usan y se conocen en la
técnica. Los adyuvantes pueden proteger el antígeno frente a una
dispersión rápida mediante su secuestro en un depósito local, o
pueden contener sustancias que estimulan que el huésped secrete
factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes
del sistema inmune. Una selección apropiada se puede preparar
convencionalmente por los expertos en la técnica, por ejemplo, de
los descritos en esta memoria descriptiva.
El tratamiento se logra en una dosis única o
repetida según sea necesario a intervalos, como se puede determinar
fácilmente por los expertos en la técnica. Por ejemplo, a una dosis
de cebo siguen tres dosis de recuerdo a intervalos semanales o
mensuales. Una dosis apropiada depende de diversos parámetros
incluyendo el receptor (por ejemplo, adulto o niño), el antígeno de
vacuna particular, y la vía y frecuencia de administración, la
presencia/ausencia o tipo de adyuvante, y el efecto deseado (por
ejemplo, protección y/o tratamiento), como se puede determinar por
los expertos en la técnica. En general, un antígeno de vacuna de la
invención, se administra mediante una vía mucosal en una cantidad
entre aproximadamente 10 \mug y aproximadamente 500 mg,
preferiblemente entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 200 mg.
Para la vía de administración parenteral, la dosis normalmente no
excede de aproximadamente 1 mg, preferiblemente aproximadamente 100
\mug.
Los adyuvantes útiles en cualquiera de las
composiciones de vacuna descrita anteriormente son como sigue. Los
adyuvantes para la administración parenteral incluyen compuestos de
aluminio, tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, e
hidroxifosfato de aluminio. El antígeno se precipita con, o se
adsorbe en, el compuesto de aluminio de acuerdo con protocolos
convencionales. Otros adyuvantes, tales como RIBI (ImmunoChem,
Hamilton MT), se usan en la administración parenteral.
Los adyuvantes para la administración mucosal
incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo, la toxina de cólera,
(CT), la toxina lábil al calor de E. coli (LT) la toxina A de
Clostridium difficile y la toxina de tosferina (PT), o las
combinaciones, subunidades toxoides, o mutantes de los mismos tal
como una preparación purificada de la subunidad B de toxina de
cólera nativa (CTB). Los fragmentos, homólogos, derivados y fusiones
a cualquiera de estas toxinas son también adecuados, con la
condición de que retengan la actividad adyuvante. Preferiblemente,
se usa un mutante que tiene actividad reducida. Los mutantes
adecuados se describe, por ejemplo, en el Documento WO 95/17211
(mutante CT Arg-7-Lys), documento WO
96/06627 (mutante LT Arg-192-Gly),
y documento WO 95/34323 (mutante PT
Arg-9-Lys y
Glu-129-Gly) .Los mutantes LT
adicionales que se usan en los procedimientos y composiciones de la
invención incluyen, por ejemplo los mutantes
Ser-63-Lys,
Ala-69-Gly,
Glu-110-Asp, y
Glu-112-Asp. Otros adyuvantes, tales
como un monofosforil lípido a bacteriano (MPLA) de, por ejemplo,
E. coli, Salmonella minnesota, Salmonella typhimirium, o
Shigella flexneri, o microesferas de polilactida glicolida
(PLGA), también se pueden usar en la administración mucosal.
Los adyuvantes útiles para ambas
administraciones mucosal y parenteral incluyen polifosfaceno
(documento WO 95/02415), DC-col (3
\beta-(N-(N',N'-dimetil
aminometano)-carbamoil) colesterol; patente de
Estados Unidos
Nº 5.283.185 y documento WO 96/14831) y Q3-21 (documento WO 88/09336).
Nº 5.283.185 y documento WO 96/14831) y Q3-21 (documento WO 88/09336).
Cualquier composición farmacéutica de la
invención que contiene un lipopolisacárido, o un anticuerpo de la
invención, se fabrica de una manera convencional. En particular, se
formula con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable,
por ejemplo, agua o una solución salina tal como solución salina de
tampón fosfato. En general, se selecciona un diluyente o vehículo
en base al modo y vía de administración, y la práctica farmacéutica
convencional. Los vehículos o diluyentes farmacéuticos adecuados,
así como las necesidades farmacéuticas para su uso en las
formulaciones farmacéuticas, se describen en Remington's
Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en este
campo y en el USP/NF.
También se describen procedimientos en los que
la infección por Haemophilus influenzae se pueden tratar
mediante administración oral de un polisacárido de Haemophilus
influenzae de la invención y un adyuvante mucosal, en
combinación con un antibiótico, sucralfato, o una combinación de los
mismos. Los ejemplos de tales compuestos que se pueden administrar
con el antígeno de vacuna son antibióticos, por ejemplo, macrólidos,
tetraciclinas, y los derivados de los mismos (los ejemplos
específicos de antibióticos que se pueden usar incluyen
azitromicina o doxiciclina, o inmunomoduladores tales como
citoquinas o esteroides). Además, se usan los compuestos que
contienen más de uno de los componentes enumerados anteriormente
acoplados juntos. La invención también incluye composiciones para
llevar a cabo estos procedimientos, y uno o más de los compuestos
enumerados anteriormente, en un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Las cantidades de los compuestos enumerados
anteriormente usados en los procedimientos y composiciones descritos
en esta memoria descriptiva se determinan fácilmente por los
expertos en la técnica. Los programas de tratamiento/inmunización
también se conocen y se diseñan fácilmente por los expertos en la
técnica. Por ejemplo, los componentes de no-vacuna
se pueden administrar los días 1-14, y el antígeno
de vacuna + adyuvante se pueden administrar los días 7, 14, 21 y
28.
Ciertas cepas de Haemophilus influenzae
que se describen y se mencionan en esta memoria descriptiva se han
depositado con la Autoridad depositaria Internacional de Canadá
(IDAC) localizada en la Oficina de Microbiología, Health Canada,
1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá R3E 3R2. Los
depósitos se han hecho conforme a las previsiones del Tratado de
Budapest. La información del depósito es:
La cepa Rd lic1 lpsA de Haemophilus
influenzae se depositó el 25 de agosto de 2001 bajo número de
acceso IDAC 250801-1.
La cepa 1003 lic1 lpsA de Haemophilus
influenzae se depositó el 25 de agosto de 2001 bajo número de
acceso IDAC 250801-2.
\newpage
La invención descrita y reivindicada en esta
memoria descriptiva no está limitada en su alcance por los
materiales biológicos depositados, y el material biológico
depositado se pretende solamente como una ilustración de la
realización de la invención.
Los siguientes ejemplos ilustran las
realizaciones preferidas de los aspectos de la invención, y no
pretenden limitar el alcance de la invención.
La cepa Rd de H. influenzae se obtuvo
originalmente de Alexander y Leidy (Alexander, H. E., y Leidy, G.
(1951) J. Exp. Med. 93, 345-359) por Herriot. Se
proporcionó a H. O. Smith quien nombró la cepa KW-20
y usó en el proyecto de secuenciación del genoma (Fleischmann, R.
D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F.,
Kerlavage, A. R., Butt, C. J., Tomb, J-F.,
Dougherty, B. A., Merrik, J. M., McKenney, K., Sutton, G.,
FitzHugh, W., Fields, C., Gocaine, J. D., Scout, J., Shirley, R.,
Liu, L-I., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J.
F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D.,
Utterback, T. TR., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M.,
Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritchman, J. L., Fuhrmann, J. L.,
Geohagen, N. S. M., Gnehm, C. L., McDonald, L. A., Small, K. V.,
Fraser, C. M., Smith, H. O., y Venter, J. C. (1995) Science 269,
496-512). Esta misma cepa obtenida del laboratorio
Smith se ha usado por el solicitante (RM 118). Los genotipos de
mutantes derivados de esta cepa se enumeran en la tabla 1. Las cepas
de Haemophilus influenzae se desarrollaron a 37ºC en caldo
de infusión de cerebro y corazón (BHI) suplementado con hemina (10
\mug/ml) y NAD (2 \mug/ml). Para la selección después de la
transformación, se añadió kanamicina (10 \mug/ml) al medio de
crecimiento.
Se usó la cepa DH5 \alpha de Escherichia
coli para propagar productos clonados de PCR y construcciones
génicas y se desarrolló a 37ºC en caldo
Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina (100
\mug/ml) de kanamicina (50 \mug/ml) según se requiera
(Sambrook, J., Fritsch; E. F., y Maniatis, T. (1989). Molecular
Cloning; a laboratory manual 2º edición, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Los genes biosintéticos de LPS supuestos de
habían identificado previamente mediante una investigación "in
silico" de la secuencia del genoma de H. influenzae con
secuencias heterólogas de los genes biosintéticos de LPS a partir
de un amplio intervalo de organismos obtenidos de las bases de datos
disponibles públicamente (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T.,
Masoud, H., Martín, A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J.
C, Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965). El locus RM 118lgtF (HI0653) se
identificó mediante la búsqueda en la base de datos de la secuencia
de la cepa Rd de H. influenzae del Instituto para
Investigación Genómica (TIGR)
www.tigr.org/tdb/CMR/ghi/htmls/SplashPage.html)
para coincidencias con la secuencia de proteínas
de Lgtf de N. meningitidis (Nº de acceso del GenBank
US8765).
Se obtuvieron endonucleasas de restricción y
enzimas de modificación de ADN de Boehringer Mannheim y se usaron de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La Preparación de ADN de plásmido, el análisis
de transferencia de Southern y análisis de hibridación se realizaron
como describen Sambrook y col., (Sambrook, J., Eritch, E. F., y
Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; a Laboratory Manual 2º
edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) - El
ADN cromosómico se preparó a partir de Haemophilus mediante
el procedimiento descrito en otra parte (High, N. J., Deadman, M.
E., y Moxon, E. R., (1993) Mol. Microbiol. 9,
1275-1282).
Aparte de IgtF, se clonaron y se mutaron los
genes biosintéticos de LPS de H. influenzae supuestos como
se ha reseñado previamente (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T.,
Masoud, H., Martín, A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J.
C, Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965). Para el locus lgtF, se diseñaron cebadores
de oligonucleótidos,
| LgtFa |
| (5'-TGGTGGTGGGCAAGACGC-3') |
| y lgtFb |
| (5'-AGCCTGAATTCGACAGCC-3') |
a partir de la secuencia del genoma de la cepa
Rd para amplificar un fragmento de 1461 pares de bases que incluye
HI0653 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las
condiciones para PCR eran durante períodos de 1 minuto de
desnaturalización (94ºC), hibridación (50ºC) y polimerización (72ºC)
durante 30 ciclos. Se ligó 1 \mul de producto de PCR con 50 ng de
plásmido pT7blues de (Novagen) y se transformó en la cepa DH5 de
E. coli. Los plásmidos recombinantes se prepararon a partir
de transformantes después se confirmaron mediante digestión con
endonucleasas de restricción y secuenciando a partir de cebadores
específicos de plásmidos (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T.,
Masoud, H., Martín, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J.
C., Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965). El gen lgtF se inactivó insertando un
módulo de resistencia a kanamicina (liberado mediante digestión con
EcoR1 de pUC4kan, Pharmacia) en un sitio de restricción MunI de 257
pares de bases en el interior del extremo 5' de HI0653 para
proporcionar el plásmido pDQ1.
Se usaron 2-3 \mug de plásmido
linealizado, que contiene genes biosintéticos de LPS mutados, para
transformar la cepa RM 118 de H. influenzae mediante el
procedimiento de MIV (Herriot, R,. M., Meyer, E. M., y Vogt, M. J.
(1970) J. Bacterial. 101, 517-524) y se
seleccionaron transformantes en kanamicina. Para construir la cepa
RM 118 lic1, RM 118 se transformó con 5 \mug de ADN cromosómico
fragmentado aislado del mutante RM 153 correspondiente. La cepa RM
118lic2A se construyó mediante transformación de RM 118 con 1 \mug
de un producto de PCR que incluye lic2A y el gen adyacente ksgA
amplificado a partir de la cepa RM153lic2A.
PCR usaba los cebadores
| L2A |
| 5'-CTCCATATTACATAAT-3' |
| y L2D |
| 5'-AAACACTTAGGCCATACG-3' |
en condiciones como se han descrito
anteriormente. Todos los transformantes se comprobaron volviendo a
cultivar en placas apropiadas de BHI/antibiótico después se
confirmaron como mutantes mediante amplificación por PCR y/o
transferencia de Southern/hibridación de ADN cromosómico digerido
por endonucleasa.
Mutante lpsAlic1. El locus lic1 se
identificó mediante transferencia de un banco de fragmentos de ADN
clonados a partir de RM 7004, que expresa epítopes de LPS
reconocidos mediante anticuerpos monoclonales (mAb) 4C4, 6A2, y
12D9, en la cepa RM 118 que no expresa de manera natural ninguno de
estos epítopes en su LPS. Un fragmento de 4,4 Kb clonado de ADN que
confiere reactividad a los mAb 6A2 y 12D9 se secuenció y se
identificaron cuatro marcos abiertos de lectura (ORF). Estos 4 ORF
se inactivaron juntos mediante supresión de un fragmento Clal/EcoRV
de 2,7 miles de pares de bases a partir del ADN clonado y reemplazo
con un módulo de resistencia a tetraciclina del plásmido pHVT1.
Esta construcción se usó para preparar una mutación lic1 en la cepa
RM 7004 después la cepa RM 118 mediante recombinación homóloga
después de la transformación.
El gen lpsA se identificó a partir de la
secuencia del genoma de la cepa Rd como un homólogo de un gen que
codifica una glicosiltransferasa en Pasteurella haemolytica.
El gen se amplificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) usando los cebadores diseñados a partir de la secuencia del
genoma de Rd. El producto de PCR se clonó en el plásmido pT7Blue
después el gen se fragmentó mediante digestión con Nsil e inserción
de un módulo de resistencia a kanamicina derivado de pUC4kan,
mediante digestión con Pstl. El plásmido resultante se linealizó
después se usó para transformar las cepas RM 118 y NTHi 1003. Los
transformantes se comprobaron mediante PCR para confirmar los
mutantes.
Las cepas doble mutantes RM 118lpsAlic1
(denominadas indistintamente RdlpsAlicl o Rdlic1lpasA) y
1003lpsAlic1 (denominada indistintamente 1003lic1lpsA) se
construyeron mediante transformación de cada uno de los mutantes RM
118 y 1003 lpsA con ADN cromosómico derivado de la cepa mutante RM
118lic1. Las cepas doble mutantes se confirmaron mediante análisis
de PCR de los loci relevantes y el fondo de las cepas se confirmó
mediante digestión con enzimas de restricción y comparación de los
patrones de los fragmentos de ADN sobre geles con las cepas de tipo
salvaje relevantes.
Las cepas se comprobaron posteriormente usando
un número de mAb, cada uno específico para epítopes particulares de
LPS. En cada caso las cepas doble mutantes RM 118 y 1003 lpsAlic1
había perdido reactividad a mAb TEPC-15, un
anticuerpo específico para fosfocolina, cuando se compara con la de
tipo salvaje. La incorporación de fosfocolina en LPS de H.
influenzae depende del locus lic1. El LPS derivado de las cepas
mutantes también se fraccionó en geles de poliacrilamida y se
comparó con el LPS de tipo salvaje relevante. En cada caso la cepa
doble mutante tenía LPS que estaba truncada cuando se compara con
la de cepas de tipo salvaje.
\newpage
La reactividad de las cepas de tipo salvaje y
mutantes de la cepa RM 118 de H. influenzae a anticuerpos
monoclonales específicos de LPS se analizaron como se ha descrito
por Rochey col., (Roche, R. J., High, N. J., y Moxon, E. R. (1994)
FEMS Microbiol. Lett. 120, 279-284).
Los patrones de LPS aislado de cepas de tipo
salvaje y mutantes se determinaron después del fraccionamiento por
electroforesis en gel de
tricina-SDS-poliacrilamida
(T-SDS-PAGE) (véase, A. J.,
Campagnari, A. A., Bittner, W. E., y Apicella, M. A (1990) J.
Immunolog. Methods 126, 109-117) como se ha descrito
previamente (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H.,
Martín, A., Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C.,
Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965).
Células de cultivos de lote de 10 l (10 lotes de
1 l) se recogieron después de crecer durante toda una noche, se
extrajo LPS mediante el procedimiento fenol
caliente-agua. (Westpahal, O. y Jann, K. (1965)
Meth. carbohydr. Chem. 5, 83-91), seguido de
precipitación en etanol como se ha descrito por Thibault y Richards
(Thibault, P. y Richards, J. C. (2000). Se purificó el LPS mediante
ultracentrifugación repetida (105 000 g, 4ºC, 2 x 5 h) y se
analizaron las muestras como sus derivados
O-desacilados (LPS-OH). La
O-desacilación se logró mediante mezclado del LPS
(1-10 mg) con hidracina anhidra
(0,2-1 ml) a 37ºC durante 1 hora como se ha
descrito previamente (Holst, O., Broer, W.,
Thomas-Oates, J. E., Mamat, U., y Brade, H. (1993)
Eur. J. Biochem. 214, 703-710). Los azúcares se
identificaron mediante cromatografía gas-líquido
espectrometría de masas (CGL-EM) como sus acetatos
de alditol como se ha descrito previamente (Jarosik, G. P., y
Hansen, E. J., (1994) Infect. Immun. 62,
4861-4867). El análisis de enlace se llevó a cabo
después de la acetilación de los oligosacáridos con anhídrido
acético (0,5 ml) y 4-dimetilaminopiridina (0,5 mg) a
temperatura ambiente durante 24 horas. Después el material
peracetilado se trató con yoduro de metilo en dimetilsulfóxido en la
presencia de metilsulfinilmetanida de litio para producir los
oligosacáridos metilados que se recuperaron usando un cartucho
SepPak™ C18 y se sometieron a análisis de azúcar (Blakeney, A. B. y
Stone, B. A. (1985) Coabohydr. Res. 140, 319-324).
las proporciones relativas de los diversos acetatos de alditol y los
acetatos de alditol metilados parcialmente obtenidos en azúcar y
los análisis de metilación se midieron a partir de respuestas del
detector de CGL-EM y están sin corregir.
CGL-EM se llevó a cabo con un cromatógrafo Delsi
Di200™ equipado con un espectrómetro de masas de cuadripolo NERMAG
R10-10H™ o con un sistema Varian lontrap™ usando
una columna capilar de sílice de pirólisis DB-5 (25
m x 0,25 mm x 0,25 \mum) y un gradiente de temperatura de 160ºC
(1 min) \rightarrow 250ºC a 3ºC/min. La espectrometría de masas
de ionización por electropulverización (IEP-EM) se
realizó en un espectrómetro de masas VG Quatro™ (Micromass
Manchester, Reino Unido) en el modo de ion negativo. Las muestras se
disolvieron en agua y después se mezclaron en una relación 1 : 1
con acetonitrilo acuoso al 50% que contenía ácido acético al 1%.
Las soluciones de la muestra se inyectaron mediante una bomba de
jeringa en un disolvente de desarrollo de H_{2}O : CH_{3}CN (1
: 1) a un caudal de 5 \mul/min. Los espectros de ^{1}H RMN de
una dimensión (1D) se registraron a 500 MHz para soluciones en
óxido de deuterio a 22ºC, después de varias liofilizaciones con
D_{2}O, en un espectrómetro Bruker AMX 500™. Para potenciar la
resolución espectral, perdeutero-EDTA (2 mM) y
perdeutero-SDS (10 mg/ml) se añadieron a las
soluciones de D_{2}O (Risberg, A., Schweda, E. K. H., y Jansson,
P. -E. (1997). Eur. J. Biochem. 243, 701-707). Los
desplazamientos químicos están referenciados a la resonancia de
protón de metilo (\delta: 2,225 ppm) de acetona interna.
La enzima codificada por lgtD se ensayó con el
aceptor sintético FCHASE-P^{k} usando
electroforesis capilar para la detección del producto. La
electroforesis capilar se realizó esencialmente como se ha descrito
previamente (Wakarchuk, W., Martín, A., Jennings, M. P., Moxon, E.
R., y Richards, J. C., (1996) J. Biol. Chem. 271,
19166-1917). FCHASE-P^{k} se
sintetizó a partir de FCHASE-lac usando la enzima de
LgtC de Neisseria meningitidis como se ha descrito
anteriormente (Wakarchuk, W. W., y col., Protecin Eng. 11:
295-302, 1998). Las condiciones de reacción eran
aceptor 0,5 mM, 1 mM UDP-GalNAc, 50 mM
HF-PES-NaOH pH 7,0, 10 mM
MgCl_{2}. El extracto se preparó sonicando las células, y después
recogiendo la fracción de membranas mediante centrifugación a
100.000 x g durante 30 minutos. Tanto RM 118 como la RM 118:lgtD
mutante se analizaron. la pequeña cantidad de producto se aisló
mediante TLC como se ha descrito previamente (Wakarchuk, W., Martín,
A., Jennings, M. P., Moxon, E. R., y Richards, J. C., (1996) J.
Biol. Chem. 271, 19166-1917). Debido a que la
conversión del producto era pequeña, también se aisló algo del
material de partida con él. La mezcla recuperada se dividió en 2
partes iguales y después se trató con
\beta-hexosaminidasa como recomienda el proveedor
de enzima (NEB). El producto de la reacción de LgtD se mostró que
tenía especificidad \beta-anomérica mediante
digestión con \beta-hexosaaminidasa.
La actividad para LgtC estaba por debajo del
límite de detección en los extractos de RM118, de manera que el gen
se clonó en vector de expresión y se ensayó la actividad en E.
coli. El gen se amplificó mediante PCR (como se ha descrito
anteriormente usando cebadores
\newpage
| lgtCa |
| 5' GGG GGG CAT ATG GGA CGG ACT GTC AGT CAG ACA ATG |
| y lgtCb |
| 5' GGG GGG GTC GAC TCA TTA ATT ATC TTT TAT TCT CTT TCT TAAT C |
Después el gen se insertó en plusat pCWori los
sitios Ndel y Sall de manera similar a lo descrito para lgtC de
N. meningitidis (Wakarchuk, W. W., y col., Protein Eng. 11.
295-302, 1998). Los extractos brutos sonicados del
clon recombinante se ensayaron con 1 mM FCHASE-Lac,
1 mM UDP-Gal, 10 mM MnCl_{2}, 5 mM DTT, 50 mM
HEPES pH 7,5. La enzima se mostró que era inestable en E.
coli y necesitaba ensayarse dentro de unas pocas horas en que
se prepararon los extractos (datos no mostrados). El producto de la
reacción enzimática se analizó mediante digestión con glicosidasa
específica, espectrometría de masas y
co-cromatografía con FCHASE-p^{k}
auténtico (datos no mostrados).
El conjunto de mutantes preparados como se ha
indicado anteriormente se usó para investigar en detalle la base
genética de la biosíntesis de la parte oligosacárida de LPS de la
cepa RM 118 de H. influenzae, la cepa índice a partir de la
que se derivó la secuencia del genoma completa. La Tabla 1 enumera
los genes que los inventores han investigado. Las construcciones de
ADN usadas para mutar la mayoría de estos genes se ha reseñado
previamente (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H.,
Martín, A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C,
Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22,
951-965). Cada construcción consistía en un vector
de plásmido en el que se clonó un gen de LPS supuesto, con un gen de
resistencia a kanamicina insertado dentro del extremo 5' (primer
tercio) del marco predicho de lectura. No existía ningún gen
candidato obvio responsable de la adición de la glucosa a la primera
heptosa (HeP). La búsqueda de la base de datos de la secuencia del
genoma de Rd con la secuencia de lgtF de Neisseria
proporcionó una coincidencia (31% de identidad sobre 247
aminoácidos) al marco de lectura HI0653. lgtF se amplificó mediante
PCR a partir del ADN cromosómico de las cepas RM 118 y RM 153. El
producto clonado de la cepa RM 118 se inactivó mediante inserción
de un módulo de kanamicina para proporcionar el plásmido pDQ1 y se
usó para transformar las cepas de H. influenzae. lic 1 y
lic2A son loci biosintéticos de LPS de fase variable (High, N. J.,
Deadman, M. E., y Moxon, E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9,
1275-1282; Weiser, J. N., Love, J. M., y Moxon, E.
R. (1989) Cell 59, 657-665). lic1 se ha mostrado
que está implicado en la adición de grupos PCho a LPS de H.
influenzae (Weiser, J. N., Shchepetov, M., y Chong, S. T. H.
(1997) Infect. Immun. 65, 943-950). Para cada locus,
la cepa RM118 se transformó usando las construcciones de gen mutado
(10-10^{5} transformantes/\mug de ADN de
entrada). Para la mayoría de loci RM 118 era la fuente de ADN que se
había clonado pero en varios casos el ADN derivado de la cepa RM
153 se usó como donante sin cambio en la eficacia de transformación.
Los genes responsables para la síntesis del primer azúcar añadido
al lípido A, Kdo, (kdsA, kdsB) y la Kdo transferasa (kdtA) se han
identificado a partir de la secuencia del genoma (Fleischmann, R.
D., Adams, M. D., White, O., Clayton, R. A., Kirkness, E. F.,
Kerlavage, A. R., Butt, C. J., Tomb, J-F.,
Dougherty, B. A., Merrick, J. M., McKenney, K., Sutton, G.,
Fitzhugh, W., Fields, C., Gocayne, J. D., Scott, J. Shirley, R.,
Liu, L-I., Glodek, A., Kelley, J. M., Weidman, J.
F., Phillips, C. A., Spriggs, T., Hedblom, E., Cotton, M. D.,
Utterback, T. R., Hanna, M. C., Nguyen, D. T., Saudek, D. M.,
Brandon, R. C., Fine, L. D., Fritcman, J. L., Fuhrmann, J. L.,
Geoghagen, N. S. M., Gnhem, C. L., McDonald, L. A., Small, K. V.,
Fraser, C. M., Smith, H. C., y venter, J. C. (1995) Science 269,
496-512). Los intentos para construir cepas mutadas
en el gen kdtA, usando una diversidad de construcciones de plásmido
no proporcionaron ningún transformante. Esto es similar a los
hallazgos con las cepas de tipo b (Hood, D. W., Deadman, M. E.,
Allen, T., Masoud, H., Martín, A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R.,
Venter, J. C, Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol.
22, 951-965) y se asume que es debido a la no
viabilidad de este mutante. El LPS aislado de RM 118 y las cepas
mutantes isogénicas se analizó mediante
T-SDS-PAGE (datos no mostrados). Las
cepas mutadas en los genes más probablemente codificaban las
glicosiltransferasas para la síntesis de oligosacáridos de RM 118, y
que mostraron un patrón alterado de las bandas de LPS cuando se
compara con el de tipo salvaje mediante
T-SDS-PAGE (Figura 1), se
seleccionaron para el análisis estructural detallado de su LPS como
se describe más adelante. También se investigó un mutante en el que
el locus licl está inactivado.
El análisis de LPS de la cepa RM 118 mediante
T-SDS-PAGE mostró un patrón
heterogéneo de bandas correspondientes en movilidad electroforética
a poblaciones de LPS de baja masa molecular compuesto de lípido A y
componentes de oligosacáridos que difieren en el número de residuos
de azúcar unidos (Figura 1). El solicitante ha mostrado previamente
que la cepa RM 118 crecida en condiciones similares expresa
poblaciones de LPS que contienen tres a cinco restos de glucosa
unidos a un elemento del núcleo interno común (Risberg, A., Masoud,
H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H.
(1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180). LPS de las
cepas con mutaciones en licl, lgtF, y lgtD mostraron patrones de
bandas complejos similares, mientras que las de las cepas con las
mutaciones lgtC, lic2A, lpsA, orfH, rfaF, y opsX proporcionan menos
patrones complejos que comprenden bandas que tienen movilidades más
rápidas consecutivamente consistente con supresiones sucesivas de
azúcar. La identificación de la naturaleza y localización de las
supresiones de azúcar en las muestras de LPS de las cepas mutantes
se lograron mediante análisis estructural comparativo. LPS se
extrajo a partir de mutantes isogénicas de la cepa RM 118 después
de crecimiento en cultivo líquido. La huella estructural se realizó
usando el análisis de IEP-EM y 1D ^{1}H RMN de las
muestras de LPS O-desacilado
(LPS-OH), obtenidas después del tratamiento con
hidracina anhidra. Además, se llevaron a cabo análisis de glucosa y
enlace sobre muestras de LPS intacto. Una comparación de los datos
obtenidos a partir de las cepas mutantes que contienen los genes de
la glicosil transferasa supuestos específicamente inactivados con la
del modelo estructural para el LPS de RM 118 que contiene
globotetrosa (Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards, J. C.,
Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-180) establecía las características
estructurales clave de las glicoformas de LPS alterados.
IEP-EM proporciona una herramienta valiosa para
investigar la composición estructural de LPS de baja masa molecular
(Gibson, B. W., Melaugh, W., Phillips, N. J., Apicella, M. A.,
Campagnari, A. A., y Griffis, J. M. (1993) J. bacterial. 175,
2702-2712; Masoud, H., Moxon, E. R., Martín, A.,
Krajcarski, D., y Richards, J. C. (1996) Biochem. 36,
2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martín, A.,
Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J.
Biochem. 261, 171-180; Risberg, A., Schweda, E. K.
H., y Jansson, P. E. (1999) Eur. J. Biochem. 243,
701-707)., Phillips, N. J., MaLaughlin, R., Miller,
T. J., Apicella, M. A. y Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35,
5937-5947). Los datos de IEP-EM
obtenidos en el modo de ion negativo sobre las muestras de LPS
O-desacilado se presentan en la Tabla 2. Las
muestras de LPS-OH de las cepas mutantes
proporcionaron los datos consistentes con la presencia de
oligosacáridos unidos mediante
Kdo-4-fosfato a un resto Lípido A
O-desacilado común que difiere en el número de
sustituyentes que contienen heptosa, hexosa y fosfato (Phillips, N.
J., Apicella, M. A., Griffis, J. M. y Gibson, B. W. (1992) Biochem.
31, 4515-4526; Masoud, E. R., Martín, A.,
Krajcarski, D., y Richards, J. C. (1996) Biochem. 36,
2091-2103; Risberg, A., Masoud, H., Martín, A.,
Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J.
Biochem. 261, 171-180; Schweda, E. K. H., Hegedeus,
O. E., Borrelli, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W., Maskell, D.
J., y Moxon, E. R. (1993) Carbohydr. Res. 246,
319-330; Schweda, E. K. H., y Jansson, P. E.,
Moxon, E. R., y Lindberg, A. A., (1995) Carbohydr. Res. 272,
213-224; Risberg, A., Schweda, E. K. H., y Jansson,
P. E. (1997) Eur. J. Biochem. 243, 701-707;
Phillips, N. J., McLaughlin, R., Miller, T. J., Apicella, M. A. y
Gibson, B. W. (1996) Biochem. 35, 5937-5947). El
mutante opsX. La inactivación de opsX dio lugar, a LPS
profundamente bruto, que estaba desprovisto de restos heptosa o
hexosa, que contenía solamente un Kdo fosforilado unido al resto de
Lípido A (Tabla 2). Los inventores han mostrado previamente que la
mutación en el gen opsX de la cepa RM 153 de tipo b de H.
influenzae da como resultado el truncamiento del LPS entre Hepl
y Kdo (Hood, D. W., Deadman, M. E., Allen, T., Masoud, H., Martín,
A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R., Venter, J. C, Richards, J. C.,
y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol. 22, 951-965).
El análisis de EM-EM de la muestra de
LPS-OH mediante la activación de colisión de baja
energía del ion molecular doblemente cargado (m/z 625) produjo un
fragmento iónico principal en m/z 951
(Lípido-A-OH) que surge de la
escisión del enlace de la
Kdo-\beta-D-glucosalina
(datos no mostrados). La masa de este fragmento iónico es
consistente con la esperada para el Lípido A-OH de
H. influenzae (Helander, I. M., Lindner, B., Brade, H.,
Altmann, K., Lindberg, K. K., Rietschel, E. T., Y Zahringer, U.
(1988) Eur. J. Biochem. 177, 483-492). Es evidente
que los mutantes opsX de RM 118 y RM 153 expresan LPS similar al de
la cepa mutante Rdisn (169) previamente caracterizado (Helander, I.
M., Lindner, B., Brade, H., Altmann, K., Lindberg, K. K.,
Rietschel, E. T., Y Zahringer, U. (1988) Eur. J. Biochem. 177,
483-492).; Preston, A., Maskell, D., Jonson, A., y
Moxon, E. R. (1996) J. Bacterial. 178, 396-402). El
fenotipo de l69 LPS surge de una mutación en el gen gmhA
biosintético de heptosa (Brook, J. S., y Valdano, M. A
(1996)j . Bacterial. 178, 3339-3341), que
produce la cepa mutante incapaz de añadir heptosa a su LPS.
Mutante rfaF. El análisis de ^{1}H RMN
de LPS-OH de RM 118rfaF mostró, además de la
resonancia de ^{1}H esperada del resto de glucosalina
\alpha-unido del lípido A, una resonancia de
protón anomérica (\sim 5,19 ppm) en la región de campo baja de una
sola unidad de heptosa. El análisis de azúcar confirmó que el
residuo Hep es
L-glicero-D-mano
heptosa. De manera correspondiente, el espectro
IEP-EM estaba dominado por un solo ion doblemente
cargado abundante a m/z 721,6 consistente con la estructura,
Hep_{1}-Kdo-Lípido
A-OH (tabla 2).
Mutante orfH. Los organismos en los que
el gen orfH está inactivado proporcionaron una mezcla de glicoformas
de LPS, conteniendo cada una dos restos Hep, como se evidencia de
los datos de IEP-EM (Tabla 2). Además de la
población principal de las glicoformas que contienen un resto
adicional Hep, es decir Hep_{2} \cdot PEtn
_{0-2} \cdot (Kdo-Lípido
A-OH, comparada con el LPS de RM 118rfaF, eran
especies que contenían una unidad Hex-PCho. El
análisis de azúcares indicó la presencia de
D-glucosa y los protones metilo de PCho proporcionó
una señal intensa en la ^{1}H RMN a 3,24 ppm. Como se esperaba,
LPS de esta cepa reaccionó con TEPC-15, un
anticuerpo monoclonal específico de PCho (Mab) (Weiser, J. H.,
Shchepetov, M., y Chong, S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65,
943-950), en experimentos de inmunotransferencia.
Los análisis de enlace revelaron la presencia de restos Hep
terminal, Hep 3 sustituida y Hep 3,4 disustituida (Tabla 3).
Basándose en la estructura de la cepa precursora, estos datos son
consistentes con RM 118orfH que tiene la capacidad de elaborar LPS
que expresa las dos estructuras 1 y 2 de glicoformas principales
(PEtn muestra sustitución parcial).
Estructura 1: R^{1} = H
Estructura 2: R^{1} =
PCho(6)-\beta-D-Glcp
La existencia de dos bandas para el LPS de RM
118orfH cuando se analiza por
T-SDS-PAGE (Figura 1) es consistente
con la conclusión.
Mutante lpsA. El análisis de
IEP-EM de LPS-OH de RM 118lpsA
indicó que contenía las glicoformas que tienen un resto Hep
adicional cuando se compara con RM 118orfH (Tabla 2), siendo la
glicoforma de Hex1 que contiene fosfocolina la especie de LPS
principal (Figura 2). El análisis de enlace era consistente con la
adición secuencial de la heptosa a la Hep terminal en la estructura
2 (Tabla 3). De manera correspondiente, el espectro de ^{1}H RMN
de esta muestra de LPS O-desacilada mostró el patrón
característico en la región del campo baja (5,0-6,0
ppm) para el elemento del núcleo interno de
tri-heptosa de LPS (Hep II, 5,76 ppm; Hep I/Hep III,
5,16/5,15 ppm) de H. influenzae (Figura 3) (Risberg, A.,
Masoud, H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R., y Schweda,
E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261, 171-180).
Estos datos son consistentes con el LPS derivado de RM 118 lpsA que
tiene la estructura 3. (Figura 2, tabla 4).
Mutante lic2A. El análisis de
IEP-EM de LPS O-desacilado de RM
118lic2A reveló la presencia de las glicoformas Hex2 como la
especie de LPS principal (Tabla 2). El análisis de composición del
LPS de RM 118lic2A indicó la presencia de D-glucosa
como la única hexosa neutra, el análisis de enlace indicada que era
un resto terminal (Tabla 3). Una proporción significativa de restos
de heptosa unidos en 2 también se reveló mediante análisis de
enlace. Merece la pena hacer notar, que los restos de heptosa
2-sustituidos no se detectaron en la muestra de LPS
del mutante lpsA debido a la sustitución de ese resto por grupos
PEtn (cf. Estructura 3) que no son fácilmente excindibles en las
condiciones de hidrólisis empleadas en el procedimiento de análisis
de enlace. De acuerdo con estos hallazgos, se puede concluir que
LPS del mutante lic2A difiere del mutante lpsA porque lleva un
resto glucosa en la posición 2 de Hep III como se muestra en la
Estructura 4. (Tabla 4). La presencia de una señal de ^{1}H RMN
adicional a 4,65 ppm indicaba que el D-Glcp terminal
tiene la configuración \beta, el valor del desplazamiento campo
arriba de la resonancia para Hep II (5,58 ppm) comparado con la del
análogo no sustituido, (5,76 ppm) siendo indicativo del enlace 1,2
a Hep III (estructura 4) (Masoud, H., Moxon, E. R., Martín, A.,
Krajcarski, D., y Richards, J. C. (1996) Biochem. 36,
2091-2103; Schweda, E. K. H., Hegedeus, O. E.,
Borrelli, S., Lindberg, A. A., Weiser, J. W., Maskell, D. J., y
Moxon, E. R. (1993) Carbohydr. Res. 246, 319-330;
Schweda, E. K. H., y Jansson, P. E., Moxon, E. R., y Lindberg, A.
A., (1995) Carbohydr. Res. 272, 213-224.
Mutante lic3A. De manera similar, se
generó un mutante que permitía la investigación de glicoformas
dializadas. Estos estudios confirmaron la carencia de ácido siálico
en el mutante lic3A relevante. La preparación del mutante se
describe en Hood y col., Mol. Microbiol. 39:
341-350, 2001. La glicoforma sialilada se encontró
que estaba ausente en las cepas que contienen una ruptura del gen
lic3A. Lic3A he demostrado que tiene una actividad
sialiltransferasa, que está modificada por la acción de otra
glicosil transferasa de fase variable, lgtC, que compite por el
mismo aceptor de lactosilo.
Mutante lgtC. En el mutante RM 118lgtC,
el análisis de IEP-EM de la muestra de LPS
O-desacilada reveló la presencia de glicoformas
Hex3. El análisis de azúcar indicó que el LPS del mutante lgtC
contenía D-galactosa, que mediante análisis de
enlace se encontró que estaba presente como un resto terminal (Tabla
3). El análisis de enlace también reveló restos
D-Glcp unidos en 4 consistentes con el hecho de que
la glicoforma Hex 3 principal (Tabla 3) estuviera sustituida con un
resto lactosa en Hep III (Estructura 5). El espectro de ^{1}H RMN
del LPS-OH es idéntico al reseñado previamente por
los inventores (Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards, J.
C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-180) para la lactosa que contiene la glicoforma
de LPS de Hex3 que está presente en la cepa precursora. En N.
meningitidis, el gen lgtC se ha mostrado que codifica una
1,4-\alpha galactosil transferasa (Wakarchuck, W.
W., Cunningham, A. M., Watson, D. C., y Young, N. M. 1998. Role of
paired basic residues in the expression of active recombinant
galactosyltransferases from the bacterial pathogen Neisseria
meningitidis. Protein Eng. 11: 295-302). Una
función similar se demostró para lgtC de RM 118 mediante el examen
de la actividad transferasa de la enzima recombinante y mediante el
análisis del LPS a partir del mutante RM 118lgtC.
Mutante lgtD. Una mezcla de las
glicoformas de LPS Hex3 y Hex4 se elaboraron mediante RM 118 de
H. influenzae en la que el gen lgtD está inactivado (Tabla
2). Por lo tanto, se observaron dos bandas tras análisis de
T-SDS-PAGE del LPS, una
correspondiente en la movilidad electroforética a la del mutante
lgtC y una banda migratoria más lenta (Figura 1). LPS de esta cepa
mutante contenía los restos D-Galp terminal y unido
en 4 (Tabla 3). Una comparación de los espectros de 1D ^{1}H RMN
con los de la cepa precursora y su mutante lgtC, apuntaba a la
presencia de una unidad
\alpha-D-Galp-(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Galp en
la glicoforma Hex 4, siendo una señal en 5,01 ppm indicativa del
resto \alpha-D-galp terminal
(estructura 6) (Tabla 4). El producto génico lgtD se investigó para
evaluación de la actividad glicosil transferasa con el aceptor
sintético, FCHASE-p^{k}. Una comparación de las
cepas RM 118 precursora y el mutante lgtD en el ensayo CE mostró la
carencia de la actividad transferasa de
\beta-galpNAc en el mutante (Figura 4).
Mutante lgtF. La mutación del gen lgtF en
H. influenzae proporcionó una cepa a partir de la que el LPS
ni reaccionaba con Mab TEPC-15 (datos no mostrados)
ni mostraban la señal del protón metilo de PCho característica
(3,24 ppm) en su espectro ^{1}H RMN. El análisis de enlace
indicaba que LPS carecía del residuo terminal
\beta-D-Glcp, que contiene
solamente los restos de Hep I
mono-3-sustituidos (Tabla 3). Una
distribución similar de glicoformas, como s encontró en el LPs de
la cepa precursora, que difiere en la longitud de la cadena de
oligosacáridos de Hep III se observó para LPS-OH del
mutante lgtF en su IEP-EM (tabla 2). Merece la pena
destacar que la extensión total de la unidad de globotetraosa de Hep
III se puede producir en la ausencia o la presencia del resto
\beta-D-Glcp en Hep I (Figura 5).
El solicitante ha mostrado que la cepa precursora puede elaborar
poblaciones mixtas de las glicoformas de LPS en la que la unidad de
galabiosa está alargada mediante la adición de un resto terminal
\beta-D-galpNAc que proporciona
las unidades de glabotraosa
\beta-D-GalpNAc-(1 \rightarrow
3)-\alpha-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp
(Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E.
R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-180).
Mutante lic1. El análisis de
IEP-EM de la forma de LPS
O-desacilada del mutante lic1 proporcionó una mezcla
heterogénea similar de glicoformas (Tabla 2) como la observada en
la cepa precursora (Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards,
J. C., Moxon, E. R., y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem.
261, 171-180), pero que carece de la presencia de
sustituyentes PCho. El locus lic. se ha mostrado que contiene genes
responsables de la expresión de sustituyentes de PCho en la
posición 6 de \beta-D-Glcp unida a
la heptosa 3,4-disustituida (Hep I) en RM 118
(Risberg, A., Masoud, H., Martín, A., Richards, J. C., Moxon, E. R.,
y Schweda, E. K. H. (1999) Eur. J. Biochem. 261,
171-190); Weiser, J. N., Shchepetoov, M., y Chong,
S. T. H. (1997) Infect. Immun. 65, 943-950). El
examen del espectro de ^{1}H RMN de LPS
O-desacilado de RM 118licl reveló la ausencia de la
señal de protón metilo de PCHo característica a 3,24 ppm.
Adicionalmente el LPS de este mutante lic., como se esperaba (34),
no reaccionó con Mab TEPC-15 (datos no
mostrados).
En la cepa 2019 de NTHi, Hep I está sustituida
con lactosa (R_{1} =
\beta-D-Galp-(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp;
R_{2}/R_{3} = H) (N. J. Phillips y col., Biochemistry, 31 (1992)
4515-4526), En la cepa 375 de NTHi, Hep III está
sustituida con lactosa sialilada en una población de glicoformas
secundarias (R_{1} =
\beta-D-Glcp, R_{2} = H,
R_{3} =
Neu5Ac-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp-(1
\rightarrow 2)). (D. W. Hood y col., Mol. Micro. 33 (1999)
679-692). Este ejemplo resume los resultados de las
investigaciones estructurales de LPS a partir de 4 cepas de NTHi
usando análisis de metilación, espectrometría de masas de ionización
por electropulverización (IEP-EM) y RMN.
Las cepas 466, 176, 285 y 1159 de H.
influenzae no tipificables se obtuvieron a partir del estudio de
cohorte del oído interno y son aislamientos obtenidos del oído
interno. Las bacterias se desarrollaron en caldo de infusión de
cerebro corazón (BHI) (Disco™ (3,7%, p/v) que contenía dinucleótido
de nicotinamida adenina (NAD) (2 \mug/ml), hemina (10 \mug/ml)
y ácido neuramínico (NeuAc; 50 \mug/ml) a 37ºC. El LPS se obtuvo
a partir de bacterias liofilizadas mediante el uso del procedimiento
de fenol cloroformo/éter de petróleo, seguido de
ultracentrifugación (A. Risberg y col., Eur. J. Biochem., 261,
(1999) 171-180). Se realizaron estudios
estructurales detallados mediante el uso de procedimientos basados
en EM y técnicas de MMR de campo alto sobre muestras de
oligosacáridos obtenidas de muestras de LPS o bien
O-desacilación con hidracina anhidra (37ºC, 1h) o
escisión del enlace cetosídico de kdo con ácido acético diluido
(100ºC, 2 h).
Los análisis de composición de azúcar de LPS de
las cepas 486, 176, 285 y 1158 de NTHi, todos indicaban
D-glucosa (Glc)
2-amino-2-desoxi-D-glucosa
(GlcN) y
L-glicero-D-mano-heptosa
(Hep) como los componentes principales identificados mediante
CGL-EM de sus derivados de acetato de aldiol y
2-butil glicósido correspondientes. Además, se
identificó D-galactosa en las cepas 486, 176 y 1158.
Además, se encontró que
D-glicero-D-mano-heptosa
era un componente principal en la cepa 1158. Este azúcar se
identificó recientemente la primera vez como un componente en el
LPS de H. influenzae en la cepa 9274 de NTHI (M. M. Rahman y
col., Glycobiology, 9 (1999) 1371-1380). El
tratamiento de LPS O-desaciladdo
(LPS-OH) con neuraminidasa seguido de cromatografía
de intercambio aniónico de alta resolución e IEP-EM
indicó que el ácido siálico (NeuAc) era un componente principal en
la cepa 486 de NTHi. Cantidades secundarias se detectaron en las
cepas 176, 285 y 1158 de NTHi.
IEP-EM de muestras de
LPS-OH indicaron mezclas heterogéneas de glicoformas
en todas las cepas. Parte del espectro de IEP-EM de
LPS-OH de la cepa 486 de NTHi se muestra en la
figura 2. Las composiciones propuestas para las principales
glicoformas de LPS de las cepas de NTHi se muestran en la Tabla 2.
Todas las glicoformas contienen el resto del núcleo interno de
triheptosilo PEtn sustituido unido mediante el engarce Kdo
fosforilado al Lípido A O-desacilado supuesto
(Lípido A-OH).
PCho está presente en todas las cepas como un
componente principal. La presencia de dos PCho en una glicoforma
Hex 2 está indicada para la cepa 1158. La glicoforma más corta (Hex
1) se observa para la cepa 285.
Los datos de los análisis de metilación de las
muestras de LPS se proporcionan en la tabla 6. Merece la pena hacer
notar que solamente pequeñas cantidades de Hep
2-sustituidas, un componente integral de las
estructuras de H. influenzae previamente publicadas, se
pudieron detectar en las cepas 176 y 486. En su lugar, se
detectaron cantidades significativas de Hep
3-sustituidas apuntando a un nuevo patrón de
sustitución en el elemento del núcleo interno de
L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow
2)-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow 3)-[\beta-D-Glcp-(1
\rightarrow4)-]-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow 5)-\alpha-Kdop común
de LPS de H. influenzae. Las estructuras completas de las
glicoformas principales en las cepas 176 y 486 se determinaron
mediante RMN y los resultados se resumen más adelante. El análisis
de metilación de la cepa 285 reveló, entre otros, cantidades altas
de L,D-Hep terminal además de Hep
3,4-disustituida lo que indicaba una sustitución de
Hep II y Hep III del resto del núcleo interno de triheptosilo (es
decir, R_{2} y R_{3} = H). La estructura completa de al
glicoforma Hex 1 en esta cepa (Fig. 9) se determinó mediante RMN
sobre LPS-OH (datos no mostrados). El análisis de
metilación de la cepa 1158 mostró, entre otros,
D-Glc 6-sustituido y
D,D-Hep terminal que se podría atribuir al elemento
estructural
D-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow
6)-\beta-D-Glcp-(1
\rightarrow
4)-L-\alpha-D-Hepp
que se evidenció mediante RMN (datos no mostrados). La glicoforma de
LPs principal se encontró que estaba sustituida en Hep II (R2 =
\alpha-D-Glcp) y Hep III (R3 =
PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp).
Una estructura tentativa de la glicoforma principal en la cepa 1158
de NTHi se proporciona en la Fig. 10.
Detalles estructurales de la cepa 176 de
NTHi. La hidrólisis parcial ácida de LPS con ácido acético
diluido produjo un Lípido A insoluble y fracciones de
oligosacáridos del núcleo que se separaron mediante GPC (Fig. 11)
proporcionando Fr. 1, Fr. 2 y Fr. 3. Los datos del análisis de
metilación para estas fracciones se presentan en la Tabla 6. La
presencia de Gal 3- y 6- sustituidas y GlcN
4-sustituida en Fr. 1 indicaba la presencia de
características estructurales novedosas para este oligosacárido.
EC-IEP-EM sobre Fr. 1 reveló, entre
otros, un ion doblemente cargado principal en m/z 1214,0 indicando
una glicoforma de peso molecular considerablemente mayor (HMG) en
esta fracción que el observado en Fr. 2 y Fr. 3. Se realizó una
observación similar para la cepa 285 de NTHi (véase más adelante).
El espectro de IEP-EM de Fr. 2 (datos no mostrados)
indicó que las glicoformas principales tenían la composición
PCho_{1}-Hex_{2}-Hep_{3}-PEtn
\cdot AnKdo-ol y
PCho_{1}-Hex_{3}-Hep_{3}-PEtn
\cdot Ankdo-ol. El IEP-EM para
Fr. 3 (datos no mostrados) indicaron glicoformas principales con las
composiciones respectivas
Hex_{3}-Hep_{3}-PEtn \cdot
Ankdo-ol y
Hex_{4}-Hep_{3}-PEtn \cdot
Ankdo-ol.
La estructura de la glicoforma Hex3 en Fr. 2 se
podría detallar mediante análisis detallado de ^{1}H RMN. El
espectro de ^{1}H RMN de Fr. 2 se muestra en la Fig. 12. La señal
característica para los grupos metilo de PCho se observó a \delta
3,24. Las resonancias anoméricas de Hep I-Hep III se
identificaron a 5,03-5,13, 5,83 y 5,26,
respectivamente. Los subespectros correspondientes a Glc I, Glc II y
Gal y se identificaron en los espectros de 2D COSY y TOCSY a
\delta 4,56, 4,62 y 4,64, respectivamente. Los datos de
desplazamiento químico apuntan a Glc II y Gal que son residuos
terminales de acuerdo con los análisis de metilación. El valor
desplazado campo abajo para H-6,5' de Glc I a
\delta 4,3 indica que este residuo está sustituido con PCho en
esta posición. Las conectividades de Inter. residuos NOE entre pares
de protones Glc II H-1/Glc I H-4,
Glc I H-1/Hep I H-4, 6 (Fig. 13)
estableció la secuencia de una unidad de disacárido y su punto de
unión a \beta-D-Glcp-(1
\rightarrow 4)-(PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp-(1
\rightarrow4)-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow. El Interresiduo NOE entre H-1 de Gal
y H-3//H-2 de Hep III proporcionó
evidencia para la unidad
\beta-D-Galp-(1 \rightarrow
3)-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow. A partir de los datos combinados se puede concluir
así que la glicoforma Hex 3 PCho sustituida tiene la estructura 2
(Fig. 14). El análisis de metilación de Fr. 2 mostró una cantidad
considerable de Heo terminal y se puede concluir que la glicoforma
de Hex 2 PCho sustituida observada en los espectros
IEP-EM tiene la estructura 3 (Fig. 14).
El espectro de ^{1}H RMN de Fr. 3 se muestra
en la Fig. 12. De acuerdo con los datos de IEP-EM es
evidente que PCho no se expresa en el grado alto como en Fr. 2 ya
que la señal para los protones de metilo de PCho es de baja
intensidad. Las señales para los protones anoméricos de Hep
I-III resuenan a aproximadamente los mismos
desplazamientos químicos que los correspondientes en Fr. 2. A
\delta 5,26 se observa la resonancia anomérica de un residuo Glc
terminal unido a \alpha (Glc III). la región anomérica para las
hexosas unidas a \beta era más heterogénea que en Fr. 2. Los
sistemas de giro de los espectros 2D para los residuos Glc
terminales se observaron en \delta 4,50 y 4,45. Un residuo Glc
4-sustituido y 2 residuos Gal terminales se
identificaron a \delta 4,56, 4,61 y 4,54. Los datos de NOE
confirmaron la presencia del elemento estructural Glcp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp-(1
\rightarrow
4)-L-\alpha-D-Hepp-(1
\rightarrow así como gal unido a Hep III. Además, las
conectividades de NOE confirmaron que el Glc unido a \alpha a
unirse a la posición 3 de Hep II. La evidencia combinada conduce a
la estructura de la glicoforma Hex 4 como se muestra en la Tabla 4
(Fig. 14). De acuerdo con el análisis de metilación que muestran Hep
2-sustituido y Hep terminal, las glicoformas Hex 4
se concluye que tienen las estructuras 5 y 6 (Fig. 14).
Detalles estructurales de la cepa 486 de
NTHi. La estructura del LPS principal de la glicoforma de la
cepa 486 de NTHi se estableció siguiendo el uso extensivo de
IEP-EM. Los análisis de RMN y de metilación sobre
LPS-OH y el material oligosacárido
(OS-1) obtenido después de la hidrólisis suave ácida
(Fig. 15). Como para la cepa 176, Hep III se sustituye en la
posición O-3. Sin embargo en este caso, mediante un
residuo glucosa. el LPs de la cepa 486 de NTHi está altamente
dializado con Neu5Ac unido a la \beta-galactosa
terminal de un resto lactosa.
En el espectro de ^{1}H RMN de
LPS-OH, cinco señales discretas de aproximadamente
área igual se observaron entre \delta 5,8 y 5,0. Tres de estas
señales corresponden a las señales H-1 de los tres
restos heptosa (Hep I-Hep III) en la región del
núcleo interno. La señal anomérica de un resto glucosa unido en
\alpha (Glc) se identificó a \delta 5,28 (J 3,8 Hz), las
señales anoméricas correspondientes a las hexosas unidas en \beta
se identificaron entre \delta 4,52 y 4,42. En el espectro de
^{1}H RMN de OS-1, resonancias anoméricas de las
heptosas así como un sitio de acetilación se observaron a \delta
5,83-5,75 (1H, no resuelto) y \delta
5,14-5,04 (3H, no resuelto). Una señal intensa
correspondiente a los protones metilo de un grupo
O-acetilo se observó a \delta 2,17, que está
correlacionada con una señal ^{13}C a \delta 21,0 en el
espectro HSQC. La secuencia de las glucosas dentro de la región del
núcleo interno se estableció a partir de conectividades de NOE
transglicosídicas que relacionan protones anoméricos y aglicónicos
en los residuos adyacentes. Las señales para los protones metilo de
PCho se observaron a \delta 3,21 (LPS-OH) y
\delta 3,23 (OS-1) y sistemas de giro para
protones etileno de este residuo y a partir de PEtn eran similares a
las observadas anteriormente (A, Risberg y col., Eur. J. Biochem.,
261 (1999) 171-180. Los estudios de correlación deH
RMN de LPS-OH y OS-1, demostraron
que PCho y PEtn estaban unidos a restos Glc I y Hep II,
respectivamente. Las señales características de los protones
metileno H-3 de ácido siálico se observaron a
\delta 1,79 (H-3_{ax}, J_{3ax,3eq} = 12,3 Hz)
y \delta 2,73 (H-3_{ax}, J_{3ax,4} = 4,3 Hz en
el espectro de ^{1}H RMN de LPS-OH. El
Interresiduo NOE entre H-3_{ax} de Neu5Ac y
H-3 de un residuo Gal confirmó que el ácido siálico
estaba unido en 2,3 a galactosa como se indica por los análisis de
metilación, \alpha-D-Neu5Ac-(2
\rightarrow
3)-\beta-D-galp-(1
\rightarrow. Varios valores de desplazamiento químico para un
número de núcleos en Hep III de OS-1 diferían
considerablemente de los desplazamientos químicos correspondientes
en LPS-OH. Los desplazamientos campo abajo se
obtuvieron para H-2 (0+0,99 ppm),
H-1 (+ 0,03 ppm), H-3 (+ 0,22 ppm) y
C-2 (+ 1,2 ppm) de Hep III en OS-1,
mientras que C-1 (- 3,3 ppm) y C-3
(- 2,5 ppm) se desplazaron campo arriba. De este modo, se indicó
que Hep III estaba acetilado en la posición O-2. El
sitio de acetilación se apoyaba también por el experimento de NBC,
donde se observó una correlación entre el carbono carbonilo
(\delta 174,0) y H-2 de Hep III. Además, un pico
cruzado se observó entre el carbono carbonilo y los protones metilo
del grupo O-acetilo, estableciendo por lo tanto la
identidad del sustituyente.
IEP-EM y los análisis de
metilación de LPS del mutante lpsA de la cepa 486 de NTHi indicaron
una ausencia de extensión de cadena desde Hep III. Los análisis de
metilación del material O-desacetilado mostró Glc
terminal, Hep terminal, Hep 3,4-disustituido, Hep
2,3-disustituido y GlcN 6-sustituido
en las proporciones relativas 34 : 39 : 20 : 3: 4. En el espectro
IEP-EM de LPS-OH, se pueden observar
dos iones triplemente cargados principales en m/z 812,9/653,9,
correspondientes a Pcho \cdot Hex_{2} \cdot Hep_{3} \cdot
PEtn_{1-2} \cdot P_{1} \cdot Kdo_{1}
\cdot Lípido A-OH.
Las glicoformas de alto peso molecular en las
cepas 176 y 285 de NTHi. Después de la hidrólisis ácida suave
sobre LPS de la cepa 285 de NTHi, la filtración en gel mostró una
fracción secundaria que contenía una glicoforma de mayor peso
molecular junto con una fracción principal que contenía la
glucoforma mostrada en la Fig. 9. El análisis de azúcar de esta
fracción de alto peso molecular (HMW) indicaba
D-Glc, D-gal,
D-GlcNAc y L,D-Hep y análisis de
mutilación proporcionó Gal terminal, gal
3-sustituido, gal 6-sustituido,
GlcNAc 4-sustituido; Hep terminal y Hep
2,4-disustituido.
EC-IEP-EM mostró, entre otros, un
ion doblemente cargado principal a m/z 1052. EM/EM en este ion
proporcionó un patrón de fragmentación similar como m/z 1214
observado para HMW de la cepa 176 de NTHi (véase anteriormente). En
particular un ion hijo se observó a m/a 692 correspondiente a una
composición Pcho-Hex-HexNAc.
Ratones hembra BALB/c, 6-8
semanas de edad, se inmunizaron por vía intraperitoneal con células
enteras de lic1lpsa de Rd matadas con formalina. Cada ratón recibió
10^{8} células en 0,5 ml de PBS por inyección. Los ratones se
reinmunizaron el día 14, 35 y se extrajo una muestra de sangre el
día 45. A los dos ratones que muestran la titulación más alta de
anticuerpo al homólogo LPS se proporcionaron dos inyecciones finales
el día 56, una inyección i.p. como se ha proporcionado
anteriormente y una inyección intravenosa en 0,1 ml de PBS. la
fusión se realizó tres días después de la última inyección. Células
de bazo estimuladas de los dos ratones inmunizados se fusionaron
con células de mieloma SP2/O-Agl4 en una relación de
10 : 1 en 33% de PEGI-450. Los híbridos supuestos
que sobreviven la selección de hipoxantina/aminopteridin/timina
(HAT), se seleccionaron mediante ELISA contra LPS de Rd lic1lpsA
homólogo y LPS de Rd heterólogo. Los hibridomas que producen
anticuerpos de interés se clonaron dos veces usando dilución
limitante para asegurar la estabilidad y clonabilidad. la subclase
Ig se determinó sobre el sobrenadante gastado usando el kit EIA
mouse MaAb isotyping (Amersham Canadá, Oakville, ON). Los clones se
expandieron como fluido ascítico mediante inyección intraperitoneal
de 10^{6} células de hibridoma en ratones BALB/c
10-14 días después del tratamiento i.p. con 0,5 ml
de 2,6,10,14-tetrametilpentadecano (pristano). Se
golpeó ligeramente el fluido ascítico 7-14 días
después de la inyección.
ELISA indirecto. Sobrenadante de cultivo
y fluido ascítico se ensayaron contra LPS purificado en placas de
96 pocillos Nunc maxisorp EIA. Los pocillos se revistieron a 37ºC
durante 3 horas con 1,0 \mul de LPS en 100 \mul de tampón
carbonato 0,05 M (pH 9,8) que contiene MgCl_{2} 0,02 M y después
se bloqueó con 200 \mul de BSA al 1%-PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente. Después de lavar con PBS-T
(0,05% de Tween 20), las muestras del cultivo sobrenadante de
ascitos, se diluyeron en serie en BSA al 1%-PBS se añadieron e
incubaron 1-3 horas a temperatura ambiente. Las
placas se lavaron después y se añadió IgG anti-ratón
de cabra marcada con fosfatasa alcalina (Cedarlane Laboratorios,
Hornby, ON), diluida 1 : 3000 en BSA al 1%-PBS durante 1 hora a
temperatura ambiente. Las placas se desarrollaron con Sistema
Sustrarto Fosfato p-NPP (Kirkegaard & Perry
laboratorios, gaithersberg, MD). Después de 30-60
minutos, las placas se exploraron a 410 nm en un lector de placas
Dynatech EIA.
Resultados. La inmunización de los
ratones BALB/c con células enteras matadas con formalina de Rd
lic1lpsA, fusión, y selección de ELISA inicial contra el LPS
homólogo y Rd LPS heterólogo dio como resultado el establecimiento
de 12 hibridomas. Después del ensayo de los 12 MAb contra un panel
de PLS del mutante Rd, dos MAbs, LLA5, IgG_{2a}, se eligieron
para ensayo posterior. LLA5 se encontró que reacciona de manera
cruzada con 14 de 25 LPS de la cadena no tipificable mientras que
LLA4 reconocía el LPS homólogo. El análisis estructural reveló que
LLA4 detectaba las glicoformas de alto peso molecular mientras que
LLA4 estaba unido al epítope del núcleo i8nterno presente en la
cadena homóloga.
LPS de la cepa RdliclpsA se aisló y se purificó
mediante el protocolo de extracción de fenol agua y
O-desacilado mediante tratamiento con hidracina
anhidra de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.
El análisis de azúcar indicó que la parte de oligosacárido del
LPS-OH contenía
L-glicero-D-mano-heptasa
y glucosa como las únicas aldosas detectables.
IEP-EM del LPS-OH reveló un ion
doblemente cargado en m/z 1056,5 correspondiente a una masa
molecular de 2114,9 que es consistente con la composición esperada
de
Glc(HepIII-PEtn-Kdo-P-Lípido
A-OH (1). ^{1}H RMN mostró claramente señales
anoméricas bien definidas de los residuos heptosa a 5,16 (Hep),
5,15 (Hep III) y 5-76 ppm (Hep II) para el resto
triheptosilo conservado similar al de LPS-OH
observado para el mutante individual RdlpsA (Ejemplo 1). No era
detectable ninguna señal debida a resonancias de metilo de
Pcho(Risberg y col., Eur. J. Biochem. 261:
171-180, 1999) en el ^{1}H RMN.
El LPS-OH del previo ejemplo se
puede conjugar a BSA de acuerdo con el procedimiento descrito en Gu
y col., Infect. Immun. 64: 4047-4053, 1996. Como
alternativa, se puede conjugar a BSA mediante el grupo carboxilo de
Kdo con M_{2}C_{2}H
(4(4-N-maleimidometil)ciclohexano
1-carboxil hidracida. ½ dioxano) de acuerdo con el
procedimiento desarrollado por Wei Zou del Consejo de Investigación
Nacional de Canadá como se describe en la figura C. En resumen,
LPS-OH se conjugó a BSA mediante la activación
selectiva del grupo carboxilo de Kdo con EDC y el uso de la
estrategia de engarce mostrado en el esquema anterior.
Ratones hembra BALB/c, de 6-8
semanas de edad, se inmunizaron por vía intraperitoneal con
conjugado Rd liclpsA odA LPS-BSA. Cada ratón
recibió 2 \mug de carbohidrato en 0,2 ml de adyuvante completo
Ribis (Cerdalane Laboratories Ltd, Hornby, ON) por inyección. Los
ratones se reinmunizaron el día 21 y 42, con una cantidad
equivalente de vacuna de conjugado. el día 137 recibió una inyección
i.p. final que contenía 10 \mug de LPS de 1.003 lic1lpsA odA en
Ribi y se recogió suero el día 147.
\vskip1.000000\baselineskip
Cepas con mutaciones definidas en la maquinaria
biosintética de LPS se puede usar para producir anticuerpos
monoclonal (Mabs) a estructuras de oligosacáridos de LPs definidas.
Se indujeron Mabs murinos contra cepas mutantes de H.
influenzae que contienen el resto del núcleo interno conservado.
Por ejemplo, ratones BALB/c se inmunizaron con células enteras
matadas con formalina de Rdlic1lpsA. La selección inicial ELISA
contra el LPS homólogo y LPS de Rd heterólogo dio como resultado el
establecimiento de 12 hibridomas. Después del ensayo de los 12 MAb
contra un panel de LPS del mutante Rd, dos MAb, LLA5, IgG_{2a} y
LLA4, IgG2b, se eligieron para el ensayo
posterior.
posterior.
LLA4 se encontró que reconoce un epítope del
núcleo interno presente en la cepa homóloga. En el ensayo ELISA,
LLa5 mostró reactividad cruzada con LPS purificado de una cepa
mayoritaria de una colección de cultivo genéticamente diversa (14
de 25 cepas no tipificable) (Tabla 1). El epítope reconocido por Mab
LLA5 estaba presente en el mutante individual RdlpsA y el doble
mutante RdliclorfH más truncado que carece del residuo Hep III
(Tabla 2). El epítope LLA5 no está presente en LPS del mutante
individual, RdlgtF. Como se ha mencionado anteriormente el gen lgtF
se requiere para adición del residuo
\beta-D-Glc en la posición 4 de
Hep I.
Sorprendentemente, una comparación del LPS de
las 25 cepas mediante técnicas de análisis estructurales conocidas
en la técnica indicaban que Mab LLA5 detectaba un epítope de
oligosacárido que contiene
lacto-N-neotetraosa (LNnT) que
proviene de la extensión de cadena de la unidad Hep I del resto del
núcleo interno. Las cepas que no se reconocían, por Mab LLA5 se
caracterizaban por la ausencia de las extensiones de cadena que
contienen LNnT. Las cepas de H. influenzae que expresan la
extensión de cadena que contiene LNnT solamente se expresan en un
grado menor en condiciones de crecimiento de laboratorio
convencionales. No se identificó previamente en la cepa Rd debido a
los niveles de baja expresión (Risberg y col., Eur. J. Biochem.,
261: 717-180. 1999). Ahora se ha aislado y
caracterizado liberando el oligosacárido del núcleo del LPS de la
cepa Rd (RM 118) mediante hidrólisis ácida suave y separación sobre
cromatografía de permeación en gel en Biogel P-4.
(Fig. 11), procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
La fracción de oligosacáridos del núcleo que contiene LNnT eluye
como una "fracción HMW" marcada con el componente de alto peso
molecular. existe un componente secundario comparado con el pico
más grande (centrado a 400) que comprendía las glicoformas
principales identificadas para la cepa Rd (Risberg y col., 1999
anteriormente). El oligosacárido del núcleo HMW de la cepa rd se
caracterizó por tener extensiones de cadena que contienen LNnT de
Heo I mediante técnicas de espectrometría de masas en tándem.
(EM/EM) (Thibault y Richards, en Methods in Molecular Biology, vol.
145, 145, Bacterial toxins: Methods and Protocols (Holst, O. ed) p.
327-344, Humana Press, 1999 y las referencias en ese
documento). El patrón de fragmentación en el
IEP-EM/EM era indicativo de la presencia de la
cadena de oligosacáridos LNnT que tiene la secuencia
Gal-GlcNAc-gal-Glc y
se tapó mediante la unidad de azúcar terminal,
Petn-GalNAc
(Fig. 8).
(Fig. 8).
Cuando la cepa Rd se hace crecer en medio que
contiene ácido siálico, se expresa la glicoforma de LPS que
contiene los oligosacáridos sialilizados. El solicitante ha
encontrado silalilactosa que tiene la estructura
\alpha-Neu5Ac (2 \rightarrow
3)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glc
unido como una extensión de oligosacárido de Hep III. Además esta
extensión de oligosacárido se ha identificado en varias cepas de
NTHi. El gen de fase variable lic3A codifica la sialiltransferasa
que añade CMP-Neu5Ac al aceptor de lactosa. Los
análogos dializados de las extensiones de cadena LNnT son
detectables en el LPS en la cadena de Rd cuando el organismo se
hace crecer en las condiciones descritas. Las extensiones de cadena
de oligosacáridos de LNnT sialilizado del LPS del núcleo interno
que tienen la estructura \alpha-Neu5Ac (2
\rightarrow
3)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-GlcpNAc-(1
\rightarrow
3)-\beta-D-Galp-(1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp
son fácilmente detectables en el doble mutante RdlgtClic3A por
EP-EM de LPS O-desacilado. Los
inventores han confirmado que la estructura de LPS en el núcleo
interno conservado tiene extensiones de cadena que contienen LNnT
sialilizado usando técnicas EM/EM, técnicas de resonancia magnética
nuclear de campo alto, y análisis de mutilación, todos los cuales
son procedimientos de análisis estructurales conocidos por los
expertos en la técnica. Los inventores han encontrado que H.
influenzae utiliza un mecanismo de bloqueo para añadir las
extensiones de cadena del oligosacárido que contiene LNnT que
implica los genes del locus rfb. Existe una correlación absoluta
entre la presencia del gen rfb y la formación de LNnT en todas las
cepas de Hi investigadas.
El LPS de las cepas de NTHi que son reactivas
con Mab LLA5 también muestran una fracción de alto peso molecular
(HMW) en los cromatogramas de permeación en gel después de la
hidrólisis ácida suave. Por ejemplo, LPs de la cepa 285 de NTHi
muestra la fracción secundaria de HMW para la que la presencia de
extensiones de cadena que contienen LNnT, también bloqueadas por
una unidad Petn-GalNAc, se caracterizan a partir de
fragmentación de EM/EM (Fig. 8). la confirmación adicional para
esta extensión de cadena de oligosacáridos que contienen LNnT se
obtuvo a partir de un experimento de EM/EM/EM. No se encuentra
ninguna fracción detectable de HMW en los hidrolizados de cepas que
son LLA5 - no reactivas, por ejemplo la cepa 1247 de NTHi (tabla
7).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los números HI son las designaciones de ORF
proporcionadas por TIGR para la base de datos de la secuencia del
genoma de H. influenzae. Los genes proporcionados en letra
negrita son los seleccionados para el análisis comparativo detallado
de las glicoformas de LPS expresadas.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
6. \begin{minipage}[t]{140mm} Hood, D. W., Deadman, M. E.,
Allen, T., Masoud, H., Martín, A.; Brisson, J. R., Fleischmann, R.,
Venter, J. C, Richards, J. C., y Moxon, E. R. (1996) Mol. Microbiol.
22, 951-965.\end{minipage} \cr 7.
\begin{minipage}[t]{140mm} Weiser, J. N., Maskell, D. J.,
Butler, P. D., Lindberg, A. A., y Moxon, E. R. (1990) J. Bacteriol.
172, 3304-3309.\end{minipage} \cr 9. High, N.
J., Deadman, M. E., y Moxon, E. R. (1993) Mol. Microbiol. 9,
1275 - 1282.\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Datos de IEP-EM de ion negativo
y composiciones propuestas de LPS O-desacilado de la
cepa Rd de H. influenzae y mutantes. Se usaron unidades de
masa media para el cálculo del peso molecular basándose en la
composición propuesta como sigue: Lípido A-OH,
953,00; Hex, 162,15; HexNAc, 203,19; Hep, 192,17;
Kdo-P, 300,16; PEm), 123,05. PCho, 165,05
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm} Datos adquiridos por
EC-IEP-EM sobre un instrumento de
cristal Modelo 310CE con interfase a un espectrómetro de masas
triple cuadrupolar (Perkin-Elmer/Sciex) equipado con
una columna capilar de sílice condensada sencilla y usando acetato
de morfolina 30 mM (pH 9,0) que contiene metanol al 5% como tampón
de separación como se ha descrito (30).\end{minipage} \cr
^{b} Medido a partir de los iones moleculares respectivos en el
espectro reconstruido.\cr ^{c} El ion principal observado
correspondía al ion molecular - 18 (pérdida de
agua).\cr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un resto de lipopolisacárido aislado que
consta de un resto del núcleo interno de triheptosilo que tiene la
estructura II:
en la que R^{1} es hidrógeno,
\beta-D-Glcp (1 \rightarrow 4);
o PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp (1
\rightarrow 4); R^{2} es fosfato (P) o pirofosfoetanolamina
(P-PEtn); R^{3} es hidrógeno,
\beta-D-Glcp o
\beta-D-Galp,
y cuando R^{1} es hidrógeno o
\beta-D-Glcp (1 \rightarrow 4),
entonces R^{3} también puede ser
\beta-D-Galp (1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp,
\alpha-D-Galp (1 \rightarrow 4)
\beta-D-Galp (1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp
\beta-D-GalpNac-(1 \rightarrow
3)-\alpha-D-Galp
(1 \rightarrow 4) \beta-D-Galp
(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp, o
\alpha-NeuAc (2 \rightarrow
3)-\beta-D-Galp (1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp (1
\rightarrow 3), en la que R^{3} está unido a o bien la posición
O-3 u O-2 de Hep III; y
Kdo es ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico;
y
Lípido A está destoxificado.
2. Una composición farmacéutica que comprende el
resto de lipopolisacárido de la reivindicación 1 junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. La composición farmacéutica de la
reivindicación 2 en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable
es inmunogénico.
4. Un anticuerpo que específicamente se une al
resto de lipopolisacárido de la reivindicación 1.
5. Un procedimiento para la producción y
recogida de un anticuerpo de reactividad cruzada contra
Haemophilus influenzae que comprende:
- (a)
- generar anticuerpos contra el resto de lipopolisacárido de la reivindicación 1;
- (b)
- ensayar tales anticuerpos contra una pluralidad de cepas de Haemophilus influenzae;
- (c)
- y seleccionar los anticuerpos que tienen reactividad cruzada.
6. El procedimiento de la reivindicación 5 en el
que el Haemophilus influenzae es Haemophilus
influenzae no tipificable.
7. Uso de la composición de la reivindicación 2
ó 3 para la preparación de un medicamento en el tratamiento de una
enfermedad provocada por infección con Haemophilus
influenzae.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que el Haemophilus influenzae es Haemophilus
influenzae no tipificable.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 u
8, en el que la enfermedad se selecciona entre el grupo constituido
por otitis media, meningitis, neumonía, e infección del tracto
respiratorio.
10. El Nº de acceso ISAC
250801-1 de la cepa de Rd lic1lpsA de Haemophilus
influenzae.
11. El Nº de acceso ISAC
250801-2 de la cepa de 1003 lic1lpsA de
Haemophilus influenzae.
12. Un procedimiento para preparar un resto de
lipopolisacárido que consta de un resto del núcleo interno de
triheptosilo conservado que tiene la estructura II:
en la
que
R^{1} es hidrógeno,
\beta-D-Glcp (1 \rightarrow 4),
o PCho \rightarrow
6)-\beta-D-Glcp (1
\rightarrow 4);
R^{2} es fosfato (P) o pirofosfoetanolamina
(P-PEtn);
R^{3} es hidrógeno,
\beta-D-Glcp,
\beta-D-Galp,
\beta-D-Galp (1 \rightarrow
4)-\beta-D-Glcp,
\alpha-D-Galp (1 \rightarrow
4)-\beta-D-Galp (1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp, y
cuando R^{1} es hidrógeno o
\beta-D-Glcp (1 \rightarrow 4),
entonces R^{3} también puede ser
\beta-D-GalpNac-(1 \rightarrow
3)-\alpha-D-Galp
(1 \rightarrow
4)-\beta-D-Galp (1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp, o
\alpha-NeuAc (2 \rightarrow
3)-\beta-D-Galp (1
\rightarrow
4)-\beta-D-Glcp (1
\rightarrow 3), en la que R^{3} está unido a o bien la posición
O-3 u O-2 de Hep III; y
Kdo es ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico;
comprendiendo dicho procedimiento:
- -
- transformar una cepa bacteriana de Haemophilus influenzae receptora con uno o más genes inactivados seleccionados entre el grupo constituido por lpsA, lic1, lic2, lic2A, lic2orf3, lic2B, lic3A, lgtC, lgtD, y lgtF;
- -
- cultivar la cepa bacteriana de Haemophilus influenzae transformada en condiciones adecuadas para expresar el resto de lipopolisacárido;
- -
- aislar el resto de lipopolisacárido; y
- -
- destoxificar la parte del Lípido A del resto de lipopolisacárido.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 en el que el Haemophilus influenzae es
Haemophilus influenzae no tipificable.
14. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 5 en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal que se une al resto del núcleo interno triheptosilo
conservado como se define en la reivindicación 1.
15. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12 ó 13, que comprende además la identificación del
resto lipopolisacárido poniendo en contacto el resto de
lipopolisacárido con un anticuerpo monoclonal específico para un
epítope expresado después de la inactivación de uno o más genes
seleccionados entre el grupo constituido por lpsA, lic1, lic2,
lic2A, lic2orf3, lic2B, lic3A, lgtC, lgtD, lgtF, rfaF y orfH.
16. El procedimiento de la reivindicación 15 que
comprende al anticuerpo monoclonal producido de acuerdo con la
reivindicación 14.
17. Un glicoconjugado que comprende:
el resto de lipopolisacárido de acuerdo con la
reivindicación 1 y un vehículo inmunogénico reticulado al resto de
lipopolisacárido.
18. El glicoconjugado de acuerdo con la
reivindicación 17 en el que el resto de lipopolisacárido y el
vehículo inmunogénico están reticulados con una molécula de
engarce.
\newpage
19. El glicoconjugado de acuerdo con la
reivindicación 18 en el que la molécula de engarce se selecciona
entre el grupo constituido por dihidrazida del ácido adípico, ácido
epsilon aminohexanoico, clorohexanol dimetil acetal,
D-glucuronolactona y p-nitrofenil
amina.
20. El glicoconjugado de una cualquiera de las
reivindicaciones 17 a 19 en el que el vehículo es TT o NTHi HMP.
21. Una composición de vacuna que comprende uno
o más glicoconjugados de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a
20 y un adyuvante.
22. La composición de vacuna de la
reivindicación 21, en la que la vacuna se formula en forma de un
liposoma.
en la que R es hidrógeno o
fosfoetanolamina, Glc es D-glucopiranosa, Kdo es
ácido
3-desoxi-D-mano-2-octulosónico
y P-PEtn es
pirofosfoetanolamina.
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