ES2285768T3

ES2285768T3 - Proteinas crsp (proteinas segregadas ricas en cisteina), moleculas de acido nucleico que codifican para las mismas y uso de las mismas.

Info

Publication number: ES2285768T3
Application number: ES98918453T
Authority: ES
Inventors: Sean A. Mccarthy
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1998-04-16
Publication date: 2007-11-16
Anticipated expiration: 2018-04-16
Also published as: DE69837085D1; PT975755E; EP0975755A1; ES2285768T5; DK0975755T3; ATE505543T1; CY1107629T1; EP0975755B9; EP0975755B2; AU2009227915A1; ATE353964T1; DE69837085T2; EP2298899A2; DE69842225D1; EP1852507B1; JP2010011853A; EP1852507A1; DE69837085T3; JP2006166917A; CA2288430A1

Abstract

Molécula de ácido nucleico aislada seleccionado del grupo constituido por: a) un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID.NO: 9; b) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 24-350 de SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8; c) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 14, en el que dicha variante alélica que se produce de manera natural modula la transducción de la señal celular o la proliferación celular, y en el que (i) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO:5 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 6 en condiciones de lavado rigurosas, (ii) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 12 en condiciones de lavado rigurosas, (iii) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas de lavado, en el que las condiciones rigurosas de lavado son 0, 2 X SSC, SDS al 0, 1% a 50-65ºC; d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento de a), b), o c); y e) un vector de expresión de célula eucariota recombinante que comprende el ácido nucleico de a), b), c) o d).

Description

Proteínas CRSP (proteínas segregadas ricas en cisteína), moléculas de ácido nucleico que codifican para las mismas y usos de las mismas.

Antecedentes de la invención

Las proteínas segregadas desempeñan un papel íntegro en la formación, diferenciación y mantenimiento de células en organismos multicelulares. Por ejemplo, en la técnica se sabe que las proteínas secretoras están implicadas en la señalización entre células que están calientes en contacto directo. Tales moléculas de señalización segregadas son particularmente importantes en el desarrollo de tejido de vertebrados durante la embriogénesis así como en el mantenimiento del estado diferenciado de tejidos adultos. Por ejemplo, las interacciones inductivas que se producen entre capas celulares vecinas y los tejidos en el embrión en desarrollo son sumamente dependientes de la existencia y regulación de moléculas de señalización segregadas. En interacciones inductivas, las señales bioquímicas segregadas por una población celular influyen en el destino del desarrollo de una segunda población celular, normalmente alterando el destino de la segunda población celular. Por ejemplo, las proteínas Wnt se reconocen en la actualidad como una de las principales familias de moléculas de señalización importantes para el desarrollo en organismos que varían desde Drosophila hasta ratones. Para una revisión véase Cadigan, K. M. y R. Nusse (1997) Genes & Development, 11:3286-3305.

También se reconoce bien actualmente que las principales familias de moléculas de señalización tienen un papel doble que desempeñar tanto en el desarrollo de un organismo así como en la estimulación o mantenimiento del estado diferenciado de tejidos en el animal adulto. Además, las principales familias de moléculas de señalización se han implicado en el control de la proliferación de células en tejidos adultos maduros, por ejemplo, durante la renovación celular normal en el organismo adulto así como en la regeneración tisular activada como resultado del daño al tejido adulto.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de moléculas de ácido nucleico que codifican para una familia novedosa de proteínas segregadas, denominadas en el presente documento proteínas segregadas ricas en cisteína ("CRSP" o "proteínas CRSP"). Las moléculas CRSP de la presente invención son útiles como agentes moduladores para regular una variedad de procesos celulares. Consecuentemente, en un aspecto, esta invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para proteínas CRSP o partes biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos que codifican para CRSP.

En una realización, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico de CRSP tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Otro aspecto de la invención proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de CRSP. En ciertas realizaciones, el vector es un vector de expresión recombinante. En otra realización, la invención proporciona una célula huésped que contiene un vector de la invención. La invención también proporciona un método para producir una proteína CRSP cultivando en un medio adecuado una célula huésped de la invención que contiene un vector de expresión recombinante de manera que se produce una proteína CRSP.

Otro aspecto de esta invención muestra proteínas CRSP aisladas o recombinantes y polipéptidos. En una realización, una proteína CRSP aislada tiene una secuencia señal y al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente una región rica en cisteína, y se segrega. En otra realización, una proteína CRSP aislada tiene una secuencia de aminoácidos tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Las proteínas CRSP de la presente invención, o partes biológicamente activas de las mismas, pueden estar operativamente unidas a un polipéptido distinto de CRSP para formar proteínas de fusión de CRSP. La invención muestra adicionalmente anticuerpos que se unen específicamente a proteínas CRSP, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales. Además, las proteínas CRSP o partes biológicamente activas de las mismas pueden incorporarse a composiciones farmacéuticas, que opcionalmente incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la expresión de CRSP en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente que puede detectar un polipéptido, una proteína o una molécula de ácido nucleico de CRSP, de manera que se detecta la presencia de un polipéptido, una proteína o una molécula de ácido nucleico de CRSP en la muestra biológica.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de actividad de CRSP en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente que puede detectar un indicador de actividad de CRSP de manera que se detecta la presencia de actividad de CRSP en la muestra biológica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para modular la actividad de CRSP que comprende poner en contacto la célula con un agente que modula la actividad de CRSP de tal manera que se modula la actividad de CRSP en la célula. En una realización, el agente inhibe la actividad de CRSP. En otra realización, el agente estimula la actividad de CRSP. En una realización, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína CRSP. En otra realización, el agente modula la expresión de CRSP modulando la transcripción de un gen de CRSP o la traducción de un ARNm de CRSP. Todavía en otra realización, el agente es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es antisentido con respecto a la cadena codificante de un ARNm de CRSP o un gen de CRSP.

Los métodos basados en la presente invención pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene un trastorno caracterizado por actividad o expresión de ácido nucleico o proteína CRSP aberrante administrando un agente que es un modulador de CRSP al sujeto. En una realización, el modulador de CRSP es una proteína CRSP. En otra realización el modulador de CRSP es una molécula de ácido nucleico de CRSP. Todavía en otra realización, el modulador de CRSP es un péptido, molécula peptidomimética u otra molécula pequeña. En una realización preferida el trastorno se caracteriza por expresión de ácido nucleico o proteína CRSP aberrante es un trastorno del desarrollo, de diferenciación o proliferativo.

La presente invención también proporciona un ensayo diagnóstico para identificar la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos una de (i) mutación o modificación aberrante de un gen que codifica para una proteína CRSP; (ii) regulación errónea de dicho gen; y (iii) modificación posterior a la traducción aberrante de una proteína CRSP, en la que una forma de tipo natural de dicho gen codifica para una proteína con una actividad de CRSP.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une a, o modula la actividad de, una proteína CRSP, proporcionando una composición indicadora que comprende una proteína CRSP que tiene actividad de CRSP, poniendo en contacto la composición indicadora con un compuesto de prueba, y determinando el efecto del compuesto de prueba sobre la actividad de CRSP en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína CRSP.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos prevista de CRSP-1 humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2479 de SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 350 de SEQ ID NO: 2.

La figura 2 representa la secuencia de ADNc y secuencia de aminoácidos prevista de CRSP-2 humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 848 de SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 224 de SEQ ID NO: 5.

La figura 3 representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos prevista de CRSP-3 humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 1529 de SEQ ID NO: 7. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 266 de SEQ ID NO: 8.

La figura 4 representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos prevista de CRSP-4 humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 702 de SEQ ID NO: 10. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 179 de SEQ ID NO: 11.

La figura 5 representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos prevista de N terminal de tipo CRSP humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácido nucleicos 1 a 928 de SEQ ID NO: 13. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 242 de SEQ ID NO: 14.

La figura 6 representa las secuencias de aminoácidos de CRSP-1 humana, CRSP-2 humana, CRSP-3 humana, y CRSP-4 humana, así como la secuencia consenso generada a partir de la alineación de estas secuencias. La figura detalla la relación entre las proteínas CRSP de la presente invención.

La figura 7 es un diagrama esquemático que representa la relación entre las proteínas CRSP de la presente instantánea. La figura representa los dominios biológicos y funcionales de CRSP humana. Los péptidos señal se indican mediante cajas rellenas. Los dominios ricos en cisteína de una región rica en cisteína de CRSP se representan como CRD-1 y CRD-2.

La figura 8 representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos prevista de CRSP-1 murina. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 928 de SEQ ID NO: 16. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 349 de SEQ ID NO: 17.

La figura 9 es un diagrama esquemático que representa la relación entre la secuencia de nucleótidos de CRSP-1 y las de RIG y 7-1 de tipo RIG (números de registro U32331 y AF034208, respectivamente).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de moléculas novedosas, denominadas en el presente documento como moléculas de ácido nucleico y proteínas CRSP, que comprenden una familia de moléculas que tienen ciertas características estructurales y funcionales conservadas. Se pretende que el término "familia" cuando se refiere a la proteína y moléculas de ácido nucleico de la invención signifique dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural común y que tienen suficiente homología de secuencia de aminoácidos o nucleótidos tal como se define en el presente documento. Tales miembros de familia pueden producirse de manera natural y pueden ser o bien de la misma especie o bien de diferentes especies. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, así como otras proteínas distintas de origen humano, o alternativamente pueden contener homólogos de origen no humano. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.

En una realización, se identifica un miembro de la familia de CRSP basándose en la presencia de al menos un "domino rico en cisteína" en la proteína o molécula de ácido nucleico correspondiente. Tal como se define en el presente documento, un "dominio rico en cisteína" se refiere a una parte de una proteína CRSP (por ejemplo, CRSP-1) que es rica en residuos de cisteína, es decir, al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 aminoácidos son residuos de cisteína. Preferiblemente, un "dominio rico en cisteína" es un dominio proteico que tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 30-100 aminoácidos, de manera preferible de aproximadamente 35-95 aminoácidos, de manera más preferible de aproximadamente 40-90 aminoácidos, de manera más preferible de aproximadamente 45-85 aminoácidos, de manera incluso más preferible de aproximadamente 50-80 aminoácidos, y de manera incluso más preferible de aproximadamente 55-75, 60-70, ó 65 aminoácidos, de los que al menos aproximadamente 3-20, de manera preferible aproximadamente 5-15, o de manera más preferible aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 aminoácidos son residuos de cisteína.

Un dominio rico en cisteína preferido tiene al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, o preferiblemente 20 residuos de cisteína ubicados en la misma posición de aminoácido relativa que los residuos de cisteína en CRSP-1 humana que tiene SEQ ID NO: 2. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 6, CRSP-2 tiene al menos aproximadamente 10 residuos de cisteína ubicados en la misma posición de aminoácido relativa que los residuos de cisteína en CRSP-1 humana que tiene SEQ ID NO: 2 (por ejemplo, cys151 en CRSP-2, SEQ ID NO: 5, está ubicada en la misma posición de aminoácido relativa que cys214 en CRSP-1, SEQ ID NO: 2; cys156 en CRSP-2, SEQ ID NO: 5, está ubicada en la misma posición de aminoácido relativa que cys219 en CRSP-1, SEQ ID NO: 2; y cys157 en CRSP-2, SEQ ID NO: 5, está ubicada en la misma posición de aminoácido que cys220 en CRSP-1, SEQ ID NO: 2). De manera similar, tal como se muestra en la figura 6, CRSP-3 tiene al menos aproximadamente 10 residuos de cisteína ubicados en la misma posición de aminoácido relativa que los residuos de cisteína en CRSP-1 humana que tiene SEQ ID NO: 2. Tal como también se muestra en la figura 6, CRSP-4 tiene al menos aproximadamente 10 residuos de cisteína ubicadas en la misma posición de aminoácido relativa que los residuos de cisteína en CRSP-1 humana que tiene SEQ ID NO: 2.

Una proteína CRSP preferida de la presente invención es una proteína humana (por ejemplo, codificada por una secuencia de nucleótidos que corresponde a un gen humano que se produce de manera natural). Por ejemplo, en una realización, una proteína CRSP-1 (CRSP-1 humana) contiene un primer dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 147-195 de SEQ ID NO: 2, que tiene 10 residuos de cisteína, y un segundo dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 201-284 de SEQ ID NO: 2, que tiene 10 residuos de cisteína (las posiciones de los residuos de cisteína se representan en la figura 6). En otra realización, una proteína CRSP-2 (CRSP-2 humana) contiene un primer dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 41-90 de SEQ ID NO: 5, que tiene 10 residuos de cisteína, y un segundo dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 41-218 de SEQ ID NO: 5, que tiene 10 residuos de cisteína (las posiciones de los residuos de cisteína se representan en la figura 6). En otra realización, una proteína CRSP-3 proteína (CRSP-3 humana) contiene un primer dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 85-138 de SEQ ID NO: 8, que tiene 10 residuos de cisteína, y un segundo dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 182-263 de SEQ ID NO: 8, que tiene 10 residuos de cisteína (las posiciones de los residuos de cisteína se representan en la figura 6). En otra realización, una proteína CRSP-4 (CRSP-4 humana) contiene un primer dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 1-47 de SEQ ID NO: 11, que tiene 8 residuos de cisteína, y un segundo dominio rico en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 96-176 de SEQ ID NO: 11, que tiene 10 residuos de cisteína (las posiciones de los residuos de cisteína se representan en la figura 6).

Proteínas CRSP preferidas tienen más de un dominio rico en cisteína, más preferiblemente tienen al menos dos dominios ricos en cisteína y, por tanto, tienen una región rica en cisteína. Tal como se usa en el presente documento, el término "región rica en cisteína" se refiere a un dominio proteico que incluye al menos dos dominios ricos en cisteína y tiene una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 120-200, de manera preferible de aproximadamente 130-190, de manera más preferible de aproximadamente 140-180 residuos de aminoácidos, y de manera incluso más preferible de al menos aproximadamente 135-175 aminoácidos de los que al menos aproximadamente 10-30, de manera preferible aproximadamente 15-20, y de manera más preferible aproximadamente 16, 17, 18, ó 19 de los aminoácidos son residuos de cisteína. En una realización preferida, una región rica en cisteína está ubicada en la región C-terminal de una proteína CRSP. Por ejemplo, en una realización, una proteína CRSP-1 contiene una región rica en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 147-284 de SEQ ID NO: 2, que tiene 20 residuos de cisteína en las posiciones indicadas en la figura 6. En otra realización, una proteína CRSP-2 contiene una región rica en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 41-218 de SEQ ID NO: 5, que tiene 20 residuos de cisteína en las posiciones indicadas en la figura 6. En otra realización, una proteína CRSP-3 contiene una región rica en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 85-263 de SEQ ID NO: 8, que tiene 20 residuos de cisteína en las posiciones indicadas en la figura 6. En otra realización, una proteína CRSP-4 contiene una región rica en cisteína que contiene aproximadamente los aminoácidos 1-176 de SEQ ID NO: 2, que tiene 18 residuos de cisteína en las posiciones indicadas en la figura 6.

En otra realización, además de los dominios ricos en cisteína, la región rica en cisteína contiene una región espaciadora que separa el primer y segundo dominio rico en cisteína. Tal como se usa en el presente documento, la "región espaciadora" se refiere a residuos de aminoácidos que están ubicados entre los dominios ricos en cisteína primero y segundo de una región rica en cisteína e incluye residuos de aminoácidos ubicados en C-terminal con respecto al primer dominio rico en cisteína y en N-terminal con respecto al segundo dominio rico en cisteína. Tal como se define en el presente documento, una "región espaciadora" se refiere a un dominio proteico de aproximadamente 5-70, de manera preferible de aproximadamente 10-65 aminoácidos, de manera más preferible de aproximadamente 15-60 aminoácidos, de manera incluso más preferible de aproximadamente 20-55, y de manera incluso más preferible de aproximadamente 25-50, 30-45 ó 35-40 aminoácidos. Por ejemplo, la proteína CRSP-1 contiene una región espaciadora de aproximadamente los aminoácidos 196-200 de SEQ ID NO: 2; la proteína CRSP-2 contiene una región espaciadora de aproximadamente los aminoácidos 91-137 de SEQ ID NO: 5; la proteína CRSP-3 contiene una región espaciadora de aproximadamente los aminoácidos 139-181 de SEQ ID NO: 8; y la proteína CRSP-4 contiene una región espaciadora de aproximadamente los aminoácidos 48-95 de SEQ ID NO: 11.

En otra realización de la invención, la proteína CRSP tiene al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente una región rica en cisteína, y una secuencia señal. Tal como se usa en el presente documento, una "secuencia señal" se refiere a un péptido que contiene aproximadamente 20 aminoácidos que se produce en el extremo N-terminal de proteínas de membrana secretoras e integrales y que contiene un gran número de residuos de aminoácidos hidrófobos. Por ejemplo, una secuencia señal contiene al menos aproximadamente 14-28 residuos de aminoácidos, de manera preferible aproximadamente 16-26 residuos de aminoácidos, de manera mas preferible aproximadamente 18-24 residuos de aminoácidos, y de manera más preferible aproximadamente 20-22 residuos de aminoácidos, y tiene al menos aproximadamente el 40-70%, de manera preferible aproximadamente el 50-65%, y de manera más preferible aproximadamente el 55-60% de residuos de aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptófano, o prolina). Tal "secuencia señal", también se denomina en la técnica como un "péptido señal", sirve para dirigir una proteína que contiene una secuencia de este tipo hacia una bicapa lipídica. Por ejemplo, en una realización, una proteína CRSP-1 contiene una secuencia señal de aproximadamente los aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 2. En otra realización, una proteína CRSP-2 contiene una secuencia señal de aproximadamente los aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO: 5. En otra realización, una proteína CRSP-3 contiene una secuencia señal de aproximadamente los aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 8.

Las proteínas CRSP de la presente invención pueden usarse para identificar miembros adicionales de la familia de CRSP. Por ejemplo, se identificó una proteína que tiene homología con CRSP-1 usando la secuencia que codifica para la región única N-terminal de CRSP-1 para buscar una base de datos de secuencias de proteínas. Una proteína de este tipo, denominada en el presente documento como "N terminal de tipo CRSP" se representa en la figura 5. La secuencia de nucleótidos de N terminal de tipo CRSP (SEQ ID NO: 13) codifica para una proteína que tiene 242 aminoácidos (SEQ ID NO: 14). La secuencia de nucleótidos de N terminal de tipo CRSP incluye una región no traducida en 5' que contiene los nucleótidos 1-74 de SEQ ID NO: 13, una región codificante que contiene los nucleótidos 75-800 de SEQ ID NO: 13 (que corresponde a los nucleótidos 1-726 de SEQ ID NO: 15), y una región no traducida en 3' que contiene los nucleótidos 801-928 de SEQ ID NO: 13.

Consecuentemente, una realización de la invención muestra una proteína CRSP que tiene al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente al menos una región rica en cisteína. Otra realización muestra una proteína CRSP que tiene al menos una región rica en cisteína, en la que la región rica en cisteína incluye al menos un dominio rico en cisteína. Otra realización muestra una proteína CRSP que tiene al menos una región rica en cisteína, en la que la región rica en cisteína incluye al menos dos dominios ricos en cisteína. Otra realización muestra una proteína que tiene homología del 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, ó 99% con respecto a un dominio rico en cisteína de una proteína CRSP de la invención (por ejemplo, CRSP-1, CRSP-2, CRSP-3, o CRSP-4).

Todavía otra realización de la invención muestra una proteína CRSP que tiene al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente al menos una región rica en cisteína y un péptido señal. Otra realización muestra una proteína CRSP que tiene al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente al menos una región rica en cisteína y un péptido señal, en la que la región rica en cisteína incluye al menos dos dominios ricos en cisteína. Otra realización muestra una proteína CRSP que tiene al menos un dominio rico en cisteína, preferiblemente al menos una región rica en cisteína y un péptido señal, en la que la región rica en cisteína incluye al menos dos dominios ricos en cisteína y un espaciador.

Moléculas CRSP preferidas de la presente invención se definen en las reivindicaciones adjuntas. Tal como se usa en el presente documento, el término "suficientemente homóloga" se refiere a una primera secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos o de nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de aminoácidos que tiene una cadena lateral similar) con respecto a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos de manera que las secuencias de aminoácidos o nucleótidos primera y segunda compartan dominios estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos aproximadamente un 40% de homología, preferiblemente un 50% de homología, más preferiblemente un 60%-70% de homología a lo largo de la secuencia de aminoácidos de los dominios y contienen al menos un, preferiblemente dos, más preferiblemente tres, e incluso más preferiblemente cuatro, cinco o seis dominios estructurales, se definen en el presente documento como suficientemente homólogas. Además, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten al menos un 40%, preferiblemente un 50%, más preferiblemente un 60, 70, u 80% de homología y comparten una actividad funcional se definen en el presente documento como suficientemente homólogas.

Tal como se usa indistintamente en el presente documento, una "actividad de CRSP", "actividad biológica de CRSP" o "actividad funcional de CRSP", se refiere a una actividad ejercida por una molécula de ácido nucleico, polipéptido o proteína CRSP sobre una célula sensible a CRSP tal como se determina in vivo, o in vivo, según las técnicas habituales. En una realización, una actividad de CRSP es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de CRSP. Tal como se usa en el presente documento, una "molécula diana" es una molécula con la que se une o interactúa una proteína CRSP en la naturaleza, de manera que se logra función mediada por CRSP. Una molécula diana de CRSP puede ser una molécula distinta de CRSP o un polipéptido o proteína CRSP de la presente invención. En una realización a modo de ejemplo, una molécula diana de CRSP es una proteína unida a membrana (por ejemplo, un receptor de superficie celular o "receptor de CRSP") o una forma modificada de una proteína de este tipo que se ha alterado de manera que la proteína es soluble (por ejemplo, producida recombinantemente de manera que la proteína no exprese un dominio de unión a membrana). En otra realización, una diana de CRSP es una segunda molécula de proteína soluble (por ejemplo, una "pareja de unión a CRSP" o "sustrato de CRSP"). En una realización de este tipo a modo de ejemplo, una pareja de unión a CRSP puede ser una segunda proteína distinta de CRSP soluble o una segunda molécula de proteína CRSP de la presente invención. Alternativamente, una actividad de CRSP es una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por interacción de la proteína CRSP con una segunda proteína (por ejemplo, un receptor de CRSP). Tal como se usa en el presente documento, el término "receptor de CRSP" se refiere a una proteína o complejo de proteína, al que puede unirse una proteína CRSP, por ejemplo, CRSP humana. Un receptor puede ser un receptor de superficie celular, por ejemplo, un receptor de hormona nuclear. Los receptores de CRSP pueden aislarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en el presente documento. La interacción de una proteína CRSP con un receptor de CRSP puede resultar en la transducción de una señal de la superficie celular con respecto al núcleo. La señal transducida puede ser, un aumento del calcio intracelular, un aumento de fosfatidilinositol u otra molécula, y puede dar como resultado, por ejemplo, la fosforilación de proteínas específicas, una modulación de transcripción génica y cualquiera de las otras actividades biológicas expuestas en el presente documento.

En una realización preferida, una actividad de CRSP es al menos una o más de las siguientes actividades: (i) interacción de una proteína CRSP con, y/o unión a, una segunda molécula, (por ejemplo, una proteína, tal como un receptor de CRSP, una forma soluble de un receptor de CRSP, un receptor para un miembro de la familia de wnt de las proteínas de señalización, o una molécula de señalización distinta de CRSP); (ii) interacción de una proteína CRSP con una proteína intracelular a través de un receptor de CRSP unido a membrana; (iii) formación de complejo entre una proteína CRSP soluble y una segunda pareja de unión a CRSP soluble (por ejemplo, una molécula de proteína distinta CRSP o una segunda molécula de proteína CRSP); (iv) interacción con otras proteínas extracelulares (por ejemplo, regulación de adhesión celular dependiente de wnt a componentes de matriz extracelular); (v) unión a y eliminación de una molécula no deseable (por ejemplo, una actividad desintoxicante o función de defensa); y/o (vi) una actividad enzimática. Todavía en otra realización preferida, una actividad de CRSP es al menos una o más de las siguientes actividades: (1) modulación de transducción de señales celulares, o bien in vitro o bien in vivo (por ejemplo, antagonismo de la actividad de miembros de la familia de wnt de proteínas segregadas o supresión de transducción de señales dependiente de wnt); (2) regulación de comunicación entre células (por ejemplo, regulación de interacciones célula-célula dependientes de wnt); (3) regulación de expresión de genes cuya expresión está modulada por la unión de CRSP (por ejemplo, CRSP-1) a un receptor; (4) regulación de transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o diferenciación, o bien in vitro o bien in vivo (por ejemplo, inducción de diferenciación celular); (5) regulación de transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o diferenciación, en la que al menos un gen codifica para proteína específica de diferenciación; (6) regulación de transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o diferenciación, en la que al menos un gen codifica para una segunda proteína segregada; (7) regulación de transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o diferenciación, en la que al menos un gen codifica para una molécula de transducción de señales; (8) regulación de proliferación celular, o bien in vitro o bien in vivo (por ejemplo, inducción de proliferación celular o inhibición de proliferación como en el caso de supresión de tumorigénesis (por ejemplo, supresión de formación de glioblastoma)); (9) formación y mantenimiento de disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados, tanto adultos como embrionarios (por ejemplo, inducción de formación de cabeza durante el desarrollo del vertebrado o mantenimiento de células progenitoras hematopoyéticas); (10) modulación de muerte celular, tal como estimulación de supervivencia celular; (11) regulación de migración celular; y/o (12) modulación inmunitaria.

Tal como se denomina en el presente documento, "proteínas específicas de diferenciación" incluyen proteínas implicadas en la transición de una célula desde el fenotipo no diferenciado hasta el diferenciado. Por ejemplo, tales proteínas pueden ser proteínas estructurales específicas de diferenciación o factores de transcripción específicos de diferenciación. Tales proteínas específicas de diferenciación se expresan generalmente a niveles superiores en células que están haciendo la transición desde el fenotipo no diferenciado al fenotipo diferenciado (por ejemplo, durante el desarrollo embrionario o durante la regeneración de tejido maduro en el animal adulto), o se expresan a niveles superiores en células totalmente diferenciadas o diferenciadas de manera terminal comparadas con sus contrapartes no diferenciadas. También, tal como se denomina en el presente documento, "genes específicos de diferenciación" incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas específicas de diferenciación.

Por consiguiente, otra realización de la invención muestra proteínas CRSP aisladas y polipéptidos que tienen una actividad de CRSP. Proteínas CRSP preferidas tienen al menos una región rica en cisteína y una actividad de CRSP. En otra realización preferida, la proteína CRSP tiene al menos una región rica en cisteína, en la que la región rica en cisteína comprende al menos un dominio rico en cisteína, y una actividad de CRSP. En otra realización preferida, la proteína CRSP tiene al menos una región rica en cisteína, en la que la región rica en cisteína comprende al menos dos dominios ricos en cisteína, y una actividad de CRSP. Todavía en otra realización preferida, una proteína CRSP comprende además una secuencia señal. Aún en otra realización preferida, una proteína CRSP tiene una región rica en cisteína, una actividad de CRSP, y una secuencia de aminoácidos tal como se define en las reivindicaciones
adjuntas.

El ADNc de CRSP-1 humana, que tiene aproximadamente 2479 nucleótidos de longitud, codifica para una proteína que tiene aproximadamente 350 residuos de aminoácidos de longitud. La proteína CRSP humana contiene una secuencia señal N-terminal y una región rica en cisteína que comprende dos dominios ricos en cisteína. Puede encontrarse una región rica en cisteína de CRSP al menos, por ejemplo, desde aproximadamente los aminoácidos 147-284 de SEQ ID NO: 2. La región rica en cisteína de CRSP-1 comprende un primer dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 147-195 de SEQ ID NO: 2 y un segundo dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 201-284 de SEQ ID NO: 2. La proteína CRSP-1 humana es una proteína segregada que contiene adicionalmente una secuencia señal en aproximadamente los aminoácidos 1-23 de SEQ ID NO: 2. La predicción de un péptido señal de este tipo puede hacerse, por ejemplo, utilizando el algoritmo informático SIGNALP (Henrik, et al. (1997) Protein Engineering 10:1-6).

El ADNc de CRSP-2 humana, que tiene aproximadamente 848 nucleótidos de longitud, codifica para una proteína que tiene aproximadamente 224 residuos de aminoácidos de longitud. La proteína CRSP humana contiene una secuencia señal N-terminal y una región rica en cisteína que comprende dos dominios ricos en cisteína. Puede encontrarse una región rica en cisteína de CRSP al menos, por ejemplo, desde aproximadamente los aminoácidos 41-218 de SEQ ID NO: 5. La región rica en cisteína de CRSP-2 comprende un primer dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 41-90 de SEQ ID NO: 5 y un segundo dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 138-218 de SEQ ID NO: 5. La proteína CRSP-2 humana es una proteína segregada que contiene adicionalmente una secuencia señal en aproximadamente los aminoácidos 1-19 de SEQ ID NO: 5.

El ADNc de CRSP-3, que tiene aproximadamente 1529 nucleótidos de longitud, codifica para una proteína que tiene aproximadamente 266 residuos de aminoácidos de longitud. La proteína CRSP humana contiene una secuencia señal N-terminal y una región rica en cisteína que comprende dos dominios ricos en cisteína. Puede encontrarse una región rica en cisteína de CRSP al menos, por ejemplo, desde aproximadamente los aminoácidos 85-263 de SEQ ID NO: 8. La región rica en cisteína de CRSP-3 comprende un primer dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 85-138 de SEQ ID NO: 8 y un segundo dominio rico en cisteína desde aproximadamente los amino ácidos 182-263 de SEQ ID NO: 2. La proteína CRSP-3 humana es una proteína segregada que contiene adicionalmente una secuencia señal en aproximadamente los aminoácidos 1-20 de SEQ ID NO: 8.

El ADNc de CRSP-4 humana, que tiene aproximadamente 702 nucleótidos de longitud, codifica para una proteína que tiene aproximadamente 179 residuos de aminoácidos de longitud. La proteína CRSP humana contiene una región rica en cisteína que comprende dos dominios ricos en cisteína. Puede encontrarse una región rica en cisteína de CRSP al menos, por ejemplo, desde aproximadamente los aminoácidos 1-176 de SEQ ID NO: 11. La región rica en cisteína de CRSP-4 comprende un primer dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 1-47 de SEQ ID NO: 11 y un segundo dominio rico en cisteína desde aproximadamente los aminoácidos 96-176 de SEQ ID NO: 11.

Se describen diversos aspectos de la invención con más detalle en las siguientes subsecciones:

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para proteínas CRSP o partes biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para usarse como sondas de hibridación para identificar ácidos nucleicos que codifican para CRSP (por ejemplo, ARNm de CRSP) y fragmentos para usarse como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de CRSP. Se pretende que el término "molécula de ácido nucleico", tal como se usa en el presente documento, incluya moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generado usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble, pero preferiblemente es ADN de cadena doble.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una que está separada de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean de manera natural el ácido nucleico (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de CRSP aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean de manera natural la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la que se deriva el ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos tal como se define en las reivindicaciones adjuntas, puede aislarse usando técnicas de biología molecular habituales y la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Usando todo o una parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 10, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452 como una sonda de hibridación, pueden aislarse moléculas de ácido nucleico de CRSP usando técnicas de hibridación y clonación habituales (por ejemplo, tales como se describen en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Además, una molécula de ácido nucleico que abarca toda o parte de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 10, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452 puede aislarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos diseñados basándose en la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 10, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452.

Un ácido nucleico de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como un molde y cebadores de oligonucleótidos apropiados según técnicas de amplificación por PCR habituales. El ácido nucleico así amplificado puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a la secuencia de nucleótidos de CRSP pueden prepararse mediante técnicas sintéticas habituales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una secuencia de nucleótidos tal como se define en las reivindicaciones.

La secuencia de SEQ ID NO: 1 corresponde al ADNc de CRSP-1 humana. Este ADNc comprende secuencias que codifican para la proteína CRSP-1 humana (es decir, "la región codificante", desde los nucleótidos 38-1087), así como secuencias no traducidas en 5' (nucleótidos 1 a 37) y secuencias no traducidas en 3' (nucleótidos 1088 a 2479). Alternativamente, la molécula de ácido nucleido puede comprender sólo la región codificante de SEQ ID NO: 1, (por ejemplo, nucleótidos 38 a 1087, correspondientes a SEQ ID NO: 3). Se depositó un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica para CRSP-1 en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, Virginia, EE.UU. 20110-2209 el 11 de Junio de 1997 y se asignó el número de registro 98452. Se depositó un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica para CRSP-1 en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, Virginia, EE.UU. 20110-2209 el 16 de enero de 1998 y se asignó el número de registro 98634.

La secuencia de SEQ ID NO: 4 corresponde al ADNc de CRSP-2 humana. Este ADNc comprende secuencias que codifican para la proteína CRSP-2 humana (es decir, "la región codificante", desde los nucleótidos 126-796), así como secuencias no traducidas en 5' (nucleótidos 1 a 125) y secuencias no traducidas en 3' (nucleótidos 797 a 848). Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender sólo la región codificante de SEQ ID NO: 4 (por ejemplo, nucleótidos 126 a 796, correspondientes a SEQ ID NO: 6).

La SEQ ID NO: 7 corresponde al ADNc de CRSP-3 humana. Este ADNc comprende secuencias que codifican para la proteína CRSP-3 humana (es decir, "la región codificante", desde los nucleótidos 93-890), así como las secuencias no traducidas en 5' (nucleótidos 1 a 92) y secuencias no traducidas en 3' (nucleótidos 891 a 1529). Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender sólo la región codificante de SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, nucleótidos 93 a 890 correspondientes a SEQ ID NO: 9). Se depositó un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica para CRSP-3 en la colección americana de cultivos tipo (ATCC), Manassas, Virginia, EE.UU. 20110-2209 el 16 de enero de 1998 y se asignó el número de registro 98633.

La secuencia de SEQ ID NO: 10 corresponde al ADNc de CRSP-4 humana. Este ADNc comprende secuencias que codifican para la proteína CRSP-4 humana (es decir, "la región codificante", desde nucleótidos 1-537), así como las secuencias no traducidas en 3' (nucleótidos 538 a 702). Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender sólo la región codificante de SEQ ID NO: 10 (por ejemplo, nucleótidos 1 a 537, correspondientes a SEQ ID NO: 12).

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos reivindicada. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia nucleica reivindicada es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos reivindicada de tal manera que puede hibridarse con la secuencia de nucleótidos reivindicada formando así un dúplex estable.

Moléculas de ácido nucleico asiladas útiles comprenden una secuencia de nucleótidos que es homóloga en al menos aproximadamente un 30-35%, de manera preferible aproximadamente un 40-45%; de manera más preferible aproximadamente un 50-55%, de manera preferible incluso más aproximadamente un 60-65%, y de manera preferible incluso más al menos aproximadamente un 70-75%, un 80-85%, un 90-95% o más con la secuencia de nucleótidos reivindicada o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

Además, una molécula de ácido nucleico útil puede comprender sólo una parte de la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452, por ejemplo un fragmento que puede usarse como una sonda o cebador o un fragmento que codifica para una parte biológicamente activa de una proteína CRSP. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación de genes de CRSP humana permite la generación de sondas y cebadores diseñados para usarse en la identificación y/o clonación de homólogos de CRSP en otros tipos de células, por ejemplo a partir de otros tejidos, así como homólogos de CRSP de otros mamíferos. La sonda/cebador comprende normalmente un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende normalmente una región de secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12, de manera preferible de aproximadamente 25, de manera más preferible de aproximadamente 40, 50 ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452, de una secuencia antisentido de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452, o de un mutante que se produce de manera natural de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98452. En una realización a modo de ejemplo, una molécula de ácido nucleico útil comprende una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 470-2479 de SEQ ID NO: 1 o a una molécula de ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1-475 de SEQ ID NO: 4.

Sondas basadas en la secuencia de nucleótidos de CRSP humana pueden usarse para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican para proteínas idénticas u homólogas. Por ejemplo, cebadores basados en el ácido nucleico representado en SEQ ID NO: 1 ó 3 pueden usarse en reacciones de PCR para clonar homólogos de CRSP (por ejemplo, homólogos de CRSP-1). En una realización preferida de la invención, se clonan homólogos de CRSP mediante amplificación por PCR (por ejemplo, RT-PCR) usando cebadores que hibridan con una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio rico en cisteína de CRSP. De igual manera, pueden usarse sondas basadas en las secuencias de CRSP objeto para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican para proteínas idénticas u homólogas. En realizaciones preferidas, la sonda comprende además un grupo marcador unido a la misma, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden usarse como parte de un kit de prueba diagnóstica para identificar células o tejido que expresan erróneamente una proteína CRSP, tal como midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica para CRSP en una muestra de células de un sujeto por ejemplo, detectando niveles de ARNm de CRSP o determinando si un gen de CRSP genómico ha mutado o se ha delecionado.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica para una "parte biológicamente activa de una proteína CRSP" puede prepararse aislando una parte de una secuencia definida en las reivindicaciones adjuntas, que codifica para un polipéptido que tiene una actividad biológica de CRSP (las actividades biológicas de las proteínas CRSP se han descrito previamente), expresando la parte codificada de la proteína CRSP (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada de la proteína CRSP.

La invención engloba además moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452, debido a la degeneración del código genético y por tanto codifica para las mismas proteínas CRSP que las codificadas por la secuencia de nucleótidos definida en las reivindicaciones adjuntas. En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos definida en las reivindicaciones adjuntas.

Además de la secuencia de nucleótidos de CRSP humana mostradas en las reivindicaciones, los expertos en la técnica apreciarán que los polimorfismos de la secuencia de ADN que dan lugar a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas CRSP pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Pueden existir tales polimorfismos genéticos en los genes de CRSP entre individuos dentro de una población debido a variación alélica natural. Tal como se usa en el presente documento, los términos "gen" y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que comprenden un marco de lectura abierto que codifica para una proteína CRSP, preferiblemente una proteína CRSP de mamífero. Tales variaciones alélicas naturales pueden dar normalmente como resultado una varianza del 1-5% en la secuencia de nucleótidos de un gen de CRSP. Se pretende que todas y cada una de tales variaciones nucleotídicas y polimorfismos de aminoácidos resultantes en los genes de CRSP que son el resultado de variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional de una proteína CRSP estén dentro del alcance de la invención.

Además, se pretende que moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas CRSP de otras especies, y que por tanto tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de ácido nucleico humana, estén dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, se ha identificado un ADNc de CRSP-1 murina basándose en la secuencia de nucleótidos de CRSP-1 humana. La secuencia de nucleótidos de CRSP-1 murina (SEQ ID NO: 16) codifica para una proteína CRSP-1 que tiene 349 aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos y nucleótidos de CRSP-1 murina se muestran en la figura 8. La región codificante de CRSP-1 murina está representada por SEQ ID NO: 18.

Moléculas de ácido nucleico correspondientes a variantes alélicas naturales y homólogas de los ADNc de CRSP de la invención pueden aislarse basándose en su homología con los ácidos nucleicos de CRSP humana descritos en el presente documento usando el ADNc humano, o una parte del mismo, como una sonda de hibridación según las técnicas de hibridación habituales bajo condiciones de hibridación rigurosas. Ejemplos de tejidos y/o bibliotecas adecuados para el aislamiento de ácidos nucleicos objeto incluyen timo, ganglios linfáticos y tejido inflamatorio. ADNc que codifica para una proteína CRSP (por ejemplo, una proteína CRSP-1) puede obtenerse aislando ARNm total de una célula, por ejemplo, una célula de vertebrado, una célula de mamífero, o una célula humana, incluyendo células embrionarias. Después pueden prepararse ADNc de cadena doble a partir de ARNm total y posteriormente insertarse en un vector bacteriófago o plásmido adecuado usando una cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. El gen que codifica para una proteína CRSP-1 también puede clonarse usando técnicas de reacción en cadena de polimerasa establecidas según la información de la secuencia de nucleótidos proporcionada por la invención. El ácido nucleico de la invención puede ser ADN o ARN o análogos de los mismos.

Por consiguiente, una molécula de ácido nucleico aislada útil tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y hibrida en condiciones rigurosas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452. En otra realización, el ácido nucleico tiene al menos 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "hibrida en condiciones rigurosas" describa las condiciones de hibridación y lavado en las cuales la secuencia de nucleótidos homólogas en al menos un 60% entre sí permanecen normalmente hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que secuencias homólogas en al menos aproximadamente un 70%, de manera más preferible en al menos aproximadamente un 80%, de manera incluso más preferible en al menos aproximadamente un 85% ó 90% entre sí permanecen hibridadas entre sí. Los expertos en la técnica conocen tales condiciones rigurosas y pueden encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo no limitante preferido de condiciones de hibridación rigurosas es hibridación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido por uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO: 1 corresponde a una molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural. Tal como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico "que se produce de manera natural" se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se produce en la naturaleza (por ejemplo, codifica para una proteína natural).

Además de variantes alélicas que se producen de manera natural de las secuencias de CRSP que pueden existir en la población, el experto en la técnica apreciará adicionalmente que pueden introducirse cambios mediante mutación en las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452, conduciendo así a cambios en la secuencia de aminoácidos de las proteínas CRSP codificadas, sin alterar la capacidad funcional de las proteínas CRSP. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos (particularmente sustituciones de aminoácidos conservativas) en residuos de aminoácidos "no esenciales" en la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452. Un residuo de aminoácido "no esencial" es un residuo que puede alterarse de la secuencia de tipo natural de CRSP (por ejemplo, la secuencia de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido "esencial" se requiere para la actividad biológica. Por ejemplo, residuos de aminoácidos que se conservan entre las proteínas CRSP de la presente invención (por ejemplo, residuos de cisteína dentro de dominios ricos en cisteína), se espera que sean particularmente poco susceptibles de alteración. Además, los residuos de aminoácidos que se conservan entre proteína CRSP y otras proteínas que tienen dominio rico en cisteína es poco probable que sean susceptibles de alteración.

Por consiguiente, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas CRSP que contienen cambios en residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Tales proteínas CRSP difieren en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11 aunque mantienen la actividad biológica. Una molécula de ácido nucleico aislada útil comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína, en la que la proteína comprende una secuencia de aminoácidos homóloga en al menos aproximadamente un 60% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11. Una proteína útil codificada por la molécula de ácido nucleico es homóloga en al menos aproximadamente un 65-70% con la SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11, de manera más preferible homóloga en al menos aproximadamente un 75-80% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11, de manera incluso más preferible homóloga en al menos aproximadamente un 85-90% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11, y de la manera más preferible homóloga en al menos aproximadamente un 95% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO:
11.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un proteína CRSP homóloga a la proteína de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11 puede prepararse introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452, de manera que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en la proteína codificada. Pueden introducirse mutaciones en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452, mediante técnicas habituales, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos conservativas se hacen en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales previstos. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por tanto, un residuo de aminoácido no esencial previsto en una proteína CRSP (por ejemplo, uno no ubicado en un dominio rico en cisteína) se sustituye preferiblemente por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de todo o parte de una secuencia que codifica para de CRSP, tal como mediante mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden examinarse para seleccionar actividad biológica de CRSP para identificar mutantes que conservan actividad. Tras la mutagénesis de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositad en la ATCC con el número de registro 98634, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98452, puede expresarse recombinantemente la proteína codificada y puede determinarse la actividad de la proteína.

Una proteína CRSP mutante puede someterse a ensayo para determinar calcio intracelular, un aumento de fosfatidilinositol u otra molécula, y puede dar como resultado, por ejemplo, la fosforilación de proteínas específicas, una modulación de transcripción génica y cualquiera de las otras actividades biológicas expuestas en el presente documento.

Una proteína CRSP mutante también puede someterse a ensayo para determinar la capacidad de (1) modular la transducción de señal celular, o bien in vitro o in vivo; (2) regular la comunicación entre células; (3) regular la expresión de genes cuya expresión está modulada por la unión de CRSP (por ejemplo, CRSP-1) a un receptor; (4) regular la transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o diferenciación, o bien in vitro o bien in vivo; (5) regular la proliferación celular, o bien in vitro o bien in vivo; (6) formar y/o mantener disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados; (7) modular la muerte celular (por ejemplo supervivencia celular); (8) regular la migración celular; y/o (9) modular la función del sistema inmunitario.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican para las proteínas CRSP descritas anteriormente, la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido con respecto a las mismas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "sentido" que codifica para una proteína, por ejemplo, complementario a la cadena codificante de una molécula de ADNc de cadena doble o complementario a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede unirse mediante enlace de hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena que codifica para CRSP entera, o sólo a una parte de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica para CRSP. El término "región codificante" se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos (por ejemplo, la región codificante de CRSP-1 humana corresponde a SEQ ID NO: 3, la región codificante de CRSP-2 humana corresponde a SEQ ID NO: 6, la región codificante de CRSP-3 humana corresponde a SEQ ID NO: 9, la región codificante de CRSP-4 humana corresponde a SEQ ID NO: 12, y la región codificante de N terminal de tipo CRSP humana corresponde a SEQ ID NO: 15). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región no codificante" de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica para CRSP. El término "región no codificante" se refiere a secuencias en 5' y 3' que flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (es decir, también denominadas regiones no traducidas en 5' y 3').

Dadas las secuencias de cadena codificante codifican para CRSP descritas en el presente documento (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 12), pueden diseñarse ácidos nucleicos antisentido según las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante entera de ARNm de CRSP, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido a sólo una parte de la región codificante o no codificante de ARNm de CRSP. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de traducción de ARNm de CRSP. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ó 50 nucleótidos de longitud. Un ácido nucleico antisentido puede construirse usando síntesis química y reacciones de ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se producen de manera natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleico antisentido y sentido, por ejemplo, pueden usarse derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5- oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, puede producirse biológicamente el ácido nucleico antisentido usando un vector de expresión en el que se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado será de orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito en detalle a en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido se administran normalmente a un sujeto o se generan in situ de manera que hibridan con, o se unen a, ARNm celular y/o ADN genómico que codifica para una proteína CRSP para así inhibir la expresión de la proteína, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, mediante interacciones específicas en la ranura principal de la doble hélice. Un ejemplo de vía de administración de moléculas de ácido nucleico antisentido incluye inyección directa en un sitio tisular. Alternativamente, pueden modificarse moléculas de ácido nucleico antisentido para dirigirse a células seleccionadas y luego administrarse sistemáticamente. Por ejemplo, para administración sistémica, pueden modificarse moléculas antisentido de manera que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo, uniendo las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores o antígenos de superficie celular. Las moléculas de ácido nucleico antisentido también pueden administrarse a células usando los vectores descritos en el presente documento. Para lograr concentraciones intracelulares suficientes de moléculas antisentido, se prefieren constructos de vectores en los que se coloca la molécula de ácido nucleico antisentido bajo el control de un promotor pol II o pol III fuerte.

La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica. Una molécula de ácido nucleico \alpha-anomérica forma híbridos de cadena doble específicos con ARN complementario en los que, al contrario que las unidades \beta habituales, las cadenas corren paralelas la una a la otra (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido también puede comprender un 2'-o-metilrribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) o un análogo ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).

En aún otra realización, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas con actividad ribonucleasa que pueden escindir un ácido nucleico de cadena sencilla, tal como un ARNm, con el que tienen una región complementaria. Por tanto, pueden usarse ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) para escindir catalíticamente transcritos de ARNm de CRSP para así inhibir la traducción de ARNm de CRSP. Puede diseñarse una ribozima que tiene especificidad por un ácido nucleico que codifica para CRSP basándose en la secuencia de nucleótidos de ADNc de CRSP descrita en el presente documento (es decir, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98634, o la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositado en la ATCC con el número de registro 98633). Por ejemplo, puede construirse un derivado de un ARN de Tetrahymena L-19 IVS en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que debe escindirse en un ARNm que codifica para CRSP. Véase, por ejemplo, Cech et al. patente estadounidense número 4.987.071; y Cech et al. patente estadounidense número 5.116.742. Alternativamente, puede usarse ARNm de CRSP para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleasa específica de una combinación de moléculas de ARN. Véase, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J. W. (1993) Science 261:1411-1418.

Alternativamente, puede inhibirse la expresión del gen de CRSP dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de la CRSP (por ejemplo, el promotor y/o potenciador de CRSP) para formar estructuras de triple hélice que evitan la transcripción del gen de CRSP en células diana. Véase de manera general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L. J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.

Las moléculas de ácido nucleico de CRSP de la presente invención pueden modificarse en el resto básico, resto de azúcar o esqueleto de fosfato para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto fosfato desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico puede modificarse para generar ácido nucleicos peptídicos (véase Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1): 5-23). Tal como se usan en el presente documento, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" se refieren a compuestos miméticos de ácido nucleico, por ejemplo, compuestos miméticos de ADN, en los que el esqueleto de fosfato desoxirribosa se sustituye por un esqueleto pseudopeptídico y sólo se conservan las cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutral de los PNA permite hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de baja concentración iónica. La síntesis de oligómeros de PNA puede realizarse usando protocolos de síntesis peptídica en fase sólida habituales tal como se describe en Hyrup B. et al. (1996) citado

\hbox{anteriormente; Perry-O'Keefe  et
al . PNAS 93: 14670-675.}

Los PNA de moléculas de ácido nucleico de CRSP pueden usarse en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, pueden usarse PNA como agentes antisentido o antígenos para la modulación específica de secuencia de la expresión génica mediante, por ejemplo, inducción de la parada de transcripción o traducción o inhibición de la replicación. Los PNA de moléculas de ácido nucleico de CRSP también pueden usarse en el análisis de mutaciones de un único par de bases en un gen, (por ejemplo, mediante adición de estructura de unión por PCR dirigida por PNA); como "enzimas de restricción artificiales" cuando se usan en combinación con otras enzimas, (por ejemplo, nucleasas S 1 (Hyrup B. (1996) citado anteriormente)); o como sondas o cebadores para la hibridación o secuenciación de ADN (Hyrup B. et al. (1996) citado anteriormente; Perry-O'Keefe citado anteriormente).

Los PNA de CRSP pueden modificarse, (por ejemplo, para potenciar su estabilidad o captación celular),uniendo grupos lipófilos u otros grupos cooperadores a PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de administración de fármacos conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden generarse quimeras PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico de CRSP que pueden combinar las propiedades ventajosas de PNA y ADN. Tales quimeras permiten que enzimas de reconocimiento de ADN, (por ejemplo, ARNasa H y ADN polimerasas) interaccionen con la parte de ADN mientras la parte del PNA proporciona una alta afinidad de unión y especificidad. Las quimeras PNA-ADN pueden unirse usando ligadores de longitudes apropiadas seleccionados en cuando al apilamiento de bases, número de enlaces entre las nucleobases y orientación (Hyrup B. (1996) citado anteriormente). La síntesis de quimeras PNA-ADN puede realizarse tal como se describe en Hyrup B. (1996) citado anteriormente y Finn P. J, et al. (1996) Nucleic Acids. Res. 24 (17): 3357-63. Por ejemplo, puede sintetizarse una cadena de ADN sobre un soporte sólido usando la química de acoplamiento de fosforamidita habitual y análogos de nucleósidos modificados, por ejemplo, puede usarse 5'-(4-metoxitritil)amino-5'-desoxi-timidina-fosforamidita, como un entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag, M. et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 5973-88). Después se acoplan los monómeros de PNA de una manera gradual para producir una molécula quimérica con un segmento de PNA en 5' y un segmento de ADN en 3' (Finn P.J. et al. (1996) citado anteriormente). Alternativamente, pueden sintetizarse moléculas quiméricas con un segmento de ADN en 5' y un segmento de PNA en 3' (Peterser, K.H. et al. (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).

El oligonucleótido puede incluir otros grupos unidos tales como péptidos (por ejemplo, para seleccionar como diana receptores de células huésped in vivo), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (véase, por ejemplo, Letsinger et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. US. 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652; publicación PCT número WO88/09810, publicada el 15 de diciembre de 1988) o la barrera hematoencefálica (véase, por ejemplo, la publicación PCT número WO89/10134, publicada el 25 de abril de 1988). Además pueden modificarse los oligonucleótidos con agentes de escisión activada por la hibridación (véase, por ejemplo, Krol et al. (1988) BioTechniques 6:958-976) o agentes intercalables. (Véase, por ejemplo, Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Con este fin, el oligonucleótido puede conjugarse con otra molécula, (por ejemplo, un péptido, un agente de reticulación activada por la hibridación, un agente de transporte o agente de escisión activada por la hibridación).

II. Proteínas CRSP aisladas y anticuerpos anti-CRSP

Un aspecto de la invención se refiere a proteínas CRSP aisladas, y partes biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de polipéptidos adecuados para su uso como inmunógenos para crear anticuerpos anti-CRSP. En una realización, las proteínas CRSP nativas pueden aislarse a partir de fuentes celulares o tisulares mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas habituales. En otra realización, las proteínas CRSP se producen mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, puede sintetizarse químicamente un polipéptido o proteína CRSP usando técnicas de síntesis de péptidos habituales.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una parte biológicamente activa de la misma está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva la proteína CRSP, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente. La expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína CRSP en las que la proteína está separada de componentes celulares de las células de las que se aísla o produce recombinantemente. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína CRSP que tienen menos de aproximadamente un 30% (en peso seco) de proteína distinta de CRSP (también denominada en el presente documento como "proteína contaminante"), de manera más preferible menos de aproximadamente un 20% de proteína distinta de CRSP, de manera aún más preferible menos de aproximadamente un 10% de proteína distinta de CRSP, y de la manera más preferible menos de aproximadamente un 5% de proteína distinta de CRSP. Cuando se produce de manera recombinante la proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma, también está de manera preferible sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente el 20%, de manera más preferible menos de aproximadamente el 10%, y de la manera más preferible menos de aproximadamente el 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de proteína CRSP en las que la proteína se separa de los precursores químicos u otros productos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos" incluye preparaciones de proteína CRSP que tienen menos de aproximadamente el 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos distintos de CRSP, de manera más preferible menos de aproximadamente el 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de CRSP, de manera aún más preferible menos de aproximadamente el 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de CRSP, y de la manera más preferible menos de aproximadamente el 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de CRSP.

Partes biológicamente activas de una proteína CRSP incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente homólogas a, o derivadas de, la secuencia de aminoácidos de la proteína CRSP, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 11, que incluye menos aminoácidos que las proteínas CRSP de longitud completa, y muestran al menos una actividad de una proteína CRSP. Normalmente, las partes biológicamente activas comprenden un domino o motivo con al menos una actividad de la proteína CRSP. Una parte biológicamente activa de una proteína CRSP puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 10, 25, 50, 100 o más aminoácidos de longitud.

En una realización, una parte biológicamente activa de una proteína CRSP comprende al menos una región rica en cisteína. En otra realización, una parte biológicamente activa de una proteína CRSP comprende al menos una región rica en cisteína, en la que la región rica en cisteína incluye al menos un dominio rico en cisteína. Todavía en otra realización, una parte biológicamente activa de una proteína CRSP comprende al menos una secuencia señal.

En una realización alternativa, una parte biológicamente activa de una proteína CRSP comprende una secuencia de aminoácidos de CRSP que carece de una secuencia señal.

Debe entenderse que una parte biológicamente activa de una proteína CRSP preferida de la presente invención puede contener al menos uno de los dominios estructurales anteriormente identificados. Una parte biológicamente activa más preferida de una proteína CRSP puede contener al menos dos de los dominios estructurales anteriormente identificados. Una parte biológicamente activa incluso más preferida de una proteína CRSP puede contener al menos tres de los dominios estructurales anteriormente identificados. Una parte biológicamente activa particularmente preferida de una proteína CRSP de la presente invención puede contener al menos cuatro de los dominios estructurales anteriormente identificados.

Además, otras partes biológicamente activas, en las que se delecionan otras regiones de la proteína, pueden prepararse mediante técnicas recombinantes y evaluarse para determinar una o más actividades funcionales de una proteína CRSP nativa.

La proteína CRSP de la invención tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en las reivindicaciones adjuntas.

Para determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos, se alinean las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para la alineación óptima con una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico). Entonces se comparan los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son homólogas en esa posición (es decir, tal como se usa en el presente documento "homología" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "identidad" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de homología entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = nº de posiciones idénticas /nº total de posiciones x 100). La determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias puede lograrse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Un algoritmo de este tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pueden realizarse búsquedas BLAST de nucleótidos con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a moléculas de ácido nucleico de CRSP de la invención. Pueden realizarse búsquedas BLAST de proteínas con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de proteína CRSP de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos puede usarse Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo no limitante preferido de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Un algoritmo de este tipo se incorpora en al programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de software de alineación de secuencias de GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, pueden usarse una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4.

La invención puede usarse para proporcionar proteínas quiméricas o de fusión de CRSP. Tal como se usa en el presente documento, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de CRSP comprende un polipéptido de CRSP operativamente unido a un polipéptido distinto de CRSP. Un "polipéptido de CRSP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a CRSP, mientras que un "polipéptido distinto de CRSP" se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia aminoácidos correspondiente a una proteína que no es sustancialmente homóloga a la proteína CRSP, por ejemplo, una proteína que es diferente de la proteína CRSP y que se deriva de un organismo idéntico o diferente. Dentro de una proteína de fusión de CRSP del polipéptido de CRSP puede corresponder a todo o una parte de una proteína CRSP. Una proteína de fusión de CRSP comprende al menos una parte biológicamente activa de una proteína CRSP. Otra proteína de fusión de CRSP comprende al menos dos partes biológicamente activas de una proteína CRSP. Otra proteína de fusión de CRSP comprende al menos tres partes biológicamente activas de una proteína CRSP. Dentro de la proteína de fusión, se pretende que el término "operativamente unido" indique que el polipéptido de CRSP y el polipéptido distinto de CRSP están fusionados en marco entre sí. El polipéptido distinto de CRSP puede fusionarse al extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de CRSP.

Por ejemplo, una proteína de fusión es una proteína de fusión GST-CRSP en la que las secuencias de CRSP están fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias de GST. Tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de CRSP recombinante.

Otra proteína de fusión es una proteína CRSP que contiene una secuencia señal heteróloga en su extremo N-terminal. Por ejemplo, la secuencia señal de CRSP nativa (es decir, aproximadamente los aminoácidos 1 a 23 de SEQ ID NO: 2) puede eliminarse y sustituirse por una secuencia señal de otra proteína. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamíferos), la expresión y/o secreción de CRSP puede aumentarse a través del uso de una secuencia señal heteróloga.

Todavía otra proteína de fusión es una proteína de fusión CRSP-inmunoglobulina en la que las secuencias de CRSP que comprenden principalmente las regiones ricas en cisteína de CRSP están fusionadas a secuencias derivadas de otro miembro de la familia de proteínas de inmunoglobulina. También se han preparado derivados solubles de glucoproteínas de superficie celular en la superfamilia de genes de inmunoglobulina que consisten en un dominio extracelular de la glucoproteína de superficie celular unido a una región constante (Fc) de inmunoglobulina (véase por ejemplo, Capon, D.J. et al. (1989) Nature 337:525-531 y Capon patentes estadounidenses números 5.116.964 y 5.428.130 [constructos CD4-IgGI]; Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 173:721-730 [un constructo CD28-IgGI y un constructo B7-I-IgGI]; y Linsley, P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174:561-569 y patente estadounidense número 5.434.131 [un CTLA4-IgG1]). Tales proteínas de fusión han resultado ser útiles para modular las interacciones receptor-ligando. Se han preparado derivados solubles de proteínas de superficie celular del receptor de las proteínas de la superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral (TNPR) que consisten en un dominio extracelular del receptor de superficie celular fusionado con una región constante (Fc) de inmunoglobulina (véase por ejemplo Moreland et al. (1997) N. Engl. J. Med. 337(3):141-147; van der Poll et al. (1997) Blood 89(10):3727-3734; y Ammann et al. (1997) J. Clin. Invest. 99 (7):1699-1703).

Las proteínas de fusión CRSP-inmunoglobulina pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas y administrarse a un sujeto para inhibir una interacción entre un ligando de CRSP y un receptor de CRSP sobre la superficie de una célula, para así suprimir la transducción de señales mediada por CRSP in vivo. Las proteínas de fusión CRSP-inmunoglobulina pueden usarse para afectar a la biodisponibilidad de un receptor relacionado con CRSP. La inhibición de la interacción ligando de CRSP/CRSP puede ser terapéuticamente útil tanto para el tratamiento de trastornos de diferenciación o proliferativos, así como para la modulación (por ejemplo, estimulación o inhibición) de respuestas de desarrollo, adhesión celular y/o destino celular. Además, las proteínas de fusión CRSP-inmunoglobulina de la invención pueden usarse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-CRSP en un sujeto, para purificar ligandos de CRSP y en ensayos de selección para identificar moléculas que inhiben la interacción de CRSP con un ligando de CRSP.

Preferiblemente, una proteína de fusión o quimérica de CRSP se produce mediante técnicas de ADN recombinante habituales. Por ejemplo, fragmentos de ADN que codifican para diferentes secuencias polipeptídicas están ligados juntos en marco según técnicas habituales, por ejemplo empleando extremos romo o en asta para ligamiento, digestión por enzimas de restricción para proporcionar los extremos apropiados, bloqueo de extremos cohesivos según convenga, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar unión no deseable y ligamiento enzimática. El gen de fusión puede sintetizarse meditante técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos génicos puede realizarse usando cebadores de anclaje que dan lugar a proyecciones complementarias entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden aparearse posteriormente y volver a amplificarse para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Además, hay muchos vectores de expresión comercialmente disponibles que ya codifican para un resto de fusión (por ejemplo, un polipéptido de GST). Un ácido nucleico que codifica para CRSP puede clonarse en un vector de expresión de este tipo de manera que el resto de fusión esté unido en marco a la proteína CRSP.

La presente invención también se refiere a variantes de las proteínas CRSP que funcionan o bien como agonistas de CRSP (compuestos miméticos) o bien como antagonistas de CRSP. Pueden generarse variantes de las proteínas CRSP mediante mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual diferenciada o truncamiento de una proteína CRSP. Un agonista de las proteínas CRSP puede conservar sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma que se produce de manera natural de una proteína CRSP. Un antagonista de una proteína CRSP puede inhibir una o más actividades de la forma que se produce de manera natural de la proteína CRSP mediante, por ejemplo, unión competitiva a un elemento aguas abajo o aguas arriba de una cascada de señalización celular que incluye la proteína CRSP. Por tanto, puede provocarse efectos biológicos específicos mediante tratamiento con una variante de función limitada. En una realización, el tratamiento de un sujeto con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma que se produce de manera natural de la proteína tiene menos efectos secundarios en un sujeto con respecto al tratamiento con la forma que se produce de manera natural de la proteína CRSP.

Variantes de una proteína CRSP que funcionan o bien como agonistas de CRSP (compuestos miméticos) o bien como antagonistas de CRSP pueden identificarse examinando bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, de una proteína CRSP para seleccionar la actividad agonista o antagonista de una proteína CRSP. En una realización, una biblioteca diversa de variantes de CRSP se genera mediante mutagénesis combinatoria en el nivel de ácido nucleico y se codifica por una biblioteca génica diversa. Una biblioteca diversa de variantes de CRSP puede producirse mediante, por ejemplo, ligamiento enzimático de una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas de manera que un conjunto degenerado de secuencias de CRSP potenciales pueda expresarse como polipéptidos individuales, o alternativamente, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, para presentación en fagos) que contienen el conjunto de secuencias de CRSP en las mismas. Existe una variedad de métodos que pueden usarse para producir bibliotecas de variantes de CRSP potenciales a partir de una secuencia de oligonucleótidos degenerada. La síntesis química de una secuencia génica degenerada puede realizarse en un sintetizador de ADN automático, y entonces puede ligarse el gen sintético en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite proporcionar, en una mezcla, todas las secuencias que codifican para el conjunto deseado de secuencias de CRSP potenciales. En la técnica se conocen métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados (véase, por ejemplo, Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477.

Además, pueden usarse bibliotecas de fragmentos de una secuencia que codifica para una proteína CRSP para generar una población diversa de fragmentos de CRSP para examinar y posteriormente seleccionar variantes de una proteína CRSP. En una realización, puede generarse una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante tratando un fragmento de PCR de doble cadena de una secuencia que codifica para CRSP con una nucleasa en condiciones en las que la creación de mellas se produce aproximadamente sólo una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de cadena doble, volviendo a naturalizar el ADN para formar ADN de cadena doble que puede incluir pares sentido/antisentido de diferentes productos con mella, eliminando partes de cadena sencilla de los dúplex reformados mediante el tratamiento con nucleasa S I, y ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, puede derivarse una biblioteca de expresión que codifica para fragmentos N-terminal, C-terminal e internos de diversos tamaños de la proteína CRSP.

En la técnica se conocen varias técnicas para examinar productos génicos de bibliotecas combinatorias preparados mediante mutaciones puntuales o truncamiento, y para examinar bibliotecas de ADNc para seleccionar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Tales técnicas son adaptables para examinar rápidamente bibliotecas de genes generadas mediante la mutagénesis combinatoria de las proteínas CRSP. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles de análisis riguroso, para examinar grandes bibliotecas génicas incluyen normalmente clonar la biblioteca génica en vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante y expresar genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica para el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursiva (REM - "Recrusive Ensemble Mutagenesis"), una nueva técnica que potencia la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, puede usarse en combinación con los ensayos de selección para identificar variantes de CRSP (Arkin y Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331).

Los ensayos basados en células pueden explotarse para analizar una biblioteca de CRSP diversa. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede transfectarse en una línea celular que normalmente responde a un ligando particular de una manera dependiente de CRSP. Después se ponen en contacto las células transfectadas con el ligando y puede detectarse el efecto de la expresión del mutante sobre la señalización por el ligando, por ejemplo, midiendo cualquiera de varias respuestas celulares inmunitarias. El ADN del plásmido puede recuperarse entonces a partir de las células que puntúan para la inhibición, o alternativamente, para la potenciación de inducción de ligando, y caracterizarse adicionalmente los clones individuales.

Una proteína CRSP aislada, o una parte o fragmento de la misma, puede usarse como un inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a CRSP usando técnicas habituales para la preparación de anticuerpo policlonal y monoclonal. Puede usarse una proteína CRSP de longitud completa o, alternativamente, la invención proporciona fragmentos de péptidos antigénicos de CRSP para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de CRSP comprende al menos 8 residuos de aminoácidos y abarca un epítopo de CRSP de manera que un anticuerpo preparado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con CRSP. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente al menos 15 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 20 residuos de aminoácidos, y lo más preferiblemente al menos 30 residuos de aminoácidos.

Epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de CRSP que están ubicadas sobre la superficie de la proteína, por ejemplo, regiones hidrófilas.

Normalmente se usa un inmunógeno de CRSP para preparar anticuerpos mediante inmunización de un sujeto adecuado, (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, proteína CRSP expresada de manera recombinante o un polipéptido de CRSP químicamente sintetizado. La preparación puede incluir adicionalmente un adyuvante, tal como un adyuvante completo o incompleto de Freund, o agente inmunoestimulante similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de CRSP inmunogénica induce una respuesta de anticuerpo policlonal anti-CRSP.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a anticuerpos anti-CRSP. El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como CRSP. Ejemplos de partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden generarse tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a CRSP. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de sitio de unión a antígeno que puede inmunorreaccionar con un epítopo particular de CRSP. Por tanto, una composición de anticuerpo monoclonal presenta una afinidad de unión única para una proteína CRSP particular con la que inmunorreacciona.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales anti-CRSP tal como se describió anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno de CRSP. El título de anticuerpo anti-CRSP en el sujeto inmunizado puede monitorizarse a lo largo del tiempo mediante técnicas habituales, tales como con un ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) usando CRSP inmovilizada. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra CRSP pueden aislarse del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado tras la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-CRSP son lo más altos, pueden obtenerse las células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y usarse para preparar anticuerpos mediante técnicas habituales, tales como la técnica del hibridoma originalmente descrita por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (véase también, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. .255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la técnica de hibridoma de célula B humana más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpo monoclonal se conoce bien (véase de manera general R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, Nueva York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36). En resumen, una línea celular inmortal (normalmente un mieloma) se fusiona con linfocitos (normalmente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de CRSP tal como se describió anteriormente, y los sobrenadantes del cultivo de las células de hibridoma resultantes se examinan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a CRSP.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas puede aplicarse con fines de generación de un anticuerpo monoclonal anti-CRSP (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266:55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., citado anteriormente; Lerner, Yale J Biol. Med., citado anteriormente; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado anteriormente). Además, el experto en la técnica apreciará que existen muchas variaciones de tales métodos que también pueden ser útiles. Normalmente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizado. Líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede usarse cualquiera de una variedad de líneas celulares de mieloma como una pareja de fusión según técnicas habituales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la ATCC. Normalmente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Entonces se seleccionan células de hibridoma resultantes de la fusión usando medio HAT, que mata células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren tras varios días porque no se transforman). Se detectan células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención examinando los sobrenadantes de cultivo para seleccionar anticuerpos que se unen a CRSP, por ejemplo, usando un ensayo ELISA habitual.

Alternativamente a la preparación de hibridomas que segregan anticuerpo monoclonal, puede identificarse un anticuerpo anti-CRSP monoclonal y aislarse examinando una biblioteca de inmunoglobulina combinatoria recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación en fagos de anticuerpo) con CRSP para así aislar miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen a CRSP. Existen kits disponibles comercialmente para generar y examinar bibliotecas de presentación de fagos (por ejemplo, el sistema de anticuerpo de fago recombinante ("Recombinant Phage Antibody System") de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-0 1; y el kit de presentación de fago ("Phage Display Kit") SurfZAP^{TM} de Stratagene, número de catálogo 240612). Adicionalmente, ejemplos de métodos y reactivos particularmente útiles para su uso para generar y examinar bibliotecas de presentación de anticuerpo pueden encontrarse en, por ejemplo, Ladner et al. patente estadounidense número 5.223.409; Kang et al. publicación PCT internacional número WO 92/18619; Dower et al. publicación PCT internacional número WO 91/17271; Winter et al. publicación PCT internacional WO 92/20791; Markland et al. publicación PCT internacional número WO 92/15679; Breitling et al. publicación PCT internacional WO 93/01288; McCafferty et al. publicación PCT internacional número WO 92/01047; Garrard et al. publicación PCT internacional número WO 92/09690; Ladner et al. publicación PCT internacional número WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.

Adicionalmente, anticuerpos anti-CRSP recombinantes, tal como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto partes humanas como no humanas, que pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante habituales, están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en Robinson et al. solicitud internacional número PCT/US86/02269; Akira, et al. solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496; Morrison et al. solicitud de patente europea 173.494; Neuberger et al. publicación PCT internacional número WO 86/01533; Cabilly et al. patente estadounidense número 4.816.567; Cabilly et al. solicitud de patente europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Winter patente estadounidense número 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J Immunol. 141:4053-4060.

Puede usarse un anticuerpo anti-CRSP (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar CRSP mediante técnicas habituales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-CRSP puede facilitar la purificación de CRSP natural a partir de células y de CRSP producidas de manera recombinante expresadas en células huésped. Además, puede usarse un anticuerpo anti-CRSP para detectar proteína CRSP (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y patrón de expresión de la proteína CRSP. Pueden usarse anticuerpos anti-CRSP de manera diagnóstica para monitorizar niveles de proteína en tejido, por ejemplo, como parte de procedimiento de ensayo clínico, para, por ejemplo, determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Puede facilitarse la detección acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupo prostético incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{35}S o ^{3}H.

III. Vectores de expresión recombinantes y células huésped

Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contienen un ácido nucleico que codifica para CRSP (o una parte de la misma). Tal como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales en el genoma viral. Ciertos vectores pueden experimentar replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamíferos episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y por tanto se replican junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan en el presente documento como "vectores de expresión". En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usad de vector. Sin embargo, se pretende que la invención incluya otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus y retrovirus defectuosos para la replicación), que presentan funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células huésped que van a usarse para la expresión, que están operativamente unidas a la secuencia de ácido nucleico secuencia que va a expresarse. Dentro de un vector de expresión recombinante, se pretende que "operativamente unido" signifique que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la(s) secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando se introduce el vector en la célula huésped). Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de célula huésped y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células huésped (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células huésped para así producir proteínas o péptidos, incluyendo péptidos o proteínas de fusión, codificadas por ácidos nucleicos tal como se describió en el presente documento (por ejemplo, proteínas CRSP, formas mutantes de CRSP, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para expresar CRSP en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, puede expresarse CRSP en células bacterianas tal como E. coli, células de insecto (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Células huésped adecuadas se tratan adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Alternativamente, puede transcribirse y traducirse el vector de expresión recombinante in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras de promotor de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas se realiza lo más a menudo en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas o bien de fusión o bien no de fusión. Los vectores de fusión añaden una variedad de aminoácidos a una proteína codificada en los mismos, normalmente en el extremo amino-terminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión normalmente sirven para tres fines: 1) aumentar la expresión de proteína recombinante; 2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) ayudar en la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión posterior a la purificación de la proteína de fusión. Tales enzimas, y sus secuencias de reconocimiento relacionadas, incluyen factor Xa, trombina y enterocinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. y Johnson, K. S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fusionan glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E, o proteína A, respectivamente, a la proteína recombinante diana.

Pueden utilizarse proteínas de fusión purificadas en ensayos de actividad de CRSP, en unión a ligando de CRSP (por ejemplo, ensayos directos o ensayos competitivos descritos con detalle a continuación), para generar anticuerpos específicos para proteínas CRSP, como ejemplos. En una realización preferida, una fusión de CRSP expresada en un vector de expresión retroviral de la presente invención puede utilizarse para infectar células de la médula ósea que se transplantan posteriormente en los receptores irradiados. La patología del sujeto receptor se examina entonces tras haber transcurrido suficiente tiempo (por ejemplo seis (6) semanas).

Ejemplos de vectores de expresión de E. coli no de fusión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión de gen diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de ARN polimerasa del huésped a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión gn10-lac de T7 mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (gn1 de T7). Esta polimerasa viral se suministra por cepas huésped BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que alberga un gen gnl de T7 bajo control transcripcional del promotor 5 lacUV.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteína recombinante en E. coli es expresar la proteína en una bacteria huésped con una capacidad afectada para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico que va a insertarse en un vector de expresión de manera que los codones individuales para cada aminoácido son los utilizados preferentemente en E. coli (Wada et al., (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Tal alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse mediante técnicas de síntesis de ADN habituales.

En otra realización, el vector de expresión de CRSP es un vector de expresión de levadura. Ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), y picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).

Alternativamente, puede expresarse CRSP en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:31-39).

Todavía en otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan a menudo por elementos reguladores virales. Por ejemplo, promotores comúnmente usados derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas véanse los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante puede dirigir la expresión del ácido nucleico preferiblemente en un tipo de célula particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). En la técnica se conocen elementos reguladores específicos de tejido. Ejemplos no limitantes de promotores específicos de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, promotor de suero de leche; patente estadounidense 4.873.316 y solicitud de patente europea número 264.166). También se abarcan promotores regulados por desarrollo, por ejemplo los promotores de hox (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada en el vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está operativamente unida a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión (mediante transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido con respecto a ARNm de CRSP. Pueden elegirse secuencias reguladoras operativamente unidas a un ácido nucleico clonado en la orientación antisentido que dirijan la expresión continua de una molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo potenciadores y/o promotores virales, o pueden elegirse secuencias reguladoras que dirijan la expresión específica de tejido o específica de tipo de célula constitutiva de ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido recombinante, faguémido o virus atenuado en el que los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficacia, cuya actividad puede determinarse por el tipo de célula en la que se introduce el vector. Para una evaluación de la regulación de expresión génica usando genes antisentido véase Weintraub, H. et al., Antisense ARN as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1 (1) 1986.

Otro aspecto de la invención se refiere a células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos "célula huésped" y "célula huésped recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la célula objeto particular sino a la progenie o progenie potencial de una célula de este tipo. Dado que pueden producirse ciertas modificaciones en generaciones posteriores debido o bien a mutación o bien a influencias ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula original, pero aun así se incluyen dentro del alcance del término tal como se usa en el presente documento.

Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, puede expresarse una proteína CRSP en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los expertos en la técnica conocen otras células huésped
adecuadas.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transfección o transformación convencionales. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que los términos "transformación" y "transfección" se refieran a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, incluyendo coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Métodos adecuados para transformar o transfectar células huésped pueden encontrarse en Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia frente a antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia frente a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Puede introducirse ácido nucleico que codifica para un marcador seleccionable en una célula huésped en el mismo vector que el que codifica para CRSP o puede introducirse en un vector separado. Pueden identificarse células transfectadas de manera estable con el ácido nucleico introducido mediante selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen de marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) proteína CRSP. Por consiguiente, la invención proporciona adicionalmente métodos para producir proteína CRSP usando las células huésped de la invención. En una realización, el método comprende poner en cultivo la célula huésped de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica para CRSP) en un medio adecuado de manera que se produce la proteína CRSP. En otra realización, el método comprende adicionalmente aislar CRSP del medio o de la célula huésped.

Las células huésped de la invención también pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula huésped de la invención es un ovocito fertilizado no humano o una célula madre embrionaria no humana en la que se han introducido secuencias que codifican para CRSP. Tales células huésped pueden usarse entonces para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido secuencias de CRSP exógenas en su genoma o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado secuencias de CRSP endógenas. Tales animales son útiles para el estudio de la función y/o actividad de CRSP y para identificar y/o evaluar moduladores de actividad de CRSP. Tal como se usa en el presente documento, un "animal transgénico" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un roedor tal como una rata o ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras pollos, anfibios, etc. Un transgén es ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta manera la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Tal como se usa en el presente documento, un "animal recombinante homólogo" es un animal no humano, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un ratón, en el que se ha alterado un gen de CRSP endógeno mediante recombinación homóloga entre el gen endógeno y la molécula de ADN exógeno introducido en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Un animal transgénico no humano de la invención puede crearse introduciendo un ácido nucleico que codifica para CRSP en el pronúcleo masculino de un ovocito fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, infección retroviral, y permitiendo que el ovocito se desarrollo en un animal de acogida hembra pseudopreñada. La secuencia de ADNc de CRSP humana de la invención puede introducirse como un transgén en el genoma de un animal no humano. Alternativamente, un homólogo no humano de un gen de CRSP humana, tal como un gen de CRSP de ratón, puede aislarse basándose en la hibridación con el ADNc de CRSP humana (descrito adicionalmente en la subsección I anterior) y usarse como un transgén. También pueden incluirse secuencias intrónicas y señales de poliadenilación en el transgén para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Puede(n) unirse operativamente una(s) secuencia(s) reguladora(s)
específica(s) de tejido al transgén de CRSP para dirigir la expresión de la proteína CRSP a células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos no humanos mediante manipulación embrionaria y microinyección, particularmente en animales tales como ratones, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en las patentes estadounidenses números 4.736.866 y 4.870.009, ambas concedidas a Leder et al., patente estadounidense número 4.873.191 concedida a Wagner et al., y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se usan métodos similares para la producción de otros animales transgénicos no humanos. Un animal fundador transgénico no humano puede identificarse basándose en la presencia del transgén de CRSP en su genoma y/o expresión de ARNm de CRSP en tejidos o células de los animales. Entonces puede usarse un animal fundador transgénico no humano para criar animales adicionales que llevan el transgén. Además, los animales transgénicos no humanos que llevan un transgén que codifica para CRSP pueden criarse adicionalmente para generar otros animales transgénicos no humanos que llevan otros transgenes.

Para crear un animal no humano recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un gen de CRSP en el que se ha introducido una deleción, adición o sustitución para así alterar, por ejemplo, afectar funcionalmente, el gen de CRSP. El gen de CRSP puede ser un gen humano (por ejemplo, el ADNc de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 12), pero más preferiblemente, es un homólogo no humano de un gen de CRSP humano. Por ejemplo, un gen de CRSP de ratón de SEQ ID NO: 16 puede usarse para construir un vector de recombinación homólogo adecuado para alterar un gen de CRSP endógeno en el genoma del ratón. En una realización preferida, se diseña el vector de manera que, tras la recombinación homóloga, el gen de CRSP endógeno se altera funcionalmente (es decir, ya no codifica para una proteína funcional; también denominado como un vector "deficiente"). Alternativamente, puede diseñarse el vector de manera que, tras la recombinación homóloga, el gen de CRSP endógeno se muta o de otra manera se altera pero aún codificará para proteína funcional (por ejemplo, puede alterarse la región reguladora en sentido 5' para así alterar la expresión de la proteína CRSP endógena). En el vector de recombinación homólogo, la parte alterada del gen de CRSP está flanqueada en sus extremos 5' y 3' por ácido nucleico adicional del gen de CRSP para permitir que se produzca la recombinación homóloga entre el gen de CRSP exógeno llevado por el vector y un gen de CRSP endógeno en una célula madre embrionaria no humana. El ácido nucleico de CRSP flanqueante adicional es de suficiente longitud como para una recombinación homóloga satisfactoria con el gen endógeno. Normalmente, se incluyen varias kilobases de ADN flanqueante (tanto en el extremo 5' como 3') en el vector (véase por ejemplo, Thomas, K.R. y Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 para una descripción de vectores de recombinación homólogos). Se introduce el vector en una línea de células madre embrionarias no humanas (por ejemplo, mediante electroporación) y se seleccionan células en las que el gen de CRSP introducido se ha recombinado de manera homóloga con el gen de CRSP endógeno (véase por ejemplo, Li, E. et al., (1992) Cell 69:915). Las células seleccionadas se inyectan entonces en un blastocito de un animal no humano (por ejemplo, un ratón) para formar quimeras de agregación (véase por ejemplo, Bradley, A. en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) págs. 113-152). Entonces puede implantarse un embrión quimérico no humano en un animal de acogida no humano hembra pseudopreñada adecuada y llevar el embrión a término. La progenie que alberga el ADN recombinado de manera homóloga en sus células germinales puede usarse para criar animales en los que todas las células del animal contienen el ADN recombinado de manera homóloga por la transmisión de línea germinal del transgén. Se describen adicionalmente métodos para construir vectores de recombinación homólogos y animales recombinantes homólogos en Bradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2:823-829 y en las publicaciones internacionales PCT números: WO 90/11354 por Le Mouellec et al.; WO 91/01140 por Smithies et al; WO 92/0968 por Zijlstra et al.; y WO 93/04169 por Berns et al.

En otra realización, pueden producirse animales no humanos transgénicos que contienen sistemas seleccionados que permiten expresión regulada del transgén. Un ejemplo de un sistema de este tipo es el sistema cre/loxP recombinasa del bacteriófago P1. para una descripción del sistema cre/loxP recombinasa, véase, por ejemplo, Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6236. Otro ejemplo de sistema recombinasa es el sistema FLP recombinasa de Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355). Si se usa un sistema cre/loxP recombinasa para regular la expresión del transgén, se requieren animales que contienen transgenes que codifican tanto para la Cre recombinasa como para una proteína seleccionada. Tales animales pueden proporcionarse mediante la construcción de animales transgénicos "dobles" no humanos, por ejemplo, mediante reproducción de dos animales transgénicos no humanos, conteniendo uno un transgén que codifica para una proteína seleccionada y conteniendo el otro un transgén que codifica para una recombinasa.

Clones de los animales transgénicos no humanos descritos en el presente documento también pueden producirse según los métodos descritos en Wilmut, I. et al. (1997) Nature 385:810-813. En resumen, una célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico puede aislarse e inducirse a salir del ciclo de crecimiento y entrar en la fase Go. Después puede fusionarse la célula quiescente, por ejemplo, mediante el uso de pulsos eléctricos, a un ovocito endonucleado no humano de un animal de la misma especie a partir de la que se aísla la célula quiescente. El ovocito no humano reconstruido se cultiva entonces de manera que se desarrolle para dar una mórula o blastocito y luego se transfiere a un animal de acogida hembra pseudopreñada. Las crías nacidas de este animal de acogida hembra serán un clon del animal a partir del cual se aísla la célula, por ejemplo, la célula somática.

IV. Composiciones farmacéuticas

Las moléculas de ácido nucleico de CRSP, las proteínas CRSP, y los anticuerpos anti-CRSP (también denominados en el presente documento "principios activos") de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración. Tales composiciones comprenden normalmente la molécula de ácido nucleico, proteína, o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para los principios farmacéuticamente activos se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También pueden incorporarse en las composiciones, principios activos complementarios.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración deseada. Ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, vía intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa, y rectal. Las disoluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o parabenos metílicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como el cloruro de sodio o la dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso inyectable incluyen disoluciones acuosas estériles (que son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de la dispersión o las disoluciones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL^{TM} (BASF, Parsippany, NJ) solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que exista una fácil capacidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. Puede provocarse la absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las disoluciones inyectables estériles pueden prepararse mediante la incorporación del principio activo (por ejemplo, una proteína CRSP o anticuerpo anti-CRSP) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los componentes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del principio activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros componentes de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío, y liofilización, lo que produce un polvo del principio activo más cualquier componente adicional deseado a partir de una disolución previamente filtrada para esterilidad del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden incorporarse en cápsulas de gelatina o fabricarse por compresión para dar lugar a comprimidos. Para el fin de la administración terapéutica oral, el principio activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en la forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse utilizando un vehículo fluido para su uso como un enjuague bucal, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se utiliza como enjuague y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes de unión y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los componentes o compuestos siguientes de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente discrepante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en la forma de un pulverizador de aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede realizarse mediante medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se utilizan en la formulación agentes penetrantes apropiados para la permeación de la barrera. Tales agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa puede llevarse a cabo a través del uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los principios activos se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas, tal como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos también pueden prepararse en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

En una realización, los principios activos se preparan con vehículos que protegerán al compuesto frente a la rápida eliminación del organismo, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido polilácico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden utilizarse suspensiones de liposomas (incluyendo liposomas dirigidos para células infectadas con anticuerpos monoclonales frente a antígenos virales) como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse según los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense número 4.522.811.

Resulta especialmente ventajoso formular las composiciones orales o parenterales en formas farmacéuticas unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que va a tratarse; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada del principio activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la invención están dictadas por y dependen directamente de las características únicas del principio activo y del efecto terapéutico particular que va a lograrse, y de las limitaciones inherentes en la técnica de la formulación de un principio activo de este tipo para el tratamiento de los individuos.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos de este tipo pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La razón de dosis entre los efectos tóxicos y los terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la razón DL50/DE50. Se prefieren los compuestos que muestran índices terapéuticos elevados. Aunque pueden utilizarse compuestos que muestran efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un sistema de administración que dirija tales compuestos al sitio del tejido afectado con el fin de minimizar el posible daño a células no infectadas y, de esta manera, reducir los efectos secundarios.

Pueden utilizarse los datos obtenidos a partir de ensayos con cultivos celulares y estudios con animales para formular un intervalo de dosificación para su uso en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo, dependiendo de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede calcularse inicialmente a partir de los ensayos del cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentraciones plasmáticas circulantes que incluyen la CI50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la mitad de la inhibición máxima de los síntomas) tal como se determina en el cultivo celular. Tal información puede utilizarse para determinar más exactamente las dosis útiles en humanos. Pueden medirse los niveles en plasma, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (véase la patente estadounidense 5.328.470) o mediante inyección esteotáctica (véase por ejemplo, Chen et al. (1994) PNAS 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que está incluido el vehículo de administración génica. Alternativamente, cuando puede producirse el vector de administración génica completo intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, los vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de administración génica.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluir un envase, paquete, o dispensador, junto con instrucciones para la administración.

V. Usos y métodos de la invención

Las moléculas de la presente invención (por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos, proteínas, homólogos de proteínas, y anticuerpos descritos en el presente documento) pueden utilizarse en uno o más de los siguientes métodos: a) ensayos de selección; b) medicina de diagnóstico (por ejemplo, ensayos de diagnósticos, ensayos de pronóstico, ensayos clínicos de monitorización, y ensayos farmacogenéticos); y c) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéuticos y profilácticos). Tal como se describe en el presente documento, una proteína CRSP de la invención tiene una o más de las siguientes actividades: calcio intracelular, un aumento en el fosfatidilinositol u otra molécula, y puede dar como resultado, por ejemplo, la fosforilación de proteínas específicas, una modulación de la transcripción génica y cualquiera de las otras actividades biológicas explicadas en el presente documento.

En una realización preferida, una actividad de CRSP es al menos una o más de las siguientes actividades: (i) interacción de una proteína CRSP con y/o unión a una segunda molécula, (por ejemplo, una proteína, tal como un receptor de CRSP (por ejemplo, CRSP-1), una forma soluble de un receptor de CRSP, un receptor para un miembro de la familia wnt de proteínas de señalización, o una molécula de señalización distinta de CRSP); (ii) interacción de una proteína CRSP con una proteína intracelular mediante un receptor de CRSP unido a la membrana; (iii) formación de complejo entre una proteína CRSP soluble y una segunda pareja de unión de CRSP soluble (por ejemplo, una molécula de proteína distinta de CRSP o una segunda molécula de proteína CRSP); (iv) interacción con otras proteínas extracelulares (por ejemplo, regulación de la adhesión celular dependiente de wnt a los componentes de la matriz extracelular); (v) unión a y eliminación de una molécula no deseada (por ejemplo, una función de actividad detoxificante o de defensa); y/o (vi) una actividad enzimática, y por tanto puede utilizarse en, por ejemplo, (1) modulación de transducción de señales celulares, ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, antagonismo de la actividad de los miembros de la familia wnt de proteínas segregadas o supresión de la transducción de señales dependientes de wnt); (2) regulación de la comunicación entre células (por ejemplo, regulación de interacciones célula-célula dependientes de wnt); (3) regulación de la expresión de genes cuya expresión está modulada mediante la unión de la CRSP (por ejemplo, CRSP-1) a un receptor; (4) regulación de la transcripción génica en una célula que participa en el desarrollo o la diferenciación, ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, inducción de diferenciación celular); (5) regulación de la transcripción génica en una célula que participa en el desarrollo o la diferenciación, en la que al menos un gen codifica para una proteína específica de diferenciación; (6) regulación de la transcripción génica en una célula que participa en el desarrollo o la diferenciación, en la que al menos un gen codifica para una segunda proteína segregada; (7) regulación de la transcripción génica en una célula que participa en el desarrollo o la diferenciación, en la que al menos un gen codifica para una molécula de transducción de señales; (8) regulación de la proliferación celular, ya sea in vitro o in vivo (por ejemplo, inducción de la proliferación celular o inhibición de la proliferación como en el caso de la supresión de la tumorigénesis (por ejemplo, supresión de formación de glioblastoma)); (9) formación y mantenimiento de disposiciones espaciales ordenadas de tejidos diferenciados en vertebrados, tanto adultos como embrionarios (por ejemplo, inducción de la formación de la cabeza durante el desarrollo de vertebrados o mantenimiento de las células progenitoras hematopoyéticas); (10) modulación de la muerte celular, tal como estimulación de la supervivencia celular; (11) migración de las células de regulación; y/o (12) modulación inmunitaria.

En consecuencia, una realización de la presente invención supone un método de uso (por ejemplo, un ensayo diagnóstico, un ensayo pronóstico, o un método profiláctico/terapéutico de tratamiento) en el que se usa una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína CRSP, un ácido nucleico de CRSP, o un modulador de CRSP), por ejemplo, para diagnosticar, pronosticar y/o tratar una enfermedad y/o estado en el que está indicada cualquiera de las actividades anteriormente mencionadas (es decir, actividades (i) - (vi) y (1) - (12) en el párrafo anterior). En otra realización, la presente invención supone un método de uso (por ejemplo, un ensayo diagnóstico, un ensayo pronóstico, o la fabricación de un medicamento para un método de tratamiento profiláctico/terapéutico) en el que se usa una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína CRSP, ácido nucleico de CRSP, o un modulador de CRSP), por ejemplo, en la fabricación de un medicamento para el diagnóstico, pronóstico, y/o tratamiento de sujetos, preferiblemente de un sujeto humano, en el que está alterada patológicamente cualquiera de las actividades anteriormente mencionadas. En una realización preferida, los métodos de uso (por ejemplo, ensayos de diagnósticos, ensayos de pronóstico, o fabricación de medicamentos para métodos de tratamiento profilácticos/terapéuticos) suponen la producción de un medicamento para su administración a un sujeto, preferiblemente un sujeto humano, de una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína CRSP, ácido nucleico de CRSP, o un modulador de CRSP) para el diagnóstico, pronóstico, y/o tratamiento terapéutico. En otra realización, los métodos de uso (por ejemplo, ensayos de diagnósticos, ensayos de pronóstico, o fabricación de medicamentos para métodos de tratamiento profilácticos/terapéuticos tratamiento) suponen la producción de un medicamento para su administración a un sujeto humano de una molécula de la presente invención (por ejemplo, una proteína CRSP, ácido nucleico de CRSP, o un modulador de CRSP).

Otras realizaciones de la invención están relacionadas con el uso de moléculas de ácidos nucleicos aisladas de la invención que pueden usarse, por ejemplo, para expresar la proteína CRSP (por ejemplo, mediante un vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar ARNm de CRSP (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de CRSP, y para modular la actividad de CRSP, tal como se describe adicionalmente más adelante. Además, las proteínas CRSP pueden usarse como fármacos o compuestos de selección que modulan la actividad de CRSP, así como para tratar trastornos caracterizados por producción insuficiente o excesiva de proteína CRSP o producción de formas de proteína CRSP que tienen actividad diminuida o aberrante en comparación con la proteína CRSP de tipo natural (por ejemplo, trastornos del desarrollo, enfermedades proliferativas tales como cáncer así como enfermedades, estados o trastornos caracterizados por la diferenciación y/o supervivencia celular anómala, una estructura extracelular anómala, o una anomalía en un mecanismo de defensa). Además, los anticuerpos anti-CRSP de la invención pueden utilizarse para detectar y aislar proteínas CRSP, regular la biodisponibilidad de las proteínas CRSP, y modular la actividad de CRSP. La expresión "una actividad aberrante", tal como se aplica a una actividad de una proteína tal como CRSP (por ejemplo, CRSP-1), se refiere a una actividad que difiere de la actividad de la proteína natural o nativa o que difiere de la actividad de la proteína en un sujeto sano. Una actividad de una proteína puede ser aberrante debido a que es más fuerte que la actividad de su homóloga nativa. Alternativamente, una actividad puede ser aberrante debido a que es más débil o a que está ausente con respecto a la actividad de su homóloga nativa. Una actividad aberrante también puede ser un cambio en una actividad. Por ejemplo una proteína aberrante puede interaccionar con una proteína diferente con respecto a su homóloga nativa. Una célula puede tener una actividad de CRSP aberrante (por ejemplo, CRSP-1) debido a la expresión superior o inferior a lo normal del gen que codifica para CRSP.

A. Ensayos de selección

La invención proporciona un método (también denominado en el presente documento un "ensayo de selección") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes de prueba o candidatos (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas u otros fármacos) que se unen a las proteínas CRSP o tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre, por ejemplo, la expresión de CRSP o la actividad de CRSP. Los moduladores pueden incluir, por ejemplo, agonistas de CRSP y/o antagonistas de CRSP. El término "agonista", tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un agente que imita o regula por incremento (por ejemplo potencia o complementa) una bioactividad de CRSP (por ejemplo, CRSP-1). Un agonista de CRSP puede ser un compuesto que imita a una bioactividad de una proteína CRSP, tal como la transducción de una señal desde un receptor de CRSP, mediante por ejemplo, la interacción con un receptor de CRSP-1. Un agonista de CRSP también puede ser un compuesto que regula por incremento la expresión de un gen de CRSP. Un agonista de CRSP también puede ser un compuesto que modula la expresión o actividad de una proteína que está situada posteriormente a un receptor de CRSP, imitando o potenciando así el efecto de la unión de CRSP a un receptor de CRSP.

"Antagonista" tal como se usa en el presente documento, pretende referirse a un agente que inhibe, disminuye o suprime una bioactividad de CRSP (por ejemplo, CRSP-1). Un antagonista puede ser un compuesto que disminuye la señalización de una proteína CRSP, por ejemplo, un compuesto que puede producir la unión a CRSP-1 o a un receptor de CRSP-1. Un antagonista de CRSP preferido inhibe la interacción entre una proteína CRSP y otra molécula, tal como un receptor de CRSP. Alternativamente, un antagonista de CRSP puede ser un compuesto que regula por disminución la expresión de un gen de CRSP. Un antagonista de CRSP también puede ser un compuesto que modula la expresión o la actividad de una proteína que está situada posteriormente a un receptor de CRSP, antagonizando así con el efecto de unión de CRSP a un receptor de CRSP.

En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos de prueba o candidatos que se unen a o que modulan la actividad de una proteína CRSP o polipéptido o parte biológicamente activa de los mismos. En otra realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos de prueba o candidatos que se unen a o modulan la actividad de un receptor de CRSP. Los compuestos de prueba de la presente invención pueden obtenerse utilizando cualquiera de los numerosos enfoques en los métodos de biblioteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase de disolución o fase sólida paralelas espacialmente dirigibles; métodos de biblioteca sintética que requieren deconvolución; el método de biblioteca de “una perla un compuesto” (“one-bead one-compound”); y métodos de biblioteca sintéticos utilizando selección mediante cromatografía de afinidad. El enfoque de la biblioteca biológica se limita a las bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a las bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o pequeñas moléculas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Pueden encontrarse en la técnica ejemplos de métodos para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J Med. Chem. 37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y en Gallop et al. (1994) J Med. Chem. 37:1233.

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en disolución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (patente estadounidense 5.223.409 de Ladner), esporas (patente estadounidense '409 de Ladner), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner citado anteriormente).

En una realización, un ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa un receptor de CRSP en la superficie celular está en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse a un receptor de CRSP. La célula, por ejemplo, puede ser de origen mamífero o una célula de levadura. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para unirse a un receptor de CRSP puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante el acoplamiento del compuesto de prueba con un radioisótopo o un marcador enzimático, de manera que la unión del compuesto de prueba al receptor de CRSP puede determinarse detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden marcarse con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo puede detectarse mediante el recuento directo de radioemisión o mediante recuento por centelleo. Alternativamente, los compuestos de prueba pueden marcarse enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y el marcador enzimático puede detectarse mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en
producto.

También está dentro del alcance de esta invención determinar la capacidad de un compuesto de prueba para interaccionar con un receptor de CRSP sin marcar ninguno de los compuestos que interaccionan. Por ejemplo, puede utilizarse un microfisiómetro para detectar la interacción de un compuesto de prueba con un receptor de CRSP sin el marcaje del compuesto de prueba o el receptor. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912. Tal como se usa en el presente documento, un "microfisiómetro" (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno utilizando un detector potenciométrico dirigible mediante luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación pueden utilizarse como indicadores de la interacción entre el ligando y el receptor.

En una realización preferida, el ensayo comprende poner en contacto una célula que expresa un receptor de CRSP en la superficie celular con una proteína CRSP o una parte biológicamente activa de la misma, para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con un receptor de CRSP, en la que la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con un receptor de CRSP comprende determinar la capacidad del compuesto de prueba unirse preferentemente al receptor de CRSP en comparación con la capacidad de CRSP, o de una parte biológicamente activa de la misma, para unirse al receptor.

En otra realización, un ensayo es un ensayo basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de CRSP con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo estimular o inhibir) la actividad de la molécula diana de CRSP. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una molécula diana de CRSP puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de la proteína CRSP para unirse a o para interaccionar con la molécula diana de CRSP.

La determinación de la capacidad de la proteína CRSP para unirse o interaccionar con una molécula diana de CRSP puede llevarse a cabo mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización preferida, la determinación de la capacidad de la proteína CRSP para unirse o interaccionar con una molécula diana de CRSP puede llevarse a cabo mediante la determinación de la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana puede determinarse mediante la detección de la inducción de un segundo mensajero celular de la molécula diana (es decir Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP_{3}, etc.), detección de la actividad catalítica/enzimática de la molécula diana de un sustrato apropiado, detección de la inducción de un gen indicador (que comprende un elemento regulador sensible a CRSP unido operativamente a un ácido nucleico que codifica para un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o detección de una respuesta celular, por ejemplo, desarrollo, diferenciación o velocidad de proliferación.

Todavía en otra realización, un ensayo de la presente invención es un ensayo libre de células en el que una proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse a la proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma. La unión del compuesto de prueba a la proteína CRSP puede determinarse directa o indirectamente tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, el ensayo incluye poner en contacto la proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a CRSP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto el mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteína CRSP, en la que la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con una proteína CRSP comprende determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse preferentemente a la CRSP o parte biológicamente activa de la misma as en comparación con el compuesto
conocido.

En otra realización, el ensayo es un ensayo libre de células en el que una proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína CRSP puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de la proteína CRSP para unirse a una molécula diana de CRSP mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. La determinación de la capacidad de la proteína CRSP para unirse a una molécula diana de CRSP también puede llevarse a cabo utilizando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real. Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Tal como se usa en el presente documento, "BIA" es una tecnología para el estudio de las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los compuestos que interaccionan (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) pueden usarse como indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En una realización alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una proteína CRSP puede llevarse a cabo mediante la determinación de la capacidad de la proteína CRSP para modular adicionalmente la actividad de una molécula diana de CRSP. Por ejemplo, puede determinarse la actividad catalítica/enzimática de la molécula diana en un sustrato apropiado, tal como se describió anteriormente.

Todavía en otra realización, el ensayo libre de células supone poner en contacto una proteína CRSP o parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a la proteína CRSP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto el mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con la proteína CRSP, en la que la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con la proteína CRSP comprende determinar la capacidad de la proteína CRSP para unirse preferentemente a o para modular la actividad de una molécula diana de CRSP.

En muchos programas de selección de fármacos que prueban las bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseable ensayos de alto rendimiento con el fin de maximizar el número de compuestos examinados en un periodo de tiempo dado. A menudo se prefieren los ensayos que se realizan en sistemas libres de células, tales como los que pueden derivarse de proteínas purificadas o semipurificadas, como selecciones "primarias" porque pueden generarse para permitir el rápido desarrollo y la detección relativamente fácil de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de prueba. Además, los efectos de la toxicidad y/o biodisponibilidad celular del compuesto de prueba pueden ignorarse generalmente en el sistema in vitro, enfocándose por el contrario el ensayo principalmente en el efecto del fármaco sobre la diana molecular, ya que puede manifestarse en una alteración en la afinidad de unión con elementos aguas arriba o aguas abajo. En consecuencia, en un ensayo de selección ejemplo de la presente invención, el compuesto de interés se pone en contacto con una proteína CRSP (por ejemplo, CRSP-1) o una pareja de unión de CRSP (por ejemplo, CRSP-1), por ejemplo, un receptor. El receptor puede ser soluble o el receptor puede estar presente en una superficie celular. Entonces se añade a la mezcla del compuesto y a la proteína CRSP o pareja de unión de CRSP una composición que contiene una pareja de unión de CRSP o una proteína CRSP, respectivamente. La detección y cuantificación de los complejos de proteínas CRSP y Parejas de unión de CRSP proporcionan un medio para determinar la eficacia de un compuesto para inhibir (o potencia) la formación del complejo entre CRSP y una pareja de unión. La eficacia del compuesto puede evaluarse generando curvas de respuesta a la dosis a partir de los datos obtenidos utilizando diversas concentraciones del compuesto de prueba. Además, también puede realizarse un ensayo de control para proporcionar una línea base para comparación. En el ensayo de control, se añade el polipéptido o pareja de unión de CRSP aislado y purificado a una composición que contiene la CRSP pareja de unión o el polipéptido CRSP, y se cuantifica la formación de un complejo en ausencia del compuesto de prueba.

Los ensayos libres de células de la presente invención son susceptibles de usarse con formas solubles y/o unidas a la membrana de proteínas aisladas (por ejemplo proteínas CRSP o partes biológicamente activas de las mismas o moléculas diana de CRSP). En el caso de los ensayos libres de células en los que se usa una forma unida a la membrana de proteína aislada (por ejemplo, una molécula diana o receptor de CRSP) puede ser deseable utilizar un agente solubilizante de manera que la forma unida a la membrana de la proteína aislada se mantenga en disolución. Ejemplos de agentes solubilizantes de este tipo incluyen detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, isotridecipoli(etilenglicol éter)_{n}, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-1-propano (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilaminio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), o N-dodecil=N, sulfonato de N-dimetil-3-amonio-1-propano.

En más de una realización de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar o bien CRSP o bien su molécula diana para facilitar la separación de las formas complejadas de las no complejadas de una o ambas proteínas, así como adaptar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a una proteína CRSP, o la interacción de una proteína CRSP con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, puede llevarse a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/CRSP o las proteínas de fusión glutatión-S-transferasa/proteína diana pueden adsorberse en perlas de glutatión-Sepharosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que entonces se combinan con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y o bien la proteína diana no adsorbida o bien la proteína CRSP, y la mezcla se incuba en estados conductores para la formación de complejos (por ejemplo, en estados fisiológicos para sal y pH). Tras la incubación, las perlas o pocillos de las placas de microtitulación se lavan para eliminar cualquier componente no unido, la matriz se inmoviliza en el caso de las perlas, el complejo se determina directa o indirectamente, por ejemplo, tal como se describió anteriormente. Alternativamente, los complejos pueden disociarse de la matriz y puede determinarse el nivel de unión o actividad de la CRSP utilizando técnicas habituales.

En los ensayos de selección de la invención también pueden utilizarse otras técnicas para inmovilizar proteínas en matrices. Por ejemplo, puede inmovilizarse o bien una proteína CRSP o bien una molécula diana de CRSP utilizando conjugación de biotina y estreptavidina. La proteína CRSP o las moléculas diana biotiniladas pueden prepararse a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilización, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertos con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, pueden derivatizarse anticuerpos reactivos con proteína CRSP o moléculas diana pero que no interfieren con la unión de la proteína CRSP a su molécula diana, a los pocillos de la placa, y a la molécula diana no unida o a la proteína CRSP atrapada en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados a GST, incluyen inmunodetección de complejos utilizando anticuerpos reactivos con la proteína CRSP o la molécula diana, así como ensayos ligados a enzimas que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína CRSP o la molécula diana.

En otra realización, se identifican los moduladores de la expresión de CRSP en un método en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP en la célula. El nivel de expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de del ARNm de CRSP o la proteína CRSP en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato puede identificarse entonces como un modulador de la expresión de CRSP basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP es mayor (mayor de manera estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP es menor (menor de manera estadísticamente significativa) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP. El nivel de expresión del ARNm de CRSP o la proteína CRSP en las células puede determinarse mediante los métodos descritos en el presente documento para detectar del ARNm de CRSP o la proteína CRSP.

Todavía en otro aspecto de la invención, las proteínas CRSP pueden usarse como "proteínas cebo" en un ensayo de dos híbridos o un ensayo de tres híbridos (véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; y documento WO94/10300 de Brent), para identificar otras proteínas, que se unen a o interaccionan con CRSP ("proteínas de unión a CRSP" o "CRSP-pb") y modulan la actividad de CRSP. Tales proteínas de unión a CRSP también es probable que participen en la propagación de las señales producidas por las proteínas CRSP as, por ejemplo, a elementos aguas abajo de una ruta de señalización mediada por CRSP. Alternativamente, es probable que tales proteínas de unión a CRSP sean moléculas de la superficie celular asociadas con células que no expresan CRSP, en las que tales proteínas de unión a CRSP participan en la transducción de señales.

El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayor parte de los factores de transcripción, que consiste en dominios de activación y unión al ADN que pueden separarse. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica para una proteína CRSP se fusiona con un gen que codifica para el dominio de unión al ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN, procedente de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica para una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona con un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" pueden interaccionar, in vivo, formando un complejo dependiente de CRSP, los dominios de activación y unión al ADN del factor de transcripción se transportan en proximidad cercana. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ) que está operativamente unido a un sitio de regulación de la transcripción que responde al factor de transcripción. Puede detectarse la expresión del gen indicador y pueden aislarse las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional y utilizarse para obtener el gen clonado que codifica para la proteína que interacciona con la proteína CRSP.

Esta invención se refiere además a agentes novedosos que identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente y a procedimientos para producir tales agentes mediante el uso de estos ensayos. Por consiguiente, en una realización, la presente invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende las etapas de uno cualquiera de los ensayos de selección mencionados anteriormente (por ejemplo, ensayos basados en célula o ensayos libres de células). Por ejemplo, en una realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de CRSP con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse a, o modular la actividad de, la molécula diana de CRSP. En otra realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una célula que expresa una molécula diana de CRSP con una proteína CRSP o una parte biológicamente activa de la misma, para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con, o modular la actividad de, la molécula diana de CRSP. En otra realización, la invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una proteína CRSP o una parte biológicamente activa de la misma con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse a, o modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de, la proteína CRSP o la parte biológicamente activa de la misma. En todavía otra realización, la presente invención incluye un compuesto o agente que puede obtenerse mediante un método que comprende poner en contacto una proteína CRSP o una parte biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a la proteína CRSP para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de prueba, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para interaccionar con, o modular la actividad de la proteína CRSP.

Por consiguiente, está dentro del alcance de esta invención el uso adicional de un agente identificado tal como se describe en el presente documento en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, puede usarse un agente identificado tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, un agente modulador de CRSP, una molécula de ácido nucleico de CRSP antisentido, un anticuerpo específico para CRSP, o una pareja de unión a CRSP) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con tal agente. Alternativamente, un agente identificado tal como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de tal agente.

La presente invención también se refiere a los usos de agentes novedosos identificados mediante los ensayos de selección descritos anteriormente para diagnósticos, pronósticos y tratamientos, tal como se describe en el presente documento. Por consiguiente, está dentro del alcance de la presente invención el uso de tales agentes en el diseño, formulación, síntesis, fabricación, y/o producción de un fármaco o composición farmacéutica para usase en el diagnóstico, pronóstico o tratamiento, tal como se describe en el presente documento. Por ejemplo, en una realización, la presente invención incluye un método para sintetizar o producir un fármaco o composición farmacéutica haciendo referencia a la estructura y/o las propiedades de un compuesto que puede obtenerse mediante uno de los ensayos de selección descritos anteriormente. Por ejemplo, un fármaco o composición farmacéutica puede sintetizarse basándose en la estructura y/o propiedades de un compuesto obtenido mediante un método en el que una célula que expresa una molécula diana de CRSP se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse a, o modular la actividad de, la molécula diana de CRSP. En otra realización a modo de ejemplo, la presente invención incluye un método para sintetizar o producir un fármaco o una composición farmacéutica basándose en la estructura y/o las propiedades de un compuesto que puede obtenerse mediante un método en el que una proteína CRSP o una parte biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse a, o modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de, la proteína CRSP o la parte biológicamente activa de la misma.

B. Ensayos de detección

Partes o fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas en el presente documento (y las correspondientes secuencias génicas completas) pueden usarse de numerosas maneras como reactivos polinucleotídicos. Por ejemplo, estas secuencias pueden usarse para: (i) mapear sus respectivos genes en un cromosoma; y, por tanto, localizar regiones génicas asociadas con una enfermedad genética; (ii) identificar a un individuo de una muestra biológica mínima (tipificación de tejido); y (iii) ayuda en identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las subsecciones a continuación.

1. Mapeo de cromosomas

Una vez se ha aislado la secuencia (o una parte de la secuencia) de un gen, puede usarse esta secuencia para mapear la ubicación del gen en un cromosoma. Este procedimiento se denomina mapeo cromosómico. Por consiguiente, partes o fragmentos de la secuencia de nucleótidos de CRSP, descritos en el presente documento, pueden usarse para mapear la ubicación de los genes de CRSP en un cromosoma. El mapeo de las secuencias de CRSP en los cromosomas es una primera etapa importante para correlacionar estas secuencias con genes asociados con enfermedad.

En resumen, los genes de CRSP pueden mapearse en cromosomas para preparar cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb de longitud) a partir de la secuencia de nucleótidos de CRSP. Puede usarse un análisis informático de las secuencias de CRSP para predecir cebadores que no se expanden más de un exón en el ADN genómico, complicando así el procedimiento de amplificación. Después pueden usarse estos cebadores para examen por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de CRSP darán como resultado un fragmento amplificado.

Se preparan los híbridos de células somáticas mediante la fusión de células somáticas de distintos mamíferos (por ejemplo, células humanas y de ratón). A medida que crecen y se dividen los híbridos de células humanas y de ratón, pierden gradualmente cromosomas humanos de manera aleatoria, pero conservan los cromosomas de ratón. Mediante el uso de medios en los que las células de ratón no pueden crecer, porque carecen de una enzima particular, pero las células humanas sí pueden, se conservará el cromosoma que contiene el gen que codifica para la enzima necesaria. Mediante el uso de diversos medios, pueden establecerse paneles de líneas celulares híbridas. Cada línea celular en un panel contiene o bien un cromosoma humano sencillo o bien un pequeño número de cromosomas humanos, y un conjunto completo de cromosomas de ratón, permitiendo un fácil mapeo de genes individuales para cromosomas humanos específicos. (D'Eustachio P. et al. (1983) Science 220: 919-924). También pueden producirse híbridos de células somáticas que contienen sólo fragmentos de cromosomas humanos usando cromosomas humanos con translocaciones y deleciones.

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar una secuencia particular a un cromosoma particular. Pueden asignarse tres o más secuencias por día usando un ciclador térmico sencillo. Usando la secuencia de nucleótidos de CRSP para diseñar cebadores oligonucleotídicos, puede lograrse la sublocalización con paneles de fragmentos de cromosomas específicos. Otras estrategias de mapeo que pueden usarse de manera similar para mapear una secuencia 9o, 1p, o 1v para su cromosoma incluyen hibridación in situ (descrita en Fan, Y. et al. (1990) PNAS, 87:6223-27), preselección con cromosomas separados por citometría de flujo marcados y preselección mediante hibridación con bibliotecas de ADNc específicas de cromosomas.

La hibridación in situ fluorescente (FISH) de una secuencia de ADN con una metafase cromosómica extendida puede usarse adicionalmente para proporcionar una localización cromosómica precisa en una etapa. Las extensiones de cromosomas pueden prepararse usando células cuya división se ha bloqueado en metafase mediante un producto químico tal como colcemid que altera el huso acromático mitótico. Los cromosomas pueden tratarse brevemente con tripsina, y luego teñirse con Giemsa. En cada cromosoma se revela un patrón de bandas claras y oscuras, de manera que los cromosomas pueden identificarse individualmente. La técnica FISH puede usarse con una secuencia de ADN de tan solo 500 ó 600 bases. Sin embargo, los clones superiores a 1.000 bases tienen mayor probabilidad de unirse a una única ubicación cromosómica con suficiente intensidad de señal para la detección simple. Preferiblemente 1.000 bases, y más preferiblemente 2.000 bases serán suficientes para obtener buenos resultados en una cantidad razonable de tiempo. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, Nueva York 1988).

Pueden usarse reactivos para el mapeo de cromosomas individualmente para marcar un único cromosoma o un sitio único en ese cromosoma, o pueden usarse paneles de reactivos para marcar sitios múltiples y/o cromosomas múltiples. De hecho, se prefieren los reactivos correspondientes a regiones no codificantes de los genes con fines de mapeo. Es más probable que las secuencias codificantes se conserven dentro de las familias de genes, aumentando así la posibilidad de hibridaciones cruzadas durante el mapeo cromosómico.

Una vez se ha mapeado una secuencia en una ubicación cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, disponible en línea a través de la biblioteca médica Welch de la Universidad Johns Hopkins (Johns Hopkins University Welch Medical Library)). La relación entre un gen y una enfermedad, mapeada en la misma región cromosómica, puede identificarse entonces a través del análisis de unión (co-herencia de genes físicamente adyacentes), descrito en, por ejemplo, Egeland, J. et al. (1987) Nature, 325: 783-787.

Además, pueden determinarse las diferencias en las secuencias de ADN entre individuos afectados y no afectados con una enfermedad asociada al gen de CRSP. Si se observa una mutación en alguno o todos los individuos afectados pero no en cualquier individuo no afectado, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad particular. La comparación de individuos afectados y no afectados generalmente implica mirar en primer lugar para detectar alteraciones estructurales en los cromosomas, tales como deleciones, translocaciones que son visibles desde las extensiones de cromosomas o detectables usando PCR basándose en esa secuencia de ADN. Por último, puede realizarse la secuenciación completa de los genes de varios individuos para confirmar la presencia de una mutación para distinguir mutaciones de polimorfismos.

2. Tipificación tisular

También pueden usarse las secuencias de CRSP de la presente invención para identificar individuos de muestras biológicas mínimas. El ejército de los Estados Unidos, por ejemplo, está considerando el uso de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) para la identificación de su personal. En esta técnica, se digiere el ADN genómico de un individuo con una o más enzimas de restricción, y se examinan con sondas en una transferencia tipo Southern para dar lugar a bandas únicas para la identificación. Este método no adolece de las limitaciones actuales de las "Dog Tags" (placas identificativas del ejército de los EE.UU.) que pueden perderse, cambiarse, o robarse, dificultando la identificación positiva. Las secuencias de la presente invención son útiles como marcadores adicionales de ADN para RFLP (descritas en la patente estadounidense número 5.272.057).

Además, las secuencias de la presente invención pueden usarse para proporcionar una técnica alternativa que determina la secuencia de ADN real base por base de partes seleccionadas del genoma de un individuo. Por tanto, la secuencia de nucleótidos de CRSP descrita en el presente documento puede usarse para preparar dos cebadores de PCR a partir de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores pueden usarse entonces para amplificar el ADN de un individuo y posteriormente secuenciarlo.

Los paneles de secuencias de ADN correspondientes de individuos, preparados de esta manera, pueden proporcionar identificaciones individuales únicas, dado que cada individuo tendrá un conjunto único de tales secuencias de ADN debido a diferencias alélicas. Las secuencias de la presente invención pueden usarse para obtener tales secuencias de identificación a partir de individuos y de tejidos. La secuencia de nucleótidos de CRSP de la invención únicamente representa partes del genoma humano. La variación alélica se produce hasta cierto grado en las regiones codificantes de estas secuencias, y en mayor grado en las regiones no codificantes. Se estima que la variación alélica entre individuos humanos se produce con una frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases. Cada una de las secuencias descritas en el presente documento puede usarse, hasta cierto grado, como un patrón frente al que puede compararse el ADN de un individuo con fines identificativos. Dado que se producen mayores números de polimorfismos en las regiones no codificantes, se necesitan menos secuencias para diferenciar individuos. Las secuencias no codificantes de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, o SEQ ID NO: 10, pueden proporcionar cómodamente identificación de individuo positiva con un panel de quizás 10 a 1.000 cebadores, cada uno de los cuales da como resultado una secuencia amplificada no codificante de 100 bases. Si se usan las secuencias codificantes previstas, tales como las de SEQ ID NO: 3, SEO ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 12, un número más apropiado de cebadores para la identificación de individuo positiva será de 500-2.000.

Si se usa un panel de reactivos de una secuencia de nucleótidos de CRSP descritos en el presente documento para generar una base de datos de identificación única, esos mismos reactivos pueden usarse más adelante para identificar el tejido de ese individuo. Usando la base de datos de identificación única, puede realizarse identificación positiva del individuo, vivo o muerto, a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.

3. Uso de secuencias de CRSP en biología forense

También pueden usarse técnicas de identificación basadas en ADN en biología forense. La biología forense es un campo científico que emplea tipificación genética de evidencias biológicas encontradas en la escena de un crimen como medio para identificar positivamente, por ejemplo, al autor principal de un crimen. Para realizar tal identificación, puede usarse tecnología de PCR para amplificar secuencias de ADN tomadas a partir de muestras biológicas muy pequeñas tales como tejidos, por ejemplo, cabello o piel, o fluidos corporales, por ejemplo, sangre, saliva, o semen encontrados en la escena de un crimen. La secuencia amplificada puede compararse entonces con un patrón, permitiendo así la identificación del origen de la muestra biológica.

Las secuencias de la presente invención pueden usarse para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, cebadores de PCR, dirigidos hacia loci específicos en el genoma humano, lo que puede potenciar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN, por ejemplo, proporcionando otro "marcador de identificación" (es decir otra secuencia de ADN que es única para un individuo particular). Tal como se mencionó anteriormente, la información básica real de secuencia puede usarse para la identificación como una alternativa precisa a los patrones formada por fragmentos generados por enzimas de restricción. Las secuencias dirigidas hacia regiones no codificantes de la secuencia de nucleótidos de la invención son particularmente apropiadas para este uso, dado que se produce un mayor número de polimorfismos en las regiones no codificantes, haciendo que sea más fácil diferenciar a los individuos usando esta técnica. Ejemplos de reactivos polinucleotídicos incluyen las secuencias de nucleótidos de CRSP o una parte de las mismas, por ejemplo, los fragmentos derivados de las regiones no codificantes de las secuencias de nucleótidos de la invención, que tienen una longitud de al menos 20 bases, preferiblemente de al menos 30 bases.

Las secuencias de nucleótidos de CRSP descrita en el presente documento puede usarse adicionalmente para proporcionar reactivos polinucleotídicos, por ejemplo, sondas marcadas o que se pueden marcar que pueden usarse en, por ejemplo, una técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico, por ejemplo, tejido cerebral. Esto puede ser muy útil en casos en los que un patólogo forense se presenta con un tejido de origen desconocido. Los paneles de tales sondas de CRSP pueden usarse para identificar tejidos mediante especies y/o por tipo de órgano.

De una manera similar, estos reactivos, por ejemplo, sondas o cebadores de CRSP, pueden usarse para examinar cultivo tisular para detectar contaminación (es decir, examinar para detectar la presencia de una mezcla de distintos tipos de células en un cultivo).

C. Medicina de diagnóstico

La presente invención también se refiere al campo de la medicina de diagnóstico, en la que se usan ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos clínicos de monitorización con fines de pronóstico, (predictivos) para tratar así a un individuo profilácticamente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la proteína CRSP y/o la expresión del ácido nucleico, así como la actividad de CRSP, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejido) para determinar así si un individuo está afectado por una enfermedad o trastorno o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad de CRSP aberrante, tal como la proliferación, diferenciación, y/o supervivencia celular aberrante, dando como resultado por ejemplo una enfermedad neurodegenerativa o cáncer. La invención también se refiere a ensayos de pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la actividad, expresión de ácido nucleico o proteína CRSP. Por ejemplo, pueden someterse a ensayo las mutaciones en un gen de CRSP en una muestra biológica. Tales ensayos pueden usarse con fines de pronóstico o predictivos para tratar así profilácticamente a un individuo antes del comienzo de un trastorno caracterizado por o asociado con la actividad, expresión de ácido nucleico o proteína CRSP.

Otro uso de la invención se refiere a la monitorización de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión o actividad de CRSP en ensayos clínicos.

Estos y otros agentes se describen con detalle a continuación en las siguientes secciones.

1. Ensayos de diagnóstico

Un método a modo de ejemplo para detectar la presencia o ausencia de la proteína CRSP o el ácido nucleico en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de prueba y poner la muestra biológica con un compuesto o agente que puede detectar la proteína CRSP o el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADN genómico) que codifica para la proteína CRSP, de manera que se detecte la presencia de proteína CRSP o ácido nucleico en la muestra biológica. Un agente preferido para la detección de ADN genómico o ARNm de CRSP es una sonda de ácido nucleico marcada que puede hibridarse con ADN genómico o ARNm de CRSP. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un ácido nucleico de CRSP de longitud completa, tal como un ácido nucleico de la invención, o una parte del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridarse específicamente en condiciones rigurosas con ADN genómico o ARNm de CRSP. En el presente documento se describen otras sondas adecuadas para su uso en los ensayos de diagnóstico de la invención.

Un agente preferido para detectar la proteína CRSP es un anticuerpo que puede unirse a la proteína CRSP, preferiblemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Puede usarse un anticuerpo intacto o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab o F(ab')_{2}). Se pretende que el término "marcado", en relación con la sonda o anticuerpo, englobe el marcaje directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante la reacción con otro reactivo que está marcado directamente. Ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado por fluorescencia y el marcaje de extremo de una sonda de ADN con biotina de manera que pueda detectarse con estreptavidina marcada por fluorescencia. Se pretende que el término "muestra biológica" incluya tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Es decir, el método de detección de la invención puede usarse para detectar ADN genómico, proteína o ARNm de CRSP en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm de CRSP incluyen hibridaciones de tipo Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de proteína CRSP incluyen ensayos de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), inmunotransferencias de tipo Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para detectar ADN genómico de CRSP incluyen hibridaciones de tipo Southern. Además, las técnica in vitro para la detección de proteína CRSP incluyen introducir un anticuerpo anti-CRSP marcado en un sujeto. Por ejemplo, puede marcarse el anticuerpo con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto puede detectarse mediante técnicas de formación de imágenes habituales.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de prueba. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de prueba o moléculas de ADN genómico del sujeto de prueba. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada mediante medios convencionales a partir de un sujeto.

En otra realización, los métodos implican adicionalmente obtener una muestra biológica control de un sujeto control, poner en contacto la muestra control con un compuesto o agente que puede detectar ADN genómico, ARNm o proteína CRSP, de manera que se detecte la presencia de ADN genómico, ARNm o proteína CRSP en la muestra biológica y se compare la presencia de ADN genómico, ARNm o proteína CRSP en la muestra control con la presencia de ADN genómico, ARNm o proteína CRSP en la muestra de prueba.

La invención también engloba kits para detectar la presencia de CRSP en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un agente o compuesto marcado que puede detectar el ARNm o proteína CRSP en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de CRSP en la muestra; y medios para comparar la cantidad de CRSP en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar envasado en un recipiente adecuado. Adicionalmente, el kit puede comprender instrucciones para usar el kit para detectar ácido nucleico o proteína CRSP.

2. Ensayos de pronóstico

Los métodos de diagnóstico descritos en el presente documento pueden utilizarse además para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con actividad o expresión de CRSP aberrante. Por ejemplo, los ensayos descritos en el presente documento, tal como los anteriores ensayos de diagnósticos o los siguientes ensayos, pueden utilizarse para identificar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la actividad, la expresión del ácido nucleico o la proteína CRSP, tal como un trastorno proliferativo, un trastorno del desarrollo o de la diferenciación, un trastorno así como enfermedades hematopoyéticas, estados o trastornos caracterizados por supervivencia celular anómala, estructura extracelular anómala o una anomalía en un mecanismo de defensa. Alternativamente, los ensayos de pronóstico pueden utilizarse para identificar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad proliferativa o de diferenciación (por ejemplo, cáncer). Por tanto, la presente invención proporciona un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o la expresión de CRSP aberrante, en el que la muestra de prueba se obtiene a partir de un sujeto y se detecta el ácido nucleico o la proteína CRSP (por ejemplo, ARNm, ADN genómico), en el que la presencia de ácido nucleico o proteína CRSP es diagnóstico para un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la actividad o la expresión de CRSP aberrante. Tal como se usa en el presente documento, una "muestra de prueba" se refiere a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de prueba puede ser un fluido biológico (por ejemplo, suero), muestra celular o tejido.

Además, los ensayos de pronóstico descritos en el presente documento pueden usarse para determinar si se le puede o no administrar a un sujeto un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato a fármaco) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con actividad o expresión de CRSP aberrante. Por ejemplo, pueden usarse tales métodos para determinar si un sujeto puede tratarse eficazmente con un agente para un trastorno, tal como trastorno proliferativo, trastorno de diferenciación o del desarrollo, un trastorno hematopoyético, así como trastornos caracterizados por supervivencia celular anómala, estructura extracelular anómala o una anomalía en un mecanismo de defensa. Alternativamente, pueden usarse tales métodos para determinar si puede o no tratarse eficazmente a un sujeto con un agente para una enfermedad de diferenciación o proliferativa (por ejemplo, cáncer). Por tanto, la presente invención proporciona métodos para determinar si un sujeto puede tratarse eficazmente con un agente para un trastorno asociado con actividad o expresión de CRSP aberrante, en el que se obtiene una muestra de prueba y se detecta la actividad o expresión de ácido nucleico o proteína CRSP (por ejemplo, en el que la abundancia de actividad o expresión de ácido nucleico o proteína CRSP es diagnóstico para un sujeto al que se le pueden administrar el agente para tratar un trastorno asociado con actividad o expresión de CRSP aberrante).

Los métodos de la invención también pueden usarse para detectar alteraciones genéticas en un gen de CRSP, determinando así si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de padecer un trastorno caracterizado por desarrollo aberrante, diferenciación celular aberrante, proliferación celular aberrante o una respuesta hematopoyética aberrante. En realizaciones preferidas, los métodos incluyen detectar, en una muestra de células del sujeto, la presencia o ausencia de una alteración genética mediante al menos una de una alteración que afecta a la integridad de un gen que codifica para una proteína CRSP, o la expresión fallida del gen de CRSP. Por ejemplo, pueden detectarse tales alteraciones genéticas determinando la existencia de al menos una de 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen de CRSP; 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen de CRSP; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen de CRSP, 4) un reordenamiento cromosómico de un gen de CRSP; 5) una alteración en el nivel de un transcrito de ARN mensajero de un gen de CRSP, 6) modificación aberrante de un gen de CRSP, tal como el patrón de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de corte y empalme de tipo no natural de un transcrito de ARN mensajero de un gen de CRSP, 8) un nivel de tipo no natural de una proteína CRSP, 9) pérdida alélica de un gen de CRSP, y 10) modificación posterior a la traducción inapropiada de una proteína CRSP. Tal como se describe en el presente documento, hay un gran número de técnicas de ensayo conocidas en la técnica que pueden usarse para detectar alteraciones en un gen de CRSP. Una muestra biológica preferida es una muestra tisular o sérica aislada mediante medios convencionales de un sujeto.

En ciertas realizaciones, la detección de la alteración implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 4.683.195 y 4.683.202), tal como PCR de anclaje o PCR RACE, o, alternativamente, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, por ejemplo, Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) PNAS 91:360-364), la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen de CRSP (véase Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res.23:675-682). Este método puede incluir las etapas de tomar una muestra de células de un paciente, aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente con un gen de CRSP en condiciones tales que se produzca la hibridación y la amplificación del gen de CRSP (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra control. Se prevé que puede ser deseable usar PCR y/o LCR como una etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas usadas para detectar mutaciones descritas en el presente documento.

Métodos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencia autosostenida (Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación de traducción (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), replicasa Q-Beta (Lizardi, P.M. et al, 1988, Bio/Technology 6:1197), o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido por la detección de las moléculas amplificadas usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas se encuentran en muy pequeña cantidad.

En una realización alternativa, pueden identificarse mutaciones en un gen de CRSP de una célula de muestra mediante alteraciones en las rutas de escisión de las enzimas de restricción. Por ejemplo, se aísla ADN de muestra y control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan los tamaños de longitud de fragmento mediante electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias en los tamaños de longitud de fragmento entre ADN de muestra y control indica mutaciones en el ADN de muestra. Además, el uso de ribozimas específicas de secuencia (véase, por ejemplo, patente estadounidense número 5.498.531) puede usarse para puntuar la presencia de mutaciones específicas por desarrollo o pérdida de un sitio de escisión de ribozima.

En otras realizaciones, pueden identificarse las mutaciones genéticas en CRSP hibridando ácidos nucleicos de muestra y control, por ejemplo, ADN o ARN, a ensayos de alta densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin, M.T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). Por ejemplo, pueden identificarse mutaciones genéticas en CRSP en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas por luz tal como se describe en Cronin, M.T. et al. citado anteriormente. En resumen, una primera matriz de hibridación de sondas puede usarse para explorar a través de extensiones largas de ADN en una muestra y control para identificar cambios de bases entre las secuencias realizando matrices lineales de sondas solapantes de manera secuencial. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa va seguida por una segunda serie de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas usando matrices de sondas especializadas más pequeñas complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada serie de mutación está compuesta por conjuntos de sondas paralelas, uno complementario al gen de tipo natural y el otro complementario al gen mutante.

En todavía otra realización, puede usarse cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen de CRSP y detectar mutaciones comparando la secuencia de la CRSP de muestra con la correspondiente secuencia de tipo natural (control). Ejemplos de reacciones de secuenciación incluyen las basadas en técnicas desarrolladas por Maxim y Gilbert ((1977) PNAS 74:560) o Sanger ((1977) PNAS 74:5463). También se contempla que puede utilizarse cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan ensayos de diagnóstico ((1995) Biotechniques 19: 448), incluyendo secuenciación mediante espectrometría de masas (véase, por ejemplo, Publicación PCT Internacional número WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen de CRSP incluyen métodos en los que se usa protección a partir de agentes de escisión para detectar bases con apareamiento erróneo en heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230:1242). En general, la técnica "escisión por apareamiento erróneo" comienza proporcionando heterodúplex de ARN O ADN (marcados) mediante hibridación, que contienen la secuencia de CRSP de tipo natural con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido de una muestra de tejido. Los dúplex de cadena doble se tratan con un agente que escinde las regiones de cadena sencilla del dúplex tal como existirá debido a los apareamientos erróneos de pares de bases entre las cadenas control y de muestra. Por ejemplo, pueden tratarse los dúplex de ARN/ADN con ARNasa y pueden tratarse los híbridos ADN/ADN con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones erróneamente apareadas. En otras realizaciones, pueden tratarse los dúplex o bien de ADN/ADN o bien de ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina con el fin de digerir las regiones erróneamente apareadas. Tras la digestión de las regiones erróneamente apareadas, el material resultante se separa entonces por tamaño sobre geles de poliacrilamida de desnaturalización para determinar el sitio de mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, el ADN o ARN control puede marcarse para su detección.

En todavía otra realización, la reacción de escisión por apareamiento erróneo emplea una o más proteínas que reconocen pares de bases erróneamente apareadas en ADN de cadena doble (denominadas enzimas de "reparación de apareamiento erróneo de ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales en ADNc de CRSP obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en apareamiento erróneo G/A y la timidina ADN glucosilasa a partir de células HeLa escinde T en apareamientos erróneos G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). Según una realización ejemplo, una sonda basada en una secuencia de CRSP, por ejemplo, una secuencia de CRSP de tipo natural, hibrida con un ADNc u otro producto de ADN de una(s) célula(s)
de prueba. Se trata el dúplex con una enzima de reparación de apareamiento erróneo de ADN, y los productos de escisión, si hay alguno, pueden detectarse a partir de protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.459.039.

En otras realizaciones, se usarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar mutaciones en genes de CRSP. Por ejemplo, puede usarse polimorfismo de conformación de cadena sencilla (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo natural (Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). Fragmentos de ADN de cadena sencilla de ácidos nucleicos CRSP de muestra y control se desnaturalizarán y se permitirá su renaturalización. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos de cadena sencilla varía según la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección de incluso un único cambio de base. Pueden marcarse los fragmentos de ADN o detectarse con sondas marcadas. La sensibilidad del ensayo puede aumentarse usando ARN (en lugar de ADN), en el que la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método objeto utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex de cadena doble

\hbox{basándose en cambios de movilidad 
electroforética (Keen  et al . (1991) Trends Genet
7:5).}

En todavía otra realización, se somete a ensayo el movimiento de fragmentos mutantes o de tipo natural en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de agente de desnaturalización usando electroforesis en gel de gradiente de desnaturalización (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se usa DGGE como el método de análisis, se modificará el ADN para asegurar que no está completamente desnaturalizado, por ejemplo añadiendo una estructura de unión de GC ("GC clamp") de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de alto punto de fusión mediante PCR. En una realización adicional, se usa un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de desnaturalización para identificar diferencias en la movilidad del ADN de muestra y control (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero no se limitan a, hibridación de oligonucleótidos selectiva, amplificación selectiva, o extensión de cebador selectiva. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores oligonucleotídicos en los que la mutación conocida se coloca en el centro y luego hibrida con ADN diana en condiciones que permiten la hibridación sólo si se encuentra un apareamiento perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230). Tales oligonucleótidos específicos de alelo se hibridan con ADN diana amplificado por PCR o varias mutaciones diferentes cuando los oligonucleótidos están unidos a la membrana de hibridación e hibridados con el ADN diana marcado.

Alternativamente, junto con la presente invención puede usarse la tecnología de amplificación específica de alelo que depende de la amplificación por PCR selectiva. Los oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (de manera que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el extremo 3' terminal de un cebador cuando, en condiciones apropiadas, el apareamiento erróneo puede evitar, o reducir la extensión de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además, puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear detección basada en escisión (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se prevé que en ciertas realizaciones también puede realizarse la amplificación usando Taq ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En tales casos, sólo se producirá la ligamiento sólo si hay un apareamiento perfecto en el extremo 3' de la secuencia en 5' haciendo que sea posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.

Los métodos descritos en el presente documento pueden llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando kits de diagnóstico envasados previamente que comprenden al menos un reactivo de anticuerpo o ácido nucleico de sonda descritos en el presente documento, que pueden usarse convenientemente, por ejemplo, en la práctica clínica para diagnosticar a pacientes que muestran síntomas o historial familiar de una enfermedad o afección que implica un gen de CRSP.

Además, cualquier tipo de célula o tejido en el que se expresa CRSP puede utilizarse en los ensayos de pronóstico descritos en el presente documento.

3. Monitorización de los efectos durante ensayos clínicos

La monitorización de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión o la actividad de CRSP (por ejemplo, modulación de transducción de señal celular, regulación de transcripción génica en una célula implicada en el desarrollo o la diferenciación, regulación de la proliferación celular) puede aplicarse no sólo en la selección de fármaco básica, sino también en ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de selección, tal como se describe en el presente documento, para aumentar la expresión de gen de CRSP, los niveles de proteína, o para regular por incremento la actividad de CRSP, puede monitorizarse en ensayos clínicos de sujetos que muestran disminución de la expresión del gen de CRSP, niveles de proteína o actividad de CRSP regulada por disminución. Alternativamente, la eficacia de un agente determinado mediante un ensayo de selección para disminuir la expresión de gen de CRSP, los niveles de proteína, o regular por disminución la actividad de CRSP, puede monitorizarse en ensayos clínicos de sujetos que muestran aumento de la expresión del gen de CRSP, niveles de proteína, o actividad de CRSP regulada por incremento. En tales ensayos clínicos, la expresión o actividad de CRSP y, preferiblemente, de otros genes que se han visto implicados en, por ejemplo, un trastorno proliferativo, pueden usarse como un "lector" o marcadores del fenotipo de una célula particular.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, pueden identificarse genes, incluyendo CRSP, que se modulan en células mediante tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o molécula pequeña) que modula la actividad de CRSP (por ejemplo, identificada en un ensayo de selección tal como se describe en el presente documento). Por tanto, para estudiar el efecto de los agentes sobre trastornos proliferativos, trastornos del desarrollo o de diferenciación, trastornos hematopoyéticos así como trastornos caracterizados por supervivencia y/o diferenciación celular anómala, una estructura extracelular anómala, o una anomalía en un mecanismo de defensa, por ejemplo, en un ensayo clínico, pueden aislarse células y prepararse ARN y analizarse para detectar los niveles de expresión de CRSP y otros genes implicados en el trastorno proliferativo, trastorno del desarrollo o de diferenciación, trastorno hematopoyético así como trastornos caracterizados por supervivencia y/o diferenciación celular anómala, una estructura extracelular anómala o una anomalía en un mecanismo de defensa, respectivamente. Pueden cuantificarse los niveles de expresión génica (es decir, un patrón de expresión génica) mediante análisis de transferencia tipo Northern o RT-PCR, tal como se describe en el presente documento, o alternativamente midiendo la cantidad de proteína producida, mediante uno de los métodos tal como se describe en el presente documento, o midiendo los niveles de actividad de CRSP u otros genes. De esta manera, el patrón de expresión génica puede servir como un marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células frente al agente. Por consiguiente, este estado de respuesta puede determinarse antes, y en distintos puntos durante el tratamiento del individuo con el agente.

La presente invención puede usarse como base de un método para monitorizar la eficacia del tratamiento de un sujeto con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña u otro candidato a fármaco identificado por los ensayos de selección descritos en el presente documento) que comprende las etapas de (i) obtener una muestra antes de la administración de un sujeto antes de la administración del agente, (ii) detectar el nivel de expresión de un ADN genómico, ARNm o proteína CRSP en la muestra antes de la administración; (iii) obtener una o más muestras posteriores a la administración del sujeto; (iv) detectar el nivel de expresión o actividad del ADN genómico, ARNm o proteína CRSP, en las muestras posteriores a la administración; (v) comparar el nivel de expresión o actividad de ADN genómico, ARNm o proteína CRSP, en la muestra antes de la administración con ADN genómico, ARNm o proteína CRSP en la muestra o muestras posteriores a la administración; y (vi) modificar la administración del agente al sujeto en consecuencia. Por ejemplo, el aumento de la administración del agente puede ser deseable para aumentar la expresión o actividad de CRSP a niveles superiores a los detectados, es decir, para aumentar la eficacia del agente. Alternativamente, puede ser deseable una disminución de la administración del agente para disminuir la expresión o actividad de CRSP a niveles inferiores a los detectados, es decir para disminuir la eficacia del agente. Según tal realización, puede usarse la expresión o actividad de CRSP como un indicador de la eficacia de un agente, incluso en ausencia de una respuesta de fenotipo observable.

C. Métodos de tratamiento

La presente invención puede usarse como la base tanto para métodos profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o propenso a) padecer un trastorno o que tiene un trastorno asociado con actividad o expresión de CRSP aberrante. En relación con ambos métodos de tratamiento profiláctico y terapéutico, tales tratamientos pueden diseñarse o modificarse específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del campo de farmacogenómica. La "farmacogenómica", tal como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como la secuenciación génica, la genética estadística y el análisis de la expresión génica para fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta frente a un fármaco (por ejemplo, el "fenotipo de respuesta a fármaco", o "genotipo de respuesta a fármaco" de un paciente). Por tanto, la invención proporciona la base de los métodos para diseñar un tratamiento terapéutico o profiláctico de un individuo con cualquiera de las moléculas de CRSP de la presente invención, o bien con moduladores de CRSP según el genotipo de respuesta a fármaco de ese individuo. La farmacogenómica permite que un internista o médico dirija tratamientos profilácticos o terapéuticos a los pacientes que más se beneficiarán del tratamiento y para evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios relacionados con fármacos tóxicos.

1. Métodos profilácticos

En un aspecto, la invención proporciona la fabricación de un medicamento para evitar en un sujeto, una enfermedad o estado asociado con una actividad o expresión de CRSP aberrante. El medicamento incluye un agente que modula la expresión de CRSP o al menos una actividad de CRSP. Los sujetos que están en riesgo de padecer una enfermedad que está producida por o a la que contribuye la actividad o expresión de CRSP aberrante pueden identificarse mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico tal como se describe en el presente documento. La administración de un agente profiláctico puede producirse antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de CRSP, de manera que se evite una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrase su progresión. Dependiendo del tipo de aberración de CRSP, por ejemplo, puede usarse un agonista de CRSP o agente antagonista de CRSP para tratar al sujeto. Puede determinarse el agente apropiado basándose en ensayos de selección descritos en el presente documento. Los métodos profilácticos se tratan con más detalle en las siguientes subsecciones.

2. Métodos terapéuticos

Otro aspecto de la invención proporciona la fabricación de un medicamento para modular la actividad o expresión de CRSP con fines terapéuticos. El método modulador de la invención implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de la actividad de la proteína CRSP asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína CRSP puede ser un agente tal como se describe en el presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, una molécula diana que se produce de manera natural de una proteína CRSP, un péptido, un peptidomimético de CRSP, u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más actividades de proteína CRSP. Ejemplos de tales agentes estimulantes incluyen proteína CRSP y una molécula de ácido nucleico que codifica para CRSP que se ha introducido en la célula. En otra realización, el agente inhibe una o más actividades de la proteína CRSP. Ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico de CRSP antisentido y anticuerpos anti-CRSP. Estos métodos moduladores pueden realizarse in vitro (por ejemplo, mediante el cultivo de la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo, (por ejemplo, administrando el agente p a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona la fabricación de medicamentos para tratar a un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por actividad o expresión de CRSP aberrante de una proteína CRSP o molécula de ácido nucleico. En una realización, el medicamento incluye un agente (por ejemplo, un agente identificado mediante un ensayo de selección descrito en el presente documento), o combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regulan por incremento o regulan por disminución) la actividad o la expresión de CRSP. Puede administrarse una proteína CRSP o una molécula de ácido nucleico como un tratamiento para compensar la actividad o la expresión de CRSP aberrante o reducida.

La estimulación de la actividad de CRSP es deseable en situaciones en las que CRSP está anómalamente reducida por disminución y/o en las que es probable que el aumento de la actividad de CRSP tenga un efecto beneficioso. De igual manera, la inhibición de la actividad de CRSP es deseable en situaciones en las que CRSP está anómalamente regulada por incremento y/o en las que es probable que la disminución de la actividad de CRSP tenga efectos beneficiosos. Un ejemplo de tal situación es cuando un sujeto tiene un trastorno caracterizado por diferenciación celular o de desarrollo aberrante. Otro ejemplo de tal situación es cuando el sujeto tiene una enfermedad proliferativa (por ejemplo, cáncer) o un trastorno caracterizado por una respuesta hematopoyética aberrante. Todavía otro ejemplo de tal situación es cuando es deseable lograr regeneración tisular en un sujeto (por ejemplo, cuando un sujeto ha experimentado daño cerebral o de la médula espinal y es deseable regenerar tejido neuronal de una manera regulada).

Por consiguiente, en una realización, la enfermedad es una enfermedad caracterizada por una proliferación, diferenciación, y/o supervivencia celular anómalas. Por ejemplo, la enfermedad puede ser una enfermedad hiper o hipoproliferativa. La invención también se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades caracterizadas por una proliferación, diferenciación, y/o supervivencia celular anómalas en un sujeto, que no están caracterizadas por actividad de CRSP anómala (por ejemplo, actividad de CRSP-1). De hecho, dado que es probable que CRSP pueda modular el estado proliferativo de una célula (es decir, estado de proliferación, diferenciación, y/o supervivencia de una célula), CRSP puede regular una enfermedad en la que el estado proliferativo de una célula resulta de un defecto distinto de la actividad de CRSP anómala.

Las enfermedades hiperproliferativas pueden tratarse con agentes terapéuticos de CRSP (por ejemplo, CRSP-1) incluyendo enfermedades neoplásicas e hiperplásicas, tales como diversas formas de cáncer y leucemias y trastornos fibroproliferativos. Otras enfermedades hiperproliferativas que pueden tratarse o evitarse con los agentes terapéuticos de CRSP objeto (por ejemplo agentes terapéuticos de CRSP-1) incluyen estados cancerosos, estados precancerosos, estados benignos. El estado que va a tratarse o evitarse puede ser un tumor sólido, tal como un tumor que surge en un tejido epitelial. Por consiguiente, el tratamiento de tal cáncer podría comprender la administración al sujeto de un agente terapéutico de CRSP que disminuya la interacción de CRSP con un receptor de CRSP. Otros cánceres que pueden tratarse o evitarse con una proteína CRSP incluyen sarcomas y carcinomas, por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de próstata, mama, ovario, esófago, pulmón, melanoma, seminoma y adenocarcinoma de células escamosas. Otros tumores sólidos dentro del alcance de la invención incluyen los que pueden encontrarse en un libro de texto médico.

El estado que va a tratarse o evitarse también puede ser un tumor soluble, tal como leucemia, o bien crónico o bien agudo, incluyendo leucemia mielógena crónica o aguda, leucemia linfocítica crónica o aguda, leucemia promielocítica, leucemia monocítica, leucemia mielomonocítica, y eritrolecucemia. Todavía otros trastornos proliferativos que pueden tratarse con un agente terapéutico de CRSP de la invención incluyen enfermedad de cadena pesada, mieloma múltiple, linfoma, por ejemplo, linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin y macroglobulemia de Waldenstroem.

Enfermedades o estados caracterizados por un tumor sólido o soluble pueden tratarse administrando un agente terapéutico de CRSP o bien local o bien sistemáticamente, de manera que se inhibe o disminuye la proliferación celular aberrante. A continuación se describen con detalle métodos para administrar los compuestos de la invención.

La invención también proporciona la fabricación de un medicamento para evitar la formación y/o desarrollo de tumores. Por ejemplo, puede anticiparse el desarrollo de un tumor mediante la presencia de una lesión específica, tal como una lesión preneoplásica, por ejemplo, hiperplasia, metaplasia, y displasia, que pueden detectarse, por ejemplo, mediante métodos citológicos. Tales lesiones pueden encontrarse; por ejemplo, en el tejido epitelial. Por tanto, la invención se refiere a la fabricación de un medicamento para inhibir la progresión de tal lesión en una lesión neoplásica. Al sujeto que tiene una lesión preneoplásica se le puede administrar una cantidad de agente terapéutico de CRSP-1 suficiente para inhibir la progresión de la lesión preneoplásica en una lesión neoplásica.

La invención también se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades en las que se desea la proliferación celular. Por ejemplo, pueden usarse agentes terapéuticos de CRSP para estimular la reparación tisular o la cicatrización de heridas, tal como tras la cirugía o para estimular la cicatrización tisular de quemaduras. Otras enfermedades en las que es deseable la proliferación de células son las enfermedades hipoproliferativas, es decir, enfermedades caracterizadas por una proliferación anómalamente baja de ciertas células.

En todavía otra realización, la invención proporciona la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir enfermedades o estados caracterizados por diferenciación celular aberrante. Por consiguiente, métodos para estimular la diferenciación celular en estados caracterizados por una inhibición de diferenciación celular normal que pueden o no estar acompañadas por una proliferación excesiva. Alternativamente, pueden usarse agentes terapéuticos de CRSP para inhibir la diferenciación de células específicas.

En un método preferido, la célula que prolifera y/o se diferencia de manera aberrante es una célula presente en el sistema nervioso. Se sugiere un papel para CRSP en el sistema nervioso al menos en parte a partir del hecho de que CRSP-1 humana se expresa en cerebro fetal humano. Por consiguiente, la invención proporciona la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades o estados asociados con el sistema nervioso central o periférico. Por ejemplo, la invención se refiere a la fabricación de un medicamento para tratar lesiones del sistema nervioso asociadas con una proliferación, diferenciación o supervivencia aberrante de cualquiera de las siguientes células: neuronas, células de Schwann, células gliales y otro tipo de células neurales. Los trastornos del sistema nervioso incluyen, pero no se limitan a: daños en la médula espinal, daños cerebrales, lesiones asociadas con cirugía, lesiones isquémicas, lesiones cancerosas, lesiones infecciosas, lesiones degenerativas (enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica), enfermedades desmielinizantes (esclerosis múltiple, mielopatía asociada a inmunodeficiencia humana, mielopatía transversa, leucoencefalopatía multifocal progresiva, mielinolisis pontina), daños en neurona motora, atrofia muscular espinal progresiva, parálisis bulbar progresiva, esclerosis lateral primaria, atrofia muscular infantil y juvenil, parálisis bulbar progresiva infantil (síndrome Fazio-Londe), poliomielitis, y neuropatía motora y sensitiva hereditaria (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth).

En otra realización, la invención proporciona la fabricación de un medicamento para potenciar la supervivencia y/o estimular la proliferación y/o diferenciación de células y tejidos in vitro. En una realización preferida, se usan los agentes terapéuticos de CRSP para estimular la regeneración y/o reparación tisular (por ejemplo, para tratar lesión nerviosa). Por ejemplo, pueden obtenerse tejidos de un sujeto y hacerlos crecer in vitro en presencia de un agente terapéutico de CRSP, de manera que las células tisulares estimulen para proliferar y/o diferenciar. Después puede volver a administrarse el tejido al sujeto.

Entre los enfoques que pueden usarse para aliviar los síntomas que implican una actividad de CRSP aberrante y/o una proliferación, diferenciación, y/o supervivencia celular anómalas, se encuentran, por ejemplo, las moléculas antisentido, ribozimas y de triple hélice, descritas anteriormente. Ejemplos de compuestos adecuados incluyen los antagonistas, agonistas u homólogos descritos con detalle anteriormente.

Todavía otros agentes terapéuticos de CRSP consisten en un primer péptido que comprende un péptido de CRSP que puede unirse a un receptor de CRSP, y un segundo péptido que es citotóxico. Tales agentes terapéuticos pueden usarse para seleccionar específicamente como objetivo y lisar células que expresan o sobreexpresan un receptor para CRSP.

3. Farmacogenómica

Las moléculas de CRSP de la presente invención, así como los agentes, o moduladores que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre la actividad de CRSP (por ejemplo, expresión del gen de CRSP) tal como se identifica mediante un ensayo de selección descrito en el presente documento, pueden administrarse a individuos para tratar (profiláctica o terapéuticamente) trastornos (por ejemplo, trastornos proliferativos o del desarrollo) asociados con actividad de CRSP aberrante. Junto con tal tratamiento, puede considerarse la farmacogenómica (es decir, el estudio de la relación entre el genotipo de un individuo y la respuesta de este individuo a un compuesto extraño o fármaco). Las diferencias en el metabolismo de agentes terapéuticos pueden dar lugar a toxicidad grave o fallo terapéutico mediante la alteración de la relación entre la dosis y la concentración en la sangre del fármaco activo farmacológicamente. Por tanto, un médico o internista puede considerar aplicar el conocimiento obtenido en estudios de farmacogenómica relevantes para determinar si administrar o no una molécula de CRSP o modulador de CRSP, así como diseñar la dosificación y/o régimen terapéutico de tratamiento con una molécula de CRSP o modulador de CRSP.

La farmacogenómica trata con variaciones hereditarias clínicamente significativas en la respuesta frente a fármacos debido a disposición de fármaco alterada y a la acción anómala en personas afectadas. Véase por ejemplo, Eichelbaum, M., Clin Exp Pharmacol Physiol, 1996, 23(10-11):983-985 y Linder, M.W., Clin Chem, 1997, 43(2):254-266. En general, pueden diferenciarse dos tipos de estados farmacogenéticos. Estados genéticos transmitidos como un factor único que altera la forma en que los fármacos actúan en el cuerpo (acción de fármaco alterada) o estados genéticos transmitidos como factores únicos que alteran la forma en que el cuerpo actúa sobre los fármacos (metabolismo de fármaco alterado). Estos estados farmacogenéticos pueden producirse o bien como defectos genéticos raros o como polimorfismos que se producen de manera natural. Por ejemplo, la deficiencia de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) es una enzimopatía hereditaria común en la que la principal complicación clínica es la hemólisis tras la ingesta de fármacos oxidantes (antimalariales, sulfonamidas, analgésicos, nitrofuranos,) y consumo de habas.

Un enfoque farmacogenómico para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco, conocidos como "una asociación amplia de genoma", se basa en primer lugar en un mapa de alta resolución del genoma humano que consiste en marcadores relacionados con genes ya conocidos (por ejemplo, un mapa de marcador de gen "bialélico" que consiste en 60.000-100.000 sitios polimórficos o variables del genoma humano, cada uno de los cuales tiene dos variantes). Tal mapa genético de alta resolución puede compararse con un mapa del genoma de cada uno de un número estadísticamente significativo de pacientes que toma parte en un ensayo de fármaco en fase II/III para identificar marcadores asociados con una respuesta al fármaco particular observada o efectos secundarios. Alternativamente, tal mapa de alta resolución puede generarse a partir de una combinación de alguno de los diez millones de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) conocidos en el genoma humano. Tal como se usa en el presente documento, un "SNP" es una alteración común que se produce en una base nucleotídica sencilla en una extensión de ADN. Por ejemplo, puede producirse un SNP una vez cada 1000 bases de ADN. Un SNP puede estar implicado en un proceso de enfermedad, sin embargo, la inmensa mayoría no estarán asociados a enfermedad. Dado un mapa genético basado en la aparición de tales SNP, pueden agruparse los individuos en categorías genéticas dependiendo de un patrón de SNP particular en su genoma individual. De tal manera, los regímenes de tratamiento pueden diseñarse, para grupos de individuos genéticamente similares, teniendo en cuenta características que pueden ser comunes entre tales individuos genéticamente similares.

Alternativamente, puede utilizarse un método denominado el "enfoque de gen candidato", para identificar genes que predicen respuestas ante fármacos. Según este método, si se conoce un gen que codifica para una diana de fármacos (por ejemplo, una proteína CRSP o receptor de CRSP de la presente invención), todas las variantes comunes de ese gen pueden identificarse bastante fácilmente en la población y puede determinarse si tener una versión del gen frente a otro está asociado con una respuesta al fármaco particular.

Como una realización ilustrativa, la actividad de las enzimas que metabolizan el fármaco es un determinante principal tanto de la intensidad como de la duración de la acción del fármaco. El descubrimiento de los polimorfismos genéticos de las enzimas que metabolizan el fármaco (por ejemplo, N-acetiltransferasa 2 (NAT 2) y enzimas CYP2D6 y CYP2C 19 de citocromo P450) ha proporcionado una explicación de por qué algunos pacientes no obtienen los efectos del fármaco esperados o muestran respuesta al fármaco exagerada y toxicidad grave tras tomar la dosis habitual y segura de un fármaco. Estos polimorfismos se expresan en dos fenotipos en la población, el metabolizador rápido (EM, extensive metabolizer) y el metabolizador lento (PM, pour metabolizer). La prevalencia de PM es diferente entre poblaciones diferentes. Por ejemplo, el gen que codifica para CYP2D6 es sumamente polimórfico y se han identificado varias mutaciones en PM, que dan lugar todas a la ausencia de CYP2D6 funcional. Los metabolizadores lentos de CYP2D6 y CYP2C19 experimentan bastante a menudo efectos secundarios y respuesta al fármaco exagerada cuando reciben las dosis habituales. Si un metabolito es el resto terapéutico activo, los PM no muestran respuesta terapéutica, tal como se demuestra por el efecto analgésico de la codeína mediada por su metabolito de morfina formado por CYP2D6. En el otro extremo están los denominados metabolizadores ultrarrápidos que no responden a las dosis habituales. Recientemente, se ha identificado que la base molecular del metabolismo ultrarrápido se debe a la amplificación del gen de CYP2D6.

Alternativamente, un método denominado "elaboración del perfil de expresión génica", puede utilizarse para identificar genes que predicen la respuesta al fármaco. Por ejemplo, la expresión génica de un animal al que se dosifica un fármaco (por ejemplo, una molécula de CRSP o modulador de CRSP de la presente invención) puede dar una indicación de si las rutas génicas relacionadas con la toxicidad se han activado o no.

Puede usarse la información generada a partir de más de uno de los enfoques farmacogenómicos anteriores pueden usarse para determinar la dosificación y los regímenes de tratamiento adecuados para el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo. Este conocimiento, cuando se aplica a la dosificación o la selección de fármaco, puede evitar reacciones adversas o fallos terapéuticos y por tanto, potenciar la eficacia terapéutica o profiláctica cuando se trata a un sujeto con una molécula de CRSP o un modulador de CRSP, tal como un modulador identificado por uno de los ensayos de selección a modo de ejemplo descritos en el presente documento.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

Aislamiento y caracterización de ADNc de CRSP-1 humana

En este ejemplo, se describe el aislamiento y la caracterización del gen que codifica para CRSP- 1 (también denominada "CRISPY-1" o "TANGO 59").

Aislamiento de ADNc de CRSP-1 humana

La invención se basa al menos en parte en el descubrimiento de un gen humano que codifica para una proteína segregada, denominada en el presente documento proteína segregada rica en cisteína-1 (CRSP-1). Se aisló un ADNc parcial usando un método para atrapar la secuencia señal. Esta metodología se aprovecha del hecho de que moléculas tales como CRSP tienen una secuencia señal amino terminal que dirige ciertas proteínas segregadas y unidas a membrana a través del aparato secretor celular.

En resumen, se preparó una biblioteca de ADNc con cebador al azar usando ARNm preparado a partir de tejido cerebral fetal humano (Clontech, Palo Alto CA) usando el kit Stratagene-ZAP-ADNc Synthesis^{TM}, (número de catálogo 20041). Se ligó el ADNc en el vector de expresión de mamífero pTrap adyacente a un ADNc que codifica para la fosfatasa alcalina de placenta carece de señal secretora. Se transformaron los plásmidos en E. coli y se preparó ADN usando el kit de purificación de ADN Wizard^{TM} (Promega). Se transfectó ADN en células COS-7 con Lipofectamine^{TM} (Gibco-BRL). Tras una incubación de 48 horas se sometieron a ensayo los sobrenadantes de las células COS para detectar fosfatasa alcalina en un contador de centelleo Micro-Beta de Wallac usando el kit Phospha-Light^{TM} (Tropix Inc., número de catálogo BP300). Los ADN de plásmido individuales que puntúan positivo en el ensayo de secreción de fosfatasa alcalina de célula COS se analizaron adicionalmente mediante secuenciación de ADN usando procedimientos habituales.

Usando un ADNc parcial aislado mediante el método descrito anteriormente, se clonó un ADNc de longitud completa que codifica para CRSP-1 humana. La secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína CRSP-1 humana de longitud completa se muestra en la figura 1 y se expone como SEQ ID NO: 1. La proteína de longitud completa codificada por este ácido nucleico está comprendida por aproximadamente 350 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 1 y expuesta como SEQ ID NO: 2. La parte codificante (marco de lectura abierto) de SEQ ID NO: 1 se expone como SEQ ID NO: 3.

Análisis de CRSP-1 humana

La determinación del perfil hidrófobo de CRSP-1 humana que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 indica la presencia de una región hidrófoba desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 23 de la SEQ ID NO: 2. El análisis adicional de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 usando programas de predicción de péptido señal predijo la presencia de un péptido señal desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 19, 21, ó 23 de la SEQ ID NO: 2. Por consiguiente, la proteína CRSP-1 madura incluye aproximadamente 327, 329, ó 331 aminoácidos que se extienden desde aproximadamente el aminoácido 20, 22, ó 24 hasta aproximadamente el aminoácido 350 de SEQ ID NO: 2. La presencia de la secuencia señal, además del hecho de que se identificó CRSP-1 usando un sistema de atrapamiento de secuencia señal, indica que CRSP-1 es una proteína segregada. Es más, puede realizarse la predicción de tal péptido señal y tal sitio de escisión de péptido señal, por ejemplo, utilizando el algoritmo informático SIGNALP (Henrik, et al. (1997) Protein Engineering 10:1-6).

Además, cuando se expresó el ADNc que codifica para CRSP-1 humana en células bacterianas con un marcador FLAG C-terminal, se encontró que el producto de proteína CRSP-1 marcada con FLAG se segregaba al medio celular.

El examen de la secuencia de ADNc representada en la figura I muestra que CRSP-1 humana es particularmente rica en residuos de cisteína. Tal como se muestra en la figura 1, CRSP-1 contiene 20 residuos de cisteína localizados entre el aminoácido 147 y aminoácido 284 de SEQ ID NO: 2. Estos residuos de cisteína pueden formar posiblemente 10 puentes disulfuro.

Una búsqueda BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de CRSP-1 ha revelado que CRSP-1 es significativamente similar a ADNc de pollo que codifica para una proteína de función desconocida, número de registro de GenBank D26311. Se aisló este ADNc de una biblioteca de ADNc del cristalino de pollo y mostró que se expresaba en fibras del cristalino y epitelio del cristalino, pero no en la retina neural ni en las células del hígado. (Sawada et al. (1996) Int. J. Dev. Biol. 40:531). CRSP-1 y la proteína de pollo tienen una identidad de secuencia de aminoácidos del 56% y una similitud de secuencia de aminoácidos del 72%. La similitud de secuencia de aminoácidos entre la proteína del pollo y CRSP-1 humana es particularmente alta en el dominio rico en cisteína de CRSP-1 que está ubicada entre los aminoácidos 147 y 284 de SEQ ID NO: 2. En particular, los 20 residuos de cisteína de CRSP-1 ubicados en esta región están presentes en la proteína del pollo (véase la figura 3).

Dos genes recientemente identificados en un examen para detectar supresores de formación de glioblastoma (Ligon et al., 1997 Oncogene 14 1075-1081) también muestran homología significativa con hCRSP-1. Estos genes, RIG ("Regulados en Glioblastoma") y 7-1 de tipo RIG (números de registro de GenBank U32331 y AF034208, respectivamente), se identificaron en un examen diferencial para detectar ARNm regulados por la introducción de una copia normal del cromosoma 10 en una línea celular de glioblastoma que alberga una deleción en el cromosoma 10 que estimula tumorigénesis. Se presenta un diagrama esquemático que resume la relación entre las secuencias de los genes de CRSP-1 y RIG como la figura 9. La región indicada de identidad entre CRSP-1, RIG y 7-1 de tipo RIG comprende una región del UTR en 3' del ARNm de CRSP-1 humana. Inicialmente se aisló este ADNc en el examen diferencial descrito y posteriormente se usó para aislar mensajeros de RIG y 7-1 de tipo RIG de longitud completa tal como se describe. 7-1 de tipo RIG es extremadamente homólogo (similar en un 96,8% tal como se determina usando el programa de alineación de proteína Lipman-Pearson, Ktuple (Tupla K): 2; Gap penalty (penalización por hueco): 4, Gap lenght penalty (penalización por longitud de hueco): 12; y homólogo en un 64,7% usando el programa de alineación de ADN Wilbur Lipman, Ktuple: 3; Gap penalty: 3; Window (intervalo): 20) a CRSP-1, aunque la proteína codificada carece de la secuencia señal N-terminal y por tanto, no se prevé que sea una proteína segregada. El ARNm de RIG de longitud completa sólo presenta homología con CRSP-1 en la región del ADNc inicial. Estos datos asocian CRSP-1 con glioblastoma humano y sugieren que CRSP-1 puede ser importante en la supresión del fenotipo tumoral. También es coherente un papel en el glioblastoma con el alto nivel de expresión de ARNm de CRSP-1 observado en el tejido cerebral humano. Además, la co-localización de los genes de CRSP-1, RIG y de tipo RIG en una región de cromosoma 11 (11p15.1) implicada en el desarrollo de astrocitoma maligno humano (Ligon et al. 1997 Oncogene 14 1075-1081) indica adicionalmente un papel para estos genes en tumorigénesis.

La proteína CRSP-1 humana también tiene alguna similitud de secuencia aminoácidos con la metalotioneína, particularmente en el dominio rico en cisteínas.

Distribución tisular de ARNm de CRSP-1

Este ejemplo describe la distribución tisular de ARNm de CRSP-1, tal como se determina mediante hibridación por transferencia de tipo Northern.

Las hibridaciones por transferencia de tipo Northern con las diversas muestras de ARN se realizaron en condiciones habituales y se lavaron en condiciones rigurosas, es decir, 0,2 x SSC a 65ºC. En cada muestra, la sonda se hibridó con un ARN sencillo de aproximadamente 2,5 kb. Los resultados de la hibridación de la sonda con diversas muestras de ARNm se describen a continuación.

La hibridación de una transferencia de tipo Northern de tejido múltiple (MTN) fetal de Clontech (Clontech, LaJolla, CA) que contiene ARN de riñón, hígado, pulmón y cerebro fetal indicó la presencia de altos niveles de ARNm de CRSP-1 en pulmón y cerebro fetal y niveles ligeramente inferiores de ARNm de GRSP-1 en riñón fetal. Sin embargo, no se encontró nivel significativo de ARNm de CRSP-1 en el hígado fetal.

La hibridación de una transferencia de tipo Northern de tejido múltiple (MTN) humano de Clontech (Clontech, LaJolla, CA) que contiene ARN de páncreas, riñón, músculo esquelético, hígado, pulmón, placenta, cerebro y corazón adulto con una sonda de CRSP-1 humana indicó la presencia de altos niveles de ARNm de CRSP-1 en el corazón, niveles ligeramente inferiores en el cerebro y niveles mucho más inferiores en la placenta y pulmón. También se encontró algo de ARNm de CRSP-1 en el músculo esquelético adulto. Sin embargo, no se observaron niveles significativos de ARNm de CRSP-1 en el páncreas, riñón o hígado adulto. De manera interesante, el gen de pollo que era homólogo a CRSP-1 no se expresó a niveles detectables en ninguno de los hígados (Sawada et al. (1996) Int. J. Dev. Biol. 40:531).

Hibridación adicional de una transferencia de tipo Northern de tejido múltiple (MTN) humano de Clontech (Clontech, LaJolla, CA) que incluye ARN de médula espinal adulta reveló niveles elevados de expresión de CRSP-1 en ARNm aislado de médula espinal adulta.

Un análisis in situ reveló adicionalmente los siguientes patrones de expresión cuando hibridan secciones tisulares con sondas de CRSP-1. Se expresó ARNm de CRSP-1 en el corazón, pulmón, aorta, ojo (retina y cristalino) y cerebro (corteza) en embriones de ratón de 14,5 días. Se expresó ARNm de CRSP-1 en el corazón, pulmón, ojo (retina y cristalino), cerebro (cortical), y cartílago (pie, traquea, laringe, cabeza, esternón y médula espinal) en tejidos de ratones post-natales de 1,5 días. Se expresó ARNm de CRSP-1 en el cerebro (corteza, hipocampo, tronco encefálico), corazón (sólo aurícula), ojo (retina y capa exterior del cristalino) en tejidos de ratones adultos.

Por tanto, CRSP-1 se expresa de manera específica de tejido, observándose la mayor expresión en el cerebro, corazón y médula espinal.

Datos de expresión de proteína CRSP-1 Constructos

Se prepararon constructos de expresión para dos formas de CRSP-1 usando el vector de expresión pMET-stop de mamífero. La forma 1 comprendía un ADNc que incorpora la secuencia codificante de proteína CRSP-1 de 350 aa (CRSP-1 flag.larga) y la forma 2 comprendía la secuencia codificante de CRSP-1 completa salvo por los últimos 18 aminoácidos (CRSP-1 flag.corta). Se añadió una secuencia C-terminal que codifica para el epítopo FLAG (DYKDDDDK) a ambas formas de CRSP-1 para facilitar la detección y purificación. Se generaron ADNc de CRSP-1flag mediante PCR a partir de un molde de ADNc de CRSP-1 de longitud completa y se ligaron a pMET-stop usando sitios de restricción EcoR1 y Sal1.

Transfección de prueba - expresión a pequeña escala

Se transfectaron constructos de expresión para CRSP-1flag.larga y CRSP-1flag.corta en células 293T usando 10 \mul de lipofectamina (GIBCO/BRL) y 2 \mug de ADN por pocillo de una placa de 6 pocillos de células que eran confluentes en un 70-80%. Tras 5 horas a 37ºC, se alimentaron las células con 1 ml de FCS/DMEM al 20%. Tras la incubación durante la noche a 37ºC, se acondicionaron las células en 1 ml de OptiMEM durante 48 horas a 37ºC. Se solubilizaron las muestras de sobrenadante y sedimentos celulares en tampón de gel SDS-PAGE hirviendo, se eluyeron en un gel SDS-PAGE al 4-20%, se transfirieron a una membrana de nylon y se exploraron con sonda con el anticuerpo anti-FLAG monoclonal M2. Las muestras tanto del sobrenadante como del sedimento mostraron inmunorreactividad significativa en un intervalo de peso molecular de 40-65 kDa sobre película autorradiográfica usando un anticuerpo secundario conjugado HRP y reactivos de detección de ECL. Por tanto, se segregan ambas formas de CRSP-1 sometidas a prueba a partir de células 293T confirmando así experimentalmente que CRSP-1 es una proteína segregada. Debe observarse que los pesos moleculares de ambas formas de CRSP-1 sometidas a prueba son superiores de lo previsto a partir de la secuencia de aminoácidos, lo que sugiere que las proteínas CRSP-1 segregadas por células 293T pueden glucosilarse. Esto concuerda con la presencia de cuatro sitios potenciales para glucosilación unida en N en la proteína CRSP-1.

Producción de proteína CRSP-1 a gran escala

Para la expresión de CRSP-1flag.larga a gran escala, se transfectaron a 30 x 150 mM, placas de células 293T con una confluencia del 70-80% con 27 \mug de ADN, 100 \mul de lipofectamina en 18 ml de OptiMEM durante 5 horas a 37ºC. Se añadieron 18 ml de FCS/DMEM al 10% a cada placa y se incubaron durante la noche a 37ºC. Veinticuatro horas tras el comienzo de la transfección, se aspiró el sobrenadante de transfección y se añadieron 35 ml de OptiMEM a cada placa y se incubaron las placas a 37ºC durante 72 horas. Se recogió el medio condicionado, se centrifugó a 4000 rpm durante 30 min a 4ºC, y se filtró a través de una unidad de filtro de 0,45 micras. Se pasaron 1100 ml a través de una columna de afinidad anti-FLAG M2 de 1,6 x 10 cm preequilibrada en tampón PBS, pH 7,4 a una velocidad de flujo de 2,0 ml por minuto. Tras lavar con 200 ml de tampón PBS pH 7,4, se eluyó el material unido mediante una etapa de tampón Glicina 200 mM, pH 3,0 y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Tras la elución, se detectó un pico de proteína significativo por absorbancia a 280 nm. Se analizaron las muestras correspondientes al medio condicionado, las fracciones de flujo a través y eluidas mediante SDS-PAGE teñidas con plata y azul de Coomassie y mediante análisis por inmunotransferencia de tipo western tal como se describió anteriormente. Se detectó inmunorreactividad significativa en un intervalo de peso molecular de 40-65 kDa en medio condicionado y en fracciones eluídas pero no en la muestra de flujo a través, lo que indica que la proteína CRSP-1 flag.larga segregada se unió específicamente a la columna de afinidad y se eluyó eficazmente mediante las condiciones descritas. La tinción de geles de SDS-PAGE con azul de Coomassie sugirió que la proteína inmunorreactiva predominante constituía >90% de la proteína presente en el pico de proteína unida y eluida. Se juntaron las fracciones de pico de la proteína eluida y se sometieron a diálisis frente a solución salina tamponada de fosfato dando como resultado un volumen de 4 ml de proteína CRSP-1 flag.larga a una concentración de aproximadamente 1 mg/ml.

Ejemplo 2

Aislamiento y caracterización de ADNc de CRSP-2, CRSP-3, y CRSP-4 humanas

Para identificar proteínas novedosas relacionadas con CRSP-1, se usó la secuencia de aminoácidos de CRSP-1 humana para buscar las bases de datos privadas y dbEST usando TBLASTN (WashUversion, 2.0, matriz de búsqueda BLOSUM62). A partir de esta búsqueda, se identificaron cuatro secuencias de proteínas parciales distintas que presentaban homología significativa con CRSP-1 humana. Se diseñaron estas secuencias como secuencias parciales para las CRSP-h novedosas; CRSP-2-h, CRSP-3-h, CRSP-4-h y N terminal de tipo h-CRSP.

Se derivó la secuencia de proteína parcial hCRSP-2 de un clon de dbEST sencillo con número de registro
AA565546. Este clon se obtuvo posteriormente de la colección IMAGE y se secuenció totalmente para definir la secuencia de hCRSP-2 completa representada en la figura 2.

Se derivó la secuencia de proteína parcial hCRSP-3 de un clon de jthKb075a10 con un código de identificación de secuencia jthKb075a10. Este clon se secuenció adicionalmente y se combinó esta información de secuencia con secuencias adicionales de dbEST usando el programa de reunión Phrap (P. Green, U. Washington) para definir la secuencia de hCRSP-3 completa representada en la figura 3. Se depositó el ADN para el clon de jthKb075a10 en la ATCC con el número de registro 98633. El análisis de transferencia tipo Northern de diversos tejidos usando una sonda específica para hCRSP-3 reveló que el ARNm de CRSP-3 se limitaba a la placenta. La expresión de ARNm de CRSP-3 todavía no se ha demostrado en otros tejidos humanos adultos normales.

Recientemente se ha descrito un homólogo murino y de Xenopus de CRSP-3 denominado dkk-1 ("dickkopf", alemán, cabeza dura) que se propone que codifica para una molécula de señalización segregada (Nature, 391, 357-368). Se describe dkk-1 como un inductor potente de la formación de la cabeza durante el desarrollo temprano de Xenopus, suponiendo aparentemente su mecanismo de acción la inhibición de la familia wnt de factores segregados.

Dada la homología entre CRSP-3 y dkk-1, se sugiere que hCRSP-3 puede presentar profunda actividad de inducción de la cabeza durante el desarrollo embrionario humano temprano. Además, se piensa que los mecanismos de acción de dkk-1 implican antagonismo de miembros de la familia wnt de proteínas segregadas. Se ha asociado la sobreexpresión de proteínas wnt con ciertos tipos de cáncer. Por ejemplo, la activación de la expresión de wnt- 1 mediante inserción proviral de MMTV provoca cáncer de mama en ratón (véase Cadigan y Nusse, Genes y Dev., 1997 11 3286-3305). Por tanto, al menos CRSP-3, y potencialmente otros miembros de la familia de CRSP, también pueden tener un papel en la supresión de señalización de wnt en cáncer.

Se derivó la secuencia de proteína parcial CRSP-4-h de un clon de dbEST sencillo con número de registro W55979. Posteriormente se obtuvo este clon de la colección IMAGE y se secuenció totalmente para definir una secuencia de CRSP-4-h mostrada en la figura 4. El análisis por transferencia tipo Northern de diversos tejidos usando una sonda específica para CRSP-4-h reveló que el ARNm de CRSP-4 se expresaba en diversos tejidos humanos adultos. La expresión de ARNm de CRSP-4 fue superior en el corazón, cerebro, placenta, pulmón y músculo esquelético.

Se derivó la secuencia de proteína parcial N terminal de tipo CRSP humana de un clon de dbEST sencillo con número de registro AA397836. Este clon se obtuvo posteriormente de la colección IMAGE y se secuenció totalmente para definir la secuencia de N terminal de tipo CRSP mostrada en la figura 5.

Estructura de las proteínas de la familia CRSP

En la figura 6 se muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de CRSP-1 humana, CRSP-2 humana, CRSP-3 humana, y CRSP-4 humana. Los residuos de aminoácidos que se conservan entre los miembros de la familia de CRSP están recuadrados. Los 20 residuos de cisteína conservados están indicados mediante un asterisco. Los dominios ricos en cisteína están indicados como CRD-1 y CRD-2. La estructura del dominio de las proteínas CRSP de longitud completa de la presente invención se muestra en la figura 7. La homología de aminoácidos y nucleótidos entre los miembros de la familia de CRSP es tal como sigue en las tablas 1 y 2.

TABLA 1

1

Los porcentajes de homología de aminoácidos se determinaron usando el programa ALIGN, (versión 2.0) (paquete de software GCG) usando una tabla de residuos en peso PAM120, gap lenght penalty (penalización de longitud de hueco) de 12, y gap penalty (penalización de hueco) de 4.

TABLA 2

2

Los porcentajes de homología de nucleótidos se determinaron usando el programa de alineación de ADN Wilbur Lipman, Ktuple: 3; Gap Penalty (penalización de hueco): 3; Window (intervalo): 20.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MILLENNIUM BIOTHERAPEUTICS, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 620 MEMORIAL DRIVE

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: CAMBRIDGE

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 02319

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(H): FAX

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEÍNA CRSP NOVEDOSA Y MOLÉCULAS DE ACIDO NUCLEICO Y USOS DE LAS MISMAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 18

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: LAHIVE & COCKFIELD, LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 25 STATE STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: BOSTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MASSACHUSETTS

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 02109

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PATENTIN Release # 1.0, Versión # 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE ABRIL 1998

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/843,704

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 DE ABRIL 1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE SOLICTUD: US 08/842,898

\vskip0.500000\baselineskip

(D): FECHA DE PRESENTACIÓN: 17 DE ABRIL 1997

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO DE SOLICITUD: 60/071,589

\vskip0.500000\baselineskip

(F): FECHA DE PRESENTACIÓN: 15 DE ENERO 1998

\vskip0.500000\baselineskip

(G): NÚMERO DE SOLICITUD: 09/009,802

\vskip0.500000\baselineskip

(H): FECHA DE PRESENTACIÓN: 20 DE ENERO 1998

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MANDRAGOURAS, AMY E

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.207

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE DOCKET: MEI-008CPPC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (617)227-7400

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FAX:(617)742-4214

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2479 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 38..1087

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 350 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SEQUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1050 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1050

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 848 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 125..796

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SEQUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 224 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 672 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..672

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SEQUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1529 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLECULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:93..890

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

18

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 266 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SEQUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 798 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:1..798

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 702 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..537

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 179 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 537 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..537

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 928 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 75..800

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 242 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SEQUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 726 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..726

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA :SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2381 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 110..1156

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

35

36

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 349 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TIPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERISTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1047 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN_{C}

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..1047

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 1 2479 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 18,7%; puntuación de alineación global: -5757

43

44

45

46

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 1 2479 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 14,3%; puntuación de alineación global: -7400

48

49

50

51

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 1 2479 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 16,0%; puntuación de alineación global: -7115

53

54

55

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 1 2479 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 14,6%; puntuación de alineación global: -7433

58

59

60

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 1 2479 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 12,7%; puntuación de alineación global: -7722

63

64

65

66

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 3 1050 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 30,3%; puntuación de alineación global: -1869

68

69

70

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 3 1050 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 26,1%; puntuación de alineación global: -2234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

\hskip1cm

73

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 3 1050 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 31,2%; puntuación de alineación global: -1835

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 3 1050 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 28,9%; puntuación de alineación global: -2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 3 1050 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 25,2%; puntuación de alineación global: -2269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 4 848 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 36,2%; puntuación de alineación global: -1075

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 4 848 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 33,2%; puntuación de alineación global: -1352

85

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 4 848 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 36,9%; puntuación de alineación global: -1046

87

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 4 848 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 33,0%; puntuación de alineación global: -1306

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 4 848 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 41,9%; puntuación de alineación global: -217

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 6 672 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 42,1%; puntuación de alineación global: -579

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 6 672 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 38,6%; puntuación de alineación global: -742

95

96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 6 672 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 43,7%; puntuación de alineación global: -481

97

98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 6 672 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 39,4%; puntuación de alineación global: -670

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 6 672 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 45,5%; puntuación de alineación global: 45

101

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 7 1529 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 24,4%; puntuación de alineación global: -3426

103

104

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 7 1529 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 27,1%; puntuación de alineación global: -2414

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

109

110

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 7 1529 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 24,0%; puntuación de alineación global: -3522

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

111

112

113

\hskip1,3cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 7 1529 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 21,1%; puntuación de alineación global: -3797

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

115

116

117

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 7 1529 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 18,5%; puntuación de alineación global: -4009

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

119

120

121

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 9 798 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 40,2%; puntuación de alineación global: -879

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 9 798 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 34,1%; puntuación de alineación global: -1153

125

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 9 798 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 38,0%; puntuación de alineación global: -987

127

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 9 798 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 34,3%; puntuación de alineación global: -1204

129

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 9 798 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 31,8%; puntuación de alineación global: -1309

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 10 702 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 42,5%; puntuación de alineación global: -581

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 10 702 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 40,2%; puntuación de alineación global: -780

135

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 10 702 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 41,9%; puntuación de alineación global: -598

137

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 10 702 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 37,7%; puntuación de alineación global: -817

139

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 10 702 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 36,3%; puntuación de alineación global: -736

141

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 12 537 nt frente a D1 rev 465 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 45,4%; puntuación de alineación global: -260

143

144

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 12 537 nt frente a D2 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 42,8%; puntuación de alineación global: -429

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

145

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 12 537 nt frente a D3 rev 469 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 46,5%; puntuación de alineación global: -203

147

148

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 12 537 nt frente a D4 rev 416 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 45,0%; puntuación de alineación global: -297

\vskip1.000000\baselineskip

149

\vskip1.000000\baselineskip

ALIGN calcula una alineación global de dos secuencias

Versión 2.0u, cítese por favor: Myers y Miller, CABIOS (1989) 4:11-17

Seq 12 537 nt frente a D8 rev 355 nt

Matriz de puntuación: ADN, penalizaciones de hueco: -14/-4

Identidad del 40,7%; puntuación de alineación global: -504

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

150

151

Claims

1. Molécula de ácido nucleico aislada seleccionado del grupo constituido por:

a) un ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID.NO: 9;

b) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 24-350 de SEQ ID NO: 2, o la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8;

c) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 14, en el que dicha variante alélica que se produce de manera natural modula la transducción de la señal celular o la proliferación celular, y en el que (i) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 6 en condiciones de lavado rigurosas, (ii) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 12 en condiciones de lavado rigurosas, (iii) dicho ácido nucleico que codifica para una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 15 en condiciones rigurosas de lavado, en el que las condiciones rigurosas de lavado son 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC;

d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento de a), b), o c); y

e) un vector de expresión de célula eucariota recombinante que comprende el ácido nucleico de a), b), c) o d).

2. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 1, y SEQ ID NO: 3.

3. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y la secuencia de nucleótidos del inserto de ADN del plásmido depositada en la ATCC con el número de registro 98633.

4. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 20-350 de SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 22-350 de SEQ ID NO: 2 y los residuos de aminoácidos 24-350 de SEQ ID NO: 2.

5. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1, en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 8 y los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8.

6. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1a), 1b) o 1c), en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada además comprende:

i) una secuencia de ácido nucleico vector; y/o

ii) una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo.

7. Molécula de ácido nucleico aislada según la reivindicación 1e), en la que dicha molécula de ácido nucleico aislada además comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo.

8. Célula huésped que comprende el vector de expresión de célula eucariota recombinante según la reivindicación 1e).

9. Célula huésped que comprende un vector que comprende el ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1a), 1b), 2, 3, 4 ó 5 en la que dicho ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante.

10. Polipéptido aislado seleccionado del grupo constituido por:

a) un polipéptido que comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de las SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, polipéptido que modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular;

b) un polipéptido que comprende una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5, los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en el que dicha variante alélica que se produce de manera natural modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular y en el que (i) dicha variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 6 en condiciones de lavado rigurosas, (ii) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 9 en condiciones de lavado rigurosas, (iii) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 12 en condiciones de lavado rigurosas, y (iv) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 15 en condiciones de lavado rigurosas, y en el que las condiciones de lavado rigurosas son 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC;

c) un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos 24-350 de SEQ ID NO: 2; y

d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 8 o SEQ ID NO: 11 sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 11, respectivamente, y modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

11. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 8 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

12. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

13. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID N0:5, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

14. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

15. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

16. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 8 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

17. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID N0:8 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

18. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido comprende al menos 50 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 8 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

19. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en que dicho polipéptido comprende al menos 100 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 8 y en el que dicho polipéptido modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

20. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 8 y los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8.

21. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 20-350 de SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 22-350 de SEQ ID NO: 2, y los residuos de aminoácidos 24-350 de SEQ ID NO: 2.

22. Polipéptido aislado según la reivindicación 10, en el que dicho polipéptido aislado comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 5, los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 14.

\newpage

23. Polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 10-22, que además comprende un polipéptido heterólogo.

24. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo que se une específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo constituido por:

a) un polipéptido constituido por 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14; y

b) un polipéptido constituido por una variante alélica que se produce de manera natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5, los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14, en el que dicha variante alélica que se produce de forma natural modula la transducción de señales celulares o la proliferación celular y en el que (i) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 6 en condiciones de lavado rigurosas, (ii) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 9 en condiciones de lavado rigurosas, (iii) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 12 en condiciones de lavado rigurosas, (iv) dicha variante alélica que se produce de forma natural de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 está codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida con el complemento de SEQ ID NO: 15 en condiciones de lavado rigurosas, y en el que las condiciones de lavado rigurosas son 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC.

25. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido constituido por 15 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.

26. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido constituido por 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.

27. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido constituido por 30 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 14.

28. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 24, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 14.

29. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 28, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 21-266 de SEQ ID NO: 8.

30. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 28, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se une específicamente a un polipéptido que está constituido por la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 20-224 de SEQ ID NO: 5.

31. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-30, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo humano, un anticuerpo monoclonal humanizado, un anticuerpo monoclonal quimérico y una parte inmunológicamente activa de uno de los anteriores.

32. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-30, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo es un anticuerpo monoclonal o una parte inmunológicamente activa de un anticuerpo monoclonal.

33. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-30, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo es una parte inmunológicamente activa seleccionada del grupo constituido por un fragmento Fab y un fragmento F(ab')_{2}.

34. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-33, en el que dicho anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo comprende un marcador detectable.

35. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según la reivindicación 34, en el que dicho marcador detectable es una enzima, un grupo prostético, un material fluorescente, un material luminiscente, un material bioluminiscente o un material radiactivo.

36. Método para producir un polipéptido según la reivindicación 10, que comprende poner en cultivo la célula huésped según la reivindicación 8 en condiciones en las que se expresa el vector de expresión recombinante y se produce dicho polipéptido.

37. Método para producir un polipéptido según la reivindicación 20 o la reivindicación 21, que comprende poner en cultivo la célula huésped según la reivindicación 9 en condiciones en las que se expresa el ácido nucleico recombinante, y se produce dicho polipéptido.

38. Método para detectar la presencia de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, en una muestra que comprende:

a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35; y

b) determinar si dicho anticuerpo se une a un polipéptido en la muestra para así detectar la presencia de dicho polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 en la muestra.

39. Kit que comprende un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35 e instrucciones para su uso.

40. Uso de un kit para detectar un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 en una muestra, comprendiendo dicho kit un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35 e instrucciones para su uso.

41. Método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una muestra que comprende:

a) poner en contacto la muestra con un cebador o sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5; y

b) determinar si el cebador o sonda de ácido nucleico se une a una molécula de ácido nucleico en la muestra para así detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en la muestra.

42. Método según la reivindicación 41, en el que la muestra comprende moléculas de ARNm y se pone en contacto con una sonda de ácido nucleico.

43. Uso de un kit para detectar una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una muestra, comprendiendo dicho kit un cebador o sonda de ácido nucleico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 e instrucciones para su uso.

44. Método in vitro para identificar un compuesto que se une a un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 que comprende:

a) poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, o una célula que expresa dicho polipéptido con un compuesto de prueba; y

b) determinar si el polipéptido se une con el compuesto de prueba.

45. Método según la reivindicación 44, en el que se detecta la unión del compuesto de prueba con el polipéptido mediante un método seleccionado del grupo constituido por:

a) detección de unión mediante detección directa de la unión compuesto de prueba/polipéptido;

b) detección de unión usando un ensayo de unión por competencia; y

c) detección de unión usando un ensayo para detectar la transducción de señales celulares o la proliferación celular.

46. Método in vitro para modular la transducción de señales celulares o la actividad de proliferación celular de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, que comprende poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 o una célula que expresa dicho polipéptido con un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35 en una concentración suficiente para modular la transducción de señales celulares o la actividad de proliferación celular de dicho
polipéptido.

47. Método para identificar un compuesto que modula la transducción de señales celulares o la actividad de proliferación celular de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 que comprende:

a) poner en contacto un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 con un compuesto de prueba; y

b) determinar el efecto del compuesto de prueba sobre la transducción de señales celulares o la actividad de proliferación celular de dicho polipéptido para identificar así un compuesto que modula la transducción de señales celulares o la actividad de proliferación celular de dicho polipéptido.

48. Anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35, para su uso en tratamiento o diagnóstico.

49. Uso de un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del desarrollo, de diferenciación o proliferativo.

50. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, para su uso en tratamiento o diagnóstico.

51. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del desarrollo, de diferenciación o proliferativo.

52. Uso de un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 10-23 para la fabricación de un medicamento o diagnóstico para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico del cáncer.

53. Molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en tratamiento o diagnóstico.

54. Uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del desarrollo, de diferenciación o proliferativo.

55. Uso de un anticuerpo o parte inmunológicamente activa del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 24-35, para la fabricación de un medicamento o diagnóstico para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico del cáncer.

56. Uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para la fabricación de un medicamento o diagnóstico para el tratamiento, profilaxis o diagnóstico del cáncer.

57. Célula huésped no humana que comprende un transgén que comprende la molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1a), 1b), 2, 3, 4 ó 5.