ES2284879T3 - Metodo para la identificacion de agentes para el tratamiento de la diabetes. - Google Patents
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Abstract
Método para identificar un agente que modula la capacidad de un polipéptido Mnk2 para modular la captación de glucosa en una célula, comprendiendo el método: poner en contacto un polipéptido Mnk2 (cinasa 2 que interactúa con la MAP cinasa) con un agente candidato; y determinar el efecto del agente candidato sobre la capacidad del polipéptido Mnk2 para modular la captación de glucosa en una célula.
Description
Método para la identificación de agentes para el
tratamiento de la diabetes.
La presente invención se refiere al uso de las
"cinasas que interactúan con la MAP cinasa" humanas Mnk2a y
Mnk2b, en métodos para la identificación de agentes
farmacéuticamente útiles, en particular agentes útiles para el
tratamiento de la diabetes tipo II.
Una de las hormonas principales que influyen en
el metabolismo es la insulina, que se sintetiza en las células beta
de los islotes de Langerhans del páncreas. La insulina regula
principalmente la dirección del metabolismo, desplazando muchos
procesos hacia el almacenamiento de sustratos y alejándolos de su
degradación (para revisiones, véase por ejemplo Shepherd, P.R.
et al. (1998) Biochem. J. 333: 471-490;
Alessi, D. R. & Downes, C. P. (1998) Biochim. Biophys. Acta
1436: 151-164). La insulina actúa para aumentar el
transporte de glucosa y aminoácidos así como minerales clave tales
como potasio, magnesio y fosfato desde la sangre hasta las células.
También regula una variedad de reacciones enzimáticas en las
células, de las que todas tienen una dirección global común,
concretamente la síntesis de moléculas grandes a partir de unidades
pequeñas. Una deficiencia en la acción de la insulina (diabetes
mellitus) produce una grave insuficiencia en (i) el almacenamiento
de glucosa en forma de glucógeno y la oxidación de la glucosa para
dar energía; (ii) la síntesis y el almacenamiento de grasas a
partir de ácidos grasos y sus precursores y la finalización de la
oxidación de ácidos grasos; y (iii) la síntesis de proteínas a
partir de aminoácidos.
Existen dos variedades de diabetes. La tipo I es
la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM,
"insulin-dependent diabetes mellitus";
denominada antes como diabetes de aparición juvenil), para la que se
requiere inyección de insulina. En este tipo, la insulina no se
secreta por el páncreas y por tanto debe tomarse mediante inyección.
La diabetes tipo II, diabetes mellitus no dependiente de insulina
(NIDDM, "non-insulin-dependent
diabetes mellitus"), se caracteriza clínicamente por
hiperglucemia y resistencia a la insulina y está asociada
normalmente con la obesidad. La diabetes tipo II es un grupo
heterogéneo de trastornos en los que la hiperglucemia resulta tanto
de una respuesta secretora de insulina insuficiente frente a glucosa
como de una disminución de la eficacia de la insulina para
estimular la captación de glucosa por el músculo esquelético y para
restringir la producción de glucosa hepática (resistencia a
insulina). Antes del desarrollo de la diabetes, los pacientes
pierden generalmente la respuesta secretora de insulina temprana
frente a glucosa y pueden secretar cantidades relativamente grandes
de proinsulina. En la diabetes establecida, aunque los niveles de
insulina en plasma en ayunas pueden ser normales o incluso
superiores en los pacientes de diabetes tipo II, la secreción de
insulina estimulada por glucosa está disminuida claramente. Los
niveles de insulina disminuidos reducen la captación de glucosa
mediada por insulina y no restringen la producción de glucosa
hepática.
La homeostasis de glucosa dependen de un
equilibrio entre la producción de glucosa por el hígado y la
utilización de glucosa por tejidos dependientes de insulina, tales
como grasa y músculo, y tejidos independientes de insulina, tales
como de corazón y de riñón. En la diabetes tipo II la entrada de
glucosa en la grasa y músculo está reducida y la producción de
glucosa en el hígado está aumentada, debido a la resistencia a
insulina en los tejidos.
Los receptores de tipo tirosina cinasas (RTK
"receptor tyrosine kinases") son un tipo importante de
receptores de superficie celular. Los ligandos para los RTK son
hormonas peptídicas/proteicas que incluyen el factor de crecimiento
nervioso (FCN), factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP),
factor de crecimiento epidérmico (EGF), e insulina. La unión de un
ligando a un RTK estimula la actividad de proteína tirosina cinasa
intrínseca del receptor, que estimula posteriormente una cascada de
transducción de señal que conduce a cambios en la fisiología
celular y patrones de expresión génica. Las rutas de señalización de
RTK tienen un amplio espectro de funciones incluyendo la regulación
de la proliferación y diferenciación celular, la promoción de la
supervivencia celular y la modulación del metabolismo celular;
Ras es una proteína interruptora de unión a GTP
que actúa como una molécula clave de señalización en las rutas
provocadas por la activación de los RTK. Todos los RTK unidos a Ras
en las células de mamíferos parecen utilizar una ruta de
transducción de señal altamente conservada en la que Ras activada
induce una cascada de cinasa que culmina en la activación de la MAP
cinasa (proteína cinsasa activada por mitógeno). Esta
serina/treonina cinasa, que puede translocarse hacia el núcleo,
fosforila muchas proteínas diferentes incluyendo factores de
transcripción que regulan la expresión de proteínas importantes
específicas de la diferenciación y del ciclo celular.
Los productos génicos Mnk1 y Mnk2 de murino
("cinasa que interactúa con MAP cinasa" o "cinasa que integra
la señal de la MAP cinasa" 1 y 2) son serina/treonina cinasas de
dominio único que comparten el 72% de identidad de secuencia
(Waskiewicz A.J. et al. (1997) EMBO J. 16:
1909-1920; números de registro GenBank Y11091 y
Y11092). También se ha descrito la Mnk1 humana (Fukunaga, R. et
al. (1999) EMBO J. 16: 1921-1933; número de
registro GenBank AB000409). Estas tres proteínas se identificaron
por su capacidad de unirse de manera ajustada a MAP cinasas. Tanto
Mnk1 como 2 se unen a las cinasas que regulan la señal extracelular
ERK1 y ERK2, y Mnk1 también se une a la cinasa activada por estrés,
p38. El factor de iniciación eucariótico 4E (eIF4E) se ha
identificado como uno de los sustratos fisiológicos de Mnk1 y Mnk2
(Scheper, G.C. et al. (2001) Mol. Cell. Biol.
21:743-754).
El gen de Mnk2 humano se ha identificado y
caracterizado mediante una selección de dos híbridos en levadura en
la que la proteína Mnk2 interactuaba con el dominio de unión a
ligando del receptor \vartheta de estrógeno (ER\beta)
(Slentz-Kesler, K. et al. (2000) Genomics 69:
63-71). Se ha mostrado que el gen de Mnk2 humano
tiene dos variantes de corte y empalme C-terminales,
designadas Mnk2a (las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de
Mnk2a se designan SEQ ID NOS:1 y 2, respectivamente; número de
registro GenBank AF237775) y Mnk2b (las secuencias de nucleótidos y
aminoácidos de Mnk2b se designan SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente;
número de registro AF237776). Las dos isoformas son idénticas a lo
largo de los primeros 385 aminoácidos de la secuencia codificante y
difieren sólo en el exón final que codifica para 80 residuos
adicionales para Mnk2a y para 29 residuos para Mnk2b. Se mostró
además que la interacción de Mnk2 era selectiva para el receptor de
estrógeno (ER)\vartheta a diferencia de ERI y que la
interacción era específica para Mnk2b a diferencia de Mnk2a o
Mnk1.
La figura 1 es una gráfica que representa el
efecto de la sobreexpresión de Mnk2b en los adipocitos
3T3-L1 transfectados con GLU-REx3,
CRE, IRE, o SREBP-RE. Se transfectaron las células
control con un vector de plásmido vacío y se fijó el nivel de
expresión control a 1,00.
La figura 2 es una gráfica que representa el
efecto de Mnk2b sobre la captación de glucosa, cuando se
sobreexpresa en adipocitos diferenciados 3T3-L1
(2A) y la línea celular neuronal humana SHSY (2B). Se transfectaron
las células control (ctrl) con un vector de plásmido vacío. Las
barras grises indican las células no estimuladas, las barras
blancas indican las células estimuladas con insulina.
La figura 3 es una gráfica que representa el
efecto de la sobreexpresión de Mnk2b y la interrupción de la
interferencia por ARN (iARN) de la expresión de Mnk2b sobre la
captación de glucosa en células humanas.
Se ha encontrado sorprendentemente que Mnk2 está
implicada en la ruta de señalización de la insulina.
En un aspecto, la invención ofrece un método
para identificar un agente que modula (aumenta o disminuye) la
capacidad de un polipéptido Mnk2 de modular la captación de glucosa
en una célula, comprendiendo el método: poner en contacto un
polipéptido Mnk2 con un agente candidato; y determinar el efecto del
agente candidato sobre la capacidad del polipéptido Mnk2 para
modular la captación de glucosa en una célula. En un ejemplo, el
agente candidato disminuye la capacidad del polipéptido Mnk2 para
disminuir la captación de glucosa en la célula.
En otro aspecto, la invención ofrece un método
para identificar un agente que modula la capacidad de un polipéptido
Mnk2 para modular la actividad de un elemento de respuesta frente a
glucosa en una célula, comprendiendo el método: poner en contacto
un polipéptido Mnk2 con un agente candidato; y determinar el efecto
del agente candidato sobre la capacidad del polipéptido Mnk2 para
modular la actividad de un elemento de respuesta frente a glucosa
en una célula. En un ejemplo, el agente candidato disminuye la
capacidad de la actividad de un elemento de respuesta frente a
glucosa (por ejemplo, un elemento de respuesta descrito en el
presente documento) en la célula.
En otro aspecto, la invención ofrece un método
para identificar un modulador de la captación de glucosa,
comprendiendo el método: proporcionar una célula que expresa un
polipéptido Mnk2 recombinante; exponer la célula a un agente
candidato; y medir la captación de glucosa en la célula en presencia
del agente candidato, en el que la captación alterada de glucosa en
la célula en presencia del agente candidato comparada con la
ausencia del agente candidato indica que el agente candidato es un
modulador de la captación de glucosa. En un ejemplo, el agente
candidato produce un aumento de la captación de glucosa.
Un agente candidato puede contener por ejemplo,
un péptido, un peptidomimético, aminoácido, análogo de aminoácido,
polinucleótido, análogo de polinucleótido, nucleótido, análogo de
nucleótido u otra molécula pequeña. En un ejemplo, el agente
candidato inhibe una actividad biológica de Mnk2 tal como una
actividad serina/treonina cinasa, la capacidad para reducir la
captación de glucosa en una célula, la capacidad de disminuir la
actividad de un elemento de respuesta frente a glucosa (por ejemplo
un elemento descrito en el presente documento) y/o la capacidad
para unirse a un ligando de Mnk2 descrito en el presente documento.
En una realización, el agente candidato se une a un polipéptido
Mnk2 o a un ácido nucleico (ARN o ADN) que codifica para un
polipéptido Mnk2.
Los métodos de selección descritos en el
presente documento pueden incluir opcionalmente una etapa de
introducir en una célula un ácido nucleico que codifica para un
polipéptido Mnk2. El efecto de un agente candidato sobre una
actividad biológica descrita en el presente documento puede
evaluarse en presencia y/o ausencia de un polipéptido Mnk2 o un
ácido nucleico que codifica para un polipéptido Mnk2. Los métodos
descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo in
vitro o in vivo usando un sistema basado en células, un
sistema libre de células, o una combinación de sistemas basados en
células y libres de células.
En otro aspecto, la invención ofrece un método
para modular la captación de glucosa in vitro en una célula,
comprendiendo el método poner en contacto una célula con una
cantidad de un compuesto eficaz para modular la expresión o
actividad de un polipéptido Mnk2 y modular por tanto la captación de
glucosa en la célula.
El polipéptido Mnk2 usado en los métodos
descritos en el presente documento puede ser un polipéptido Mnk2 de
mamífero, por ejemplo, un polipéptido Mnk2 humano. Por ejemplo, el
polipéptido Mnk2 puede ser un polipéptido Mnk2a o Mnk2b humano.
El polipéptido Mnk2 puede tener una secuencia
mostrada como SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. Un polipéptido Mnk2
también puede diferir de la correspondiente secuencia mostrada como
SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. Las diferencias son, preferiblemente,
diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución
conservativa. En una realización, el polipéptido Mnk2 incluye una
secuencia de aminoácidos idéntica al menos aproximadamente en un
60% a un secuencia mostrada como SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 o un
fragmento de la misma. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos
es idéntica al menos en un 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%,
99% o más a SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 y tiene una actividad
biológica Mnk2 descrita en el presente documento. Por ejemplo, la
secuencia de aminoácidos puede ser idéntica a SEQ ID NO:2 o SEQ ID
NO:4.
Los polipéptidos Mnk2 preferidos son al menos un
10%, preferiblemente al menos un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, o
más, de la longitud de la secuencia mostrada como SEQ ID NO:2 o SEQ
ID NO:4 y tienen una actividad biológica Mnk2 descrita en el
presente documento. Por ejemplo, un polipéptido Mnk2 puede tener una
actividad serina/treonina cinasa, reducir la captación de glucosa
en una célula, disminuir la actividad de un elemento de respuesta
frente a glucosa (por ejemplo, un elemento descrito en el presente
documento), y/o unirse a un ligando de Mnk2 descrito en el presente
documento.
Un polipéptido Mnk2 también incluye un
polipéptido que comprende un dominio funcional del polipéptido de
SEQ IDNO:2 o SEQ ID NO:4 descrito en el presente documento, por
ejemplo, un dominio de cinasa. En una realización, el polipéptido
Mnk2 tiene actividad cinasa.
Un polipéptido Mnk2 también incluye un
polipéptido que comprende al menos 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150,
200, 250, 300, 350, 400, 450, o más residuos de aminoácidos
contiguos de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4. Preferiblemente, el
polipéptido tiene una actividad biológica Mnk2 descrita en el
presente documento.
En algunos aspectos de la invención el
polipéptido Mnk2 puede ser un polipéptido sustancialmente puro. El
término "sustancialmente puro" tal como se usa en el presente
documento en referencia a un polipéptido dado significa que el
polipéptido está sustancialmente libre de otras macromoléculas
biológicas. Por ejemplo, el polipéptido sustancialmente puro es al
menos un 75%, 80, 85, 95, o 99% puro en peso seco. La pureza puede
medirse mediante cualquier método habitual apropiado conocido en la
técnica, por ejemplo, mediante cromatografía en columna,
electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC.
En toda esta descripción los términos
"protocolos habituales" y "procedimientos habituales",
cuando se usan en el contexto de técnicas de biología molecular,
han de entenderse como protocolos y procedimientos que se
encuentran en un manual de laboratorio ordinario tal como: Current
Protocols in Molecular Biology, editores F. Ausubel et al.,
John Wiley and Sons, Inc. 1994, o Sambrook, J., Fritsch, E.F. y
Maniatis, T., Molecular Cloning: A laboratory manual, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
1989.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos científicos y técnicos usados en el presente documento
tienen el mismo significado tal como se entienden comúnmente por un
experto habitual en la técnica que pertenece a esta invención. A
continuación se describen métodos y materiales adecuados, aunque
también pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes
a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas
de la presente invención. Todas las publicaciones, solicitudes de
patentes, patentes y otras referencias mencionadas en el presente
documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de
conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las
definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos
son sólo a modo de ilustración y no propuestos para ser
limitativos.
A continuación, la invención se describe en los
ejemplos adjuntos, que se proponen para ilustrar la invención, sin
limitar el alcance de protección.
Ejemplo
1
La mutagénesis mediada por el elemento P es una
tecnología ampliamente usada en la genética de Drosophila
(Cooley, L. et al. (1988) Science 239:
1121-1128; Robertson, H.M. et al. (1988)
Genetics 118: 461-470). El elemento P es un
elemento que puede transportarse bien caracterizado, que puede
introducir mutaciones hereditarias de pérdida de función en una
amplia serie de genes. Acopladas con la anotación genómica del sitio
de inserción del elemento P, las bibliotecas del elemento P
proporcionan una herramienta genética inversa valiosa. Las
selecciones genéticas que usan bibliotecas de mutantes de inserción
de P en genes conocidos permiten una exploración rápida del genoma
para identificar posibles genes modificadores.
\newpage
La señalización del receptor de insulina
afectada tiene la manifestación fenotípica de un tamaño celular más
pequeño (Huang, H., et al. (1999) PTEN affects cell size,
cell proliferation and apoptosis during Drosophila eye
development. Development 126:5365-5372.). Se realizó
una selección genética para identificar modificadores de la
señalización del receptor de insulina, usando una biblioteca de
líneas de Drosophila mutagenizadas por inserción de P. En
esta selección, la manifestación fenotípica de ojo pequeño se usó
como lectura. Se identificó el gen LK6 de la D. melanogaster
(número de registro GenBank U76378) como un débil pero constante
potenciador del fenotipo D.N. del receptor de insulina.
Se usó la proteína L6K de Drosophila
melanogaster en una búsqueda TBLASTN
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Education/blasttutorial.html) en las bases de datos de nucleótidos públicas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Los resultados positivos humanos fueron MNK1 (AB000409; valor de e de e-113), MNK2a (AF237775; valor de e de e-114) y MNK2b (AF237776; valor de e de e-110). Por consiguiente, se concluyó mediante análisis bioinformático que el gen LK6 de D. melanogaster tiene dos homólogos humanos, Mnk1 y Mnk2.
Education/blasttutorial.html) en las bases de datos de nucleótidos públicas (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Los resultados positivos humanos fueron MNK1 (AB000409; valor de e de e-113), MNK2a (AF237775; valor de e de e-114) y MNK2b (AF237776; valor de e de e-110). Por consiguiente, se concluyó mediante análisis bioinformático que el gen LK6 de D. melanogaster tiene dos homólogos humanos, Mnk1 y Mnk2.
Ejemplo
2
Se aisló el extremo 3' del ADNc de Mnk2b a
partir del clon Incyte número 1309709. Este clon contiene una
secuencia correspondiente a las últimas 570 pb de Mnk2b. Se
verificó el inserto de ADNc del clon Incyte mediante secuenciación,
realizada por el kit de reacción preparada para la secuenciación de
ciclo de terminador ABI PrismBigDye, en sistema de secuenciación de
ADN de Applied Biosystems modelo ABI 377 XL/96.
Para aislar un clon de ADNc que codifica para el
extremo 5' de Mnk2b (670 pb), se usó la secuencia pública de Mnk2b
(número de registro GenBank AF237776) para diseñar cebadores para
PCR para la amplificación por PCR.
Como molde para la clonación, se usó ADNc
producido por el hígado humano. Se realizó una primera síntesis de
la cadena de ADNc, usando el sistema de elección
SUPER-SCRIPT (Life Technologies; número de catálogo
18090-019), usando 1 \mug de ARNm de hígado
humano (Clontech; número de catálogo 6510-1) con
hexámeros aleatorios según las instrucciones del fabricante.
Se realizó la PCR de 100 \mul usando el kit de
la ADN polimerasa de Pfu nativa (Stratagene; número de catálogo
600135) y 5 \mul de cada uno de los cebadores específicos para el
gen LAKQ166 (SEQ ID NO:5) y LAKQ168 (SEQ ID NO:6). Se usó el
ciclador térmico de ADN Perkin Elmer 480 con el programa: 1 ciclo de
94ºC, 2 min.; 60ºC, 1 min.; 74ºC, 2 min.; 25 ciclos de 94ºC, 1min.;
58ºC, 1 min.; 74ºC, 2 min.; y finalmente 72ºC, 7 min. seguido de
enfriamiento hasta 4ºC. Se realizaron cinco rondas adicionales de
amplificación tal como anteriormente, excepto que la temperatura de
apareamiento se disminuyó hasta 55ºC.
Se cargó una alícuota, 15 \mul, de PCR sobre
un gel de agarosa al 1% de baja temperatura de fusión NuSieve GTG
(FMC BioProducts; número de catálogo 50082) y se escindió el
fragmento de aproximadamente 670 pb del gel. Se clonaron 3 \mul
del fragmento aislado en 1 \mul de plásmido
pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA
(Invitrogen; número de catálogo K4500-01). Se
transformaron 3 \mul de la mezcla de ligación en células de E.
coli TOP 10 químicamente competentes One Shot (Invitrogen;
número de catálogo C4040-03).
Se obtuvieron ADN de plásmido a partir de tres
clones (3 ml de cultivo durante la noche), usando kit QIAprep Spin
Miniprep (QIAGEN; número de catálogo 27104) y se realizó la
secuenciación (número A0452) posterior tal como anteriormente. El
plásmido con la secuencia correcta confirmada se designó pMB
1500.
Se unieron las dos partes de Mnk2b, el extremo
3' de Incyte 1309709, y el extremo 5' de pMB 1500, mediante una
ligación de tres fragmentos en pCR2.1-TOPO,
produciendo pBV1556.
Se digirieron 2,4 \mug de pBM1500 con
EcoRI y SacI, y se digirieron 1,8 \mug del mismo
plásmido con EcoRI y BglII. Se cargaron la mitad de
las digestiones sobre un gel E al 1,2%, Invitrogen, y se cortó una
banda de aproximadamente 3800 pb (fragmento a) de la digestión con
EcoRI-SacI, y se cortó una banda de aproximadamente
680 pb (fragmento b) de la digestión con EcoRI-BglII.
Se digirieron 2,7 \mug del plásmido Incyte 1309709 con
SacI y BglII. Se cargó la mitad de la digestión sobre
un gel E y se cortó del gel una banda de aproximadamente 700 pb
(fragmento c). Se purificaron los fragmentos usando el kit de
extracción del gel (Qiagen; número de catálogo 28704) y la elución
posterior en 50 \mul de H_{2}O.
Se realizó la ligación usando la T4 ADN ligasa
Ready-To-Go (Amersham Pharmacia
Biotech; número de catálogo
27-0361-01). Se mezclaron 6 \mul
del fragmento A con 7 \mul de los fragmentos B y C,
respectivamente. Se transformó la mezcla de ligación en células
E. coli TOP 10 químicamente competentes One Shot, y se
obtuvo el ADN de plásmido tal como anteriormente. Las digestiones
control usando las enzimas de restricción para la clonación,
EcoRI, SacI y BglII verificaron el inserto.
Se produjo Mnk2b para la expresión de mamífero
usando la tecnología de clonación Gateway^{TM} de Life
Technologies. Se diseñaron cebadores compatibles con Gateway (SEQ
ID NOS:7 y 8) y se realizó la PCR usando pBV1556 como molde. Se
realizó la PCR en 50 \mul usando la Taq ADN polimerasa, Roche
(número de catálogo 1 435 094) y 1 \mul de cada uno de los
cebadores BEKA 248 y BEKA247. Se usó el sistema 2400 de
amplificación génica por PCR de Perkin Elmer con el siguiente
programa: 95ºC, 5 min.; (95ºC 30 s, 55ºC 30 s, 72ºC 2 min.) x 25; y
72ºC, 7 min.; seguido de enfriamiento hasta 4ºC. Se cargaron 10
\mul de la reacción sobre un gel E al 1,2%, y se cortó del gel un
fragmento de aproximadamente 1400 pb, y se purificó usando el kit de
extracción del gel QIAquick.
Se clonó el fragmento de PCR en pDONR201 (Life
Technologies; número de catálogo 11798-014), según
las instrucciones del fabricante. El clon de entrada resultante se
designó pBV27, y se confirmó el inserto mediante secuenciación. Se
construyó un clon de expresión de mamífero con fusión de
5'-GST, designado pBV44 (SEQ ID NO:9), (según las
instrucciones del fabricante) usando el vector de destino pDEST27
(Life Technologies; número de catálogo 11812-013).
En SEQID NO:9, los aminoácidos 1 a 226 representan el dominio GST,
mientras que los aminoácidos 237 a 649 representan Mnk2b
humana.
Ejemplo
3
Para determinar los niveles de expresión
relativos de MNK2b en diferentes tejidos, se usó una matriz de
expresión en múltiples tejidos (CLONTECH; número de catálogo 775)
en un experimento de hibridación con una sonda específica para gen
de 106 pb.
Se digirió el clon de ADNc de MNK2b, pBV27, con
las enzimas de restricción NcoI y PpuMI. Se separaron
los fragmentos en un gel de agarosa al 1,2% (Invitrogen; número de
catálogo G5018-01). Se escindió del gel el
fragmento de 106 pb y se purificó usando el kit de extracción del
gel QIAquick (QIAGEN; número de catálogo 28704).
Se usaron 25 ng del fragmento purificado en una
reacción de marcación con ^{32}P, realizada con reactivos tal
como se recomiendan en el manual de instrucciones para la síntesis
de sondas de ADN Strip-EZ (Ambion; número de
catálogo 1470). Se adquirió
[\alpha-^{32}P]dATP usado en la reacción
de Amersham Pharmacia Biotech (número de catálogo AA0004).
Se realizaron las condiciones de hibridación y
de lavado tal como se recomienda por el manual de CLONTECH
PT3307-1. Se expuso la matriz de MTE ("Multiple
Tissue Expression", expresión en múltiples tejidos) en una
pantalla de fósforo STORM860 durante 70 h. Se usó ImageQuant para
analizar la señal de hibridación.
Los resultados indicaron los niveles de
expresión más altos de MNK2b en el músculo esquelético. Esto fue
inesperado, ya que los resultados publicados sobre los tejidos de
ratón adulto mostraron expresión de ARNm de Mnk2 en todos los
tejidos estudiados, excepto del cerebro (Waskiewicz A.J. et
al. (1997) EMBO J. 16: 1909-1920).
Ejemplo
4
Se prepararon o se adquirieron vectores
indicadores inducibles que contienen el gen indicador de la
luciferasa de Photinus pyralis (luciérnaga), conducidos por
un elemento promotor básico (caja TATA), así como elementos
potenciadores en posición cis inducibles (repeticiones directas de
las regiones promotoras de diversos genes). Los vectores
indicadores se diseñan para las lecturas in vivo de las rutas
de transducción de señal, ya que los potenciadores son puntos
convergentes de muchas rutas de transducción de señales. Cuando un
plásmido que expresa el gen de interés se cotransfecta en células
de mamífero con un plásmido indicador en la posición cis, un
aumento de la expresión de la luciferasa indica la activación
transcripcional o bien directa o bien indirecta.
Se preparó un vector designado
pGluREx3-luciferasa
((gtgCACGTGtgaCAGCTGcaa)x3) usando el vector promotor pTAL
(Clontech; número de catálogo 6252). El vector pGluREx3 se diseña
para monitorizar los efectos sobre la respuesta frente a glucosa
(PortoisL., et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:
8181-8190).
Se preparó un vector designado
pSREBP-luciferasa (aTCACcCCAC) clonando dos
elementos de respuesta frente a proteínas de unión al elemento
regulador del esterol (SREBP, "sterol regulatory element binding
protein") en el vector del promotor pGLE2 (Promega; número de
catálogo E1631). El vector pSREBP se diseña para monitorizar los
efectos sobre el elemento de respuesta frente a esteroides (Yokyama,
C. et al. (1993) Cell 75: 187-197).
El vector pCRE-luciferasa,
diseñado para monitorizar la activación de las rutas de transducción
de señal mediadas por AMPc y la proteína (CREB) de unión a AMPc, se
adquirió de Stratagene (número de catálogo 219075).
Se preparó un vector designado
pIRE-luciferasa
((tagCAAAACAaactTATTTTGaaca)x3), usando el vector del
promotor pGL2 (Promega; número de catálogo E1631). Es vector pIRE
se diseña para monitorizar la señalización mediada por el receptor
de insulina a través de la proteína (IGFBP-1) de
unión al factor de crecimiento de tipo insulina.
Se transfectaron de manera transitoria los
adipocitos de ratón (células 3T3-L1 diferenciadas)
con el constructo de elemento de respuesta de interés, en
combinación con Mnk2b o un constructo de plásmido de estructura
principal (control), usando LipofectAmine^{TM}2000
(LifeTechnologies). Tras 48 h, se lisaron las células usando un
tampón de lisis (Tris-EDTA + 0,25% de
Triton-X100) durante 10 min. a temperatura ambiente,
y se midió la actividad de la luciferasa usando un ensayo de
actividad de la luciferasa (BioThema).
Los resultados (figura 1) indican que la
sobreexpresión de Mnk2b en los adipocitos de ratón dio como
resultado una disminución del 70% de la actividad del indicador de
la GLUx3-luciferasa, indicando una disminución de
la capacidad de respuesta frente a glucosa en las células. Según el
conocimiento de los inventores, no existen resultados dados a
conocer previamente que indiquen un enlace entre Mnk2b y la
captación de glucosa.
Los resultados mostrados en la figura 1 indican
además que la sobreexpresión de Mnk2b en los adipocitos de ratón
conduce a una disminución de la actividad del elemento de respuesta
frente a SREBP. La conclusión es que Mnk2b afecta al metabolismo de
lípidos, ya que el elemento de respuesta frente a SREBP ha mostrado
controlar la transcripción de por ejemplo el gen del receptor de
lipoproteínas de baja densidad (Yokoyama,C. et al. (1993)
Cell 75: 187-197) y regular el metabolismo del
colesterol (Brown, M.S. y Goldstein J.L. (1997) Cell 83:
331-340).
La sobreexpresión de Mnk2b en los adipocitos de
ratón también conduce a una disminución de la actividad de los
indicadores pCRE y pIRE. Estos resultados confirman los datos
publicados sobre Mnk2b como parte de la ruta de señalización de la
MAP-cinasa (Waskiewicz, A. et al. (1997) EMBO
J. 16: 1909-1920; Fukunaga, R. y Hunter, T. (1997)
EMBO J. 16: 1921-1933).
Ejemplo
5
Se determinó la captación de glucosa según el
método de Hundal et al. (1994) Biochem. J. 297:
289-295. En resumen, tras la incubación con
hormonas durante 45 minutos, si no se indica lo contrario, se
enjuagan las monocapas celulares con PBS libre de glucosa. Se
cuantificó la captación de glucosa incubando las células en
presencia de 1 \muCi/ml de
^{3}H-2-desoxi-glucosa
en PBS durante 8 min. Se determinó la captación no específica
cuantificando la radiactividad asociada a la célula en presencia de
citocalasina B 10 \muM. Se determinó la captación de
2-desoxi-glucosa aspirando
rápidamente el medio, seguido de tres lavados sucesivos de las
monocapas celulares con PBS helado. Se lisaron las células en NaOH
0,5 M, seguido de recuento de centelleo líquido. Las tasas de
transporte se normalizaron para el contenido en proteína de cada
célula.
Los resultados (figura 2) indican que la
sobreexpresión de Mnk2b en adipocitos (células
3T3-L1 diferenciadas) y una línea celular humana
(SHSY) disminuyó la tasa de la captación de glucosa de manera
dependiente de insulina. Los resultados confirman los resultados a
partir del ensayo de indicador (ejemplo 4) e indican además que un
efecto de la expresión de Mnk2b es la reducción de la captación de
glucosa.
Ejemplo
6
Se prepararon tres modelos estructurales
tridimensionales de Mnk1, Mnk2a y Mnk2b a partir de datos de
homología. Se usó como molde para los tres modelos la estructura de
la proteína cinasa dependiente de calmodulina (entrada del banco de
datos de proteínas ("Protein Data Bank") 1A06). (El banco de
datos de proteínas está disponible en http://www.rcsb.org/pdb;
véase también Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:
235-242). Se prepararon los modelos estructurales
usando el software ICM de MolSoft Inc. (http://www.molsoft.com).
Los modelos de Mnk1, Mnk2a y Mnk2b fueron
sumamente similares pero se identificaron algunas diferencias
estructurales, que pueden emplearse para conseguir la selectividad
de unión. Se identificaron un número de 87 residuos no idénticos
cuando se comparó Mnk2b con Mnk1. Muchos de éstos están situados
lejos del sitio activo, pero dos diferencias de interés entre Mnk1
y Mnk2b son Y\rightarrowH en el sitio activo (compárese la
posición 95 en SEQ ID NO:4) y T\rightarrowL en un bucle que puede
implicarse en el reconocimiento del sustrato (compárese la posición
248 en SEQ ID NO:4).
Una comparación entre Mnk2a y Mnk2b indicó que
el extremo C, que es la única parte diferente entre las dos
variantes de corte y empalme, pliega de nuevo el sitio activo en los
modelos. Esto indica la posibilidad de identificar agentes que
tienen especificad entre Mnk2a y Mnk2b.
Ejemplo
7
La iARN (interferencia por ARN) se refiere a la
introducción de ARN de doble cadena homólogo (ARNdc) para
seleccionar como diana específicamente un producto génico, dando
como resultado fenotipos nulos o hipomórficos. La técnica de iARN
se usó para estudiar los efectos sobre la respuesta frente a glucosa
en células cultivadas con interrupción de la expresión de proteína
Mnk2. se transfectaron de manera transitoria las células
(SH-SY5y) de neuroblastoma humano con un elemento
de respuesta frente a glucosa acoplado a un gen indicador de la
luciferasa (GluREx3-luciferasa), Mnk2b o plásmido
de estructura principal y [Mnk2 de iARN] usando LipofectAmine2000
(LifeTechnologies). Se mezclaron para cada pocillo en una placa de
96 pocillos 0,2 \mug de GluREx3-Luciferasa, 0,07
\mug de Mnk2b/estructura principal y 0,13 \mug [Mnk2 de iARN]
con 1,8 \mul de LA2000/\mug de ADN diluido en 50 \mul de
Opti-MEM (Gibco). Tras 48 h, se lisaron las células
usando 15 \mul/pocillo de tampón de lisis
(TRIS-EDTA con 0,25% de Triton x 100) y se midió la
actividad de la luciferasa (kit de ensayo de la actividad de la
luciferasa, BioThema).
Los resultados (figura 3) indican que la
interrupción de la expresión de la proteína Mnk2 en células
(SH-SY5y) de neuroblastoma humano mediante el uso
de iARN conduce a un aumento de la actividad del elemento de
respuesta frete a glucosa. La sobreexpresión de la proteína Mnk2b
en las mismas células, disminuye la actividad del elemento de
respuesta frente a glucosa. Esta disminución se neutraliza por la
interrupción de la proteína Mnk2b sobreexpresada que es la
transfección combinada del plásmido de expresión y la iARN en las
mismas células.
Ejemplo
8
Se usó una biblioteca de diversidad que
consistía en compuestos sumamente solubles en agua y relativamente
pequeños para seleccionar MNK-2B nativo para agentes
de unión mediante RMN (resonancia magnética nuclear). La técnica de
RMN usada para identificar agentes de unión fue la diferencia de
transferencia de saturación (STD "Saturation Transfer
Difference"): las resonancias de ^{1}H de proteínas se saturan
por medio de un campo débil de radiofrecuencia aplicado a una
región espectral estrecha. La saturación se transfiere por difusión
de spin al resto de la proteína y posteriormente además a los
compuestos que se unen a la proteína atenuando sus señales en el
espectro de RMN. Entonces, el espectro se sustrae de un espectro
obtenido en condiciones de no saturación para obtener un espectro
de STD que muestra sólo las señales de los compuestos que
interactúan con la proteína. En la práctica la secuencia de pulso
se escribe de tal manera que la sustracción se realiza
automáticamente en una de cada dos exploraciones, es decir, nunca se
observan los espectros individuales (Mayer & Meyer, Angew.
Chem. Int. Ed., 38, 1784-1788, 1999).
Los compuestos en la biblioteca se dividen en
mezclas que consisten en 4-8 compuestos cada una.
Cada muestra contenía MNK-2B nativo 1 \muM,
mezcla de compuestos 200 \muM, tampón fosfato de sodio 50 mM, DTT
1 mM, pH 7,5 en aproximadamente el 98% de D_{2}O/el 2% de
H_{2}O. Una muestra no contenía ninguno de los compuestos y actúo
como control negativo. El volumen era 600 \mul y se usaron tubos
de RMN convencionales. Se realizaron experimentos en un
espectrómetro de RMN Varian Unity de 600 MHz a 20ºC. Se registraron
en cada muestra un experimento de STD y un experimento de ^{1}H
^{1}D de referencia. Se volvieron a ejecutar los agentes de unión
identificados a partir de la selección como un compuesto único para
la confirmación. Para estos experimentos de seguimiento se usaron
muestras que contenían Mnk2B nativo 2 \muM y 250 \muM del
compuesto individual. Se identificaron como ligandos de Mnk2b
varios compuestos, por ejemplo éster metílico del ácido
4-hidroxibenzoico.
Un ensayo de la actividad cinasa según los
métodos habituales indicó que los compuestos identificados
inhibieron la actividad cinasa de Mnk2b en dependencia de la dosis.
Por consiguiente, se mostró que es posible identificar compuestos
pequeños, ligandos de Mnk2b.
<110> Biovitrum AB
\vskip0.400000\baselineskip
<120> métodos nuevos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 00572
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<160> 9
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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<211> 1444
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<212> ADN
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<213> humano
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<220>
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<221> CDS
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<222> (37)..(1434)
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<300>
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<308> GenBank/AF237775
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<309>
26-10-2000
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 465
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 2
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<211> 1564
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<212> ADN
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<213> humano
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<220>
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<221> CDS
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<222> (37)..(1281)
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<300>
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<308> GenBank/AF237776
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<309>
26-10-2000
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<400> 3
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<211> 414
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<212> PRT
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<213> humano
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<400> 4
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskipatggtgcaga agaaaccagc cgaacttc
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\hfill49
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<212> PRT
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (1)..(226)
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<220>
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<221> DOMINIO
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<222> (237)..(649)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (18)
1. Método para identificar un agente que modula
la capacidad de un polipéptido Mnk2 para modular la captación de
glucosa en una célula, comprendiendo el método:
- poner en contacto un polipéptido Mnk2 (cinasa 2 que interactúa con la MAP cinasa) con un agente candidato; y
- determinar el efecto del agente candidato sobre la capacidad del polipéptido Mnk2 para modular la captación de glucosa en una célula.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
el polipéptido Mnk2 es un polipéptido Mnk2 de mamífero.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es un polipéptido Mnk2 humano.
4. Método según la reivindicación 2, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es Mnk2a.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
el polipéptido Mnk2a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO:2.
6. Método según la reivindicación 2, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es Mnk2b.
7. Método según la reivindicación 6, en el que
el polipéptido Mnk2b comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO:4.
8. Método para identificar un agente que modula
la capacidad de un polipéptido Mnk2 para modular la actividad de un
elemento de respuesta frente a glucosa en una célula, comprendiendo
el método:
- poner en contacto un polipéptido Mnk2 con un agente candidato; y
- determinar el efecto del agente candidato sobre la capacidad del polipéptido Mnk2 para modular la actividad de un elemento de respuesta frente a glucosa en una célula.
9. Método según la reivindicación 8, en el que
el polipéptido Mnk2 es un polipéptido Mnk2 de mamífero.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es un polipéptido Mnk2 humano.
11. Método según la reivindicación 9, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es Mnk2a.
12. Método según la reivindicación 11, en el que
el polipéptido Mnk2a comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO:2.
13. Método según la reivindicación 9, en el que
el polipéptido Mnk2 de mamífero es Mnk2b.
14. Método según la reivindicación 13, en el que
el polipéptido Mnk2b comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO:4.
15. Método para identificar un modulador de la
captación de glucosa, comprendiendo el método:
- proporcionar una célula que expresa un polipéptido Mnk2 recombinante;
- exponer la célula a un agente candidato; y
- medir la captación de glucosa en la célula en presencia del agente candidato, en el que la captación alterada de glucosa en la célula en presencia del agente candidato comparada con la ausencia del agente candidato indica que el agente candidato es un modulador de la captación de glucosa.
16. Método in vitro para modular la
captación de glucosa en una célula, comprendiendo el método poner en
contacto una célula con una cantidad de un compuesto eficaz para
modular la expresión o actividad de un polipéptido Mnk2 y modular
así la captación de glucosa en la célula.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
el compuesto disminuye la expresión o actividad del polipéptido
Mnk2 y aumenta así la captación de glucosa en la célula.
18. Método según la reivindicación 17, en el que
el compuesto disminuye la actividad cinasa del polipéptido
Mnk2.
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