ES2285771T3 - Polipeptidos con actividad aminopaptidasa y acidos nucleicos que lo codifican. - Google Patents

Polipeptidos con actividad aminopaptidasa y acidos nucleicos que lo codifican. Download PDF

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Abstract

Polipéptido aislado con actividad aminopeptidasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2; y (b) un fragmento de (a), donde el fragmento tiene actividad aminopeptidasa.

Description

Polipéptidos con actividad aminopeptidasa y ácidos nucleicos que los codifican.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad aminopeptidasa y a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a métodos para producir los polipéptidos. La presente invención también se refiere a métodos para obtener hidrolizados proteicos útiles como agentes mejoradores del sabor.
Descripción de las técnicas relacionadas
Varios productos alimentarios, p. ej., sopas, salsas y condimentos, contienen agentes aromatizantes obtenidos por hidrólisis de materiales proteínicos. Esta hidrólisis se realiza de forma convencional usando ácido clorhídrico fuerte, seguido de la neutralización con hidróxido sódico. No obstante, una hidrólisis química de este tipo conduce a una degradación severa de los aminoácidos obtenidos durante la hidrólisis, y también a subproductos peligrosos formados en el transcurso de esta reacción química. Un interés creciente sobre el uso de agentes aromatizantes obtenidos por hidrólisis química ha conducido al desarrollo de procesos de hidrólisis enzimática.
Los procesos de hidrólisis enzimática de materiales proteínicos prevén obtener un elevado grado de hidrólisis (DH), y esto se logra normalmente usando un complejo de enzimas proteolíticas de actuación no específica (es decir, endo- y exopeptidasas de actuación no específica). Por ejemplo, WO 94/25580 describe un método para hidrolizar proteínas usando una preparación enzimática de actuación no específica obtenida a partir de Aspergillus oryzae. Las enzimas proteolíticas de actuación específica no han sido usadas para este propósito porque estas enzimas sólo conducen a un grado de hidrólisis inadecuado.
Los polipéptidos con actividad aminopeptidasa catalizan la eliminación de uno o más residuos aminoácidos del N-término de péptidos, polipéptidos, y proteínas. Estos polipéptidos se clasifican según el Número de Clasificación Enzimática E.C. 3.4.11.- de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular.
WO 96/28542 expone una aminopeptidasa con un peso molecular de 35 kDa. JP-7-5034631 (Noda) expone una leucina aminopeptidasa obtenida a partir de moho koji amarillo, que incluye Aspergillus oryzae. JP-7-4021798 (Zaidan Hojin Noda Sangyo) expone la producción de miso añadiendo una leucina aminopeptidasa II preparada cultivando varias cepas, incluso la cepa 460 de Aspergillus oryzae (ATCC 20386) y la cepa IAM 2616. La cepa 460 de Aspergillus oryzae es conocida por producir varias leucina aminopeptidasas tres de las cuales tienen un peso molecular de 26.5, 56, y 61 kDa por filtración en gel (Nakada et al.; 1972; Agricultural and Biological Chemistry 37: 757-765; Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 767-774; y Nakada et al., 1972, Agricultural and Biological Chemistry 37: 775-782; respectivamente). Penicillium citrium produce una leucina aminopeptidasa intracelular con un peso molecular de 65 kDa por SDS-PAGE (Kwon et al., 1996, Journal of Industrial Microbiology 17: 30-35).
WO 97/04108 (Roehm) expone ADN que codifica una leucina aminopeptidasa de Aspergillus sojae. Chang y Smith (1989, Journal of Biological Chemistry 264: 6979-6983) exponen la clonación y secuenciación molecular de un gen que codifica una aminopeptidasa vacuolar de Saccharomyces cerevisiae. Chang et al. (1992, Journal of Biological Chemistry 267: 8007-8011) exponen la clonación y secuenciación molecular de un gen que codifica una metionina aminopeptidasa de Saccharomycse cerevisiae.
La producción de hidrolizados proteicos con propiedades deseables organolépticas y altos grados de hidrólisis generalmente requieren el uso de una mezcla de actividades peptidasa. Sería deseable proporcionar una enzima peptidasa monocomponente con una actividad útil para mejorar las propiedades organolépticas y el grado de hidrólisis de los hidrolizados proteicos usados en productos alimenticios bien solos o en combinación con otras enzimas.
Un objeto de la presente invención es el hecho de proporcionar polipéptidos mejorados con actividad aminopeptidasa así como métodos para obtener hidrolizados proteicos con calidades organolépticas deseables y grados de hidrólisis elevados.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a polipéptidos aislados con actividad aminopeptidasa seleccionada del grupo que consiste en:
(a)
un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2;
(b)
un fragmento de (a), donde el fragmento tiene actividad aminopeptidasa; y
La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos y a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos así como a los métodos para producir los polipéptidos.
La presente invención también se refiere a los métodos para obtener hidrolizados a partir de sustratos proteínicos que comprenden el sometimiento del material proteínico a un polipéptido con actividad aminopeptidasa solo o en combinación con una endopeptidasa.
La presente invención también se refiere a métodos para obtener a partir de un sustrato proteínico un hidrolizado enriquecido con ácido glutámico libre y/o residuos de ácido glutámico unidos por péptidos, dichos métodos comprenden el sometimiento del sustrato a un proceso de desamidación y a la acción de un polipéptido con actividad aminopeptidasa.
La presente invención también se refiere a composiciones mejoradoras del sabor que comprenden un polipéptido con actividad aminopeptidasa. Las composiciones pueden además comprender actividades enzimáticas adicionales.
En un aspecto final, los métodos de la invención pueden ser usados en aplicaciones relacionadas con los alimentos para mejorar el sabor, tal como la cocción. De forma alternativa, la mejora del sabor en los alimentos puede conseguirse por la adición de los hidrolizados obtenidos por los métodos de la invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la secuencia de ácidos nucléicos y la secuencia de aminoácidos deducida de una aminopeptidasa ATCC 20386 de Aspergillus oryzae (SEC ID NOS:1 y 2, respectivamente).
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pMWR3.
La Figura 3 muestra un mapa de restricción de pEJG19.
La Figura 4 muestra un mapa de restricción de pDM181.
La Figura 5 muestra un mapa de restricción de pEJG28.
Descripción detallada de la invención Polipéptidos con actividad aminopeptidasa
El término "actividad aminopeptidasa" se define en la presente como una actividad peptidasa que cataliza la eliminación de los aminoácidos del extremo N-terminal de los péptidos, los oligopéptidos o las proteínas. Definido de una manera general, la actividad aminopeptidasa es capaz de seccionar el aminoácido X del N-término de un péptido, polipéptido, o proteína, donde X puede representar cualquier residuo aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, y Val, pero al menos Leu, Glu, Gly, Ala, y/o Pro. Será entendido que los polipéptidos aislados que tienen actividad aminopeptidasa de la presente invención pueden ser no específicos en cuanto a la secuencia de aminoácidos del péptido, polipéptido, o proteína por seccionar.
En una primera forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados con una secuencia de aminoácidos que tiene un grado de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, preferiblemente al menos aproximadamente el 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 95%, e incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 97%, con actividad aminopeptidasa (de ahora en adelante "polipéptidos homólogos"). En una forma de realización preferida, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere por cinco aminoácidos, preferiblemente por cuatro aminoácidos, más preferiblemente por tres aminoácidos, incluso más preferiblemente por dos aminoácidos, y más preferiblemente por un aminoácido de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Para fines de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos está determinado por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS. 5: 151-153) con una tabla de identidad, una penalización de los gaps de 10; y una penalización de la longitud de los gaps de 10.
Preferiblemente, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o una variante alélica; y un fragmento de la misma, donde el fragmento tiene actividad aminopeptidasa. En una forma de realización más preferida, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. En otra forma de realización preferida, el polipéptido de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma, donde el fragmento tiene actividad aminopeptidasa. Un fragmento de la SEC ID NO:2 es un polipéptido que tiene uno o más aminoácidos delecionados del término amino y/o carboxi de esta secuencia de aminoácidos. En una forma de realización más preferida, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.
Preferiblemente, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoácidos, más preferiblemente al menos 380 residuos aminoácidos, y más preferiblemente al menos 430 residuos aminoácidos.
Una variante alélica indica cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede resultar en un polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. El término variante alélica también se utiliza para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.
Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos homólogos pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 por una inserción o deleción de uno o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos aminoácidos por residuos aminoácidos diferentes. Preferiblemente, los cambios aminoácidos son de una naturaleza inferior, es decir las sustituciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al doblamiento y/o a la actividad de la proteína; pequeñas deleciones, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino- o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina aminoterminal; un pequeño péptido enlazador de hasta aproximadamente 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de las sustituciones conservadoras están dentro del grupo de aminoácidos básicos (tales como arginina, lisina y histidina), aminoácidos acidicos (tales como ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (tales como glutamina y asparraguina), aminoácidos hidrofóbicos (tales como leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (tales como fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (tales como glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica son conocidas en la técnica y están descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Los intercambios que ocurren con más frecuencia son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, y Asp/Gly y los mismos a la inversa.
En una segunda forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad aminopeptidasa que son codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan bajo condiciones de astringencia baja, más preferiblemente condiciones de astringencia media, y más preferiblemente condiciones de astringencia alta, con una sonda de oligonucleótidos que se hibridiza bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria (J. Sambrook, E.F. Fritsch, y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratoty Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York); o variantes alélicas y fragmentos de los polipéptidos, donde los fragmentos tienen actividad aminopeptidasa.
La hibridación indica que la secuencia de ácidos nucléicos se hibridiza a la sonda de oligonucleótidos correspondiente a la parte codificadora del polipéptido de la secuencia de ácidos nucléicos mostrada en la SEC ID NO:1; bajo condiciones de astringencia baja a alta (es decir, prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE; 0.3% SDS; 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado, y sea 25, 35 o 50% de formamida para astringencias bajas, medias y altas, respectivamente), después de procedimientos de Southern blot estándares.
La secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o una secuencia parcial de la misma puede ser usada para diseñar una sonda de oligonucleótidos, o una secuencia de ácidos nucléicos que codifique un polipéptido de la presente invención, tal como la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO:1, o una subsecuencia de la misma, pueden ser usadas para identificar y clonar polipéptidos codificadores del ADN que tienen actividad aminopeptidasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, estas sondas pueden ser usadas para la hibridación con el genómico o ADNc del género o especies de interés, según los procedimientos de Southern blot estándares, para identificar y aislar el gen correspondiente en las mismas. Estas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían tener al menos 15, preferiblemente al menos 25, y más preferiblemente al menos 40 nucleótidos de largo. Sondas más largas también pueden ser usadas. Tanto las sondas de ADN como de ARN pueden ser usadas. Las sondas están normalmente marcadas para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P; ^{3}H; ^{35}S, biotina, o avidina).
Así, una biblioteca genómica, de ADNc o combinatoria química obtenida a partir de estos otros organismos pueden ser seleccionados para el ADN que se hibridiza con las sondas anteriormente descritas y que codifica un polipéptido con actividad aminopeptidasa. El ADN genómico o de otro tipo de estos otros organismos puede ser separado por agarosa o electroforesis en gel de poliacrilamida, u otras técnicas de separación. El ADN de las bibliotecas o el ADN separado puede ser transferido a e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEC ID NO:1; se usa el material portador en un Southern blot donde el material portador es finalmente lavado tres veces durante 30 minutos cada vez usando 2 x SSC; 0.2% de SDS preferiblemente al menos 50ºC, más preferiblemente al menos 55ºC, más preferiblemente al menos 60ºC, más preferiblemente al menos 65ºC, incluso más preferiblemente al menos 70ºC, y más preferiblemente al menos 75ºC. Las moléculas a las que se hibridiza la sonda de oligonucleótidos bajo estas condiciones son detectadas usando una película de rayos X.
En una tercera forma de realización, la presente invención se refiere a los polipéptidos aislados que tienen las propiedades fisicoquímicas siguientes: (a) un pH óptimo en la gama de aproximadamente pH 7.27 a aproximadamente pH 10.95 determinado a la temperatura ambiente en presencia de Ala-para-nitroanilida; (ii) una estabilidad de la temperatura del 90% o más, relativa a la actividad inicial, a pH 7.5 determinada tras la incubación durante 20 minutos a 60ºC en ausencia de sustrato; y (iii) una actividad hacia Xaa-para-nitroanilida donde Xaa está seleccionado del grupo que consiste en Leu, Glu, Gly, Ala, y Pro. Los polipéptidos de la presente invención también tienen la capacidad de hidrolizar otros sustratos.
En una forma de realización preferida, el pH óptimo en la gama de pH de aproximadamente 7.27 a aproximadamente pH 10.95, más preferiblemente en la gama de pH de aproximadamente 8.03 a aproximadamente pH 10.95, y más preferiblemente en la gama de pH de aproximadamente 8.62 a aproximadamente pH 10.51 se determina tras la incubación durante 5 minutos a la temperatura ambiente en presencia de Ala-pro-para-nitroanilida.
En una cuarta forma de realización, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen identidad inmunoquímica o identidad inmunoquímica parcial al polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2. Las propiedades inmunoquímicas están determinadas por pruebas de identidad inmunológicas de reacción cruzada por el conocido procedimiento de inmunodifusión doble de Ouchterlony. Específicamente, un antisuero que contiene anticuerpos que son inmunoreactivos o que se enlazan con epítopos del polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 son preparados mediante la inmunización de conejos (u otros roedores) según el procedimiento descrito por Harboe e Ingild, en N.H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Capítulo 23, o Johnstone y Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (más específicamente páginas 27-31). Un polipéptido que tiene identidad inmunoquímica es un polipéptido que reacciona con el antisuero en una forma idéntica como por ejemplo la fusión total de precipitados, la morfología idéntica del precipitado, y/o movilidad electroforética idéntica usando una técnica específica inmunoquímica. Otra explicación de la identidad inmunoquímica está descrita por Axelsen, Bock, y Krøll, en N.H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973; Capítulo 10. Un polipéptido que tiene identidad parcial inmunoquímica es un polipéptido que reacciona con el antisuero en una forma parcialmente idéntica como la fusión parcial de los precipitados, la morfología parcialmente idéntica de los precipitados, y/o la movilidad electroforética parcialmente idéntica usando una técnica específica inmunoquímica. Otra explicación de la identidad inmunoquímica parcial está descrita por Bock y Axelsen, en N.H. Axelsen, J. Krøll, and B. Weeks, editors, A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973; Capítulo 11.
Los polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan con una sonda de oligonucleótidos que se hibridiza con la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO:1, su cadena complementaria, o variantes alélicas y subsecuencias de la SEC ID NO:1; variantes alélicas y fragmentos de los polipéptidos; o los polipéptidos homólogos y polipéptidos con propiedades inmunológicas idénticas o parcialmente idénticas pueden ser obtenidos a partir de microorganismos de cualquier género.
En una forma de realización preferida, estos polipéptidos pueden ser obtenidos de una fuente bacteriana. Por ejemplo, estos polipéptidos pueden ser obtenidos a partir de una bacteria gram positiva tal como una cepa de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, o Bacillus thuringiensis; o una cepa de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus; o de una bacteria gram negativa, p. ej., E. coli o Pseudomonas sp.
Los polipéptidos pueden ser obtenidos a partir de una fuente fúngica, y más preferiblemente de una cepa de levadura tal como, una cepa de Candida Kluyveromices, Pichia, Saccharomyces, Schizosacaromyces, o Yarrowia; o una cepa filamentosa fúngica tal como una cepa de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, o Trichoderma.
En una forma de realización preferida, los polipéptidos son obtenidos a partir de una cepa de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis.
En otra forma de realización preferida, los polipéptidos son obtenidos a partir de una cepa de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Trichoderma harzianuin, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
Los polipéptidos de la presente invención son preferiblemente obtenidos de especies de Aspergillus que incluyen, pero no se limitan a, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae.
En una forma de realización más preferida, un polipéptido de la presente invención es obtenido de una cepa de Aspergillus oryzae, y más preferiblemente de Aspergillus oryzae ATCC 20386 o una cepa mutante de la misma, p. ej., el polipéptido con la secuencia de aminoácidos de la SEG ID NO:2.
Será entendido que para las especies mencionadas, la invención comprende los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, p. ej., anamorfos, a pesar del nombre de las especies por el que se conocen. Los expertos en la técnica fácilmente reconocen la identidad de los equivalentes apropiados. Los polipéptidos de la presente invención pueden también ser obtenidos de microorganismos que son sinónimos de Aspergillus tal y como se define por Raper, K.D. y Fennel, D.L, 1965, The Genus Aspergillus, The Wilkins Company, Baltimore. Los hisopos son hongos mitospóricos caracterizados porque un hisopo compuesto por un tallo de conidiospora sin estados teleomórficos conocidos que terminan en una vesícula, que a su vez soporta una o dos capas de células especializadas formadas sincrónicamente, a las que se hace referencia de diversas maneras como sterigmata o fiálides, y esporas asexuales formadas llamadas conidias. Los teleomorfos conocidos de Aspergillus incluyen Eurotium, Neosartorya, y Emericella. Las cepas de Aspergillus y los teleomorfos de las mismas están fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos a partir de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (p. ej., tierra, composts, agua, etc.) usando las sondas mencionadas arriba. Las técnicas para aislar microorganismos de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. La secuencia de ácidos nucléicos puede luego ser derivada seleccionando de forma similar una biblioteca genómica o de ADNc de otro microorganismo. Una vez que la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la secuencia puede ser aislada o clonada utilizando técnicas que son conocidas por los expertos en la técnica (ver, p. ej., Sambrook et al.; 1989; supra).
Para fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" según se utiliza en este caso en relación con una fuente dada significará que el polipéptido es producido por la fuente o por una célula donde un gen de la fuente ha sido insertado.
Tal y como se define aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido que está esencialmente libre de otros polipéptidos sin aminopeptidasa, p. ej., al menos aproximadamente con el 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 60% de pureza, incluso más preferiblemente aproximadamente el 80% de pureza, más preferiblemente aproximadamente el 90% de pureza, e incluso más preferiblemente aproximadamente el 95% de pureza, según está determinado por SDS-PAGE.
Secuencias de ácidos nucleicos
La presente invención también se refiere a secuencias aisladas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de la presente invención. En una forma de realización preferida, la secuencia de ácidos nucléicos codifica un polipéptido obtenido a partir de Aspergillus, p. ej., Aspergillus oryzae, y en una forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucléicos se obtiene a partir de Aspergillus oryzae ATCC 20386, p. ej., la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO:1. En otra forma de realización más preferida, la secuencia de ácidos nucléicos es la secuencia contenida en el plásmido pEJG18 que está contenido en Escherichia coli NRRL B- 21677. La presente invención también comprende secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2, que difiere de la SEC ID NO:1 en virtud de la degeneración del código genético. La presente invención también se refiere a subsecuencias de la SEC ID NO:1 que codifica fragmentos de la SEC ID NO:2 con actividad aminopeptidasa. Una subsecuencia de la SEC ID NO: 1 es una secuencia de ácidos nucléicos comprendida por la SEC ID NO: 1 a excepción de que uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o del extremo 3' ha sido delecionado. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 990 nucleótidos, más preferiblemente al menos 1140 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 1290 nucleótidos.
Las secuencias de ácidos nucleicos pueden ser obtenidas a partir de microorganismos que son equivalentes taxonómicos de Aspergillus tal y como se define por Raper, K.D. y Fennel, D.I., 1965, supra., a pesar del nombre de las especies por el que se conocen.
Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucléicos que codifican un polipéptido son conocidas en la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, una preparación de ADNc, o una combinación de los mismos. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención a partir de este ADN genómico puede ser efectuada, p. ej., usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) bien conocida o seleccionando anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar los fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Ver, p. ej., Innis et al.; 1990; PCR: A. Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Se pueden utilizar procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada ligada (LAT) y la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA). La secuencia de ácidos nucléicos puede ser clonada a partir de una cepa de Aspergillus, u otro organismo o uno relacionado y por tanto puede ser, por ejemplo, una variante alélica o de especies de la región codificadora de polipéptidos de la secuencia de ácidos nucléicos.
El término "secuencia de ácidos nucleicos aislada" según se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucléicos que está esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, p. ej., al menos aproximadamente con el 20% de pureza, preferiblemente al menos aproximadamente el 40% de pureza, más preferiblemente al menos aproximadamente el 60%, de pureza incluso más preferiblemente al menos aproximadamente el 80% de pureza, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de pureza según está determinado por electroforesis en agarosa. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucléicos aislada puede ser obtenida por procedimientos de clonación estándares usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucléicos desde su ubicación natural hasta un sitio diferente en el que será reproducida. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácidos nucleicos deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula del vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde múltiples copias o clones de la secuencia de ácidos nucléicos serán replicadas. La secuencia de ácidos nucléicos puede ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintético, sintético, o cualquier combinación de
estos.
La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos con cierto grado de homología a la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO: de al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente aproximadamente el 60%, preferiblemente aproximadamente el 70%, preferiblemente aproximadamente el 80%, más preferiblemente aproximadamente el 90%, incluso más preferiblemente aproximadamente el 95%, y más preferiblemente aproximadamente el 97% de homología, que codifica un polipéptido activo. Para fines de la presente invención, el grado de homología entre dos secuencias de ácidos nucleicos está determinado por el método Clustal (Higgins; 1989; supra) con una tabla de identidad, una penalización por los gaps de 10; y una penalización por la longitud de los
gaps de 10.
La modificación de una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustantialmente similares" al polipéptido se refiere a formas de origen no natural del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir en una manera creada genéticamente del polipéptido aislado de su fuente nativa. Por ejemplo, puede ser interesante sintetizar variantes del polipéptido donde las variantes difieren en la actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, o similar usando, p. ej., la mutagénesis sitio dirigida. La secuencia análoga puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucléicos presentada como la parte codificadora del polipéptido de la SEC ID NO:1, p. ej., una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no den lugar a otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucléicos, pero que se corresponda con el uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución de nucleótidos, ver, p. ej., Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Será evidente para los expertos en la técnica que estas sustituciones pueden hacerse fuera de las regiones fundamentales para la función de la molécula y además resultarán en un polipéptido activo. Los residuos aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucléicos aislada de la invención, y en consecuencia preferiblemente no sometidos a la sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis sitio dirigida o la mutagénesis de rastreo de alanina (ver, p. ej., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas por la actividad aminopeptidasa para identificar residuos aminoácidos que son fundamentales para la actividad de la molécula. Los sitios de interacción enzima-sustrato pueden también ser determinados por análisis de la estructura tridimensional según está determinado por técnicas de este tipo como el análisis de resonancia magnética nuclear, marcado por cristalografía o fotoafinidad (ver, p. ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).
Los polipéptidos de la presente invención también incluyen polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido se fusiona en el N-término o en el C-término del polipéptido o en un fragmento del mismo. Un polipéptido fusionado es producido mediante la fusión de una secuencia de ácidos nucléicos (o una parte de la misma) que codifica otro polipéptido hasta una secuencia de ácidos nucléicos (o una parte de la misma) de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidos en la técnica, e incluyen ligar las secuencias de codificación que codifican los polipéptidos de modo que estén en un marco y que la expresión del polipéptido fundido esté bajo el control del mismo promotor(es) y terminador.
La presente invención también se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican un polipéptido de la presente invención, que se hibridan bajo condiciones de baja astringencia, más preferiblemente condiciones de astringencia media, y más preferiblemente condiciones de astringencia alta, con una sonda de oligonucleótidos que se hibrida bajo las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucléicos de la SEC ID NO:1 o su cadena complementaria; o variantes alélicas y subsecuencias de la misma (Sambrook et al.; 1989; supra).
Constructos de ácidos nucleicos
La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia de codificación en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control. Se entenderá que la expresión incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido que incluye, pero no se limita a, la transcripción, modificación postranscripcional, traducción, modificación postraduccional, y secreción.
"Constructo de ácidos nucléicos" se define aquí como una molécula de ácidos nucleicos, bien mono o bicatenaria, que está aislada de un gen de origen natural o que ha sido modificada para contener segmentos del ácido nucleico que se combinan y superponen en cierto modo los cuales no existirían en naturaleza de otra manera. El término constructo de ácidos nucléicos es sinónimo del término cassette de expresión cuando el constructo de ácidos nucleicos contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia de codificación de la presente invención. El término "secuencia de codificación" tal y como se define aquí es una secuencia que está transcrita en ARNm y traducida en un polipéptido de la presente invención. Los bordes de la secuencia de codificación están generalmente determinados por un centro de unión del ribosoma (procariotas) o por el codón de iniciación ATG (eucariotas) localizados justo hacia arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia del terminador de la transcripción localizada justo hacia abajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes.
Una secuencia de ácidos nucléicos aislada que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada de varias maneras para proveer la expresión del polipéptido. La manipulación de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Las técnicas para modificar las secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de clonación son bien conocidos en la técnica.
El término "secuencias de control" se define aquí por incluir todos los componentes que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o externa a la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido. Las secuencias de control de este tipo incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, de poliadenilación, una secuencia del propéptido, un promotor, una secuencia señal, y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de parada de la transcripción y de la traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlazadores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten la unión de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido. El término "operativamente enlazado" se define aquí como una configuración en la que una secuencia de control se coloca de manera apropiada en una posición con respecto a la secuencia de codificación de la secuencia de ADN de manera que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido.
La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucleicos que sea reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucléicos que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de genes extracelulares o polipéptidos intracelulares sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos del operón lac de E. coli, el gen de la agarasa (dagA) de Streptomyces coelicolor, el gen de la levansucrasa (sacB) de Bacillus subtilis, el gen de la alfa-amilasa (amyL) de Bacillus licheniformis, el gen de la amilasa maltogénica (amyAl) de Bacillus stearothermophilus, el gen de la alfa-amilasa (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, el gen de la penicilinasa (penP) de Bacillus licheniformis, los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al., 1989, supra.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención en una célula huésped filamentosa fúngica son los promotores obtenidos a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, la alfa-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, la glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, la lipasa de Rhizomucor miehei, la proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, la acetamidasa de Aspergillus nidulans, la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (Patente U.S. nº. 4,288,627), y, los promotores mutantes, truncados, e híbridos de los mismos. Los promotores particularmente preferidos para el uso en células huéspedes filamentosas fúngicas son la TAKA amilasa, NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes que codifican la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae), y los promotores de glaA.
En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles a partir del gen de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, el gen de la galactocinasa (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, los genes de alcohol deshidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, y el gen de la 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huéspedes de levadura están descritos por Romanos et al.; 1992; Yeast 8: 423-488. En una célula huésped de mamífero, los promotores útiles incluyen promotores víricos tales como aquellos del Virus Símico 40 (SV40), virus del Sarcoma de Rous (RSV), adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV), y citomegalovirus humano (CMV).
La secuencia de control puede también ser una secuencia del terminador de la transcripción adecuada, es decir una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar transcripción. La secuencia del terminador está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido. Cualquier terminador que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención.
Los terminadores preferidos para las células huéspedes filamentosas fúngicas se obtienen a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, y la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para las células huéspedes de levadura son obtenidos a partir de los genes que codifican la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CiC 1), o gliceraldehido-3- fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huéspedes de la levadura están descritos por Romanos et al.; 1992; supra. Las secuencias del terminador son bien conocidas en la técnica para las células huéspedes de mamífero.
La secuencia de control puede también ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al término 5' de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido. Cualquier secuencia líder que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.
Los líderes preferidos para células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidos a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
Los líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos a partir del gen de la enolasa (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, el gen de la 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, y los genes de alcohol deshidrogenase/gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de control puede también ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que está operativamente enlazada al término 3' de la secuencia de ácidos nucléicos y que, cuando se transcribe, es reconocida por la célula huésped como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células huéspedes filamentosas fúngicas son obtenidas a partir de los genes que codifican la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, la glucoamilasa de Aspergillus niger, la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, y la alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. Las secuencias de poliadenilación son bien conocidas en la técnica para células huéspedes de mamífero.
La secuencia de control puede también ser una región de codificación del péptido señal, la cual codifica para una secuencia de aminoácidos enlazada al término amino del polipéptido que puede dirigir el polipéptido codificado en la vía secretora celular. El extremo S' de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucléicos puede intrínsecamente contener una región de codificación del péptido señal naturalmente enlazada en el marco de lectura de la traducción con el segmento de la región de codificación que codifica el polipéptido segregado. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia de codificación puede contener una región de codificación del péptido señal que sea externa a la secuencia de codificación. La región de codificación del péptido señal externo puede ser requerida cuando la secuencia de codificación normalmente no contiene una región de codificación del péptido señal. De forma alternativa, la región de codificación del péptido señal externo puede simplemente reemplazar la región de codificación del péptido señal natural para obtener una secreción mejorada del polipéptido. La región de codificación del péptido señal puede ser obtenida a partir de una glucoamilasa o un gen de la amilasa de una especie de Aspergillus, un gen de la lipasa o de proteinasa de una especie de Rhizomucor, del gen para el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, un gen de la amilasa o de proteasa de una especie de Bacillus, o del gen de la preproquimosina de ternero. No obstante, cualquier región de codificación del péptido señal que dirige el polipéptido expresado en la vía secretora de la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención.
Una región de codificación del péptido señal eficaz para células huéspedes bacterianas es la región de codificación del péptido señal obtenida del gen de la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, el gen de la alfa- amilasa de Bacillus stearothermophilus, el gen de la subtilisina de Bacillus licheniformis, el gen de la beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, los genes de las proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), o el gen prsA de Bacillus subtilis. Otros péptidos señal están descritos por Simonen y Palva; 1993; Microbiological Reviews 57: 109-137.
Una región de codificación del péptido señal eficaz para las células huéspedes filamentosas fúngicas es la región de codificación del péptido señal obtenida a partir del gen de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, el gen de la amilasa neutra de Aspergillus niger, el gen de la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, el gen de la celulasa de Humicola lanuginosa, o el gen de la lipasa de Humicola lanuginosa.
Los péptidos señal útiles para células huéspedes de la levadura son obtenidos a partir de los genes para el alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae y de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones de codificación del péptido señal útiles están descritas por Romanos et al.; 1992; supra.
La secuencia de control puede también ser una región de codificación del propéptido, que codifica para una secuencia de aminoácidos situada en el término amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido es generalmente inactivo y puede ser convertido a un polipéptido maduro activo por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido a partir del propolipéptido. La región de codificación del propéptido puede ser obtenida a partir del gen de la proteasa alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, el gen de la proteasa neutra (nprT) de Bacillus subtilis, el gen del alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae, el gen de la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, o el gen de la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).
Cuando tanto el péptido señal como las regiones del propéptido están presentes en el término amino de un polipéptido, la región del propéptido está situada junto al término amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada junto al término amino de la región del propéptido.
Los constructos de los ácidos nucleicos de la presente invención pueden también comprender una o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican uno o más factores que son ventajosos para dirigir la expresión del polipéptido, p. ej., un activador transcripcional (p. ej., un factor trans-actor), una chaperona, y una proteasa de procesamiento. Cualquier factor que es funcional en la célula huésped de elección puede ser usado en la presente invención. Los ácidos nucleicos que codifican uno o más de estos factores no están necesariamente en serie con la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido.
Un activador de la transcripción es una proteína que activa la transcripción de una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido (Kudla et al.; 1990; EMBO Journal 9: 1355-1364; Jarai y Buxton, 1994, Current Genetics 26: 2238-244; Verdier, 1990, Yeast 6: 271-297). La secuencia de ácidos nucléicos que codifica un activador puede ser obtenida a partir de los genes que codifican NprA (nprA) de Bacillus stearothermophilus, la hemoproteína activadora 1 (hapl) de Saccharomyces cerevisiae, la proteína metabolizadora de galactosa 4 (gal4) de Saccharomyces cerevisiae, la proteína reguladora de amonio (areA) de Aspergillus nidulans, y del activador de la alfa-amilasa (amyR) de Aspergillus oryzae. Para ejemplos adicionales, ver Verdier; 1990; supra y MacKenzie et al.; 1993; Journal of General Microbiology 139: 2295-2307.
Una chaperona es una proteína que ayuda a otro polipéptido a doblarse de forma adecuada (Hart) et al., 1994, TIBS 19: 20- 25; Bergeron et al., 1994, TIBS 19: 124-128; Demolder et al., 1994, Journal of Biotechnology 32: 179-189; Craig, 1993, Science 260: 1902-1903; Gething y Sambrook, 1992, Nature 355: 33-45; Puig y Gilbert, 1994, Journal of Biological Chemistry 269: 7764-777; Wang y Tsou, 1993, The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson et al., 1994, BiolTechnology 1: 381-384; Jacobs et al., 1993, Molecular Microbiology 8: 957- 966). La secuencia de ácidos nucléicos que codifica una chaperona puede ser obtenida a partir de los genes que codifican las proteínas GroE de Bacillus subtilis, PrsA de Bacillus subtilis, la proteína disulfuro isomerasa de Aspergillus oryzae, calnexina de Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae BiP/GRP78, y Saccharomyces cerevisiae Hsp70. Para ejemplos adicionales, ver Gething y Sambrook, 1992,supra, y Hartl et al., 1994, supra.
Una proteasa de procesamiento es una proteasa que secciona un propéptido para generar un polipéptido maduro bioqímicamente activo (Enderlin y Ogridziak; 1994; Yeast 10: 67-79; Fuller et al., 1989, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Julius et al., 1984, Cell 37: 1075-1089; Julius et al., 1983, Cell 32: 839-852; Patente estadounidense No. 5,702,934). La secuencia de ácidos nucléicos que codifica una proteasa de procesamiento puede ser obtenida a partir de los genes que codifican la dipeptidilaminopeptidasa de Saccharomyces cerevisiae, Kex2 de Saccharomyces cerevisiae, la endoproteasa de procesamiento dibásico (xpr6) de Yarrowia lipolytica, y la metaloproteinasa (gen p45) de Fusarium oxysporum.
Puede también ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido con respecto al crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son los que causan la expresión del gen que debe ser activado o desactivado como respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en los sistemas procarióticos incluyen los sistemas del operador lac, tac, y trp. En la levadura, se puede emplear el sistema ADH2 o sistema GAL1. En hongos filamentosos, se pueden emplear el promotor de la TAKA alfa-amilasa, el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus oryzae como secuencias reguladoras. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que tienen en cuenta la amplificación génica. En los sistemas eucarióticos, están incluidos el gen de la dihidrofolato reductasa que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de la metalotioneina que son amplificados con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido sería operativamente enlazada con la secuencia reguladora.
La presente invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos para alterar la expresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido de la presente invención. Los constructos pueden contener el número mínimo de componentes necesarios para alterar la expresión del gen endógeno. En una forma de realización, los constructos de ácidos nucleicos preferiblemente contienen (a) una secuencia de identificación, (b) una secuencia reguladora, (c) un exón, y (d) un sitio donador de empalme. Tras la introducción del constructo de ácidos nucléicos en una célula, el constructo se inserta por recombinación homóloga en el genoma celular en el sitio del gen endógeno. La secuencia de acceso dirige la integración de los elementos (a)- (d) en el gen endógeno de manera que los elementos (b)-(d) se enlacen operativamente al gen endógeno. En otra forma de realización, los constructos de ácidos nucleicos contienen (a) una secuencia de identificación, (b) una secuencia reguladora, (c) un exón, (d) un sitio donador de empalme, (e) un intrón, y (f) un sitio aceptor de empalme, donde la secuencia de identificación dirige la integración de los elementos (a)-(f) de manera que los elementos (b)- (f) estén operativamente enlazados al gen endógeno. No obstante, los constructos pueden contener componentes adicionales tales como un marcador seleccionable.
En ambas formas de realización, la introducción de estos componentes resulta en la producción de una nueva unidad de transcripción donde la expresión del gen endógeno es alterada. En esencia, la unidad de la transcripción nueva es un producto de fusión de las secuencias introducidas por los constructos de identificación y el gen endógeno. En una forma de realización en la que el gen endógeno es alterada, el gen es activado. En esta forma de realización, la recombinación homóloga se utiliza para reemplazar, interrumpir, o deshabilitar la región reguladora normalmente asociada con el gen endógeno de una célula madre a través de la inserción de una secuencia reguladora que provoca que el gen sea expresado a niveles más altos que los niveles evidentes en la célula madre correspondiente. El gen activado puede ser amplificado adicionalmente por la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable en el constructo usando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, patente estadounidense nº. 5,641,670). En otra forma de realización en la que el gen endógeno es alterado, la expresión del gen se reduce.
La secuencia de identificación puede estar dentro del gen endógeno, inmediatamente contigua al gen, dentro de un gen en dirección hacia arriba, o en dirección hacia abajo y a cierta distancia desde el gen endógeno. Se pueden emplear una o más secuencias de identificación. Por ejemplo, un plásmido circular o un fragmento de ADN preferiblemente emplea una única secuencia de identificación, mientras que un plásmido lineal o un fragmento de ADN preferiblemente emplea dos secuencias de identificación.
La secuencia reguladora del constructo puede estar compuesta por uno o más promotores, intensificadores, regiones SAR o sitios de fijación matricial, elementos reguladores negativos, sitios de unión de la transcripción, o combinaciones de estas secuencias.
Los constructos además contienen uno o más exones del gen endógeno. Un exón se define como una secuencia de ADN que es copiada en ARN y que está presente en una molécula de ARNm de manera que la secuencia del exón está dentro del marco de lectura con la región de codificación del gen endógeno. Los exones pueden, opcionalmente, contener ADN que codifica uno o más aminoácidos y/o que codifica parcialmente un aminoácido. De forma alternativa, el exón contiene ADN que corresponde a una región no codificante 5'. Cuando el exón o exones exógeno(s) codifica(n) uno o más aminoácidos y/o una parte de un aminoácido, el constructo de ácidos nucléicos está diseñado de manera que, tras la transcripción y el empalme, el marco de lectura esté dentro del marco de lectura con la región de codificación del gen endógeno de modo que el marco de lectura apropiado de la parte del ARNm derivada del segundo exón no cambie.
El sitio donador de empalme de los constructos dirige el empalme de un exón a otro exón. Normalmente, el primer exón está en la posición 5' del segundo exón, y el sitio donador de empalme que recubre y flanquea al primer exón en su lado 3' reconoce un sitio aceptor de empalme que flanquea al segundo exón en el lado 5' del segundo exón. Un sitio aceptor de empalme, así como un sitio donador de empalme, es una secuencia que dirige el empalme de un exón a otro exón. Actuando junto con un sitio donador de empalme, el aparato de empalme usa un sitio aceptor de empalme para efectuar la eliminación de un intrón.
Vectores de expresión
La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención, un promotor, y señales de parada de la transcripción y de la traducción. Las distintas secuencias de ácidos nucleicos y de control anteriormente descritas pueden ser unidas entre si para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido en estos sitios. De forma alternativa, la secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención puede ser expresada insertando la secuencia de ácidos nucléicos o un constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Al crear el vector de expresión, la secuencia de codificación está localizada en el vector de modo que la secuencia de codificación está operativamente enlazada con las secuencias de control apropiadas para la expresión, y posiblemente la secreción.
El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (p. ej., un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante y que puede provocar la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos. La elección del vector normalmente dependerá de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se debe introducir el vector. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, p. ej., un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. De forma alternativa, el vector puede ser uno que al introducirse en la célula huésped, se integre en el genoma y se replique con el(los) cromosoma(s) en el(los) que se haya integrado. El sistema del vector puede ser un único vector o plásmido o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen uno o más marcadores seleccionables que permiten una fácil selección de células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona resistencia a los biocidas o a los virus, resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica como por ejemplo resistencia a la ampicilina, canamicina, cloranfenicol o tetraciclina. Los marcadores adecuados para células mamíferas son la dihidrofolato reductasa (dfhr), la higromicina fosfotransferasa (hygB), la aminoglicósido fosfotransferasa II, y los genes de resistencia a la fleomicina. Los marcadores adecuados para las células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Un marcador seleccionable para el uso en una célula huésped filamentosa fúngica puede ser seleccionado del grupo que incluye, pero no está limitado a, amds (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-S'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de otras especies. Para el uso en una célula de Aspergillus son preferidos los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus. Además, la selección puede ser realizada por cotransformación, p. ej., como se describe en WO 91/17243, donde el marcador seleccionable está en un vector separado.
Los vectores de la presente invención preferiblemente contienen un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma de la célula.
Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucléicos que codifican el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. De forma alternativa, el vector puede contener secuencias de ácidos nucleicos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en
una(s) ubicación(es) precisa(s) en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían preferiblemente contener un número suficiente de ácidos nucleicos, como por ejemplo de 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente de 400 a 1,500 pares de bases, y más preferiblemente de 800 a 1,500 pares de bases, que son altamente homólogos a la secuencia blanco correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia blanco en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos codificantes o no codificantes. En cambio, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
Para la replicación autónoma, el vector puede además comprender un origen de replicación que permita que el vector se replique de manera autónoma en la célula huésped en cuestión. Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322; pUC19; pACYC177, y pACYC184 que permiten la replicación en E. coli, y pUB110; pE194; pTA1060, y pAM\beta1 que permiten la replicación en Bacillus. Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 micras, ARS 1, ARS4, la combinación de ARS 1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CENE. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que le haga funcionar de manera sensible a la temperatura en la célula huésped (ver, p. ej., Ehrlich; 1978; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433).
Más de una copia de una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para amplificar la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos. Una amplificación estable de la secuencia de ácidos nucléicos puede ser obtenida integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácidos nucléicos donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por tanto las copias adicionales de la secuencia de ácidos nucléicos, pueden ser seleccionadas cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
Los procedimientos usados para ligar los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son conocidos por los expertos en la materia (ver, p. ej., Sambrook et al.; 1989; supra).
Células huéspedes
La presente invención también se refiere a células huéspedes recombinantes, que comprenden una secuencia de ácidos nucléicos de la invención, que es ventajosamente usada para la producción recombinante de los polipéptidos. El término "célula huésped" comprende cualquier descendiente de una célula madre que no es idéntica a la célula madre debido a las mutaciones que ocurren durante la replicación.
Un vector que comprende una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención es introducido en una célula huésped de modo que el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicante. La integración está generalmente considerada una ventaja puesto que la secuencia de ácidos nucléicos es más propensa a ser mantenida estable en la célula. La integración del vector en el cromosoma huésped puede hacerse por recombinación homóloga o no homóloga según se ha descrito antes.
La elección de una célula huésped en gran parte depende del gen que codifica el polipéptido y de su fuente. La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, p. ej., un procariota, o un microorganismo no unicelular, p. ej., un eucariota. Las células unicelulares útiles son las células bacterianas tales como las bacterias gram positivas que incluyen, pero no se limitan a, una célula de Bacillus, p. ej., Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, y Bacillus thuringiensis; o Un una célula de Streptomyces, p. ej., Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli y Pseudomonas sp. En una forma de realización preferida, la célula huésped bacteriana es una célula de Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus, o Bacillus subtilis. La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuada mediante la transformación del protoplasto (ver, p. ej., Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, p. ej., Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por electroporación (ver, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742- 751), o por conjugación (ver, p. ej., Koehler y Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).
La célula huésped puede ser una eucariota, tal como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o una célula fúngica. Las células mamíferas útiles incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células COS, o cualquier número de otras líneas celulares inmortalizadas disponibles, p. ej., de la American Type Culture Collection.
En una forma de realización preferida, la célula huésped es una célula fúngica. Los "hongos" como se utiliza en este caso incluyen el filo Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (tal y como se define por Hawkswort et al., En, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) al igual que el Oomycota (como citado en Hawkswort et al.; 1995; supra, página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al.; 1995; supra). Los grupos representativos de Ascomycota incluyen, p. ej., Neurospora, Eupenicillium (=Penicillium), Emericella (=Aspergillus), Eurotium (=Aspergillus), y las levaduras reales catalogadas más abajo. Ejemplos de Basidiomycota incluyen hongos, royas, y tizones. Grupos representativos de Chytridiomycota incluyen, p. ej., Chytridiomycota, y hongos acuáticos. Grupos representativos de Oomycota incluyen, p. ej., hongos acuáticos del género Saprolegnia (moldes acuáticos) tales como Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos incluyen Aspergillus, Penicillium, Candida, y Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota incluyen, p. ej., Rhizopus y Mucor.
En una forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. "Levadura" como se utiliza en este caso incluye levadura del género ascospora (Endomycetales), levadura del género basidiospora, y levadura de los Hongos Imperfectos (Blastomycetes). Las levaduras del género ascospora se dividen en las familias Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Éste último está compuesto por cuatro subfamilias, Schizosaccharomycoideae (p. ej., género Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (p. ej., géneros Kluyveromyces, Pichia, y Saccharomyces). Las levaduras del género basidiospora incluyen los géneros Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. Las levaduras pertenecientes a los Hongos Imperfectos se divididen en dos familias, Sporobolomycetaceae (p. ej., géneros Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (p. ej., género Candida). Puesto que la clasificación de levadura puede cambiar en el futuro, para fines de esta invención, la levadura será definida como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980. La biología de la levadura y la manipulación de la genética de la levadura se conocen bien en la técnica (ver,p. ej., Biochemistry and Genetics of Yeast, Bacil, M., Horecker, B.J., y Stopani, A.O.M., editors, 2nd edition, 1987; The Yeasts, Rose, A.H., y Harrison, J.S., editors, 2nd edition, 1987; y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern et al., editors, 1981).
En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped de la levadura es una célula de una especie de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, o Yarrowia.
En una forma de realización más preferida, la célula huésped de la levadura es una célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kiuyveri, Saccharomyces norbensis o Saccharomyces oviformis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de la levadura es una célula de Kluyveromyces lactis. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped de la levadura es una célula de Yarrowia lipolytica.
En otra forma de realización más preferida, la célula huésped fúngica es una célula micótica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (tal y como se define por Hawkswort et al.; 1995; supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo es por alargamiento hifal y el catabolismo del carbono es estrictamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es por injerto de un talo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo. En una forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de unas especies de, pero no limitada a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, y Trichoderma.
En una forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Aspergillus. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Acremonium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Fusarium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Humicola. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Mucor. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es la célula de Myceliophthora. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Neurospora. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Penicillium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Thielavia. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Tolypocladium. En otra forma de realización aún más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Trichoderma.
En una forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenatum. En una forma de realización aún más preferida, la célula madre filamentosa fúngica es una célula de Fusarium venenatum (Nirenberg sp. nov.). En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Humicola insolens o de Humicola lanuginosa. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Mucor miehei. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Myceliophthora termofilum. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Neurospora crassa. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Penicillium purpurogenum. En otra forma de realización más preferida, la célula huésped filamentosa fúngica es una célula de Thielavia terrestris. En otra forma de realización más preferida, la célula de Trichoderma es una célula de Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride.
Las células micóticas pueden ser transformadas por un proceso que implica la formación de los protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de las células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Un método adecuado para transformar especies de Fusarium está descrito por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 o en WO 96/00787. La levadura puede ser transformada usando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, J.N. y Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182- 187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. Las células mamíferas pueden ser transformadas por captación directa usando el método de la precipitación del fosfato de calcio de Graham y Van der Eb (1978, Virology 52: 546).
Métodos de producción
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprende (a) cultivar una cepa, la cual en su forma tipo salvaje sea capaz de producir el polipéptido, para producir un sobrenadante que comprenda el polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Preferiblemente, la cepa es del género Aspergillus.
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una célula huésped bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.
La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención que comprenden (a) cultivar una célula homólogamente recombinante, que tenga incorporada en su interior una unidad de transcripción nueva comprendiendo una secuencia reguladora, un exón, y/o un sitio de empalme donador operativamente enlazado a un segundo exón de una secuencia de ácidos nucléicos endógena que codifica el polipéptido, bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. Los métodos están basados en el uso de la tecnología de activación de genes, por ejemplo, como se describe en la patente estadounidense nº. 5,641,670. La tecnología de activación de genes se basa en activar un gen que normalmente no está expresado en una célula o en aumentar la expresión de un gen que está expresado a niveles muy bajos en una célula. La tecnología de activación de genes incluye métodos para insertar un constructo de ADN exógeno que contiene una secuencia reguladora, un exón, y/o un sitio de empalme donador en el ADN genómico de una célula de manera que la inserción resulta en la producción de una unidad de transcripción nueva donde la secuencia reguladora, el exón, y/o el sitio de empalme donador están operativamente enlazados a ésta y activan la expresión del gen endógeno.
En los métodos de producción de la presente invención, las células se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada por cultivo en un frasco de agitación, fermentación a pequeña escala o a gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, batch, fed-batch, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizados en un medio adecuado y bajo condiciones que permitan que el polipéptido sea expresado y/o aislado. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica (ver, p. ej., referencias para bacterias y levaduras; Bennett, J.W. y LaSure, L., editors, More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden ser preparados según composiciones publicadas (p. ej., en catálogos de la colección americana de cultivos tipo). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es segregado, se puede recuperar de lisatos celulares.
Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, un ensayo enzimático puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido. Los procedimientos para determinar la actividad aminopeptidasa son conocidos en la técnica e incluyen, p. ej., la medición del nivel inicial de hidrólisis de ap-nitroanilida a 405 nm.
El polipéptido resultante puede ser recuperado por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación.
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, cromatografía (p. ej., intercambio fónico, afinidad, cromatoenfoque hidrofóbico, y exclusión por tamaños), los procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio, solubilidad diferencial (p. ej., precipitación del sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (ver, p. ej., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989).
Eliminación o reducción de la actividad aminopeptidasa
La presente invención también se refiere a métodos para producir una célula mutante de una célula madre, que comprende interrupción o deleción de una secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido o una secuencia de control de la misma, que resulta en que la célula mutante produce menos polipéptido que la célula madre.
La construcción de cepas con actividad aminopeptidasa reducida puede ser convenientemente realizada por modificación o inactivación de una secuencia de ácidos nucléicos necesaria para la expresión del polipéptido con actividad aminopeptidasa en la célula. La secuencia de ácidos nucléicos puede ser modificada o inactivada, por ejemplo, una secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido o una parte del mismo esencial para presentar actividad aminopeptidasa, o la secuencia de ácidos nucléicos puede tener una función reguladora requerida para la expresión del polipéptido a partir de la secuencia de codificación de la secuencia de ácidos nucléicos. Un ejemplo de tal secuencia reguladora o de control puede ser una secuencia del promotor o una parte funcional de la misma, es decir, una parte que es suficiente para afectar a la expresión del polipéptido. Otras secuencias de control para una posible modificación incluyen, pero no se limitan a, una secuencia líder, de poliadenilación, una secuencia de propéptidos, una secuencia señal, y un terminador de la terminación.
La modificación o inactivación de la secuencia de ácidos nucléicos puede ser realizada sometiendo la célula a mutagénesis y seleccionando células en las que la capacidad de producción de la aminopeptidasa ha sido reducida o eliminada. La mutagénesis, que puede ser específica o aleatoria, puede ser realizada, por ejemplo, usando un agente mutagenizante físico o químico adecuado, usando un oligonucleótido adecuado, o sometiendo la secuencia de ADN a mutagénesis generada por PCR. Además, la mutagénesis puede ser realizada usando cualquier combinación de estos agentes mutagenizantes.
Ejemplos de un agente mutagenizante físico o químico adecuado para este fin incluyen irradiación ultravioleta (UV) , hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bisulfito de sodio, ácido fórmico, y análogos del nucleótido.
Cuando estos agentes son usados, la mutagénesis es normalmente realizada incubando la célula que debe ser mutagenizada en presencia del agente mutagenizante de elección bajo las condiciones adecuadas, y seleccionando células que presenten actividad aminopeptidasa reducida o ninguna expresión de la misma.
La modificación o inactivación de la producción de un polipéptido de la presente invención puede ser realizada por introducción, sustitución, o eliminación de uno o más nucleótidos de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido o un elemento regulador requerido para la transcripción o traducción de la misma. Por ejemplo, los nucleótidos pueden ser insertados o eliminados para resultar en la introducción de un codón de parada, la eliminación del codón de iniciación, o un cambio del marco de lectura abierto. Esta modificación o inactivación puede ser realizada por mutagénesis dirigida o mutagénesis generada por PCR conforme a los métodos conocidos en la técnica. Aunque, en principio, la modificación puede ser realizada in vivo, es decir, directamente en la célula que expresa la secuencia de ácidos nucléicos que debe ser modificada, se prefiere que la modificación se realice in vitro como se ejemplifica más abajo.
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Un ejemplo de un modo conveniente de inactivar o reducir la producción por una célula huésped de elección se basa en técnicas de sustitución de genes o interrupción de genes. Por ejemplo, en el método de interrupción de genes, una secuencia de ácidos nucléicos correspondiente al gen endógeno o fragmento del gen de interés es mutagenizada in vitro para producir una secuencia de ácidos nucléicos defectuosa que es luego transformada en la célula huésped para producir un gen defectuoso. Mediante recombinación homóloga, la secuencia de ácidos nucléicos defectuosa reemplaza al gen endógeno o al fragmento de gen. Puede ser deseable que el gen defectuoso o el fragmento de gen también codifique un marcador que puede ser usado para seleccionar transformantes en los que el gen que codifica el polipéptido ha sido modificado o destruido.
De forma alternativa, la modificación o inactivación de la secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser realizada por técnicas sin sentido usando una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de codificación del polipéptido. Más específicamente, la producción del polipéptido por una célula puede ser reducida o eliminada introduciendo una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de ácidos nucléicos que codifica al polipéptido que puede ser transcrito en la célula y que es capaz de hibridar al ARNm del polipéptido producido en la célula. Bajo las condiciones que permiten que la secuencia de nucleótidos sin sentido hibride al ARNm del polipéptido, la cantidad de polipéptido traducido entonces se reduce o se elimina.
Se prefiere que la célula que debe ser modificada conforme a los métodos de la presente invención sea de origen microbiano, por ejemplo, una cepa fúngica que sea conveniente para la producción de los productos proteicos deseados, bien homólogos o heterólogos a la célula.
La presente invención también se refiere a una célula mutante de una célula madre que comprende una interrupción o deleción de una secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido o una secuencia de control de la misma, que resulta en que la célula mutante produce menos polipéptido que la célula madre.
Las células mutantes deficitarias de polipéptido creadas de esta manera son particularmente útiles como células huéspedes para la expresión de polipéptidos homólogos y/o heterólogos. En consecuencia, la presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido homólogo o heterólogo que comprende (a) cultivar la célula mutante bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido. En este contexto, los términos "polipéptidos heterólogos" se definen aquí como polipéptidos que no son nativos a la célula huésped, una proteína nativa en la que se han hecho modificaciones para alterar la secuencia nativa, o una proteína nativa cuya expresión es alterada de forma cuantitativa como resultado de una manipulación de la célula huésped por técnicas de ADN recombinante.
En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a un método para la producción de un producto proteico esencialmente libre de actividad aminopeptidasa por fermentación de una célula que produce tanto un polipéptido de la presente invención como el producto proteico de interés. El método comprende la adición de una cantidad eficaz de un agente capaz de inhibir la actividad aminopeptidasa en el caldo de fermentación bien durante o después de que la fermentación haya sido completada, la recuperación del producto de interés del caldo de fermentación, y opcionalmente el sometimiento del producto recuperado a una purificación adicional.
En otro aspecto alternativo, la presente invención se refiere a un método para producir un producto proteico esencialmente libre de actividad aminopeptidasa, donde el producto proteico de interés es codificado por una secuencia de ADN presente en una célula que codifica un polipéptido de la presente invención. El método comprende el cultivo de la célula bajo condiciones que permiten la expresión del producto, sometiendo el caldo de cultivo resultante a un tratamiento combinado de pH y de la temperatura para reducir la actividad aminopeptidasa sustancialmente, y recuperar el producto del caldo de cultivo. De forma alternativa, el tratamiento combinado del pH y de la temperatura puede ser realizado en una preparación enzimática recuperada del caldo de cultivo. El tratamiento combinado del pH y de la temperatura puede opcionalmente ser usado en combinación con un tratamiento con un inhibidor de la aminopeptidasa.
El tratamiento combinado del pH y de la temperatura es preferiblemente realizado a un pH en la gama de 9-11 y una temperatura en la gama de 40- 70ºC durante un periodo temporal suficiente para lograr el efecto deseado, en el que normalmente son suficientes de 30 a 60 minutos.
Conforme a este aspecto de la invención, es posible eliminar al menos el 60%, preferiblemente al menos el 75%, más preferiblemente al menos el 85%, aún más preferiblemente al menos el 95%, y más preferiblemente al menos el 99% de la actividad aminopeptidasa. Se considera que una eliminación completa de actividad aminopeptidasa puede ser obtenida usando estos métodos.
Los métodos usados para cultivar y purificar el producto de interés pueden ser realizados por métodos conocidos en la técnica.
Los métodos de la presente invención para producir un producto esencialmente libre de aminopeptidasa es de interés particular en la producción de polipéptidos eucarióticos, en particular proteínas fúngicas tales como las enzimas. La enzima puede ser seleccionada entre, p. ej., una enzima amilolítica, una enzima lipolítica, una enzima proteolítica, una enzima celulítica, una oxidorreductasa o una enzima degradadora de la pared celular vegetal. Ejemplos de enzimas de este tipo incluyen una aminopeptidasa, una amilasa, una amiloglucosidasa, una carbohidrasa, una carboxipeptidasa, una catalasa, una celulasa, una quitinasa, una cutinasa, una ciclodextrina glicosiltransferasa, una desoxiribonucleasa, una esterasa, una galactosidasa, una beta-galactosidasa, una glucoamilasa, una glucosa-oxidasa, una glucosidasa, una haloperoxidasa, una hemicelulasa, una invertasa, una isomerasa, una lacasa, una ligasa, una lipasa, una liasa, una manosidasa, una oxidasa, una enzima pectinolítica, una peroxidasa, una fitasa, una fenoloxidasa, una polifenoloxidasa, una enzima proteolítica, una ribonucleasa, una transferasa, una transglutaminasa, o una xilanasa. Las células carentes de aminopeptidasa pueden también ser usadas para expresar proteínas heterólogas de interés farmacéutico tales como hormonas, factores de crecimiento, receptores, y similares.
Será entendido que el término "polipéptidos eucarióticos" incluye no sólo polipéptidos nativos, sino también aquellos polipéptidos, p. ej., enzimas, que han sido modificados por sustituciones, deleciones o adiciones, de aminoácidos u otras modificaciones de este tipo para intensificaar la actividad, termostabilidad, tolerancia del pH y similares.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un producto proteico esencialmente libre de actividad aminopeptidasa que es producido por un método de la presente invención.
Métodos para producir hidrolizados de proteínas
Los polipéptidos de la presente invención pueden ser usados en la producción de hidrolizados de proteínas para aumentar el grado de hidrólisis y desarrollar el sabor.
La presente invención también se refiere a métodos para usar un polipéptido de la presente invención en combinación con una endopeptidasa para producir un alto grado de hidrólisis de un material rico en proteínas. El método comprende el tratamiento de un sustrato proteínico con el polipéptido y una endopeptidasa. El sustrato puede ser tratado con las enzimas simultánea o consecutivamente.
Un polipéptido de la presente invención se añade al sustrato proteínico en una cantidad eficaz empleada de forma convencional en procesos de hidrólisis de la proteína, preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100,000 unidades de aminopeptidasa por 100 g de proteína, y más preferiblemente en la gama de aproximadamente 1 a aproximadamente 10,000 unidades de aminopeptidasa por 100 g de proteína. Tal y como se define aquí, una unidad de aminopeptidasa (APU) es la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 micromol de p-nitroanilida por minuto de Leu-p-nitroanilida (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) bajo las condiciones especificadas. De forma alternativa, la aminopeptidasa puede ser empleada preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 500 LAPU/g de proteína, y más preferiblemente en la gama de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 LAPU/g de proteína. LAPU se define como la actividad leucina aminopeptidasa que está determinada como se describe en AF 298/1-GB (disponible bajo petición por Novo Nordisk A/S, Dinamarca).
La endopeptidasa puede ser obtenida a partir de una cepa de Bacillus, preferiblemente Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, una cepa de Staphylococcus, preferiblemente de Staphylococcus aureus, una cepa de Streptomyces, preferiblemente Streptomyces thermovularis o Streptomyces griseus, una cepa de la especie Actinomyces, una cepa de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae, o una cepa de Fusarium, preferiblemente Fusarium venenatum.
La endopeptidasa se añade al sustrato proteínico en una cantidad eficaz empleada de forma convencional en procesos de hidrólisis de proteínas, preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 15 AU/100 g de proteína, y más preferiblemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 8 AU/100 g de proteína. Una AU (unidad de Anson) se define como la cantidad de enzima que bajo condiciones estándar (i.e.; 25ºC, pH 7.5 y 10 min. de tiempo de reacción) digiere la hemoglobina a un nivel inicial de manera que se libere por minuto una cantidad de producto soluble en ATC el cual da el mismo color con reactivo de fenol que un milli-equivalente de tirosina. El método analítico AF 4/5 está disponible bajo petición por Novo Nordisk NS, Dinamarca, el cual está incorporado aquí por referencia.
El tratamiento enzimático, es decir, la incubación del sustrato con las preparaciones enzimáticas, puede ocurrir a cualquier temperatura conveniente a la cual la preparación enzimática no se vuelva inactivada, preferiblemente en la gama de de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 70ºC. Conforme a la práctica establecida, las preparaciones enzimáticas pueden ser inactivadas de manera adecuada aumentando la temperatura de la mezcla de incubación a una temperatura en la que las enzimas se vuelven inactivadas, p. ej., hasta aproximadamente más de 70ºC, o de forma similar reduciendo el pH de la mezcla de incubación hasta un punto en el que las enzimas se vuelven inactivadas, p. ej., aproximadamente menos de 4.0.
Además, los métodos de la presente invención suponen una intensificación del grado de hidrólisis de un sustrato proteínico. Como se utiliza en este caso, el grado de hidrólisis (DH) es el porcentaje del número total de enlaces amino en una proteína que ha sido hidrolizada por una enzima proteolítica. En una forma de realización preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Leu, Gly, Glu, Ser, Asp, Asn, Pro, Cys, Ala, y/o Gln, p. ej., al menos 1.1 veces superior. En una forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Leu. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Gly. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Glu. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Ser. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Asp. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Asn. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Pro. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Cys. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Ala. En otra forma de realización más preferida, los hidrolizados de proteínas tienen un contenido aumentado de Gln.
La presente invención también se refiere a métodos para obtener un hidrolizado de proteínas enriquecido con residuos de ácido glutámico unido a péptidos y/o sin ácido glutámico, dicho método comprende:
1.
(a) someter al sustrato a un proceso de desamidación; y
2.
(b) someter al sustrato a la acción de un polipéptido con actividad aminopeptidasa.
Las dos fases pueden ser realizadas simultáneamente, o la segunda fase puede ser realizada después de la primera fase.
Estos métodos de la presente invención producen hidrolizados de proteínas de sabor excelente porque el ácido glutámico (Glu), sea libre o unido a péptidos, juega un papel importante en el sabor y en la apetencia de los hidrolizados de proteínas. Este método también produce hidrolizados de proteínas con una funcionalidad mejorada, en particular, una solubilidad mejorada, propiedades emulsionantes mejoradas, un grado de hidrólisis aumentado, y propiedades de expansión mejoradas.
La conversión de amidas (glutamina o asparraguina) en ácidos cargados (ácido glutámico o ácido aspártico) por medio de la liberación de amonio es conocida como desamidación. La desamidación puede ocurrir como un proceso de desamidación no enzimático o enzimático.
En una forma de realización preferida, la desamidación se realiza como un proceso de desamidación enzimática, p. ej., sometiendo al sustrato a una transglutaminasa y/o peptidoglutaminasa.
La transglutaminasa puede ser de cualquier fuente conveniente incluidos los mamíferos, ver p. ej., JP 1050382 y JP 5023182; incluido el factor XIII activado, ver p. ej., WO 93/15234; aquellas derivadas del pescado, ver p. ej., EP 555,649; y aquellas obtenidas a partir de microorganismos, ver p. ej., EP 379,606; WO 96/06931 y WO 96/22366. En una forma de realización preferida, la transglutaminasa se obtiene a partir de un Oomycete, incluyendo una cepa de Phytophthora, preferiblemente Phytophthora cactorum, o una cepa de Pythium, preferiblemente Pythium irregulare, Pythium sp., Pythium intermedium, Pythium ultimum, o Pythium periilum (o Pythium periplocum). En otra forma de realización preferida, la transglutaminasa es de origen bacteriano y se obtiene a partir de una cepa de Bacillus, preferiblemente Bacillus subtilis, una cepa de Streptoverticillium, preferiblemente Streptoverticillium mobaraensis, Streptoverticillium griseocarneum, o Streptoverticillium cinnamoneum, y una cepa de Streptomyces, preferiblemente de Streptomyces lydicus.
La peptidoglutaminasa puede ser una peptidoglutaminasa I (peptidil-glutaminasa; EC 3.5.1.43), o una peptidoglutaminasa II (proteína glutamina glutaminasa; EC 3.5.1.44), o cualquier mezcla de las mismas. La peptidoglutaminasa puede ser obtenida de una cepa de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus japonicus, una cepa de Bacillus, preferiblemente de Bacillus circulans, una cepa de Cryptococcus, preferiblemente de Cryptococcus albidus, o una cepa de Debaryomyces, preferiblemente de Debaryomyces kloecheri.
La transglutaminasa se añade al sustrato proteínico en una cantidad eficaz empleada de forma convencional en procesos de desamidación, preferiblemente en la gama de aproximadamente el 0.01 a aproximadamente el 5% (p/p), y más preferiblemente en la gama de aproximadamente el 0.1 a aproximadamente el 1% (p/p) de preparación enzimática con respecto a la cantidad de sustrato.
La peptidoglutaminasa se añade al sustrato proteínico en una cantidad eficaz empleada de forma convencional en procesos de desamidación, preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100,000 unidades de PGasa por 100 g de sustrato, y más preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10,000 unidades de PGasa por 100 g de sustrato.
La actividad peptidoglutaminasa puede ser determinada según el procedimiento de Cedrangoro et al. (1965, Enzymologia 29: 143). Según este procedimiento; 0.5 ml de una muestra enzimática, ajustados a pH 6.5 con 1 N de NaOH, se cargan en un vaso pequeño. Luego 1 ml de una solución tampón de borato pH 10.8 se añade al vaso. El amonio descargado es absorbido por 5 N de ácido sulfúrico, y usando el reactivo de Nessler, se permite que la mezcla forme un color que es medido a 420 nm. Una unidad de PGasa es la cantidad de enzima capaz de producir 1 micromol de amonio por minuto bajo estas condiciones.
De forma alternativa, la actividad peptidoglutaminasa puede ser determinada según el procedimiento descrito en US 3,857,967 o en el Ejemplo 20 más abajo.
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En la fase (b) de los métodos de la presente invención, el sustrato es sometido a un polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de la presente invención se añade al sustrato proteínico en una cantidad eficaz empleada de forma convencional en procesos de hidrólisis de proteínas, preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.5 AU/100 g de sustrato, más preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.1 AU/100 g de sustrato.
En otra forma de realización, los métodos de la presente invención para producir un hidrolizado enriquecido con residuos de ácido glutámico unidos a péptidos y/o sin ácido glutámico además comprenden:
(c)
someter al sustrato a una o más enzimas endo- y/o exo-peptidasas que actúan de forma no específica.
Esta fase puede ocurrir simultáneamente con las fases (a) y (b), o después de las fases (a) y (b).
En una forma de realización preferida, la enzima endo- y/o exo-peptidasa que actúa de forma no específica se obtiene a partir de una cepa de Aspergillus, preferiblemente Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, o Aspergillus sojae, o una cepa de Bacillus, preferiblemente Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, o Bacillus subtilis.
La enzima endo- y/o exo-peptidasa que actúa de manera no específica se añade al sustrato en una cantidad eficaz de forma convencional empleada en procesos de hidrólisis de proteínas, preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 15 CPU/100 g de sustrato, y más preferiblemente en la gama de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 5 CPU/100 g de sustrato. Una CPU (unidad de caseína proteasa) se define como la cantidad de enzima que libera 1 micromol de grupos amino primarios (determinados por comparación con un estándar de serina) por minuto a partir de caseína bajo condiciones estándar, es decir, incubación durante 30 minutos a 25ºC y pH 9.5. El método analítico AF 228/1, que se incorpora aquí por referencia, está disponible bajo pedido por Novo Nordisk NS, Bagsaerd, Dinamarca.
Cada tratamiento enzimático puede ocurrir a cualquier temperatura en la que la preparación enzimática no se vuelva inactivada, preferiblemente en la gama de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 70ºC. La preparación enzimática puede luego ser inactivada aumentando la temperatura, p. ej., hasta aproximadamente más de 70ºC, o reduciendo el pH, p. ej., menos de aproximadamente 4.0.
El sustrato proteínico usado en los métodos de la presente invención puede consistir en proteínas intactas, proteínas prehidrolizadas (es decir, péptidos), o una mezcla de las mismas. El sustrato proteínico puede ser de origen vegetal o animal. Preferiblemente, el sustrato proteínico es de origen vegetal, p. ej., proteína de soja, proteína del grano, p. ej., gluten de trigo, gluten de maíz, cebada, centeno, avena, arroz, ceína, altramuz, proteína de la semilla del algodón, proteína de la semilla de la colza, harina de maní, proteína de la alfalfa, proteína del guisante, proteína de la judía fabácea, proteína de la semilla de sésamo, o girasol. Un sustrato proteínico de origen animal puede ser la proteína del lactosuero, caseína, proteínas de la carne, proteínas del pescado, glóbulos rojos, clara de huevo, gelatina, o lactoalbumina.
La presente invención también se refiere a hidrolizados de proteínas producidos por estos métodos.
Otros Usos
La presente invención también se refiere a métodos para desactivar enzimas con un polipéptido de la presente invención.
Además, un polipéptido de la presente invención puede ser útil para varios objetivos en los que un seccionamiento específico de secuencias peptídicas es deseable. Por ejemplo, algunas proteínas o péptidos son sintetizados en forma de precursores inactivos que comprenden varios residuos aminoácidos adicionales en el N-terminal de la proteína madura. Un polipéptido de la presente invención podría proporcionar el procesamiento postraduccional necesario para activar tales proteínas precursoras.
Composiciones
En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere a composiciones polipeptídicas que comprenden un polipéptido de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones son enriquecidas con un polipéptido de la presente invención. En el presente contexto, el término "enriquecido" indica que la actividad aminopeptidasa de la composición polipeptídica ha sido aumentada,p. ej., con un factor de enriquecimiento de 1.1.
La composición polipeptídica puede comprender un polipéptido de la invención como el componente enzimático más importante, p. ej., una composición polipeptídica monocomponente. De forma alternativa, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, una amilasa, una carbohidrasa, una carboxipeptidasa, una catalasa, una celulasa, una quitinasa, una cutinasa, una ciclodextrina glicosiltransferasa, una desoxirribonucleasa, una esterasa, una alfa- galactosidasa, una beta-galactosidasa, una glucoamilasa, una alfa-glucosidasa, una beta-glucosidasa, una haloperoxidasa, una invertasa, una lacasa, una lipasa, una manosidasa, una oxidasa, una enzima pectinolítica, una peptidoglutaminasa, una peroxidasa, una fitasa, una polifenoloxidasa, una enzima proteolítica, una ribonucleasa, una transglutaminasa, o una xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) ser producible(s) mediante un microorganismo del género Aspergillus, preferiblemente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, o Aspergillus oryzae, o Trichoderma, Humicola, preferiblemente Humicola insolens, o Fusarium, preferably Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, o Fusarium venenaium.
En una forma de realización preferida, la invención se refiere a una composición de mejora del sabor que comprende un polipéptido con actividad aminopeptidasa y un portador adecuado. Cualquier portador adecuado conocido en la técnica puede ser usado. En otra forma de realización preferida, la composición mejoradora del sabor también comprende una endopeptidasa. En otra forma de realización preferida, la composición aromatizante también comprende una o más enzimas endo- y/o exo-peptidasas que actúan de manera no específica. En otra forma de realización preferida, la composición aromatizante comprende además una o más enzimas endo- y/o exo-peptidasas de actuación específica.
En una forma de realización preferida, la enzima proteolítica de actuación específica es una endopeptidasa tal como una glutamil endopeptidasa (EC 3.4.21.19); una lisil endopeptidasa (EC 3.4.21.50); una leucil endopeptidasa (EC 3.4.21.57); una glicil endopeptidasa (EC 3.4.22.25); una propil endopeptidasa (EC 3.4.21.26); tripsina (EC 3.4.21.4) o una endopeptidasa de tipo tripsina (lisina/arginina específica); o una peptidil-Asp- metaloendopeptidasa (EC 3.4.24.33).
La glutamil endopeptidasa (EC 3.4.21.19) puede preferiblemente ser obtenida de una cepa de Bacillus, en particular Bacillus licheniformis y Bacillus subtilis, una cepa de Estafilococo, en particular Estafilococo aureus, una cepa de Streptomyces, en particular Streptomyces termovulgaris y Streptomyces griseus, o una cepa de Actinomyces.
La lisil endopeptidasa (EC 3.4.21.50) puede preferiblemente ser obtenida a partir de una cepa de Achromobacter, en particular Achromobacter lyticus, una cepa de Lysobacter, en particular Lysobacter enzymogenes, o una cepa de Pseudomonas, en particular de Pseudomonas aeruginosa.
La leucil endopeptidasa (EC 3.4.21.57) puede ser de origen vegetal.
La glicil endopeptidasa (EC 3.4.22.25) puede preferiblemente ser obtenida de la planta de la papaya (Carica papaya).
La prolil endopeptidasa (EC 3.4.21.26) puede preferiblemente ser obtenida de una cepa de Flavobacterium, o puede ser de origen vegetal.
La endopeptidasa de tipo tripsina puede preferiblemente ser obtenida de una cepa de Fusarium, en particular Fusarium oxysporum, p. ej., como se describe en WO 89/06270 o WO 94/25583.
La peptidil-Asp-metaloendopeptidasa (EC 3.4.24.33) puede preferiblemente ser obtenida de la cepa de Pseudomonas, en particular Pseudomonas fragi.
En otra forma de realización preferida, la enzima proteolítica de actuación específica es una exo-peptidasa que puede actuar desde cualquier extremo del péptido.
En una forma de realización preferida, la enzima proteolítica de actuación específica es una aminopeptidasa tal como una leucil aminopeptidasa (EC 3.4.11.1); o una tripéptido aminopeptidasa (EC 3.4.11.4).
En otra forma de realización preferida, la enzima proteolítica de actuación específica es una carboxipeptidasa tal como una prolina carboxipeptidasa (EC 3.4.16.2); una carboxipeptidasa A (EC 3.4.17.1); una carboxipeptidasa B (EC 3.4.17.2); una carboxipeptidasa C (EC 3.4.16.5); una carboxipeptidasa D (EC 3.4.16.6); una lisina (arginina) carboxipeptidasa (EC 3.4.17.3); una glicina carboxipeptidasa (EC 3.4.17.4); una alanina carboxipeptidasa (EC 3.4.17.6); una glutamato carboxipeptidasa (EC 3.4.17.11); una peptidil-dipeptidasa A (EC 3.4.15.1); o una peptidil-dipeptidasa (EC 3.4.15.5).
Las composiciones polipeptídicas pueden ser preparadas conforme a los métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de una composición líquida o seca. El polipéptido puede ser estabilizado por métodos conocidos en la técnica.
La presente invención también se refiere a productos alimentarios, p. ej., productos horneados, que comprenden un hidrolizado proteico obtenido por los métodos de la presente invención. Tales productos alimentarios presentan calidades organolépticas mejoradas, tales como mejora del sabor, de la apetencia, sensación en la boca, aroma y color de la corteza.
En el presente contexto, el término "productos horneados" incluye cualquier alimento obtenido a partir de una masa, sea de tipo blando o crujiente. Ejemplos de productos horneados, sea de tipo blanco, claro u oscuro, que puede ser ventajosamente producido por la presente invención, son el pan, en particular el pan blanco, integral o de centeno, normalmente en forma de barras o bocadillos; pan de tipo baguette francesa; pan de pita; tacos; pasteles; panqueques; galletas; pan crujiente; y similares.
Tales productos horneados son de forma convencional obtenidos a partir de una masa que comprende harina y agua, y que es normalmente leudada. La masa puede ser leudada de varias maneras, como por ejemplo añadiendo bicarbonato sódico o similar, o añadiendo una levadura (masa de fermentación), pero la masa es preferiblemente leudada añadiendo un cultivo de levadura adecuado tal como un cultivo de Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería). Cualquiera de las cepas de Saccharomyces cerevisiae comercialmente disponibles puede ser empleada.
Además, la masa usada en la preparación de los productos horneados puede ser fresca o congelada. La preparación de masa congelada está descrita por K. Kulp y K. Lorenz en "Frozen and Refrigerated Doughs and Batters". Una composición mejoradora del sabor según la presente invención está normalmente incluida en la masa en una cantidad en la gama del 0.01-5%, más preferiblemente del 0.1-3%.
En los métodos de la presente invención, un polipéptido de la presente invención, una endopeptidasa, una transglutaminasa, una peptidoglutaminasa, una o más enzimas endo- y/o exo-peptidasas de actuación específica y/o no específica, y/o una o más de las enzimas especificadas arriba pueden ser añadidas, bien separadamente o al mismo tiempo, a la mezcla a partir de la cual se ha hecho la masa o a cualquier ingrediente, p. ej., harina, a partir de la cual se hace la masa.
La presente invención también se refiere a una premezcla, p. ej., en forma de una composición de harina, para masa y/o para productos horneados hechos a partir de la masa, donde la premezcla comprende un polipéptido o una composición mejoradora del sabor según la invención y un portador o ingrediente para la cocción, y opcionalmente una o más de las enzimas especificadas arriba.
En otra forma de realización, la premezcla comprende un hidrolizado obtenido por los métodos de la invención.
La premezcla puede ser preparada mezclando las enzimas pertinentes con un portador adecuado tal como harina, almidón, una azúcar o una sal. La premezcla puede contener otros aditivos mejoradores de la masa y/o del pan.
En este contexto, el término "premezcla" es una mezcla de agentes para hornear, que normalmente incluyen harina, que ha sido preparada para permitir el almacenamiento bajo las condiciones designadas y proporcionan una manipulación conveniente durante los procesos de preparación de la masa. Tal premezcla puede ser de uso ventajoso en plantas e instalaciones industriales y comerciales para la cocción del pan, al igual que en panaderías de venta al público.
La presente invención también se refiere al uso de un hidrolizado producido por los métodos según la invención como un aditivo para productos alimentarios, tales como los alimentos horneados, para realzar las calidades organolépticas, tales como el sabor, apetencia y aroma.
Los hidrolizados enriquecidos con ácido glutámico libre y/o residuos de ácido glutámico unidos a péptidos obtenidos por los métodos de la presente invención pueden ser usados en varias aplicaciones industriales, en particular, cuando hay una necesidad de incorporar proteínas funcionales.
Por ejemplo, la presente invención también se refiere a productos alimentarios que comprenden un hidrolizado enriquecido con ácido glutámico libre y/o residuos de ácido glutámico unidos a péptidos obtenidos por el método de la invención y a aditivos para piensos que comprenden un hidrolizado enriquecido con ácido glutámico libre y/o residuos de ácido glutámico unidos a péptidos obtenidos por los métodos de la presente invención.
La presente invención está posteriormente descrita por los ejemplos siguientes los cuales no deberían ser interpretados como limitadores del objetivo de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de aminopeptidasa II de FLAVOURZYME^{TM}
La aminopeptidasa fue purificada de un caldo de FLAVOURZYME^{TM} (Novo Nordisk NS, Bagsvaerd, Dinamarca). El caldo de FLAVOURZYME^{TM} fue producido por el cultivo de la cepa 1568 de Aspergillus oryzae (ATCC 20386) en un medio compuesto por fuentes de nitrógeno y carbono y metales traza. Primero, el caldo (20 ml conteniendo 720 mg de proteína) fue diluido con 180 ml de tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0 y filtrado usando Nalgene Filterware equipado con un filtro de 0.45 \muM (Nalgene, Rochester NY). La solución filtrada fue cargada en una columna 24 X 130 mm conteniendo 31 ml de Q-Sefphrose, Big Beads (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) preequilibradas con tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La proteína fue eluida usando gradientes de pH 7.0 (tampón fosfato sódico 20 mM) hasta S.0 (tampón acetato sódico 20 mM), de 5.0 a 3.5 (tampón acetato sódico 20 mM), y luego de 3.5 a 3.0 (tampón acetato sódico 20 mM). Las fracciones que se eluían entre pH 3.5 y 3.0 fueron recogidas, agrupadas, y concentradas hasta 20 ml por ultrafiltración con una membrana de PM 10 (Amicon, New Bedford, MA).
La solución concentrada fue diluida con 100 ml de tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0 y luego cargada en una columna de 20 x 100 mm conteniendo MonoQ Beads de Pharmacia (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) preequilibrada con tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La proteína fue eluida con un gradiente de NaCl de 0 a 0.4 M en tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. Las fracciones entre 0.330 y 0.343 M de NaCl fueron recogidas, agrupadas, y concentradas usando la ultrafiltración contra el tampón acetato sódico 20 mM pH 4.0 .
Se encontró que la preparación purificada contenía tres bandas mayores juzgado por el análisis de SDS-PAGE. La muestra consistía en componentes con pesos moleculares de aproximadamente 65, 50 y 33 kDa.
Ejemplo 2 Secuenciación de aminoácidos de aminopeptidasa II
Una alícuota de la preparación de aminopeptidasa II purificada descrita en el ejemplo 1 fue sometida a electroforesis y posteriormente transferida a una membrana de PVDF (Novex, San Diego, CA) usando 10 mM de CAPS (ácido 3-[ciclohexilamino]-1-propanosulfónico) pH 11 en metano al 10% durante 2 horas. La membrana de PVDF fue teñida con azul de Coommassie R-250 al 0.1% en metanol al 40%/ácido acético al 1% durante 20 segundos y desteñida en etanol al 50% para observar las bandas proteicas. Tres componentes a 65, 50, y 33 kDa fueron cortados y sometidos a secuenciación del amino terminal en un secuenciador de proteínas Modelo 476A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) usando un cartucho de transferencia y una liberación de TFA de fase líquida según las instrucciones del fabricante. Los tres componentes produjeron la misma secuencia amino terminal, RALVSPDEFPEDIQLEDLLEGSQQLEDFAY (aminoácidos 17-47 de SEC ID NO:2).
Una muestra de 300 \mul de la proteína fue secada en Savant Speed Vac AS 160 (Savant Instruments, Farmingdale, NY) y luego reconstruida con 300 \mul de ácido fórmico (acuoso) al 70%. Se añadieron algunos cristales de bromuro de cianógeno y se incubó a la temperatura ambiente a oscuras durante toda la noche. Se volvió a secar la muestra en el Speed Vac y se reconstruyó en un tampón de muestra de Tricina (Novex, San Diego, CA). Los fragmentos para la separación del bromuro de cianógeno fueron separados usando un 10- 20% de gel de Tricina SDS-poliacrilamida en bandas de 6, 10, 15, 22, 27, 40, y 50 kDa y transferidos a una membrana PVDF. Las bandas de 6, 10, 15, y 22 kDa fueron cortadas y sometidas a secuenciación amino terminal.
Las secuencias amino terminales de las bandas de 15 y 22 kDa fueron idénticas a la secuencia amino terminal anterior, mientras que se determinó que las secuencias de las bandas de 6 y 10 kDa contenían ambas la secuencia TYSPSVEVTADVAWKNLGTSEADYPDVEGKVAL (los aminoácidos 108-142 de la SEC ID NO:2).
Ejemplo 3 Aislamiento del ARN de la cepa 1568 de Aspergillus oryzae
La cepa 1568 de Aspergillus oryzae fue cultivada en un tanque de fermentación en un medio compuesto por 7.5 g de almidón de patata; 10 g de harina de soja; 2 g de KH_{2}PO_{4}, 5 g de Na_{2}HPO_{4} -2H_{2}O, y 0.1 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O por litro. Una muestra de dos litros fue tomada después de cinco días de crecimiento a 30ºC, y los micelios fueron recogidos, congelados en N_{2} líquido, y almacenados a -80ºC. El ARN total fue obtenido a partir de los micelios congelados, en polvo, de Aspergillus oryzae 1568 por extracción con tiocianato de guanidino seguido de ultracentrifugado a través de un "cojín" de cloruro cesio 5.7 M (Chirgwin et al.; 1979; Biochemistry 18: 5294-5299). ARN poli(A)+ fue aislado por cromatografía de afinidad de la oligo(dT)celulosa según Aviv y Leder (1972, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69: 1408- 1412).
Ejemplo 4 Construcción de una biblioteca de ADNc
El ADNc bicatenario fue sintetizado de 5 \mug de Aspergillus oryzae 1568 ARN poli(A)+ del ejemplo 3 usando el procedimiento descrito por Gubler y Hoffman (1983, Gene 25: 263-269) y Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York), a excepción de que un cebador de anclaje oligo(dT)-NotI, en vez de un cebador oligo(dT)12-18, fue usado en la primera reacción de la cadena. Después de la síntesis, el ADNc fue tratado con nucleasa de la judía de Mung (Life Technologies, Gaithersburg, MD), con extremos romos con T4 ADN polimerasa (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), y ligado con adaptadores BstXI no palindrómicos (Invitrogen, San Diego, CA), usando un exceso molar de los adaptadores de aproximadamente 50 veces. El ADNc adaptado fue digerido con NotI, fraccionado por tamaños para ADNcs de 1.2- 3.0 kb por electroforesis en gel de agarosa, y ligado en pYES2.0 (Invitrogen, San Diego, CA) seccionado con BstXI/NotI. La mezcla de ligadura fue transformada en células E. coli DH1OB electrocompetentes (Life Technologies, Gaithersburg, MD) según las instrucciones del fabricante. La biblioteca que consiste en 1 x 10^{6} de clones independientes fue almacenada como depósitos individuales (25,000-30,000 colonias formando unidades/agrupación) en glicerol al 20% a -80ºC, y como ADNc bicatenario y mezcla de ligadura a -20ºC.
Ejemplo 5 Extracción del ADN genómico
Aspergillus oryzae 1568 creció en 25 ml de medio de extracto de levadura al 0.5%- glucosa al 2% (YEG) durante 24 horas a 37ºC y 250 rpm. Los micelios fueron luego recogidos por filtración a través de Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) y lavados una vez con 25 ml de tampón 10 mM Tris- 1 mM EDTA (TE). El exceso del tampón fue drenado de la preparación de micelios que fue posteriormente congelada en nitrógeno líquido. La preparación de micelios congelados fue molida hasta obtener un polvo fino en un molinillo de café eléctrico, y el polvo fue añadido a un tubo centrifugador de plástico desechable que contenía 20 ml de tampón TE y 5 ml de dodecilsulfato de sodio al 20% p/v (SDS). La mezcla fue suavemente invertida varias veces para asegurar la mezcla, y extraída dos veces con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v). Se añadió acetato sódico (solución 3 M) a la muestra extraída hasta una concentración final de 0.3 M seguido de 2.5 volúmenes de etanol helado para precipitar el ADN. El tubo fue centrifugado a 15,000 x g durante 30 minutos para granular el ADN. Se dejó que el granulado de ADN se secara al aire durante 30 minutos antes de la resuspensión en 0.5 ml de tampón TE. La ribonucleasa A libre de ADNsa fue añadida al granulado resuspendido de ADN hasta una concentración de 100 \mug por ml y la mezcla fue luego incubada a 37ºC durante 30 minutos. Se añadió la proteinasa K (200 \mug/ml) y el tubo fue incubado durante una hora adicional a 37ºC. Finalmente, la muestra fue extraída dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y el ADN fue precipitado con etanol. El ADN precipitado fue lavado con etanol al 70%, secado al vacío, resuspendido en tampón TE , y almacenado a 4ºC.
Ejemplo 6 Amplificación por PCR de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568
En base a las secuencias de aminoácidos de los péptidos parciales de aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 descritas en el ejemplo 2, los cebadores oligonucleótidos degenerados mostrados más abajo fueron sintetizados con un sintetizador de ADN/ARN Modelo 394 de Applied Biosystems, según las instrucciones del fabricante, para amplificar por PCR los fragmentos del gen de la aminopeptidasa II a partir de ADN genómico de Aspergillus oryzae 1568.
Cebador directo: 5'-CCIGAYGARTTYCCIGARGA-3' (SEC ID NO:3)
Cebador inverso: 5'-RTTYTTIACIACIGCIACRTCIGCIGTIACYTCIAC-3' (SEC ID NO:4)
(R= A o G,Y= C o T, N= G o A o C o T, H= A o C o T, I= Inosina)
Se prepararon reacciones de amplificación (50 \mul) usando aproximadamente 1 \mug de ADN genómico de Aspergillus oryzae 1568, preparado como se describe en el Ejemplo 5, como el molde. Cada reacción contenía los componentes siguientes: 1 \mug de ADN genómico; 40 pmol de cebador directo; 40 pmol de cebador inverso; 200 \muM cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP; Tampón 1 x Taq polimerasa (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ), y 2.5 unidades de Taq polimerasa (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ). Las reacciones fueron incubadas en un variador térmico de Perkin-Elmer modelo 480 programado como sigue: Ciclo 1 a 94ºC durante 5 minutos; 50ºC durante 2 minutos, y 72ºC durante 2 minutos; y Ciclos 2-26 a 94ºC durante 2 minutos; 50ºC durante 1 minuto, y 72ºC durante 2 minutos. Los productos de la reacción fueron aislados en un gel de agarosa al 1.5% (Eastman Kodak, Rochester, NY) donde una banda de producto de 309 bp fue cortada del gel y purificada usando Qiaex II (Qiagen, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El producto purificado por PCR fue posteriormente clonado en un vector pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) y la secuencia de ADN fue determinada usando los cebadores lac directos e inversos (New England BioLabs, Beverly, MA).
El segmento del gen de la aminopeptidasa II (309 bp) que consta de 103 codones fue amplificado a partir de Aspergillus oryzae 1568 con los cebadores para PCR específicos para la aminopeptidasa II anteriormente descritos. El análisis de la secuencia de ADN mostró que el segmento del gen amplificado codificó una parte del gen de la correspondiente aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568. El segmento del gen de la aminopeptidasa II fue usado para sondar la biblioteca de ADNc de Aspergillus oryzae 1568 descrita en el Ejemplo 5.
Ejemplo 7 Identificación de clones de aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568
La biblioteca de ADNc de Aspergillus oryzae 1568 fue colocada en placas de Luria más 50 \mug/ml de carbenicilina agar. Las transferencias de colonias (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) fueron realizadas en aproximadamente 10,000 colonias y el ADN fue reticulado sobre membranas (Hybond N+, Amersham, Arlington Heights, IL) usando un UV Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA). Las membranas fueron puestas a remojo durante tres horas a 45ºC en una solución de hibridación que contenía 5 x SSPE; SDS al 0.3%; formamida al 50%, y 10 \mug/ml de ADN de esperma de arenque desnaturalizado y cortado. El fragmento del gen de la aminopeptidasa II aislado de Aspergillus oryzae 1568 como se describe en el ejemplo 6 fue radiomarcado usando el Random Primed DNA Labeling Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), desnaturalizado añadiendo NaOH a una concentración final de 0.1M, y añadido a la solución de hibridación a una actividad de aproximadamente 1 x 10^{6} cpm por ml de solución de hibridación. La mezcla fue incubada durante toda la noche a 45ºC en un baño maría con agitación. Después de la incubación, las membranas fueron lavadas tres veces en 2 X SSC con SDS al 0.2% a 55ºC. Las membranas fueron luego secadas en papel secante durante 15 minutos, envueltas en SaranWrap^{TM}, y expuestas a una película de rayos X durante 48 horas a -70ºC con filtros intensificadores (kodak, Rochester, NY).
Once colonias, produjeron fuertes señales de hibridación con la sonda. Las once colonias fueron inoculadas en cinco ml de LB más 50 \mug/ml de medio de carbenicilina y se dejaron durante toda la noche a 37ºC. Se obtuvo ADN miniprep a partir de cada uno de estos clones usando el kit de purificación de ADN Wizard 373 (Promega, Madison, WI). El clon 9 y el clon 10 contenían la secuencia de codificación de la aminopeptidasa II, como fue confirmado por secuenciación del ADN. El clon 9 (pEJG18) fue de longitud total. El plásmido pEJG18 fue subclonado en células DH5\alpha de E. coli para producir E. coli DH5\alpha EJG18.
Ejemplo 8 Análisis de la secuencia de ADN del gen de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568
La secuenciación del ADN del gen de la aminopeptidasa II contenido en pEJG18 en E. coli DH5\alpha EJG18 descrita en el ejemplo 7 fue realizada con un secuenciador de ADN automático Modelo 373A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) en ambas cadenas usando la técnica del paseo con el cebador con química del dye terminador (Giesecke et al., 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60). Los cebadores de secuenciación de oligonucleótidos fueron diseñados para secuencias complementarias en el gen de la aminopeptidasa II y fueron sintetizados en un sintentizador de ADN/ARN Modelo 394 de Applied Biosystems según las instrucciones del fabricante.
La secuencia de nucleótidos del gen que codificaba la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 y la secuencia de aminoácidos deducida de la misma está mostrada en la figura 1 (SEC ID NOS:1 y 2, respectivamente). El análisis de secuencias del inserto clonado revelaron un gran marco de lectura abierto de 1488 nucleótidos (excluyendo el codón de detención) que codificaba una proteína de una secuencia de 496 aminoácidos (SEC ID NO:2). El contenido G+C de este marco de lectura abierto es del 58%. En base a las reglas de van Heijne (van Heijne; 1984; Journal of Molecular Biology 173: 243- 251), los primeros 15 aminoácidos posiblemente comprenden un péptido señal secretor que dirige el polipéptido naciente en el retículo endoplásmico (subrayado doble en la figura 1).
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos parciales derivados de la aminopeptidasa II purificada como se describe en el ejemplo 2 están subrayadas en la Figura 1 y fueron constantes con aquellos encontrados en la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:2) del ADNc de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568.
Usando el programa de alineamiento de Clustal (Higgins; 1989; supra) para comparar la secuencia de aminoácidos deducida de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 con aquella de la aminopeptidasa II Y (SEC ID NO:5) de Saccharmyces cerevisiae, se observó una identidad del 33.7%.
Ejemplo 9 Construcción de un vector de expresión de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 para un huésped de Aspergillus
Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR la secuencia de codificación del gen de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae A1568 a partir del plásmido pEJG18 E. coli DH5\alpha-EJG18) para la subclonacion y expresión en un huésped de Aspergillus.
Cebador directo: 5'-ATGATGAGGTCGCTTTTGTGGGC-3' (SEC ID NO:6)
Cebador inverso: 5'-GGGATGCATCTATGCCTCGACTT-3' (SEC ID NO:7)
Las letras en negrita representan la secuencia de codificación.
Para facilitar la subclonación del fragmento del gen en un vector de expresión designado pMWR3 (figura 2), un sitio de restricción enzimático NsiI fue introducido en el extremo 3' del gen de la aminopeptidasa II. El extremo 5' fue convertido en romo con una adición de ATG para la inserción en el sitio SwaI. El vector pMWR3 contenía el promotor y terminador TAKA como secuencias reguladoras. Puesto que el plásmido no contiene un marcador seleccionable para transformaciones fúngicas, fue cotransformado con pToC90 (WO 91/17243) conteniendo amdS como marcador seleccionable.
Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción PCR (50 \mul) conteniendo 70 ng de pEJG18 (un clon de ADNc de Aspergillus oryzae 1568 en pYES2); tampón 1X Pwo (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN); 8 \mul de una mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, y 2.5 unidades de PwoI (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 9 ciclos a 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minutos; 15 ciclos a 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto, con una extensión de 20 segundos por ciclo; y un ciclo final de 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 7 minutos. El bloque de calor luego fue hasta un ciclo de agitación de 4ºC. El fragmento de ADN amplificado de 1500 bp fue purificado por electroforesis en gel y Qiaex II. El clon de la aminopeptidasa fue digerido con NsiI (usando las condiciones especificadas por el fabricante). El fragmento fue extraído con fenolcloroformo y precipitado con etanol. El fragmento cortado fue clonado en pMWR3 que había sido previamente cortado con SwaI y NsiI dando como resultado el plásmido de expresión pEJG19 (figura 3) en el que la transcripción del gen de la aminopeptidasa II estaba bajo el control del promotor TAKA. El plásmido pEJG19 fue transformado en células DH5\alpha de E. coli (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Un transformante de E. coli conteniendo el plásmido pEJG19 fue aislado y el ADN del plásmido fue preparado según los procedimientos descritos por Sambrook et al.; 1989; supra.
Ejemplo 10 Expresión del gen de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 en Aspergillus oryzae
El plásmido pEJG19 fue introducido en un huésped JaL142-6 de Aspergillus oryzae carente de proteasa alcalina usando los siguientes métodos de transformación del protoplasto. La transformación fue realizada con protoplastos a una concentración de aprox. 2x10^{7} protoplastos por ml. Cien \mul de protoplastos fueron colocados en hielo con aprox. 5 \mug de pEJG19 y 5 \mug de pTOC90, 250 \mul de PEG 4000 al 60%, 10 mM tris-HCl, pH 7.5, CaCl_{2} 10 mM fueron añadidos, y los protoplastos fueron incubados a 37ºC durante 30 minutos. Tres mls de STC (sorbitol 1.2 M; tris-HCl 10 mM, pH 7.5; y CaCl_{2} 10 mM) fueron añadidos. La solución fue mezclada suavemente y vertida en placas de transformación COVE (por litro: 0.52 g de KC1, 0.52 g de MgSO_{4}-7H_{2}O; 1.52 g de KH_{2}PO_{4}, 1 ml de metales traza descritos más abajo; 342.3 g de sacarosa; 25 g de agar Noble; 10 ml de acetamida 1 M; 10 ml de CsCl_{3} 3M). La solución de metales traza (1000X) estaba compuesta de 22 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O; 11 g de H_{3}BO_{3}, 5 g de MnCl_{2}-4H_{2}O; 5 g de FeSO_{4}-7H_{2}O; 1.6 g de CoCl_{2}-5H_{2}O; 1.6 g de (NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}, y 50 g de Na_{4}EDTA por litro. Las placas fueron incubadas durante 7 días a 37ºC. Los transformantes fueron transferidos a placas del mismo medio e incubados durante 2 días a 37ºC. 140 transformantes fueron totalmente recuperados por su capacidad para crecer en el medio COVE usando acetamida como fuente de nitrógeno única.
Los transformantes crecieron durante 4 días a 34ºC, 200 rpm en placas de 24 pocillos que contenían 1 ml por pocillo de medio MY50 al 25% diluido con sales MY50 al 75%. MY50 estaba compuesto por litro de 50 g de maltodextrina; 2.0 g de MgSO_{4}-7H_{2}O; 10 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de ácido cítrico; 10 g de extracto de levadura; 2.0 g de urea; 2 g de K_{2}SO_{4} y 0.5 ml de solución de elementos traza ajustada a pH 6.0. La solución de metales traza estaba compuesta por litro de 14.3 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O; 2.5g de CuSO_{4}-5H_{2}O; 0.5 g de NiCl_{2}-6H_{2} 0; 13.8 g de FeSO_{4}-7H_{2}O; 8.5 g de MnSO_{4}-H_{2}O; 3 g de ácido cítrico. Las sales de MY50 estaban compuestas por litro de 2.0 g de MgSO_{4}-7H_{2}O; 10 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de ácido cítrico, y 2 g de K_{2}SO_{4}, pH 6.0.
Cada uno de los 140 pocillos fueron evaluados por su actividad aminopeptidasa II usando Leu-pNA (sal de hidrocloruro) como sustrato. En una placa de microtitulación de 96 pocillos, 4 \mul de sobrenadante fueron añadidos a 100 \mul de 1 mg/ml de Leu-pNA en un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5. Se vigiló la absorbencia a 405 nm.
Cuatro transformantes, 20, 88, 90, y 137; con el nivel más alto de actividad aminopeptidasa II fueron luego dejjados crecer en frascos de agitación de 125 ml durante 4 días a 34ºC conteniendo 25 ml de medio MY50.
Las muestras fueron evaluadas en los días 2, 3, y 4 por su actividad aminopeptidasa II mezclando 100 \mul de sobrenadante diluido 10 veces con 100 pl de 2 mg/ml Leu-pNA en un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5. Los transformantes 20, 90, y 137 fueron los mayores productores. Para la purificación de la aminopeptidasa II, los transformantes 20 y/o 90 se dejaron crecer en frascos de agitación como antes o en un medio de fermentación compuesto por fuentes de nitrógeno y carbono adecuadas.
Ejemplo 11 Purificación de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae@ 1568 recombinante producida en Aspergillus
Los sobrenadantes combinados de los caldos del frasco de agitación descritos en el ejemplo 10 fueron combinados (aproximadamente 100 mg de proteína en aproximadamente 100 ml) y fueron diluidos hasta 3.7 mS y ajustados a pH 7.0. La muestra diluida fue luego cargada en Q-Sepharose, Big Beads, preequilibrada con un tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La aminopeptidasa II fue eluida con un gradiente de NaCl 0-0.4 M en un tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0 seguido de un lavado con 0.4 M de NaCl. Las fracciones fueron evaluadas por su actividad aminopeptidasa II mezclando 100 pl de cada fracción con 100 \mul de 2 mg de Leu-pNA por ml de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5. Los resultados del ensayo indicaron que la aminoepeptidasa II fue eluida al final del gradiente y durante el lavado con NaCl 0.4 M. El análisis por SDS-PAGE reveló que la enzima era homogénea.
Ejemplo 12 Construcción de un vector de expresión de aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 para un huésped de Fusarium
Dos cebadores oligonucleótidos sintéticos mostrados más abajo fueron diseñados para amplificar por PCR la secuencia de codificación del gen de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae A1568 del plásmido pEJG18 (E. coli DH5\alpha-EJG18) para la subclonación y expresión en un huésped de Fusarium.
Cebador directo: 5'-ATTTAAATcaccATGAGGTCGCTTTTGTGGGC-3' (SEC ID NO:8)
Cebador inverso: 5'-GGGTTAATTAACTATGCCTCGACTTGAGAATG-3' (SEC ID NO:9)
Las letras en negrita representan la secuencia de codificación. Las minúsculas representan una secuencia de consenso de Kozak para realzar la expresión. (Kozak, 1981, Nucleic Acids Research 12. 857-872)
Para facilitar la subclonación del fragmento del gen en un vector de expresión designado pDM181 (Figura 4), los sitios de restricción enzimáticos SwaI y PacI fueron introducidos en el extremo 5' y 3' del gen de la aminopeptidasa II, respectivamente. El vector pDM181 contenía el promotor y terminador de la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (SP387) (WO 96/00787) como secuencias reguladoras. El plásmido también contenía el gen bar como un marcador seleccionable para transformaciones fúngicas (de Block et al., 1987, EMBO Journal 6:2513-2518).
Cincuenta picomoles de cada uno de los cebadores anteriores fueron usados en una reacción PCR que contenía 70 ng de pEJG18, tampón 1XPwo; 5 \mul de mezcla 10 mM de dATP, dTTP, dGTP, y dCTP, y 2.5 unidades de PwoI. Las condiciones de amplificación fueron un ciclo a 94ºC durante 2 minutos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 9 ciclos cada uno a 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto; 15 ciclos cada uno a 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 1 minuto, con una extensión de 20 segundos por ciclo; y un ciclo final a 94ºC durante 15 segundos; 55ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 7 minutos. El bloque de calor fue luego mantenido en un ciclo de remojo a 4ºC. El fragmento de ADN amplificado de 1500 bp fue purificado por electroforesis en gel y Qiaex II, y luego fue subclonado en el vector de clonación pCRII TOPO TA (Stratagene, San Diego, CA). El clon de la aminopeptidasa pCRII fue cortado con las endonucleasas de restricción SwaI y PacI (usando las condiciones indicadas por el fabricante). El fragmento fue purificado por electroforesis en gel y Qiaex II. El fragmento cortado fue clonado en pDM181 que había sido previamente cortado con SwaI y PacI dando como resultado el plásmido de expresión pEJG28 (Figura 5) en el que la transcripción del gen de la aminopeptidasa II estuvo bajo el control del promotor de la proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum. El plásmido pEJG28 fue transformado en células ABLE K de E. coli (Stratagene, San Diego, CA). El transformante de E. coli que contenía el plásmido pEJG28 fue aislado y el ADN plásmido fue preparado según los procedimientos descritos por Sambrook et al.; 1989; supra.
Ejemplo 13 Transformación de Fusarium CC1-3 y análisis de los transformantes
La cepa CC1-3 de Fusarium; un mutante morfológico muy ramificado de la cepa A3/5 de Fusarium (ATCC 20334) (Wiebe et al., 1992, Mycological Research 96: 555-562; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 95: 1284-1288; Wiebe et al., 1991, Mycological Research 96: 555-562), creció en un medio líquido que contenía Sales de Vogel, (Vogel; 1964; Am. Nature 98: 435- 446); NaNO_{3} 25 mM, y glucosa al 1.5% durante 4 días a 28ºC y 150 rpm. Las conidias fueron purificadas por filtración a través de 4 capas de telas de gasa y finalmente a través de una capa de Miracloth. Las suspensiones conidiales fueron concentradas por centrifugado. Cincuenta ml de medio YPG compuesto por extracto de levadura al 1%; bactopeptona al 2%, y glucosa al 2% fueron inoculados con aproximadamente 108 conidias, e incubados durante 14 horas a 24ºC y 150 rpm. Las hifas resultantes fueron retenidas en un filtro estéril de 0.4 mm y lavadas sucesivamente con agua destilada estéril y MgSO_{4} 1.0 M. Las hifas fueron resuspendidas en 10 ml de solución de NOVOZYM 234^{TM} (2-10 mg/ml en 1.0 m MgSO_{4}) y digeridas durante 15-30 minutos a 34ºC con agitación a 80 rpm. NOVOZYM 234^{TM} se obtuvo de Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dinamarca. El material hifal no digerido fue eliminado de la suspensión del protoplasto resultante por filtración sucesiva a través de 4 capas de tela de gasa y a través de Miracloth. Veinte ml de sorbitol 1 M fueron combinados con la solución de protoplastos. Después de la mezcla, los protoplastos fueron granulados por centrifugado y lavados sucesivamente por resuspensión y centrifugado en 20 ml de sorbitol 1 M y en 20 ml de STC (sorbitol 0.8 M; Tris 0.05 M pH 8.0, CaCl_{2} 0.05 M). Los protoplastos lavados fueron resuspendidos en 4 partes de STC y 1 parte de SPTC (sorbitol 0.8 M; PEG 4000 al 40%, Tris 0.05 M pH 8.0, CaCl_{2} 0.05 M) a una concentración de 5 x 10^{7}/ml.
Cien ml de suspensión de protoplastos fueron añadidos a 10 \mug de pEJG28 en tubos de polipropileno (17 x 100 mm), mezclados e incubados en hielo durante 30 minutos. Un ml de SPTC fue mezclado suavemente en la suspensión del protoplasto y la incubación fue continuada a la temperatura ambiente durante 20 minutos. 12.5 ml de solución fundida (enfriada a 40ºC) que consistía en 1X sales de Vogel; NaNO_{3}25 mM, sacarosa 0.8 M y agarosa de baja fusión al 1% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) fueron mezclados con los protoplastos y luego colocados en una placa Petri de 100 mm vacía. La incubación fue continuada a temperatura ambiente durante 10 a 14 días. Tras la incubación a la temperatura ambiente durante 24 horas; 12.5 ml del medio idéntico más 10 mg de BASTA^{TM} (Hoechst Schering, Rodovre, Dinamarca) por ml fueron recubiertos sobre la placa petri. BASTA^{TM} fue extraído dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), y una vez con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) antes del uso.
Después de dos semanas; 2 transformantes designados #1 y #2 aparecieron. Un fragmento micelial del borde de cada transformante fue transferido a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contenía un medio de Vogel /
BASTA^{TM}. El medio contenía 25 g de sacarosa; 25 g de agar Noble; 20 ml de 50X Sales de Vogel (Vogel; 1964; supra); NaNO_{3}25 mM, y 10 g de BASTA^{TM} por litro. La placa fue sellada en una bolsa de plástico para mantener la humedad y se incubó durante aproximadamente una semana a la temperatura ambiente.
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Ejemplo 14 Expresión del gen de la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 en Fusarium
Un fragmento micelial de cada uno de los 2 transformantes CCI-3 de Fusarium descritos en el ejemplo 13 fue inoculado en 20 ml de medio M400Da compuesto por 50 g de maltodextrina; 2.0 g de MgSO_{4}-7H_{2}O; 2.0 g de KH_{2}PO_{4}, 4.0 g de ácido cítrico; 8.0 g de extracto de levadura; 2.0 g de urea, y 0.5 ml de solución de metales traza por litro e incubado durante 7 días a 30ºC y 150 rpm. El medio fue ajustado a pH 6.0 con 5 N de NaOH. La solución de metales traza contenía 14.3 g de ZnSO_{4}-7H_{2}O; 2.5 g de CuSO-5H_{2}O; 0.5 g de NiCl_{2}-6H_{2}O; 13.8 g de FeSO_{4}-7H_{2}O; 8.5 g de MnSO_{4}-H_{2}O, y 3.0 g de ácido cítrico por litro. El huésped no transformado fue también realizado como un control. Un ml de sobrenadante de cultivo fue cosechado a los 7 días, almacenado y evaluado. La actividad aminopeptidasa II fue determinada mezclando 10 \mul de sobrenadante con 200 \mul de una solución madre del sustrato conteniendo 2 mg de Leu-para-nitroanilida por ml de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 y vigilando el cambio de absorbencia a 405 nm en 4 minutos. Ambos transformantes presentaron actividad hacia Leu-pNA mayor que el control no transformado.
El transformante #2 primario de Fusarium descrito en el Ejemplo 13 fue cultivado en frascos de agitación de 125 ml durante 5 días a 30ºC en 25 ml de medio M400Da. El caldo de cultivo entero fue filtrado usando una capa doble de Miracloth. El filtrado fue recuperado y luego congelado a -20ºC.
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Ejemplo 15 Purificación de aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568 recombinante producida por Fusarium
Un volumen de 20 ml de un caldo de Fusarium de 5 días descrito en el Ejemplo 14 fue filtrado a través de un filtro de jeringa de 0.45 micras. La muestra fue luego diluida 8 veces en un tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La conductividad y el pH de la muestra fue 3.1 mS y 7.10, respectivamente. La muestra fue cargada en una columna XK-26 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) que contenía 60 ml de Q-Sepharose, Big Beads, que había sido preequilibrada con el tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La columna fue lavada hasta alcanzar una línea base y luego la muestra fue eluida con un gradiente lineal de NaCl 0-0.5 M en el tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0 en 8.3 volúmenes de la columna y a un nivel de flujo de 5 ml/min. Las fracciones fueron evaluadas usando Leu-pNA como sustrato mezclando 10 pi de cada fracción con 90 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 y 100 \mul de una solución madre del sustrato que contenía 2 mg de Leu-pNA por ml de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 y vigilando el cambio de absorbencia a 405 nm en 4 minutos. Todas las fracciones activas en Leu-pNA fueron luego agrupadas, diluidas y concentradas usando una unidad de ultrafiltración Amicon utilizando una membrana PM 10.
La muestra concentrada fue luego cargada en una columna Mono Q 16/10 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) que había sido preequilibrada con el tampón fosfato sódico 20 mM pH 7.0. La columna fue luego lavada con NaCl 0.15 M. Un gradiente fue realizado a partir de 0.15-0.5 M de NaCl sobre 10 volúmenes de la columna a un nivel de flujo de 2 ml/min. Las fracciones activas fueron luego equilibradas en (NH_{4})_{2}SO_{4} 1.7 M en un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.0.
La muestra fue luego cargada en una columna Phenyl Superose 5/5 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala,, Suecia) que había sido preequilibrada con de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1.7 M en el tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.0. La columna fue lavada con de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1.7 M en tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.0 hasta que la línea base fue conseguida. La enzima fue eluida con un gradiente de 1.7 M a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} sobre 30 volúmenes de la columna a un nivel de flujo de 0.5 ml/min. El flujo tuvo actividad en Leu-pNA, como lo hicieron las fracciones que fueron eluidas. La enzima apareció como una serie de formas diferencialmente glicosiladas basadas en el análisis de SDS-PAGE. Cuando las distintas formas de la enzima fueron tratadas con Endoglicosidasa F/N glicosidasa F (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), según el protocolo sugerido por el fabricante, una única banda con un peso molecular de -58 kDa apareció en todas las muestras analizadas. Las formas diferencialmente glicosiladas fueron luego, agrupadas y desaladas usando un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5, y sometidas a caracterización bioquímica.
Ejemplo 16 Caracterización de aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae@ 1568 recombinante
La aminopeptidasa II purificada descrita en el Ejemplo 11 fue usada en la caracterización siguiente.
Los parámetros cinéticos de la aminopeptidasa II fueron determinados para varias p-nitroanilidas (pNA) incluyendo Leu-pNA, Gly-pNA, Ala-pNA, y pro-pNA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, o Bachem, Torrance, CA). Se diluyeron soluciones madres de 100 mg de cada p-nitroanilida por ml de dimetilsulfóxido con el tampón fosfato potásico 50 mM pH 7.0 hasta concentraciones que variaban de 0.0064 a 9.56 mM. Debe ser destacado que la solubilidad de los sustratos no es siempre suficiente para tener concentraciones comparables a K_{m}, pudiendo dar errores que podrían ser superiores a los previstos normalmente. La reacción de la aminopeptidasa II con la p-nitroanilida fue iniciada cuando una alícuota de 100 \mul de la solución enzimática en 50 mM de fosfato potásico pH 7.0 fue añadida a 100 \mul de una solución del sustrato en un pocillo de una placa de microtitulación y vigilada a 405 nm y 25ºC usando un lector de microplacas THERMOmax (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA). Los análisis de los índices iniciales de hidrólisis de las p-nitroanilidas produjeron los resultados mostrados en la tabla 1:
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TABLA 1 Parámetros cinéticos de la aminopeptidasa II a pH 7.0 y 25ºC
100
Los resultados mostraron que la aminopeptidasa II posee una especificidad hacia el sustrato cuando la especificidad hacia Ala es mucho peor que hacia Gly.
La inhibición de la aminopeptidasa II con 1,10-fenantrolina fue evaluada usando Leu-pNA como sustrato a pH 7.5 en un tampón Tris 50 mM pH 7.5 donde la hidrólisis fue vigilada a 405 nm. Una solución de 200 mM de 1,10- fenantrolina en metanol fue preparada. La reacción de la inhibición fue realizada mezclando 100 \mul de 2 mg de Leu-pNA por ml de 50 mM de solución de fosfato sódico pH 7.5 y 10 \mul de la solución de 1,10-fenantrolina con 100 \mul de aminopeptidasa II diluida 5 veces en un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5. Un control fue realizado en el que se utilizó 10 \mul de tampón Tris 20 mM pH 7.6 en lugar de la solución de 1,10-fenantrolina.
Los resultados indicaron que 1,10-fenantrolina inhibió la aminopeptidasa II sugeriendo que la aminopeptidasa II es una metaloproteasa. El índice de hidrólisis de Leu-pNA disminuyó de 285 mOD/minuto a 21 mOD/minuto en presencia de 1,10-fenantrolina.
La aminopeptidasa II purificada descrita en el Ejemplo 15 fue usada en las caracterizaciones siguientes.
El pH óptimo fue determinado usando Ala-pNA como sustrato en el tampón universal compuesto por ácido cítrico 0.125 M; fosfato sódico monobásico 0.125 M, y ácido bórico 0.125 M, el pH fue ajustado a 4.5-11 con 10 N de NaOH, en incrementos de pH de 0.5. El sustrato Ala-pNA fue preparado disolviendo 100 mg de Ala-pNA en 1 ml de DMSO y añadiendo 20 \mul de la solución Ala-pNA/DMSO a 980 \mul del tampón universal en los distintos valores de pH. El ensayo fue iniciado añadiendo una alícuota de 15 \mul de la aminopeptidasa II en el tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 a 200 \mul de 2 mg/ml Ala-pNA en los distintos valores de pH a temperatura ambiente. El cambio en la absorbencia a 405 nm fue vigilado durante 5 minutos. La autohidrólisis del sustrato como un control fue determinada añadiendo 15 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 a 200 \mul de 2 mg/ml de Ala-pNA en los distintos valores de pH.
Los resultados mostrados en la Tabla 2 a continuación demostraron que la aminopeptidasa II tenía actividad con Ala-pNA como sustrato en el rango de pH medido de 4.91 a 10.91 con actividad óptima a pH \sim9.5-10. Ninguna autohidrólisis del sustrato fue observada a valores de pH de 11 o inferiores.
TABLA 2
101 
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La estabilidad de la temperatura de la aminopeptidasa II fue determinada usando el protocolo siguiente: 480 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 fueron preincubados a 37º, 45º, 55º, 60º, 65º, 70º, y 75ºC durante 30 minutos en un tubo de Eppendorf de 1.7 ml. Luego 20 \mul de aminopeptidasa II purificada fue añadida y la muestra fue luego incubada durante 20 minutos adicionales. Las muestras fueron luego colocadas en hielo. Una vez completadas las incubaciones para todas las temperaturas, las muestras fueron luego evaluadas por su actividad usando Leu-pNA como sustrato.
El ensayo fue realizado mezclando 100 \mul de las mezclas de incubación para las distintas temperaturas con 100 \mul de 2 mg/ml de Leu-pNA en el tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 a la temperatura ambiente. La absorbencia a 405 nm fue vigilada durante 5 minutos.
Los resultados mostrados en la Tabla 3 demostraron que la aminopeptidasa II retuvo el 90% de su actividad después de una incubación de 20 minutos a 60ºC, pH 7.5.
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TABLA 3
103
Los parámetros cinéticos para varios sustratos de la aminopeptidasa II fueron determinados usando el protocolo siguiente. Aminopeptidasa II purificada con un A_{280} de 0.581 fue empleada. Cada sustrato fue disuelto en DMSO a una concentración de 100 mg/ml y luego diluido 50 veces en un tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5 a 2 mg/ml. Los sustratos incluyeron Leu- pNA, Glu-pNA (Bachem, Torrance, CA), y Ala-pNA. En una placa de microtitulación de 96 pocillos, 10 \mul de aminopeptidasa II purificada fueron incubados con cada sustrato como sigue excepto 50 \mul de aminopeptidasa II purificada que fueron incubados con Glu-pNA, y la absorbencia a 405 nm fue medida durante 4 minutos:
1. 200 \mul de 2 mg/ml de sustrato + 0 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5
2. 100 \mul de 2 mg/ml de sustrato + 100 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5
3. 50 \mul de 2 mg/ml de sustrato + 150 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5
4. 25 \mul de 2 mg/ml de sustrato + 175 \mul de tampón fosfato sódico 50 mM pH 7.5
Un gráfico de Lineweaver-Burke fue construido para determinar el K_{m} y el K_{cat} para cada sustrato, usando un peso molecular promedio de 97 kDa para las formas diferencialmente glicosiladas.
Para Leu-pNA, se determinó que K_{m} y K_{cat} eran 5.78 mM y 230.9 min^{-1}, respectivamente.
Para Glu-pNA, se determinó que K_{m} y K_{cat} eran 1.17 mM y 8.217 min^{-1}, respectivamente.
Para Ala-pNA, se determinó que K_{m} y K_{cat} eran 1.49 mM y 34.638 min^{-1}, respectivamente.
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Ejemplo 17 Preparación de hidrolizados de proteínas con la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae 1568
La aminopeptidasa II purificada descrita en el ejemplo 11 fue evaluada en grados de ensayos de hidrólisis usando soja, gluten de trigo, y caseína como sustratos según el procedimiento siguiente.
El grado de ensayos de hidrólisis (DH) fue realizado a 50ºC durante 18 horas como una mini-hidrólisis en una escala de 10 ml usando comprimidos de harina de soja, comprimidos de alimento de gluten de trigo, y caseinato de sodio a una concentración del 2% ajustada a pH 7, si es necesario, sin ajuste del pH durante la hidrólisis. Los hidrolizados fueron inactivados a 85ºC durante 3 minutos en un baño maría. Las enzimas usadas fueron FLAVOURZYME^{TM} y aminopeptidasa II. Las enzimas fueron dosificadas como sigue. Para la soja, 2 LAPUs y 5 LAPUs de aminopeptidasa II (recombinante) fueron añadidas en comparación con 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM}. Para el gluten, 2 LAPUs y 5 LAPUs de aminopeptidasa II (recombinante) fueron añadidas en comparación con 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM}. Para la caseína, 1 y 2 LAPUs de aminopeptidasa II (recombinante) fueron añadidas en comparación con 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM}. Una LAPU (unidad de leucina amino peptidasa) es la cantidad de enzima que descompone 1 micromol de L-leucina-P-nitroanilida por minuto según las condiciones siguientes: 26 mM L-leucina-p-nitroanilida en tampón Tris 0.1 M pH 8.0 a 40ºC durante 10 minutos. Después de la hidrólisis, p-nitroanilida es liberada volviendo amarilla la solución que es vigilada a 405 nm.
El grado de hidrólisis (DH), tal y como se define como se describe por Adler-Nissen (986, Enzymic Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers), fue determinado por reacción del sobrenadante con OPA (orto-ftaldialdehído, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) según el procedimiento siguiente El hidrolizado fue diluido 100 veces en agua destilada. Luego 120 \mul fueron transferidos a 900 \mul de reactivo OPA. Para el reactivo OPA; 160 mg de OPA fue disuelto en 4 ml de etanol y transferido a un matraz volumétrico de 200 ml conteniendo una solución de 7.62 g de tetraborato decahidrato de disodio; 200 mg de dodecilsulfato de sodio, y 176 mg de ditiotreitol y el matraz fue rellenado hasta 200 ml con agua. La solución fue luego bien agitada y después de 2 minutos exactamente, se midió la absorbencia a 340 nm y se comparó con la absorbencia de una solución de L- serina 0.95 mM (agua destilada) después de la sustracción del valor en blanco (agua reaccionado con reactivo OPA). Para determinar el DH real, los equivalentes de serina medidos en los hidrolizados fueron corregidos con los factores sugeridos por Adler-Nissen para el método del ácido trinitrobencenosulfónico (Adler-Nissen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 17: 1256) que dio la misma respuesta que el método de OPA descrito. El DH fue calculado en base a la cantidad total de proteína en la mezcla de la hidrólisis (no en base a la proteína soluble).
Un volumen de 25 \mul de sobrenadante diluido de manera adecuada fue mezclado con 200 \mul de reactivo OPA en un pocillo de una placa de microtitulación y se dejó reaccionar durante exactamente 2 minutos a 25ºC. La absorbencia a 340 nm fue medida en un lector de placas de microtitulación y en comparación con la absorbencia de una solución normal 95 mM de L-serina después de la sustracción del valor del blanco (agua reaccionado con reactivo OPA). Para determinar el DH real, los equivalentes de serina medidos en los sobrenadantes fueron corregidos con los factores sugeridos por Adler-Nissen para el método del ácido trinitrobencenosulfónico (Adler-Nissen, 1979, Agricultural and Food Chemistry 17: 1256) dando la misma respuesta que el método de OPA descrito. El grado de hidrólisis fue calculado en base a la cantidad total de proteína en la mezcla de la hidrólisis (no en base a la proteína soluble).
Para la soja, la adición de 2 LAPUs y 5 LAPUs de aminopeptidasa II a 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM} aumentó el DH absoluto al menos al 8% y 10%, respectivamente, sobre las muestras con 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM} solo.
Para el gluten, la adición de 2 LAPUs y 5 LAPUs de aminopeptidasa II a 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM} aumentó el DH absoluto 6% y 9%, respectivamente.
Para la gelatina, la adición de 2 LAPUs y 5 LAPUs del dipéptido aminopeptidasa II a 3 LAPUs de FLAVOURZY-
ME^{TM} aumentó el DH absoluto 4.9% y 5.3% respectivamente.
Para la caseína, la adición de 1 y 2 LAPUs de aminopeptidasa II a 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM} aumentó el DH absoluto 7% y 9%, respectivamente, tras la adición de 3 LAPUs de FLAVOURZYME^{TM} solo.
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Ejemplo 18 Hidrólisis de la proteína de soja con la aminopeptidasa II de Aspergillus oryzae
La proteína de soja fue hidrolizada en una escala de 10 ml (mini- hidrólisis) con un pH inicial de 7.0 y una concentración proteica del 2%. El tiempo y temperatura de la hidrólisis fueron 18 horas y 50ºC, respectivamente. Las enzimas fueron inactivadas a 85ºC durante 5 minutos y los hidrolizados fueron centrifugados. Los sobrenadantes fueron analizados por su DH usando el método de OPA. El DH, tal y como se define como se describe por Adler-Nissen (1986, Enzymic Hydrolysis of Food Proteins, Elsevier Applied Science Publishers), fue determinado por reacción del sobrenadante con OPA (orto-ftaldialdehído, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Para el reactivo OPA; 160 mg de OPA fueron disueltos en 4 ml de etanol y transferidos a un matraz volumétrico de 200 ml conteniendo una solución de 7.62 g de tetraborato decahidrato de disodio; 200 mg de dodecilsulfato de sodio, y 176 mg de ditiotreitol y el matraz fue llenado hasta 200 ml con agua. Las muestras seleccionadas fueron analizadas por su contenido en aminoácidos libres usando el método PicoTag HPLC (Waters Associates, Milford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Las dosificaciones de enzimas para cada matraz de hidrólisis conteniendo 200 mg de proteína de soja están mostradas en la tabla 4 más abajo. La aminopeptidasa II fue producida de forma recombinante en Aspergillus oryzae como se describe en el Ejemplo 10 y purificada en consecuencia. La solución de aminopeptidasa II tuvo un A_{280} de 8.1 y un contenido proteico estimado de 5 mg/ml a partir de la determinación del aminoácido.
Los resultados del análisis de DH están presentados en la Tabla 4. El DH fue calculado a partir de la concentración proteica del 2% - no del contenido proteico soluble.
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TABLA 4 Resultados de DH para los hidrolizados
1
2
La Tabla 5 muestra el % del aumento relativo en los aminoácidos individuales tras la adición de una dosificación de aminopeptidasa II máxima (0.5 g/kg proteína de soja) a una dosificación de fondo de FLAVOURZYME^{TM}
TABLA 5 % de aumento relativo en aminoácidos libres debido a la adición de aminopeptidasa II
104
Los resultados mostraron que cuando la aminopeptidasa II fue añadida a una dosificación baja de FLAVOURZY-
ME^{TM} (1.5%), Gly mostró el aumento relativo máximo seguido de Ser, Asp, Asn, pro, Cys, y Ala. Cuando la aminopeptidasa II fue añadida a una dosificación de FLAVOURZYME^{TM} elevada (6%), Pro mostró el aumento relativo máximo seguido de Asp, Glu, Cys, Gly, y Gln.
Ejemplo 19 Solubilidad proteica y liberación de glutamato aumentadas por desamidación
Gluten de trigo (WG) se obtuvo a partir de Cargill (JOB 5141) y gluten de trigo desamidado (DWG) se obtuvo por StaPro Consultancy B.V., Lemdijk 32, 9422 TH Smilde, NL. Suspensiones del 8% de proteína fueron hechas mezclando 11 g de gluten con 89 g de agua. El pH fue ajustado a 6.5 con NaOH. La proteasa específica de glutamato/aspartato (SP446), obtenible como se describe en WO 91/13554, o la proteasa específica de lisina/arginina (SP387) obtenible como se describe en WO 89/06270, fue añadida a las suspensiones. La dosificación fue 0.01 AU/g de proteína para SP446 y 0.006 AU/g de proteína para SP387. FLAVOURZYME^{TM} (una preparación de proteasa que actúa de manera no específica disponible por Novo Nordisk NS, Bagsvrd, Dinamarca, que contiene actividades endo- y exo-peptidasas, y que se obtiene por fermentación de Aspergillus oryzae) fue añadida a alguno de los hidrolizados a una dosificación de 20 LAPU/g de proteína.
Los hidrolizados fueron realizados a 50ºC sin ajuste del pH adicional durante 18 horas. Las enzimas fueron inactivadas calentando a 85ºC durante 15 minutos. El pH fue ajustado a 5 y los hidrolizados fueron centrifugados. Se determinó el contenido de proteína y glutamato libre en el sobrenadante.
El contenido proteico fue determinado por el análisis de Kjeldahl, usando un factor Kjeldahl de 6.25.
El contenido de glutamato libre fue determinado usando un equipo de determinación del glutamato según las instrucciones del fabricante (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN). El método fue adaptado para el uso en placas de microtitulación.
Al comparar el gluten de trigo (WG) al glutén de trigo desamidado (DWG), los resultados mostrados en la Tabla 6 demostraron que la desamidación aumentó la susceptibilidad del gluten a las proteasas específicas, de manera que se volvió soluble mayor cantidad de proteína. Mediante la adición de FLAVOURZYME^{TM} con una proteasa específica, la liberación de glutamato fue doblada debido a la desamidación.
TABLA 6
106
Ejemplo 20 Desamidación enzimática y liberación de glutamato
La peptidoglutaminasa II fue producida haciendo crecer la cepa ATCC 21590 de Bacillus en frascos de agitación (400 ml) conteniendo 200 ml de un medio compuesto por polipeptona al 1%; lactosa al 0.5%; MgSO_{4}-7H_{2}O al 0.025%; de FeSO_{4}-7H_{2}O al 0.005%; KH_{2}PO_{4} al 0.025%, y Na_{2}HPO_{4}-12H_{2}O al 17% (pH ajustado a 7.2), a 30ºC durante 20 horas mezclando a 270 rpm. Las células fueron cosechadas por centrifugado a 4000 rpm en matraces de 1 litro. Las células fueron luego congeladas.
La purificación de la peptidoglutaminasa II de Bacillus circulans fue realizada a la temperatura ambiente. Las células de Bacillus circulans congeladas fueron descongeladas y suspendidas en un tampón de Lysis (50 mM Tris/HCl; sacarosa al 25% (p/v); EDTA 1 mM, pH 8.0) hasta que se obtuvo una suspensión homogénea - 100 g de células mojadas por litro de tampón de Lysis. Lisozima (10 mg/ml) y DNAsa I (Sigma DN-25, 10 mg/ml) fueron disueltos en el tampón de Lysis. Luego 100 ml de solución de la lisozima; 10 ml de MgCl_{2} 1.0 M , y 1 ml de solución de la DNAsa I fueron añadidos por litro de suspensión celular. Las enzimas fueron dejadas actuar durante 1 hora.
La suspensión fue filtrada a través de una placa de filtración profunda de Seitz y el filtrado fue transferido a 10 mM KH_{2}PO_{4}/NaOH, pH 8.0 (tampón A) en una columna Sephadex G25 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia). La solución enzimática fue aplicada a una columna SOURCE Q (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) equilibrada en el tampón A y eluida con un gradiente de NaCl lineal (0\rightarrow 500 mM) en el tampón A. Fracciones de la columna fueron analizadas por su actividad peptidoglutaminasa II como se describe a continuación y las fracciones con actividad fueron agrupadas. La absorbencia de las fracciones agrupadas a 280 nm fue 1.78, estimando así el contenido proteico en 1.8 mg/ml.
La pureza de la proteína en la agrupación de peptidoglutaminasa II fue aproximadamente del 25% según fue juzgado a partir de un gel SDS-PAGE. Por tanto, la preparación contenía aproximadamente 0.5 mg/ml de peptidoglutaminasa II pura.
La actividad peptidoglutaminasa fue determinada midiendo el amonio formado durante la hidrólisis de \gamma-carboxiamida de N-tert-butoxicarbonil-Gln-pro (N-t-BOC-Gln-Pro; SIGMA No. B-4403) usando el kit de Boehringer-Mannheim para determinar el amonio (Cat. Nº. 1112732). En este kit, el amonio es medido por determinación del consumo de NADH por la glutamato deshidrogenasa, y blancos sin adición de N-t-BOC-Gln-Pro fueron también aplicados para substraer el efecto de otras enzimas consumidoras de NADH.
Un total de 200 mg de proteína de gluten de trigo fue añadido a 9 ml de agua hirviendo y tras el enfriamiento, el pH fue ajustado a 7.0. Luego se añadieron 250 \mul de la preparación de peptidoglutaminasa II (PEP) anteriormente descrita. La proteasa específica de glutamato/aspartato (SP446) descrita en el Ejemplo 19 fue añadida en una cantidad de 0.04 AU/g de proteína, y FLAVOURZYME^{TM} descrita en el Ejemplo 19 fue añadida en una cantidad de 20 LAPU/g de proteína.
Se dejó desarrollar la hidrólisis sin ajustar pH durante 18 horas a 50ºC. También se realizaron controles sin la adición de peptidoglutaminasa. Los hidrolizados fueron centrifugados y el glutamato fue medido como se describe en el Ejemplo 19. El DH fue determinado como se describe en el Ejemplo 18.
Los resultados según se muestran a continuación en la Tabla 7 demostraron que la hidrólisis con la preparación de peptidoglutaminasa aumentó el DH así como la liberación de glutamato.
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TABLA 7
3 
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Depósito de materiales biológicos
El material biológico siguiente ha sido depositado según las condiciones del tratado de Budapest con la colección de cultivos de patentes del servicio de investigación agrícola, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604; y se le ha dado el número de accesión siguiente:
Depósito Número de accesión Fecha de depósito
E. coli DH5\alpha pEJG18 NRRL B-21677 4 de Abril de 1997
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
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(i)
SOLICITANTE:
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(A)
NOMBRE: Novo Nordisk Biotech, Inc.
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(B)
CALLE: 1445 Drew Avenue
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(C)
CIUDAD: Davis, California
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(D)
PAÍS: Estados Unidos de América
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(E)
CÓDIGO POSTAL (ZIP ): 95616-4880
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(F)
TELÉFONO: (530) 757-8100
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(G)
TELEFÁX: (530) 758-0317
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(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptidos con actividad aminopeptidasa y ácidos nucleicos que los codifican
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(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 9
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(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
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(A)
RECEPTOR: Novo Nordisk of North America, Inc.
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(B)
CALLE: 405 Lexington Avenue
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(C)
CIUDAD: Nueva York
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(D)
ESTADO: NY
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(E)
PAÍS: E.E.U.U.
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(F)
CÓDIGO POSTAL: 10174
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(v)
FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
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(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: FastSEQ para Windows Version 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: por asignar
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO: 13-MAYO-1998
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA ANTERIOR SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE DEPÓSITO:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Gregg, Valeta A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35,127
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/SUMARIO: 5253.204-WO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 212-867-0123
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFÁX: 212-878-9655
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1491 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 496 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
5
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ninguna
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 537 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATGATGAGGT CGCTTTTGTG GGC 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGATGCATC TATGCCTCGA CTT 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATTTAAATCA CCATGAGGTC GCTTTTGTGG GC 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: único
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGGTTAATTA ACTATGCCTC GACTTGAGAA TG 
\hfill
32

Claims (21)

1. Polipéptido aislado con actividad aminopeptidasa, seleccionado del grupo que consiste en:
(a)
un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2; y
(b)
un fragmento de (a), donde el fragmento tiene actividad aminopeptidasa.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.
3. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2 o un fragmento de la misma.
4. Polipéptido según la reivindicación 3, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:2.
5. Polipéptido según la reivindicación 1, que se obtiene a partir de una cepa de Aspergillus.
6. Polipéptido según la reivindicación 5, que se obtiene a partir de una cepa de Aspergillus oryzae.
7. Polipéptido según la reivindicación 1, que es codificado por la secuencia de ácidos nucléicos contenida en el plásmido pEJG18 contenido en E. coli NRRL B-21677.
8. Secuencia de ácidos nucléicos aislada que comprende una secuencia de ácidos nucléicos que codifica al polipéptido según la reivindicación 1.
9. Constructo de ácidos nucléicos que comprende la secuencia de ácidos nucléicos según la reivindicación 8 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado.
10. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 9, un promotor, y señales de parada de la transcripción y de la traducción.
11. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucléicos según la reivindicación 9.
12. Método para producir el polipéptido según la reivindicación 1 que comprende (a) el cultivo de una cepa para producir un sobrenadante que comprenda el polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
13. Método para producir el polipéptido que comprende (a) el cultivo de una célula huésped según la reivindicación 11 bajo las condiciones adecuadas para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
14. Método para producir el polipéptido según la reivindicación 1 que comprende (a) el cultivo de una célula recombinante de forma homóloga, que tenga incorporada en su interior una unidad de transcripción nueva comprendiendo una secuencia reguladora, un exón, y/o un sitio donador de empalme operativamente enlazado a un segundo exón de una secuencia de ácidos nucléicos endógena que codifica el polipéptido, bajo las condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.
15. Método para producir un hidrolizado de un sustrato proteínico que comprende el sometimiento del sustrato a un polipéptido según la reivindicación 1 y una endopeptidasa.
16. Método según la reivindicación 15, donde el hidrolizado es enriquecido con Leu, Gly, Glu, Ser, Asp, Asn, Pro, Cys, Ala, y/o Gln.
17. Método según la reivindicación 16, donde el hidrolizado es enriquecido con Gly.
18. Método para obtener a partir de un sustrato proteínico un hidrolizado proteico enriquecido con ácido glutámico libre y/o residuos de ácido glutámico unidos a péptidos, comprendiendo el sometimiento del sustrato a un proceso de desamidación y un polipéptido según la reivindicación 1.
19. Método según la reivindicación 18, que comprende además el sometimiento del sustrato a una o más enzimas endo- y/o exo- peptidasas de actuación no específica.
20. Composición de mejora del sabor que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 y un portador adecuado.
21. Premezcla para una masa que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 y un ingrediente para la cocción.
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