ES2284967T3

ES2284967T3 - Analisis y deteccion de multiples secuencias diana usando sondas circulares.

Info

Publication number: ES2284967T3
Application number: ES02795451T
Authority: ES
Inventors: Michael Josephus Theresia Van Eijk; Rene Cornelis Josephus Hogers
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2001-12-14
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2022-12-16
Also published as: EP1453978B9; JP2005512549A; WO2003052142A3; WO2003052141A2; WO2003052141A9; EP1453978A2; WO2003052140A2; AU2002360223B2; US20060121458A1; WO2003052141A3; EP1453978B1; US7498131B2; AU2002360222A1; WO2003052140A3; DE60219199D1; CA2470356A1; DE60219199T2; AU2002359090A1; AU2002360223A1; EP1319718A1

Abstract

1. Un método para determinar la presencia o ausencia de una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de: (a) proporcionar a una muestra de ácido nucleico al menos una sonda circularizable para cada secuencia diana a detectar en la muestra, por lo que la sonda tiene una primera sección específica de diana en su extremo 5¿ que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana y una segunda sección específica de diana en su extremo 3¿ que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana, por lo que la primera y segunda partes de las secuencias diana están localizadas adyacentes entre sí, y por lo que la sonda comprende adicionalmente una sección de marca que es esencialmente no complementaria a la secuencia diana, por lo que la sección de marca puede comprender una secuencia de relleno y por lo que la sección de marca comprende al menos una secuencia de unión a cebador; (b) permitir que la primera y segunda secciones específicasde diana de la sonda circular hibriden con la primera y segunda partes de las secuencias diana por lo que la primera y segunda secciones específicas de diana de la sonda hibridan adyacentes en la secuencia diana; (c) proporcionar un medio para el ligamiento de la primera y segunda secciones específicas de diana hibridadas de forma adyacente a la secuencia diana y permitir que en la primera y segunda secciones específicas de diana conecten, para producir una sonda circular ligada, correspondiente a una secuencia diana en la muestra; (d) proporcionar al menos un primer cebador que es complementario a la secuencia de unión a cebador, y una enzima polimerasa; (e) amplificar la mezcla resultante para producir una muestra amplificada que comprende amplicones que son representaciones lineales de las sondas circulares ligadas; (f) determinar la presencia o ausencia de una secuencia diana en una muestra detectando la presencia o ausencia del amplicón correspondiente; en el que al menos una sonda circularizable contiene una sección de bloqueo que comprende un grupo de bloqueo que está localizado adyacente al extremo 3¿ del sitio de unión al cebador, de modo que la sección de bloqueo detiene la elongación o amplificación del cebador hibridado con la sonda circularizada, generando de este modo una representación lineal de la sonda circular y de modo que el grupo de bloqueo se excluya de la elongación o amplificación del cebador.

Description

Análisis y detección de múltiples secuencias diana usando sondas circulares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la biotecnología. En particular, la presente invención proporciona un método para la separación y detección de alto rendimiento de secuencias nucleotídicas, y el uso del método en la discriminación e identificación de secuencias diana tales como polimorfismos de un único nucleótido. La invención proporciona adicionalmente sondas que son capaces de hibridar con la secuencia diana de interés, cebadores para la amplificación de sondas ligadas, el uso de estas sondas y cebadores en la identificación y/o detección de secuencias nucleotídicas que están relacionadas con una amplia diversidad de rasgos genéticos y genes y kits de cebadores y/o sondas adecuados para su uso en el método de acuerdo con la invención.

Antecedentes de la invención

Existe un interés rápidamente creciente en la detección de secuencias de ácido nucleico específicas. Este interés no ha surgido solamente del borrador de la secuencia nucleotídica descrita recientemente del genoma humano y la presencia en el mismo, así como en los genomas de muchos otros organismos, de una cantidad abundante de polimorfismos de un único nucleótido (SNP), sino también de tecnologías marcadoras tales como AFLP. El reconocimiento de que la presencia de sustituciones de un único nucleótido (y otros tipos de polimorfismos genéticos, tales como inserciones/deleciones pequeñas; indels) en genes proporciona una amplia diversidad de información también se atribuye a este interés aumentado. Ahora se ha reconocido en líneas generales que estas sustituciones de un único nucleótido son una de las causas principales de una cantidad significativa de enfermedades monogenéticas y multigenéticas hereditarias, por ejemplo en seres humanos, o están implicados de otro modo en el desarrollo de fenotipos complejos tales como rasgos de producción en plantas y especies de ganado. Por tanto, las sustituciones de un único nucleótido están en muchos casos también relacionadas con o al menos son indicativas de rasgos importantes en seres humanos, plantas y especies animales.

El análisis de estas sustituciones de un único nucleótido e indels producirá una gran cantidad de información valiosa, que tendrá implicaciones extensas en la medicina y la agricultura en los términos más amplios posibles. Por ejemplo se preve en líneas generales que estos desarrollos producirán una medicación específica de paciente. Para analizar estos polimorfismos genéticos, existe una necesidad creciente de métodos adecuados, fiables y rápidos que posibiliten el manejo de grandes cantidades de muestras y grandes cantidades (predominantemente) SNP de un modo de alto rendimiento, sin comprometer significativamente la calidad de los datos obtenidos.

Aunque existe actualmente una amplia diversidad de plataformas de detección de alto rendimiento para SNP (tales como fluorómetros, microseries de ADN, espectrómetros de masa e instrumentos de electroforesis capilar), la principal limitación para conseguir una detección rentable de alto rendimiento es que actualmente se carece de una técnica de amplificación múltiple, robusta y eficaz para una selección no aleatoria de SNP para utilizar estas plataformas de forma eficaz, que provoca un uso subóptimo de estas potente plataformas de detección y/o elevados costes por dato puntual. "Rendimiento" como se usa en este documento, define un parámetro relativo que indica la cantidad de muestras y secuencias diana que pueden analizarse por unidad de tiempo.

Específicamente, usando técnicas de amplificación comunes tales como la técnica de PCR, es posible amplificar una cantidad limitada de secuencias diana combinando los pares de cebadores correspondientes en una reacción de amplificación única pero la cantidad de secuencias de diana que puede amplificarse simultáneamente es pequeña y puede requerirse una optimización extensiva para conseguir las eficacias de amplificación similares de las secuencias diana individuales. Una de las soluciones a la amplificación múltiple es el uso de un par de cebadores único para la amplificación de todas las secuencias diana, que requiere que todas las dianas deban contener los sitios de unión a cebador correspondientes. Este principio se incorpora en la técnica de AFLP (documento EP-A 0 534 858). Usando AFLP, los sitios de unión a cebador producen una digestión del ácido nucleico diana (es decir, ADN genómico total o ADNc) con una o más enzimas de restricción, seguido por ligamiento con adaptador. El AFLP se dirige esencialmente a una selección aleatoria de secuencias contenidas en el ácido nucleico diana. Se ha demostrado que, usando AFLP, puede amplificarse una cantidad prácticamente ilimitada de secuencias diana en una reacción única, dependiendo de la cantidad de secuencias diana que contienen la región o regiones de unión a cebador que son perfectamente complementarias a los cebadores de amplificación. Explotando el uso de pares de cebadores únicos para la amplificación en combinación con un método no aleatorio para la selección de dianas SNP y el uso eficaz de una plataforma de detección de alto rendimiento puede aumentarse, por lo tanto, sustancialmente la eficacia del genotipado de SNP, sin embargo, dicha tecnología no se ha proporcionado en la técnica.

Uno de los métodos principales usados para el análisis de los ácidos nucleicos de una secuencia conocida se basa en la hibridación de dos sondas con una secuencia diana y, cuando las sondas están hibridadas de forma adyacente con la secuencia diana, el ligamiento de las sondas. El principio OLA (Ensayo de Ligamiento de Oligonucleótido) se ha descrito, entre otros, en el documento US 4.988.617 (Landegren et al.) y en el documento WO01/06012. Esta publicación describe un método para determinar la secuencia de ácido nucleico en una región de una secuencia de ácido nucleico conocida que tiene una posible mutación conocida. Para detectar la mutación, se seleccionan oligonucleótidos para que hibriden con segmentos inmediatamente adyacentes de la secuencia a determinar. Una de las sondas oligonucleotídicas seleccionadas tiene una región final en la que uno de los nucleótidos de la región terminal es complementaria al nucleótido normal o mutado en la posición correspondiente en la secuencia de ácido nucleico conocida. Se proporciona una ligasa que conecta covalentemente la dos sondas cuando están apareadas correctamente y están localizadas inmediatamente adyacentes entre sí. La presencia o ausencia de las sondas unidas es un inicio de la presencia de la secuencia y/o mutación conocida.

Abbot et al., en el documento WO 96/15271 desarrollaron un método para un procedimiento de amplificación y ligamiento múltiple que comprende la hibridación y ligamiento de sondas adyacentes. Estas sondas están provistas de un segmento de longitud adicional, cuya secuencia, de acuerdo con Abbot et al., no es importante. La introducción deliberada de diferencias de longitud pretende facilitar la discriminación en base a la longitud del fragmento en técnicas basadas en gel.

El documento WO 97/45559 (Barany et al.) describe un método para la detección de diferencias de secuencias de ácido nucleico usando combinaciones de reacciones de detección de ligasa (LDR) y reacciones en cadena de la polimerasa (PCR). Se describen métodos que comprenden hibridar conjuntos de sondas específicas de alelo con una secuencia diana y el ligamiento posterior con una ligasa termoestable, opcionalmente seguido por la retirada de los cebadores no ligados con una exonucleasa. La amplificación de los productos ligados con cebadores marcados con fluorescencia produce un producto amplificado marcado con fluorescencia. La detección de los productos se basa en la separación por tamaño o movilidad electroforética o en una serie dirigible.

La detección de las sondas amplificadas se realiza en una serie dirigible universal que contiene oligonucleótidos de captura. Estos oligonucleótidos de captura contienen una región es capaz de hibridar con una región predeterminada en la sonda amplificada, una llamada "región zip" o "zip code". Cada sonda amplificada contiene un "zip code" diferente y cada "zip code" hibridará con su oligonucleótido de captura correspondiente en la serie. La detección del marcador en combinación con la posición en la serie proporciona información sobre la presencia de la secuencia diana en la muestra. Este método permite la detección de varias secuencias de ácido nucleico en una muestra. Sin embargo, el diseño, validación y uso rutinario de las series para la detección de sondas amplificadas implica muchas etapas (ligamiento, amplificación, opcionalmente purificación del material amplificado, producción de la serie, hibridación, lavado, exploración y cuantificación de datos), de las que algunos (particularmente la hibridación y el lavado) son difíciles de automatizar. La detección basada en serie, por lo tanto, es laboriosa y costosa para analizar una gran cantidad de muestras para una gran cantidad de SNP.

Las sondas oligonucleotídicas LDR en una condiciones dadas pueden generar un producto de una longitud única y por tanto puede distinguirse entre otros productos en base al tamaño. Para la amplificación se proporciona un conjunto de cebadores en el que uno de los cebadores contiene un marcador. Diferentes cebadores pueden estar provistos de diferentes marcadores para permitir la distinción de los productos.

Se ha descubierto que el método y las diversas realizaciones descritas por Barany et al., tienen ciertas desventajas. Una de las mayores desventajas es que el método en principio no proporciona un proceso de alto rendimiento verdadero para la determinación de grandes cantidades de secuencias diana en cortos periodos de tiempo usando métodos fiables y robustos sin comprometer la calidad de los datos producidos y la eficacia del proceso.

Más en particular, una de las desventajas del medio y los métodos descritos por Barany et al. reside en la capacidad múltiple limitada cuando la discriminación se basa, entre otros, en la longitud de los conjuntos de sondas específicas de alelo. La discriminación entre las secuencias que se pueden distinguir solamente por una diferencia de longitud relativamente pequeña, en general, no es sencilla y pueden requerirse condiciones optimizadas cuidadosamente para alcanzar la potencia de resolución deseada. La discriminación entre secuencias que tienen una diferenciación de longitud mayor es en general más fácil de conseguir. Estos puede proporcionar un aumento en la cantidad de secuencias que pueden analizarse en la misma muestra. Sin embargo, proporcionar sondas nucleotídicas necesarias más largas es un obstáculo adicional a soportar. En la técnica, se producen secuencias nucleotídicas sintéticas por síntesis química de oligonucleótidos etapa por etapa convencional con un rendimiento de aproximadamente el 98,5% por nucleótido añadido. Cuando se sintetizan sondas más largas (más largas de aproximadamente 60 nucleótidos) el rendimiento generalmente disminuye y la fiabilidad y pureza de la secuencia producida sintéticamente puede llegar a ser un problema.

Estas y otras desventajas de los métodos descritos en el documento WO 97/45559 y otras publicaciones basadas en los ensayos de ligamiento de oligonucleótidos de este documento conducen a la conclusión de que los métodos descritos en los mismos son menos preferibles para la adaptación en un protocolo de alto rendimiento que sea capaz de manejar una gran cantidad de muestras comprendiendo cada una grandes cantidades de secuencias.

El problema específico de proporcionar sondas más largas se ha resuelto por Schouten et al. (documento WO 01/61033). El documento WO 01/61033 describe la preparación de sondas más largas para su uso en ensayos de ligamiento-amplificación. Proporcionaron sondas que eran considerablemente más largas que las pueden obtenerse por métodos de síntesis química convencional para evitar el problema asociado con la discriminación basada en la longitud de productos amplificados usando geles de bloque o electroforesis capilar, concretamente que solamente se usa una pequeña parte de la ventana de detección/capacidad de resolución de longitud de hasta 1 kilobase cuando se sintetizan sondas OLA por medios químicos. Con un límite superior en la práctica de aproximadamente 100-150 bases para oligonucleótidos sintetizados químicamente de acuerdo con el estado actual de la tecnología, esto produce productos de amplificación que son menores a 300 pares de bases de longitud como mucho, pero a menudo mucho menos (véase Barany et al.). La dificultad de generar dichas sondas largas (más de aproximadamente 150 nucleótidos) con suficiente pureza y rendimiento por medios químicos se ha contrarrestado por Schouten et al., usando un método en el que las sondas se han obtenido por una polimerización dirigida por un molde enzimático in vivo, por ejemplo por la acción de un ADN polimerasa en una célula adecuada, tal como un fago M 13.

Sin embargo, la producción y purificación de dichas sondas biológicas requiere un conjunto de cepas hospedadoras adecuadas que contienen el fago M 13 que confiere las variaciones de longitud deseadas y el uso de múltiples oligonucleótidos cortos sintetizados químicamente en el proceso, por tanto su uso es muy laborioso y consume mucho tiempo, por tanto es costoso y no es adecuado para el desarrollo de ensayos de alto rendimiento. Además, el uso de sondas relativamente largas y diferencias de longitud relativamente grandes entre las secuencias diana amplificables puede producir eficacias de amplificación diferentes a favor de las secuencias diana más cortas. Esto afecta de forma adversa a la calidad global de los datos, dificultando el desarrollo de un método de alto rendimiento verdadero. Por tanto, permanece la necesidad de una solución fiable y rentable a la amplificación múltiple y posterior detección basada en la longitud para una aplicación de alto rendimiento.

Otras soluciones que se han sugerido en la técnicas tales como el uso de sondas circulares (cerradas) (documento WO 95/22623) en combinación con amplificación isotérmica tal como amplificación por círculo rodante (RCA) se consideran rentables a causa de las características de hibridación mejoradas de las sondas circulares y el carácter isotérmico de RCA.

La amplificación por círculo rodante es un método de amplificación en el que se hibrida un primer cebador con una sonda circular ligada o conectada. La elongación posterior del cebador, usando una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena provoca la formación de una cadena polinucleotídica larga que contiene múltiples representaciones de la sonda circular conectada. Dicha cadena larga de concatémeros de la sonda conectada se detecta posteriormente por el uso de sondas de hibridación. Estas sondas pueden estar marcadas. La amplificación exponencial de la sonda ligada puede conseguirse por la hibridación de un segundo cebador que hibrida con la cadena concatemérica y se elonga posteriormente. La Amplificación por Círculo Rodante (Exponencial) ((E)RCA) se describe entre otros en el documento US5854033, US6143495, WO97/19193, Lizardi, et al. Nature genetics 19(3): 225-232 (1998).

Los documentos US 5.876.924, WO98/04745 y WO98/04746 de Zhang et al., describen una reacción de ligamiento usando dos sondas adyacentes en las que una de las sondas es una sonda de captura con un elemento de unión tal como biotina. Después del ligamiento, las sondas no ligadas se retiran y la sonda de captura ligada se detecta usando perlas paramagnéticas con un resto de unión (biotina) al ligando. Zhang también describe la amplificación de sondas circulares usando cebadores de PCR en una amplificación por círculo rodante, usando un ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena, generando de este modo un largo concatémero de la sonda circular, comenzando desde la extensión del primer cebador. Posteriormente un segundo cebador de PCR hibrida con el concatémero largo y la elongación del mismo proporciona una segunda generación de concatémeros y facilita la amplificación exponencial. La detección generalmente se basa en la hibridación de sondas marcadas.

Sin embargo, estos métodos han demostrado ser menos deseables de un modo de alto rendimiento. Una de las razones es que, para un método de alto rendimiento basado en la discriminación de longitud, el uso de (E)RCA provoca la formación de concatémeros largos. Estos concatémeros son problemáticos, ya que no son adecuados para la detección de alto rendimiento.

El documento US 6.221.603 describe una sonda circular que contiene un sitio de restricción. La sonda se amplifica usando (E)RCA y los concatémeros resultantes se restringen en el sitio de restricción. Los fragmentos de restricción después se separan por longitud y se detectan. La separación y detección se realiza en una plataforma electroforética capilar, tal como el equipo MegaBACE disponible en Molecular Dynamics Amersham-Pharmacia. Para la detección pueden incorporarse dNTP marcados en los fragmentos durante la amplificación, o los fragmentos pueden detectarse por tinción o por sondas de detección marcadas. La digestión parcial por la enzima de restricción, sin embargo, puede afectar a la fiabilidad del método. Además, los métodos para marcar los fragmentos que se describen en el documento US 6.221.603, no permiten utilizar completamente la capacidad de MegaBACE de detección simultánea de múltiples colores.

En la presente invención se ha propuesto eliminar o al menos disminuir los problemas existentes en la técnica intentando al mismo tiempo mantener los aspectos ventajosos de la misma, y mejorar adicionalmente la tecnología. Otros problemas en la técnica y las soluciones proporcionadas a los mismos por la presente invención quedarán claros durante toda la descripción, las figuras y las diversas realizaciones y ejemplos.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la separación y detección de alto rendimiento de múltiples secuencias. El presente método resuelve muchos de los problemas previamente encontrados en la técnica. Más en particular, la presente invención proporciona un ensayo múltiple de ligamiento y amplificación que permite un análisis rápido y de alto rendimiento de una multiplicidad de muestras, que contienen preferiblemente una multiplicidad de secuencias. La presente invención también proporciona un método para la discriminación y detección de alto rendimiento de una multitud de secuencias nucleotídicas en base a la combinación de diferencias de longitud y marcadores. La presente invención combina las ventajas de ciertos métodos evitando al mismo tiempo las desventajas asociadas con las diversas técnicas, proporcionando de este modo un método mejorado para la detección de secuencias diana de un modo fiable y reproducible y adecuado para un método de detección de alto rendimiento.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método para la separación y detección de alto rendimiento de una multiplicidad de secuencias diana, opcionalmente en una multiplicidad de muestras que comprende someter cada muestra a un ensayo de amplificación dependiente de ligamiento.

El método es preferiblemente un método para determinar la presencia o ausencia de al menos una secuencia diana (2) en una muestra, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar a una muestra de ácido nucleico al menos una sonda circular (26) para cada secuencia diana a detectar en la muestra, por lo que la sonda tiene una primera sección específica de diana en su extremo 5' (4) que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana (5) y una segunda sección específica de diana en su extremo 3' (6) que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana (7), por lo que la primera y segunda partes de la secuencia diana se localizan adyacentes entre sí, y por lo que la sonda comprende adicionalmente una secuencia de marca (8, 9) que es esencialmente no complementaria a la secuencia diana, por lo que la secuencia de marca puede comprender una secuencia de relleno (10, 11) y por lo que la sección de marca comprende al menos una secuencia de unión a cebador (12, 13);

(b) permitir que la primera y segunda secciones específicas de diana de la sonda circular hibriden con la primera y segunda parte de las secuencias diana por lo que la primera y segunda secciones específicas de diana de la sonda hibridan adyacentes en la secuencia diana;

(c) proporcionar un medio para ligar la primera y segunda secciones específicas de diana hibridadas adyacentes con la secuencia diana y permitir que la primera y segunda secciones específicas de diana se conecten, para producir una sonda circular ligada (28), correspondiente a la secuencia diana en la muestra;

(d) proporcionar al menos un primer cebador que es complementario a la secuencia de unión a cebador (12), y una enzima polimerasa;

(e) amplificar la mezcla resultante para producir una muestra amplificada (19) que comprende amplicones (20) que son representaciones lineales de las sondas circulares ligadas;

(f) determinar la presencia o ausencia de una secuencia diana en una muestra detectando la presencia o ausencia del amplicón correspondiente;

en el que la al menos una sonda circularizable contiene una sección de bloqueo que comprende un grupo de bloqueo que está localizado adyacente al extremo 3' del sitio de unión a cebador, de modo que la sección de bloqueo detiene la elongación o amplificación del cebador hibridado con la sonda circularizada, generando de este modo una representación lineal de la sonda circular y de modo que el grupo de bloqueo se excluya de la elongación o amplificación del cebador.

Sonda

La sonda oligonucleotídica circular usada en la presente invención es una sonda oligonucleotídica lineal única que se proporciona en la etapa (a) para cada secuencia diana en una muestra. Esta sonda oligonucleotídica lineal única combina las dos secciones específicas de diana en una molécula única que se circulariza en la etapa (c) cuando se conectan las secciones complementarias hibridadas. Por tanto, en la sonda lineal única las secciones de complementariedad con la diana están cada una presentes en los extremos terminales de la sonda lineal única. Las secciones complementarias en los extremos terminales están intercaladas por las secuencias que pueden servir como secuencias de unión a cebador y pueden estar intercaladas adicionalmente por secuencias de relleno de longitud variable. Un ejemplo de dicha disposición de grupos funcionales en la sonda circular es: (sección de complementariedad con la diana 1 - secuencia de relleno 1, secuencia de unión a cebador 1 - secuencia de unión a cebador 2 - secuencia de relleno 2 - sección de complementariedad con la diana 2). Un especialista en la técnica apreciará que las sondas circulares se sintetizan y aplican en una forma lineal y que solamente serán circulares cuando las dos secciones complementarias en los extremos terminales de la sonda estén conectados (ligados) hibridando con la secuencia diana apropiada. Por tanto, las expresión "sonda circular" como se usa en este documento realmente se refiere a un molécula lineal que se circulariza por la conexión dependiente de la secuencia diana (ligamiento). Solamente la expresión "sonda circular conectada" como se usa en este documento se refiere a una molécula en forma verdaderamente circular.

Las secciones complementarias de las sondas oligonucleotídicas se diseñan de modo que para cada secuencia diana en una muestra se proporcione una sonda, preferiblemente una sonda específica, por lo que las sondas contienen cada una sección en ambos extremos terminales que es complementaria una parte de la secuencia diana y las partes complementarias correspondientes de la secuencia diana están localizadas esencialmente adyacentes entre sí. En una sonda oligonucleotídica circular, la sonda oligonucleotídica tiene una sección en su extremo 5' que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana y una sección en su extremo 3' que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana. Por tanto, cuando la sonda circular está hibridada con partes complementarias de una secuencia diana el extremo 5' de la sonda oligonucleotídica está esencialmente adyacente al extremo 3' de la sonda oligonucleotídica de modo que los extremos respectivos de la sonda puedan ligarse para formar un enlace fosfodiéster y por tanto llegar a ser una sonda circular.

Las sondas circulares son ventajosas en la etapa de ligamiento (c) porque ambas secciones de complementariedad de diana están contenidas en la misma molécula. En comparación con sondas lineales convencionales tales como las descritas entre otros por el documento WO97/45559, esto significa que hay cantidades equimolares de las dos secciones específicas de diana presentes y en las cercanías entre sí. Dichas sondas muy probablemente hibridan con sus secuencias diana respectivas porque la hibridación de la primera sección de complementariedad de diana con la diana facilita la hibridación de la segunda y viceversa. Además, el uso de sondas circulares reduce las posibilidades de formación de productos de ligamiento incorrecto que se producen por el ligamiento entre sondas de diferentes secuencias diana, debido a la cantidad inferior de posibles combinaciones de productos de ligamiento que pueden formarse cuando la primera y segunda sondas son parte de la misma molécula circular.

Para más detalles con respecto a las características, diseño y construcción, uso y ventajas de sondas cerradas se hace referencia, entre otros, a los siguientes documentos: M. Nilsson et al., "Padlock Probes: Circularizing Oligonucleotides for Localized DNA Detection, "Science 265: 2085-88 (1994); Pickering et al., en Nucleic Acids Research, 2002, vol. 30, e60-US5854033; US5912124; WO 02/068683, WO 01/06012, WO 0077260, WO 01/57256 cuyos contenidos se incorporan por la presente como referencia.

Para cada secuencia diana para la que se tiene que determinar la presencia o ausencia en una muestra, se diseña una sonda oligonucleotídica específica con secciones complementarias a las partes complementarias adyacentes de cada secuencia diana. Por tanto, en el método de la invención, para cada secuencia diana que está presente en una muestra, puede obtenerse un amplicón correspondiente (específico) en la muestra amplificada. Preferiblemente, se proporciona una multiplicidad de sondas oligonucleotídicas complementarias a una multiplicidad de secuencias diana en una muestra. Una sonda oligonucleotídica para una secuencia diana dada en una muestra al menos diferirá en la secuencia de nucleótidos de las sondas de otras secuencias diana, y preferiblemente también diferirá en la longitud de las sondas para otras dianas, más preferiblemente una sonda para una diana dada producirá una sonda conectada y/o amplicón que difiere en la longitud de las sondas conectadas correspondientes a otras dianas en la muestra como se describe a continuación. Como alternativa, los amplicones correspondientes a diferentes dianas pueden tener una longitud idéntica si pueden distinguirse de otro modo,

\hbox{por ejemplo, por  marcadores diferentes como se describe
a continuación.}

Marcas y sitios de unión a cebador

La sonda oligonucleotídica contiene adicionalmente una marca que es esencialmente no complementaria a la secuencia diana. La marca no hibrida o no hibrida de forma significativa, preferiblemente al menos en las condiciones de hibridación anteriores, con ninguna de las secuencias diana en una muestra, preferiblemente no hibrida con ninguna de las secuencias en una muestra. La marca comprende preferiblemente al menos uno, preferiblemente dos sitios de unión a cebador y puede comprender opcionalmente una o más secuencias de relleno de longitud variable y/o una sección de bloqueo (véase a continuación).

Relleno

La marca de la sondas oligonucleotídicas puede comprender una o más secuencias de relleno de una longitud variable. La longitud del relleno varía de 0 a 500, preferiblemente de 0 a 100, más preferiblemente de 1 a 50. La longitud de la marca varía de 15 a 540, preferiblemente de 18 a 140, más preferiblemente de 20 a 75. El relleno puede ser una única secuencia que se conoce como secuencia Zip-code como se describe por Iannone et al., (2000), Cytometry 39: pág. 131-140.

Sección de bloqueo

En una realización alternativa, la sonda circular puede contener una sección de bloqueo (27). La sección de bloqueo bloquea la elongación del cebador. La sección de bloqueo está preferiblemente localizada entre los dos sitios de unión a cebador. Preferiblemente, la sección de bloqueo está localizada esencialmente adyacente al extremo 3' del cebador directo y esencialmente adyacente al extremo 5' del sitio de unión al cebador inverso, véase también la Figura 14. Un ejemplo de dicha disposición de grupos funcionales en la sonda circular es: (sección de complementariedad con la diana 1 - secuencia de relleno 1, secuencia de unión a cebador 1 - secuencia de bloqueo - secuencia de unión a cebador 2 - secuencia de relleno 2 - sección de complementariedad con la diana 2). Esta sección de bloqueo limitará de forma eficaz la elongación del cebador durante la amplificación, proporcionando de este modo representaciones lineales de las sondas circulares conectadas. Preferiblemente, la propia sección de bloqueo está localizada entre los dos sitios de unión a cebador de modo que la sección se excluya de la amplificación. La sección de bloqueo puede comprender polímeros no nucleotídicos tales como HEG (hexaetilenglicol). Si está presente una sección de bloqueo, tal como un grupo HEG, la ADN polimerasa usada puede tener una actividad desplazamiento de cadena ya que la sección de bloqueo evitará la formación de concatémeros largos.

En una realización alternativa, la sonda circular ligada o conectada que comprende una sección de bloqueo también puede amplificarse usando solamente un cebador, preferiblemente el cebador directo. Esta amplificación provocará la acumulación lineal de amplicones con cada amplificación alrededor. La sonda circular en este caso puede contener uno o más sitios de unión a cebador siempre que se proporcione solamente un cebador.

Generando representaciones lineales de las sondas circulares conectadas, los amplicones, puede superarse el problema de los concatémeros largos, haciendo que el método sea adecuado para tecnologías electroforéticas de alto rendimiento verdadero. Por la amplificación solamente de cadenas cortas de oligonucleótidos, usando la sección de bloqueo descrita anteriormente en este documento o usando al menos un cebador en combinación con una polimerasa que carece de la actividad de desplazamiento de cadena, puede obtenerse un conjunto de amplicones que representan una muestra en el que los amplicones son de una longitud discreta en un intervalo predeterminado, en base al diseño de la sondas. Posteriormente a la carga en un dispositivo electroforético se producirá la separación rápida de los amplicones.

Hibridación

En la etapa (a) se pone en contacto una multiplicidad de diferentes secuencias diana, es decir, al menos dos secuencias diana diferentes, con una multiplicidad de sondas oligonucleotídicas específicas en condiciones de hibridación. Posteriormente se deja que las sondas oligonucleotídicas hibriden con las partes complementarias adyacentes de las múltiples secuencias diana en la muestra. Los métodos y condiciones para la hibridación específica de las sondas oligonucleotídicas con secuencias diana de complementariedad son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, en Sambrook y Russel (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3ª edición), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Habitualmente, después de mezclas las sondas oligonucleotídicas y las secuencias diana se desnaturalizan los ácidos nucleicos por incubación (generalmente entre 94ºC y 96ºC) durante un corto periodo de tiempo (por ejemplo, 30 segundos a 5 minutos) en un tampón de bajo contenido salino (por ejemplo, un tampón que no contiene sales o contiene menos sales que la fuerza iónica equivalente de NaCl 10 mM). La muestra que contiene las sondas desnaturalizadas y las secuencias diana después se dejan enfriar a una temperatura de hibridación óptima para una hibridación específica de las sondas y las secuencias diana, que habitualmente es aproximadamente 5ºC inferior a la temperatura de fusión del híbrido entre la sección complementaria de la sonda y su secuencia complementaria (en la secuencia diana). Para evitar la hibridación no específica o ineficaz de una de las dos secciones de la sonda, o en una muestra con múltiples secuencias diana, se prefiere que, en una muestra, las secciones de las sondas que son complementarias a las secuencias diana sean de temperaturas de fusión similares, preferiblemente idénticas entre las diferentes secuencias diana presentes en la muestra. Por tanto, las secciones de complementariedad de las sondas preferiblemente difieren en menos de 20, 15, 10, 5 ó 2ºC en la temperatura de fusión. Esto se facilita usando secciones de complementariedad de las sondas con una longitud similar y contenido en G/C similar. Por tanto, las secciones de complementariedad difieren preferiblemente en menos de 20, 15, 10, 5 ó 2 nucleótidos de longitud y sus contenidos en G/C difieren en menos del 30, 20, 15, 10, ó 5%. Complementariedad como se usa en este documento significa que una primera secuencia de nucleótidos es capaz de hibridar específicamente con una segunda secuencia de nucleótidos en condiciones de rigurosidad normal. Una secuencia de nucleótidos que se considera complementaria a otra secuencia de nucleótidos puede contener una cantidad minoritaria, es decir, preferiblemente menos del 20, 15, 10, 5 o 2% de falta de coincidencia. Como alternativa, puede ser necesario compensar las faltas de coincidencia por ejemplo por incorporación de los llamados nucleótidos universales, tales como por ejemplo los descritos en el documento EP-A 974 672, incorporado en este documento como referencia o por el uso de ácidos nucleicos bloqueados adecuados (LNA) y ácidos péptido nucleicos (PNA). Como la hibridación de las sondas con las secuencias diana depende de la concentración, la hibridación se realiza preferiblemente en un pequeño volumen, es decir, menos de 10 \mul. En estas condiciones de hibridación, la hibridación de las sondas con las secuencias diana habitualmente es rápida y no procede durante más de 5, 10 ó 15 minutos, aunque puede usarse un tiempo de hibridación mayor siempre que la temperatura de hibridación se mantenga para evitar la hibridación no específica.

En una realización preferida de la invención, se han obtenido resultados excelentes por tiempos de hibridación prolongados tales como hibridación durante una noche o durante más de una hora. Los tiempos de hibridación prolongados pueden ser ventajosos en estos ensayos ya que la diferencia en la señal debida a las diferentes eficacias de hibridación está reducida y se considera deseable conseguir una hibridación y ligamiento completos de todas las sondas para la que está presente una secuencia diana. Se han obtenido resultados excelentes por una etapa de hibridación-ligamiento combinada usando una ligasa termoestable descrita en este documento. En esta realización, se realizó la hibridación-ligamiento permitiendo que las sondas hibridan durante 1 hora en presencia de una ligasa termoestable, seguido por una etapa de desnaturalización. Repetir estas etapas durante al menos 2 veces proporcionó buenos resultados. Repetir estas etapas 10 veces proporcionó resultados excelentes.

Para evitar la evaporación durante la desnaturalización e hibridación, también pueden calentarse las paredes y tapas de las cámaras de reacción (es decir, tubos o pocillos de microtitulación) a la misma temperatura que la mezcla de reacción. En sondas oligonucleotídicas preferidas, la longitud de la sección complementaria es preferiblemente al menos 15, 18 ó 20 nucleótidos y preferiblemente no más de 30, 40 ó 50 nucleótidos y las sondas tienen preferiblemente una temperatura de fusión de al menos 50ºC, 55ºC o 60ºC.

Sondas no hibridadas

Las sondas que no son complementarias a una parte de la secuencia diana o que contienen demasiadas faltas de coincidencia no hibridarán o hibridarán solamente a un grado reducido con la secuencia diana cuando la muestra se someta a condiciones de hibridación. Por consiguiente, es menos probable que suceda el ligamiento. La cantidad de productos de ligamiento falsos a partir de estas sondas en general, por lo tanto, no será suficiente y mucho menor que los productos de ligamiento auténticos de modo que se superarán durante la posterior amplificación múltiple. Por consiguiente, no se detectarán o se detectarán sólo a un grado minoritario.

Ligamiento

Los extremos 5' y 3' respectivos de la sonda oligonucleotídica que están hibridados esencialmente adyacentes con las partes complementarias de una secuencia diana se conectan en la etapa (c) para formar un enlace covalente por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los extremos de las sondas pueden conectarse enzimáticamente en un enlace fosfodiéster por una ligasa, preferiblemente una ADN ligasa. Las ADN ligasas son enzimas capaces de catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre (los extremos de) dos cadenas polinucleotídicas unidas a sitios adyacentes en una cadena de complementariedad. Las ADN ligasas habitualmente requieren ATP (EC 6.5.1.1) o NAD (EC 6.5.1.2) como un cofactor para cerrar las mellas en el ADN bicatenario. La ADN ligasa para su uso en la presente invención es la ADN ligasa T4, la ADN ligasa de E. coli o preferiblemente una ligasa termoestable como, por ejemplo, la ligasa de Thermus aquaticus (Taq), la ADN ligasa de Thermus thermophilus, o la ADN ligasa de Pyrococcus. Como alternativa, puede usarse el autoligamiento químico de extremos de polinucleótidos modificados para ligar dos sondas oligonucleotídicas hibridadas en sitios adyacentes en las partes de complementariedad de una secuencia diana (Xu y Kool, 1999, Nucleic Acid Res. 27: 875-881).

El ligamiento tanto químico como enzimático sucede de forma mucho más eficaz en complejos de sonda-secuencia diana perfectamente coincidentes en comparación con complejos en los que uno o los dos extremos de la sonda forman una falta de coincidencia con la secuencia diana en, o cerca del sitio de ligamiento (Wu y Wallace, 1989, Gene 76; 245-254; Xu y Kool, supra). Para aumentar la especificidad de ligamiento, es decir, las eficacias de ligamiento relativas de oligonucleótidos perfectamente coincidentes en comparación con oligonucleótidos no coincidentes, el ligamiento se realiza preferiblemente a elevadas temperaturas. Por tanto, en una realización preferida de la invención, se emplea una ADN ligasa que permanece activa a 50-65ºC durante tiempos prolongados, pero que se inactiva fácilmente a temperaturas mayores, por ejemplo, las usadas en la etapa de desnaturalización durante una PCR, habitualmente 90-100ºC. Una de dichas ADN ligasas es una ADN ligasa que requiere NAD de una bacteria Gram-positiva (cepa MRCH 065) como se conoce a partir del documento WO 01/61033. Esta ligasa se conoce como "ligasa 65" y está disponible en el mercado en HMC Holland, Ámsterdam.

Ligamiento de Huecos

En una realización alternativa, por ejemplo dirigida a la identificación de indels, los extremos respectivos pueden hibridarse de modo que se deje un hueco. El hueco puede rellenarse con un oligonucleótido adecuado y ligarse. Dichos métodos son conocidos en la técnica como "ligamiento de hueco" y se describen entre otros en el documento WO 00/77260. Otra posibilidad para rellenar este hueco es por extensión de un extremo de la sonda usando una polimerasa y una ligasa en combinación con nucleótidos sencillos, opcionalmente preseleccionados entre A, T, C ó G, o di-, o trinucleótidos u otros oligonucleótidos pequeños.

Cebadores

Las sondas conectadas se amplifican usando un par de cebadores correspondientes a los sitios de unión a cebador. En una realización preferida se usa al menos uno de los cebadores o el mismo conjunto de cebadores para la amplificación de dos o más sondas conectadas diferentes en una muestra, preferiblemente para la amplificación de todas las sondas conectadas en una muestra. Dicho cebador a veces se conoce como cebador universal ya que estos cebadores son capaces de cebar la amplificación de todas las sondas que contienen el sitio de unión al cebador universal correspondiente y por consiguiente de todas las sondas ligadas que contienen el sitio de unión al cebador universal. Los diferentes cebadores que se usan en la amplificación en la etapa (d) preferiblemente son esencialmente iguales en la eficacia de hibridación y cebado. Por tanto, los cebadores en una muestra preferiblemente difieren menos de 20, 15, 10, 5 ó 2ºC en la temperatura de fusión. Esto puede conseguirse como se ha descrito anteriormente para la sección de complementariedad de las sondas oligonucleotídicas. A diferencia de la secuencia de las secciones de complementariedad, la secuencia de los cebadores no está impuesta por la secuencia diana. Las secuencias del cebador por lo tanto pueden diseñarse convenientemente ensamblando la secuencia de tetrámeros de nucleótidos en los que cada tetrámero contiene una A, T, C y G o por otros modos que aseguren que el contenido en G/C y la temperatura de fusión de los cebadores sean idénticas o muy similares. La longitud de los cebadores (y sitios de unión a cebador correspondientes en las marcas de las sondas) es preferiblemente al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos y preferiblemente no más de 25, 30, 40 nucleótidos.

En una realización preferida, al menos dos de las sondas oligonucleotídicas que son complementarias a al menos dos secuencias diana diferentes en una muestra comprenden una secuencia de marca que comprende un sitio de unión a cebador que es complementario a una secuencia cebadora única. Por tanto, se usa preferiblemente al menos uno del primer y segundo cebadores en un par de cebadores para la amplificación de sondas conectadas correspondientes a al menos dos secuencias diana diferentes en una muestra, más preferiblemente para la amplificación de sondas conectadas correspondientes a todas las secuencias diana en una muestra. Preferiblemente, se usa solamente un único primer cebador y en algunas realizaciones solamente un único primer y un único segundo cebadores para la amplificación de todas las sondas conectadas. Habitualmente es ventajoso usar cebadores comunes para la amplificación de múltiples fragmentos diferentes para la eficacia de la etapa de amplificación.

Las sondas conectadas obtenidas del ligamiento de las secciones de las secciones de sonda hibridadas adyacentes se amplifican en la etapa (d), usando un conjunto de cebadores, preferiblemente compuesto por un par de cebadores para cada una de las sondas conectadas en la muestra. El par de cebadores comprende cebadores que son complementarios a secuencias de unión a cebador que están presentes en las sondas conectadas. Un par de cebadores habitualmente comprende un primer y al menos un segundo cebador, pero puede estar compuesto solamente por un único cebador que cebe en ambas direcciones. Se han obtenidos excelentes resultados usando cebadores que son conocidos en la técnica como cebadores AFLP tales como los descritos, entre otros, en el documento EP534858 y en Vos et al., Nucleic Acid. Research, 1995, vol. 23, 4407-44014.

Cebadores selectivos

En una realización preferida particular, uno o más de los cebadores usados en la etapa de amplificación de la presente invención es un cebador selectivo. Un cebador selectivo se define en este documento como un cebador que, además de su secuencia universal que es complementaria a un sitio de unión a cebador en la sonda, contiene una región que comprende los llamados "nucleótidos selectivos". La región que contiene los nucleótidos selectivos está localizada en el extremo 3' del cebador universal.

El principio de los nucleótidos selectivos se describe, entre otros, en el documento EP534858 y en Vos et al., Nucleic Acid. Research, 1995, vol., 23, 4407-44014. Los nucleótidos selectivos son complementarios a los nucleótidos en la sondas (ligadas) que están localizadas adyacentes a la secuencia cebadora. Los nucleótidos selectivos generalmente no forman parte de la región en las sondas (ligadas) que se representa como secuencia cebadora. Los cebadores que contienen un nucleótido selectivo se indican como cebadores +N, en los N significa la cantidad de nucleótidos selectivos presentes en el extremo 3' del cebador. N se selecciona preferiblemente entre A, C, T o G.

N también puede seleccionarse entre diversas alternativas nucleotídicas, es decir, compuestos que son capaces de imitar el comportamiento de nucleótidos ACTG pero además de ello tienen otras características tales como capacidad de hibridación mejorada en comparación con los nucleótidos ACTG o la capacidad de modificar la estabilidad del dúplex resultante de la hibridación. Los ejemplos de los mismos son PNA, LNA, inosina, etc. Cuando se realiza la amplificación con más de un cebador, tal como con PCR usando dos cebadores, puede equiparse uno o ambos cebadores con nucleótidos selectivos. La cantidad de nucleótidos selectivos puede variar, dependiendo de la especie u otras características particulares que pueden determinar los especialistas en la técnica. En general, la cantidad de nucleótidos selectivos es no más de 10, pero al menos 5, preferiblemente 4, más preferiblemente 3, mucho más preferiblemente 2 y de forma especialmente preferible es 1 nucleótido selectivo.

Por tanto un cebador +1 contiene un nucleótido selectivo, un cebador +2 contiene 2 nucleótidos selectivos, etc. Un cebador sin nucleótidos selectivos (es decir, un cebador convencional) puede representarse como cebador +0 (sin nucleótidos selectivos añadidos). Cuando se añade un nucleótido selectivo específico, éste se representa por la noción +A o +C, etc.

Amplificando un conjunto de sondas (ligadas) con un cebador selectivo, se obtiene un subconjunto de sondas (ligadas), con la condición de que la base complementaria se incorpore en la posición apropiada en la sonda deseada que se supone que se amplifica selectivamente usando el cebador selectivo. Usando un cebador +1, por ejemplo, el factor de combinación de la mezcla amplificada se reduce en un factor 4 en comparación con la mezcla de sondas ligadas antes de la amplificación. Pueden conseguirse reducciones mayores usando cebadores con múltiples nucleótidos selectivos, es decir, una reducción de 16 veces del índice de combinación original se obtiene con 2 nucleótidos selectivos, etc.

Cuando se desarrolla un ensayo que, después del ligamiento, tiene que amplificarse selectivamente, se prefiere que la sonda contenga el nucleótido complementario adyacente a la secuencia de unión a cebador. Esto permite la pre-selección de la sonda ligada a amplificar selectivamente.

El uso de cebadores selectivos en la presente invención ha demostrado ser ventajoso cuando se desarrollan ensayos basados en ligamiento con elevados índices de combinación de los que posteriormente solamente una parte específica tiene que analizarse provocando una reducción adicional de los costes de la reacción de ligamiento por dato puntual. Diseñando cebadores junto con nucleótidos selectivos adyacentes, pueden seleccionarse de antemano las partes específicas de la muestra que tienen que amplificarse por separado.

Uno de los ejemplos en los que esto es útil y ventajoso es en el caso del análisis de muestras que contienen solamente cantidades mínimas de ADN y/o para la identificación de diferentes (cepas de) patógenos. Por ejemplo, en un ensayo dirigido a la detección de diversas cepas de ántrax (Bacillus anthracis), para cada una de las cepas se diseña un conjunto de sondas representativas. La detección de la presencia o ausencia de este conjunto (o una parte característica del mismo) de sondas ligadas después de las etapas de hibridación y ligamiento del método de la invención puede servir como identificación de la cepa afectada. La amplificación selectiva con cebadores diseñados específicamente (cada cebador selectivo se une a una cepa específica) puede amplificar selectivamente las diversas cepas, permitiendo su identificación. Por ejemplo, la amplificación un cebador +A amplifica selectivamente las sondas ligadas dirigidas a la cepa X donde un cebador +G amplifica selectivamente las sondas ligadas dirigidas a la cepa Y. Si se desea, por ejemplo en el caso de pequeñas cantidades de ADN de muestra, una primera amplificación opcional con un cebador +0 aumentará la cantidad de sondas ligadas, facilitando de este modo la amplificación selectiva.

Por ejemplo, un cebador universal de 20 nucleótidos se convierte en un cebador selectivo por la adición de un nucleótido selectivo en su extremo 3', de modo que la longitud total del cebador ahora es de 21 nucleótidos. Véase también la Figura 15. Como alternativa, el cebador universal puede acortarse en su extremo 5' por cantidad de nucleótidos selectivos añadidos. Por ejemplo, puede combinarse la adición de dos nucleótidos selectivos en el extremo 3' de la secuencia cebadora con la ausencia (o retirada) de dos nucleótidos del extremo 5' del cebador universal, en comparación con el cebador universal original. Por tanto, se reemplaza un cebador universal de 20 nucleótidos por un cebador selectivo de 20 nucleótidos. Estos cebadores se describen como "cebadores anidados" en toda esta solicitud. El uso de cebadores selectivos basados en cebadores universales tienen la ventaja de que los parámetros de amplificación tales como la rigurosidad y temperaturas pueden permanecer esencialmente iguales para la amplificación con diferentes cebadores selectivos o variar solamente a un grado minoritario. Preferiblemente, la amplificación selectiva se realiza en condiciones de rigurosidad aumentada en comparación con la amplificación no selectiva. Con rigurosidad aumentada se entiende que las condiciones para hibridar el cebador con la sonda ligada son tales que solamente se prolongarán los cebadores selectivos perfectamente coincidentes por la polimerasa usada en la etapa de amplificación. La amplificación selectiva de cebadores de coincidencia solamente perfecta puede conseguirse en la práctica por el uso de un llamado perfil de PCR descendente en el que la temperatura durante la etapa de hibridación de cebador se disminuye por etapas en por ejemplo 0,5ºC para permitir la hibridación perfecta de los cebadores. Las condiciones de rigurosidad adecuadas son por ejemplo como se describe para la amplificación AFLP en el documento EP 534858 y en Vos et al., Nucleic Acid Research, 1995, vol. 23, 4407-44014. Los especialistas en la técnica, en base a las directrices encuentra modos para adaptar las condiciones de rigurosidad para adecuar sus necesidades específicas sin alejarse de la esencia de la invención.

Una de las ventajas adicionales de la amplificación selectiva de sondas ligadas es que puede adaptarse fácilmente un ensayo con un elevado índice de combinación para la detección con métodos o en plataformas que prefieren un índice de combinación inferior.

Uno de los muchos ejemplos de ello es la detección basada en diferencias de longitud tal como electroforesis y preferiblemente electroforesis capilar tal como se realiza en un MegaBACE y una usando nano-tecnología tal como Lab-on-a-Chip.

Amplificación

En la etapa (d) del método de la invención, la sondas conectadas se amplifican para producir sondas conectadas amplificadas (detectables) (amplicones) que son representaciones lineales de las sondas circulares conectadas por cualquier método de amplificación de ácido nucleico adecuado conocido en la técnica. Los métodos de amplificación de ácido nucleico habitualmente emplean dos cebadores, dNTP, y una (ADN) polimerasa. Un método preferido para la amplificación es PCR. "PCR" o "Reacción en Cadena de la Polimerasa" es un procedimiento rápido para la amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN específico. El ADN a amplificar se desnaturaliza calentando la muestra. En presencia de la ADN polimerasa y un exceso de desoxinucleótido trifosfatos, los oligonucleótidos que hibridan específicamente con la secuencia diana ceban la nueva síntesis de ADN. Se prefiere que la polimerasa sea una ADN polimerasa que no exprese actividad de desplazamiento de cadena o al menos no significativamente. Los ejemplos de la misma son Amplitaq y Amplitaq Gold (proveedor Perkin Elmer) y Accuprime (Invitrogen). Una ronda de síntesis produce nuevas cadenas de longitud determinada que, como las cadenas parenterales, pueden hibridar con los cebadores después de la desnaturalización e hibridación. El segundo ciclo de desnaturalización, hibridación y síntesis produce dos productos monocatenarios que juntos componen un producto bicatenario discreto, exactamente la longitud entre los extremos del cebador. Este producto discreto se acumula exponencialmente con cada ronda sucesiva de amplificación. Durante el transcurso de aproximadamente 20 a 30 ciclos, pueden conseguirse muchas amplificaciones de millones de veces del fragmento discreto. Los protocolos de PCR son bien conocidos en la técnica, y se describen en libros de texto de laboratorio convencionales, por ejemplo Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1995). Las condiciones adecuadas para la aplicación de PCR en el método de la invención se describen en el documento EP-A 0 534 858 y Vos et al. (1995; Nucleic Acids Res. 23: 4407 - 23: 4407-4407-4407-4414), donde se amplifican múltiples fragmentos de ADN entre 70 y 700 nucleótidos y que contienen secuencias de unión a cebador idénticas con una eficacia casi igual usando un par de cebadores. Otros métodos de amplificación múltiple y/o isotérmica que pueden aplicarse incluyen, por ejemplo LCR, replicación de secuencia autosostenida (3SR), amplificación de ARN mediada por la Q-\beta-replicasa, o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA). En algunos casos esto puede requerir el reemplazamiento de los sitios de unión a cebador en las marcas de las sondas por un sitio de unión a polimerasa (ARN) adecuado siempre que conduzca a productos de amplificación lineales como se ha definido anteriormente en este documento, es decir, de longitudes discretas y correspondientes a la longitud de las sondas circulares.

Como se describe en este documento, las representaciones lineales de las sondas circulares conectadas pueden obtenerse por amplificación exponencial de la sonda circular con dos cebadores, un directo y uno inverso, usando una polimerasa que no tiene o no tiene significativamente una actividad de desplazamiento de cadena. Esta primera elongación de cebador en la amplificación con el cebador directo genera un producto oligonucleotídico hasta que se alcanza el extremo 5' del cebador directo. Ahí termina la elongación del cebador, debido a la ausencia sustancial de actividad de desplazamiento de cadena de la polimerasa usada, dejando un cebador elongado con sustancialmente la misma longitud que la sonda circular conectada. El segundo ciclo de desnaturalización, hibridación de cebador y elongación de cebador producirá, para el cebador directo, la misma cadena que durante la primera elongación de cebador, mientras que el cebador inverso hibridará con el producto oligonucleotídico de la elongación de la primera elongación de cebador y por lo tanto producirá la cadena complementaria, produciendo la amplificación exponencial de la sonda circular para producir de este modo amplicones de longitud discreta que son representaciones de las sondas oligonucleotídicas circulares conectadas.

Amplicones

El término "amplicón" como se usa en este documento se refiere al producto de la etapa de amplificación de la sonda conectada o ligada. El término "amplicón" como se usa en este documento se refiere por tanto a un sonda conectada amplificada. Después de la etapa de ligamiento en la que se conectan las dos secciones específicas de diana mediante una ligasa, la sonda conectada o ligada se combina con uno o más cebadores y una polimerasa y se amplifican. La sonda ligada, los cebadores, la polimerasa y/u otros parámetros y variables son tales que la amplificación produzca representaciones lineales de la sonda circular. En la presente invención el amplicón es un oligonucleótido lineal que tiene una longitud que no excede sustancialmente la longitud de la sonda circular. La longitud mínima del amplicón es al menos la suma de la longitud de las dos secciones de complementariedad de diana. Se prefiere que la longitud del amplicón corresponda con la longitud de la sonda circular. Es más preferido que la longitud del amplicón sea indicativa del ligamiento de la sonda circular correspondiente. Preferiblemente, un amplicón no contiene repeticiones de secciones de la sonda circular, es decir, no es un concatémero o un multímero de la sonda circular o una representación multimérica del mismo. Preferiblemente, un amplicón es una representación lineal y monomérica de la sonda circular conectada.

La ventaja obtenida por la conversión de sondas circulares en amplicones lineales es que se usan las características ventajosas de la sonda circular (cinética mejorada, hibridación aumentada con la cadena diana debido a la formación de la conformación "cerrada"), mientras que los amplicones resultantes son de una longitud completa y puede detectarse posteriormente sin la necesidad de etapas adicionales tales como restricción y marcaje. La Figura 14 presenta una representación esquemática de sondas circulares y amplicones. Las diversas realizaciones de la presente invención proporcionarán detalles adicionales en este aspecto.

Detección

La detección de las muestras separadas marcadas se realiza por un detector para producir datos de detección. El detector es por supuesto dependiente del sistema general en el que se realiza la separación (electroforesis capilar, electroforesis en bloque del gel, electroforesis en gel continuo de detector fijado) pero también depende del marcador que está presente en el cebador, tal como un marcador fluorescente o radiactivo.

Los amplicones en una muestra se analizan preferiblemente en un dispositivo electroforético. El dispositivo electroforético preferiblemente separa los diferentes amplicones en una muestra amplificada en base a la longitud, después de lo cual los amplicones separados pueden detectarse como se describe a continuación. Un dispositivo electroforético adecuado puede ser un dispositivo de electroforesis en gel, por ejemplo, para electroforesis en bloque de gel convencional (poliacrilamida), o un dispositivo de electroforesis capilar tal como el ejemplificado por el equipo MegaBACE disponible en Molecular Dynamics Amersham-Biosciences. Una alternativa es los dispositivos electroforéticos capilares de tamaño nanométrico conocidos como Lab-on-a-Chip. El dispositivo electroforético preferiblemente es un dispositivo multicanal en el que se someten a electroforesis múltiples muestras en múltiples canales en paralelo. El dispositivo electroforético tiene una localización de aplicación (por canal) para la aplicación (carga) de la muestra amplificada a someter a electroforesis, un área de separación sobre la que los fragmentos en la muestra migran por electroforesis, y preferiblemente también en dispositivo de detección localizado en la localización de detección distal de la localización de aplicación. El dispositivo de detección comprenderá habitualmente un fotomultiplicador para la detección de fluorescencia, fosforescencia o quimioluminiscencia. Como alternativa, en el caso de electroforesis en gel, los fragmentos separados pueden detectarse en el gel, por ejemplo, por auto-radiografía o
fluorografía.

Discriminación de longitud

Para discriminar entre diferentes secuencias diana en la muestra se usa preferiblemente una diferencia en la longitud de los amplicones correspondientes respectivos. Separando los amplicones en base a la longitud, puede determinarse la presencia de las secuencias nucleotídicas diana correspondientes en la muestra. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, la discriminación entre amplicones derivados de diferentes secuencias diana en una muestra se basa en una diferencia de longitud entre los amplicones respectivos correspondientes a diferentes secuencias diana en una muestra o muestra amplificada.

Preferiblemente, la diferencia en la longitud se proporciona por la longitud de la secuencia o secuencias de relleno en las sondas oligonucleotídicas. Incluyendo en cada sonda oligonucleotídica un relleno de una longitud predeterminada, puede controlarse la longitud de cada amplicón en una muestra amplificada de modo que se posibilite una discriminación adecuada basada en diferencias de longitud del amplicón obtenido en la etapa (d). En una realización preferida de una sonda de acuerdo con la invención, el relleno se localiza entre la sección de la sonda complementaria a la secuencia diana y una secuencia de unión a cebador. Como hay dos secciones específicas de diana y ambos extremos de la sonda y los dos sitios de unión a cebador, pueden incorporarse dos rellenos en la sonda entre ellos. Por tanto, la longitud total del relleno se proporciona por la combinación de la longitud del primer relleno y el segundo relleno en la sonda. Por consiguiente, en una realización preferida, la sonda oligonucleotídica comprende dos rellenos, preferiblemente en las marcas no complementarias a la diana. Puede encontrarse una representación gráfica del mismo en la Figura 14.

La diferenciación en la longitud entre los amplicones obtenidos de secuencias diana en la muestra se elige preferiblemente de modo que los amplicones puedan distinguirse en base a su longitud. Esto se consigue usando secuencias de relleno o combinaciones de secuencias de relleno que (juntas) producen diferencias claras en la longitud que pueden distinguirse en dispositivos electroforéticos. Por tanto, desde la perspectiva de la potencia de resolución, las diferencias en la longitud entre los diferentes amplicones, que pueden estar causadas por sus rellenos, son tan grandes como sean posibles. Sin embargo, para otras consideraciones importantes, como se ha indicado anteriormente, las diferencias en la longitud entre los diferentes amplicones son preferiblemente lo más pequeñas posibles: (1) el límite superior que existe en la práctica con respecto a la longitud de sondas sintetizadas químicamente de aproximadamente 100-150 bases como mucho; (2) la amplificación menos eficiente de fragmentos más grandes, (3) las posibilidades aumentadas para eficacias de amplificación diferenciales de fragmentos con una gran variación de longitud; y (4) el uso de múltiples inyecciones de muestras de detección en el dispositivo de detección que funciona mejor con fragmentos en un estrecho intervalo de longitud. Preferiblemente, las diferencias de longitud entre las secuencias a determinar y proporcionar por los rellenos es al menos suficiente para permitir la discriminación entre esencialmente todos los amplicones. Por definición, en base a los procedimientos químicos, enzimáticos y biológicos de síntesis de ácido nucleico, la diferencia de tamaño útil mínima entre diferentes amplicones en una muestra amplificada es una base, y esta diferencia de tamaño se ajusta en la potencia de resolución de la mayoría de los dispositivos de electroforesis, especialmente los intervalos de tamaño menores. Por tanto, en base a lo anterior, se prefiere el uso de ensayos combinados con productos de amplificación que difieren en longitud en una única base (par). En una realización preferida, la diferencia de longitud entre diferentes amplicones en una muestra amplificada es al menos dos nucleótidos. En una realización particularmente preferida de la invención el amplicón correspondiente a diferentes secuencias diana en una muestra tiene una diferencia de longitud de dos nucleótidos.

Marcadores

En una realización preferida, al menos uno de los cebadores complementarios a los sitios de unión de cebador de la primera y segunda sondas oligonucleotídicas en la muestra comprende un marcador, preferiblemente el segundo cebador comprende un marcador. El marcador puede seleccionarse entre un gran grupo, que comprende, entre otros, restos fluorescentes y/o fosforescentes tales como colorantes, cromóforos o enzimas, antígeno, metales pesados, sondas magnéticas, restos fosforescentes, marcadores radiactivos, restos quimioluminiscentes o restos de detección electroquímica. Preferiblemente, el marcador es un colorante fluorescente o fosforescente, más preferiblemente seleccionado entre el grupo de FAM, HEX, TET, JOE, NED, y (ET)-ROX. Los colorantes tales como FITC, Cy2, Rojo Texas, TAMRA, Alexa fluor 488^{TM}, Bodipy^{TM} FL, Rodamina 123, R6G, Bodipy 530, Alexafluor^{TM} 532 e IRDyes^{TM} de Licor como se usan en la plataforma NEN Glober IR^{2} también son adecuados para su uso en la presente invención. Preferiblemente, el marcador puede elegirse entre los colorantes fluorescentes o fosforescentes en el grupo compuesto por FAM, TET, JOE, NED, HEX, (ET)-ROX, FITC, Cy2, Rojo Texas, TAMRA, Alexa fluor 488^{TM}, Bodipy^{TM} FL, Rodamina 123, R6G, Bodipy 530, Alexafluor^{TM} 532 e IRDyes^{TM}.

Mediante el uso de un conjunto de cebadores que comprende cebadores marcados de forma diferente, puede duplicarse la cantidad de sondas conectadas que puede discriminarse en una muestra y por tanto la cantidad de sondas diana en una muestra, para cada marcador adicional. Por tanto, para cada marcador adicional que se usa en una muestra, se duplica la cantidad de secuencias diana que puede analizarse en una muestra. La cantidad máxima de marcadores que puede usarse en una muestra en un método de alto rendimiento viene regida principalmente por las limitaciones en las capacidades de detección de las plataformas de detección disponibles. Actualmente, una de las plataformas más frecuentemente usadas (MegaBACE, por Molecular Dynamics - Amersham-Biosciences, Ltd.) permite la detección simultánea de hasta cuatro colorantes fluorescentes, que son FAM, JOE o HEX, NED y (ET-)ROX. Sin embargo, también son adecuados instrumentos de electroforesis capilar alternativos, que incluyen ABI310, ABI3100, ABI3700 (Perkin-Elmer Corp.), CEQ2000 XL (Beckman Coulter) y otros. Los ejemplos no limitantes de dispositivos de electroforesis basados en bloques de gel incluyen ABI377 (Perkin Elmer Corp.) y el sistema de secuenciación de ADN automático global IR^{2}, disponible en LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA.

Longitud y marcador

El rendimiento puede aumentarse por el uso de múltiples cebadores marcados. Uno de los problemas asociados con el uso de diferentes marcadores en una muestra es la comunicación o comunicación residual. La comunicación o comunicación residual, como se usa en este documento, se refiere al solapamiento entre los espectros de emisión de diferentes marcadores (fluorescentes). Por ejemplo, cuando se usan colorantes fluorescentes, cada colorante tiene un diferente espectro de emisión (y absorción). En el caso de dos colorantes en una muestra, estos espectros pueden solapar y pueden causar una alteración de la señal, que se opone a la calidad de los datos obtenidos. Particularmente cuando dos fragmentos nucleotídicos a detectar en una muestra están marcados con un marcador diferente y uno de los fragmentos está presente en una cantidad abundante mientras que el otro está presente solamente en cantidades minoritarias, la comunicación residual puede causar que la señal medida del fragmento que está presente en cantidades solamente minoritarias se obtenga principalmente de la emisión de otro marcador con un espectro de emisión solapante que está abundantemente contenido en un fragmento con tamaño idéntico de otra muestra. El efecto recíproco del otro colorante también puede suceder pero en este ejemplo su efecto es probablemente menor a causa de las diferencias de abundancia entre los amplicones marcados con los colorantes respectivos.

Chehab et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9178-9182 (1989) han intentado discriminar entre alelos uniendo diferentes colorantes fluorescentes a alelos competidores en un único tubo de reacción seleccionando combinaciones de marcadores de modo que el máximo de emisión de un colorante coincide esencialmente con el mínimo de emisión del otro colorante. Sin embargo, a una cierta longitud de onda en la que el colorante expresa un máximo de absorción, siempre existe también algo de absorción restante del otro colorante presente en la muestra, especialmente cuando la muestra contiene múltiples colorantes.

Se descubrió que esta vía para el análisis combinado estaba limitada en escala por los relativamente pocos colorantes que pueden resolverse en el espectro. Uno de los problemas principales con el uso de múltiples colorantes es que los espectros de emisión de diferentes marcadores fluorescentes a menudo se solapan. Las señales de los datos originales resultantes tienen que corregirse para la contribución de fragmentos de tamaño similar que se detectan simultáneamente y están marcados con otro colorante fluorescente por un proceso llamado corrección de comunicación. La corrección de comunicación se realiza habitualmente por un medio matemático, en base a los espectros de absorción teóricos conocidos para ambos colorantes, después de la recogida de los datos "originales" del dispositivo de detección. La corrección matemática se basa en los espectros teóricos e ignora que los espectros de emisión de los marcadores son sensibles y a menudo están afectados por la composición de la muestra de detección. Esas sensibilidades pueden afectar al brillo y/o la longitud de onda de la emisión. Esto significa que parámetros tales como el pH, temperatura, intensidad de luz de excitación, interacciones no covalentes, concentración salina y fuerza iónica incluye fuertemente en el espectro de misión resultante. En particular, se sabe que la presencia de sales residuales en una muestra afecta a la señal de fluorescencia emitida por el colorante y es un factor crítico en el caso de la detección por electroforesis capilar usando inyección electrocinética porque entonces también afecta a la eficacia de inyección. Por tanto, el solapamiento de espectros es una fuente potencial de error que influye negativamente en la calidad de los datos en el caso de detección combinada usando diferentes colorantes fluorescentes.

La presente invención proporciona una solución a este problema de modo que puedan usarse dos (o más) marcadores con espectros solapantes en la misma muestra sin afectar significativamente a la calidad de los datos. Por una combinación predeterminada de diferencias de longitud y marcadores, se obtiene un aumento en la cantidad de secuencias nucleotídicas diana que puede detectarse en la muestra mientras que la calidad de los datos permanece al menos constante. En una realización preferida de la invención, el solapamiento de espectros entre dos secuencias marcadas de forma diferente se reduce por la introducción de una diferencia de longitud entre las dos secuencias. Esta diferencia de longitud relacionada con el marcador puede proporcionarse por la longitud de la secuencia de relleno como se describe en este documento. La cantidad de diferentes marcadores que puede usarse en la misma muestra en el presente método es al menos dos, preferiblemente al menos tres, más preferiblemente al menos cuatro. La cantidad máxima de marcadores está funcionalmente limitada por el mínimo de solapamiento de espectro que permanece aceptable, que para la mayoría de las aplicaciones típicamente supone menos del 15 por ciento de la señal verdadera, preferiblemente menos del 10 por ciento, más preferiblemente menos del 5 por ciento y mucho más preferiblemente menos del 1 por ciento de la señal verdadera.

Para evitar la influencia potencial de la comunicación residual en la calidad de los datos en el caso de que se marquen diferentes muestras con múltiples colorantes fluorescentes con espectros de emisión solapantes y se detecten fragmentos con longitud idéntica simultáneamente en la misma realización, en una realización preferida se prefiere elegir las secuencias de relleno de modo que los amplicones difieran en al menos dos pares de bases en un ajuste múltiple y difieran en un único par de bases entre ajustes múltiples marcados con los diferentes colorantes que tienen espectro solapantes. Haciendo esto, la longitud de los fragmentos marcados con los colorantes respectivos pueden elegirse de modo que la influencia potencial de la comunicación residual sobre la calidad de los datos se evite porque se definen combinaciones únicas de tamaño de los fragmentos y colorante de marcaje
(Figura 3).

Una realización preferida particular de la invención se refiere a un método en el que se obtiene una muestra que comprende amplicones de una multiplicidad de secuencias diana. Estos amplicones están marcados de forma diferente, definiendo de este modo grupos de amplicones que llevan el mismo marcador. En cada grupo, el relleno proporcionó una diferencia de longitud de al menos dos, preferiblemente dos nucleótidos. Entre dos grupos con marcadores que tienen solapamiento de espectro, el relleno proporciona una diferencia de longitud de un nucleótido, produciendo de forma eficaz un grupo que tiene una cantidad par de nucleótidos y un grupo que tiene una cantidad impar de nucleótidos como se ha descrito anteriormente.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para la discriminación y detección mejoradas de secuencias diana en una muestra, que comprende proporcionar al menos dos o más grupos de sondas oligonucleotídicas, en el que los amplicones obtenidos con diferentes grupos de sondas oligonucleotídicas tienen diferentes marcadores, donde sustancialmente cada secuencia diana conectada a una sonda amplificada en un grupo tiene el mismo marcador, donde en un grupo de amplicones marcados de forma idéntica se proporciona una diferencia de longitud entre cada sonda marcada de forma idéntica en ese grupo, donde entre el primer y segundo grupos se proporciona un diferencia de longitud adicional de modo que cada sonda conectada amplificada en la muestra amplificada se caracteriza por una combinación de longitud de la secuencia y el marcador.

En una realización preferida del método de la invención, se proporcionan al menos dos grupos de sondas oligonucleotídicas a una muestra, por lo que cada grupo de sondas oligonucleotídicas tiene secuencias de marca con al menos un sitio de unión a cebador específico de grupo. Las sondas conectadas de cada grupo se amplifican desde un par de cebadores donde al menos de uno del primer y segundo cebadores son complementarios al sitio de unión a cebador específico de grupo, y por lo que al menos uno del primer y segundo cebadores de un grupo comprende un marcador específico de grupo. En cada grupo, un amplicón correspondiente a una secuencia diana en la muestra difiere en la longitud de un amplicón correspondiente a una secuencia diana diferente en la muestra. Los marcadores específicos de grupo son preferiblemente tales que el dispositivo de detección puede distinguir entre los diferentes marcadores específicos de grupo. La diferencia de longitud se proporciona preferiblemente por la longitud de la secuencia de relleno. Preferiblemente, en esta realización del método de la invención, una primera parte de los grupos tiene amplicones que tienen una cantidad par de nucleótidos y una segunda parte de los grupos tiene amplicones que tienen una cantidad impar de nucleótidos. Preferiblemente, los grupos de amplicones que tienen una cantidad par de nucleótidos y los grupos de amplicones que tienen una cantidad impar de nucleótidos están marcados con marcadores (fluorescentes), que tienen al menos un solapamiento en sus espectros de emisión. Por tanto, dos grupos de amplicones, teniendo cada grupo una cantidad impar de nucleótidos están marcados con marcadores, que tienen al menos un solapamiento en sus espectros de emisión. Lo mismo se aplica para dos grupos de amplicones, teniendo cada grupo una cantidad par de nucleótidos. Dos grupos de amplicones, teniendo un grupo una cantidad impar de nucleótidos y teniendo el otro grupo una cantidad par de nucleótidos están marcados con marcadores que tienen un solapamiento mayor en sus espectros de emisión. Las nociones relativas usadas en este documento de "al menos solapamiento en sus espectros de emisión" y "tienen un solapamiento mayor en sus espectros de emisión" se refieren a un grupo de marcadores del que puede prepararse una selección de marcadores para su uso en la presente invención. Este grupo de marcadores puede depender de la plataforma de detección usada para otros factores tales como los descritos anteriormente en este documento. En una realización particularmente preferida de este método, se produce un primer y segundo grupos de amplicones que tiene una cantidad par de nucleótidos y un tercer y cuarto grupos de sondas amplificadas conectadas que tienen una cantidad impar de nucleótidos y por lo que el primer y segundo grupos están marcados con FAM y NED, respectivamente, y el tercer y cuarto grupos están marcados con (ET-)ROX y JOE o HEX, respectivamente; o viceversa, por lo que el primer y segundo grupos están marcados con (ET-)ROX y JOE o HEX, respectivamente, y el tercer y cuarto grupo están marcados con FAM y NED, respectivamente. Por tanto, en estas realizaciones, los marcadores fluorescentes se eligen de modo que los grupos de amplicones que co-migran, porque ambos contienen fragmentos con números pares o impares de nucleótidos, tienen marcadores que tienen al menos solapamiento en sus espectros de emisión, evitando de este modo lo máximo posible la comunicación en la detección de amplicones en diferentes grupos (véase también a
continuación).

En una realización preferida para evitar la comunicación es por lo tanto deseable combinar una diferencia en la longitud con un diferente marcador cuando se analiza un conjunto de amplicones de tal modo que la influencia del solapamiento de espectros sobre la calidad de los datos se evite por diferencias de longitud entre los amplicones marcados con los colorantes que tienen espectros de emisión solapantes.

Se prefiere que en cada muestra las sondas conectadas derivadas de cada secuencia diana difieran de cualquier otra sonda conectada en la muestra en la longitud, y/o en el marcador o, preferiblemente en la combinación de longitud y marcador. Para proporcionar una separación adecuada de los amplicones de diferente longitud se prefiere que la diferencia de longitud entre dos sondas conectadas diferentes sea al menos dos nucleótidos, preferiblemente dos. Cuando se detectan polimorfismos se prefiere que la diferencia en la longitud entre dos o más alelos (SNP) del polimorfismo no sea más de dos, asegurando de este modo que la eficacia de la amplificación sea similar entre alelos o formas diferentes del mismo polimorfismo. Esto implica que se amplifiquen preferiblemente ambos alelos con el mismo par de cebadores y por tanto se marquen con el mismo colorante.

En una realización preferida, por ejemplo dirigida a la detección de alelos diferentes de una multiplicidad de loci, la distribución entre longitudes impares/pares en un grupo puede diseñarse de siguiente modo. Dos loci L1, L2 están cada uno representado por dos alelos A11, A12 para L1 y A21, A22 para L2. Las longitudes de los diversos alelos (o sondas ligadas y amplificadas que representan esos alelos) es tal que A11>A12>A21>A22; A12-A11=2; A22-A21=2, A12-A21=3. Entre los grupos G1 y G2 que llevan marcadores que pueden tener un solapamiento en sus espectros puede haber una diferencia de longitud de 1 nucleótido. Por tanto G1(A11)-G2(A11)=1, por tanto el grupo comienza con una longitud par o impar.

Esta distribución tiene algunas ventajas significativas en comparación con la distribución más densamente compactada descrita en este documento. Se sabe que debido a las diferencias conformacionales, diferentes secuencias de longitud idéntica generalmente difieren en su movilidad electroforética. Cuando hay solamente una diferencia en la longitud de un nucleótido, esto puede causar un solapamiento entre los picos si las secuencias son de una movilidad muy diferente. Por ejemplo, la diferencia en la movilidad entre dos alelos de un locus (A11, A12) será menor que la diferencia en la movilidad entre dos alelos de diferentes loci (A12, A21). Cuando hay una diferencia significativa en la movilidad entre A12 y A21, esto puede conducir a una detección no fiable. Creando distribuciones de longitud como se ha descrito en este documento, esto puede evitarse. El rendimiento inferior se pondera después frente a la fiabilidad de la detección.

El problema del solapamiento entre los espectros de los diferentes marcadores entonces se evita adecuadamente. Esto se representa esquemáticamente en la Tabla A.

TABLA A Esquema de distribución alternativa de marcadores y longitudes de sondas

1

En una realización de la presente invención se proporciona entre los amplicones en un grupo, una diferencia de longitud de dos o tres nucleótidos alternativos, es decir, 0, 2, 5, 7, 10, 12 etc. El otro grupo entonces tiene una diferencia de longitud de 1, 3, 6, 8, 11, 13 etc.

Secuencias diana

En su definición más amplia, la secuencia diana puede ser cualquier secuencia de nucleótidos de interés. La secuencia diana preferiblemente es una secuencia de nucleótidos que contiene, representa o está asociada con un polimorfismo. El término polimorfismo en este documento se refiere a la existencia de dos o más secuencias alternativas genéticamente determinadas o alelos en una población. Un marcador o sitio polimórfico es el locus en el que sucede una divergencia. Los marcadores preferidos tienen al menos dos alelos, existiendo cada uno a una frecuencia de más del 1%, y más preferiblemente más de 10% o el 20% de una población seleccionada. Un locus polimórfico puede ser tan pequeño como un par de bases. Los marcadores polimórficos incluyen polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, número variable de repeticiones en tándem (VNTR), regiones hipervariables, minisatélites, repeticiones de dinucleótidos, repeticiones de trinucleótidos, repeticiones de tetranucleótidos, repeticiones de secuencia simple y elementos de inserción tales como Alu. La primera forma alélica identificada se denomina arbitrariamente como la forma de referencia y las otras formas alélicas se denomina como alelos alternativos o variantes. La forma alélica que existe más frecuentemente en una población seleccionada a veces se denomina forma de tipo silvestre. Los organismos diploides pueden ser homocigóticos o heterocigóticos para las formas alélicas. Un polimorfismo dialélico tiene dos formas. Un polimorfismo trialélico tiene tres formas. Un polimorfismo de un único nucleótido sucede en un sitio polimórfico ocupado por un único nucleótido, que es el sitio de variación entre secuencias alélicas. El sitio está precedido y seguido por secuencias altamente conservadas del alelo (por ejemplo, secuencias que varían en menos de 1/100 o 1/1000 miembros de las poblaciones). Un polimorfismo de un único nucleótido habitualmente surge debido a la sustitución de un nucleótido por otro en el sitio polimórfico. Los polimorfismos de un único nucleótido también pueden surgir por la deleción de un nucleótido o una inserción de un nucleótido con relación a un alelo de referencia. Otros polimorfismos incluyen deleciones o inserciones pequeñas de varios nucleótidos, conocidos como indels. Una secuencia diana preferida es una secuencia diana que está asociada con un marcador AFLP®, es decir, un polimorfismo que es detectable con AFLP®.

ADN

En la muestra de ácido nucleico, los ácidos nucleicos que comprenden la diana pueden ser cualquier ácido nucleico de interés. Aunque los ácidos nucleicos en la muestra habitualmente estarán en forma de ADN, la información de la secuencia de nucleótidos contenida en la muestra puede ser de cualquier fuente de ácidos nucleicos, incluyendo por ejemplo ARN, ARN poliA+, ADNc, ADN genómico, ADN de los orgánulos tales como ADN mitocondrial o de cloroplastos, ácidos nucleicos sintéticos, bibliotecas de ADN, bancos clonales o cualquier selección o combinaciones de los mismos. El ADN en la muestra de ácido nucleico puede ser ADN bicatenario, monocatenario o bicatenario desnaturalizado en ADN monocatenario. La desnaturalización de secuencias bicatenarias produce dos fragmentos monocatenarios uno o ambos de los cuales puede analizarse por sondas específicas para las cadenas respectivas. Las muestras de ácido nucleico preferidas comprenden secuencias diana de ADNc, ADN genómico, fragmentos de restricción, fragmentos de restricción ligados a adaptadores, fragmentos de restricción ligados a adaptadores amplificados. Los fragmentos AFLP o fragmentos obtenidos en una pre-amplificación con molde AFLP.

Muestras

Se prefiere que una muestra contenga dos o más secuencias diana diferentes, es decir, dos o más se refiere a la identidad de lugar de la cantidad de las secuencias diana en la muestra. En particular, comprende al menos dos secuencias diana diferentes, en particular al menos 10, preferiblemente al menos 25, más preferiblemente al menos 50, más en particular al menos 100, preferiblemente al menos 250, más preferiblemente al menos 500 y mucho más preferiblemente al menos 1000 secuencias diana adicionales. En la práctica, la cantidad de secuencias diana está limitada, entre otros, por la cantidad de sondas circulares conectadas. Por ejemplo, demasiadas sondas oligonucleotídicas diferentes en una muestra pueden corromper la fiabilidad de la etapa de amplificación múltiple.

Una limitación adicional está formada, por ejemplo, por la cantidad de fragmentos en una muestra que pueden resolverse por el dispositivo electroforético en una inyección. La cantidad también puede estar limitada por el tamaño del genoma del organismo o la complejidad del transcriptoma de un tipo celular particular del que se obtiene la muestra de ADN o ADNc, respectivamente.

Inyección múltiple

En una realización preferida de la invención, para obtener un método de alto rendimiento de una multiplicidad de muestras, se tratan varias muestras similares para generar de este modo una multiplicidad de muestras de detección amplificadas que después pueden analizarse en un dispositivo multicanal que es al menos capaz de detectar los marcadores y/o diferencias de longitud. En este documento se describen dispositivos adecuados.

Para aumentar el rendimiento en plataformas electroforéticas se han desarrollado métodos que se describen en esta solicitud y se indican comúnmente como inyección múltiple. Inyectando múltiples muestras que contienen fragmentos de longitudes discretas, predeterminadas, en la misma matriz electroforética y/o en cortas realizaciones consecutivas, puede aumentarse el rendimiento. Todos los fragmentos detectables tienen preferiblemente una longitud en un marco específico y puede detectarse solamente una cantidad limitada de fragmentos en una muestra, por tanto la ventaja de la amplificación selectiva para la reducción del índice de combinación por la selección de un subconjunto de sondas conectadas en la etapa de amplificación produce un subconjunto de amplicones.

Las etapas (a) a (e) del método de la invención pueden realizarse en dos o más muestras de ácido nucleico, conteniendo cada una dos o más ácidos nucleicos diana diferentes, para producir dos o más muestras amplificadas en las que se analiza la presencia o ausencia de amplicones.

El análisis combinado de las muestras amplificadas siguiendo el método de la invención comprende aplicar al menos parte de una muestra amplificada a un dispositivo electroforético para la separación y detección posterior. Preferiblemente, dicha muestra amplificada contiene, o al menos se sospecha que contiene sondas conectadas amplificadas, que es un indicio de que la secuencia diana ha hibridado con las sondas oligonucleotídicas proporcionadas y que esas sondas hibridaron de forma adyacente en la secuencia diana complementaria de modo que estaban conectadas, es decir, ligadas. Posteriormente, una muestra amplificada se somete a una etapa de separación durante un periodo de tiempo seleccionado antes de que se someta la siguiente muestra amplificada.

En el método de la invención se aplican (partes de) dos o más muestras amplificadas diferentes consecutivamente al mismo canal del dispositivo electroforético (Figura 8). Dependiendo de las condiciones de electroforesis, el periodo de tiempo (23) entre dos (o más) muestras amplificadas aplicadas consecutivamente es tal que la sonda conectada amplificada de migración más lenta (19) en una muestra amplificada se detecta en la localización de detección (24), antes de que se detecte la sonda conectada amplificada de migración más rápida de una muestra amplificada aplicada posteriormente en la localización de detección (24). Por tanto, los intervalos de tiempo entre inyecciones múltiples posteriores en un canal del dispositivo se eligen de modo que las muestras aplicadas consecutivamente después de la separación no solapen en el punto de detección.

En una realización preferida, el método de la invención comprende adicionalmente las siguientes etapas:

(e1) repetir las etapas (a) a (e) para generar al menos dos muestras amplificadas;

(e2) aplicar consecutivamente al menos parte de las muestras amplificadas obtenidas en las etapas (e) y (e1), a una localización de aplicación de un canal de un dispositivo electroforético, separar electroforéticamente los amplicones en las muestras amplificadas y detectar los amplicones separados en la localización de detección localizada distal de la localización de aplicación del canal; por lo que el periodo de tiempo entre las muestras amplificadas aplicadas consecutivamente es tal que la sonda conectada amplificada de migración más lenta en una muestra amplificada se detecta en la localización de detección antes de que se detecte la sonda conectada amplificada de migración más rápida de una muestra amplificada aplicada posteriormente en la localización de detección.

El método de acuerdo con la invención permite el análisis de alto rendimiento de una multiplicidad de muestras comprendiendo cada una de ellas una multiplicidad de diferentes secuencias diana por inyección consecutiva de muestras amplificadas, que comprenden amplicones correspondientes a las secuencias diana en las muestras, en un canal de un dispositivo electroforético multicanal tal como un dispositivo de electroforesis capilar. El método de acuerdo con la invención permite el análisis de una multiplicidad de secuencias diana en una multiplicidad de muestras en una multiplicidad de canales, aumentando significativamente de este modo el rendimiento de la cantidad de muestras que puede analizarse en un marco de tiempo dado en comparación con métodos convencionales para análisis de secuencias de nucleótidos. Este método se beneficia de las muestras que contienen amplicones a detectar que son de un intervalo de tamaño de discreto por lo que el periodo de tiempo (23) entre las inyecciones sucesivas puede reducirse significativamente en comparación con métodos en los que están presentes (restos de) concatémeros.

El periodo de tiempo seleccionado evita que muestras aplicadas consecutivamente después de la separación tengan un solapamiento de amplicones en el punto de detección. El periodo de tiempo seleccionado está influido por i) la longitud de los amplicones; ii) la variación de longitud de los amplicones; iii) el dispositivo de detección y sus condiciones de funcionamiento. La aplicación de las muestras y la separación consecutiva de las muestras aplicadas en el mismo canal pueden realizarse repetidamente en uno o más canales, preferiblemente simultáneamente para permitir la separación electroforética consecutiva de múltiples muestras en un análisis de un canal y/o análisis simultáneo de múltiples muestras sobre múltiples canales y/o análisis simultáneo de múltiples muestras sobre múltiples canales realizados consecutivamente. Se proporciona una representación gráfica de ello en la Figura 8.

El periodo de tiempo entre dos muestras amplificadas cargadas consecutivamente puede determinarse experimentalmente antes de ejecutar el método. Este periodo de tiempo se selecciona de modo que, dadas las características de la muestra amplificada, especialmente la diferencia en la longitud entre los amplicones más cortos y más largos en una muestra amplificada, así como otros factores experimentales tales como el gel (matriz) y/o concentración del tampón, fuerza iónica, etc., se separen los fragmentos en una muestra amplificada a un grado tal en la localización de detección que está localiza en el extremo opuesto (distal) de la localización de aplicación donde se aplicó la muestra, que puedan detectarse individualmente los diferentes amplicones en una muestra. Después de aplicar la última muestra amplificada, puede continuarse la separación durante un periodo de tiempo adicional para permitir que los amplicones de la última muestra se separen y detecten. La combinación del periodo de tiempo seleccionado entre la aplicación de dos muestras consecutivas y el periodo de tiempo adicional opcional se elige de modo que en la localización de detección se separen los diferentes amplicones en muestras aplicadas consecutivamente de modo que puedan detectarse individualmente, a pesar de la variación de longitud limitada que existe entre los diferentes amplicones en una única muestra. Por tanto, se evitan patrones de migración solapantes cuando se aplican (se inyectan) consecutivamente muestras que contienen fragmentos de longitud variable en el dispositivo electroforético.

Usando el método de acuerdo con la invención, en principio es posible y se prefiere aplicar, cargar o inyectar muestras de forma continua. Preferiblemente, el dispositivo es capaz de realizar dicha función automáticamente, por ejemplo, controlada por un ordenador programable. Preferiblemente, el dispositivo multicanal es adecuado para dicha función o está al menos equipado para una función prolongada sin mantenimiento tal como reemplazamiento de tampones, partes, etc. Sin embargo, en la práctica generalmente éste no será el caso. Cuando una muestra final se somete generalmente es necesario continuar la separación durante un periodo de tiempo adicional hasta que el último fragmento de la muestra final se haya detectado. En una realización preferida de la invención, los rellenos presentes en las marcas de las sondas oligonucleotídicas se usan para proporcionar las diferencias de longitud (es decir, 0 a 500 nucleótidos, bases o pares de bases) entre las sondas conectadas amplificadas. La longitud total del amplicón y la variación en la longitud está dirigida principalmente por las técnicas por las que se analizan estos fragmentos. En el método de múltiple inyección de alto rendimiento de la presente invención, se prefiere que el intervalo de longitudes de amplicones en una muestra amplificada tenga una límite inferior de 40, 60, 80 ó 100 y un límite superior de 120, 140, 160 ó 180 nucleótidos, bases o pares de bases, para plataformas de electroforesis convencionales (capilar). Se prefiere particularmente que el intervalo de longitudes de los amplicones varíe de 100 a 140 nucleótidos. Sin embargo, estas cantidades están en gran medida relacionadas con los límites actuales de las técnicas actualmente conocidas. En base al conocimiento proporcionado por esta invención, los especialistas en la técnica son capaces de adaptar estos parámetros cuando se aplican otras circunstancias.

La fiabilidad de la amplificación múltiple se mejora adicionalmente limitando la variación en la longitud de las sondas conectadas amplificadas. Se prefieren limitaciones en la variación de la longitud de los amplicones para usar la inyección múltiple de forma más eficaz y se produce adicionalmente una reducción de la amplificación preferente de un amplicón más pequeño en una reacción de amplificación competitiva con sondas conectadas más grandes. Esto mejora la fiabilidad del método de alto rendimiento de la presente invención. Junto con el protocolo de inyección múltiple descrito en este documento, estas medidas, solas o en combinación, proporcionan un aumento significativo en el rendimiento en comparación con la técnica. Una mejora adicional de la capacidad de alto rendimiento se obtiene limitando la cantidad de diferentes amplicones en una muestra. Se considera más eficaz y económico limitar la capacidad de combinación de la etapa de ligamiento/amplificación en combinación con la introducción de un protocolo de inyección múltiple. Uno de los aspectos más ventajosos de la presente invención reside en la combinación de ligamiento múltiple, amplificación múltiple, preferiblemente con un único par de cebadores o con múltiples pares de cebadores que cada uno amplifica una multitud de sondas conectadas, repetidas inyecciones y detección múltiple de diferentes marcadores. Uno de los aspectos ventajosos adicionales de la presente invención reside en la aplicación combinada de diferentes longitudes con diferentes marcadores (solapantes) de modo que cada sonda conectada y por tanto cada secuencia diana en una muestra pueda caracterizarse por una única combinación de longitud y marcador. Esto permite una mejora significativa de la eficacia del análisis de secuencias diana así como una reducción significativa en los costes para cada diana analizada.

El protocolo de inyección múltiple puede realizarse en una diversidad de modos. Uno de estos es la carga múltiple de dos o más muestras en la misma matriz. Esto se considera ventajoso ya que la matriz se re-usa realizando realizaciones cortas consecutivas, aumentando de este modo la eficacia y el rendimiento. Otro es la carga múltiple de dos o más muestras en la misma matriz en la misma realización. Se prefiere re-usar la matriz realizando realizaciones cortas consecutivas. En esta realización, se inyecta y separa una primera muestra. Tan pronto como se detecta el último fragmento, se carga la siguiente muestra. Preferiblemente, entre estas dos realizaciones cortas consecutivas no se reemplaza la matriz de modo que se realizan las realizaciones en la misma matriz. Esto proporciona eficacia adicional y economía mejorada ya que se necesitan menos cambios de la matriz, reduciendo la cantidad de productos consumibles en este tipo de análisis (es decir, tampones, etc.), reduciendo el coste por dato puntual. Además, pueden evitarse los reemplazos de matriz que consumen mucho tiempo en un amplio grado, aumentando adicionalmente la eficacia del método.

En sí mismos, ciertos aspectos de la carga múltiple o inyección múltiple se han descrito, entre otros, en el documento US6156178 y el documento WO 01/04618. La última publicación describe un aparato y un método para el análisis de rendimiento aumentado de pequeños compuestos usando múltiples inyecciones espaciadas temporalmente. La publicación describe que las muestras que comprenden cebadores, extendidos en un nucleótido (extensión de cebador de un único nucleótido o SnuPE, también conocido como minisecuenciación) podrían detectarse usando múltiples inyecciones espaciadas temporalmente en un dispositivo de electroforesis capilar. La minisecuenciación se basa en la hibridación de un cebador complementario con una secuencia diana amplificada previamente. La extensión posterior del cebador con un nucleótido marcado proporcionado por separado proporciona la identificación del nucleótido adyacente al cebador. Principalmente, el producto de extensión de cebador es de longitud constante. Para aumentar el rendimiento se sugiere el uso de sucesivas inyecciones de productos de extensión de la misma longitud por realización. Para aumentar adicionalmente el rendimiento, pueden usarse cebadores de diferente longitud, que varían típicamente de 15 a 25 nucleótidos. En contraste, la presente invención contempla analizar productos de amplificación múltiple en sí mismos directamente con una variación de longitud típicamente entre 50 y 150 nucleótidos. Esto es significativamente más económico que la minisecuenciación o SnuPE como se ha indicado anteriormente en este documento porque las múltiples secuencias diana se amplifican en una única reacción, mientras que con la minisecuenciación o amplificación SnuPE se realiza individualmente para cada secuencia diana. Además, el uso de cebadores de diferente longitud y complementarios a la secuencia diana compromete la eficacia de la posterior etapa de amplificación necesaria en el método de la presente invención. Estas aplicaciones en general no abordan los problemas asociados con la detección de alto rendimiento de muestras altamente combinadas, ni proporciona soluciones a los mismos.

Exonucleasas

Un método preferido de la invención comprende adicionalmente una etapa para la retirada de sondas oligonucleotídicas que no han hibridado con las secuencias diana y/o que no están conectadas/ligadas. La retirada de dichas sondas se realiza preferiblemente antes de la amplificación, y preferiblemente por digestión con exonucleasas. Por retirada/eliminación de las sondas oligonucleotídicas que no están conectadas/ligadas puede conseguirse una reducción significativa de la amplificación de diana independiente de ligamiento (incorrecta), produciendo una proporción de señal a ruido aumentada. Una solución para eliminar uno o más de los componentes no conectados/ligados sin retirar el contenido de información de las sondas conectadas es usar una exonucleasa para digerir sondas oligonucleotídicas no conectadas/ligadas insensibles/sensibles. Los grupos de bloqueo incluyen el uso de un grupo tiofosfato y/o el uso de grupos de azúcar 2-O-metil ribosa en la estructura. Las exonucleasas incluyen Exo I (actividad 3'-5'), Exo III (actividad 3'-5') y Exo IV (actividad tanto 5'-3' como 3'-5'). Las sondas circulares de la presente invención son, una vez ligadas, insensibles a la exonucleasa, en oposición a las sondas circulares no ligadas. Esto es una ventaja adicional del uso de sondas cerradas en la presente invención.

Una ventaja del uso de exonucleasas, por ejemplo una combinación de Exo I (específica monocatenaria) y Exo III (específica bicatenaria), es la capacidad de destruir tanto la secuencia diana como las sondas oligonucleotídicas no ligadas, dejando las secuencias del producto de ligamiento sustancialmente sin digerir. Usando un tratamiento con exonucleasa antes de la amplificación, se reducen sustancialmente las sondas oligonucleotídicas en cada conjunto, y por tanto se reduce sustancialmente la hibridación de las sondas oligonucleotídicas no ligadas restantes con el ADN diana original (que está también sustancialmente reducido por el tratamiento con exonucleasa) y la formación de una secuencia del producto de ligamiento que es un sustrato adecuado para la amplificación por PCR por el conjunto de cebadores oligonucleotídicos, mejorando de este modo la proporción señal a ruido.

Marcador de tamaño

La muestra puede suministrarse con un único patrón de tamaño de fragmentos nucleotídicos que comprende uno o más fragmentos nucleotídicos de longitud conocida. Los métodos para preparar y usar patrones de tamaño nucleotídico son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook y Russel, 2001, supra). Dicho patrón de tamaño forma la base para el dimensionado apropiado de los amplicones en la muestra, y por lo tanto, para la identificación apropiada del fragmento detectado. El patrón de tamaño se suministra preferiblemente con cada muestra y/o con cada inyección. Un patrón de tamaño preferiblemente contiene una diversidad de longitudes que abarca preferiblemente la región completa de longitudes a analizar. En una realización particular de la invención, se considera ventajoso añadir patrones de tamaño flanqueantes del que pueden obtenerse los tamaños de los amplicones por interpolación. Un patrón de tamaño flanqueante es un patrón de tamaño que comprende al menos dos secuencias oligonucleotídicas marcadas de las que preferiblemente una tiene una longitud que es al menos una base más corta que la sonda conectada amplificada más corta y preferiblemente una que es al menos una base más larga que la sonda conectada amplificada más larga para permitir la interpolación y minimizar la introducción de variación de longitud adicional en la muestra. Un patrón de tamaño flanqueante preferido contiene un nucleótido que es un nucleótido más corto que la sonda conectada amplificada más corta y uno que es al menos una base más larga que la sonda conectada amplificada más larga y está marcado con al menos un colorante que es idéntico al marcador usado para marcar los amplicones contenidos en la muestra.

Un modo conveniente para ensamblar un patrón de tamaño adecuado es por síntesis química (rutinaria) de oligonucleótidos de las longitudes apropiadas, que están marcados en el extremo con un marcador adecuado. El patrón de tamaño se aplica con cada muestra aplicada consecutivamente para servir como referencia de tamaño local para dimensionar los fragmentos de muestra cargados. El patrón de tamaño puede aplicarse en el mismo canal o carril de dispositivo electroforético que la muestra a analizar, es decir junto con la muestra, o puede aplicarse en un canal paralelo o carril de un dispositivo multicanal/multicarril. El patrón de tamaño flanqueante puede marcarse con cualquiera de los marcadores usándose en el método. Si el patrón de tamaño se aplica en el mismo canal del dispositivo, los fragmentos del patrón se marcan preferiblemente con un marcador que pueda distinguirse de los marcadores usados para la detección de los amplicones en una muestra.

Combinación

En una variante de la tecnología, se combina el material de partida (ADN) de múltiples individuos de modo que se carguen menos muestras de detección que contienen este material en el dispositivo de detección. Esto puede ser ventajoso en el caso de Desequilibrio de Unión (mapeo LD) cuando el objetivo es identificar sondas conectadas amplificadas (tales como las que representan alelos SNP) que son específicas para una combinación particular de muestras de partida, por ejemplo combinaciones de material de partida derivado de individuos que tienen diferentes fenotipos para un rasgo particular.

Aplicación

Un aspecto de la invención se refiere al uso del método en una diversidad de aplicaciones. La aplicación del método de acuerdo con la invención se encuentra, aunque sin limitación, en técnicas tales como genotipado, perfilado de transcritos, mapeo genético, descubrimiento de genes, selección asistida por marcadores, control de calidad de semillas, selección híbrida, mapeo QTL, análisis segregante en masa, huella genética de ADN y análisis de microsatélites. Otro aspecto pertenece a la detección de alto rendimiento simultánea de la abundancia cuantitativa de las secuencias de ácido nucleico diana. Este enfoque es habitualmente conocido como Análisis Segregante en masa (BSA).

Detección de polimorfismos de un único nucleótido

Una aplicación particular preferida del método de alto rendimiento de acuerdo con la invención se encuentra en la detección de polimorfismos de un único nucleótido (SNP). Una primera parte complementaria a la diana de las sondas oligonucleotídicas circulares se localiza preferiblemente adyacente al sitio polimórfico, es decir, el nucleótido polimórfico único. Una segunda parte complementaria a la diana se diseña de modo que su base terminal se localice en el sitio polimórfico, es decir sea complementaria al nucleótido polimórfico único. Si la base terminal es complementaria al nucleótido presente en el sitio polimórfico en una secuencia diana, hibridará con la secuencia diana y producirá el ligamiento de las dos partes complementarias a la diana. Cuando el nucleótido final, es decir, el nucleótido específico de alelo no coincide, no sucederá ligamiento o solamente a un nivel inferior de ligamiento y el polimorfismo permanecerá indetectado.

Cuando una de las secuencias diana en una muestra se obtiene de o contiene un polimorfismo de un único nucleótido (SNP), además de las sondas específicas para ese alelo, pueden proporcionarse sondas adicionales que no solamente permiten la identificación de ese alelo, sino también la identificación de cada uno de los posibles alelos del SNP (valoración co-dominante). Para este fin puede proporcionarse una combinación de partes complementarias a la diana: una parte complementaria es igual para todos los alelos afectados y una o más de las otras partes complementarias son específicas para cada posible alelo. Estos uno o más tipos diferentes de partes complementarias contienen básicamente la misma secuencia complementaria pero difieren en cada una contiene un nucleótido, preferiblemente en el extremo, que corresponde al alelo específico. La parte específica de alelo puede proporcionarse en una cantidad correspondiente a la cantidad de diferentes alelos esperados. El resultado es que puede caracterizarse un SNP por la combinación de una parte complementaria con las otras cuatro partes complementarias (específicas de alelo), identificando los cuatros alelos teóricamente posibles (uno para A, T, C y G), incorporando secuencias de relleno de diferentes longitudes (preferidas) o diferentes marcadores en las sondas específicas de alelo.

En una realización particular, preferiblemente dirigida a la identificación de polimorfismos de un único nucleótido, la primera parte complementaria de la sonda oligonucleotídica está dirigida a una parte de la secuencia diana que no contiene el sitio polimórfico y la segunda parte complementaria de la sonda oligonucleotídica contiene, preferiblemente en el extremo distal de la primera parte complementaria, uno o más nucleótidos complementarios al sitio polimórfico de interés. Después del ligamiento de las partes adyacentes, la sonda conectada es específica para uno de los alelos de un polimorfismo de un único nucleótido.

Para identificar el alelo de sitio polimórfico en la secuencia diana, puede proporcionarse un conjunto de sondas oligonucleotídicas en el que se proporciona una primera parte complementaria y una o más segundas partes complementarias. Cada segunda parte complementaria entonces contiene un nucleótido específico en el extremo de la secuencia complementaria, preferiblemente el extremo 3', en combinación con una longitud conocida del relleno. Por ejemplo, en el caso de un polimorfismo A/C, la segunda parte complementaria puede contener un nucleótido específico T en combinación con una longitud de relleno de 2 nucleótidos y otra segunda parte complementaria para este polimorfismo combina G con una longitud de relleno de 0. Como los cebadores y las partes complementarias de las sondas son preferiblemente de la misma longitud, esto crea una diferencia de longitud de los amplicones resultantes de 2 nucleótidos. En el caso de se desee la presencia y/o ausencia de los cuatros nucleótidos teóricamente posibles del sitio polimórfico, la combinación de nucleótido específico de relleno puede adaptarse en consecuencia. En una muestra que contiene múltiples secuencias diana, amplificadas con el mismo par de cebadores de amplificación (y por tanto marcador) o con múltiples pares de cebadores de amplificación con marcadores que tienen espectros de emisión solapantes, las longitudes de relleno combinadas se eligen de modo que todas las sondas conectadas sean de una única longitud. En la Figura 4 se proporciona una ilustración de este principio de dos loci y para cada locus dos alelos. En una realización preferida este principio puede extenderse a al menos diez loci con al menos dos alelos por
locus.

Detección de secuencia diana específica

La secuencia diana contiene una secuencia de nucleótidos conocida obtenida de un genoma. Dicha secuencia no contiene necesariamente un polimorfismo, pero es por ejemplo específica para un gen, un promotor, un segmento de introgresión, o un transgén o contiene información con respecto al un rasgo de producción, resistencia a enfermedad, rendimiento, vigor del híbrido, que es indicativo de tumores u otras enfermedades y/o función génica en seres humanos, animales y plantas. Para este fin, la primera y segunda partes complementarias de la sonda circular se diseñan para que correspondan a una, preferiblemente única, secuencia diana en el genoma, asociada con la información deseada. Las partes complementarias en la secuencia diana están localizadas adyacentes entre sí. En el caso de que esté presente la secuencia diana deseada en la muestra, las sondas hibridarán de forma adyacente y después de ligamiento y la amplificación podrán detectarse.

Detección de marcadores AFLP

AFLP, su aplicación y tecnología se describen en Vos et al., Nucleic Acids Research, vol. 23 (1995) 4407-4414 así como en el documento EP-A 0 534 858 y en el documento US 6045994, todos incorporados en este documento como referencia. Para una descripción adicional de AFLP, sus ventajas, sus realizaciones, sus técnicas, enzimas, adaptadores, cebadores y compuestos adicionales, herramientas y definiciones usadas, se hace referencia explicita a los pasajes relevantes de las publicaciones mencionadas anteriormente en este documento con relación a AFLP. AFLP y su tecnología relacionada es una técnica de huella genética de ADN poderosa para la identificación de por ejemplo marcadores genéticos específicos (los llamados marcadores AFLP), que puede ser indicativo de la presencia de ciertos genes o rasgos genéticos o pueden en general usarse para comparar muestras de ADN, ADNc o ARN de origen o patrón de restricción conocido. Los marcadores AFLP están en general asociados con la presencia de sitios polimórficos en una secuencia de nucleótidos a analizar. Dicho polimorfismo puede estar presente en el sitio de restricción, y los nucleótidos selectivos, por ejemplo en forma de indels o sustituciones o en el resto del fragmento de restricción, por ejemplo en forma de indels, o sustituciones. Una vez que se ha identificado el marcador AFLP como tal, el polimorfismo asociado con el marcador AFLP puede identificarse y pueden desarrollarse sondas para su uso en el ensayo de ligamiento de la presente invención.

En otro aspecto la presente invención se refiere a una sonda de ácido nucleico circular que comprende una primera y segunda partes que son capaces de hibridar con las partes correspondientes de una secuencia diana y que comprenden adicionalmente al menos una, preferiblemente dos secuencias de unión a cebador y un relleno. Las realizaciones adicionales de la sonda de acuerdo con la presente invención son como se ha descrito anteriormente en este documento. La invención se refiere a un conjunto de sondas que comprende dos o más sondas en el que cada sonda comprende una primera parte y una segunda parte que es complementaria a parte de una secuencia diana y en el que la primera y segunda partes complementarias se localizan esencialmente adyacentes cuando hibridan con la secuencia diana y en el que cada sonda comprende adicionalmente un relleno, estando localizado dicho relleno esencialmente cerca de la parte complementaria y al menos una, preferiblemente dos secuencias de unión a cebador localizadas esencialmente adyacentes al relleno.

La invención en un aspecto adicional se refiere al uso de una sonda circular o conjunto de sondas en el análisis de al menos una secuencia de nucleótidos y preferiblemente de la detección de un polimorfismo de un único nucleótido, en el que el conjunto comprende adicionalmente al menos una sonda adicional que contiene un nucleótido que es complementario al alelo SNP conocido. Preferiblemente, el conjunto comprende una sonda para cada alelo de un polimorfismo de un único nucleótido específico. El uso de un conjunto de sondas se prefiere adicionalmente en un método para la detección de alto rendimiento de polimorfismos de un único nucleótido en el que la longitud del relleno en la sonda es específica para un locus y/o alelo de un polimorfismo de un único nucleótido.

Otro aspecto de la invención se refiere a los cebadores y en más en particular al conjunto de cebadores que comprende un primer cebador y uno o más segundos cebadores, en el que cada segundo cebador contiene un marcador y dicho segundo cebador comprende una secuencia de nucleótidos que es específica para dicho marcador.

La presente invención también encuentra realizaciones en forma de kits. Los kits de acuerdo con la invención son por ejemplo kits que comprenden sondas adecuadas para su uso en el método así como un kit que comprende cebadores, adicionalmente un kit de combinación, que comprende cebadores y sondas, preferiblemente todos equipados adecuadamente con enzimas, tampones, etc., que se proporcionan por la presente invención.

La eficacia de la presente invención puede ilustrarse del siguiente modo. Cuando se usa un dispositivo electroforético capilar con 96 canales y capaz de detectar cuatro marcadores simultáneamente, que permite 12 inyecciones posteriores por realización por canal con un periodo de tiempo seleccionado mínimo empíricamente optimizado entre las inyecciones, una muestra que contiene 20 secuencias diana de interés permite la detección de alto rendimiento de 96 (canales) * 12 (inyecciones) * 20 (dianas) * 4 (marcadores) = 92160 secuencias diana, usando el método de la presente invención. En el caso de detección de SNP co-dominante, pueden detectarse datos con respecto a 46080 SNP en una única realización.

Descripción de las figuras

Esta invención se ilustra por las figuras adjuntas. En las figuras, muchas de las características de la invención se demuestran usando dos sondas lineales que hibridan de forma adyacente. Los especialistas en la técnica apreciarán que la mayoría de estas características también se aplican a otras realizaciones descritas en este documento tales como las sondas circulares y cómo incluir esas características en las otras realizaciones tales como las sondas circulares basadas en la información proporcionada en esta solicitud.

Figura 1: Representación esquemática del ensayo de ligamiento - amplificación de oligonucleótidos, que produce sondas conectadas amplificadas.

Puede hibridarse una secuencia diana (2) que comprende una primera (5) y una segunda (7) partes a las que pueden hibridarse la primera y segunda sondas con las secciones (4) y (6) que son complementarias, respectivamente. Las sondas contienen una secuencia de marca (8, 9) que no es complementaria a la secuencia diana. La secuencia de marca puede comprender una secuencia de relleno (10, 11) y un sitio de unión a cebador (12, 13). Después de la hibridación de la sonda y el ligamiento, la sonda conectada (15) puede amplificarse usando cebadores (16, 17) capaces de hibridar con los sitios de unión de unión a cebador correspondientes. Al menos uno de los cebadores contiene un marcador (L). Los resultados de amplificación producen una muestra amplificada, que comprende amplicones (20).

Figura 2: Representación esquemática de dos sondas conectadas, en la que

(a) solamente una sonda contiene un relleno (10) y secuencias de unión a cebador (12, 13); y

(b) ambas sondas contienen un relleno (10, 11) y secuencias de unión a cebador (12, 13).

Figura 3: Representación esquemática de la combinación única de diferentes longitudes y marcadores con un perfil de elución esquemático en un canal de un dispositivo multicanal.

Figura 4: Representación esquemática del ensayo de ligamiento-ligamiento de oligonucleótidos de la presente invención. El principio se representa para dos loci 1 y 2 y para cada locus dos alelos por razones de simplicidad solamente, pero puede ampliarse fácilmente al menos 10 loci con 2 alelos cada uno. El conjunto de cebadores consta de un primer cebador (línea negra continua) y un segundo cebador (línea negra discontinua). Las sondas conectadas teóricamente posibles están representadas esquemática, junto con los cebadores. Las sondas conectadas difieren en longitud.

Figura 5: Representación esquemática del ensayo de ligamiento-ligamiento de oligonucleótidos de la presente invención. El principio se representa para dos loci 3 y 4 y para cada locus dos alelos. El conjunto de cebadores consta de un primer cebador y dos segundos cebadores. Las sondas conectadas teóricamente posibles están representadas esquemáticamente, junto con los cebadores. Las sondas conectadas difieren en longitud y en marcador.

Figura 6: Representación esquemática de los resultados de una muestra que contiene 80 sondas conectadas amplificadas con:

\bullet una diferencia de longitud entre 135 pares de bases (pb) y 97 pb para las sondas conectadas amplificadas con una longitud impar y marcadas con Marcador 1 y Marcador 3; y

\bullet una diferencia de longitud entre 134 pb y 96 pb para las sondas conectadas amplificadas con una longitud par y marcadas con Marcador 2 y Marcador 4; y

\bullet un marcador de tamaño flanqueante con oligonucleótidos de 94/95 y 136/137 (pb) que llevan el marcador 1, 2, 3 ó 4.

Figura 7: Representación esquemática del perfil de separación en un canal, sometiendo a una muestra que comprende múltiples sondas conectadas amplificadas marcadas con Marcador 1, 2, 3 y 4. Las múltiples sondas conectadas amplificadas marcadas se separan de forma detectable en el punto de detección.

Figura 8: Representación esquemática de la inyección múltiple de muestras en un canal, con una ilustración gráfica del periodo de tiempo seleccionado (23) entre la inyección de posteriores muestras y el periodo de tiempo adicional (25) después de someter la última muestra.

Figura 9: Representación esquemática del ligamiento de hasta 40 loci, y la posterior fase de amplificación detección del método. Dependiendo de la complejidad y la cantidad de loci a analizar, los puntos del procedimiento en el que puede contemplarse la combinación se indica como característica opcional (por puntos). En esta ocasión la amplificación se realiza usando un cebador directo (Directo) y para cada marcador un cebador inverso (marcador de forma diferente) (Inverso 1, 2, 3, 4). Cuando se combina las (sub)muestras de ligamiento, en principio hay dos opciones para la amplificación. Por ejemplo si las (sub)muestras derivadas de los Loci 1-10 se combinan con
(sub)muestras derivadas de los Loci 11-20 antes o después del ligamiento, la (sub)muestra combinada puede amplificarse por el cebador Directo y los cebadores Inversos 1 y 2 en una etapa o en dos etapas, primero con Directo e Inverso 1, seguido por Directo e Inverso 2 o viceversa. La detección también puede realizarse de modo similar, detectando ambos marcadores simultáneamente o primero el marcador 1, seguido por el marcador 2, opcionalmente por inyección doble.

Figura 10: A. Gel de un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos múltiple de 12 SNP del ecotipo Colombia, el ecotipo Landsberg erecta y una mezcla 50/50 de los ecotipos Colombia y Landsberg erecta.

Figura 11: A. Electroferograma parcial de la detección marcada con FAM de la muestra Colombia en un dispositivo electroforético capilar (MEGABace). Se inyectó la misma mezcla múltiple. Las sondas conectadas amplificadas en un intervalo de tamaño de 97-134 pb y los fragmentos de tamaño flanqueante (denominados S) son de 94, 95 y 137 pb. Las sondas y marcadores están todos marcados con FAM.

B. Electroferograma parcial de detección marcada con FAM de la muestra Landsberg erecta en un dispositivo electroforético capilar (MEGABace). Se inyectó la misma mezcla múltiple. Las sondas conectadas amplificadas en un intervalo de tamaño de 97-134 pb y los fragmentos marcadores flanqueantes (denominados S) son de 94, 95 y 137 pb. Las sondas y los marcadores están todos marcados con FAM.

Figura 12: A: Archivo de rastreo original de una muestra que contiene un fragmento marcado con ET-ROX de 120 pb y un fragmento marcado con NED de 124 pb. Obsérvense los marcadores FAM y JOE de otros fragmentos marcados en la muestra con la misma longitud. FAM y JOE tienen espectros de fluorescencia solapantes (ET-ROX y FAM, JOE y NED), produciendo señales solapantes (comunicación) con secuencias de longitud igual.

B: Corrección de comunicación matemática produciendo un archivo de rastreo de comunicación corregida, procesado. La comunicación se reduce, pero el resto de los espectros solapantes (FAM, JOE) están presentes, produciendo señales de falso positivo (o negativo).

C, D, E, F: representaciones de un único marcador ilustran la presencia de los remanentes (D, E) de la corrección matemática, en comparación con las señales positivas (C, F).

Figura 13 A: Representación del efecto de la retirada incompleta de comunicación de un fragmento ET-ROC de 120 pb y un fragmento NED de 124 pb, produciendo datos valorados incorrectos, en comparación con los datos teóricamente esperados.

B.: Representación del efecto del uso de la corrección de comunicación por combinaciones de longitud-marcador. Los datos valorados y los datos esperados se interpretan de forma correcta y se eliminan los datos de falso positivo o negativo.

Figura 14: Representación de una sonda circular con sitios de unión a cebador, cebadores y una sección de bloqueo opcional y su colocación relativa en la sonda circular. Después se forman los amplicones de amplificación que son representaciones de la sonda circular.

Figura 15: Representación del diseño de cebadores selectivos o anidados usados en la amplificación selectiva de una muestra de sondas circulares conectadas. La sonda circular conectada se representa esquemáticamente con un sitio de unión a cebador y nucleótidos adyacentes indicados como N. Para un ensayo de ligamiento de 24 combinaciones, se usa la amplificación selectiva con un nucleótido selectivo para visualizar la reducción a una amplificación de 6 combinaciones y ensayos de detección.

Figura 16: Amplificación con el cebador Eook+T5'-JOE de un producto de ligamiento de 10 combinaciones del conjunto 4 en la muestra 2. Se muestra la señal del canal Joe.

A. Comunicación con el canal NED causada por la amplificación de ligamiento de 10 combinaciones del conjunto 4 en la muestra 2 con el cebador Eook+T5'-JOE (véase A). Se ha omitido la señal NED.

B. Señal del canal NED causada por la amplificación con el cebador Eook+T5'-JOE y una amplificación con E00k marcada con NED de un ligamiento de 10 combinaciones del conjunto 4 de la muestra 2 (véase A). Como la señal de 5'+T E00k-Joe en NED difiere en 1 pb, pueden distinguirse estos dos picos. X significa comunicación del colorante fluorescente Joe en el canal Ned (correspondiente a la señal en B).

C. Amplificación de un ligamiento de 10 combinaciones del conjunto 4 en la muestra 2 realizada usando un cebador de amplificación E00k marcado con NED y un cebador marcado con 5'-T E00k JOE y los productos de reacción se combinaron para la detección en el MegaBACE. Se muestra la señal no procesada en el canal NED. Como los productos marcados con JOE difieren en una pb en longitud, pueden distinguirse los picos de NED y JOE en el canal NED.

D. Los mismos productos de reacción mostrados en C pero después de procesar los datos originales, es decir, después de la retirada de la comunicación. La diferencia de tamaño de 1 pb de los productos 5'T E00k JOE evita la valoración errónea causada por la comunicación de las señales JOE en el canal NED como se muestra en las Figura 16 A, B y C.

Todas las señales de A, B, C y D se obtienen después del procesamiento por el software Genetic Profiler versión 1 de Molecular Dynamics. La señal mostrada en D se corrige para la comunicación y por tanto muestra señales procesadas. Las señales en A, B y C son los datos originales y no están corregidos para la comunicación.

Figura 17:

A. Análisis de la amplificación de E00k marcado con 5'+T Joe y FAM de los productos de ligamiento del conjunto 4 para la muestra 5 (G05 capilar) y 6 (G06 capilar). El tiempo de realización fue 40 minutos.

B. Segundo análisis de la amplificación de E00k marcado con 5'+T Joe y FAM de los productos de ligamiento del conjunto 4 para la muestra 5 (G05 capilar) y 6 (G06 capilar). Esta realización se realiza directamente después de la mostrada en A, en la misma matriz. El tiempo de realización fue 40 minutos.

Figura 18:

Amplificación selectiva de 3 conjuntos de un ligamiento de 40 combinaciones para los conjuntos 1, 2, 4 y 5 de la muestra 3.

A. Amplificación selectiva del conjunto 1 con E01k-Ned y M01k.

B. Amplificación selectiva del conjunto 2 con E03k-5'+T-JOE y M04k.

C. Amplificación selectiva del conjunto 5 con E04k-Fam y M03k.

Todos los canales son visibles. Queda claro que es posible amplificar un conjunto específico de un producto de ligamiento múltiple para más conjuntos.

Ejemplos I. Diseño de la secuencias de relleno

Para evitar la hibridación cruzada entre los productos de amplificación, se prefiere que las secuencias de relleno sean diferentes y no formen horquillas. En las tablas 1-5, se presentan secuencias de relleno que pueden usarse para el desarrollo de sondas para cada colorante fluorescente, y se han verificado para la ausencia de horquillas usando Primer Designer versión 2.0 (copyright 1990, 1991, software Científico y Educativo). Las secuencias de relleno se ensamblan a partir de bloques tetraméricos elegidos aleatoriamente que contienen una G, C, T y A, y por lo tanto tienen por definición un contenido en GC del 50%. La secuencia de relleno en la sonda OLA directa para los dos alelos SNP se mantiene idéntica para evitar la amplificación de alelo SNP preferente.

TABLA 1 Longitudes de las secuencias de relleno

2

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TABLA 2 Secuencias de relleno para sondas ET-ROX (5'-3')

3

4

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TABLA 3 Secuencias de relleno para sondas JOE (5'-3')

5

TABLA 4 Secuencias de relleno para sondas FAM (5'-3')

6

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TABLA 5 Secuencias de relleno para sondas NED (5'-3')

7

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8

II. Ejemplos de ensayo de ligamiento múltiple y detección

Ejemplo 1

Descripción de materiales biológicos y aislamiento de ADN

Se usaron líneas endogámicas recombinantes (RI) generadas a partir de un cruce entre Arabidopsis ecotipos Colombia y Landsberg erecta (Lister y Dean, Plant, Journal, 4, pág. 745-750, (1993). Se obtuvieron semillas de la línea parental y RI del Nottingham Arabidopsis Stock Centre.

Se aisló el ADN del material de plantas de semillero individuales usando métodos conocidos per se, por ejemplo esencialmente como se describe en el documento EP-0534858, y se almacenaron en solución IX TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 que contenía EDTA 1 mM). Se determinaron las concentraciones por medida de UV en un espectrofotómetro (MERK) usando procedimientos convencionales, y se ajustaron a 100 ng/\mul usando 1X TE.

Ejemplo 2

Selección de SNP de Arabidopsis

Los SNP de Arabidopsis que se seleccionaron de The Arabidopsis Information Resource (TAIR) sitio web:
http://www.arabidopsis.org/SNPs.html, se resumen en la Tabla 6.

TABLA 6 SNP seleccionados de Arabidopsis thaliana

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Ejemplo 3

Diseño de sonda oligonucleotídica para la reacción de ligamiento de oligonucleótidos

Las sondas oligonucleotídicas (orientación 5'-3') se seleccionaron para discriminar los alelos SNP para cada uno de los 12 loci SNP descritos en el Ejemplo 2. Las regiones de unión a PCR están subrayadas, las secuencias de relleno están doblemente subrayadas. Los cebadores inversos están fosforilados en el extremo 5': p indica fosforilado. Las secuencias se resumen en la Tabla 7.

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11

12

13

Ejemplo 4

Diseño de los cebadores de amplificación por PCR

Las secuencias del cebador usado para la amplificación por PCR eran complementarias a las regiones de unión a cebador de PCR incorporadas en las sondas de ligamiento descritas en el Ejemplo 3. Las secuencias representan los llamados cebadores directo M13 e inverso M13. Habitualmente el cebador directo está marcado con FAM o \delta^{33}P-dATP dependiendo de la plataforma de detección. La secuencia de los cebadores en orientación 5'-3' es:

: Directo M13: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC [SEC ID Nº 37]

: Inverso M13: AGCGGATAACAATTTCACACAGGA [SEC ID Nº: 38]

La concentración de estos oligos se ajustó a 50 ng/\mul

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Ejemplo 5

Tampones y Reactivos

La composición de los tampones era: tampón de hibridación (1X), Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, MgCl_{2} 5 mM, KCl 100 mM, DTT 10 mM, tampón de ligamiento NAD+ 1 mM (1X) Tris-HCl 20 mM pH 7,6, Kac 25 mM, MgAc_{2} 10 mM, DTT 10 mM, NAD+ 1 mM, tampón de PCR Triton-X100 al 0,1% (10X); tampón de PCR 10x (contiene MgCl_{2} 15 mM). (Qiagen, Valencia, Estados Unidos de América). No se usaron adiciones en la PCR.

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Ejemplo 6

Ligamiento y Amplificación Reacciones de ligamiento

Las reacciones de ligamiento se realizaron del siguiente modo: se desnaturalizaron por calor 100 ng de ADN genómico (1 \mul de 100 ng/\mul) en un volumen total de 5 \mul por incubación durante 5 minutos a 94ºC y se enfriaron en hielo. A continuación se añadieron 4 \mumol de cada sonda directa e inversa OLA descrita en el Ejemplo 3 (36 oligonucleótidos en total), y se incubó la mezcla durante 16 horas a 60ºC. A continuación, se añadió 1 unidad de Taq Ligasa (NEB) y se incubó la mezcla durante 15 minutos a 60ºC.

A continuación, la ligasa se inactivó por calor por incubación durante 5 minutos a 94ºC y se almacenó a -20ºC hasta su uso adicional.

Amplificación por PCR

Las mezclas de reacción de PCR contenían 10 \mul de mezcla de ligamiento, 1 \mul de 50 ng/\mul de cebador directo e inverso M13 marcado (FAM o ^{33}P) (como se describe en el Ejemplo 4), 200 \muM de cada dNTP, 2,5 Unidades de HotStarTaq Polimerasa Qiagen, 5 \mul de tampón PCR 10X en un volumen total de 50 \mul.

Las amplificaciones se realizaron por ciclos térmicos en un termociclador Perkin Elmer 9700 (Perkin Elmer Cetus, Foster City, Estados Unidos de América), de acuerdo con el siguiente perfil de ciclos térmicos:

Perfil 1: Desnaturalización inicial/activación enzimática 15 minutos a 94ºC, seguido por 35 ciclos de: 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC, 1 minuto a 72ºC, y una extensión final de 2 minutos a 72ºC, 4ºC, siempre.

Perfil 2: Desnaturalización inicial/activación enzimática 15 minutos a 94ºC, seguido por 35 ciclos de: 5 segundos

En el caso de que se usara cebador de PCR directo M13 marcado en el extremo con ^{33}P, el marcaje se realizó por quinación como se describe en Vos et al., 1995 (Nucleic Acids Research, vol. 23. nº 21, pág. 4407-4414, 1995 y Patente Nº EP0534858).

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Ejemplo 7

Detección radiactiva de productos SNPWave de 12 combinaciones

La Figura 10 muestra un gel electroforético de un ensayo de ligamiento de oligonucleótidos múltiple de los 12 SNP de Arabidopsis enumerados en el Ejemplo 2. Siguiendo los procedimientos descritos anteriormente, usando ADN de ecotipo Colombia (C), Landsberg erecta (L) o una mezcla de cantidades iguales de ambos ecotipos (C+L) como material de partida.

La Figura 10 muestra que los alelos apropiados de los SNP SGCSNP164, SGCSNP119, SGCSNP69, SGCSNP29, SGCSNP27 y SGCSNP1 se observan claramente en la muestra de Colombia, y los alelos SNP apropiados de los loci de SNP SGCSNP168, SGCSNP164, SGCSNP119, SGCSNP69, SGCSNP29, SGCSNP27 y SGCSNP1 se observan claramente en la muestra Landsberg y que todos estos alelos SNP juntos se observan en la mezcla de ambas
muestras.

Este Ejemplo ilustra que al menos seis SNP pueden ligarse simultáneamente y amplificarse usando el procedimiento de ligamiento/amplificación múltiple. Este ejemplo ilustra adicionalmente que pueden detectarse al menos 12 SNP en una muestra. Los resultados se representan en la Tabla 8.

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TABLA 8

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14

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Ejemplo 8

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel se realizó como se describe en Vos et al., Nucleic Acids research 23(21), (1995), 4407-4414. Después de la exposición del gel seco a pantallas de fosfoimágenes (Fuji Photo Film Co., LTD, tipo BAS III) durante 16 horas, se obtuvo una imagen por exploración usando el escáner Fuji (Fuji Photo Film Co., LTD, Fujix BAS 2000) y se almacenó en forma digital.

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Ejemplo 9

Marcadores de tamaño oligonucleotídicos para electroforesis capilar

16

17

18

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Ejemplo 10

Purificación y dilución de las sondas conectadas amplificadas

En el caso de detección usando el instrumento de secuenciación capilar MegaBACE 1000, se realizó desalación y purificación de las mezclas de las reacciones de PCR en un formato de 96 pocillos, usando el siguiente
procedimiento.

A. Preparación de las placas de purificación en Sephadex de 96 pocillos

Se cargó Sephadex^{TM} G-50 superfino seco (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) en los pocillos de una placa de 96 pocillos (MultiScreen®-HV, Millipore Corporation, Bedford, MA, Estados Unidos), usando el cargador de columna de 45 microlitros (Millipore Corporation) del siguiente modo:

1. Se añadió Sephadex G-50 superfino al cargador de columna.

2. Se retiró el exceso de Sephadex de la parte superior del cargador de columna con un raspador.

3. Se colocó la placa Multiscreen-HV boca abajo en la parte superior del cargador de columna.

4. Se volvió a invertir la placa Multiscreen HV y el cargador de columna.

5. Se liberó el Sephadex G-50 golpeando suavemente la parte superior o en el lateral del cargador de columna.

A continuación, se hinchó el Sephadex G-50 y se aclaró del siguiente modo.

6. Se añadieron 200 \mul de agua Milli-Q por pocillo usando un pipeteador multicanal.

7. Se colocó un tramo de alineación de centrífuga en la parte superior de una microplaca de 96 pocillos convencional, se colocó la placa Multiscreen-HV en la parte superior y se compactaron las microcolumnas por centrifugación durante 5 minutos a 900 g.

8. Se vacío la placa de 96 pocillos y se volvió a colocar.

9. Se repitieron una vez las etapas 5-7.

10. Se añadieron 200 \mul de agua Milli-Q a cada pocillo para hinchar el Sephadex G-50 y se incubó durante 2-3 horas. Ocasionalmente, en esta fase las placas Multiscreen-HV con mini-columnas hinchadas de Sephadex G-50 superfino se precintaron fuertemente con parafina y se almacenaron en un refrigerador a 4ºC hasta su uso adicional.

11. Se colocó un tramo de alineación de centrifuga en la parte superior de una microplaca de 96 pocillos convencional, se colocó la placa Multiscreen HV en la parte superior del ensamblaje y se compactaron la minicolumnas por centrifugación durante 5 minutos a 900 g.

12. Se retiró la microplaca de 96 pocillos.

13. Se añadieron cuidadosamente las mezclas que contenían las sondas conectadas amplificadas al centro de cada pocillo.

14. Usando el tramo de alineación de centrífuga se colocó la placa Multiscreen HV en la parte superior de una nueva placa de microtitulación de fondo en U convencional y se realizó la centrifugación durante 5 minutos a 900 g.

15. El producto eluído en la placa de 96 pocillos convencional (aproximadamente 25 \mul por pocillo) contiene el producto purificado.

B. Dilución de los productos purificados

Las muestras purificadas se diluyeron 25-75 veces en agua Mili-Q antes de la inyección.

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Ejemplo 11

Electroforesis capilar en el MegaBACE Preparación de las muestras

Se hizo una dilución de 800 veces del patrón de tamaño ET-900 Rox (Amersham Pharmacia Biotech) en agua. Se añadieron 8 \mul de ET-900 Rox diluido a 2 \mul de la muestra purificada. Antes de la realización, la muestra que contenía el patrón de tamaño se desnaturalizó por calor por incubación durante 1 minuto a 94ºC y posteriormente se puso en hielo.

Detección en el MegaBACE

Se cargaron los capilares MegaBACE con matriz LPA 1X (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los parámetros para la inyección electrocinética de las muestras fueron los siguientes: 45 segundos a 3 kV. Los parámetros de la realización fueron 110 min a 10 kV. Después de la realización, se realizó la corrección de la comunicación y el suavizado de los picos usando el software Genetic Profiler, versión 1.0 build 20001017 (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, Estados Unidos), y se generaron electroferogramas.

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Ejemplo 12

Inyección repetida del MegaBACE

El intervalo de tiempo mínimo para la separación adecuada entre dos muestras inyectadas consecutivamente se determinó inyectando la muestra del marcador de tamaño como se describe en el Ejemplo 8. Se usó el intervalo de tiempo resultante, con un pequeño margen adicional, cuando se inyectaban las sondas conectadas amplificadas purificadas del ensayo de oligonucleótidos. Los resultados se representan en la Figura 11.

A. Electroferograma parcial de detección marcada con FAM de la muestra Colombia en un dispositivo electroforético capilar (MegaBACE). La misma mezcla múltiple se inyectó dos veces. Las sondas conectadas amplificadas (intervalo de tamaño 97-134 pb) y los fragmentos marcadores de tamaño flanqueantes (94, 95 y 137 pb) están todos marcados con FAM.

B. Electroferograma parcial de la detección marcada con FAM de la muestra Landsberg erecta en un dispositivo electroforético capilar (MegaBACE). La misma mezcla múltiple se inyectó dos veces. Las sondas conectadas amplificadas (intervalo de tamaño 97-134 pb) y los fragmentos marcadores de tamaño flanqueantes (94, 95 y 137) están todos marcados con FAM.

Ejemplo 13

Reducción de la comunicación usando secuencias de relleno de diferentes longitudes

En este experimento se demuestra el uso de diferentes combinaciones longitud-marcador para evitar la influencia negativa de la retirada incompleta de la comunicación en la calidad de los conjuntos de datos de valores dominantes (presencia/ausencia) de marcadores SNP. Las longitudes de relleno se eligieron de modo que los fragmentos marcados con ET-ROX y JOE tuvieran tamaños idénticos, y que los fragmentos FAM y NED tuvieran tamaños idénticos, pero difiriendo en 1 par de bases de los fragmentos marcados con ET-ROX y JOE. El resultado es que incluso en el caso de una retirada incompleta de la comunicación entre los colorantes con espectros de emisión solapantes, la señal observada no producirá una valoración incorrecta porque los tamaños esperados de los productos de amplificación son conocidos para cada marcador. Por tanto, las combinaciones longitud-marcador definen los patrones esperados para señales genuinas que son señales que se originan a partir de una corrección incompleta de la comunicación. Los resultados se presenta en la Figura 12 y 13.

El ejemplo muestra en la Figura 13:

A). El efecto de la retirada incompleta de la comunicación en la calidad de los datos en el caso de una muestra que contiene un fragmento marcado con ET-ROX de 120 pares de bases y un fragmento marcado con NED de 124 pares de bases en una situación en la que los fragmentos de un tamaño de particular pueden observarse en combinación con todos los marcadores. En este caso, la retirada incompleta de la comunicación de la señal ET-ROX en el canal FAM a 120 pb conduce a la incorrecta valoración de un fragmento FAM de 120 pares de bases (en realidad un fragmento marcado con ET-ROX de 120 pares de bases). De forma similar, la corrección incompleta de la comunicación de la señal NED en JOE a 120 pb conduce a la valoración incorrecta de un fragmento JOE de 124 pb (en realidad un fragmento marcado con NED de 124 pares de bases), además de los fragmentos correctos.

B). El efecto del uso de combinaciones longitud-marcador optimizadas para la comunicación de modo que los fragmentos marcados con ET-ROX y FAM de la misma longitud no se eviten eligiendo diferentes longitudes de relleno, porque sus espectros de emisión solapan. De forma similar, los fragmentos de sondas conectadas amplificadas del mismo tamaño marcados con JOE y NED se evitan. En el caso de una muestra hipotética que contenga un fragmento marcado con ET-ROX de 120 pb y un fragmento marcado con NED de 124 pb (idéntico al descrito anteriormente en A), las señales pequeñas pero detectables (picos) de FAM a 120 pb y de JOE a 124 pb que permanecen después de la corrección incompleta (matemática) de la comunicación no se valorarán porque se sabe que se originan de la comunicación de las señales ET-ROX y NED, respectivamente. Por tanto, no hay influencias sobre la calidad de los datos y ambos fragmentos se valoran correctamente.

Ejemplo 14

Identificación de SNP

Los SNP seleccionados se identifican y resumen en la Tabla 9.

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(Tabla pasa a página siguiente)

19

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28

Ejemplo 15

Las sondas oligonucleotídicas circulares (orientación 5'-3') se seleccionaron para discriminar los alelos SNP para cada uno de los loci SNP descritos en el Ejemplo 14. Las regiones de unión a PCR están subrayadas, las secuencias de relleno están doblemente subrayadas. Los cebadores inversos están fosforilados en el extremo 5': p indica fosforilado. Las secuencias se resumen en la Tabla 10.

29

30

31

32

33

34

35

36

Ejemplo 16

Diseño de los cebadores de amplificación por PCR

La secuencia de uno de los cebadores usados para la amplificación por PCR era complementaria a las regiones de unión a cebador de PCR incorporadas en las sondas de ligamiento descritas en el Ejemplo 15. La secuencia del segundo cebador de PCR coincidía con la región de unión a cebador de PCR de la sonda. Habitualmente el cebador directo está marcado. La concentración de los oligonucleótidos se ajustó a 50 ng/\mul. La secuencia de los cebadores en orientación 5'-3' se representa en la Tabla 11.

TABLA 11 Cebadores de amplificación por PCR

37

Ejemplo 17

Ligamiento y amplificación

Se sometieron 9 muestras (muestras 1-9) de líneas de tomate homocigóticas (Ejemplo 14) a una reacción de ligamiento de oligonucleótidos múltiple usando una mezcla de 20 sondas cerradas (conjunto 4). Las condiciones usadas fueron tampón de ADN ligasa Taq 1x (NEB), 0,2 U/\mul de ADN ligadas Taq, y 0,05 \mumol/\mul de cada sonda en un volumen de 10 \mul. El ligamiento se realizó en un termociclador (Perkin Elmer) con las siguientes condiciones de ciclo: 2 minutos a 94ºC + 10* (15 segundos a 94ºC + 60 minutos a 60ºC) + 4ºC continuamente. Después del ligamiento, se diluyeron los 10 \mul del producto de ligamiento con 30 \mul de tampón de ADN ligasa Taq 1x. Los 40 \mul de cada reacción se usaron para realizar 4 reacciones de amplificación usando 4 diferentes cebadores E00k marcados combinados cada uno con M00k. El cebador E00k marcado con ET-ROX y JOE se diseñó con 1 pb adicional en comparación con la longitud de E00k marcado con FAM y NED, para evitar la posible comunicación entre los marcadores fluorescentes cuando se analizan estos productos en el MegaBACE. Las condiciones usadas fueron 30 ng de cebador E00k marcado y 30 ng de cebador M00k, tampón Accuprime I 1x, 0,4 \mul de polimerasa Accuprime (Invitrogen) en 10 \mul de producto de ligamiento diluido en una reacción de PCR de 20 \mul. Se realizó la PCR en un termociclador con las siguientes condiciones de ciclo: dos minutos a 94ºC + 35* (15 segundos 94ºC + 30 segundos a 56ºC + 60 segundos a 68ºC) + 4ºC continuamente. El producto de PCR se purificó usando Sephadex 50 y se diluyó 80 veces con MQ. El producto de PCR diluido se analizó en el MegaBACE. Los diferentes productos marcados con fluorescencia se procesaron por separado y en diferentes combinaciones (2, 3 y 4 colorantes fluorescentes). Los resultados se presentan en la Figura 16.

Ejemplo 18

Uso de combinación de longitud/colorante y el principio de inyección repetida en combinación con la reutilización de la matriz LPA

Los productos de amplificación del conjunto 4 se analizaron usando realizaciones consecutivas sin reemplazamiento de la matriz LPA entre las realizaciones. Las muestras de los productos de amplificación se inyectaron después de un periodo de procesamiento de 40 minutos sin cambiar la matriz. Los resultados se presentan en la Figura 17. Pueden realizarse realizaciones consecutivas sin cambiar la matriz y sin pérdida significativa de la calidad de los datos.

Ejemplo 19

Amplificación selectiva de una muestra de ligamiento múltiple

Este experimento demuestra la posibilidad de una combinación mayor de ligamiento de oligonucleótidos, en combinación con la amplificación selectiva de un subconjunto de los productos de ligamiento formados usando cebadores de amplificación (AFLP) con nucleótidos selectivos.

Usando los 4 conjuntos de sondas diseñadas, los cebadores se basan en el conjunto 1, 2, 4 y 5 pero con nucleótidos selectivos adicionales localizados inmediatamente 3' de los sitios de unión a cebador en la sondas.

Cada conjunto se ligó por separado, y en combinación con otros conjuntos, hasta una combinación de 40 en base a los 4 conjuntos juntos. Se realizaron amplificaciones AFLP+1/+1 usando diferentes cebadores E00k marcados usando el esquema representado a continuación.

38

Las condiciones usadas fueron tampón de ADN ligasa Taq 1x (NEB), 0,2 U/\mul de ADN ligasa Taq y 0,05 \mumol/\mul de cada sonda en un volumen de 10 \mul. El ligamiento se realizó en un termociclador (Perkin Elmer) con las siguientes condiciones de ciclo: 2 minutos a 94ºC + 10* (15 segundos a 94ºC; 60 minutos a 60ºC) + 4ºC continuamente. Después del ligamiento, se diluyeron los 10 \mul del producto de ligamiento con 30 \mul de tampón de ADN ligasa Taq 1x. Las condiciones usadas fueron 30 ng de cebador E0k marcado y 30 ng de cebador M00k, tampón Accuprime I 1x (Invitrogen), 0,4 \mul de polimerasa Accuprime (Invitrogen) en 10 \mul de producto de ligamiento diluido en una reacción de PCR de 20 \mul. La PCR se realizó en un termociclador con las siguientes condiciones de ciclo: 2 minutos a 94ºC + 35* (15 segundos a 94ºC + 30 segundos a 56ºC + 6 segundos a 68ºC) + 4ºC continuamente. El producto de PCR se purificó usando Sephadex 50 y se diluyó 80 veces con MQ. El producto de PCR diluido se analizó en el Megabace. Los diferentes productos marcados con fluorescencia

\hbox{se procesaron en capilares diferentes. Los
resultados se presentan en la Figura 18.}

Composiciones de tampón:

Tampón de ADN ligasa Taq 1x

: Tris HCl 20 mM

: Acetato potásico 25 mM

: Acetato de magnesio 10 mM

: DTT 10 mM

: NAD 1 mM

: Tritón X 100 al 0,1%

: (pH 7,6 a 25ºC)

Tampón de ADN polimerasa Taq AccuPrime 1x

: Tris HCl 20 mM (pH 8,4)

: KCl 50 mM

: MgCl_{2} 1,5 mM

: dGTP, dATP, dTTP y dCTP 0,2 mM

: Proteína AccuPrime ^{TM} termoestable

: Glicerol al 10%

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<110> Keygene N.V.

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<120> Análisis y detección de múltiples secuencias diana usando sondas circulares

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<130> P205833PCT

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<140> P205833PCT

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<141> 16-12-2002

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<150> EP 01204912.8

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<151> 14-12-2001

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<160> 219

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 1

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40

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<210> 2

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 2

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41

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<210> 3

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 3

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42

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<210> 4

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 4

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43

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<210> 5

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 5

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44

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<210> 6

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<211> 53

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 6

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45

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<210> 7

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 7

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46

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<210> 8

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 8

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47

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<210> 9

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<211> 57

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 9

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48

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<210> 10

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 10

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49

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<210> 11

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 11

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50

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<210> 12

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<211> 61

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 12

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51

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<210> 13

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 13

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52

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<210> 14

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 14

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53

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<210> 15

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<211> 65

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 15

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54

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<210> 16

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<211> 49

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 16

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55

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<210> 17

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> artificial

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<212> ADN

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<400> 209

243

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<210> 210

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<211> 90

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 210

244

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<210> 211

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<211> 88

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 211

245

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<210> 212

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<211> 86

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 212

246

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<210> 213

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<211> 84

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 213

247

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<210> 214

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<211> 82

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 214

248

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<210> 215

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<211> 16

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 215

249

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<210> 216

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<211> 16

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 216

250

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<210> 217

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 217

251

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<210> 218

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 218

252

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<210> 219

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> artificial

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<400> 219

253

Claims

1. Un método para determinar la presencia o ausencia de una secuencia diana en una muestra de ácido nucleico, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar a una muestra de ácido nucleico al menos una sonda circularizable para cada secuencia diana a detectar en la muestra, por lo que la sonda tiene una primera sección específica de diana en su extremo 5' que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana y una segunda sección específica de diana en su extremo 3' que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana, por lo que la primera y segunda partes de las secuencias diana están localizadas adyacentes entre sí, y por lo que la sonda comprende adicionalmente una sección de marca que es esencialmente no complementaria a la secuencia diana, por lo que la sección de marca puede comprender una secuencia de relleno y por lo que la sección de marca comprende al menos una secuencia de unión a cebador;

(b) permitir que la primera y segunda secciones específicas de diana de la sonda circular hibriden con la primera y segunda partes de las secuencias diana por lo que la primera y segunda secciones específicas de diana de la sonda hibridan adyacentes en la secuencia diana;

(c) proporcionar un medio para el ligamiento de la primera y segunda secciones específicas de diana hibridadas de forma adyacente a la secuencia diana y permitir que en la primera y segunda secciones específicas de diana conecten, para producir una sonda circular ligada, correspondiente a una secuencia diana en la muestra;

(d) proporcionar al menos un primer cebador que es complementario a la secuencia de unión a cebador, y una enzima polimerasa;

(e) amplificar la mezcla resultante para producir una muestra amplificada que comprende amplicones que son representaciones lineales de las sondas circulares ligadas;

en el que al menos una sonda circularizable contiene una sección de bloqueo que comprende un grupo de bloqueo que está localizado adyacente al extremo 3' del sitio de unión al cebador, de modo que la sección de bloqueo detiene la elongación o amplificación del cebador hibridado con la sonda circularizada, generando de este modo una representación lineal de la sonda circular y de modo que el grupo de bloqueo se excluya de la elongación o amplificación del cebador.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que un amplicón en una muestra amplificada que correspondiente a una secuencia diana en una muestra difiere en la longitud de un amplicón en la muestra amplificada correspondiente a un secuencia diana diferente en la muestra, en el que la diferencia en la longitud se proporciona por las secuencias de relleno de diferente de longitud incorporadas en la sonda.

3. Un método de acuerdo con la reivindicaciones 1-3, en el que el amplicón tiene una longitud que corresponde a la longitud de la sonda circular conectada.

4. Un método de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que la diferencia de longitud se proporciona por la longitud de la secuencia de relleno.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dos sondas circulares diferentes contienen el mismo sitio de unión a cebador capaz de hibridar con una única secuencia cebadora.

6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el cebador comprende un marcador.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1-6, en el que el cebador contiene un cebador universal que tiene una sección que es complementaria a la secuencia de unión a cebador y contiene adicionalmente al menos un nucleótido selectivo en su extremo 3'.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:

(a) se proporcionan al menos dos grupos de sondas oligonucleotídicas circularizables en una muestra, por lo que cada grupo de sondas oligonucleotídicas circularizables tiene secuencias de marca con al menos un sitio de unión a cebador específico de grupo;

(b) las sondas circulares ligadas de cada grupo se amplifican a partir de un primer cebador donde al menos un cebador es complementario al sitio de unión a cebador específico de grupo, y por lo que al menos uno de los cebadores de un grupo comprende un marcador específico de grupo; y

(c) en cada grupo, una sonda ligada amplificada correspondiente a una secuencia diana en la muestra, difiere en la longitud de una sonda ligada amplificada correspondiente a una diferente secuencia diana en la muestra;

en el que la diferencia en la longitud se proporciona por el uso de secuencias de relleno incorporadas en la sonda de diferente longitud.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, por el que se produce una primera parte de los grupos de sondas ligadas amplificadas que tienen una cantidad par de nucleótidos y se produce una segunda parte de los grupos de sondas ligadas amplificadas que tienen un número impar de nucleótidos.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los grupos de sondas amplificadas ligadas que tienen una cantidad par de nucleótidos y los grupos de sondas amplificadas ligadas que tienen una cantidad impar de nucleótidos están marcados con marcadores fluorescentes que tienen al menos solapamiento en sus espectros de emisión.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que se producen un primer y segundo grupos de sondas amplificadas ligadas que tienen una cantidad par de nucleótidos y se producen un tercer y cuarto grupos de sondas amplificadas ligadas que tienen una cantidad impar de nucleótidos y por lo que el primer y segundo grupos están marcados con FAM y NED, respectivamente, y el tercer y cuarto grupos están marcados con (ET)-ROX y JOE o HEX, respectivamente; o por lo que el primer y segundo grupos están marcados con (ET-)ROX y JOE o HEX, respectivamente, y el tercer y cuarto grupos están marcados con FAM y NED, respectivamente.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones preferentes, en el que la sonda circularizable comprende adicionalmente un segundo sitio de unión a cebador.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la sección de bloqueo que detiene la elongación del cebador comprende un grupo de bloqueo, y en el que el grupo de bloqueo está localizado entre los dos sitios de unión a cebador, adyacente al extremo 3' del sitio de unión al cebador directo y adyacente al extremo 5' del sitio de unión al cebador inverso de modo que el grupo de bloqueo se excluya de la elongación o amplificación del cebador.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la polimerasa no expresa actividad de desplazamiento de cadena significativa.

15. Método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las siguientes etapas:

(a) (e1) repetir las etapas (a) a (e) para generar al menos dos muestras amplificadas;

(b) (e2) aplicar consecutivamente al menos parte de las muestras amplificadas obtenidas en las etapas (e) y (e1), a una localización de amplificación de un canal de un dispositivo electroforético, separar electroforéticamente los amplicones en las muestras amplificadas y detectar los amplicones separados en una localización de detección localizada distal de la localización de aplicación del canal; por lo que el periodo del tiempo entre las muestras amplificadas aplicadas consecutivamente es tal que la sonda conectada amplificada de migración más lenta en una muestra amplificada se detecta en la localización de detección antes de que se detecte la sonda conectada amplificada de migración más rápida de una muestra amplificada aplicada posteriormente en la localización de detección.

16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos diana contiene un polimorfismo, preferiblemente un polimorfismo de un único nucleótido.

17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la secuencia de nucleótidos diana es una molécula de ADN seleccionada entre grupo compuesto por: ADNc, ADN genómico, fragmentos de restricción, fragmentos de restricción ligados a adaptadores, fragmentos de restricción ligados a adaptadores amplificados y fragmentos AFLP.

18. Uso de un método definido en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para la detección de alto rendimiento de una multiplicidad de secuencias de nucleótidos diana.

19. Uso de un método de acuerdo con la reivindicación 18, para la detección de polimorfismos, preferiblemente polimorfismos de un único nucleótido.

20. Uso de un método de acuerdo con la reivindicación 19, para perfilar el transcrito.

21. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, para la detección de la abundancia cuantitativa de secuencias de ácido nucleico diana.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, para el mapeo genético, descubrimiento de genes, selección asistida por marcador, control de calidad de semillas, selección de híbridos, mapeo QTL, análisis segregante en masa, huella genética de ADN para describir información relacionada con rasgos, resistencia a enfermedades, producción, vigor del híbrido, y/o función genética.

23. Sonda de ácido nucleico circularizable que comprende una primera sección específica de diana en su extremo 5' que es complementaria a una primera parte de una secuencia diana y una segunda sección específica de diana en su extremo 3' que es complementaria a una segunda parte de la secuencia diana, por lo que la sonda comprende adicionalmente una sección de marca que es esencialmente no complementaria a la secuencia diana, por lo que la sección de marca puede comprender una secuencia de relleno y por lo que la sección de marca comprende al menos una secuencia de unión a cebador, en la que la sección de marca contiene adicionalmente una sección de bloqueo que comprende un grupo de bloqueo que está localizado adyacente al extremo 3' del sitio de unión a cebador de modo que la sección de bloqueo es capaz de detener la elongación o amplificación de cualquier cebador hibridado con dicha sonda de ácido nucleico circularizable.

24. Una sonda de ácido oligonucleotídico circularizable de acuerdo con la reivindicación 23 para su uso en un método definido en las reivindicaciones 1-16.

25. Un conjunto de dos o más sondas oligonucleotídicas circularizables de acuerdo con la reivindicación 23, para su uso en un método definido en las reivindicaciones 1-16.

26. Uso de un conjunto de dos o más sondas oligonucleotídicas definidas en la reivindicación 23, en el que el conjunto comprende una sonda para cada alelo de un polimorfismo de un único nucleótido.

27. Un conjunto de cebadores, junto con una sonda o conjunto de sondas como se define en las reivindicaciones 23-26 para su uso en un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, comprendiendo el conjunto de cebadores un primer cebador y uno o más segundos cebadores, en el que cada segundo cebador contiene un marcador.

28. Un kit que comprende sondas oligonucleotídicas definidas en las reivindicaciones 23, 24 ó 25, adecuado para su uso en un método definido en las reivindicaciones 1-16.

29. Un kit de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende adicionalmente cebadores para su uso en un método definido en las reivindicaciones 1-16.