ES2285270T3

ES2285270T3 - Uso de sulfato de dextrano para tratar ibmir.

Info

Publication number: ES2285270T3
Application number: ES03811973T
Authority: ES
Inventors: Bo Nilsson; Olle Korsgren
Original assignee: TX Medic AB
Current assignee: TX Medic AB
Priority date: 2002-11-28
Filing date: 2003-11-26
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2023-11-26
Also published as: EA200500757A1; US8906884B2; CA2507595C; SE0203526L; BRPI0316666B8; SI1567171T1; PL216067B1; PL376302A1; HK1087042A1; US20140093484A1; CA2507595A1; HRP20050439A2; DE60313356D1; EP1567171A1; AU2003302378B2; CN1296051C; NO326946B1; US20140094435A1; BRPI0316666B1; DK1567171T3

Abstract

Uso de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para el tratamiento de la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR).

Description

Uso de sulfato de dextrano para tratar IBMIR.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo uso del sulfato de dextrano.

Antecedentes

Hoy en día, aproximadamente 10 millones de personas en todo el mundo sufren de diabetes de tipo I, también denominada diabetes mellitus insulinodependiente. No obstante, se estima que el número de personas afectadas se incrementará de forma dramática y podrá afectar hasta a 25 millones en el año 2010. Actualmente se están realizando investigaciones para intentar alcanzar una normoglucemia permanente en pacientes con diabetes de tipo I introduciendo células \beta productoras de insulina. Los dos procedimientos principales han sido el trasplante de injertos pancreáticos vascularizados o de islotes de Langerhans aislados. Aunque se ha obtenido cierto éxito con injertos vascularizados (páncreas entero), sigue habiendo problemas sobre todo debido al riesgo quirúrgico y las complicaciones postoperatorias. Además también hay un problema con la escasez de donantes pancreáticos adecuados. En contraposición a esto, el trasplante de islotes pancreáticos aislados se lleva a cabo normalmente inyectando los islotes de forma transhepática en la vena porta, con lo que los islotes se embolizan en el árbol portal del hígado.

Un nuevo protocolo de alotrasplante de islotes que fue recientemente introducido por Saphiro y colaboradores [1] será sin duda beneficioso para un cierto número de pacientes con diabetes de tipo I. No obstante, incluso con este nuevo enfoque, se ha demostrado que el trasplante de islotes a partir de un único páncreas donante no es suficiente para producir la normoglucemia en un paciente [2]. Como resultado, se espera que el suministro de islotes humanos se convierta en un factor limitante en el tratamiento. Se tendrán que encontrar por lo tanto fuentes alternativas de células productoras de insulina. Una opción es usar islotes preparados a partir de tejido animal, siendo los islotes de cerdo los principales candidatos.

Uno de los obstáculos principales que se deben resolver antes de que se haga posible el xenotrasplante es la reacción inflamatoria nociva que provocan los islotes porcinos cuando se exponen a sangre humana fresca in vitro e in vivo [3]. Los islotes humanos también inducen una reacción inflamatoria nociva cuando se exponen a sangre ABO compatible del paciente en el momento del trasplante intraportal [4]. La reacción inflamatoria se caracteriza por un rápido consumo y activación de plaquetas, que se adhieren a la superficie del islote promoviendo una activación tanto de la coagulación como de la cascada del complemento. Además, los islotes se envuelven en coágulos y en ellos se infiltran leucocitos CB11b^{+}, lo cual en conjunto da como resultado una destrucción de la morfología de las células y una pérdida de la normoglucemia de los pacientes [3-4]. Además, la inflamación puede acelerar la respuesta inmune específica mediada por células que se produce con éxito en una fase posterior [5-8]. Por lo tanto, la inhibición de la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR, por sus siglas en inglés), como se denomina la reacción inflamatoria, parece ser crítica para el éxito del alotrasplante y del xenotrasplante de islotes.

Dos estudios recientes de Buheler y col [5] y Cantarovich y col. [6] han demostrado que los islotes porcinos adultos son destruidos inmediatamente cuando se trasplantan por vía intraportal en el hígado de primates no humanos incluso en condiciones de inmunosupresión intensa convencional de la técnica anterior. En estos estudios, los autores concluyeron que una poderosa respuesta inmune innata, IBMIR, que no se ve afectada por fármacos inmunosupresores, está implicada en la destrucción de los islotes xenogénicos.

Fiorante y col. han estudiado el uso de sulfato de dextrano en la prevención del rechazo hiperagudo (HAR, por sus siglas en inglés) de xenoinjertos discordantes vascularizados [9]. Los pulmones de cerdos perfundidos con sangre humana anticoagulada con citrato experimentaban HAR después de 30 minutos en el modelo de xenotrasplante. No obstante, la adición de sulfato de dextrano a 2 mg/ml prolongaba la supervivencia de los pulmones hasta aproximadamente 200 minutos. El HAR de órganos completos vascularizados esté mediado a través de la acción de anticuerpos en la sangre humana, que identifican y se unen a antígenos expuestos sobre las células endoteliales de los vasos sanguíneos de los órganos trasplantados. Esta reacción de HAR mediada por anticuerpos se ve potenciada por componentes del sistema del complemento [8, 10, 11]. Dado que también se sabe que el sulfato de dextrano inhibe la activación del complemento [9, 12], la supervivencia prolongada de los pulmones cuando se usa sulfato de dextrano en el modelo de xenotrasplante usado se cree que deriva de este efecto anti complemento del sulfato de dextrano.

Nakano y colaboradores han trasplantado islotes singénicos aislados en hígados de ratones con diabetes inducida con STZ para investigar el papel del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) en la mejora de la hiperglucemia [13]. Se sabe que el sulfato de dextrano potencia el efecto del HGF y en consecuencia se administró HGF por vía intraperitoneal en los ratones receptores conjuntamente con sulfato de dextrano. Tal administración produjo normoglucemia en todos los ratones que se investigaron. También la administración de sulfato de dextrano solo mostró cierto efecto beneficioso en unos pocos ratones, pero no cuando el espacio subcapsular renal era el sitio del trasplante de los islotes. Un tratamiento adicional con anticuerpos anti-HGF a los ratones a los que se les había administrado sulfato de dextrano suprimió totalmente el efecto beneficioso del sulfato de dextrano, indicando que el efecto del sulfato de dextrano en este modelo de trasplante alogénico de islotes en ratones está mediado a través de HGF endógeno.

Thomas y col. [14] han demostrado que derivados de dextrano solubles inhiben la activación del complemento y el daño mediado por el complemento in vivo. Células endoteliales aórticas porcinas incubadas en suero humano dieron como resultado un consumo del complemento y una deposición de fragmentos C3, C5 activados del complejo de ataque de membrana C5b-9 sobre las células endoteliales. La adición de 25 mg/ml de CMD25 sulfato de dextrano inhibió completamente la activación del complemento y la deposición del complejo citolítico sobre las células. El dextrano nativo no tuvo un efecto tal.

Resumen

La presente invención supera este y otros inconvenientes de las disposiciones de la técnica anterior.

Es un objeto general de la presente invención proporcionar tratamiento para la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR).

Es otro objeto de la invención proporcionar tratamiento para la alteración de trasplantes celulares causados por IBMIR.

Otro objeto más de la invención es proporcionar tratamiento para el rechazo de injertos de trasplantes celulares causados por IBMIR.

Estos y otros objetos son alcanzados por la invención como se definen por las reivindicaciones acompañantes.

Brevemente, la presente invención implica el uso de sulfato de dextrano y derivados del mismo para el tratamiento de reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR). Esta forma de inflamación recientemente caracterizada se desencadena cuando células o grupos de células se exponen a sangre extraña in vitro e in vivo. Un ejemplo muy importante de IBMIR existe cuando se trasplantan trasplantes alogénicos o xenogénicos de células en el cuerpo de un mamífero receptor, especialmente un paciente humano. La IBMIR conducirá entonces a una alteración morfológica y una destrucción de las células o grupos de células trasplantadas, tal como se manifiesta por la pérdida de estructura y forma. Además, la IBMIR también da como resultado generalmente un rechazo del injerto de los trasplantes de células.

La administración de sulfato de dextrano, o de derivados del mismo, suprime el efecto nocivo de IBMIR y previene de forma eficaz el rechazo al injerto y la alteración morfológica de los trasplantes celulares. El sulfato de dextrano según la invención puede tener un peso molecular desde sulfato de dextrano de bajo peso molecular (SD-BPM), por ejemplo desde unos pocos cientos o mil Daltons (Da) hasta sulfato de dextrano de alto peso molecular (SD-APM), generalmente con un peso molecular superior a 500000 Da, por ejemplo > 1000000 Da. El efecto ventajoso del sulfato de dextrano es especialmente prominente para SD-BPM, pero también se observa un efecto positivo con la administración de sulfato de dextrano con un peso molecular superior. El efecto ventajoso de moléculas de sulfato de dextrano mayores sobre la IBMIR según la invención puede potenciarse aumentando el contenido en azufre, es decir, el número de grupos sulfato por resto glucosílico en la cadena de dextrano. El SD-BPM generalmente tiene un peso molecular medio de menos de 20000 Da, tal como menor de 10000 Da y por ejemplo de aproximadamente 5000 Da. El contenido medio en azufre de SD-BPM puede ser de aproximadamente 10 a 25%, tal como 15 a 20%, correspondiendo a aproximadamente dos grupos sulfato por resto glucosílico. Para sulfato de dextrano con un peso molecular medio mayor de 20000 Da, se puede emplear un contenido en azufre mayor.

El sulfato de dextrano y los derivados del mismo se pueden administrar por suministro sistémico al sitio de IBMIR o trasplante celular, o pueden administrarse para su suministro directamente (localmente) a tal sitio. Por lo tanto, de acuerdo con la invención, se pueden administrar sulfato de dextrano o derivados del mismo por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, bucal, rectal, dérmica, nasal, traqueal, bronquial, tópica, por cualquier otra vía parenteral o por medio de inhalación, en forma de una preparación farmacéutica que comprende el ingrediente activo en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable.

En el tratamiento terapéutico de mamíferos, y especialmente de seres humanos, se pueden administrar sulfato de dextrano y derivados del mismo solos, pero se administrarán generalmente como una formulación farmacéutica en mezcla con un adyuvante, diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable, que se puede seleccionar de forma correspondiente a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica convencional.

Las cantidades de sulfato de dextrano o derivados del mismo en la formulación dependerán de la gravedad de la dolencia y del paciente que se va a tratar, así como de la presente formulación y la vía de administración empleada, y podrán ser determinadas de forma no inventiva por la persona experta. La concentración de sulfato de dextrano administrada o de derivados del mismo según la presente invención no debería ser demasiado alta, para minimizar cualquier efecto secundario asociado con el sulfato de dextrano. En la mayoría de las situaciones clínicas, son dosis adecuadas de sulfato de dextrano o de derivados del mismo en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de pacientes mamíferos, especialmente humanos, aquellas que dan una concentración media en sangre por debajo de 5 mg/ml, probablemente menor de 2 mg/ml y especialmente menor de 1 mg/ml. Un intervalo de concentración preferido es entre 0,01 mg/ml y 1 mg/ml de sulfato de dextrano, tal como más de 0,05 mg/ml, más de 0,08 mg/ml o más de 0,1 mg/ml y/o menos de 0,8 mg/ml, menos de 0,6 mg/ml, menos de 0,4 mg/ml o menos de 0,2 mg/ml, por ejemplo, en el intervalo de concentración de 0,01 mg/ml y 0,2 mg/ml y/o 0,05 mg/ml y 0,2 mg/ml.

El sulfato de dextrano según la presente invención es especialmente adecuado para prevenir el rechazo al injerto de células \beta productoras de insulina trasplantadas a pacientes que sufren de diabetes de tipo I. En tales pacientes, se pueden trasplantar islotes de Langerhans de otros seres humanos o animales, preferiblemente islotes porcinos, inyectando los islotes en la vena porta de los pacientes. No obstante, una vez que los islotes se exponen a la sangre del paciente, se desencadena IBMIR y la funcionalidad reguladora de insulina de los islotes será destruida y los islotes serán rechazados. Por lo tanto, se alcanza preferiblemente una concentración terapéutica de sulfato de dextrano, al menos localmente, en el sitio del trasplante una vez que se ha llevado a cabo el trasplante de las células o de los grupos de células. Esto se puede obtener administrando el sulfato de dextrano antes del trasplante real. De forma alternativa, se pueden inyectar los islotes disueltos en una solución que comprende sulfato de dextrano según la presente invención, para inhibir la IBMIR y prevenir cualquier destrucción o rechazo de los islotes, haciendo posible la normoglucemia en los pacientes. La concentración de sulfato de dextrano en una solución de células y sulfato de dextrano es preferiblemente lo suficientemente alta como para poder obtener una concentración terapéutica de sulfato de dextrano, es decir, preferiblemente menor a 5 mg/ml, más preferiblemente de 0,01 mg/ml a 1,0 mg/ml y especialmente de 0,01 mg/ml a 0,2 mg/ml, al menos localmente, en el sitio del trasplante durante las primeras horas después del trasplante. El sulfato de dextrano difundirá entonces desde el sitio del trasplante, disminuyendo la concentración local de sulfato de dextrano. En algunas aplicaciones, no se necesita sulfato de dextrano adicional para inhibir IBMIR, la alteración morfológica y/o el rechazo del injerto de los trasplantes celulares, dado que probablemente sólo se necesite una concentración terapéutica de sulfato de dextrano durante las primeras 24-48 horas después del trasplante. No obstante, siempre que se requiera, se puede añadir sulfato de dextrano adicional, por ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal, o por alguna otra vía de administración. Como entenderá una persona experta en la materia, la administración de una solución de sulfato de dextrano que comprende las células o grupos de células que se van a administrar puede combinarse también con la administración de sulfato de dextrano o de derivados del mismo antes del trasplante en sí.

El sulfato de dextrano o derivados del mismo también se pueden combinar con otros agentes terapéuticos que son útiles en el tratamiento de rechazo del injerto de tejido trasplantado. Son ejemplos adecuados pero no limitantes de tales agentes inmunosupresores que se pueden usar junto con sulfato de dextrano para el tratamiento de rechazo del injerto ciclosporina, tacrolimus, corticoesteroides, rapamicina (sirolimus) y micofenolato mofetilo. La administración de sulfato de dextrano según la presente invención puede también coordinarse con la administración de anticuerpos anti-TF y/o factor VIIa inactivado en el sitio, que también tienen cierta funcionalidad para inhibir la IBMIR.

Breve descripción de los dibujos

La invención, junto con objetos y ventajas adicionales de la misma se entenderá mejor haciendo referencia a la siguiente descripción en conjunción con los dibujos adjuntos, en los que:

La fig. 1 es un diagrama que ilustra los efectos de SD-BPM sobre la generación de C3a durante la perfusión de islotes porcinos con sangre humana;

La fig. 2 es un diagrama que ilustra los efectos de SD-BPM sobre la generación de sC5b-9 durante la perfusión de islotes porcinos con sangre humana;

La fig. 3 es un diagrama que ilustra los efectos de SD-BPM sobre el sistema del complemento cuando se incuba suero humano en presencia de SD-BPM;

La fig. 4 ilustra la distribución de leucocitos en islotes porcinos después de la perfusión con sangre humana que no contiene SD-BPM;

La fig. 5 ilustra la distribución de leucocitos en islotes porcinos después de la perfusión con sangre humana que contiene 1 mg/ml de SD-BPM;

La fig. 6 ilustra la distribución de plaquetas en islotes porcinos después de la perfusión con sangre humana que no contiene SD-BPM;

La fig. 7 ilustra la distribución de plaquetas en islotes porcinos después de la perfusión con sangre humana que contiene 1 mg/ml de SD-BPM;

La fig. 8 ilustra la expresión de insulina en islotes porcinos tras el trasplante intraportal en ratones diabéticos sin timo sin tratamiento con SD-BPM;

La fig. 9 ilustra la expresión de insulina en islotes porcinos tras el trasplante intraportal en ratones diabéticos sin timo con tratamiento con SD-BPM;

La fig. 10 ilustra la distribución de leucocitos en islotes porcinos tras el trasplante intraportal en ratones diabéticos sin timo sin tratamiento con SD-BPM;

La fig. 11 ilustra la distribución de leucocitos en islotes porcinos tras el trasplante intraportal en ratones diabéticos sin timo con tratamiento con SD-BPM.

Descripción detallada

La presente invención se refiere generalmente al nuevo efecto sorprendente del sulfato de dextrano sobre la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR, por sus siglas en inglés) y la alteración morfológica y el rechazo al injerto de trasplantes celulares causado por IBMIR.

La IBMIR es una reacción inflamatoria identificada de forma relativamente reciente desencadenada por la exposición o contacto de células o grupos de células con sangre extraña. La IBMIR se caracteriza por la expresión de factores tisulares sobre las células, lo cual desencadena una generación local de trombina. A continuación se adhieren plaquetas activadas a la superficie celular promoviendo la activación tanto del sistema de la coagulación como del complemento. Además se reclutan linfocitos y se infiltran entre las células. Todos estos efectos provocan una alteración y destrucción de la morfología celular en el transcurso de las primeras horas después del contacto con la sangre extraña. La IBMIR también acelera la siguiente respuesta inmune específica mediada por células en una fase posterior.

Un ejemplo muy importante de IBMIR existe cuando se trasplantan células o grupos de células en el cuerpo de un mamífero receptor, especialmente un paciente humano. Tras el contacto con la sangre del paciente receptor, las células desencadenan IBMIR, lo cual da como resultado la alteración de la morfología celular y generalmente el rechazo al injerto del trasplante celular. Se ha detectado IBMIR tanto en trasplante celular alogénico, en el que se trasplantan células de un donante con sangre ABO compatible en un paciente, como en trasplante celular xenogénico, incluyendo xenotrasplante de cerdo a mono y cerdo a humano de células y/o grupos de células.

La expresión "trasplante celular" se refiere de forma genérica, en la presente invención, a una célula individual, a varias células individuales o a un grupo ce muchas células trasplantadas en un cuerpo receptor de, preferiblemente, un mamífero, especialmente un paciente humano. En la expresión trasplante celular también están comprendidos grupos mayores de células de tejidos no vascularizados, tal como se usa en el presente documento. Un ejemplo de trasplantes celulares según la presente invención son islotes de Langerhans alogénicos o xenogénicos trasplantados en la vena porta del hígado de pacientes que sufren de diabetes de tipo I. Un ejemplo adicional puede ser el trasplante de tejido/células neurales embrionarias xenogénicos en el cuerpo estriado de pacientes con enfermedad de Parkinson.

Como se ha discutido brevemente en la sección de antecedentes, un procedimiento prometedor para obtener normoglucemia en pacientes con diabetes de tipo I es trasplantar células \beta productoras de insulina, por ejemplo en la vena porta. Se pueden obtener células productoras de insulina por ejemplo en forma de islotes de Langerhans tanto a partir de donantes alogénicos como xenogénicos. Dado que se requieren islotes de varios donantes para obtener normoglucemia y la falta de donantes humanos, se pueden usar islotes xenogénicos, preferiblemente porcinos. No obstante, tanto los islotes alogénicos como xenogénicos provocan IBMIR cuando se exponen a la sangre del paciente receptor. Como consecuencia, en el transcurso de unas pocas horas después del trasplante, se produce la alteración y la destrucción de la morfología de las células, manifestándose generalmente en una pérdida de integridad, estructura y forma de las células. Esto da como resultado una liberación de insulina inicialmente incrementada en gran medida a partir de los islotes de Langerhans, seguida por una liberación de insulina disminuida o ausente. En otras palabras, el trasplante pronto se ve seguido de una pérdida de la normoglucemia. Además, la IBMIR también provoca el rechazo al trasplante de los trasplantes celulares.

Las administraciones de fármacos inmunosupresores convencionales que previenen la producción de anticuerpos y el rechazo de órganos no tienen ningún efecto sobre la IBMIR o el rechazo al injerto de trasplantes celulares causados por IBMIR. Esto indica que los mecanismos principales de IBMIR y el rechazo al injerto de trasplantes celulares difieren del mecanismo de rechazo que se encuentra en el trasplante de órganos completos y tejido vascularizado.

A continuación, en el presente documento sigue un repaso más detallado de los síntomas de la IBMIR y en particular del consumo de plaquetas, activación de la coagulación y del complemento y la infiltración de leucocitos. Además, se repasan los efectos del sulfato de dextrano sobre los respectivos síntomas. Para una discusión más detallada de estos efectos del sulfato de dextrano, se hace referencia a la sección de ejemplos.

Comenzando con el consumo de plaquetas, la IBMIR afecta al recuento de plaquetas de sangre expuesta a células o grupos de células alogénicas o xenogénicas. Se puede detectar una disminución significativa de las plaquetas libres circulantes en la sangre tras el contacto de la sangre con las células. Las plaquetas se activan y se adhieren a las células, dando como resultado una agregación plaquetaria. Tras la adhesión a las células, las plaquetas liberan varias sustancias, incluyendo fosfolípidos plaquetarios, que son importantes para la formación de coágulos y la activación del sistema de coagulación.

La administración de una cantidad eficaz de sulfato de dextrano según la invención inhibe el consumo de plaquetas como se puede observar por un incremento en el recuento de plaquetas de la sangre, que vuelve al valor medido en la sangre antes de la exposición a células o grupos de células extrañas. Además, el sulfato de dextrano disminuye considerablemente la adhesión de plaquetas a las células, aunque todavía se pueden observar cantidades residuales de paquetas alrededor de los islotes. El efecto de estas plaquetas restantes no es sin embargo necesariamente una desventaja. Estudios con animales han demostrado que después del trasplante, transcurre al menos una semana antes de que se detecte la angiogénesis [15, 16]. Las plaquetas contienen una serie de factores de crecimiento importantes, tal como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) [17, 18], que pueden apoyar la revascularización y el injerto de los islotes en el cuerpo del paciente. En el caso de un trasplante clínico de islotes, cuando se embolizan los islotes en la vena porta, una corona de plaquetas adherentes puede, de forma similar, apoyar el injerto y la supervivencia en el tejido hepático.

Después del contacto con sangre, las células extrañas activan el sistema de coagulación por medio de la expresión de factores tisulares sobre las células y por medio de sustancias liberadas por las plaquetas que se adhieren y que se agregan. Brevemente, el factor tisular (TF) producido por las células forma complejos con el factor de coagulación sanguíneo VIIa y actúa de forma enzimática sobre el factor X para formar factor X activado (FXa). Después de esto sigue una cascada de activación de diferentes factores que, dado el caso, da como resultado la generación de trombina a partir de protrombina. La trombina a su vez provoca la polimerización de moléculas de fibrinógeno para dar fibras de fibrina que forman un coágulo de fibras alrededor de las células, todo lo cual es bien conocido para una persona experta en la materia. La trombina también activa la vía intrínseca para iniciar la coagulación de la sangre, en la que se activa el factor XII (factor de Hageman) (FXIIa) y activa a su vez de forma enzimática el factor XI (antecedente de tromboplastina), dando como resultado FISA, la forma activada del factor XI. También esta vía da como resultado eventualmente la generación de trombina a partir de protrombina según la vía extrínseca activada por TF.

La coagulación de la sangre puede ser inhibida por antitrombina, un inhibidor de la serinproteasa circulante que inactiva FXIIa, FXIa y trombina, formando complejos de factor XIIa-antitrombina (FXIIa-AT), factor XIa-antitrombina (FXIa-AT) y trombina-antitrombina (TAT). Además, el inhibidor de la esterasa C1 es un inhibidor conocido de FXIa y FXIIa que forma complejos de factor XIa-inhibidor de la esterasa C1 (FXIa-C1 INH) y factor XIIa-inhibidor de la esterasa C1 (FXIIa-C1 INH).

Un coágulo de fibrina que ya se haya formado alrededor de las células o grupos de células se puede eliminar por la acción de plasmina del sistema fibrinolítico. La plasmina degrada el coágulo de fibrina para dar productos de degradación de fibrina, previniendo con ello una coagulación adicional. No obstante, la acción de la plasmina es inhibida por antiplasmina alfa 2, que se une e inactiva la plasmina libre formando un complejo de plasmina-antiplasmina alfa 2 (PAP).

La IBMIR se caracteriza por la formación de coágulos de fibrina alrededor de células expuestas a sangre extraña in vitro e in vivo. Además, se detecta un incremento de FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT y PAP. La IBMIR no tiene ningún efecto ni sobre la cantidad de FXIa-C1 INH ni de FXIIa-C1 INH. La administración de una cantidad eficaz de sulfato de dextrano según la invención anula el efecto de IBMIR sobre la activación de la coagulación, que se manifiesta en un incremento en la cantidad de FXIa-AT, FXIIa-AT, TAT y PAP detectados en la sangre. El efecto del sulfato de dextrano sobre la activación de la coagulación puede estar mediado por el sistema de coagulación en sí, por el efecto inhibidor del sulfato de dextrano sobre la activación de las plaquetas o por ambos.

Después de la activación de las plaquetas y de la coagulación, en la IBMIR sigue una cascada del complemento. Uno de los componentes del sistema del complemento es C3, que, cuando se activa, se escinde para dar el fragmento pequeño C3a, un mediador peptídico de la inflamación, y el fragmento mayor C3b. C3b a su vez se une a otros componentes del sistema del complemento formando convertasa de C5, que escinde C5 en C5a, que se difunde, y la forma activa C5b, que se une a la superficie celular. El C5b unido se une entonces a cuatro componentes más del complemento formando el complejo de ataque de membrana C5b-9. Este complejo desplaza a los fosfolípidos de la membrana, formando grandes canales transmembrana, que interrumpen la membrana y permiten que iones y pequeñas moléculas difundan libremente. De esta forma, la célula no puede mantener su estabilidad osmótica y es lisada por un flujo de agua hacia el interior y pérdida de electrolitos.

La mayor parte del consumo de plaquetas ya se ha producido antes de que se puedan detectar los efectos de la IBMIR mediados por el complemento, lo que sugiere que la reacción de coagulación puede inducir la activación del complemento. La IBMIR provoca una activación del complemento significativa según se mide por un incremento de C3a y el complejo de ataque de membrana sC5b-9 libre el la sangre. La administración de una cantidad eficaz de sulfato de dextrano según la invención reduce la cantidad de estos componentes del complemento de una forma dependiente de la dosis en la sangre.

La IBMIR también se caracteriza por infiltración de leucocitos en las células o grupos de células. La infiltración de células polimorfonucleares CD11b^{+} y monocitos en las células se detecta claramente mediante tinción inmunohistoquímica. Análisis inmunohistoquímicos han mostrado que la infiltración de leucocitos fue totalmente anulada por la administración de sulfato de dextrano.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso de sulfato de dextrano o de un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR, por sus siglas en inglés).

Según otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de sulfato de dextrano o de un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la alteración morfológica de trasplantes de células trasplantadas. También el uso de sulfato de dextrano o de un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de rechazos al injerto de trasplantes celulares se encuentra dentro del alcance de la presente invención. Estos dos efectos, es decir, la alteración de la morfología celular y el rechazo al injerto en células trasplantadas, grupos de células o tejido no vascularizado en un paciente mamífero, preferiblemente humano se deben al efecto nocivo de la IBMIR. El efecto mediado por IBMIR sobre el trasplante celular se produce tanto en trasplante de humano a humano con donantes ABO compatibles como usando otros donantes mamíferos, preferiblemente cerdos. Por lo tanto, el sulfato de dextrano tiene un efecto terapéutico ventajoso tanto en trasplantes celulares alogénicos como xenogénicos.

Para evitar dudas, como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" incluye el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de IBMIR. "Derivados farmacéuticamente aceptables" incluyen sales y solvatos.

El sulfato de dextrano o derivados del mismo empleados según la invención puede tener un peso molecular desde sulfato de dextrano de bajo peso molecular (SD-BPM), por ejemplo desde unos pocos cientos o mil Daltons (Da) hasta sulfato de dextrano de alto peso molecular (SD-APM), generalmente con un peso molecular superior a 500000 Da, por ejemplo > 1000000 Da. El efecto ventajoso del sulfato de dextrano es especialmente prominente para SD-BPM, pero también se observa un efecto positivo con la administración de sulfato de dextrano con un peso molecular superior. No obstante, las moléculas de sulfato de dextrano mayores pueden activar FXII, dando como resultado ciertos efectos secundarios, lo cual se discute con más detalle a continuación El efecto ventajoso de moléculas de sulfato de dextrano mayores sobre la IBMIR según la invención puede potenciarse aumentando el contenido en azufre, es decir, el número de grupos sulfato por resto glucosílico en la cadena de dextrano. El SD-BPM generalmente tiene un peso molecular medio de menos de 20000 Da, tal como menor de 10000 Da y por ejemplo de aproximadamente 5000 Da. El contenido medio en azufre de SD-BPM puede ser de aproximadamente 10 a 25%, tal como 15 a 20%, correspondiendo a aproximadamente dos grupos sulfato por resto glucosílico. Para sulfato de dextrano con un peso molecular medio mayor de 20000 Da, se puede emplear un contenido en azufre mayor.

Según otro aspecto más de la invención se proporciona un procedimiento de tratamiento de Izmir que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente que necesite tal tratamiento.

Otros aspectos de la invención son un procedimiento de tratamiento del rechazo al injerto de trasplantes celulares que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente que necesite tal tratamiento un procedimiento de tratamiento de la alteración morfológica de trasplantes de células trasplantadas que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo a un paciente que necesite tal tratamiento.

El sulfato de dextrano y derivados del mismo se pueden administrar por suministro sistémico al sitio de IBMIR o trasplante celular o se pueden administrar para suministrarse directamente (localmente) a ese sitio, usando medios apropiados de administración que son conocidos para la persona experta.

Por lo tanto, de acuerdo con la invención se pueden administrar sulfato de dextrano y derivados del mismo por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, bucal, rectal, dérmica, nasal, traqueal, bronquial, tópica, por cualquier otra vía parenteral o por medio de inhalación, en forma de una preparación farmacéutica que comprende el ingrediente activo en una forma de dosificación farmacéuticamente aceptable. Dependiendo de la forma de trasplante celular, el sitio del trasplante u el paciente que se va a tratar, así como de la vía de administración, se pueden administrar las composiciones a dosis variables.

Las cantidades de sulfato de dextrano o derivados del mismo en la formulación dependerán de la gravedad de la dolencia y del paciente que se va a tratar, así como de la presente formulación y la vía de administración empleada, y podrán ser determinadas de forma no inventiva por la persona experta. La concentración de sulfato de dextrano administrada o de derivados del mismo según la presente invención no debería ser demasiado alta, para minimizar cualquier efecto secundario asociado con el sulfato de dextrano. En la mayoría de las situaciones clínicas, son dosis adecuadas de sulfato de dextrano o de derivados del mismo en el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de pacientes mamíferos, especialmente humanos, aquellas que dan una concentración media en sangre por debajo de 5 mg/ml, probablemente menor de 2 mg/ml y especialmente menor de 1 mg/ml. Un intervalo de concentración preferido es entre 0,01 mg/ml y 1 mg/ml de sulfato de dextrano, tal como más de 0,05 mg/ml, más de 0,08 mg/ml o más de 0,1 mg/ml y/o menos de 0,8 mg/ml, menos de 0,6 mg/ml, menos de 0,4 mg/ml o menos de 0,2 mg/ml, por ejemplo, en el intervalo de concentración de 0,01 mg/ml y 0,2 mg/ml y/o 0,05 mg/ml y 0,2 mg/ml. Estas concentraciones han demostrado ser lo suficientemente elevadas para prevenir o inhibir IBMIR y alteración morfológica y rechazo al injerto de trasplantes celulares, pero es aún lo suficientemente baja para minimizar cualquier efecto secundario asociado con la administración de sulfato de dextrano. Además, el cultivo de islotes en SD-BPM no tiene ningún efecto adverso sobre la función de los islotes a concentraciones que varían entre 0,01 y 1 mg/ml. En cualquier caso, el profesional sanitario o la persona experta serán capaces de determinar la dosis real, que será la más adecuada para un paciente individual, que puede variar con la edad, peso y respuesta del paciente particular. Las dosificaciones anteriormente identificadas son ejemplos de dosificaciones preferidas del caso medio. No obstante, puede haber casos individuales en los que sean necesarios intervalos de dosificación mayores o menores, y estas están dentro del alcance de la invención.

Hoy en día ya se ha usado sulfato de dextrano en estudios clínicos para terapia antiviral contre VIH, tratamiento de infarto cerebral agudo en combinación con urocinasa y en terapia antihiperlipidémica, en la que el sulfato de dextrano se acopla con una fase sólida. En los dos primeros tipos de estudios, la tasa de inyección fue de aproximadamente 45 mg/hora, que se mantuvo durante un periodo de 2-3 semanas por inyección continua de sulfato de dextrano (PM 8000 Da) y se encontró que la concentración en sangre era de aproximadamente 0,001 mg/ml. En todos estos pacientes, se observó trombocitopenia (a veces asociada con hemorragias) después de 3 días de tratamiento y se notificó alopecia en aproximadamente la mitad de los pacientes. No obstante, estos dos efectos fueron reversibles. Se estima que la administración de sulfato de dextrano para inhibir IBMIR, alteración morfológica y/o rechazo al injerto de trasplantes celulares se lleva a cabo usualmente durante hasta 1-2 o unos pocos días. Por lo tanto, los efectos secundarios anteriormente identificados serán muy leves durante un periodo de administración tan corto (unos pocos días comparados con 2-3 semanas).

Se sabe desde hace tiempo que el sulfato de dextrano produce hipotensión por medio de la liberación de bradiquinina que resulta de la activación de la calicreína plasmática. No obstante, esta observación se ha hecho principalmente cuando se ha inmovilizado SD-APM en columnas de plasmaforesis para el tratamiento de hiperlipidemia y no durante la inyección de sulfato de dextrano. Este efecto es una consecuencia de la activación directa de FXII a FXIIa. No obstante, en el presente documento se parte de la base de que el factor XII no se activa directamente por SD-BPM. Tal como se ha mencionado anteriormente, los niveles de FXIIa-AT y PAP son elevados cuando las células se exponen a sangre extraña sin SD-BPM. No obstante, estos altos niveles se normalizan cuando se añade SD-BPM.

Con el fin de prevenir la IBMIR que sigue al trasplante celular y/o alteración morfológica y rechazo al injerto de trasplantes celulares, preferiblemente se alcanza una concentración terapéutica de sulfato de dextrano o derivados del mismo, al menos localmente, en el sitio del trasplante una vez que se ha llevado a cabo el trasplante de las células o de los grupos de células. Esto se puede obtener administrando el sulfato de dextrano antes del trasplante real. De forma alternativa, se pueden inyectar los islotes disueltos en una solución que comprende sulfato de dextrano según la presente invención. La concentración de sulfato de dextrano en una solución de células y sulfato de dextrano es preferiblemente lo suficientemente alta como para poder obtener una concentración terapéutica de sulfato de dextrano, es decir, preferiblemente menor a 5 mg/ml, más preferiblemente de 0,01 mg/ml a 1,0 mg/ml (localmente), en el sitio del trasplante durante las primeras horas después del trasplante. Como entenderá una persona en la materia, la concentración real de sulfato de dextrano o derivados del mismo puede ser temporalmente superior a la concentración óptima en la sangre del paciente cuando se trasplantan células o grupos de células disueltos en una solución de sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano difundirá entonces desde el sitio del trasplante, disminuyendo la concentración local de sulfato de dextrano. En algunas aplicaciones, no se necesita sulfato de dextrano adicional para inhibir IBMIR, la alteración morfológica y/o el rechazo del injerto de los trasplantes celulares, dado que probablemente sólo se necesite una concentración terapéutica de sulfato de dextrano durante las primeras 24-48 horas después del trasplante. No obstante, siempre que se requiera, se puede añadir sulfato de dextrano adicional, por ejemplo, por vía intravenosa, intraperitoneal, o por alguna otra vía de administración. Como entenderá una persona experta en la materia, la administración de una solución de sulfato de dextrano que comprende las células o grupos de células que se van a administrar puede combinarse
también con la administración de sulfato de dextrano o de derivados del mismo antes del trasplante en sí.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de IBMIR que comprende una cantidad eficaz de sulfato de dextrano, o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo.

La presente invención también se dirige a una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento del rechazo al injerto de trasplantes celulares que comprende una cantidad eficaz de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo y una formulación farmacéutica para su uso en el tratamiento de la alteración morfológica de trasplantes de células trasplantadas que comprende una cantidad eficaz de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo.

El sulfato de dextrano o derivados del mismo también se pueden combinar con otros agentes terapéuticos que son útiles en el tratamiento del rechazo al injerto de tejido trasplantado. Son ejemplos adecuados pero no limitantes de tales agentes inmunosupresores que se pueden usar junto con sulfato de dextrano para el tratamiento de rechazo del injerto ciclosporina, tacrolimus, corticoesteroides, rapamicina (sirolimus) y micofenolato mofetilo. La administración de sulfato de dextrano según la presente invención puede también coordinarse con la administración de anticuerpos anti-TF y/o factor VIIa inactivado en el sitio, que se ha demostrado que tienen cierta funcionalidad para inhibir la IBMIR.

Ejemplos Reactivos

Se obtuvo sulfato de dextrano de bajo peso molecular (SD-BPM) con un peso molecular medio de 5000 Da y un contenido en azufre de aproximadamente 17% de Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EE.UU.). Se adquirió sulfato de dextrano de alto peso molecular (SD-APM) que tenía un peso molecular medio de > 1000000 Da y contenido en azufre de 16-19% en Amersham Bioscience (Uppsala, Suecia). Se obtuvieron dextrano de bajo peso molecular (D-BPM, PM 5000 Da) y dextrano de alto peso molecular (D-APM, PM > 1000000) de Fluka Chemical (Buchs, Suiza) y Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EE.UU.), respectivamente.

Tratamiento con heparina

Todos los materiales que estuvieron en contacto con sangre completa fueron provistos de una superficie de heparina Corline (Corline Systems AB, Uppsala, Suecia) según las recomendaciones del fabricante. La concentración superficial de heparina fue de 0,5 \mug/cm^{2}, correspondiendo a aproximadamente 0,1 U/cm^{2}, con una capacidad de unión a antitrombina de 2-4 pmol/cm^{2}.

Preparación de sangre

Se recogió sangre humana fresca, obtenida de voluntarios sanos que no habían recibido medicación durante al menos 14 días, en jeringas de 60 ml con la superficie heparinizada (calibre 18, Microlance, Becton Dickinson, Franlin Lakes, NJ). Las cánulas de las jeringas se conectaron a tubos de silicona con la superficie heparinizada. Durante el muestreo se rotaron las jeringas continuamente.

Animales

Como receptores se usaron ratones machos endogámicos sin timo (un/un Black-6, BomMice) de Bomholt Gaard Breeding and Research Centre, Ltd. (Ry, Dinamarca), de 20-25 gramos. Todos los animales tuvieron libre acceso a dieta convencional y agua.

Aislamiento de islotes

Se aislaron islotes porcinos adultos (API) a partir de los páncreas de cerdas Swedish Landrace de 2 a 3 años de edad (200 a 300 kg) por medio de un procedimiento enzimático y mecánico de digestión pancreática seguido de filtración y separación de los islotes en gradientes de Ficoll como sugirieron Ricordi y col. [19, 20]. Los islotes se suspendieron en medio de cultivo M199 (GIBCO, BRL, Life Technologies LTD, Paisley, Escocia) suplementado con 10% de suero porcino (GIBCO, BRL), nitrato de calcio 1 mM, selenio 0,02 \muM, nicotinamida 20 mM, HEPES 25 mM, fungizona (500 \mug/l) y gentamicina (50 mg/l) y se cultivaron en botellas de 250 ml a 37ºC en CO_{2} al 5% y aire humidificado durante 1 a 4 días. El medio de cultivo se cambió en el día 1 y después cada segundo día a partir de entonces. Se determinaron el volumen y su pureza bajo un microscopio invertido después de la tinción con una ditiozona (Sigma Chemicals, St. Louis, MO).

Inducción de diabetes en ratones sin timo

Se indujo diabetes en ratones sin timo mediante inyección intravenosa (i.v.) de esteptozotocina de Sigma Chemicals (Palo Alto, CA, EE.UU.) según Wennberg y col. [20]. La dosis de esteptozotocina fue de 250 mg/kg de peso corporal para los ratones sin timo. Un animal fue considerado diabético si su nivel de glucosa en sangre (glucosa-S) excedía de 20 mmol/l (> 360 mg/dl) durante 2 o más días consecutivos.

Trasplante de API en ratones sin timo diabéticos tratados con o sin SD-BPM

Después de haber sido cultivados durante 4 días, se trasplantaron 5 \mul de API (\sim 5000 IEQ) a partir de cinco aislamientos en el hígado a través de la vena porta de 11 ratones sin timo machos endogámicos, que fueron anestesiados durante la cirugía con isoflureno. Cinco ratones fueron tratados por vía intravenosa con SD-BPM. Se inyectaron 0,15 mg de SD-BPM 10 minutos antes del trasplante y se inyectaron 0,3 mg adicionales 6 horas después del trasplante. Después de ello se administró SD-BPM dos veces al día en los días 1-2, 3-4 y 5-6 después del trasplante en dosis decrecientes de 1, 0,5 y 0,25 mg, respectivamente. Se inyectó un volumen equivalente de solución salina a seis ratones (no tratados) de la misma manera.

Análisis estadístico

Todos los valores se expresaron como media \pmDT y se compararon usando ANOVA de Friedman (tabla 1), prueba de la t de Student emparejada (tabla 3), la prueba de categorías de Wilcoxon (tabla 4) y una ANOVA de una vía factorial después de prueba de Scheffe a posteriori (tabla 5). En el estudio morfológico de islotes trasplantados, se evaluaron la frecuencia de formación y la intensidad de infiltración de leucocitos usando la prueba de categorías sumatoria de Wilcoxon. Se consideraron estadísticamente significativos valores de p < 0,05.

Calidad de los islotes

Se llevó a cabo una prueba de estimulación estática de glucosa (SGS) como una prueba funcional de API. Se recogieron a mano quince islotes y se agitaron suavemente en bicarbonato de Krebs-Ringer que contenía glucosa 1,6 mM a 37ºC durante 60 minutos. Después de ello, la concentración de glucosa se cambió a 1,67 mM durante 60 minutos adicionales. Se recogieron los sobrenadantes y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis. El contenido en insulina de los sobrenadantes se analizó mediante ELISA (DAKO Dyagnostics, Ltd. Ely, Reino Unido). El índice estimulador se calculó como una proporción de la concentración de insulina a alta glucosa y baja glucosa, respectivamente. La pureza de los API usados en este estudió variaba entre 81 y 95% (media 88,5%\pm2,2%). El índice de estimulación en la prueba de estimulación estática de glucosa estaba entre 0,8 y 7,8 (3,4\pm1,2), y el contenido medio en insulina era de 85,5\pm6,2 pmol/\mug ADN.

Además se midió la proporción ADP/ATP para evaluar la viabilidad de API cultivados usando el kit ApoGlow^{TM} (LumiTech, Ltd., Nottingham, Reino Unido). Brevemente, se lavaron 75 islotes equivalentes (IEQ) de API en PBS y se mezclaron después con 100 \mul de reactivo liberador de nucleótidos durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de ello, se añadieron 20 \mul de reactivo de monitorización de nucleótidos a la solución y se midieron los niveles de ATP usando un luminómetro (Luminómetro FB 12, Berthold Detection Systems GmbH, Pforzheim, Alemania) y se expresaron como el número de unidades luminosas relativas (RLU). Después de 10 minutos, el ADP en la solución fue convertido en ATP mediante la adición de 20 \mul de reactivo de conversión de ADP y después se midió como el número de RLU. A continuación, se calculó la proporción ADP/ATP en los API como sugirieron Bradbury y col. [21]. La proporción insulina/ADN en los API se midió según Wennberg y col. [22] y se expresó como pmol/\mug. La proporción de supervivencia de API cultivados se calculó como un porcentaje de valores de IEQ obtenidos en el día 3 comparados con el día 0.

Se valoró cualquier posible toxicidad de SD-BPM cultivando API de tres páncreas diferentes en presencia (0,01, 0,1 ó 1 mg/ml) o ausencia de SD-BPM durante 3 días. Los resultados de la tasa de supervivencia, índice de estimulación, proporción ADP/ATP y proporción insulina/ADN para muestras de control y muestras con las tres concentraciones de SD-BPM diferentes se presentan en la tabla 1 a continuación. El SD-BPM no mostró ningún efecto adverso sobre la función, viabilidad o tasa de supervivencia de API a ninguna de las concentraciones probadas. Además, no hubo diferencias entre la morfología de los API tratados con SD-BPM y la de los API cultivados en ausencia de
SD-BPM.

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TABLA 1

1

Tiempo de coagulación

Se extrajo sangre de cuatro voluntarios sanos en tubos Vacutainer^{TM} que contenían citrato. Se incubó sangre completa (980 \mul) con 2 \mul de API a 37ºC en recipientes de muestra de polipropileno en un reómetro ReoRox^{TM} (Global Haemostasis International, Gotenburgo, Suecia). La reacción de coagulación se inició añadiendo 20 \mul de CaCl_{2} 1 M en presencia o ausencia de diferentes clases de dextrano (SD-BPM, SD-APM, D-BPM y D-APM). Cada 6 segundos, el recipiente se puso en oscilación torsional libre alrededor de su eje vertical y se registró la amortiguación y la frecuencia de la oscilación. El tiempo de coagulación se identificó como el punto de máxima amortiguación.

Los resultados obtenidos a partir de los experimentos de tiempo de coagulación se presentan en la tabla 2 a continuación. Los API incubados en sangre humana tratada con citrato indujeron rápidamente formación de coágulo, a una media de 6,1\pm0,3 minutos después de la calcificación. La formación de coágulo se anuló totalmente en presencia de SD-BPM a todas las dosis probadas, mientras que el SD-APM inhibió la formación de coágulo sólo a 0,1 mg/ml. Tanto el D-BPM como el D-APM ampliaron el tiempo de coagulación sólo en escasa medida comparado con las muestras de control (sin aditivos). Por lo tanto, la sulfatación del SD parece ser crucial para la capacidad inhibidora observada.

TABLA 2

2

Inhibición de IBMIR mediante SD-BPM

Se usó perfusión de islotes porcinos adultos en bucles de tubos de PVC heparinizados como un modelo para ensayar el efecto de SD-BPM sobre la IBMIR y el xenotrasplante de cerdo a humano. Este protocolo se lleva a cabo básicamente como se ha descrito previamente [4, 23] con algunas modificaciones. En general, se usaron bucles hechos de PVC (diámetro 6,3 mm, longitud 390 mm), cuya superficie interior estaba provista de heparina inmovilizada. Los tubos se mantuvieron juntos con un conector heparinizado especialmente diseñado. Se formaba un bucle circular cuando los extremos del conector se presionaban estrechamente en el lumen de los extremos de los tubos. Para generar flujo sanguíneo en el interior de los tubos se usó un aparato basculante colocado en una incubadora a 37ºC. Los bucles se sometían a oscilación en un ajuste para prevenir que la sangre entrase en contacto con los conectores.

Se llevaron a cabo siete experimentos con islotes de 60 minutos usando API aislados de cuatro cerdos diferentes. Se probó SD-BPM disuelto en solución salina a 0, 0,01, 0,1 y 1 mg/ml (concentración final). Para cada experimento se incluyó un bucle que contenía sangre humana fresca y solución salina sin API como control. En dos experimentos se incluyó un bucle que contenía sangre humana fresca y 1 mg/ml de SD-BPM sin API. De forma simultánea se probó preincubación de sangre humana con 1 mg/ml de dextrano-BPM que no estaba sulfatado en cinco experimentos. En cada experimento se añadieron 7 ml de sangre humana fresca del mismo donante a cada bucle. Los bucles se colocaron entonces en el dispositivo de oscilación durante 5 minutos con SD-BPM o solución salina. Después de ello se abrieron los bucles y se añadieron 100 \mul de solución salina con o sin 5 \mul de API (aproximadamente 5000 IEQ) a los bucles y siguió otra incubación de 60 minutos en el dispositivo de oscilación a 37ºC. Se midieron los niveles de glucosa en sangre con un glucómetro (Glucometer Elite; Bayer Diagnostics, Leverkusen, Alemania) antes de la perfusión.

Después de cada perfusión se filtraron los contenidos de los bucles a través de filtros de 70 \mum de diámetro (Filcons, Cuptype; DAKO, Dinamarca). Tanto los coágulos de sangre macroscópicos como el tejido recuperado sobre los filtros se congelaron instantáneamente en isopentano para la tinción inmunohistoquímica. La sangre filtrada restante se recogió en EDTA 4,1 mM (concentración final) y se usó para análisis hematológicos (plaquetas, linfocitos, monocitos y granulocitos) y análisis de activación de la coagulación (trombina-antitrombina [TAT], complejos factor XIa-antitrombina [FXIa-AT] y complejos factor XIIa-antitrombina [FXIIa-AT]), activación de fibrinolisis (complejos de plasmina-antiplasmina alfa 2 [PAP]), activación del complemento (C3a y sC5b-9), y activación de inhibidor de la esterasa C1 (factor XIa-inhibidor de la esterasa C1 [FXIa-C1 INH], factor XIIa-inhibidor de la esterasa C1 [FXIIa-C1 INH]. También se analizaron muestras tomadas a los 0, 15 y 30 minutos. En las muestras de 0 minutos no se añadió la sangre al bucle de tubos sino que en su lugar se transfirió inmediatamente a los tubos que contenían EDTA. Las muestras de sangre se centrifugaron a 4ºC a 3290 x g durante 20 minutos y el plasma se recogió y se almacenó a -70ºC hasta que se analizó. Los niveles de glucosa en sangre antes de la perfusión de API variaban entre 4,8 y 6,2 mmol/l.

Se analizaron los recuentos de plaquetas y los recuentos de leucocitos en un analizador Coulter ACT-diff (Beckman Coulter, FL, EE.UU) usando sangre tratada con EDTA. Se cuantificaron TAT y PAP usando kits de inmunoensayo enzimático (EIA) disponibles comercialmente (Enzygnost TAT, Behringswerke, Marburg, Alemania). Se analizaron FXIa-AT, FXIIa-AT, FXIa.C1 INH y FXIIa-C1 INH según el procedimiento de Sánchez y col. [24]. C3a se analizó como se ha descrito previamente por Nilsson Akdahl y col. [25], y sC5b-9 se analizó usando una modificación del EIA descrito por Mollnes y col. [25, 26].

En bucles de tubos que contenían sangre humana fresca sin API, los recuentos de células sanguíneas y los parámetros de coagulación y complemento se alteraron sólo ligeramente, como se puede observar en la tabla 3 a continuación. Se considera que todas estas alteraciones son cambios de fondo normales que resultan de la interacción de la sangre con la superficie de los tubos y la interfase fluido-aire.

El SD-BPM previno la coagulación macroscópica, inhibió el consumo de células sanguíneas y redujo tanto la activación de la coagulación como del complemento de una forma dependiente de la dosis (véase la tabla 3). Se pudo observar un aumento significativo de las plaquetas en la sangre tratada con SD-BPM a una concentración de 0,01 mg/ml de SD-BPM, demostrando un reestablecimiento de los recuentos de células sanguíneas hasta casi los niveles normales a esta baja concentración de SD-BPM. Los productos de la activación de la coagulación TAT, FXIa-AT y FXIIa-AT se suprimieron a 0,01 mg/ml de SD-BPM pero FXIa-AT aumentó ligeramente de nuevo a dosis que variaban entre 0,1 y 1 mg/ml de SD-BPM.

El SD-BPM reduce la activación del complemento según se ensaya mediante la generación de C3a y complejo soluble de ataque a membrana sC5b-9, como se observa en la tabla 3. La fig. 1 ilustra con más detalle el efecto de SD-BOM sobre la generación de C3a durante 60 minutos de perfusión de API con sangre humana fresca en el modelo de bucle de tubos. En muestras en las que se añadió SD-BPM, el sulfato de dextrano se preincubó con sangre humana fresca durante 5 minutos antes de la perfusión de API con la sangre. Los círculos blancos corresponden a 0 mg/ml de SD-BPM, los círculos negros representan 0,01 mg/ml de SD-BPM y los cuadrados blancos y los cuadrados negros corresponden a 0,1 mg/ml y 1 mg/ml de SD-BPM, respectivamente. Un diagrama correspondiente del efecto de SD-BPM sobre la generación de sC5b-9 se encuentra en la fig. 2. Como se observa claramente a partir de los diagramas de las figs. 1 y 2, la activación principal del complemento se produjo aproximadamente 30 minutos después de la perfusión de API. La administración de 0,1 mg/ml y 1 mg/ml de SD-BPM inhibe totalmente la generación tanto de C3a como del complejo de ataque a membrana sC5b-9, mientras que la menor concentración de SD-BPM (0,01 mg/ml) reduce significativamente la generación de C3a.

No se generó FXIa-C1 INH en ninguno de los bucles de tubos probados durante 60 minutos de perfusión (datos no mostrados). FXIIa-C1 INH no cambió ni en presencia ni en ausencia de SD-BPM.

PAP se incrementó en ausencia de SD-BPM, mientras que se suprimió de forma significativa a 0,01 mg/ml de SD-BPM.

TABLA 3

3

El efecto de dextrano-BPM sobre los recuentos de células sanguíneas, parámetros de coagulación y del complemento después de 60 minutos de perfusión de API con sangre humana fresca se investigó por medio del modelo de bucle de tubos similar a SD-BPM, como se ha explicado anteriormente. En la tabla 4 se encuentra una comparación entre D-BPM y SD-BPM sobre los síntomas de IBMIR. El dextrano-BPM, que no está sulfatado, sólo tuvo un efecto marginal sobre IBMIR. Estos datos indican que la sulfatación parece ser crucial para el efecto inhibidor del dextrano sobre IBMIR desencadenada por API.

TABLA 4

4

Efecto directo de SD-BPM sobre el sistema del complemento en suero humano

Se investigó el efecto directo de SD-BPM sobre la cascada del complemento incubando suero humano en el tubo de polipropileno. Se añadió suero (1 ml) a cada tubo junto con SD-BPm a una concentración final de 0, 0,01, 0,1 ó 1 mg/ml. A los 5, 10, 15, 30, 45 y 60 minutos después de la incubación del suero a 37ºC, se transfirieron 100 \mul de suero a tubos que contenían EDTA 10 mM. Estas muestras se almacenaron a -70ºC antes del análisis de los componentes del complemento C3a y sC5b-9.

La fig. 3 ilustra el efecto de SD-BPM sobre la presencia de C3a y sC5b-9 del sistema del complemento en suero humano. Los valores están expresados como porcentajes de la cantidad de C3a y sC5b-9 en muestras de control (sin SD-BPM). Las barras coloreadas representan la generación de C3a y las barras vacías corresponden a sC5b-9. A 0,01 mg/ml de SD-BPM, una activación del complemento incrementada se reflejó en una generación incrementada tanto de C3a como de sC5b-9, pero a 1 mg/ml se observó un efecto inhibidor. Aunque los efectos sobre sangre completa y suero no se pueden comparar directamente, el SD-BPM por sí mismo induce probablemente la activación del complemento a las dosis más bajas de SD-BPM aplicadas. A una concentración más alta, prevalece el efecto inhibidor.

Supervivencia de injertos en ratones sin timo diabéticos

Se midieron los niveles de glucosa en sangre obtenida de colas de receptores usando un instrumento de medición de B-glucosa Glucometer Elite® (Bayer AB, Gontenburgo, Suecia). Las mediciones se realizaron diariamente antes de las 12 de la mañana y se expresaron como mmol/l (1 mmol/l \approx 18 mg/dl). Se consideró que se había producido la pérdida de la función del injerto si los niveles de B-glucosa excedían de 11,1 mmol/l (> 200 mg/dl) durante 2 ó más días consecutivos. La duración de la normoglucemia tras el trasplante (< 200 mg/dl) se definió como el periodo de supervivencia del injerto.

Todos los ratones sin timo con diabetes inducida con estreptozotocina eran gravemente hiperglucémicos antes del trasplante, sin diferencias en los niveles de B-glucosa observados entre los diversos grupos de receptores. Los niveles de B-glucosa no en ayunas se redujeron inmediatamente después del trasplante en todos los receptores diabéticos a los que se les había implantado API por vía intraportal. No obstante, los ratones no tratados permanecieron normoglucémicos sólo durante un tiempo limitado, véase la tabla 5. Los niveles de B-glucosa se incrementaron de nuevo durante los 3 primeros días después del trasplante en cuatro de los seis ratones no tratados. Por el contrario, la normoglucemia se mantuvo durante un periodo significativamente más prolongado en los ratones tratados con SD- BPM que en los ratones no tratados (8,8\pm1,9 días frente a 3,5\pm1,2 días, p=0,045, tabla 5). Se demostró que todos los API usados en el presente estudio curaban a los ratones diabéticos cuando se trasplantaban cantidades equivalentes bajo el espacio subcapsular renal (la extracción del riñón que portaba el injerto daba como resultado rápidamente un nivel de glucosa en sangre elevado).

TABLA 5

5

Experimentos inmunohistoquímicos

Se recuperaron islotes y coágulos macroscópicos sobre filtros después de 60 minutos de perfusión con sangre y con SD-BPM (0,1 mg/ml y 1 mg/ml) o sin SD-BPM (control), luego re recogieron en medio de fijación (Tissue-Tek; Miles, Eckhart, IN, EE.UU.) y se congelaron instantáneamente en isopentano. Los islotes se seccionaron y se tiñeron a continuación con anticuerpo de ratón anti CD41a humano conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (R&D Systems, Abigdon, Reino Unido) y anti-CD11b^{+} (Clone 2LPM19c, DAKO, Carpintería, CA, EE.UU.). En el estudio in vivo, los hígados de ratón que contenían API se extrajeron 10 días después del trasplante y se congelaron instantáneamente en isopentano. Las muestras se seccionaron y se tiñeron con anticuerpo de cobaya anti-insulina (DAKA, Carpintería, CA, EE.UU.) y anticuerpo de rata anti-CD11b^{+} de ratón (Serotec Ltd. Scandinavia, Oslo, Noruega).

Después de 60 minutos, se encontró de forma coherente que los islotes extraídos de bucles de control no tratados estaban embebidos en coágulos. La tinción inmunohistoquímica mostró una cápsula de fibrina y plaquetas rodeando los islotes. La fig. 4 ilustra la infiltración de células polimorfonucleares CD11b^{+} y monocitos en los islotes de control. Por el contrario, se observó una inhibición completa de la formación de coágulo y el número de células CD11b^{+} infiltrantes decreció considerablemente cuando se añadió 1 mg/ml de SD-BPM durante la incubación, lo cual se ilustra en la fig. 5. Se observó también un efecto similar a 0,1 mg/ml. Las muestras de control también presentaban una capa gruesa de plaquetas que se adherían a las células como se observa en la fig. 6. En las muestras tratadas con SD-BPM se observó una capa de plaquetas mucho más fina adhiriéndose a los islotes, ilustrada en la fig. 7. Los islotes de control no expuestos a sangre eran negativos en todas las tinciones usadas.

La mayoría de los islotes extraídos de ratones no tratados estaban atrapados en coágulos, como se ilustra en la fig. 8. En esta fig. 8, la flecha representa formación de trombo con islotes porcinos atrapados. No obstante, sólo unos pocos islotes de ratones tratados con SD-BPM estaban atrapados, lo que se ilustra en la fig. 9. La tinción inmunohistoquímica mostró una infiltración de leucocitos CD11b^{+} (MAC-1^{+}) en los islotes extraídos de ratones no tratados, como se observa en la fig. 10. Por el contrario, había marcadamente menos células CD11b^{+} (MAC-1^{+}) infiltrantes en ratones tratados con SD-BPM, ilustrado en la fig. 11. La frecuencia de la formación de coágulo y la intensidad de la infiltración de leucocitos eran significativamente menores en receptores tratados con SD-BPM que en receptores no tratados (p=0,0034). Las figs. 4 a 9 son a 200x aumentos y las figs. 10 y 11 a 100x aumentos.

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Claims

1. Uso de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para el tratamiento de la reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR).

2. El uso de sulfato de dextrano según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha IBMIR está causada por exposición de un trasplante celular a sangre después del trasplante de dicho trasplante celular en un cuerpo receptor ajeno.

3. Uso de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para el tratamiento de la alteración morfológica de trasplante celular trasplantado.

4. El uso de sulfato de dextrano según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha alteración morfológica de trasplante celular se debe a una reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR).

5. Uso de sulfato de dextrano o un derivado farmacéuticamente aceptable del mismo para fabricar un medicamento para el tratamiento del rechazo al injerto de trasplante celular.

6. El uso de sulfato de dextrano según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho rechazo al injerto de trasplante celular se debe a una reacción inflamatoria inmediata mediada por la sangre (IBMIR).

7. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, caracterizado porque dicho trasplante celular es trasplantado en un cuerpo humano receptor.

8. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque dicho trasplante celular se selecciona de una lista de:

- trasplante celular alogénico o

- trasplante celular xenogénico.

9. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, caracterizado porque dicho trasplante celular se selecciona de una lista de:

- célula individual,

- grupo de células o

- tejido no vascularizado.

10. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, caracterizado porque dicho trasplante celular son islotes de Langerhans.

11. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho sulfato de dextrano tiene un peso molecular de menos de 20000 Da, preferiblemente de menos de 10000 Da.

12. El uso de sulfato de dextrano según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dicho sulfato de dextrano tiene un contenido en azufre de 10-25%, preferiblemente de 15-20%.