ES2284832T3 - Procedimiento y aparato bioquimicos para la deteccion de caracteristicas de proteinas. - Google Patents

Procedimiento y aparato bioquimicos para la deteccion de caracteristicas de proteinas. Download PDF

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Abstract

Procedimiento bioquímico de detección de una o más características de proteínas, utilizando dicho procedimiento soportes (1) cuya dimensión más grande (3) es inferior a 250 mim y en el que cada soporte (1) incorpora un medio de identificación secuencial (2), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: (a) unir una molécula de información (7) a una superficie principal (11) de cada soporte (1); (b) suspender los soportes (1) con la molécula de información asociada (7) en un fluido; (c) añadir una muestra (8) a analizar al fluido; (d) colocar el fluido que comprende sus soportes (1) asociados y la muestra (8) sobre un sustrato (49) para su posterior interrogación; (e) detectar las señales de interacción de por lo menos uno de los soportes (1) en el fluido utilizando un medio de detección de señales (40); y (f) leer el medio de identificación secuencial (2) de los soportes (1) que tienen una señal de interacción utilizando un medio de lectura (3), detectando de este modo por lo menos una de dichas una o más características de proteínas (8), caracterizado por el hecho de que (g) la molécula de información (7) es capaz de interaccionar con por lo menos una de dichas una o más características de proteínas; y (h) el medio de identificación secuencial (2) es un código de barras e incorpora totalmente por lo menos una de las características de orientación espacial y características de corrección de errores para ayudar al medio de lectura (3) a determinar las identidades de los soportes (1).

Description

Procedimiento y aparato bioquímicos para la detección de características de proteínas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento bioquímico de detección de características de proteínas según el preámbulo de la reivindicación 1 que se acompaña, y también a un aparato para detectar características de proteínas según el preámbulo de la reivindicación 16 que se acompaña.
Antecedentes de la invención
Durante los últimos años, ha habido un creciente interés por técnicas y sistemas asociados para determinar características de proteínas de numerosos tipos de organismos, por ejemplo, levaduras, bacterias y mamíferos, así como líneas celulares. Actualmente, las pruebas para detectar características de proteínas requieren un gran número de etapas experimentales realizadas de manera secuencial. Entre las etapas se incluyen electroforesis en gel bidimensional (geles 2D), extracción de las proteínas posterior a la electroforesis seguido de espectrofotometría de masas. Los procedimientos para el análisis de proteínas se están desarrollando hacia una mayor automatización con un rendimiento de la detección asociada más elevado. Dichos desarrollos tecnológicos han sido provocados por, por ejemplo, el proyecto del genoma humano; este proyecto ha indicado que realmente existen del orden de 30.000 a 40.000 genes en el genoma humano. Con el descubrimiento de nuevas características genéticas también ha habido un creciente interés en el entendimiento de cómo y porqué se producen diferentes proteínas y cómo funcionan. Con millones de características de proteínas y miles de diferentes especies a analizar, los procedimientos de análisis de características de proteínas con un alto rendimiento han resultado muy importantes para el progreso continuo en la ciencia de las proteínas. Por ejemplo, actualmente existe la necesidad de tecnologías de rendimiento elevado en paralelo y de forma masiva para la identificación y caracterización de proteínas (proteómica) en relación con la búsqueda y desarrollo de
fármacos.
En contraste con los genes, las proteínas no se pueden amplificar in vitro y, por lo tanto, sólo pequeñas cantidades están disponibles para el análisis. De este modo, el desarrollo de procedimientos de análisis de proteínas que proporcionan una mejor sensibilidad y rendimiento es de suma importancia en el uso eficaz de las bases de datos de secuencias de proteínas. A pesar de la necesidad de nuevas tecnologías con rendimientos elevados, pocos procedimientos de determinación de características de proteínas han conseguido que estén disponibles comercialmente. Los procedimientos actuales no son capaces de conseguir el rendimiento y el medio de reacción necesarios para la detección de características de proteínas.
Las técnicas utilizadas para determinar las características de proteínas implican una pluralidad de experimentos constituyentes que se marcan individualmente; cuando se han completado los experimentos, se pueden leer utilizando sus marcadores asociados para la identificación. Entre los marcadores utilizados en la presente se incluyen:
(a) la posición de cada experimento en una placa de microtítulos, en un tubo, sobre un gel 2D o inyectado en un espectrofotómetro de masas;
(b) la posición de cada experimento en la superficie de una membrana;
(c) la posición de cada experimento en la superficie de un circuito integrado de prueba, conocido como una "matriz de proteínas"; y
(d) espectro fluorescente u otros procedimientos de identificación de partículas a las que los experimentos están unidos.
Dichos procedimientos conocidos tienen la desventaja de que utilizan componentes para su ejecución que son difíciles y caros de fabricar y utilizar.
Tal como se ha mencionado anteriormente, el principal enfoque para la detección de las características de proteínas es los geles bidimensionales (2D). Este procedimiento tiene la desventaja tal como se ha indicado anteriormente de ser difícil de analizar, escasa reproducibilidad, variabilidad de resultados, y rendimiento de muestras limitado Los geles bidimensionales son muy laboriosos de utilizar y frecuentemente dan lugar sólo a una tasa de éxito del 50% en caracterización de proteínas. Las desventajas adicionales para geles 2D son que sólo se pueden llevar a cabo unos pocos experimentos simultáneos y se requiere un procesado adicional mediante espectrometría de masas antes de conseguir los resultados experimentales.
Actualmente existe una disponibilidad comercial limitada de micromatrices de proteínas y la mayoría de investigadores utilizan un procedimiento "homebrew" de análisis de proteínas, por ejemplo, fabricando una matriz mediante la unión de un conjunto de proteínas a un portaobjetos de microscopio. Este enfoque, combinado con procedimientos tales como geles 2D y la espectrometría de masas, es probable que prevalezcan a menos que un procedimiento alternativo sea comercialmente disponible.
En una Patente de Estados Unidos No. US 6.329.209 cedida a Zyomix Inc., se describe una micromatriz de proteínas. La micromatriz se utiliza para la detección simultánea de una pluralidad de proteínas que son los productos de expresión, o fragmentos de los mismos, de una célula o una población de células en un organismo. La micromatriz se refiere a un sustrato cuya superficie se divide en una pluralidad de regiones de inmovilización separadas que tienen una pluralidad de agentes capturadotes de proteínas en las mismas. Cada región de inmovilización está rodeada de bordes que resisten la unión de proteínas no específicas. Cada sitio está marcado de manera eficaz en función de su posición espacial en la superficie del sustrato. El biochip de identificación de proteínas de Zymomyx Inc. es capaz de analizar del orden de 1200 proteínas mediante un análisis paralelo. Aunque las etapas de procesado del análisis de proteínas pueden ser más eficientes con esta matriz particular en comparación con los procedimientos tradicionales, no necesariamente ofrece un aumento del rendimiento, ya que muchos geles 2D pueden separar hasta un millar de proteínas.
Debido al aumento del número de muestras ensayadas en la misma micromatriz, la demanda de una miniaturización de equipamiento de fabricación asociado y el manejo de materiales especializados hará que la fabricación de dichas micromatrices sea cada vez más compleja. Las características de proteínas de muestras que se monitorizan en dichas micromatrices deben ser conocidas y aisladas de antemano; dicho conocimiento previo hace que sea un proceso complicado y costoso para fabricar micromatrices específicas para las necesidades del cliente para cada tipo diferente de organismo o especie a estudiar.
Además, no se entiende bien la cantidad de interacción entre un gran volumen de proteínas o fragmentos de péptidos inmovilizados en la misma superficie y puede evitar una unión adecuada con la muestra de prueba. Esto es problemático, ya que, por tanto, puede disminuir la sensibilidad y/o especificidad del experimento, así como requerir posiblemente un aumento de la cantidad de muestras de proteínas en el ensayo. Algunas desventajas adicionales asociadas con esta tecnología son una flexibilidad baja, escasa cinética de reacción, tiempos de espera de fabricación bajos, tecnología de lectura avanzada, coste elevado y calidad baja de datos.
Los bioensayos realizados sobre micropartículas proporcionan otro tipo de tecnología de matrices en paralelo y de forma masiva. Se han conseguido procedimientos de muestras diferentes de separación mutua mediante la unión de moléculas de información a pequeños soportes, de manera que se pueden realizar simultáneamente muchas pruebas. Un sistema utilizado para distinguir mutuamente los soportes es normalmente los índices de fluorescencia o reflexión.
Luminex Corporation y Upstate Biotechnology proporcionan un procedimiento para detectar serina/treonina quinasas mediante la utilización de proteína básica de mielina (MBP) unida a un grupo de soportes fluorescentes. Los soportes sólidos son micropartículas y utilizan marcadores ópticos para reaccionar con la MBP para indicar una reacción asociada. A continuación, se utilizan aparatos de clasificación avanzada para clasificar los soportes que han reaccionado, consiguiendo dicha clasificación mediante la intensidad de señal óptica diferencial asociada con los diferentes soportes; los marcadores ópticos son emisores de luz y los soportes de micropartículas se clasifican dependiendo de la intensidad de la luz emitida desde los mismos. Dicho procedimiento de clasificación permite una mayor flexibilidad que los micromatrices en la detección de características de proteínas mediante la utilización de micropartículas cargadas de forma diferente. Sin embargo, se siguen experimentando problemas referentes a la complejidad de la instrumentación requerida para determinar los diferentes niveles de intensidad de luz emitida desde las micropartículas activadas. El rendimiento de esta tecnología está también actualmente limitado a 100 muestras que no proporcionan el nivel de multiplicidad requerido para experimentos con volúmenes elevados.
En la solicitud internacional de PCT publicada no. WO 00/126893 se describe un procedimiento que se refiere a la utilización de soportes sólidos en un bioensayo, y un proceso para la fabricación de dichos soportes. Los soportes se fabrican a partir de un metal anodizado, preferiblemente aluminio. Los soportes tienen, por ejemplo, anticuerpos unidos a los mismos para unirse a antígenos.
Los documentos WO-A-97/14028 y US-A-5.981.180 describen un procedimiento para el diagnóstico múltiple y el análisis genético de enzimas, fragmentos de ADN, anticuerpos, y otras biomoléculas. La citometría de flujo se utiliza para clasificar microesferas marcadas en un conjunto de microesferas.
El documento WO-A-00/55363 describe un procedimiento de detección y análisis de diferencias entre ácidos nucleicos de dos fuentes, en el que las microesferas diana se mezclan con dos ácidos nucleicos y se analizan por citometría de flujo.
El documento EP-A-0126450 describe un procedimiento para la detección de antígenos o anticuerpos en un fluido en el que se pueden distinguir poblaciones de partículas entre sí mediante una sustancia fluorescente, la cantidad de dicha sustancia y el tamaño de partícula.
El documento US-A-5.206.143 describe un procedimiento para distinguir subpoblaciones múltiples de partículas biológicas en una muestra en base a las diferencias en la intensidad de fluorescencia atribuible a uno o dos fluorocromos con los que se marcan las partículas biológicas.
El documento DE-A-10031028 describe un procedimiento para seleccionar partículas con una característica determinada de una población que comprende un gran número de partículas diferentes. El documento WO-A-95/32425 describe un procedimiento para codificar bibliotecas combinatorias utilizando microesferas marcadas con fluoróforos y el documento US-A-6.096.496 describe una microesfera de química combinatoria que incluye un emisor de espectro electromagnético como único identificador. El documento USA-4568630 describe un procedimiento de preparación de una placa de impresión de aluminio anodizado.
El documento US-A-5.519.200 describe un dispositivo de identificación que incluye una tira magneto-óptica y un código de barras óptico, en el que la tira magneto-óptica se sitúa en una localización conocida en relación al código de barras óptico, de manera que en una identificación visual del código de barras se puede encontrar la localización de la tira magneto-óptica.
Otra aplicación conocida para la caracterización e identificación de proteínas es el análisis de analitos asociados con la enfermedad. El análisis de los analitos se lleva a cabo actualmente utilizando una variedad de procedimientos incluyendo ELISA (ensayo inmunoabsorbente unido a enzima), RIA (radioinmunoensayo), ensayos de cromogenia, HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento), GCMS (cromatografía de gases-espectroscopia de masas), TLC (cromatografía en capa fina), análisis NIR (cerca del infrarrojo). Estos procedimientos tienen la desventaja de estar limitados en el número de analitos que se pueden ensayar en un tiempo dado, requieren mucho tiempo y equipo costoso.
Otro problema experimentado con la tecnología contemporánea de la caracterización de proteínas es la necesidad de personal que esté altamente preparado y entender los ajustes de varios sistemas diferentes cuando se llevan a cabo un número creciente de experimentos para determinar las características de las proteínas. Dichas necesidades de personal dan lugar a unas inversiones iniciales relativamente grandes en el entrenamiento del personal. Frecuentemente es necesario, a causa de las necesidades de validación y para aumentar la fiabilidad de los resultados de análisis, realizar experimentos de forma repetitiva que requieren la supervisión de los científicos, reduciendo la disponibilidad de estos científicos para otras actividades. Además, en muchas industrias, tales como la investigación y el desarrollo de fármacos, existen amplios grupos de tecnologías utilizadas a lo largo del proceso que deben validarse dando lugar a unas necesidades de tiempo y costos considerables.
Descripción resumida de la invención
Un primer objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento mejorado de detección de características de proteínas.
Un segundo objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento de rendimiento elevado a bajo coste para realizar experimentos para detectar características de proteínas.
Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un aparato mejorado para detectar características de proteínas.
Según un primer aspecto de la presente invención, con el fin de cumplir uno o más de los objetivos mencionados anteriormente de la presente invención y otros objetivos que serán obvios a partir de la siguiente memoria, se proporciona un procedimiento tal como se ha definido en la reivindicación 1 que se acompaña.
Además, según un segundo aspecto de la presente invención, con el fin de cumplir uno o más de los objetivos mencionados anteriormente de la presente invención y otros objetivos que serán obvios a partir de la siguiente memoria, se proporciona un aparato tal como se ha definido en la reivindicación 16 que se acompaña.
El procedimiento y aparato tiene la ventaja de que son capaces de cumplir los objetivos mencionados anteriormente de la presente invención.
De este modo, el primer aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar características de proteínas, en el que los soportes con códigos de barras específicos tienen una molécula de información unida a una superficie principal del mismo. La unión de las moléculas sobre los soportes y la suspensión de las mismas en un fluido permite muy buenas cinéticas de reacción, mejorando de este modo la sensibilidad así como reduciendo el volumen y tiempo de reacción. La muestra que contiene potencialmente una característica de proteína a detectar se añade al fluido. Es posible un experimento múltiple de cientos de miles de pruebas en una, ya que un gran número de soportes con diferentes códigos de barras y moléculas de información unidas pueden estar presentes de forma simultánea en el bioensayo. La utilización de dichas moléculas en combinación con soportes disminuye la necesidad de realizar experimentos por lotes o repetidos. Se utilizan diferentes tipos de señales para indicar los códigos de barras de los soportes y la señal de interacción que indica la interacción con una o más de las características de la proteína. Dicho enfoque da lugar a unidades de lectura y detección menos avanzadas requeridas para realizar mediciones de ensayo, reduciendo potencialmente de este modo el coste.
En una realización preferida de la presente invención, los soportes se oxidan antes de la unión de las moléculas de información a los mismos. Dicha unión permite que las superficies de los soportes tengan unas propiedades mecánicas y de unión química mejoradas. Alternativamente, o adicionalmente, los soportes se recubren con uno o más agentes de unión molecular para mejorar la unión de la molécula de información a los mismos.
En una realización preferida adicional de la presente invención, una unidad de medición realiza la detección de marcadores emisores de señales y la lectura del código de barras sustancialmente de forma simultánea. Esta medición simultánea disminuye el riesgo de lecturas incorrectas y aumenta el rendimiento, ya que no se utiliza software avanzado para el seguimiento de los soportes.
En una realización adicional de la presente invención, la lectura del código de barras incluye la localización de una o más características dispuestas para indicar cómo se interpreta la información acumulada. Esto posibilita la identificación de los soportes independientemente de su posición o dirección de flujo a través de los mismos, por ejemplo, un sistema de lectura de citómetro de flujo.
Una realización adicional de la presente invención tiene el fluido que incluye soportes cargados colocados sobre y posteriormente fijados sobre un sustrato. Esto permite un aumento múltiple de la capacidad de rendimiento de los procedimientos de lectura planos estándar requiriendo sólo ajustes menores para la configuración de equipos existentes.
Según un enfoque especial de la presente invención, la lectura de la unidad de medición implica el transporte del sustrato con sus soportes asociados a lo largo de un trayecto determinado. Dicho movimiento a lo largo del trayecto se consigue preferiblemente mediante el movimiento del sustrato con soportes localizados en los mismos a la vez que la unidad de medición está estacionaria. Es evidente que, alternativamente, la unidad de medición se podría mover a la vez que el sustrato con soportes está estacionario. Dichos enfoques son capaces de dar lugar a sustancialmente todos los soportes en el fluido que se analizan. Aquellos soportes que están sólo parcialmente en el área focal de la unidad de medición a lo largo del trayecto de medición tienen sus correspondientes registros de posiciones, de manera que sólo se analizan una vez.
En otras realizaciones preferidas de la presente invención, las características de proteínas detectadas son para el marcaje de fármacos, proteómica o análisis de analitos. Entre estas realizaciones de la presente invención se incluyen un sistema para llevar a cabo pruebas de bioensayo múltiples en paralelo y de forma masiva para el marcaje de fármacos, proteómica y/o análisis de analitos de una forma barata, rápida y conveniente. Dicho esquema consigue un rendimiento elevado realizando una suspensión que incluye muchos miles de tipos diferentes de, por ejemplo, soportes codificados micro-mecanizados, también denominados marcadores o micro-marcadores. Cada uno de estos soportes transporta, por ejemplo, moléculas de información de ácidos nucleicos, ácido nucleicos del péptido (PNA), enzimas y/o proteínas. Los soportes con moléculas de información unidas se mezclan con la muestra que incluye potencialmente la característica de la proteína a prueba junto con un marcador emisor de señales, concretamente un sistema informador, tal como la fluorescencia. Sólo los soportes con sondas de ácidos nucleicos, PNAs, enzimas y/o proteínas que se unen a las características de las proteínas investigadas se unirán al marcador emisor de señales que a continuación emite una señal, por ejemplo, fluorescencia.
En el segundo aspecto de la invención, se proporciona un aparato para detectar características de proteínas que tiene medios de detección y medios de identificación dispuestos para registrar dos tipos diferentes de señales, estando la primera señal asociada con la detección de marcadores emisores de señales activados y estando la segunda señal asociada con la lectura del código de barras de los soportes. Dicha pluralidad de tipos diferentes de señal disminuye la necesidad potencial de utilizar un equipo de procesado de imágenes avanzado y costoso.
Una realización de un soporte sólido utilizado de forma adecuada con el aparato en un ensayo bioquímico de marcaje de fármacos, proteómica o análisis de analitos tiene una forma sustancialmente lineal o plana y tiene una capa de superficie de metal anodizada. La dimensión más grande del soporte es preferiblemente inferior a aproximadamente 250 \mum, más preferiblemente inferior a 150 \mum y aún más preferiblemente inferior a aproximadamente 100 \mum de longitud, a través de la cual se puede formar una suspensión acuosa a partir de una pluralidad de soportes. Esto permite la utilización del mismo tipo de bioensayo para diversos tipos de experimentos diferentes.
En realizaciones adicionales, la capa de superficie del soporte tiene una capa de anodización de estructura celular con la dirección de crecimiento de las células de la capa de anodización perpendicular al plano de la capa de superficie. De manera adecuada, el soporte tiene moléculas de información (sondas) de ácido nucleico, PNA, enzima y/o proteína unidas a la capa de superficie. La capa de superficie del soporte puede ser de aluminio y puede ser también porosa. Además, el tamaño de poro de la capa de superficie aproximadamente encaja de forma adecuada con el tamaño de las moléculas de ácido nucleico, PNA, enzima y/o proteínas a unir. Esto proporciona al soporte excelentes propiedades de unión mecánicas y químicas para la unión de moléculas de información.
El código de barras incorporado en el soporte es un patrón de espaciado variable para objetivos de identificación. De manera adecuada, una unidad de medición, por ejemplo, un lector óptico se utiliza para leer los patrones e identificar los soportes.
Se entenderá que las características de la presente invención descritas anteriormente se pueden combinar en cualquier combinación sin apartarse del alcance de la presente invención.
Descripción de los dibujos
Las realizaciones de la presente invención se describirán a continuación, sólo a modo de ejemplo, haciendo referencia a los dibujos que se acompañan en los que:
La Figura 1 es una vista plana y una vista lateral de un soporte individual que comprende un código de barras;
La Figura 2 es una diagrama esquemático de un bioensayo que comprende soportes, moléculas de información y marcadores emisores de señales;
La Figura 3 es una vista en sección transversal en la dirección de flujo de un lector basado en flujo;
La figura 4 es un diagrama de flujo esquemático del proceso de incubación y lectura de un lector de base plana;
La figura 5 es un diagrama esquemático que ilustra un lector de base plana para interrogar soportes sobre un sustrato plano; y
Las figuras 6a y 6b son vistas superiores esquemáticas de un sustrato plano que ilustra ejemplos del trayecto de medición tomada por el lector de base plana.
Descripción de realizaciones de la invención
En la figura 1, se proporciona una ilustración de un soporte 1 individual preferido. A dicho soporte también se hará referencia como "micro marcador" en la siguiente descripción. El soporte 1 se puede fabricar a partir de una gran variedad de materiales que varían desde polímeros, vidrios hasta aleaciones metálicas, pero se fabrica preferiblemente a partir de un metal y más preferiblemente se fabrica a partir de aluminio. El soporte 1 incorpora un código de barras 2 que puede estar en forma de cómo mínimo una (o una combinación de los mismos) de ranuras, muescas, depresiones, protuberancias, proyecciones y más preferiblemente agujeros. El código de barras 2 de manera adecuada es un código de barras óptico de transmisión. El código de barras 2 está realizado como una serie secuencial de agujeros espaciados que se extiende a través del soporte 1. Dichos agujeros pueden ser de forma y tamaño variado. Son capaces de proporcionar un contraste óptico muy bueno, ya que las áreas sólidas del soporte 1 son sustancialmente no transmisivas a la luz, mientras que los agujeros del código de barras 2 son altamente transmisivos a la luz recibida en el mismo.
El soporte 1 puede tener muchos tipos de formas diferentes, pero preferiblemente tiene una forma sustancialmente plana con por lo menos una superficie principal 11. Cada soporte 1 de este tipo tiene unas dimensiones 3 máximas de menos de aproximadamente 250 \mum, más preferiblemente menos de 150 \mum, y aún más preferiblemente menos de 100 \mum de longitud. El soporte 1 tiene de forma adecuada una proporción de anchura 4 con respecto a longitud 3 en un intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 1:20, aunque se prefiere especialmente un intervalo de proporción de aproximadamente 1:5 a aproximadamente 1:15. Además, el soporte 1 tiene un grosor 5 que es preferiblemente inferior a aproximadamente 3 \mum y más preferiblemente inferior a aproximadamente 1 \mum. Se ha observado que un grosor inferior a aproximadamente 1 \mum proporciona una resistencia mecánica al soporte que hace que el soporte 1 se pueda utilizar en bioensayos. Una realización preferida de la presente invención se refiere a soportes 1 que tienen una longitud 3 de aproximadamente 100 \mum, una anchura 4 de aproximadamente 10 \mum y un grosor 5 de aproximadamente 1 \mum; dichos soportes son capaces de almacenar hasta 100.000 códigos de barras 2 de secuencias de identificación diferentes. Se han realizado demostraciones experimentales de hasta 100.000 variantes diferentes de los soportes 1 para su uso en bioensayos para experimentos de caracterización de proteínas. Se han fabricado soportes 1 de diferentes longitudes 3 en un intervalo de 40 a 100 \mum que llevan entre dos y cinco cifras decimales de datos en el código de barras 2 para su uso en diferentes experimentos para la detección de características de proteínas.
Se pueden fabricar alrededor de diez millones de dichos soportes 1, concretamente micromarcadores, en un sustrato individual de 6 pulgadas de diámetro, por ejemplo, una lámina de silicio, utilizando técnicas de fabricación actualmente establecidas. Los procesos de fotolitografía convencional y grabado en seco son ejemplos de dichas técnicas de fabricación utilizadas para fabricar y diseñar una capa de aluminio anodizada para obtener soportes sólidos 1 separados.
Un proceso de fabricación para fabricar una pluralidad de soportes similares al soporte 1 implica las siguientes etapas:
(1)
depositar una capa de liberación soluble sobre un sustrato plano;
(2)
depositar una capa de material de aluminio sobre la capa de liberación alejada del sustrato;
(3)
definir las características del soporte en la capa del material de aluminio mediante procesos fotolitográficos y procesos de grabado;
(4)
opcionalmente anodizar la capa de material de aluminio; y
(5)
extraer la capa de liberación utilizando un disolvente apropiado para obtener los soportes liberados del sustrato plano.
Se entenderá que las etapas (3) y (4) se pueden llevar a cabo en cualquier orden. Además, si es necesario, la etapa (4) se puede omitir. Opcionalmente, se puede utilizar la anodización gaseosa del material de aluminio durante la etapa (2); dicha anodización gaseosa es capaz de transmitir a los soportes 1 regiones de anodización que se extienden profundamente en los soportes 1. La capa de liberación es preferiblemente polimetil metacrilato (PMMA) u otro tipo de material adecuado, por ejemplo, una resistencia óptica tal y como se utiliza en la microfabricación de semiconductores convencionales; la capa de liberación se elige de manera que muestra propiedades que permiten que la capa de material de aluminio se mantenga en su lugar con respecto al sustrato plano durante las etapas (3) y (4). Cuando se utiliza PMMA, un disolvente adecuado comprende acetona y/o metil isobutil cetona (MIBK).
En referencia a la figura 2, se muestra un procedimiento de detección de características de proteínas en forma de un bioensayo indicado generalmente por 6. El bioensayo 6 comprende dos experimentos de unión indicados por agrupaciones moleculares diferentes entre sí expuestas tal y como se ilustran en la figura. El ensayo 6 comprende una pluralidad de soportes, siendo cada soporte similar al soporte 1. Además, el ensayo 6 se genera mediante la mezcla de suspensiones de grupos escogidos de soportes activos 1. Cada soporte activo 1 con un código de barras 2 específico correspondiente tiene asociado con el mismo una molécula de información única 7, por ejemplo una sonda de ácido nucleico o PNA asociada con el mismo, que se une a y/o interacciona con un tipo específico de molécula de muestra 8 detectada durante el posterior análisis de caracterización de la proteína. Las moléculas de información 7 se utilizan con un significado genérico en lugar de limitarse al significado de una molécula en su sentido físico o químico. Las moléculas de información 7 se pueden unir a los soportes 1 antes o después de que los soportes 1 se liberen de un sustrato plano correspondiente utilizado durante su fabricación. El recubrimiento mejorado de las moléculas de información 7 sobre los soportes 1 se consigue mediante la unión de las moléculas 7 a los soportes 1 después de su liberación de su sustrato de fabricación plano asociado. Los marcadores emisores de señales, por ejemplo un marcador 9, son preferiblemente marcadores fluorescentes. Sólo los soportes con moléculas de información 7 que se han unido a la molécula de muestra 8 con característica de proteína detectada emitirán fluorescencia. El marcador fluorescente 9 que está unido a la molécula de muestra 8 detectada e indirectamente a la molécula de información 7 provoca esta fluorescencia, indicada por 10. La molécula de muestra 8 preferiblemente comprende materia para la detección de características de las proteínas. La molécula de muestra 8 se marca preferiblemente con los marcadores emisores de señales 9 antes de ser introducida en el bioensayo 6, concretamente un fluido, preferiblemente una solución líquida y más preferiblemente una solución líquida que incluye agua. Alternativamente, los marcadores emisores de señales 9 se pueden introducir en la solución líquida antes de añadirse a la muestra a caracterizar con respecto a las proteínas. El resultado de la prueba se mide mediante el grado de fluorescencia de los diferentes tipos de soporte 1. La intensidad fluorescente de los marcadores emisores de señales 9 cuantifica el nivel de moléculas de muestra detectadas 8 con las características de las proteínas presentes en el bioensayo 6.
Los experimentos en los que se prefiere una indicación de reacción binaria sí/no sólo requieren la determinación de si los soportes 1 en el bioensayo 6 son o no fluorescentes.
Las moléculas de información 7 unidas a los soportes 1 se utilizan preferiblemente en experimentos para detectar moléculas de muestra con características de proteínas específicas en realizaciones diferentes de la presente invención, por ejemplo las moléculas 7 pueden ser:
(a)
moléculas de enzimas, proteínas y/o PNA para el análisis de analitos;
(b)
moléculas de ácidos nucleicos, proteínas y/o PNA para el marcaje de fármacos; o
(c)
moléculas de ácidos nucleicos, proteínas y/o PNA para proteómica.
Se entenderá que las moléculas de información 7 no se limitan a de (a) a (c) anteriores y pueden comprender un amplio rango de compuestos capaces de ser diferenciados e identificados de manera única. Un ejemplo de un compuesto adecuado es un fragmento de péptido adaptado para unirse a una diana específica. Todas las moléculas de este amplio rango y/o sondas se pueden unir a soportes fabricados mediante las etapas (1) a (5) anteriores antes o después de realizar las operaciones fotolitográficas o la liberación de los soportes 1 del sustrato plano. Las moléculas de información 7 se unen preferiblemente a sólo una cara del soporte 1; alternativamente, las moléculas 7 cubren preferiblemente el soporte 1 de manera total o parcial.
Las moléculas 7 se pueden disponer para unirse sólo débilmente a los soportes 1; dicha unión débil se consigue mediante la disposición de la superficie de aluminio (11) en un estado no tratado cuando se incuba en una solución líquida, por ejemplo una solución acuosa. Mediante la modificación de la superficie 11 de los soportes 1 o las moléculas de información 7, dicha unión se puede mejorar selectivamente. La anodización de la superficie de unión 11 de los soportes 1 es una manera de proporcionar dicha mejora. Los procedimientos de desarrollo de superficies porosas en el aluminio son conocidos en la técnica. Asimismo, los procesos para sellar dichas superficies porosas también son conocidos. El Solicitante ha explotado dicho conocimiento para desarrollar un proceso relativamente sencillo para desarrollar una superficie absorbente que tiene una porosidad y profundidad controladas con bastante precisión. Dichas superficies porosas son capaces de unirse de forma óptima a las moléculas de ácidos nucleicos, PNA, enzimas o proteínas preferidas. La utilización de un sistema avidina-biotina es otro enfoque para mejorar la unión entre los soportes 1 y sus moléculas de información 7 asociadas. La superficie 11 del soporte 1 también se puede tratar con un material polimérico, tal como silano y/o biotina, para mejorar adicionalmente las propiedades de unión. Los soportes 1 tienen preferiblemente silano unido mediante calor a sus superficies 11. La unión de moléculas enlazadoras, por ejemplo sistema sándwich de avidina-biotina, a las moléculas de información 7 mejora adicionalmente sus propiedades químicas de unión molecular.
Dicha unión mejorada es importante, ya que permite que las moléculas de sondas 7 se unan fuertemente a la superficie de los soportes 11 durante la fabricación a la vez que se mantiene la unión débil no específica de moléculas diana fluorescentes 8 durante las pruebas. Además, dicha unión mejorada se consigue preferiblemente mediante enlaces covalentes entre la superficie de unión 11 del soporte 1 y la molécula de información 7. Los enlaces covalentes evitan que las moléculas de información 7 se desenganchen de los soportes 1 y provoquen un ruido de fondo molesto en el bioensayo 6 durante el análisis. Se ha hallado que es importante lavar los soportes activos 1, teniendo dichos soportes moléculas de información 7 unidas a los mismos, después de la unión para eliminar cualquier exceso de moléculas de información 7 que podría aumentar el ruido en el bioensayo 6 durante el análisis. La discriminación de las pruebas se mejora por tanto a través de una mejor proporción de la señal con respecto al ruido.
Tal y como se ha descrito anteriormente, cada código de barras diferente 2 fabricado sobre los soportes 1 se asocia con una correspondiente molécula de información 7 única. El código de barras 2 se almacena preferiblemente en los soportes 1 como una serie de agujeros que utilizan esquemas de codificación similares a los que se encuentran en sistemas de códigos de barras convencionales, por ejemplo tal y como se utiliza para marcar productos en almacenes comerciales al detalle. Dicho código permite la utilización de la tecnología de lectura existente para identificar los códigos de barras 2 de los soportes 1, disminuyendo de este modo la inversión inicial al adoptar la tecnología según la presente invención.
A continuación se describirán los sistemas de lectura para usar con el bioensayo 6 y soportes asociados.
El Solicitante ha desarrollado dos clases de sistemas de lectura. Éstos se basan en células de flujo para el manejo de los soportes 1 y en el desarrollo de la imagen de soportes 1 depositados.
Se puede utilizar un sistema de lectura basado en flujos, similar en la construcción a un citómetro de flujo, para aspirar miles de soportes 1 por segundo, leyendo de este modo y de manera simultánea el código de barras 2 de cada soporte 1 y los resultados de su resultado de prueba asociado. El resultado de prueba se mide como un resultado binario de sí/no o mediante el grado de fluorescencia 10. Alternativamente, se puede utilizar un sistema de lectura plano,
en el que:
(a)
los soportes 1 están depositados sobre un sustrato plano; y a continuación
(b)
se utilizan microscopía de fluorescencia y el procesado de imágenes asociado para leer los códigos de barras de los soportes y los resultados de sus pruebas asocia-das.
Las realizaciones de los sistemas de lectura basados en flujo y el sistema de lectura plano se describirán a continuación con mayor detalle haciendo referencia a las figuras 3, 4, 5 y 6.
En referencia a la figura 3, se muestra un lector de células de flujo indicado generalmente por 30. El lector 30 comprende un tubo de flujo 31 que tiene un extremo contracorriente y un extremo corriente abajo. En el extremo contracorriente, se incluye en el tubo 31 una boquilla de inyección 33 en comunicación de fluidos con una zona de focalización asociada 32, estando la zona 32 situada fuera del tubo 31. La zona 32 se estrecha donde contacta con la boquilla 33. Además, la boquilla 33 comprende en su extremo remoto en el tubo 31 una abertura de salida 43.
En el extremo corriente abajo, el lector 30 comprende una unidad de medición indicada por 35 para soportes de lectura 1 comunicados en la operación en un flujo de fluidos desde la boquilla 33 en el extremo contracorriente hasta el aparato de medida 35 en el extremo corriente abajo. El aparato 35 incluye una zona de lectura 34, una unidad de lectura 37, una fuente de luz 38, una unidad de detección 40, una unidad de emisión de señales 39 y una unidad de procesamiento 36. La unidad de emisión de señales 39 es preferiblemente una fuente fluorescente.
La operación del lector 30 se describirá inicialmente como una visión general.
Se introduce en la zona de focalización 32 un bioensayo 6, por ejemplo un líquido que comprende una pluralidad de soportes 1 dispersados en el mismo. Además, se genera un flujo de fluido 45, por ejemplo agua filtrada, a lo largo del tubo 31 en una dirección desde el extremo contracorriente hacia el extremo corriente abajo. Los soportes 1 en la zona de focalización 32 son forzados, por el perfil de estrechamiento de la zona 32, a alinearse en una formación de filas tal y como se ilustra en la figura. Los soportes 1 se expulsan desde la abertura de salida 43 y se arrastran por el fluido 45 a lo largo del tubo 31 hasta la zona de lectura 34 y finalmente la sobrepasan. Cuando uno o más de los soportes 1 entran en la zona de lectura 34, la luz de la fuente 38 ilumina los mencionados uno o más soportes 1, de manera que aparece la visión de una silueta en la unidad de lectura 37. La unidad de lectura 37 genera una correspondiente señal de silueta que se comunica a la unidad de procesamiento 36 para el posterior procesado de la imagen para determinar el código de barras 2 de los soportes 1. La unidad emisora de señales 39 también ilumina la zona 34 con radiación que tiene una longitud de onda seleccionada para inducir fluorescencia en uno o más de los soportes activos 1. La unidad de detección 39 detecta cualquier fluorescencia producida en la zona 34 y genera una correspondiente señal de fluorescencia que es recibida posteriormente por la unidad de procesamiento 36. Para cada soporte 1 transportado a través de la zona 34, la unidad de procesamiento 36 está programada para determinar el código de barras 2 del soporte 1 con su correspondiente magnitud de fluorescencia. Además, la unidad de procesamiento 36 también está conectada a una base de datos asociada que relaciona el código de barras 2 con una prueba proporcionada por sus moléculas de información asociadas 7.
Preferiblemente, el fluido 45 que fluye en la operación a lo largo del tubo 31 es un líquido. Alternativamente, el fluido 45 puede ser un gas a presión reducida en relación a la boquilla 33, de manera que el líquido que transporta los soportes 1 a la abertura de salida 43 se vaporiza en la abertura 43, ayudando de esta manera a lanzar los soportes 1 en el tubo 31. Aunque es más fácil establecer un régimen de flujo laminar en el tubo 31 cuando el fluido que fluye por el mismo es un líquido, el flujo gaseoso a través del tubo 31 ofrece potencialmente un rendimiento de los soportes 1 extremadamente rápido e interrogación asociada en la zona 34.
A continuación se describirá con detalle el diseño y la operación del lector 30.
El lector 30 está diseñado para provocar que los soportes 1, concretamente micro-marcadores, fluyan a lo largo de una región central de un tubo 31 a través de la zona de interrogación definida 34. Mediante la utilización de una configuración de fluido envolvente 41 acelerado y la boquilla de inyección 33, los soportes 1 inyectados en la región central del tubo 31 se someten a un efecto de focalización hidrodinámica 42 que provoca que todos los soportes 1 se alineen longitudinalmente, concretamente axialmente, y pasen a través de un punto focal bien definido 44 en la zona de interrogación 34 corriente abajo desde una abertura de salida 43. En el tubo 31, existe un flujo laminar de un fluido de lectura 45 que se mezcla con la solución de bioensayo 6 que entra en el tubo 31 a través de la boquilla de inyección 33. La distancia entre la abertura de salida 43 y la zona de interrogación 34 debe ser suficientemente larga para disipar cualquier turbulencia provocada por la boquilla de inyección 33. Esta longitud suficiente permite un flujo sustancialmente laminar del flujo de lectura 45 y, por tanto, proporciona a los soportes 1 un movimiento no oscilante pasado el punto focal 44. Si es necesario, la boquilla 33 puede estar dispuesta con una disposición radialmente simétrica de tubos metálicos de alimentación de la zona de focalización 32 para obtener un perfil de velocidad más simétrico en el interior del tubo 31. Un perfil de velocidad 61 incluido en la figura 3 proporciona una ilustración de la velocidad del flujo de fluido sustancialmente laminar en el tubo 31; la velocidad de fluido aumenta desde una región central del tubo 31 hacia las superficies periféricas interiores del tubo 31. En una región de superficie de contacto próxima a las superficies periféricas del tubo 31, la velocidad del fluido se reduce progresivamente hasta sustancialmente cero en la superficie interior del
tubo 31.
Antes de entrar en el tubo 31, los soportes 1 pasan a través de la zona de focalización 32 que está operativa para disponer los soportes 1 para la inyección en el tubo 31. Los soportes 1 se transportan a través del tubo 31 a la zona de interrogación 34 donde son interrogados por la unidad de medición 45 cuando están en el punto focal 44. Preferiblemente, los soportes 1 utilizados en el sistema de lectura basado en flujo 30 tienen moléculas de información 7 unidas a por lo menos dos superficies principales opuestas 11 de los soportes 1.
La fuente de luz 38 emite luz que pasa a través de la zona de lectura 34 e ilumina el soporte 1 en el punto focal 44. Preferiblemente, la fuente de luz 38 emite luz en un plano A-A que es sustancialmente perpendicular a la dirección del flujo de bioensayo 45 y de dos direcciones radiales diferentes, teniendo las direcciones radiales preferiblemente una separación angular entre ellas, por ejemplo con una separación angular entre ellas de aproximadamente 45º. Dicha disposición de iluminación del soporte 1 en el punto focal 44 permite la identificación de los soportes 1 independientemente de su posición rotacional a lo largo de su eje longitudinal. La unidad de lectura 37, localizada sustancialmente en una cara opuesta de la zona de interrogación 34 en relación a la fuente de luz 38, lee la luz que pasa a través de uno o más soportes 1 en el punto focal 44. La unidad de lectura 37 está en comunicación óptica con los soportes 1 cuando pasan a través de la zona de interrogación 34. Se utiliza una característica en forma de calificación en un extremo de cada soporte 1 para indicar a la unidad de lectura 37 cómo interpretar la información de lectura. Esto permite la lectura del soporte 1 desde cualquier dirección a lo largo de su eje longitudinal. La calificación también es susceptible de ser utilizada para aumentar el número de posibles códigos de barras en un soporte 1 para que supere ampliamente los 100.000. Por ejemplo, la utilización de cuatro calificaciones diferentes en grupos de soportes 1 separados es capaz de aumentar el número de combinaciones de identificación de soportes hasta aproximadamente 400.000. Una característica alternativa para indicar cómo deben leerse los códigos de información es empezar cada bloque con ceros y finalizar los bloques con unos o viceversa. Las alternativas adicionales de estas características preferiblemente datos de corrección de errores, comprobaciones del bit de paridad y/o corrección de errores posteriores, mejoran de esta manera la fiabilidad de la prueba.
En la operación, la unidad emisora de señales 39 emite radiación, por ejemplo luz fluorescente, que provoca que los soportes 1 que han reaccionado con las moléculas de muestra 8 y el marcador emisor de señales 9 emitan la radiación fluorescente correspondiente 10. La unidad de detección 40 mide la magnitud de la intensidad de la radiación fluorescente 10 que es emitida por los marcadores de señales activados 9 en los soportes 1. Esta intensidad indica el grado de reacción que se puede extrapolar para determinar la cantidad de molécula de muestra reactiva 8 presente en la muestra de bioensayo 6 con características de proteínas. A continuación, la unidad de procesamiento 36 evalúa la información del código de barras 2 detectado de los soportes 1 medidos por la unidad de lectura 37 y hasta qué punto los soportes 1 han emitido una señal 10 detectada por la unidad de detección 40. A continuación, la información se verifica con la información correspondiente en una base de datos que comprende una información preprogramada que une los códigos de barras 2 específico y las moléculas de información específicas 7.
Una vez se ha leído un número suficiente de soportes 1, la unidad de procesamiento 36 de la unidad de medición 35 calcula los resultados de las pruebas asociadas con los soportes 1. Este número suficiente está preferiblemente entre 10 y 100 copias de cada tipo de soporte 1; este número es preferible para llevar a cabo un análisis estadístico sobre los resultados de la prueba. Por ejemplo, un análisis estadístico, tal como el cálculo de medias y el cálculo de desviaciones estándar se puede llevar a cabo para la fluorescencia 10 asociada con cada tipo de molécula de información 8 presente. La unidad de procesamiento 36 también controla las unidades de lectura y detección 37, 40, de manera que cada soporte individual 1 sólo es analizado una vez. También podría ser posible analizar sólo los soportes 1 fluorescentes 10 que pasan a través del lector de flujos 30 para disminuir la cantidad de información procesada.
En la figura 4, se muestra un proceso de incubación 46 que comprende las etapas de:
(a)
colocación de los soportes 1 en un sustrato plano 49, por ejemplo un chip, portaobjetos o micromatriz de vidrio, para proporcionar un sustrato 48 cargado con el correspondiente soporte, e
(b)
interrogación del sustrato 48 cargado con el correspondiente soporte utilizando una unidad de medición plana 35 tal como se ilustra en la figura 3 y se ha descrito previamente.
El proceso de incubación 46 implica la mezcla de los soportes 1, que llevan moléculas de información 7 adheridas, con una muestra que comprende moléculas 8 con características de proteínas en una solución de bioensayo líquida 6. A continuación, los soportes 1 se depositan en el sustrato plano 49 y se pueden secar posteriormente para generar el sustrato 48 cargado con el soporte. A continuación, la unidad de medición 35 mide el nivel de fluorescencia 10 y también el código de barras 2 de los diferentes soportes 1 del sustrato 48 cargado con el soporte. Normalmente, todos los soportes 1 sobre los sustratos 48 cargados se analizan para verificar la calidad total del experimento. En los casos en los que podría haber un interés en ahorrar tiempo y/o capacidad de procesamiento, el software de la unidad de procesamiento 36 se puede configurar preferiblemente para analizar sólo los soportes 1 que emiten una señal 10, por ejemplo a través de un marcador de señal fluorescente 9, indicando que ha tenido lugar una interacción con las moléculas con características de la proteína 8. El análisis del sustrato 48 cargado utilizando la unidad de medición plana 35 tiene una buena relación coste-efectividad, es fácil de llevar a cabo y es una manera adecuada de multiplicar la capacidad de análisis para un número de muestras de bajo a medio en el intervalo de, por ejemplo, menos de una decena a varios miles de soportes en cada sustrato 48.
En la figura 5 se ilustra un sistema de lectura plano e indicado en general por 62. En el lector 62, los soportes 1 se depositan, concretamente se depositan de manera fija o se depositan en un líquido, sobre el sustrato 49 plano transmisivo de la luz. Preferiblemente, el sustrato plano 49 está fabricado de un polímero, material basado en vidrio o en silicio, por ejemplo un portaobjetos de microscopio, y más preferiblemente está en forma de una micromatriz. A continuación, se utiliza la unidad de medición 35, dispuesta para llevar a acabo microscopía de fluorescencia convencional, para analizar de forma sistemática el sustrato 49 placado sobre el soporte. Los trayectos preferidos 60 para la interrogación sistemática del sustrato 49 se muestran en la figura 6a y 6b. La figura 6a es una representación de un régimen de interrogación de tipo meandro, mientras que la figura 6b es una representación de un régimen de interrogación de tipo espiral. Existen naturalmente muchos otros trayectos 60 posibles evidentes para un experto en la materia, por ejemplo el movimiento del sustrato 49 en una dirección opuesta a la del trayecto 60, o el movimiento del sustrato en un trayecto diagonal con meandros. Sin embargo, los regímenes de las figuras 6a, 6b son eficaces para conseguir una mayor velocidad de lectura del soporte 1. Preferiblemente, una placa base 50 accionada por un motor de paso que soporta y transporta el sustrato 49 se utiliza para mover el sustrato 49 mientras la unidad de medición 35 se mantiene estacionaria. Se rastrean las posiciones de los soportes 1 de manera que sólo se analizan una vez.
La unidad de lectura 37 de la unidad de medición plana 35 para el procesado de imágenes se utiliza para capturar imágenes digitales de cada campo del sustrato 49 al que los soportes 1 se han fijado. Las imágenes digitales obtenidas de esta manera corresponden a la luz transmitida a través del sustrato 49 y la placa base 50 y, a continuación, a través de los soportes 1 se obtienen con los soportes 1 una visión de silueta; dichas imágenes de silueta de los soportes 1 se analizan mediante la unidad de lectura 37 en combinación con una unidad de procesamiento 55. El código de barras 2 asociado con cada soporte 1 se identifica, por tanto, a partir de su perfil de luz transmitida por la unidad de lectura 37. La unidad emisora de señales 39 genera una señal fluorescente, la cual hace que los marcadores 9 en los soportes 1 que han interaccionado con las moléculas con características de proteínas 8 tengan fluorescencia 10. Una unidad de detección 40 detecta la magnitud de la fluorescencia 10 de soportes 1 activados para identificar el grado de reacción. La señal fluorescente 10 integrada sobre la superficie 11 de los soportes 1 activados se registra en asociación con el código de barras 2 de identificación para construir grupos de datos susceptibles de un análisis estadístico.
La unidad de procesamiento 55 está conectada a la fuente de luz 38, la unidad de señales 39, la unidad de lectura 37, y la unidad de detección 40 y a una pantalla 56. Además, la unidad de procesamiento 55 comprende un sistema de control para controlar la fuente de luz 38 y la unidad de señal 39. La silueta de luz y las señales fluorescentes 10 de los soportes 1 pasan a través de un montaje óptico 51, por ejemplo un montaje que comprende una o más lentes y/o uno o más espejos, hacia la unidad de detección 40 y la unidad de lectura 37. Se utiliza un espejo 52 para dividir las señales ópticas en dos trayectos y se utilizan filtros ópticos 53, 54 para filtrar las señales ópticas no deseadas en base a su longitud de onda. Alternativamente, la fuente de luz 38 y la unidad de señales 39 se pueden conectar y desconectar a intervalos, por ejemplo de forma alternada entre ellas. Las señales se reciben de la unidad de lectura 37 y la unidad de detección 40, se procesan y se presentan los resultados de los correspondientes análisis estadísticos en una pantalla 56. Se requieren cantidades similares de cada tipo de soporte 1 para obtener un análisis estadístico óptimo de los experimentos. Dicho análisis estadístico es bien conocido en la técnica.
La realización preferida del procedimiento bioquímico de detección de una o más características de proteínas utiliza los soportes 1 con los códigos de barras 2 descritos previamente. El procedimiento comprende varias etapas que se pueden llevar a cabo en diversos órdenes diferentes y se describirán a continuación con más detalle.
Las moléculas de información 7 se unen a por lo menos una superficie principal 11 de los soportes 1 para permitir la detección de materia potencial con características de proteínas 8 en una muestra. A continuación, los soportes 1 con por lo menos un tipo de código de barras 2 se suspenden en un fluido 6 para obtener una matriz tridimensional en la que los soportes 1 están sumergidos en el fluido 6. La matriz tridimensional permite una muy buena cinética de reacción. La cantidad de los diferentes tipos de soportes 1 suspendidos en el fluido 6 depende del rendimiento requerido de las pruebas, pero podrían ser cientos, miles o incluso millones. La cantidad de los mismos tipos de soportes 1 suspendidos en el fluido 6 depende entre otras cosas de la calidad del análisis estadístico y la facilidad del análisis.
La muestra a analizar, que potencialmente contiene la materia con características de proteínas 8, se añade al fluido 6 antes o después de que los soportes 1 se hayan suspendido en el fluido. Los marcadores emisores de señales 9 también se añaden al fluido 6. Estos marcadores emisores de señales 9 se utilizan para indicar la interacción, por ejemplo, el enlace entre las moléculas de información 7 en los soportes 1 y la materia con características de proteínas 8 buscada en la muestra analizada. Existen muchas maneras diferentes de añadir los marcadores emisores de señales 9 al fluido 6. Por ejemplo, se pueden añadir al fluido 6 por separado, se pueden unir a la materia con características de proteínas 8 a analizar antes de añadir la muestra al fluido 6, o pueden unirse a la molécula de información 7 antes o después de su unión a los soportes 1. Existen muchas maneras diferentes de que los marcadores emisores de señales 9 indiquen la interacción entre las moléculas de información 7 y la materia con características de proteínas 8 en la muestra analizada.
Una de dichas maneras es que una señal, tal como fluorescencia o luz de otra longitud de onda (color), se active por el marcador emisor de señales 9 si existe interacción entre una molécula de información 7, una materia con características de proteínas 8 que se complementa, y el marcador emisor de señales 9. Alternativamente, los marcadores emisores de señales 9 se activan antes de cualquier interacción con la materia con características genéticas 8. Cuando existe una interacción entre la molécula de información 7 y la materia con características de proteínas 8 el marcador emisor de señales 9 activo se libera de otras moléculas que desactivan su señal. Esto daría lugar a una detección que es opuesta a las descritas anteriormente, es decir, la ausencia de una señal indica que ha tenido lugar una reacción en un soporte en, por ejemplo, un experimento de sí/no. De forma similar, un descenso en la señal fluorescente 10 puede ser un indicador de la cantidad de la materia con características de proteínas 8 presente en la muestra analizada introducida en el fluido 6.
Se analiza el fluido 6 que contiene los soportes 1 con las moléculas de información 7, la muestra a analizar 8 y los marcadores emisores de señales 9 utilizando una unidad de detección 40 y una unidad de lectura 37. La unidad de lectura 37 lee el código de barras 2 de por los menos aquellos soportes 1 con moléculas de información 7 que han reaccionado con la materia con características de proteínas 8 en la muestra analizada. También puede ser preferible leer los códigos de barras 2 de todos los soportes 1 como un control de calidad de un experimento múltiple. La unidad de detección 40 detecta la ausencia o presencia de señales de interacción 10 de los marcadores emisores de señales 9. En un tipo alternativo de procedimiento de ensayo bioquímico se puede utilizar más de una señal en cada soporte indicando la presencia de dos o más características de proteínas 8 en la muestra analizada. Esto significaría que dos o más moléculas de información 7 diferentes se unieron al mismo soporte 1. En tal caso, los marcadores emisores de señales 9 emitirían una señal diferente 10 dependiendo de la materia con características de proteínas 8 que se une a las moléculas de información 7. Otra metodología preferida utilizada para la detección de características de proteínas es utilizar la señal combinada de dos o más soportes 1 con diferentes códigos de barras 2 para indicar la presencia de la característica de proteína. Las combinaciones de señales podrían ser, por ejemplo, un soporte activo A y un soporte pasivo B, soportes A y B activos, o un soporte B pasivo y un soporte A activo, indicando cada combinación diferente de soportes qué tipo de característica de proteína se detecta en el fluido.
Entre los usos a los que se dirige el ensayo bioquímico para detectar una o más características de proteínas se incluyen el marcaje de fármacos, proteómica o análisis de analitos. Estos usos de los procedimientos de bioensayo también son adecuados para su uso en el campo del cribado ("screening") y el diagnóstico.
Se entenderá que se pueden llevar a cabo modificaciones en las realizaciones de la presente invención descritas anteriormente sin apartarse del alcance de la invención tal y como se define en las reivindicaciones que se acompañan.

Claims (17)

1. Procedimiento bioquímico de detección de una o más características de proteínas, utilizando dicho procedimiento soportes (1) cuya dimensión más grande (3) es inferior a 250 \mum y en el que cada soporte (1) incorpora un medio de identificación secuencial (2), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
(a) unir una molécula de información (7) a una superficie principal (11) de cada soporte (1);
(b) suspender los soportes (1) con la molécula de información asociada (7) en un fluido;
(c) añadir una muestra (8) a analizar al fluido;
(d) colocar el fluido que comprende sus soportes (1) asociados y la muestra (8) sobre un sustrato (49) para su posterior interrogación;
(e) detectar las señales de interacción de por lo menos uno de los soportes (1) en el fluido utilizando un medio de detección de señales (40); y
(f) leer el medio de identificación secuencial (2) de los soportes (1) que tienen una señal de interacción utilizando un medio de lectura (3), detectando de este modo por lo menos una de dichas una o más características de proteínas (8),
caracterizado por el hecho de que
(g) la molécula de información (7) es capaz de interaccionar con por lo menos una de dichas una o más características de proteínas; y
(h) el medio de identificación secuencial (2) es un código de barras e incorpora totalmente por lo menos una de las características de orientación espacial y características de corrección de errores para ayudar al medio de lectura (3) a determinar las identidades de los soportes (1).
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el procedimiento incluye además una etapa de oxidación de los soportes (1) antes de la unión de moléculas de información asociadas (7) a los mismos.
3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que uno de los soportes (1) con moléculas de información asociadas y la muestra (8) se añade al fluido antes, después o simultáneamente de que el fluido se coloque sobre el sustrato (49), en que la etapa (c) se lleva a cabo antes, después o simultáneamente con la etapa (b), y que la etapa (f) se lleva a cabo antes o después de la etapa (d).
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, caracterizado por el hecho de que el procedimiento incluye además una etapa de utilización de una unidad de medición (35) para detectar las señales de interacción y para leer los códigos de barras (2), estando dispuesta la unidad de medición (35) para detectar las señales de interacción y para la lectura de los códigos de barras (2) sustancialmente de forma simultánea, comprendiendo la unidad de medición (35) el medio de detección y de lectura (37, 40) para interrogar los soportes (1).
5. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que los marcadores emisores de señales (9) se añaden al fluido, dispuestos dichos marcadores emisores (9) para emitir las señales de interacción cuando las moléculas de información (7) se unen a moléculas en la muestra que muestran una o más características de proteínas.
6. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el procedimiento comprende además una etapa de lectura del fluido a lo largo de un trayecto predeterminado (60) a lo largo del sustrato (49) utilizando una unidad de medición (35) dispuesta para detectar y leer los soportes (1), dispuesto dicho trayecto (60) para recibir sustancialmente todo el fluido.
7. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que el procedimiento comprende además una etapa de interrogación de soportes (1) individuales sólo una vez.
8. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que el fluido, comprendiendo dicho fluido los soportes (1) con moléculas de información (7) asociadas y la muestra que incluye moléculas susceptibles de mostrar por lo menos una característica de proteína (8) potencial, se pasa a través de una zona de interrogación (34) de una unidad de medición (35) mediante un medio de focalización para alinear y separar los soportes (1) antes de la interrogación.
9. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que una unidad de medición (35) verifica la información de lectura y detección de los soportes (1) con una base de datos que incluye información preestablecida que une los códigos de barras específicos (2) con las moléculas de información específicas (7).
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que los soportes (1) están recubiertos con un promotor de unión en una o más de sus superficies principales (11) para facilitar la unión de moléculas a los mismos.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que el promotor de unión es por lo menos uno entre silano y avidina-biotina.
12. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que el fluido incluye una solución líquida.
13. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características de proteínas que se detectan es el marcaje de fármacos y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de ácido nucleico, proteína y/o PNA.
14. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características de proteínas que se detectan es la proteómica y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de ácido nucleico, proteína y/o PNA.
15. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que una o más características de proteínas que se detectan es el análisis de analitos y los tipos específicos de moléculas de información (7) que se unen a los soportes (1) son moléculas de enzima, proteína y/o PNA.
16. Aparato de detección de características de proteínas para el análisis de un fluido que comprende soportes (1), cuya dimensión más grande es inferior a 250 \mu y en el que cada soporte (1) incorpora un medio de identificación secuencial (2), incluyendo el aparato un sustrato (49) para colocar el fluido que comprende soportes (1) en el mismo para la posterior interrogación, incluyendo el aparato además un medio de detección (40) y un medio de lectura (37) para detectar una pluralidad de señales independientes generadas a partir de cada soporte (1) cuando se interrogan en el aparato, por lo menos estando el medio de lectura (37) dispuesto para estar en comunicación óptica con los soportes (1) suspendidos en el fluido para detectar el medio de identificación secuencial (2) de los soportes (1) y estando el medio de detección (40) dispuesto para detectar una señal de interacción para la detección de la interacción entre una o más moléculas que muestran características de proteínas de una muestra a analizar y una molécula de información (7) unida a una superficie principal (11) de los soportes (1) incluyendo un medio de identificación secuencial (2) específico correspondiente, caracterizado por el hecho de que el medio de identificación secuencial es un código de barras e incorpora totalmente por lo menos una de las características de orientación espacial y características de corrección de errores para ayudar al medio de lectura (3) a determinar las identidades de los soportes (1).
17. Aparato según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que la señal de interacción se genera mediante un marcador emisor de señales (9) susceptible de ser activado y desactivado a través de la interacción entre la molécula de información (7) y dicha una o más moléculas susceptibles de mostrar características de proteínas (8) en la muestra analizada.
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