ES2286201T3

ES2286201T3 - Compuestos y procedimientos para la deteccion de carcinomas y sus lesiones precursoras.

Info

Publication number: ES2286201T3
Application number: ES02102814T
Authority: ES
Inventors: Johannes Coy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2002-12-18
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2022-12-18
Also published as: EP1431762B1; US20080234393A1; WO2004055514A1; CN1726393A; DE60219809D1; CA2510150C; EP1431762A1; HK1086331A1; DE60219809T2; AU2003302964A1; US20060121485A1; US8759004B2; ATE360817T1; CN1726393B; CA2510150A1; JP2006510363A; JP4527544B2

Abstract

Un procedimiento para el diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras y/o el pronóstico del curso de enfermedades que comprende: a) detectar el nivel y/o la localización subcelular de moléculas de ADNasa X en células de una muestra tisular de un individuo; b) comparar el nivel y/o la localización subcelular de moléculas de ADNasa X dentro de dicha muestra con el contenido dentro de una muestra correspondiente de control, no afectada por la enfermedad que se está probando; c) en el que el diagnóstico o pronóstico del curso de la enfermedad se predice a partir de considerar un nivel significativamente aumentado con relación al nivel de moléculas de ADNasa X de tipo salvaje en dicha muestra tisular y/o núcleo celular como indicativo de dicho trastorno o del pronóstico del curso de la enfermedad.

Description

Compuestos y procedimientos para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras.

La presente invención se refiere a compuestos y procedimientos para la detección y tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras. La invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos ADNasa X útiles para la detección y tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras. La invención está más específicamente referida a un procedimiento para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras que comprende la detección del nivel y/o localización subcelular de una o más moléculas ADNasa en muestras biológicas. Además, la presente invención proporciona procedimientos para diagnóstico temprano, pronóstico y control del curso de la enfermedad para los carcinomas y sus lesiones precursoras, así como para el tratamiento de dichas lesiones.

En la mayoría de los tumores existe una fuerte correlación entre los resultados de los pacientes que siguen el tratamiento inicial y el estadío en el que la enfermedad fue diagnosticado. De este modo, cuanto más temprano se pueda diagnosticar el cáncer, mejores serán las probabilidades de que el paciente sobreviva. Por esto, se necesitan procedimientos de prueba sensibles para detectar los tumores en estadíos tempranos o incluso en estadíos preliminares del cáncer tales como estadíos precancerosos o los precursores de las estadíos cancerosos malignos.

Los procedimientos más promisorios para el diagnóstico temprano de tumores son aquellos que involucran características de marcadores moleculares para tumores o características para estadíos precursores de los tumores.

Como el cáncer es una enfermedad bastante heterogénea, pueden estar involucrados múltiples reguladores del crecimiento celular en la génesis del cáncer. Estos elementos reguladores del ciclo celular pueden ser reguladores positivos, llamados oncogenes cuando están mutados, de modo que se alcanza un estado transformado, o bien reguladores negativos, llamados genes supresores del tumor. El número de factores conocidos que están involucrados en la regulación de ciclo celular y que son agentes potencialmente causantes en el desarrollo del cáncer excede los 100 hasta el momento y está aún en aumento.

Las moléculas que están involucradas en la aparición del estado canceroso de una célula pueden usarse para discriminar entre células cancerosas y tejido normal. Por ello, puede detectarse tejido canceroso mediante la detección de moléculas características de las células cancerosas. Esto resulta ser sofisticado debido al gran número de moléculas potencialmente involucradas en causar cáncer.

Para un mejor diagnóstico de tumores existe una necesidad de nuevos moléculas marcadoras para uso en el diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras, que permitan una detección temprana específica y den la oportunidad de tratar los trastornos en un estadío temprano.

Ya se sabe que por Tsutsumi y col, en Cancer Letters 159 (2000) 109-112 que el polimorfismo de ADNasa está asociado con carcinoma gástrico y carcinoma colorrectal. Además los autores proponen el uso del fenotipo 2 de ADNasa I para identificar pacientes con riesgo de alojar y desarrollar un carcinoma colorrectal.

Economidou-Karaoglou y col. describen en Eur., J, Cancer Clin. Oncol. Volumen 24, Nº 8, páginas 1337-1343, 1988 que las variaciones de actividad ADNasa alcalina sérica son medios útiles para controlar la respuesta del cáncer de pulmón al tratamiento y la prognosis del tumor.

El documento EP 1 249 495 A1 describe una secuencia de ADN que codifica una ADNasa X murina, la proteína ADNasa X murina y anticuerpos anti-ADNasa X. El documento también se refiere a medicamentos que contienen los compuestos anteriores, usados de preferencia para prevenir y/o tratar enfermedades en las que la apoptosis juega un papel y para procedimientos y equipos de diagnóstico basados en estos compuestos. Los autores de ese documento también postulan que las células cancerosas están caracterizadas en que contienen una cantidad significativamente menor de ADNasa X que las células sanas comparables. Sin embargo, en el curso de los experimentos que dieron lugar a la presente invención se halló y pudo demostrarse que las enfermedades tumorales están asociadas con un nivel aumentado de ADNasa X en las células tumorales.

La presente invención proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos de ADNasa X para usar en la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras. De acuerdo con la presente invención, estas moléculas pueden usarse como marcadores moleculares que permitan la detección completa de carcinomas y sus lesiones precursoras como, por ejemplo, lesiones del tracto gastrointestinal, lesiones del tracto respiratorio, etc., aún en estadios tempranos. Además, se proporciona un procedimiento para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras.

Durante los experimentos que dieron lugar a la presente invención pudo demostrarse que las moléculas de ADNasa X pueden servir como marcadores moleculares para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras. El valor diagnóstico del ácido nucleico o polipéptidos de ADNasa X para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras no está publicado hasta la fecha.

Pueden encontrarse descripciones referidas a la mutación de ADNasa en tumores. Aún así no hay indicios con respecto al uso de moléculas de ADNasa X para la detección y diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras.

La investigación de la expresión de ADNasa X en carcinomas y sus lesiones precursoras y en diferentes estadíos de tumores aclaró su uso para fines diagnósticos y de pronóstico. Por ello, la presente invención se basa en los hallazgos de los inventores que se muestran en los ejemplos que se presentan a continuación, que indican que el nivel de expresión de los ácidos nucleicos de ADNasa X así como los polipéptidos codificados por estos ácidos nucleicos de ADNasa X en las muestras permiten diagnosticar y estadificar los carcinomas y sus lesiones precursoras tales como, por ejemplo, lesiones gastrointestinales, lesiones del tracto respiratorio, para predecir el curso de la enfermedad y para hacer el seguimiento de la enfermedad tras el tratamiento inicial.

Los inventores pudieron mostrar que en procedimientos inmunoquímicos puede ser detectable ADNasa X especialmente en regiones subcelulares específicas tal como por ejemplo, en el núcleo. En el caso de ADNasa X pudo demostrarse que los patrones de tinción diferenciales en los procedimientos inmunohistoquímicos pueden depender de los respectivos agentes de unión empleados en el experimento. Pudo demostrarse que la ADNasa X puede detectarse en niveles iguales en ensayos de transferencia Western o ELISA a partir de tejidos tumorales y normales. En contraste, los mismos tejidos dan patrones de tinción nuclear específicos para la ADNasa X en muestras de tumores y carecen de tinción en las muestras de controles normales. Además los inventores encontraron que la detección de actividad ADNasa X en fluidos corporales puede usarse para la identificación de individuos que tienen cáncer o precursores cancerosos.

Esto puede deberse al enmascaramiento del epítopo, que es reconocido por el anticuerpo usado en el tejido normal. En el tejido tumoral el epítopo no está enmascarado especialmente en el núcleo celular.

La presente invención proporciona procedimientos para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras que comprenden la detección de una o más moléculas de ADNasa X en una muestra biológica. La detección de moléculas de ADNasa X en el curso del procedimiento de acuerdo con la presente invención puede comprender la detección del nivel de moléculas de ADNasa X en muestras biológicas, la detección de la presencia o ausencia de moléculas de ADNasa X en muestras biológicas o la determinación de la localización de las moléculas de ADNasa X, por ejemplo en células.

En un aspecto, el procedimiento de acuerdo con la presente invención es especialmente útil para la detección temprana de trastornos asociados con la proliferación celular anormal, tales como, por ejemplo, lesiones colorrectales y para la detección de células tumorales diseminadas en el curso del diagnóstico de enfermedad mínima residual. El procedimiento para la detección de dichos carcinomas y sus lesiones precursoras puede comprender la detección de la localización (subcelular) de las moléculas de ADNasa X, la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de moléculas de ADNasa X o la detección de la accesibilidad (detectabilidad) de los epítopos específicos de moléculas de ADNasa X en muestras biológicas. Este procedimiento puede emplear por ejemplo procedimientos mínimamente invasivos o no invasivos para obtener la muestra.

En otro aspecto de la presente invención pueden usarse los procedimientos de detección de polipéptidos de ADNasa X y/o ácidos nucleicos de ADNasa X mencionados anteriormente como marcadores moleculares en el curso de la estadificación, evaluación del pronóstico, control y el diseño de una estrategia del tratamiento del tumor.

La presente invención además proporciona ácidos nucleicos y polipéptidos de ADNasa X para uso en la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras, tales como por ejemplo, lesiones colorrectales, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de mama, cáncer cervical, etc.

La presente invención proporciona además equipos, tales como equipos de diagnóstico o equipos de investigación, para la detección de los polinucleótidos de ADNasa X o polipéptidos de ADNasa X o que comprenden polinucleótidos de ADNasa X, polipéptidos de ADNasa X o agentes de unión específicamente unidos a polipéptidos o polinucleótidos de ADNasa X para uso en la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras.

Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para el tratamiento de trastornos asociados con la proliferación celular anormal. En este aspecto los polipéptidos y/o polinucleótidos de ADNasa X de la invención pueden administrarse a individuos que sufren dichos trastornos en el curso de la inmunoterapia o terapia génica. Puede usarse uno o más de los ácidos nucleicos y/o polipéptidos de ADNasa para el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras solos o en combinación con otras moléculas.

Otro aspecto más de la presente invención son composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos de ADNasa X y/o polinucleótidos de ADNasa X descritos en este documento, solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico y/o vehículos o sustancias adyuvantes.

Existe otro aspecto más de la presente invención para proporcionar procedimientos para la identificación de moléculas que se unen a los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente invención así como de activadores e inhibidores de la expresión de los genes de la presente invención. También se proporciona un procedimiento para la identificación de fármacos candidatos para el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras.

Como se usa en el contexto de la presente invención, moléculas de ADNasa X puede comprender ácidos nucleicos, polinucleótidos, proteínas, polipéptidos o péptidos. En el nivel de los ácidos nucleicos las moléculas marcadoras pueden ser ADN o ARN que comprenden ADN genómico, ADNc y ARN tales como ARNm o ARNhn.

Generalmente la accesibilidad tal como se usa en este documento puede comprender la localización de una región particular (el epítopo) de una macromolécula en una superficie, tal que la segunda o tercera molécula puede ponerse en contacto o interaccionar con esa región. En los procedimientos de acuerdo con la presente invención puede usarse cualquier procedimiento para la determinación de la accesibilidad de una región específica de macromoléculas. Tales procedimientos pueden comprender por ejemplo procedimientos físicos, tales como por ejemplo espectroscopia, cristalografía, etc., procedimientos químicos, tales como por ejemplo derivatización de grupos funcionales en las macromoléculas, entrecruzamiento entre regiones vecinas en macromoléculas, etc. o aplicación de agentes de unión por ejemplo en procedimientos inmunoquímicos.

En ciertas formas de realización puede determinarse la accesibilidad de un epítopo de una molécula mediante procedimientos que usan por ejemplo agentes de unión. En ciertos aspectos de la presente invención se dice que un epítopo es accesible, si los agentes de unión dirigidos específicamente contra dicho epítopo pueden unirse a y reconocer el epítopo en una muestra. De manera inversa se dice que el epítopo está enmascarado o inaccesible, si los agentes de unión específicos no pueden unirse al epítopo.

La expresión tal como se usa de acuerdo con la presente invención puede comprender, por ejemplo, expresión de proteínas. Puede también entenderse que la trascripción a ARN y por ello el nivel de ARNm es la expresión de acuerdo con la presente invención.

Se dice que la expresión de un compuesto está significativamente alterada de acuerdo con la presente invención, si el nivel de expresión difiere en más del 30%. La alteración de la expresión puede comprender por ejemplo la expresión elevada o expresión reducida de dicho compuesto. Otro aspecto de la expresión alterada puede ser una alteración en una manera, que el compuesto se expresa bajo ninguna circunstancia de tipo no salvaje. Esto puede comprender, que el compuesto está por ejemplo expresado en situaciones, que naturalmente suprimen la expresión o no está expresado en situaciones, que naturalmente inducen la expresión del compuesto.

Como se usa en este documento, la alteración de la expresión puede también comprender una alteración en el patrón de transcripción de un gen, por ejemplo la alteración del patrón de transcripción puede comprender el empalme alternativo del gen. Las alteraciones en el patrón de transcripción pueden influenciar los polipéptidos traducidos a partir de transcriptos alterados o pueden restringirse a regiones no traducidas. La alteración en el patrón de transcripción de un gen puede comprender el uso de exones nuevos en los transcriptos, deleciones de exones en los transcriptos o la variación de las proporciones de diferentes variantes de empalmes en células. Por consiguiente las alteraciones en los patrones transcripcionales de los genes, tal como se usa en este documento, pueden comprender la producción de ácidos nucleicos tales como por ejemplo, ARNm, ADNc etc. que contienen tramos adicionales de secuencias de ácido nucleico comparadas con los ácidos nucleicos de tipo salvaje que se presentan en los tejidos de
control.

Como alternativa, los ácidos nucleicos producidos por patrones de empalme alternativos pueden producir ácidos nucleicos que carecen de tramos de secuencias de ácido nucleico presentes en los polinucleótidos de tipo salvaje. La presencia de tramos adicionales puede presentarse simultáneamente con la ausencia de los tramos de secuencia nativas en transcriptos únicos. Como se usa en el contexto de la presente invención, las alteraciones en la expresión de genes pueden también comprender una alteración en el nivel de expresión de variantes de empalme de los genes. Esto puede incluir una expresión aumentada o disminuida de variaciones de empalme particulares así como la expresión de variantes que no están presentes en el tejido de tipo salvaje o la ausencia de expresión de variantes de empalme presentes en el tejido de tipo salvaje. En una forma de realización, la alteración de la expresión de las variantes de empalme puede comprender la alteración de las proporciones de variantes de empalme diferentes en dicho
tejido.

Los ácidos nucleicos tal como se usan en el contexto de la presente invención son de preferencia polinucleótidos o fragmentos de los mismos. Los polinucleótidos de preferencia comprenden al menos 20 nucleótidos consecutivos, de preferencia al menos 30 nucleótidos consecutivos y de más preferencia al menos 45 nucleótidos consecutivos, que son idénticos, comparten homología de secuencia o codifican polipéptidos idénticos u homólogos, comparados con los polipéptidos asociados con los trastornos proliferativos descritos en este documento. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden también ser complementarios con cualquiera de dichos polinucleótidos. Los polinucleótidos pueden incluir por ejemplo moléculas de moléculas de cadena única (sentido o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Las moléculas de RN comprenden tanto ARNhn (que contiene intrones) como ARNm (que no contienen intrones). De acuerdo con la presente invención los polinucleótidos pueden también estar unidos a cualquiera de otras moléculas, tales como a materiales de soporte o moléculas marcadoras de detección, y pueden, aunque no necesariamente, contener secuencias adicionales codificadoras, o no codificadoras.

Los polinucleótidos ADNasa X para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención pueden ser secuencias nativas o variantes de las mismas. Las variantes pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones tales que la inmunogenicidad del polipéptido codificado no esté disminuida, en relación con las proteínas ADNasa X nativas respectivas. Las variantes muestran de preferencia una coincidencia de secuencia con las moléculas de ácido nucleico nativo de 65-70%, más preferencia al menos 80% y de mayor preferencia al menos 90% en los procedimientos de acuerdo con la presente invención. En una forma de realización de la invención las variantes muestran una coincidencia de secuencia de al menos 65% hasta 99% o cualquier valor intermedio con los ácidos nucleicos de ADNasa X nativos. En otra forma de realización de la invención las variantes muestran homologías de secuencia de aproximadamente 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o hasta 100%. Los procedimientos para determinar la similitud de secuencia son conocidos por los expertos en la técnica.

En una forma de realización de la presente invención puede emplearse una variante de moléculas de ADNasa X que está alterada de una manera tal que la interacción con los ligandos naturales o las parejas de unión está deteriorada.

Un ejemplo para detectar la similitud de secuencias puede llevarse a cabo usando el programa bioinformático FastA y/o BlastN disponible en el servidor HUSAR de DKFZ Heilderberg.

Además los ácidos nucleicos de ADNasa X para uso en los procedimientos de acuerdo con la presente invención son todos polinucleótidos, que hibridan a sondas específicas para las secuencias descritas en este documento bajo condiciones rigurosas. Las condiciones rigurosas aplicadas para la reacción de hibridación son conocidas por aquellos expertos en la técnica y pueden aplicarse como se describe en Sambrook y col., Molecular cloning: A Laboratory Manual 2ª Edición 1989.

La presente invención emplea también polinucleótidos, que debido a la degeneración del código genético codifica los polipéptidos de ADNasa X codificados de forma nativa por los ácidos nucleicos de ADNasa X descritos sin mostrar el porcentaje de homología de secuencia que se describió anteriormente dentro de la secuencia del ácido nucleico. Tales ácidos nucleicos pueden aparecer cambiando los codones presentes en las secuencias descritas por codones degenerados y de ese modo preparar un ácido nucleico sintético. En ciertas formas de realización especiales los codones pueden ajustarse al uso de codón común de un organismo huésped transgénico adecuado tal como, por ejemplo, levadura, ratones, ratas, etc.

Las secuencias de nucleótidos de ADNasa X usadas de acuerdo con la presente invención pueden estar unidas a una diversidad de otras secuencias de ácidos nucleicos usando técnicas de ADN recombinante conocidas. Las secuencias pueden por ejemplo clonarse dentro de cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, tales como plásmidos, fagémidos, derivados de fagos lambda y cósmidos. Además, vectores tales como vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación pueden estar unidos con las secuencias descritas en este documento. Las secuencias de interés especial, que pudieron clonarse a los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención son por ejemplo secuencias no codificadoras y secuencias reguladoras que incluyen promotores, potenciadores y terminadores.

En ciertas formas de realización de la presente invención, pueden unirse una o más secuencias de ácido nucleico que codifican polipéptidos de ADNasa X. Esto puede ser especialmente útil para fines terapéuticos o para la expresión de proteínas recombinantes. En estas formas de realización pueden unirse juntos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o aún más ácidos nucleicos de ADNasa X diferentes o incluso idénticos en una molécula de ácido nucleico.

En una forma de realización de preferencia, los polinucleótidos de ADNasa X pueden formularse de manera tal que puedan ser capaces de entrar en las células de mamíferos y expresarse en dichas células. Tales formulaciones son especialmente útiles para fines terapéuticos. Puede lograrse la expresión de las secuencias de ácido nucleico en células blanco por medio de cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica. Los ácidos nucleicos pueden unirse por ejemplo a elementos que sean aptos para posibilitar su expresión en una célula huésped. Tales elementos pueden comprender promotores o potenciadores, tales como promotores de CMV-, SV40-, RSV-, metalotioneína I- o promotores de polihedrina respectivamente y potenciadores de CMV- o SV-40. Los procedimientos posibles para la expresión son, por ejemplo, la incorporación de los polinucleótidos en un vector viral que incluye adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus, virus vaccinia o virus de viruela. Los vectores virales para el objetivo de expresión de ácidos nucleicos en células huésped de mamíferos pueden comprender pcDNA3, pMSX, pKCR, pEFBOS, cDM8, pCEV4, etc. Estas técnicas son conocidas por aquellos expertos en la técnica.

Otras formulaciones para la administración para objetivos terapéuticos incluyen sistemas de dispersión coloidal tales como, por ejemplo complejos de macromoléculas, microesferas, perlas, micelas y liposomas.

Generalmente es posible introducir diferentes mutaciones en las moléculas de ácidos nucleicos de la invención mediante procedimientos biológicos moleculares convencionales (ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra). Como resultado, se sintetizan los polipéptidos de ADNasa X de la invención asociados al tumor o polipéptidos relacionados con el mismo, con propiedades biológicas posiblemente modificadas. Una posibilidad es la producción de mutantes de deleción en los que las moléculas de ácido nucleico se producen mediante deleciones continuas desde el extremo 5'- o 3'- de la secuencia codificadora de ADN y que lleva a la síntesis de los polipéptidos de ADNasa X que en consecuencia tienen sus extremos acortados. Otra posibilidad es la introducción de una mutación en un punto único en posiciones en las que la modificación de la secuencia de aminoácidos tiene influencia en, por ejemplo, las propiedades específicas de proliferación. Mediante este procedimiento pueden producirse muteínas que tienen, por ejemplo, un valor de Km modificado o que ya no están sometidas a los mecanismos de regulación que existen normalmente en la célula, por ejemplo, con relación a la regulación alostérica o la modificación covalente, o propiedades de unión, dimerización, o de interacción inter o intramoleculares alteradas. Tales muteínas podrían ser también valiosas como agonistas o antagonistas terapéuticamente útiles de las moléculas de ADNasa X usadas en los procedimientos de acuerdo con la presente invención.

Para la manipulación en células procariotas por medio de ingeniería genética, pueden introducirse las moléculas de ácido nucleico de ADNnasa X de la invención o partes de estas moléculas dentro de plásmidos, permitiendo una mutagénesis o una modificación de una secuencia mediante recombinación de las secuencias de ADN. Mediante procedimientos convencionales (cf. Sambrook y col., supra) pueden intercambiarse bases y pueden agregarse secuencias naturales o sintéticas. Para unir los fragmentos de ADN unos con otros pueden agregarse adaptadores o conectores a los fragmentos. Además, pueden realizarse manipulaciones que provean sitios de escisión adecuados o que eliminen ADN superfluos o sitios de escisión. Si las inserciones, deleciones o sustituciones resultan posibles, puede realizarse mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, restricción o unión. Como procedimientos de análisis usualmente se usan análisis de secuencias, análisis de restricción y otros procedimientos biológicos, bioquímicos o moleculares.

Los polipéptidos de ADNasa X codificados por las diversas variantes de las moléculas de ácido nucleico de ADNasa X de la invención muestras ciertas características comunes, tales como peso molecular, reactividad inmunológica o propiedades de conformación o físicas tales como la movilidad electroforética, comportamiento cromatográfico, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas, estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima.

La invención además usa vectores que contienen moléculas de ácido nucleico de ADNasa X de la invención asociadas a tumores. De preferencia, los vectores son plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usualmente usados en el campo de la ingeniería genética. Los vectores adecuados para uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a los vectores de expresión dual basados en T7 (expresión en procariotas y en eucariotas) para la expresión en células de mamíferos y vectores derivados de baculovirus para la expresión en células de insectos. De preferencia, la molécula de ácido nucleico de ADNasa X para uso en el procedimiento de acuerdo con la invención está unida operativamente a los elementos reguladores en el vector recombinante de la invención que garantiza la trascripción y la síntesis de un ARNm en células procariotas y/o eucariotas que puede traducirse. La secuencia de nucleótidos a transcribir puede estar unida operativamente a un promotor tal como un promotor de T7, de metalotioneína I o de polihedrina.

En otra forma de realización, la presente invención hace uso de células huésped recombinantes que contienen, transitoria o establemente, moléculas de ácido nucleico de ADNasa X. Se entiende que una célula huésped es un organismo capaz de incorporar ADN recombinante in vitro y, eventualmente, sintetizar los polipéptidos codificado por las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. De preferencia, estas células son células procariotas o eucariotas, por ejemplo células de mamíferos, células de bacterias, células de plantas, células de insectos o células de levaduras. Las células huésped para uso en la invención están caracterizadas, de preferencia, por el hecho de que la molécula de ácido nucleico de ADNasa X introducida es heteróloga con respecto a la célula transformada, es decir, que no se presenta naturalmente en estas células, o está localizada en un sitio en el genoma diferente del correspondiente que se presenta naturalmente en la secuencia de ADNasa X.

Otra forma de realización de la invención se refiere al uso de un polipéptido que exhibe una propiedad biológica de las ADNasa X y que está codificado por las moléculas de ácidos nucleicos de ADNasa X conocidas. Estas proteínas o polipéptidos pueden producirse por medio de cualquier procedimiento adecuado incluyendo procedimientos en los que, por ejemplo, se cultiva una célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis del polipéptido de ADNasa X y posteriormente se aísla el polipéptido de ADNasa X de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

El aislamiento y la purificación del polipéptido producido de manera recombinante puede llevarse a cabo por medios convencionales que incluyen cromatografía preparativa y separaciones de afinidad e inmunológicas usando, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra las proteínas marcadoras de la invención asociadas al tumor o por ejemplo pueden purificarse sustancialmente por el procedimiento de una etapa descrito por Smith y Johnson, Gene 67; 31-40 (1988).

Los polipéptidos para uso en la presente invención, sin embargo, no sólo comprenden polipéptidos de ADNasa X producidos de manera recombinante sino que incluyen polipéptidos de ADNasa X aislados que se presentan naturalmente, polipéptidos de ADNasa X producidos de manera sintética o polipéptidos producidos mediante una combinación de estos procedimientos. Los medios para preparar tales polipéptidos o polipéptidos relacionados son bien conocidos en la técnica. Estos polipéptidos están de preferencia en una forma sustancialmente purificada.

La producción de un polipéptido de ADNasa X para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un sistema de transcripción y/o traducción in vitro libre de células. Estos sistemas son conocidos por los expertos en la técnica. Un ejemplo puede comprender un sistema de intro traducción como el provisto por el Sistema Bioquímico Rápido de traducción molecular de Roche.

Los (poli)péptidos de ADNasa X tal como se usan en los procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden comprender cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en las que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces de péptidos covalentes.

Los péptidos de ADNasa X para uso en la detección o tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras como se describe en el contexto de la presente invención deben comprender polipéptidos de longitudes de al menos 4 aminoácidos. Estos péptidos de ADNasa X pueden comprender, por ejemplo desde 4 hasta 50 aminoácidos o cualquier número intermedio de aminoácidos entre estos límites. En otra forma de realización de la presente invención los péptidos pueden comprender polipéptidos con más de 50 aminoácidos. Estos polipéptidos de ADNasa X para uso en los procedimientos de la presente invención pueden comprender, por ejemplo, 50, 100, 500, 750, 1000 aminoácidos o cualquier número de aminoácidos entre éstos y pueden comprender proteínas o fragmentos de las mismas y/o proteínas quiméricas o de fusión que comprenden en una o más secuencias heterólogas adicionales. Las secuencias adicionales pueden derivar de las proteínas de ADNasa X nativas o pueden ser heterólogas, y dicha secuencias pueden (pero no necesariamente) ser inmunorreactivas y/o antigénicas. Como se detalla a continuación, tales polipéptidos pueden aislarse del tejido tumoral o prepararse por medios sintéticos o recombinantes. Como se usa en este documento, se entiende que un polipéptido que exhibe propiedades biológicas de los péptidos de la ADNasa X para uso en los procedimientos descritos en este documento es un polipéptido que tiene al menos sustancialmente las mismas propiedades inmunogénicas, es decir, es aún capaz de unir un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de ADNasa X, por ejemplo, comprende al menos un epítopo inmunogénico de un polipéptido de ADNasa X.

Los péptidos para uso en un procedimiento como el descrito en este documento pueden ser por ejemplo polipéptidos inmunogénicos. Esto requiere que los polipéptidos puedan estimular respuestas inmunes en los organismos huésped ya sea en la forma que los polipéptidos adoptan en su medio natural y/o especialmente en la forma que adoptan los polipéptidos tras el procesamiento por que sufren por parte de la maquinaria celular de presentación y procesamiento de antígenos.

Como se usa anteriormente porción inmunogénica es una porción de una proteína, que es reconocida por un receptor de superficie de antígeno de células B y/o células T. Las porciones inmunogénicas comprenden al menos 4 restos aminoácido, al menos 10 restos aminoácido o al menos 15 restos aminoácido de la proteína descrita en este documento. En una forma de realización de la presente invención, se han delecionado los dominios particulares de la proteína, tal como por ejemplo los dominios transmembrana o las secuencias líder del extremo N-terminal.

Las porciones inmunogénicas de acuerdo con la presente invención reaccionan con antisueros o anticuerpos específicos con la misma o casi la misma intensidad que las proteínas nativas de longitud completa. Las porciones inmunogénicas se identifican generalmente usando las técnicas bien conocidas en la técnica. Las técnicas posibles son por ejemplo selección de los polipéptidos por la capacidad para reaccionar con anticuerpos específicos de antígeno, antisuero y/o líneas o clones de células T.

Las porciones inmunogénicas adecuadas para la ADNasa X por ejemplo pueden comprender los péptidos:

: 71-90: RELNRFDGSGPYSTLSSPQL

: 207-224: HWVIADGEDTTVRASTHC

: 187-206: CASLTKKRLDKLELRTEPGF

: 225-241: TYDRVVLHGERCRSLLH

: 254-269: LTEEEALNISDHYPVE

: 110-126: VLSSYVYNDEDDVFARE

Estas secuencias inmunogénicas para ADNasa X serán ejemplos para las regiones inmunogénicas y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención. Para todas las ADNasa X pueden determinarse las regiones inmunogénicas para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención por medio de cualquier procedimiento adecuado. Los procedimientos para determinar las respectivas regiones inmunogénicas en las moléculas de ADNasa X particulares son conocidos por aquellos expertos en la técnica.

En ciertas formas de realización de la presente invención de polipéptidos de ADNasa X puede comprender polipéptidos de fusión o quiméricos que contienen secuencias descritas en este documento. Las proteínas de fusión comprenden el polipéptido de acuerdo con la presente invención junto con cualquier segundo polipéptido y otro polipéptido, tal como por ejemplo uno o más polipéptidos de la misma secuencia o de otra secuencia. Los polipéptidos heterólogos pueden comprender por ejemplo enzimas, moléculas receptoras, antígenos, epítopos o fragmentos antigénicos o inmunogénicos, anticuerpos o fragmentos de los mismos, polipéptidos de señal o polipéptidos transductores de señal, polipéptidos marcados, etc. La proteína inmunogénica puede ser capaz por ejemplo de provocar una respuesta de memoria. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas de tétanos, tuberculosis y hepatitis (ver por ejemplo Stoute y col., New Engl. J. Med., 336:86-91 (1997). Las proteínas de fusión que comprenden seroalbúmina o fragmentos de la misma pueden ser útiles para uso en composiciones farmacéuticas en ciertas formas de realización de la presente invención.

En una forma de realización de la invención los péptidos de fusión pueden construirse para una mejor detección o purificación de los polipéptidos o de complejos de los polipéptidos de ADNasa X con las respectivas entidades inmunológicas de acuerdo con la presente invención. Para los objetivos de etiqueta de purificación, pueden agregarse etiquetas a los polipéptidos tales como por ejemplo etiquetas his, etiquetas myc. Para los objetivos de detección de porciones antigénicas, pueden fusionarse enzimas, secuencias cromogénicas, etc. a los polipéptidos. Las proteínas de fusión de la presente invención pueden incluir (pero no necesariamente) un péptido conector entre el primer y el segundo polipéptido.

Puede emplearse una secuencia conectora de péptidos para separar el primer y el segundo polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Tal secuencia conectora de péptidos se incorpora a la proteína de fusión usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Las secuencias conectoras de péptidos adecuadas pueden elegirse en base a los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pueda interactuar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptido; y (3) la falta de restos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. La secuencia conectora de péptidos de preferencia contiene restos Gly, Asn y Ser. En la secuencia conectora pueden también usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala. Las secuencias de aminoácidos que pueden usarse de manera útil como conectores incluyen aquellos descritos por Maratea y col., Gene 40:39-46, 1985; Murphy y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 83:8258-8262, 1986; Patente de EE.UU. Nº 4.935.233 y Patente de EE.UU. Nº 4.751.180. La secuencia conectora puede tener una longitud desde 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos. No se necesitan secuencias de péptidos cuando el primer y segundo polipéptido tienen regiones de aminoácidos N-terminal no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Los polipéptidos ADNasa para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención comprenden también variantes de las proteínas de ADNasa nativas. Estas variantes pueden diferir de la proteína nativa en una o más alteraciones, tales como sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. La inmunorreactividad de las variantes de acuerdo con la presente invención no está sustancialmente disminuida comparada con las proteínas de ADNasa X nativas. En una forma de realización de la invención de preferencia la inmunorreactividad está disminuida en menos del 50%, en una forma de realización de más preferencia la inmunorreactividad está disminuida en menos del 20% en comparación con los polipéptidos nativos. En una forma de realización la inmunorreactividad está disminuida en menos del 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o cualquier valor entre éstos. En ciertas formas de realización la inmunorreactividad de las variantes está reducida incluso en más del 50%.

En una forma de realización las variantes de ADNasa X pueden ser deficientes en una o más porciones, tal como por ejemplo, las secuencias líder del extremo N-terminal, dominios transmembrana o pequeñas secuencias del extremo N- y/o C-terminal. Las variantes exhiben una coincidencia del 60%, 65% o 70%, de más preferencia al menos 75%, 80%, 85% o 90% y de mayor preferencia al menos 92,5%, 95%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% o 99,5% con los polipéptidos de ADNasa descritos de acuerdo con la presente invención.

Las variantes de la presente invención son de preferencia sustituciones conservativas, de modo que los aminoácidos cambiados son sustituidos por aminoácidos con propiedades similares. Dichas propiedades pueden incluir polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los restos aminoácidos. Las variantes descritas en este documento pueden además comprender secuencias líder terminales adicionales, conectores o secuencias que permiten la síntesis, purificación o estabilidad de los polipéptidos de una manera más fácil y cómoda.

Los (poli)péptidos de ADNasa X para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede producirse por medio de cualquier procedimiento conocido por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos pueden aislarse a partir de células u organismos que expresan los polipéptidos, pueden producirse de manera recombinante en células huésped recombinante o pueden sintetizarse químicamente por los procedimientos comúnmente aplicados para la síntesis de polipéptidos.

El término agente de unión como se usa en este documento comprende una diversidad de sustancias tales como oligopéptidos, anticuerpos, moléculas peptidomiméticas que comprenden oligopéptidos de unión de antígenos, ácidos nucleicos, carbohidratos, compuestos orgánicos, etc. De acuerdo con la presente invención el término anticuerpo se refiere de preferencia a anticuerpos que están constituidos esencialmente por anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como también a diferentes preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen a partir de un antígeno que contiene fragmentos de los polipéptidos de la invención mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica (ver, por ejemplo Köhler y col., Nature 256 (1975), 495). Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) significa incluir moléculas intactas así como fragmentos de anticuerpos (tales como por ejemplo, fragmentos Fab y F(ab')2) que son capaces de unirse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, desaparecen más rápidamente de la circulación y pueden tener menos enlace tisular no específico que un anticuerpo intacto. (Wahl y col., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Por ello estos fragmentos resultan de preferencia, así como los productos de un Fab u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Más aún, los anticuerpos de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única y
humanizados.

Los agentes de unión usados de acuerdo con la presente invención pueden emplearse por ejemplo para la inhibición de la actividad de los polipéptidos de ADNasa X de la invención. A este respecto el término "agentes de unión" se refiere a agentes que se unen específicamente a los polipéptidos de ADNasa X transcriptos a partir de ácidos nucleicos nuevo asociados con el tumor y por ello inhiben la actividad de dicho polipéptido. Tales agentes de unión pueden comprender por ejemplo ácidos nucleicos (ADN, ARN, APN etc.), polipéptidos (anticuerpos, receptores, fragmentos antigénicos, oligopéptidos), carbohidratos, lípidos, compuestos orgánicos e inorgánicos (iones metálicos, compuestos de azufre, boranos, silicatos, agentes reductores, agentes oxidantes). Los agentes de unión pueden interactuar de preferencia con el polipéptido uniéndose a los epítopos, que son esenciales para la actividad biológica. La interacción puede ser reversible o irreversible. El enlace puede ser no covalente o incluso un enlace covalente con el polipéptido. Además, los agentes de unión pueden introducir alteraciones al polipéptido de ADNasa X que alteran o disminuyen la actividad biológica del polipéptido de ADNasa X de la invención.

Para ciertos objetivos, por ejemplo procedimientos de diagnóstico, el anticuerpo o agente de unión de la presente invención puede ser marcado de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metal, una estructura de unión biológicamente relevante tal como biotina o digoxigenina o una enzima. Además puede emplearse cualquier procedimiento adecuado para la detección de la interacción intermolecular.

Se dice que el anticuerpo o el agente de unión a antígeno reacciona específicamente si reacciona en un nivel detectable con una proteína de ADNasa X como se usa en un procedimiento de acuerdo con la presente invención y no reacciona significativamente con otras proteínas. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Otras moléculas capaces de unirse específicamente pueden ser por ejemplo fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos tales como fragmentos Fab, Moléculas de ARN o polipéptidos. De acuerdo con la presente invención los agentes de unión pueden usarse aislados o en combinación. Mediante la combinación es posible alcanzar un grado más alto de sensibilidad.

En ciertas formas de realización los agentes de unión pueden exhibir especificidades selectivas para los diversos polipéptidos de ADNasa X que pueden usarse en procedimientos de acuerdo con la presente invención. Estos agentes de unión pueden definirse por ejemplo por especificidad epitópica. La especificidad puede elegirse por ejemplo de un modo tal que asegure que sólo un producto del polipéptido del gen de ADNasa X es reconocido por el agente de unión respectivo.

Los anticuerpos o agentes de unión útiles para los procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden comprender otros sitios de unión ya sea para agentes terapéuticos u otros polipéptidos o pueden estar acoplados a dichos agentes terapéuticos o polipéptidos. Los agentes terapéuticos pueden comprender fármacos, toxinas, radionúclidos y derivados de los mismos. Los agentes pueden estar acoplados a los agentes de unión directa o indirectamente por ejemplo por medio de un grupo conector o vehículo. El grupo conector puede por ejemplo funcionar para posibilitar la reacción de acoplamiento entre el agente de unión y el agente terapéutico u otro agente o el conector puede actuar como un espaciador entre las distintas partes de la molécula de fusión. El conector puede ser también escindible bajo ciertas circunstancias, de modo de liberar el agente unido bajo dichas condiciones. Los agentes terapéuticos pueden también estar acoplados de manera covalente a los grupos vehículo directamente o por medio de un grupo conector. El agente puede también estar acoplado de manera no covalente al vehículo. Los vehículos que pueden usarse de acuerdo con la presente invención son por ejemplo albúminas, polipéptidos, polisacáridos o liposomas.

El anticuerpo usado de acuerdo con la presente invención puede estar acoplado a uno o más agentes. Los múltiples agentes acoplados a un anticuerpo pueden ser todos de la mismas especies o pueden ser varios agentes diferentes unidos a un anticuerpo.

La invención hace uso de animales transgénicos no humanos tales como ratones, ratas, cobayas, monos, conejos, cerdos, C. elegans y peces tales como el pez torpedo transgénicos que comprenden una molécula de ácido nucleico de ADNasa X o un vector de la invención, de preferencia en el que dicha molécula de ácido nucleico de ADNasa X o vector puede estar integrada de manera estable dentro del genoma de dicho animal no humano, de preferencia tal que la presencia de dicha molécula de ácido nucleico de ADNasa X o vector lleva a la expresión del polipéptido de ADNasa X (o polipéptido relacionado), o puede de otro modo estar transitoriamente expresado dentro del animal no humano. Dicho animal puede tener una o varias copias de la misma o diferentes moléculas de ácido nucleico que codifiquen una o varias formas del polipéptido de ADNasa X o formas mutantes del mismo. Este animal tiene numerosas utilidades, incluso la de modelo de investigación para la regulación de la proliferación celular y diferenciación y por consiguiente, representa un animal nuevo y valioso en el desarrollo de terapias, tratamientos, etc. para enfermedades causadas por deficiencia o fallo de la proteína de ADNasa X involucrada en el desarrollo de trastornos proliferativos celulares, por ejemplo, tumores. De acuerdo con esto, en este ejemplo, resulta de preferencia el mamífero no humano a un animal de laboratorio tal como un ratón o rata.

En ciertas formas de realización, el animal transgénico no humano además comprende al menos un alelo inactivado de tipo salvaje del gen correspondiente que codifica el polipéptido de ADNasa X de la invención. Esta forma de realización permite por ejemplo el estudio de la interacción de diversas formas mutantes de polipéptidos de ADNasa X. Todas las aplicaciones que se han comentado anteriormente en este documento con respecto a un animal transgénico también se aplican a animales que llevan dos, tres o más transgenes.

En los procedimientos de acuerdo con la presente invención sería también deseable inactivar la expresión o función de la proteína en un cierto estadío del desarrollo y/o vida del animal transgénico. Esto puede alcanzarse usando, por ejemplo, promotores específicos de tejido, promotores del desarrollo y/o regulados y/o inducibles por la células que lleven la expresión de, por ejemplo, un antisentido o ribozima dirigida contra el transcripto de ARN que codifica la ADNasa X de la invención, que codifica el ARNm; ver también supra. Un sistema inducible adecuado es por ejemplo la expresión del gen regulada por tetraciclina como está descrita, por ejemplo, por Gossen y Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 EEUU (1992), 5547-5551) y Gossen y col. (Trends Biotch. 12 (1994), 58-62). De manera similar, la expresión de la proteína mutante de la invención asociada al tumor puede controlarse mediante tales elementos reguladores.

Además, la invención hace uso, en ciertas formas de realización, de una célula transgénica de mamífero que contiene una molécula de ácido nucleico de ADNasa X o parte de la misma, (de preferencia integrada de manera estable dentro de su genoma o introducida de manera transitoria) en la que la transcripción y/o expresión de la molécula de ácido nucleico o parte de la misma lleva a la reducción de la síntesis de una molécula nativa de ADNasa X. En una forma de realización de preferencia, la reducción se logra por medio de un efecto mutante antisentido, sentido, ribozima, cosupresión y/o efecto dominante. "Antisentido" y "nucleótidos antisentido" significa construcciones de ADN o ARN que bloquean la expresión del producto del gen que se presenta naturalmente. En otra forma de realización la secuencia de ácido nucleico nativa que codifica el polipéptido de ADNasa X puede ser alterada o sustituida por una variante de dicha secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, por medio de recombinación, por consiguiente dando como resultado el gen de ADNasa X no funcional. Por lo tanto, puede obtenerse un organismo que carece de actividad ADNasa X de acuerdo con experimentos "knock out".

En ciertas formas de realización pueden ser útiles animales transgénicos no humanos con un nivel reducido de proteína ADNasa X. Las técnicas para lograr esto son bien conocidas por los expertos en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, la expresión de ARN antisentido, ribozimas, de moléculas que combinan las funciones antisentido y ribozima y/o de moléculas que proporcionan un efecto de cosupresión. Cuando se usa el enfoque antisentido para reducir la cantidad de proteínas marcadoras de la invención asociadas al tumor en células, la molécula de ácido nucleico que codifica el ARN antisentido es de preferencia de origen homólogo con respecto a las especies animales usadas para la transformación. Sin embargo, es también posible usar moléculas de ácido nucleico que exhiban un alto grado de homología con las moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína ADNasa X que se presentan de manera endógena. En este caso la homología es de preferencia mayor que 75%, 80% u 85%, particularmente mayor que 90%, 91%, 92%, 93% o 94% y de más preferencia aún mayor que 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99% o 99,5%. La reducción de la síntesis de un polipéptido de ADNasa X para uso en un procedimiento de acuerdo con la invención en las células de mamíferos transgénicos pueden dar por resultado una alteración en, por ejemplo, la degradación de proteínas endógenas. En animales transgénicos que comprenden tales células esto puede llevar a diversos cambios fisiológicos, de desarrollo y/o morfológicos.

Por lo tanto, la presente invención también hace uso de animales transgénicos no humanos que comprenden las células transgénicas descritas anteriormente. Éstos pueden mostrar, por ejemplo, una deficiencia en la regulación de la proliferación y/o diferenciación celular comparada con animales de tipo salvaje debido a la presencia estable o transitoria de un ADN extraño que da como resultado al menos una de las siguientes características:

(a) la disrupción de gen(es) endógeno(s) que codifican una ADNasa X;

(b) la expresión de al menos un ARN antisentido y/o ribozima contra un transcripto que comprende un ácido nucleico de ADNasa;

(c) la expresión de un ARNm sentido y/o no traducible de un ácido nucleico de ADNasa X;

(d) la expresión de un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de ADNasa X;

(e) la incorporación de una copia funcional o no funcional de la secuencia reguladora de una ADNasa X; o

(f) la incorporación de una molécula de ADNasa X recombinante o un vector que contiene ácido nucleico de ADNasa X.

Los procedimientos para la producción de un animal transgénico no humano para uso en la presente invención, de preferencia un ratón transgénico, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales procedimientos, por ejemplo, comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico o vector dentro de una célula germinal, una célula embrionaria, célula madre o un huevo o una célula derivada de los mismos. El animal no humano puede usarse de acuerdo con un procedimiento de selección descrito en este documento y puede ser un animal sano no transgénico o puede tener un trastorno, de preferencia un trastorno causado por al menos una mutación en una proteína y/o gen de ADNasa X.

Tales animales transgénicos son adecuados para, por ejemplo, estudios farmacológicos de fármacos en conexión con formas mutantes de los polipéptidos marcadores de la invención asociados al tumor descritos anteriormente. La producción de embriones transgénicos y la selección de éstos puede llevarse a cabo, por ejemplo, como describe A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. El ADN de las membranas embrionarias de los embriones puede analizarse usando, por ejemplo, transferencia Southern con una sonda adecuada, técnicas de amplificación basadas en ácidos nucleicos (por ejemplo PCR) etc.; véase supra.

Otro aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras. Los polipéptidos de ADNasa X, polinucleótidos de ADNasa X y agentes de unión de ADNasa X (especialmente anticuerpos) usados de acuerdo con la presente invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas o inmunogénicas.

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Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de cualquier manera adecuada conocida por aquellos expertos en la técnica. La administración puede comprender por ejemplo inyección, tal como por ejemplo inyección intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea, administración intranasal, por ejemplo por aspiración o administración oral. Una dosificación adecuada para asegurar el beneficio farmacéutico del tratamiento deberá elegirse de acuerdo con los parámetros tales como edad, sexo, peso corporal, etc. del paciente, conocidos por aquellos expertos en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas comprenden dichos compuestos y un vehículo fisiológicamente aceptable. El tipo de vehículo a emplearse en las composiciones farmacéuticas de esta invención variará dependiendo del modo de administración. Para administración parenteral, tal como inyección subcutánea, el vehículo comprende de preferencia agua, solución salina, alcohol, un lípido, una cera y/o un tampón. Para la administración oral puede emplearse cualquiera de los vehículos anteriores o un vehículo sólido, tal como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa y/o carbonato de magnesio. Para las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden emplearse además como vehículo microesferas biodegradables (por ejemplo glicólido poliláctico). Las microesferas biodegradables adecuadas se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. Nº 4.897.268 y 5.075.109.

Una composición farmacéutica para uso en un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede contener, por ejemplo, ADN que codifica uno o más polipéptidos de ADNasa X. El ADN puede administrarse de manera que permita que los polipéptidos se generen in situ. Los sistemas de expresión adecuados son conocidos por los expertos en la técnica. En otra forma de realización de la invención, los ácidos nucleicos de ADNasa X pueden ser por ejemplo construcciones antisentido. Las composiciones farmacéuticas pueden también comprender moléculas de ácido nucleico de ADNasa X expresables en un sistema huésped humano o mamífero que comprende un sistema de expresión viral u otro sistema, por ejemplo un sistema de vector adenoviral.

El ácido nucleico de ADNasa X también puede administrarse como un ácido nucleico desnudo. En este caso pueden emplearse los sistemas de administración física adecuados, que potencian la incorporación del ácido nucleico, tales como el recubrimiento de perlas biodegradables con el ácido nucleico, que se transportan eficazmente dentro de las células. La administración de ácidos nucleicos desnudos puede por ejemplo ser útil para el objetivo de expresión transitoria dentro de un huésped o una célula huésped.

Como alternativa las composiciones farmacéuticas pueden comprender uno o más polipéptidos. Los polipéptidos incorporados en las composiciones farmacéuticas pueden ser un polipéptido de ADNasa. De manera opcional el polipéptido de ADNasa X puede administrarse en combinación con uno o más polipéptidos conocidos diferentes tal como por ejemplo, enzimas, anticuerpos, factores reguladores, tal como ciclinas, quinasas dependientes de ciclinas o CKl o toxinas.

En las composiciones farmacéuticas pueden usarse polipéptidos de ADNasa X usados en la presente invención o fragmentos de los mismos, que comprenden una porción inmunogénica, en las que el polipéptido por ejemplo, estimula una respuesta dirigida específicamente contra las células tumorales en el paciente. Un paciente puede estar sufriendo una enfermedad o puede estar libre de enfermedad detectable. En consecuencia, pueden usarse compuestos de ADNasa X para tratar el cáncer o para inhibir el desarrollo del cáncer. Los compuestos pueden administrarse ya sea previo o tras un tratamiento convencional de tumores, tal como eliminación quirúrgica de tumores primarios, tratamiento por administración de radioterapia, procedimientos convencionales de quimioterapia o cualquier otro modo de tratamiento del cáncer respectivo o sus precursores.

Las composiciones inmunogénicas pueden comprender uno o más polipéptidos y potenciadores de respuesta inmune no específicas, en las que el potenciador de respuesta inmune no específica es capaz de provocar o potenciar una respuesta inmune a un antígeno exógeno. En las vacunas de esta invención puede emplearse cualquier potenciador de respuesta inmune adecuado. Por ejemplo, puede incluirse un adyuvante. La mayoría de los adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral y un estimulador no específico de respuesta inmune, tal como lípido A, Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Tales adyuvantes están disponibles comercialmente por ejemplo, el Adyuvante Incompleto de Freund y el Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) y Adyuvante Merck 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N. J.).

Las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden también contener otros epítopos o antígenos tumorales, ya sea incorporados en una proteína de fusión como se describió anteriormente (es decir un polipéptido único que contiene múltiples epítopos) o presentes dentro de un polipéptido separado.

La presente invención además proporciona equipos para uso en por ejemplo procedimientos de investigación o de diagnóstico. Tales equipos pueden contener dos o más componentes para llevar a cabo un ensayo científico o de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o equipamientos. Un componente puede ser un anticuerpo o fragmento del mismo que se une específicamente con un polipéptido de ADNasa X. Además, el equipo puede contener reactivos, tampones u otros elementos necesarios para realizar el ensayo diagnóstico conocidos en la técnica. Como alternativa el equipo de investigación o el equipo de diagnóstico puede contener sondas o cebadores de nucleótidos para la detección de ADN o ARN de ADNasa X. Tal equipo contendrá reactivos y tampones adicionales conocidos en la técnica.

Un equipo de acuerdo con la presente invención comprende:

(a) reactivos para la detección de las moléculas marcadoras de ADNasa X

(b) los reactivos y tampones usados comúnmente para llevar a cabo la reacción de detección, tales como tampones, marcadores de detección, substancias vehículo y otros

(d) una muestra de marcador de ADNasa X para realizar una reacción de control positivo.

El reactivo para la detección del marcador de ADNasa X incluye cualquier agente capaz de unirse a la molécula marcadora. Tales reactivos pueden incluir proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, glicoproteínas, proteoglicanos, polisacáridos o lípidos.

La muestra para llevar a cabo un control positivo puede comprender por ejemplo ácidos nucleicos de ADNasa X en una forma aplicable, tal como solución o sal, péptidos de ADNasa X en una forma aplicable, muestras de sección de tejidos o células positivas que expresan las moléculas de ADNasa X.

En una forma de realización de preferencia de la invención, la detección de las moléculas marcadoras se lleva a cabo a nivel de polipéptidos. En esta forma de realización los agentes de unión pueden ser por ejemplo anticuerpos específicos para ADNasa X o fragmentos de los mismos.

En otra forma de realización del equipo de prueba la detección de ADNasa X se lleva a cabo a nivel de ácido nucleico. En esta forma de realización de la invención los reactivos para la detección pueden ser por ejemplo sondas o cebadores de ácido nucleico complementarios con dichos ácidos nucleicos de ADNasa X.

Los carcinomas y sus lesiones precursoras de acuerdo con la presente invención son trastornos caracterizados por propiedades anormales de crecimiento de células o tejidos en comparación con la propiedades de crecimiento de tejidos o células control normales. El crecimiento de las células o tejidos puede por ejemplo acelerarse anormalmente o puede regularse anormalmente. La regulación anormal como se usó anteriormente puede comprender cualquier forma de presencia o ausencia de respuestas de tipo no salvajes de las células o tejidos a las influencias reguladoras de crecimiento que se presentan naturalmente. Las anormalidades en el crecimiento de las células o tejidos pueden ser por ejemplo neoplásicas o hiperplásicas. En una forma de realización de preferencia de la invención los tumores son cánceres o afecciones precancerosas del tracto respiratorio.

Los trastornos caracterizados por la proliferación anormal de células, como se usa en el contexto de la presente invención, puede comprender por ejemplo neoplasmas tales como tumores benignos y malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. Los tumores pueden comprender tumores de la cabeza y del cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores de la piel y sus apéndices, tumores tejidos blandos y huesos, tumores del sistema linfopoyético y hematopoyético, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer gastrointestinal, cáncer colorrectal, cáncer anogenital, etc.

En ciertas formas de realización los trastornos son por ejemplo adenomas o adenocarcinomas del colon, trastornos del tracto respiratorio tales como Carcinoma de Células Escamosas de Pulmón, Carcinoma de Pulmón de Células Pequeñas, Adenocarcinoma de Pulmón, Adenocarcinoma de Pulmón de Células Grandes, Carcinoma de Pulmón Adeno Escamoso, Tumor Carcinoide de Pulmón, Tumor Glandular Bronquial o Mesotelioma (maligno), cáncer anogenital tal como, cáncer cervical, cáncer de vulva, cáncer vaginal, cáncer del recto, cáncer del ano y cáncer del pene.

Una muestra de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es cualquier muestra que puede contener células, tejidos o fluidos corporales. Además cualquier muestra que potencialmente contiene las moléculas marcadoras a detectar puede ser una muestra de acuerdo con la presente invención. Tales muestras son por ejemplo: sangre, plasma, suero, médula ósea, frotis, lavados, secreciones, trasudados, exudados, esputos, heces, orina, semen, muestras celulares y titulares, punciones o biopsias.

Biopsias, como se usa en el contexto de la presente invención puede comprender por ejemplo muestras de resección de tumores, muestras de tejidos preparadas por medios endoscópicos o biopsias con aguja. Además cualquier muestra que contenga potencialmente las moléculas marcadoras a detectar puede ser una muestra de acuerdo con la presente invención.

En una forma de realización de la presente invención las muestras comprenden células del tracto anogenital, del tracto respiratorio, del tracto gastrointestinal (especialmente el tracto colorrectal) o de la piel y sus apéndices. En ciertas formas de realización las células pueden ser células del cerviz uterino, la vagina, la vulva, el pene, el ano, el recto, el árbol bronquial, el pulmón, el peritoneo, el espacio peritoneal, el espacio nasofaríngeo, la cavidad oral, el colon ascendente, el colon transverso, el colon descendente, el colon sigmoide, el páncreas, el intestino delgado, el duodeno, el yeyuno, el íleon, el ciego, el esófago, el estómago, el árbol biliar, el hígado o la piel.

En ciertas formas de realización de la presente invención la muestra puede ser una muestra histológica, una biopsia o una muestra citológica tal como por ejemplo un extendido, un frotis, un lavado, un fluido corporal que contiene células (esputo, una secreción, saliva, etc.). En ciertas formas de realización de la presente invención las muestras pueden comprender células infectadas por papiloma virus. Las muestras en ciertas formas de realización pueden comprender extendidos cervicales, lavados bronquioalveolares, heces, muestras obtenidas por medios endoscópicos tales como por ejemplo gastroscopía, colonoscopía, broncoscopía, etc.

La preparación de una muestra puede comprender por ejemplo obtener una muestra de un tejido, de fluido corporal o de células de un paciente. De acuerdo con la presente invención la preparación de la muestra puede también comprender varias etapas de otras preparaciones de la muestra, tales como la preparación de disecciones, preparación de suspensiones celulares, extensión o aplicación de las células para ser examinadas en portaobjetos de microscopía, preparación de arreglos tisulares, aislamiento de polipéptidos o ácidos nucleicos, preparación de péptidos o ácidos nucleicos fijados a una fase sólida o preparación de perlas, membranas o portaobjetos a los que están acopladas de manera covalente o no covalente las moléculas a determinar.

Puede obtenerse una muestra para uso en el procedimiento de la presente invención mediante cualquier procedimiento adecuado. Las muestras pueden comprender por ejemplo cualquier muestra del contenido del tracto gastrointestinal (por ejemplo el estómago, el esófago o el intestino), del tracto respiratorio (por ejemplo del espacio nasofaríngeo, los bronquios o bronquiolos), del tracto anogenital (por ejemplo la vagina), del tracto urogenital (por ejemplo la vejiga o la uretra), del sistema vascular, etc. La muestra puede obtenerse por excreción activa del material por un individuo, o puede obtenerse en el curso de un procedimiento médico quirúrgico, invasivo o mínimamente invasivo. Por ejemplo una muestra de heces, como se usa en el contexto de la presente invención, puede ser una muestra de material contenido en el lumen del colon, que se obtuvo mediante enemas, por colonoscopía, digitalmente del recto o puede haberse obtenido de una deposición realizada por un paciente. Una muestra de heces de acuerdo con la presente invención puede, pero no necesariamente, contener células o detritus celulares de origen colorrectal. En una forma de realización de la presente invención los polipéptidos usados para la detección de lesiones colorrectales son proteínas secretadas que pueden detectarse en muestras de heces independientemente de la presencia de células o detritus celulares originados de una lesión colorrectal dentro de la muestra. En una forma de realización de la presente invención la muestra puede comprender sangre, linfa, nódulos linfáticos, médula ósea, etc. En otra forma de realización de la presente invención la muestra puede comprender tejido mamario, células de mama, aspirados de pezón, lavados canaliculares o cualquier muestra que contiene células o detritus celulares originados de la mama.

En ciertas formas de realización de la presente invención, muestra se refiere al material respectivo dentro del cuerpo de un individuo tal como la orina, las heces, el esputo, etc. Una muestra en este contexto puede ser por ejemplo el contenido del intestino in vivo. En esta forma de realización la muestra (heces, orina, esputo, exudados, semen, secreción) no necesita ser separada del paciente para someterla a los procedimientos descritos en este documento.

El procedimiento para la preparación de la muestra puede comprender cualquier procedimiento adecuado para asegurar la detección precisa de la presencia o ausencia de lesiones asociadas con propiedades de crecimiento anormales. En ciertas formas de realización de la presente invención la preparación de muestras puede comprender por ejemplo obtener cualquier porción de una muestra total (tal como por ejemplo deposición de heces, orina excretada, extendido obtenido, lavado, esputo) con cualquier medio adecuado tal como una espátula, un cepillo, una cuchara, una punta, una tela, una membrana, un capilar, una jeringa, una aguja o alfiler o similar. Por ejemplo la preparación de la muestra puede comprender transferir una porción de la muestra (tal como por ejemplo la superficie de las heces) a una membrana, una hoja, una película plástica o una tela, tomando una porción de las heces por medio de una aguja, jeringa, capilar, espátula, cuchara, un dispositivo poroso o textil (algodón, celulosa, celulosa derivatizada, etc.) o una punta o cualquier otro medio adecuado.

En ciertas formas de realización de la invención puede resultar adecuada cualquier fracción aleatoria de una muestra para realizar el procedimiento de detección descrito en este documento. En ciertas otras formas de realización de la invención puede prepararse una muestra de una manera tal que asegure la presencia de una porción representativa de la muestra total. Tales porciones representativas pueden obtenerse por ejemplo mediante procedimientos descritos en el documento U.S.6.303.304, que se incorporará en este documento por referencia, para muestras de heces.

En ciertas formas de realización especiales de la presente invención la muestra puede prepararse como una monocapa o una preparación de capa fina de un espécimen citológico. Los procedimientos respectivos para la preparación de monocapas o preparaciones de capa fina en citología son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En una forma de realización la preparación puede comprender por ejemplo la tecnología ThinPrep^{TM}. Otros procedimientos comprenden extendidos convencionales, o procedimientos que usan suspensiones de células para la preparación de especímenes citológicos.

En ciertas formas de realización de la presente invención puede usarse un procedimiento para enriquecer o purificar los polipéptidos y/o polinucleótidos de interés. En ese caso, la identificación de ácidos nucleicos, proteínas o péptidos en muestras complejas, que comprenden varios ácidos nucleicos, proteínas o péptidos, pueden mejorarse por medio de un procedimiento de separación de especies moleculares particulares presentes en la muestra. Estos procedimientos de purificación pueden involucrar la purificación en el significado de separar ácidos nucleicos, proteínas o componentes peptídicos de la muestra de otros componentes tales como lípidos, ácidos nucleicos, etc. En ciertas formas de realización de la invención la purificación puede también involucrar la separación de ácidos nucleicos y/o proteínas o péptidos de propiedades particulares de otras proteínas o componentes peptídicos dentro de la mezcla.

Generalmente los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos o polipéptidos mencionados en este documento pueden aplicarse en el curso de cualquier procedimiento de detección adecuado para la detección de moléculas de ADNasa X de la presente invención. Por consiguiente, en ese caso, cualquier procedimiento de detección para detectar las moléculas marcadoras descritas en este documento pueden comprender procedimientos de purificación para ácidos nucleicos y/o polipéptidos como se mencionó anteriormente. El procedimiento de purificación puede realizarse en cualquier etapa en el curso de un procedimiento total, por ejemplo previo a la reacción de detección o amplificación, posteriormente a una reacción de detección o amplificación, en una reacción de una etapa única simultáneamente con una reacción de detección o amplificación, etc.

La separación de proteínas y/o ácidos nucleicos puede llevarse a cabo utilizando sus propiedades físicas, químicas o biológicas. Los parámetros físicos usados para la separación pueden comprender carga, hidrofobicidad, masa, volumen, forma o cualquier otro parámetro físico adecuado para separar diferentes proteínas o especies peptídicas. Los parámetros químicos aplicables en la separación de proteínas comprenden el uso de grupos reactivos tales como hidroxilo, sulfhidrilo o cualquier otra estructura reactiva o no reactiva para la separación de proteínas/péptidos. Los parámetros biológicos que pueden usarse para la separación de proteínas pueden incluir actividad enzimática, interacciones moleculares tales como por ejemplo unión de restos de unión biológica, tales como por ejemplo ligandos o receptores, inmunogenicidad o cualquier otra propiedad biológica adecuada para la separación de proteínas o péptidos diferentes. Con respecto a ácidos nucleicos, los parámetros biológicos pueden estar relacionados con propiedades de hibridación.

Todos los parámetros mencionados anteriormente pueden usarse independientemente o en cualquier combinación para separar y purificar ácidos nucleicos, proteínas y/o péptidos. En una forma de realización puede separarse una muestra compleja mediante procedimientos electroforéticos tales como electroforesis en gel de agarosa, PAGE, SDS-PAGE, electroforesis de flujo libre, electroforesis capilar, electroforesis 2-D o cualquier otro procedimiento electroforético adecuado para separar ácidos nucleicos, proteínas o péptidos. En ciertas formas de realización puede usarse electroforesis 2-D de manera tal que la separación en la primera dimensión se basa en la carga (por ejemplo en un gel de poliacrilamida bajo condiciones de voltaje elevado) y las proteínas o péptidos separados resultantes se separan por sus masas (por ejemplo en un gel de poliacrilamida dodecilsulfato de sodio en una dirección perpendicular a la primera dimensión). Como alternativa, puede obtenerse la primera dimensión de separación de proteínas o péptidos por enfoque isoeléctrico de las moléculas en un gradiente de pH bajo voltaje elevado. En ciertas formas de realización puede aplicarse un campo pulsado de electroforesis para la separación de moléculas de ADNasa X de acuerdo con la presente invención.

En ciertas otras formas de realización puede usarse electroforesis capilar para la separación de mezclas complejas. Por ejemplo puede llenarse un capilar con un medio de separación adecuado tal como por ejemplo poliacrilamida y se coloca la muestra en un extremo (dependiendo de la posición del capilar, por ejemplo en la parte superior) del capilar. Dependiendo del tampón y las condiciones del gel pueden separarse las proteínas y/o péptidos en al muestra por la masa o carga, respectivamente.

Además puede aplicarse cromatografía líquida para separar ácidos nucleicos, proteínas y/o péptidos. Pueden separarse macromoléculas tales como ácidos nucleicos, péptidos y/o proteínas de acuerdo con su comportamiento físico o químico y o comportamiento biológico y o combinaciones de estos dependiendo del medio cromatográfico y los disolventes usados para la cromatografía. En una forma de realización la mezcla compleja de proteínas y/o péptidos puede unirse a una fase sólida según sus cargas y eluirse de manera separada incrementando las concentraciones de sales. En una forma de realización se separa la mezcla compleja mediante una fase sólida según sus masas usando una fase sólida con una distribución de tamaño de poros definida en la que las proteínas y/o péptidos aumentan su velocidad de flujo por difusión dentro de los poros según sus masas.

En una forma de realización la mezcla compleja de proteínas y/o péptidos se separa mediante una fase sólida según su forma usando una fase sólida con una forma de poro y/o distribución de forma de poro definida en la que las proteínas y/o péptidos aumentan su velocidad de flujo por difusión dentro de los poros según su forma. En una forma de realización la mezcla compleja de proteínas y/o péptidos está unida a una fase sólida según su hidrofobicidad y se eluyen por separado aplicando un gradiente de disolventes hidrofóbos. En una forma de realización resulta adecuada uno o todos los procedimientos cromatográficos mencionados anteriormente para separar mezclas complejas de proteínas y/o péptidos.

En ciertas formas de realización puede usarse HPLC bidimensional para la separación de ácidos nucleicos, proteínas y/o péptidos. Por ejemplo, puede aplicarse una separación por medio de columnas de intercambio iónico en combinación con una columna en fase inversa. La columna de intercambio iónico puede por ejemplo ser una columna de intercambio aniónico o catiónico con una fuerza adecuada para uso en el procedimiento descrito en este documento. Los materiales para uso en estos procedimientos de HPLC son conocidos por aquellos expertos en la técnica. En ciertas formas de realización los eluatos de la primer columna (eluidos por ejemplo por medio de etapas de incrementos de sales) pueden cargarse en la columna de fase inversa. La columna de fase inversa puede por ejemplo eluirse mediante un gradiente ascendente de un disolvente adecuado (por ejemplo acetonitrilo).

En ciertas formas de realización de la presente invención puede aplicarse un tratamiento previo de las macromoléculas separadas tal como por ejemplo proteínas o polipéptidos previo a la reacción de detección. Tales procedimientos pueden por ejemplo usar la reducción u oxidación de proteínas o péptidos, escisión proteolítica, modificación de proteínas o péptidos, derivatización o aplicación de restos protectores para prevenir que partes reactivas de los péptidos sufran reacciones no deseadas. Por ejemplo en ciertas formas de realización puede prevenirse la oxidación de grupos sulfhidrilo. Generalmente puede ser necesaria, pero no necesariamente, la digestión de un extracto proteico para uso en los procedimientos de acuerdo con la presente invención, enzimas adecuadas tales como tripsina o cualquier otra proteasa para preparar péptidos adecuados para la detección.

En ciertas formas de realización de la presente invención pueden estar presentes uno o más fragmentos sin someter a la muestra a ninguna etapa de preparación de muestra. Esto puede deberse a la actividad de enzimas (digestivas) proteolíticas dentro de la muestra tal como por ejemplo, en heces, en fluidos del tracto gastrointestinal o en secreciones gastrointestinales, Los fragmentos pueden detectarse por cualquier medio descrito en este documento. En una forma de realización pueden detectarse los fragmentos en el curso de un análisis de espectrometría de masas. La detección de los picos respectivos de los fragmentos correspondientes a los péptidos derivados de ADNasa puede ser especialmente útil para la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de proteínas de ADNasa X en las muestras.

En una forma de realización de la presente invención los ácidos nucleicos pueden someterse, pero no necesariamente, a procedimientos de purificación previo a la posterior reacción de detección o amplificación. Esto puede ser deseable por ejemplo para potenciar más la señal en relación con el ruido. Además la purificación de ácidos nucleicos puede aplicarse también posteriormente a la reacción de amplificación según el caso.

Las técnicas de purificación para los objetivos de purificación de ácidos nucleicos son conocidas por aquellos expertos en la técnica y comprenden por ejemplo electroforesis en gel, cromatografía, precipitación, ultracentrifugación, etc. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden purificarse usando electrofeoresis en un medio sólido, viscoso o líquido adecuado, tal como un gel fabricado a partir de sustancias conocidas por los expertos en la técnica (agarosa, poliacrilamida, almidón, etc.).

Como alternativa pueden purificarse ácidos nucleicos usando hibridación de los ácidos nucleicos con sondas de ácidos nucleicos complementarias o inversamente complementarias (por ejemplo fijadas a una fase sólida tal como perlas, membranas, portaobjetos, etc.) en el procedimiento de una cromatografía de afinidad y otros formatos de captura adecuados. Pueden aplicarse procedimientos de precipitación adicionales para precipitar ácidos nucleicos (por ejemplo usando etanol, isopropanol u otro alcohol en concentración adecuada, ácido tricloroacético, u otros ácidos adecuados y otro agente adecuado para la precipitación de ácidos nucleicos desde soluciones) para la purificación así como también procedimientos cromatográficos, tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc. De acuerdo con la presente invención los ácidos nucleicos pueden purificarse usando técnicas de ultracentrifugación, tales como centrifugación en gradiente de densidad en por ejemplo una forma isocinética o isopícnica y otras técnicas adecuadas de centrifugación.

Un procedimiento para la detección del nivel de moléculas marcadoras para uso en los procedimientos de la presente invención es generalmente cualquier procedimiento, adecuado para detectar e identificar macromoléculas biológicas tales como ácidos nucleicos, péptidos y moléculas de proteínas en muestras. En ciertas formas de realización de la invención estos procedimientos pueden ser procedimientos que exhiben alta sensibilidad, de manera que pueden detectarse inclusive pequeñas cantidades de moléculas. En otras formas de realización de la presente invención pueden usarse procedimientos de detección convencionales que exhiben sensibilidades adecuadas. Puede usarse cualquier procedimiento tal como por ejemplo aquellos que incluyen reacciones de detección en soluciones, procedimientos que usan agentes acoplados o adsorbidos en fase sólida, etc. El procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o puede ser un procedimiento in vivo, por ejemplo en el curso de procedimientos de generación de imágenes in vivo.

En ciertas formas de realización podrán determinarse uno o más péptidos derivados de polipéptidos y/o polinucleótidos de ADNasa X en un procedimiento de detección. La detección del nivel de polipéptidos marcadores o fragmentos de los mismos de acuerdo con la presente invención puede ser la detección del nivel de moléculas marcadoras únicas en mezclas de reacción por separado así como la detección de una combinación de marcadores simultáneamente.

Además, la detección de ácidos nucleicos, polipéptidos y/o nucleótidos de ADNasa X como se describen en este documento puede realizarse en combinación con otra y otras reacciones de detección. Estas reacciones de detección pueden ser por ejemplo reacciones para la determinación de la presencia de otros ácidos nucleicos y/o polipéptidos marcadores adecuados o de una o más moléculas marcadoras de ácidos nucleicos en las muestras. Otras moléculas marcadoras, que pueden ser adecuadas para la detección de trastornos proliferativos en el curso de un procedimiento como se describe en este documento comprenden por ejemplo ciclinas (Ciclina A, Ciclina B, Ciclina E), inhibidores de quinasas dependientes de ciclinas (p13,5, p14, p15, p16, p18, p19, p21, p27, etc.), quinasas dependientes de ciclina (cdk2, cdk4, cdk6, etc.), proteínas reguladoras del ciclo celular (p14ARF, pRb, mdm2, p53), moléculas marcadoras de proliferación (mcm2, mcm3, mcm4, mcm5, mcm6, mcm7, cdc2, cdc6, Ki67, Ki-S2, PCNA, ADN polimerase delta, rF Kappa B, etc.), marcadores para infección viral (tales como HBV, HPV (especialmente HPV de alto riesgo: 16, 18, 31, 33, 38, 44, 45, 58, 68, etc.), VIH etc.) u otras proteínas o ácidos nucleicos marcadores tumorales (por ejemplo her2neu, CEA, PSA etc.).

La detección de una o más moléculas marcadoras puede realizarse en una única mezcla de reacción o en dos mezclas de reacción separadas. Las reacciones de detección para varias moléculas marcadoras pueden por ejemplo realizarse simultáneamente en recipientes de reacción de pocillos múltiples. Los ácidos nucleicos y/o polipéptidos de ADNasa X descritos en este documento pueden detectarse usando procedimientos y/o reactivos que detectan específicamente estas moléculas. Pueden detectarse uno o más marcadores simultáneamente usando procedimientos y/o reactivos que los detectan específicamente. El procedimiento de detección para cada marcador puede comprender una o más etapas. En ciertas formas de realización el procedimiento de detección puede comprender la detección de las moléculas marcadoras mediante una etapa de detección primaria seguida por una etapa de detección secundaria que hacen disponible el resultado del procedimiento para análisis cuantitativo y/o cualitativo. Los ejemplos de procedimientos de detección que incluyen etapas múltiples pueden comprender por ejemplo el uso de agentes de unión primarios y secundarios y otros.

En ciertas formas de realización el procedimiento de detección puede además comprender una reacción indicadora que muestre el nivel de los polipéptidos y/o ácidos nucleicos de ADNasa X de la invención. La reacción indicadora puede ser por ejemplo una reacción que produce un compuesto coloreado, generalmente una reacción que emite radiación, o una reacción que incluye una reacción de unión química tal como la unión de biotina o la unión de quelato de metales.

En ciertas formas de realización de la presente invención los procedimientos para las reacciones de detección de acuerdo con la presente invención pueden usar por ejemplo cualquier procedimiento inmunológico para la detección de moléculas, tales como transferencia Western, transferencia de mancha, inmunoprecipitación o ensayos inmunológicos, tales como ELISA, RIA, ensayos de flujo lateral, etc.

En estas formas de realización la determinación de los ácidos nucleicos y/o polipéptidos marcadores (de ADNasa X) pueden por ejemplo llevarse a cabo en una reacción que comprende un agente de unión específico para la detección de las moléculas marcadoras. Estos agentes de unión pueden comprender por ejemplo sondas de ácido nucleico, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos que contienen mínimos epítopos de unión a antígenos, etc. Los agentes de unión pueden usarse en muchas técnicas de detección diferentes, por ejemplo en transferencia southern, northern, western, ELISA, ensayos de flujo laterl, ensayos de captura (híbridos), aglutinación de látex, tiras inmunocromatográficas o inmunoprecipitación. Generalmente la detección basada en agentes de unión puede realizarse in vitro directamente in situ por ejemplo en el curso de una reacción de tinción inmunocitoquímica. Para determinar la cantidad de polipéptidos particulares en soluciones de muestras biológicas puede usarse cualquier otro procedimiento adecuado según la presente invención, tales como procedimientos bioquímicos, químicos, físicos o fisicoquímicos.

Los procedimientos para la detección de metilación de ácidos nucleicos son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden comprender por ejemplo procedimientos que usan un tratamiento químico previo de ácidos nucleicos con, por ejemplo bisulfito, permanganato o hidrazina de sodio y la detección posterior de la modificación por medio de endonucleasas de restricción específicas o por medio de sondas específicas, por ejemplo en el curso de una reacción de amplificación. La detección de metilación puede además llevarse a cabo usando endonucleasas de restricción específicas para metilación.

En una forma de realización de la invención, la detección del nivel de moléculas marcadoras puede llevarse a cabo mediante la detección del nivel de ácidos nucleicos que codifican las moléculas marcadoras o fragmentos de los mismos presentes en la muestra. Los medios para la detección de moléculas de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la técnica. El procedimiento de detección de ácidos nucleicos puede llevarse a cabo, por ejemplo por medio de una reacción de unión de la molécula a detectar con sondas de ácido nucleico complementario, proteínas con especificidad de unión con los ácidos nucleicos o cualquier otra entidad que reconozca y se una específicamente a dichos ácidos nucleicos. Este procedimiento puede llevarse a cabo tanto in vitro, como directamente in situ, por ejemplo en el curso de una reacción de detección por tinción. Otra forma de detectar las moléculas marcadoras en una muestra a nivel de ácidos nucleicos realizada en el procedimiento de acuerdo con la presente invención es una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, que puede llevarse a cabo de manera cuantitativa tal como por ejemplo PCR, LCR o NASBA.

En ciertas formas de realización de la presente invención puede aplicarse amplificación de ácidos ribonucleicos o desoxirribonucleicos para detectar pequeñas cantidades de moléculas marcadoras de ADNasa X o de pequeñas cantidades de células que expresan moléculas marcadoras de ADNasa X en las muestras. Esto puede resultar especialmente útil para la detección de células tumorales dispersadas en muestras, o para la detección de moléculas de ADNasa X, que se han dispersado a los fluidos corporales desde células tumorales, que expresan estas moléculas de ADNasa X. Generalmente, la detección de metástasis, enfermedad mínima residual o células tumorales diseminadas en muestras corporales puede comprender una reacción de amplificación de ácidos nucleicos como se mencionó anteriormente.

En el curso de la detección de enfermedad mínima residual, la detección general de moléculas de ADNasa X tales como péptidos, proteínas, ADN o ARNm en muestras de sangre o la detección de células diseminadas, puede ser adecuada. En el curso de la detección de moléculas de ADNasa X puede usarse una reacción de amplificación (por ejemplo PCR, LCR, NASBA). En el curso de la detección de células tumorales diseminadas, pueden separarse de un líquido corporal y tras lisar las células, pueden detectarse las moléculas de ADNasa X en el lisado. En ciertas formas de realización de la presente invención, la detección de las células tumorales dispersadas puede llevarse a cabo en muestras de ganglios linfáticos o en muestras de médula ósea para detectar metástasis o células tumorales diseminadas, que se han esparcido a las muestras respectivas. Debe entenderse que, en el curso de una detección de células tumorales diseminadas, puede resultar útil cualquier muestra obtenible de un individuo.

En una forma de realización de la presente invención, la detección de un carcinoma o sus lesiones precursoras o la detección de metástasis o enfermedad mínima residual en un individuo puede comprender la determinación de la accesibilidad de una región específica de una molécula de ADNasa X en las muestras. Esto puede comprender por ejemplo la detección de la capacidad de un agente de unión específico de un sitio para reaccionar con ADNasa X en una muestra. Además la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras así como la detección de enfermedad mínima residual o metástasis puede comprender la determinación de la localización subcelular de ADNasa X en
células.

Como alternativa, para el objetivo de detección de células tumorales diseminadas, metástasis o enfermedad mínima residual, puede aplicarse detección por espectrometría de masas de ácidos nucleicos posterior a la amplificación, o puede aplicarse sin reacción de amplificación.

En otra forma de realización de la invención, la detección del nivel de moléculas marcadoras se lleva a cabo determinando el nivel de expresión de una proteína. La determinación de las moléculas marcadoras a nivel de proteínas puede realizarse, por ejemplo en una reacción que comprende un agente de unión específico para la detección de las moléculas marcadoras. Estos agentes de unión pueden comprender por ejemplo anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos, anticuerpos híbridos bifuncionales, peptidomiméticos que contienen mínimos epítopos de unión a antígenos, etc. Los agentes de unión pueden usarse en muchas técnicas de detección diferentes, por ejemplo en transferencia western, ELISA, ensayo de flujo lateral, aglutinación de látex, tiras inmunocromatográficas o inmunoprecipitación. Generalmente, la detección basada en agentes de unión puede realizarse tanto in vitro como directamente in situ, por ejemplo en el curso de una reacción de tinción inmunocitoquímica. Para determinar la cantidad de polipéptidos particulares en soluciones de muestras biológicas puede usarse cualquier otro procedimiento adecuado según la presente invención, tales como procedimientos bioquímicos, químicos, físicos o fisicoquímicos.

En ciertas formas de realización de la presente invención puede usarse espectrometría de masas para la detección de ácidos nucleicos y/o polipéptidos marcadores de ADNasa X. Generalmente, puede usarse cualquier tipo de espectrometría de masas en un procedimiento de acuerdo con la presente invención. Las moléculas a analizar pueden ionizarse mediante cualquier procedimiento adecuado. En una forma de realización el procedimiento de ionización en el curso de la espectrometría de masas puede ser una ionización por desorción láser asistida por matriz, ionización por bombardeo con átomos rápidos, ionización por vaporización de electrones o cualquier otro procedimiento adecuado. En un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede usarse cualquier técnica conocida para la resolución espectrométrica y detección de los iones generados. El análisis de espectrometría de masas puede llevarse a cabo por ejemplo por medio de un analizador de tiempo de vuelo, puede usar una trampa de iones, un cuadrupolo, un analizador de campo sectorial, un ciclotrón, etc.

El análisis completo que incluye HPLC-2D y espectrometría de masas puede llevarse a cabo por ejemplo en un ProteomeX-Workstation (ThermoFinnigan, San José, CA, EEUU). El sistema incluye un sistema de HPLC que comprende dos bombas de HPLC y un muestreador automático que están conectados para proporcionar disolvente independientemente a una columna de intercambio de cationes fuerte y a una columna inversa. En la primera etapa se carga el digerido con tripsina en una columna de intercambio iónico fuerte y se lava usando un disolvente adecuado para eliminar cualquier contaminación no adecuada para otros análisis. Al aumentar las etapas de sales comenzando con cloruro de amonio 1 mM y terminando con cloruro de amonio 900 mM, las fracciones de los pépticos proteolíticos se eluyen de una columna de intercambio catiónico fuerte y se cargan en la columna de fase inversa. Usando la segunda bomba de HPLC se eluyen los péptidos en la columna inversa aumentando el gradiente de acetonitrilo desde acetonitrilo al 5% hasta 80% en agua tras lavar los péptidos unidos para eliminar el exceso de sal y acondicionar los péptidos para el posterior análisis de espectrometría de masas. Los péptidos que eluyen de la columna de fase inversa se miden en línea usando un espectrómetro de masas con trampa de iones por ionización con electrovaporización (DECA LCQ, ThermoFinnigan, San Jose, CA, EEUU) que permite el análisis y fragmentación directa de los péptidos eluidos. Cada análisis en fase inversa se controla continuamente por medio de espectros ESI-MS y ESI-MS/MS y se guardan para la posterior identificación de proteínas con el paquete de programas informáticos SEQUEST. SEQUEST usa los espectros de masas de fragmentación de péptidos obtenidos durante el procedimiento MS/MS dependiente de los datos que generó el espectro de masas de fragmentos de los péptidos eluidos. El algoritmo SEQUEST enlaza los espectros de fragmentos derivados experimentalmente con los espectros de fragmentos generados en sílice de bases de datos y permite la correlación del espectro derivado experimentalmente con el registro de bases de datos adecuado que identifica el péptido que corresponde con este registro.

Los fragmentos detectados durante el análisis MS pueden identificarse por comparación de estos fragmentos con datos obtenidos de una base de datos. Usando algoritmos adecuados pueden identificarse proteínas de acuerdo con el dato del fragmento obtenido a partir del análisis MS.

En una forma de realización, los fragmentos de péptidos obtenibles por escisión proteolítica de proteínas de ADNasa X pueden ser especialmente útiles para la detección de proteínas de ADNasa X en muestras. La detección de la presencia o el nivel de proteínas de ADNasa X en muestras puede comprender, en una forma de realización de la presente invención, la detección de la presencia o ausencia de y/o el nivel de uno o más fragmentos proteolíticos de péptidos derivados de proteínas de ADNasa X en una muestra. En una forma de realización, la detección puede comprender la detección de los picos respectivos de los fragmentos en un espectro de masas o en un patrón complejo de diferentes señales de fragmentos de péptidos obtenible por medio de un procedimiento analítico adecuado.

En ciertas formas de realización, la separación de las proteínas, el posterior análisis de las proteínas y péptidos y la identificación final de las proteínas de acuerdo con los espectros de masas detectados puede realizarse en un procedimiento ensamblado.

Otra técnica adecuada para la identificación de péptidos en muestras complejas usa Electroforesis 2D en lugar de cromatografía líquida 2D. Pueden cortarse las manchas en gel teñidas con azul brillante de Coomassie del gel y digerirse usando tripsina. La identificación posterior de péptidos únicos así como la "huella dactilar de masas" de la proteína digerida puede llevarse a cabo usando espectrometría de masas con ionización y desorción láser asistida con matriz o espectrometría de masas con ionización por electrovaporización.

Para la detección en espectrometría de masas de ácidos nucleicos, pueden someterse los ácidos nucleicos purificados a reacciones de amplificación. Las reacciones de amplificación adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica y pueden comprender amplificación basada en ADN así como amplificación basada en ARN. Las reacciones de amplificación de acuerdo con la presente invención pueden comprender PCR, LCR, NASBA, etc. La reacción de amplificación puede realizarse usando uno o más cebadores específicos. En una forma de realización de la invención, una reacción de amplificación comprende la amplificación de un ácido nucleico único. En otra forma de realización de la invención la amplificación se lleva a cabo como una reacción de amplificación múltiplex amplificando simultáneamente una serie de varios ácidos nucleicos.

En una forma de realización de la presente invención, los ácidos nucleicos amplificador puede usarse para una posterior reacción de extención con cebadores, con o sin purificación previa que da lugar a fragmentos de ácidos nucleicos con una longitud de desde 10 hasta aproximadamente 50 pb.

En ciertas formas de realización de la presente invención pueden detectarse entidades inmunológicas dirigidas contra ADNasa X. Esta reacción de detección puede realizarse en el curso de detección de trastornos asociados con la expresión de moléculas de ADNasa X o en el curso de una inmunoterapia para la determinación del estado inmunológico de un individuo o para controlar el efecto de un tratamiento de inmunización o vacunación.

En una forma de realización de la invención, la detección del nivel de entidades inmunológicas específicas para péptidos de ADNasa X se lleva a cabo a nivel de anticuerpos. El procedimiento para la detección de trastornos de acuerdo con la presente invención por consiguiente puede usar la detección de entidades inmunológicas dirigidas contra un péptido único o la detección de una serie de entidades inmunológicas. El uso de una multiplicidad de péptidos potenciales eleva la probabilidad de detectar la presencia de un trastorno particular, y puede además dar información adicional útil en la estadificación de un trastorno, en el control del curso de la enfermedad o en la evaluación del pronóstico relacionado con el curso de la enfermedad.

Las entidades inmunológicas, como se usa en el contexto de la presente invención comprenderán cualquier componente del sistema inmune de un mamífero, que es capaz de reaccionar específicamente con un epítopo antigénico. Tales entidades inmunológicas pueden comprender por ejemplo anticuerpos, todas las inmunoglobulinas, tales como por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, células T CD8+ específicas o células T-ayudantes específicas.

En esta forma de realización la detección puede realizarse, por ejemplo usando la interacción específica entre los péptidos de ADNasa X respectivos con los anticuerpos. La determinación de la presencia o ausencia y/o el nivel de anticuerpos dirigidos contra los péptidos de ADNasa X en un individuo puede realizarse por ejemplo con péptidos de ADNasa X producidos de manera recombinante. Los péptidos pueden usarse en muchas técnicas de detección diferentes, por ejemplo en transferencia western, ELISA o inmunoprecipitación. En una forma de realización la detección de anticuerpos se lleva a cabo como un ensayo de captura de anticuerpos (Antibodies A laboratory Manual, Harlow, Ed. y col., Cold Spring Harbor Laboratory 1988).

En otra forma de realización de la invención la detección de los anticuerpos específicos se lleva a cabo usando anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen específicamente el epitome de unión al antígeno de los primeros anticuerpos. Con este objetivo pueden aplicarse los procedimientos inmunológicos de detección mencionados anteriormente. En otra forma de realización pueden usarse antígenos quiméricos en la reacción de detección. Tales antígenos quiméricos pueden comprender, por ejemplo proteínas de fusión que combinan el epítopo antigénico de un polipéptido asociado al tumor, reconocido por el anticuerpo en cuestión, fusionado con otro antígeno, que puede ser reconocido por un anticuerpo de detección. Los antígenos particulares dentro del polipéptido quimérico pueden separarse por medio de una región conectora o espaciadora.

En muestras biológicas de acuerdo con la presente invención puede usarse cualquier otro procedimiento para determinar la cantidad de anticuerpos particulares o inmunoglobulinas.

Generalmente la detección de los anticuerpos de acuerdo con la presente invención puede realizarse tanto in vitro como directamente in situ, por ejemplo en el curso de una reacción de tinción inmunohistoquímica o inmunocitoquímica.

En una forma de realización de la presente invención, las entidades inmunológicas dirigidas contra moléculas de ADNasa X pueden detectarse en una prueba de piel. En este formato de pruebas, los péptidos de ADNasa X pueden introducirse por vía intradérmica en la piel de individuos in vivo. El formato de las pruebas es conocido por los expertos en la técnica a partir de la prueba llamada prueba TINE o prueba de impronta SERO de Sero-Mérieux. En esta prueba se diagnostica la presencia de entidades inmunológicas dirigidas contra moléculas de ADNasa X a partir de una reacción visible en el individuo, por ejemplo la inflamación de la piel en el punto respectivo de inyección del péptido. Por lo tanto la evaluación se basa en el enrojecimiento de la piel y por ejemplo, la formación de pápulas rojizas, etc. en la piel. El resultado de la prueba puede depender por ejemplo del diámetro del enrojecimiento o de las pápulas detectables tras la aplicación de los antígenos. El resultado de la prueba puede registrarse por ejemplo mediante documentación fotográfica.

Los péptidos (en este contexto también llamados "antígenos") aplicables para la detección de entidades inmunológicas en individuos pueden producirse por medio de cualquier procedimiento conocido por los expertos en la técnica y pueden comprender por ejemplo síntesis química de polipéptidos (síntesis fmoc o equivalente) o pueden producirse de manera recombinante en un huésped adecuado. Sin embargo debe cumplirse que los péptidos estén libres de componentes inmunogénicos diferentes de los péptidos derivados de ADNasa X respectivos.

Las cantidades de péptidos que pueden aplicarse en este formato de pruebas con el fin de provocar reacciones inmunológicas visibles están en el intervalo desde 0,1 \mug hasta 10 \mug del péptido purificado. En ciertas formas de realización pueden usarse 0,05 \mug, 0,1 \mug, 0,5 \mug, 1 \mug ó 5 \mug de antígeno o cualquier valor intermedio por aplicación. Los antígenos (péptidos) se aplican de preferencia como solución (mientras que también puede usarse cualquier otro formato adecuado de aplicación tal como polvo, aerosol o similar de acuerdo con la presente invención). El disolvente puede ser cualquier solución médicamente aceptable estéril y libre de pirógenos, que no cause reacción inflamatoria o inmunogénica, cuando se aplica en el formato de la prueba como se usa en la prueba de piel presentada.

Las células que exhiben especificidad para un antígeno de ADNasa X pueden detectarse mediante cualquier procedimiento adecuado para ese objetivo conocido por los expertos en la técnica. Los procedimientos pueden comprender por ejemplo ensayos de proliferación, ELISA para citocinas, ensayos ELISAspot, tinción FACS intracelular, identificación de células que expresan citocinas específicas de péptido (o similar) mediada por PCR, tinción de tetrámeros, ensayos de citotoxicidad y reacciones DHT (hipersensibilidad de tipo retardada).

En el caso de ensayos de proliferación, puede medirse la inducción de células T específicas de péptido mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Esto puede lograrse contando simplemente las células, midiendo la incorporación de nucleótidos marcados en ADN celular o midiendo el nivel y/o actividad de proteína(s) celular(es). El ELISA para citocinas puede comprender identificación de células que secretan citocinas específicas de péptido midiendo los niveles de citocinas en el sobrenadante. En el curso de un ensayo ELISpot se determina el número de células que secretan citocinas específicas de péptido (por ejemplo IFN-\gamma) en una muestra. De manera similar la tinción FACS intracelular identifica células que expresan citocinas a nivel de proteínas. En contraste, puede usarse PCR (en tiempo real) para identificación de células que expresan citocinas específicas de péptido (o similar) a nivel de transcriptos. En el curso de un ensayo de tinción de tetrámeros el marcador es una molécula de tetrámero de moléculas del CMH de clase I recombinantes, cargadas con el péptido específico y acopladas con un colorante. El tetrámero se une al receptor de la célula T. Los ensayos de citotoxicidad son procedimientos para la identificación de células, que pueden reconocer y matar células diana de una manera específica de péptido. La reacción DTH (hipersensibilidad de tipo retardada) se basa en la medición de la reacción en la piel de personas vacunadas tras la aplicación intradérmica (o similar) de péptido(s).

El procedimiento para la detección de entidades inmunológicas como se describe en este documento puede llevarse a cabo con el objetivo de controlar en el curso de tratamientos inmunoterapéuticos de individuos. A este respecto, se determina en un individuo la presencia o ausencia y/o el nivel de anticuerpos dirigidos contra un péptido de la invención. La determinación del nivel puede realizarse usando los procedimientos establecidos anteriormente. La detección puede llevarse a cabo en varios momentos consecutivos para controlar la alteración con el tiempo de las entidades inmunológicas. La determinación puede realizarse por ejemplo diariamente, semanalmente, mensualmente, una vez al año o una vez cada diez años o en cualquier intervalo intermedio.

En una forma de realización de preferencia de la invención el nivel de marcadores está significativamente elevado en comparación con una prueba en una muestra no tumoral. En este caso el marcador está sobre expresado en la muestra. En otra forma de realización de preferencia de la presente invención el nivel del marcador está disminuido en comparación con una prueba en una muestra no tumoral. En una tercera forma de realización no hay ninguna expresión detectable del marcador en la muestra de prueba distinta de la muestra de control. En otra forma más de realización existe un nivel detectable de moléculas marcadoras de tipo no salvaje. Las moléculas marcadoras de tipo no salvaje pueden comprender cualquier molécula que difiere en secuencia o estructura de la estructura o secuencia, que es funcional en el tejido de tipo salvaje, no afectado por una enfermedad de proliferación celular. Las secuencias o estructuras de tipo salvaje son las secuencias o estructuras predominantemente presentes en células o tejidos normales. En una forma de realización de preferencia de la invención, el nivel de variantes de empalme particulares del gen marcador está alterado en las muestras de prueba en comparación con el tejido de tipo salvaje. Esto puede llevar a niveles alterados de variantes de empalme, nuevas variantes de empalme, neopéptidos, proporciones alteradas de variantes de empalme diferentes de genes.

El procedimiento de detección de acuerdo con la presente invención puede comprender además un procedimiento de tinción citoquímica que da una tinción cromogénica o fluorescente de células o compartimientos celulares. Tales procedimientos de tinción son conocidos por aquellos expertos en la técnica y pueden comprender por ejemplo, la tinción de estructuras acidófilas o basófilas, de regiones subcelulares (por ejemplo el núcleo, la mitocondria, el aparato de Golgi, el citoplasma, etc.), de moléculas específicas (los cromosomas, lípidos, glicoproteínas, polisacáridos, etc.) en los especímenes citológicos. Pueden usarse colorantes fluorescentes tales como DAPI, Quinacrina, Cromomicina, etc. Además pueden aplicarse colorantes cromogénicos tales como Azan, naranja de Acridina, Hematoxilina, Eosina, rojo Sudán, colorantes de Tiazina (azul de Toluidina, Tionina). En otras formas de realización pueden usarse los procedimientos de tinción tales como la tinción Pap, la tinción Giemsa, la tinción con Hematoxilina-Eosina, la tinción de van-Gieson, la tinción de Schiff (que usa el reactivo de Schiff), la tinción de Feulgen, procedimientos de tinción que usan precipitación de metales (tales como por ejemplo de plata en procedimientos de tinción que usan Nitrato de Plata) o tinciones insolubles tales como por ejemplo tinción de azul de Turnbulls (u otros cianuros de metales insolubles), etc. en el curso de un procedimiento como los descritos en este documento. Debe entenderse que los colorantes y los procedimientos de tinción nombrados serán ejemplos para los procedimientos aplicables y que puede aplicarse cualquier otro procedimiento conocido en la técnica a un procedimiento descrito en este documento.

Los procedimientos de tinción pueden producir tinciones cromogénicas para la inspección con microscopio óptica o tinciones fluorescentes para inspección bajo condiciones de microscopía fluorescente. En otra forma de realización de la presente invención pueden usarse para un procedimiento de acuerdo con la presente invención, procedimientos que emiten radiación, procedimientos que usan sustancias que mejoran la transmisión de radiación u otro medio de contraste para imágenes de las condiciones citológicas en una muestra (por ejemplo la generación de impresión óptica por medios tales como generación de imagen (micro)autorradiográfica o (micro)radiográfica.

Todos los procedimientos de tinción y de obtención de imágenes para análisis, no sólo en procedimientos microscópicos sino también en procedimientos de análisis automatizados tales como citometría, análisis microscópico automatizado (compuratizado o asistido por ordenador) o cualquier otro procedimiento para análisis de especímenes citológicos teñidos.

El análisis de los resultados de las tinciones u obtención de imágenes de los diferentes procedimientos puede realizarse en una etapa única de análisis o en diferentes etapas posteriores. Por ejemplo la inspección con microscopio óptico de un espécimen puede realizarse previamente o tras la inspección con microscopio de fluorescencia del espécimen. En microscopía de fluorescencia puede realizarse el análisis de diferentes tinciones con diferentes longitudes de onda de excitación de manera simultánea o consecutiva. En los procedimientos nombrados pueden usarse otros procedimientos simultáneos o consecutivos.

Puede haber diversas circunstancias, bajo las cuales puede resultar adecuada la combinación de diferentes procedimientos de tinción. Por ejemplo, en casos en los que no pueden lograrse resultados de tinción citológica satisfactorios por medio de tinción inmunoquímica, puede resultar adecuada la aplicación adicional de técnicas generales de tinción citológica.

En ciertas formas de realización de la presente invención, el procedimiento para la detección de moléculas marcadoras en muestras puede llevarse a cabo de una manera automatizada. La automatización del procedimiento puede lograrse mediante la tinción automatizada y el análisis de especímenes histológicos o citológicos en una superficie sólida por medios microscópicos. En otra forma de realización, la automatización puede comprender un análisis de citometría de flujo de la tinción de las células en solución.

En una forma de realización de preferencia, la detección de tejidos que expresan productos de genes de ADNasa X se lleva a cabo en forma de procedimientos de imágenes moleculares. Los procedimientos respectivos son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los procedimientos de obtención de imágenes para uso en el contexto de la presente invención pueden comprender, por ejemplo MRI, SPECT, PET y otros procedimientos adecuados para la obtención de imágenes in vivo.

En una forma de realización, el procedimiento puede estar basado en la conversión enzimática de compuestos inertes o marcados en moléculas detectables en el curso de un procedimiento de obtención de imágenes por las moléculas marcadoras. En otra forma de realización, el procedimiento de imágenes moleculares puede estar basado en el uso de compuestos que llevan un marcador adecuado para la obtención de imágenes moleculares in vivo, tales como radioisótopos, iones metálicos, etc., que se unen específicamente a las moléculas marcadoras in vivo.

En una forma de realización de preferencia de la invención estos compuestos son no tóxicos y pueden eliminarse de la circulación de los organismos, tales como seres humanos, en un período de tiempo que permite realizar la detección del marcador acumulado en el tejido tumoral que sobre expresa el gen marcador de ADNasa X. En otra forma de realización de preferencia de la invención se usan compuestos para imágenes moleculares, para los que la depuración desde la circulación no es relevante para llevar a cabo la reacción de imágenes moleculares. Esto puede ser por ejemplo debido al bajo fondo producido por las moléculas circulantes, etc. Los compuestos para uso en procedimientos de imágenes moleculares se administras en una forma farmacéuticamente aceptable en composiciones que pueden comprender además cualquier otra sustancia adecuada, tal como por ejemplo otras sustancias útiles para el diagnóstico, sustancias útiles para el tratamiento, sustancias vehículo o similares.

Las moléculas de ADNasa X descritas de acuerdo con la presente invención pueden usarse para diagnóstico, control del curso de la enfermedad y pronóstico en trastornos de proliferación celular tales como por ejemplo tumores.

Cualquier procedimiento para la detección de moléculas de ADNasa X, de la accesibilidad de regiones en moléculas de ADNasa X o de entidades inmunológicas dirigidas contra moléculas de ADNasa X de acuerdo con la presente invención puede ser útil por ejemplo en el curso de diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras. Además, los procedimientos para detección de moléculas de ADNasa X o de entidades inmunológicas dirigidas contra moléculas de ADNasa X pueden usarse para la determinación de un estado inmunológico de individuos, por ejemplo en el curso de procedimientos de inmunoterapia o vacunación.

El diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras como se usa en este documento puede comprender, por ejemplo la detección detección de células o tejidos afectados por crecimiento anormal. En una forma de realización de preferencia, diagnóstico significa la detección primaria de una enfermedad en un organismo o muestra.

De acuerdo con la presente invención, el procedimiento para diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras puede aplicarse en pruebas de selección de rutina para aspectos preventivos con el fin de detectar dicha enfermedad en una etapa temprana del establecimiento del trastorno. Con el objetivo de la detección temprana pueden usarse por ejemplo, muestras obtenidas por medio de procedimientos mínimamente invasivos tales como por ejemplo muestras de sangre, muestras de heces, muestras de esputo, aspirados de pezón, o muestras obtenidas mediante procedimientos que comprenden colonoscopía, broncoscopía, lavado bronquioalveolar, lavado canalicular, etc. Los procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden usarse en el curso de la detección de etapas tempranas de tumores y de lesiones precursoras de tumores o cánceres.

En otra forma de realización de preferencia, el procedimiento de diagnóstico puede usarse para determinar la enfermedad mínima residual de un tumor tras el tratamiento primario. A este respecto, el procedimiento de la invención puede aplicarse para determinar células en muestras del cuerpo que exhiben una expresión anormal de moléculas marcadoras de acuerdo con la presente invención, características de tumores. Por consiguiente, puede detectarse una diseminación de las células afectadas en los fluidos corporales.

En una forma de realización de la invención, pueden usarse los procedimientos descritos en este documento para la detección e identificación de metástasis. Puede aplicarse el procedimiento para la detección de metástasis en tejidos corporales u órganos por medio de los procedimientos de detección descritos en este documento, o pueden detectarse las metástasis con respecto al pronóstico y predicción del curso de la enfermedad.

El control del curso de la enfermedad puede comprender la determinación de niveles de moléculas marcadoras en diferentes puntos, la comparación de los niveles en los diferentes momentos y la evaluación de un diagnóstico acerca de la progresión de la enfermedad durante el período de tiempo cubierto. Por lo tanto, el control puede permitir la evaluación del pronóstico y/o el diseño de un tratamiento adecuado para un paciente particular.

Control o diagnóstico, como se usan en el contexto de la presente invención pueden también comprender la detección de un estado inmunológico de individuos en el curso de un tratamiento de inmunoterapia o de vacunación.

El pronóstico del curso de la enfermedad de un trastorno de proliferación celular tal como por ejemplo los tumores de acuerdo con la presente invención puede comprender determinar el nivel de expresión de una o más moléculas marcadoras, comparar los niveles con datos de estudios posteriores y en una base de datos y pronosticar el curso de la enfermedad a partir de dicha comparación. En una forma de realización de preferencia, el procedimiento puede comprender la detección de los niveles de una serie de moléculas marcadoras, cuyos distintos niveles pueden caracterizar distintos estadíos en el curso de la enfermedad. En otra forma de realización de la invención, la combinación de los niveles de una combinación de marcadores puede ser un indicador del pronóstico del curso de la enfermedad y puede construir las bases para el diseño de un tratamiento adecuado.

Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para tratamiento y/o vacunación. De acuerdo con la presente invención, puede realizarse un tratamiento de un trastorno de proliferación celular usando los polipéptidos y/o polinucleótidos de ADNasa X de la invención. El tratamiento puede ser por ejemplo un tratamiento de inmunoterapia o un tratamiento genético somático.

Los polipéptidos y/o polinucleótidos de ADNasa X de la invención de acuerdo con la presente invención pueden usarse para la vacunación contra trastornos de proliferación celular. Vacunación, de acuerdo con la presente invención puede comprender la administración de un compuesto inmunogénico a un individuo con el objetivo de estimular una respuesta inmune dirigida contra dicho compuesto inmunogénico y por lo tanto la inmunización de dicho individuo contra dicho compuesto inmunogénico. Estimular una respuesta inmune puede comprender la inducción de la producción de anticuerpos contra dicho compuesto así como también estimular células T citotóxicas. Con el objetivo de vacunación, pueden administrarse los polipéptidos, ácidos nucleicos y agentes de unión de acuerdo con la presente invención en una forma fisiológicamente aceptable. La composición a administrar a individuos puede comprender uno o más componentes antigénicos, sustancias vehículo o soluciones tampón fisiológicamente aceptables, inmunoestimulantes y/o adyuvantes. Los adyuvantes pueden comprender por ejemplo el adyuvante incompleto de Freund o el adyuvante completo de Freund u otros adyuvantes conocidos por los expertos en la técnica.

La composición puede administrarse en una manera aplicable tal como por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular, etc. La dosificación de la composición depende del caso particular y objetivo de la vacunación. Debe adaptarse a parámetros del individuo tratado tales como la edad, peso, sexo, etc. Además, debe tenerse en cuenta el tipo de respuesta inmune provocada. En general, puede resultar de preferencia si un individuo recibe 100 \mug - 1 g de un polipéptido de acuerdo con la presente invención o una multiplicidad de infección (MOI) de 10^{6} - 10^{12} de un ácido nucleico recombinante, que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en una forma que puede expresarse in situ.

Los individuos para el objetivo de vacunación pueden ser cualquier organismo que contiene los polipéptidos y/o polinucleótidos asociados a tumores de la invención y que son capaces de verse afectados por trastornos proliferativos celulares.

La vacunación de individuos puede ser favorable por ejemplo en el caso de secuencias o estructuras de tipo no salvaje, alteradas de células marcadoras asociadas con trastornos proliferativos celulares. En una forma de realización de la invención puede aplicarse vacunación en casos en los que las estructuras cuaternarias de tipo no salvaje de ADNasa Xs que aparecen en carcinomas y en sus lesiones precursoras, no están presentes en el tejido de tipo salvaje.

Los polipéptidos descritos en este documento pueden también usarse en inmunoterapia adoptiva para el tratamiento del cáncer. La inmunoterapia adoptiva puede clasificarse groseramente en inmunoterapia activa o pasiva. En la inmunoterapia activa, el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del huésped para que reaccione contra tumores con la administración de agentes que modifican la respuesta inmune (por ejemplo vacunas tumorales, adyuvantes bacterianos, y/o citocinas).

En la inmunoterapia pasiva, el tratamiento incluye la administración de reactivos biológicos con reactividad inmune tumoral establecida (tal como células efectoras o anticuerpos) que pueden directa o indirectamente mediar los efectos antitumorales y que no necesariamente dependen de un sistema inmune intacto del huésped. Los ejemplos de células efectoras incluyen linfocitos T (por ejemplo, linfocitos T citotóxicos CD8+, T ayudantes CD4+, linfocitos infiltrados tumorales), células asesinas (tales como células Natural Killer, células asesinas activadas por linfoquinas), células B, o células presentadoras de antígenos (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan los antígenos descritos. Los polipéptidos descritos en este documento pueden usarse también para generar anticuerpos o anticuerpos anti-idiotípicos (como en la Patente de EEUU Nº 4.918.164), para inmunoterapia pasiva.

El procedimiento predominante para procurar el número adecuado de células T para inmunoterapia adoptiva es el cultivo in vitro de células T inmunes. Las condiciones de cultivo para la expansión de células T únicas específicas de antígeno hasta varios billones con retención del reconocimiento de antígeno in vivo son bien conocidas en la técnica. Estas condiciones de cultivo in vitro típicamente usan estimulación intermitente con antígenos, frecuentemente en presencia de citocinas, tales como IL-2, y células alimentadoras que no se dividen. Como se indicó anteriormente, los polipéptidos inmunorreactivos descritos en este documento pueden usarse para expandir rápidamente cultivos de células T específicas de antígeno para generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, pueden pulsarse células presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas, macrófagos o células B con polipéptidos inmunorreactivos o pueden transferirse con una secuencia(s) de ácido nucleico usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden transferirse células presentadoras de antígeno con una secuencia de ácido nucleico, en las que dicha secuencia contiene una región promotora adecuada para aumentar la expresión, y puede expresarse como parte de un virus recombinante u otro sistema de expresión. Para que las células T cultivadas sean eficaces en el tratamiento, las células T cultivadas deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y de sobrevivir un largo tiempo in vivo. Los estudios han demostrado que puede inducirse a las células T cultivadas para que crezcan in vivo y para que sobrevivan un largo tiempo en un número sustancial mediante la estimulación reiterada con antígeno suplementado con IL-2 (ver, por ejemplo, Cheever, M., y col., "Therapy With Cultured T Cells: Principles Revisited", Immunological Reviews, 157:177, 1997).

Los polipéptidos de ADNasa X usados en este documento pueden también usarse para generar y/o aislar células T reactivas de tumores, que pueden administrarse al paciente. En una técnica, pueden generarse líneas de células T específicas de antígeno por inmunización in vivo con péptidos cortos que corresponden a porciones inmunogénicas de los polipéptidos descritos. Los clones de CTL CD8+ específicos de antígeno pueden aislarse del paciente, expandirse usando técnicas de cultivo tisular, y devolverse al paciente.

Como alternativa, los péptidos que corresponden a porciones inmunogénicas de los polipéptidos de ADNasa X usados de acuerdo con la invención pueden usarse para generar subseries de células T reactivas de tumor mediante la estimulación selectiva in vitro y expansión de células T autólogas para proporcionar células T específicas de antígeno que pueden posteriormente transferirse al paciente como describieron, por ejemplo Chang y col. (Crit. Rev. Oncol. Hematol., 22(3), 213, 1996). Las células del sistema inmune, tales como células T, pueden aislarse de la sangre periférica de un paciente, usando sistemas de separación celular disponibles comercialmente, tales como el sistema CEPRATE^{TM} de CellPro Incorporated (Bothell, Wash.), (ver las Patentes de EEUU Nº 5.240.856; 5.215.926; los documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Las células separadas son estimuladas con uno o más polipéptidos inmunorreactivos contenidos dentro de un vehículo de administración, tal como una microesfera, para proporcionar células T específicas de antígeno. A continuación se expande la población de células T específicas de antígeno tumoral usando técnicas convencionales y se administran las células de nuevo al paciente.

En otra forma de realización, las células T y/o los receptores de anticuerpo específicos para los polipéptidos pueden clonarse, expandirse y transferirse en otros vectores o células efectoras para uso en inmunoterapia adoptiva.

En otra forma más de realización, pueden pulsarse células dendríticas singenéicas o autólogas con péptidos que corresponden con al menos una porción inmunogénica de un polipéptido descrito en este documento. Las células dendríticas específicas de antígeno resultantes pueden transferirse dentro de un paciente, o usarse para estimular células T para proporcionar células T específicas de antígeno, que pueden, a su vez, administrarse a un paciente. El uso de células dendríticas pulsadas con péptidos para generar células T específicas de antígeno y el posterior uso de tales células T específicas de antígeno para erradicar tumores en un modelo murino ha sido demostrado por Cheever y col., Immunological Reviews, 157:177, 1997.

Estos carcinomas y sus lesiones precursoras de acuerdo con la presente invención comprenden condiciones caracterizadas por propiedades de crecimiento anormal de células o tejidos en comparación con las propiedades de crecimiento de células o tejidos normales de control. El crecimiento de las células o tejidos puede por ejemplo acelerarse anormalmente o puede regularse anormalmente. La regulación anormal como se usa anteriormente puede comprender cualquier forma de presencia o ausencia de respuestas de tipo no salvaje de las células o tejidos frente a influencias reguladoras del crecimiento que se presentan naturalmente. Las anormalidades en el crecimiento de células o tejidos pueden por ejemplo ser neoplásicas o hiperplásicas.

Los trastornos caracterizados por la proliferación celular anormal, como se usa en el contexto de la presente invención, pueden comprender por ejemplo neoplasmas tales como tumores benignos o malignos, carcinomas, sarcomas, leucemias, linfomas o displasias. Los tumores pueden comprender tumores de la cabeza y del cuello, tumores del tracto respiratorio, tumores del tracto gastrointestinal, tumores del sistema urinario, tumores del sistema reproductor, tumores del sistema endocrino, tumores del sistema nervioso central y periférico, tumores de la piel y sus apéndices, tumores de los tejidos blandos y de huesos, tumores del sistema linfopoyético y hematopoyético, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer anogenital, etc.

En ciertas formas de realización, los trastornos son por ejemplo adenomas o adenocarcinomas del colon, trastornos del tracto respiratorio tales como Carcinoma de Pulmón de Células Escamosas, Carcinoma de Pulmón de Células Pequeñas, Adenocarcinoma de Pulmón, Carcinoma de Pulmón de Células Grandes, Carcinoma de Pulmón Adenoescamoso, Tumor Carcinoide del Pulmón, Tumor Glandular Bronquial o Mesotelioma (maligno), cáncer anogenital tal como, cáncer cervical, cáncer vulval, cáncer vaginal, cáncer del recto, cáncer del ano y cáncer de pene. En una forma de realización, el trastorno puede ser cáncer de mama.

Además, los vectores que expresan ácidos nucleicos de ADNasa X pueden introducirse en células madre tomadas del paciente y propagarse in vitro para posteriormente realizar el transplante autólogo en el mismo paciente.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra moléculas de ADNasa X pueden usarse como compuestos terapéuticos con el objetivo de disminuir o eliminar tumores en un procedimiento de acuerdo con la presente invención. Los anticuerpos pueden usarse por sí solos (por ejemplo, para inhibir metástasis) o acoplados a uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados al respecto incluyen radionúclidos, inductores de diferenciación, fármacos, toxinas, y derivados de los mismos. Los radionúclidos de preferencia incluyen 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At, y 212Bi. Los fármacos de preferencia incluyen metotrexato, y análogos de pirimidina y purina. Los inductores de diferenciación de preferencia incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas de preferencia incluyen ricina, abrina, toxina diftérica, toxina colérica, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella, y proteína antiviral de Phytolacca.

En una forma de realización de la invención, el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras puede comprender la administración de construcciones antisentido o ribozimas. Los procedimientos para la administración de ribozymas o construcciones antisentido son conocidos por aquellos expertos en la técnica. La administración puede tener lugar como administración de ácidos nucleicos desnudos o como administración de ácidos nucleicos que son adecuados para la expresión in situ de los productos activos relevantes.

En otra forma de realización de la invención, el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras puede comprender la administración de agentes de unión dirigidos contra los polipéptidos de ADNasa X. Estos agentes de unión pueden estar acoplados, por ejemplo a otros compuestos tales como toxinas, enzimas, radioisótopos, etc.

En otra forma de realización de la invención, el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras puede comprender la administración de antagonistas o agonistas de polipéptidos de ADNasa X, de acompañantes de unión de polipéptidos de ADNasa X, de inhibidores o potenciadores de la expresión de los polipéptidos de ADNasa X o de fármacos identificables por medio de ensayos que incluyen la medición de la actividad de los polipéptidos de ADNasa X. Los procedimientos para identificar estas sustancias son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Un ejemplo para un procedimiento para identificar un acompañante de unión de un polipéptido (o polipéptido relacionado) y/o polinucleótido de ADNasa X puede comprender:

(a) poner el polipéptido de ADNasa X de la invención en contacto con un compuesto a seleccionar; y

(b) determinar si el compuesto provoca una actividad del polipéptido.

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Los polipéptidos de ADNasa X pueden usarse para seleccionar proteínas u otros compuestos que se unen a los polipéptidos asociados con lesiones colorrectales de la invención o para seleccionar proteínas u otros compuestos a los que se une el polipéptido asociado con la lesión colorrectal de la invención. La unión del polipéptido de ADNasa X y la molécula puede activar (agonista), aumentar, inhibir (antagonista), o disminuir la actividad del polipéptido de ADNasa X o la molécula unida. Los ejemplos de tales moléculas incluyen anticuerpos, oligonucleótidos, proteínas (por ejemplo, receptores), o moléculas pequeñas.

En una forma de realización, la molécula está estrechamente relacionada con el ligando natural del polipéptido de ADNasa X, por ejemplo, un fragmento del ligando, o sustrato natural, un ligando, un mimético estructural o funcional; ver, por ejemplo, Coligan, Current Protocols in Immunology 1(2) (1991); Capítulo 5. De manera similar, la molécula puede estar estrechamente relacionada con un receptor natural al que se unirá la ADNasa X, o al menos, un fragmento del receptor capaz de ser unido por el polipéptido de ADNasa X (por ejemplo, el sitio activo). En cualquier caso, la molécula puede diseñarse de manera racional usando técnicas conocidas.

De preferencia, la selección de estas moléculas incluye la producción de células adecuadas que expresan el polipéptido de ADNasa X, ya sea como una proteína secretada o en la membrana celular. Las células de preferencia incluyen células de mamíferos, levaduras, Drosophila, y E. coli. Las células que expresan el polipéptido de la invención asociado con la lesión colorrectal (o membrana celular que contiene el polipéptido expresado) se ponen a continuación en contacto con un compuesto de prueba que contiene potencialmente la molécula para observar la unión, estimulación, o inhibición de la actividad del polipéptido de ADNasa X.

El ensayo puede probar simplemente la unión de un compuesto candidato al polipéptido de ADNasa X, en el que la unión se detecta mediante un marcador, o en un ensayo que incluye la competición con un competidor marcado. Además, el ensayo puede probar si el compuesto candidato da como resultado una señal generada por la unión al polipéptido de ADNasa X.

Como alternativa, el ensayo puede llevarse a cabo usando preparaciones libres de células, polipéptidos/moléculas fijadas a un soporte sólido, bibliotecas químicas, o mezclas de productos naturales. Este ensayo puede también comprender simplemente las etapas de mezclar un compuesto candidato con una solución que contiene la ADNasa X, medir la actividad o unión del polipéptido/molécula de ADNasa X, y comparar la actividad o unión del polipéptido/molécula de ADNasa con un patrón.

De preferencia, un ensayo ELISA puede medir el nivel o la actividad de ADNasa X en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica) usando un anticuerpo monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede medir el nivel de polipéptido de ADNasa X o la actividad uniéndose, directa o indirectamente, al polipéptido de ADNasa X o compitiendo con el polipéptido de ADNasa X por un sustrato. Todos los ensayos anteriores pueden usarse para seleccionar marcadores para diagnóstico o pronóstico y para agentes terapéuticos. Las moléculas descubiertas usando estos ensayos pueden usarse para tratar la enfermedad o para obtener un resultado particular en un paciente (por ejemplo, la eliminación de un tumor epitelial o detener la progresión de crecimiento de un tumor) activando o inhibiendo las moléculas de polipéptidos de ADNasa X. Por otra parte, los ensayos pueden descubrir agentes que pueden inhibir o potenciar la producción de polipéptidos de ADNasa X a partir de células o tejidos adecuadamente manipulados. Por consiguiente, la invención incluye un procedimiento para identificar compuestos para uso en el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras que se unen a polipéptidos de ADNasa X que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto de unión candidato con un polipéptido de ADNasa X; y (b) determinar si se produjo la unión.

Por otra parte, la invención incluye un procedimiento para identificar activadores/agonistas o inhibidores/antago-
nistas del polipéptido de la invención asociado con la lesión colorrectal para uso en el tratamiento de trastornos caracterizados por proliferación celular anormal que comprende las etapas de: (a) incubar un compuesto candidato con un polipéptido de ADNasa X; b) ensayar una actividad biológica de ADNasa X (actividad enzimática u otra), y (c) determinar si se ha alterado una actividad biológica del polipéptido de ADNasa X.

En otra forma de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para identificar y obtener fármacos para el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras que comprende las etapas de:

a. poner una ADNasa o una célula que expresa dicho polipéptido de ADNasa X en presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta

-: a la regulación alterada de la proliferación celular

-: a la actividad alterada de un polipéptido de ADNasa X

-: a la diferenciación celular alterada,

en contacto con dicho fármaco candidato a ser seleccionado bajo condiciones que permitan la degradación proteica, y

b. detectar la presencia o ausencia de una señal o aumento de la señal generada por la actividad del polipéptido de ADNasa X, la proliferación o diferenciación celular, siendo la presencia o aumento de la señal indicativo para un supuesto fármaco.

Pueden usarse experimentos que usan células aisladas o líneas celulares para examinar el comportamiento de células o tejidos dependiente de la acción del polipéptido de ADNasa X. Pueden usarse los mismos procedimientos para el estudio de la diferenciación celular.

El fármaco candidato puede ser un compuesto único o una pluralidad de compuestos. El término "pluralidad de compuestos" en un procedimiento de la invención se entenderá como una pluralidad de sustancias que pueden o no ser idénticas.

Dicho compuesto o pluralidad de compuestos pueden sintetizarse químicamente o producirse microbiológicamente y/o comprender, por ejemplo, muestras, por ejemplo extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dicho(s) compuesto(s) pueden ser conocidos en la técnica pero hasta la fecha no se sabe que sean capaces de suprimir o activar un polipéptido de ADNasa X. La mezcla de reacción puede ser un extracto libre de células o puede comprender un cultivo celular o tisular. Las formas adecuadas para realizar el procedimiento de la invención son conocidas por los expertos en la técnica y están descritas en general, por ejemplo en Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, tercera edición (1994) y en los ejemplos añadidos. La pluralidad de compuestos pueden por ejemplo agregarse a la mezcla de reacción, medio de cultivo, inyectarse en una célula o aplicarse de otra manera al animal transgénico. La célula o tejido que puede usarse en el procedimiento de la invención de preferencia es una célula huésped, célula de mamífero o un animal transgénico no humano de la invención descritos en las formas de realización anteriores.

Si se identifica una muestra que contiene un compuesto o una pluralidad de compuestos en el procedimiento de la invención, entonces es posible aislar el compuesto desde la muestra original identificada como que contiene el compuesto capaz de suprimir o activar un polipéptido de ADNasa X, o se puede subdividir además la muestra original, por ejemplo, si está constituida por una pluralidad de compuestos deiferentes, para reducir el número de sustancias diferentes por muestra y repetir el procedimiento con las subdivisiones de la muestra original. Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo varias veces, de preferencia hasta que la muestra identificada de acuerdo con el procedimiento de la invención sólo comprende un número limitado o sólo una sustancia(s). De preferencia dicha muestra comprende sustancias con propiedades químicas y/o físicas similares, y de mayor preferencia dichas sustancias son idénticas.

Los expertos en la técnica conocen varios procedimientos para producir y seleccionar grandes bibliotecas para identificar compuestos que tienen afinidad específica por un objetivo. Estos procedimientos incluyen el procedimiento de presentación de fagos en el que se presentan péptidos aleatorios del fago y se seleccionan por cromatografía de afinidad a un receptor inmovilizado; ver, por ejemplo los documentos WO 91/17271, WO 92/01047, US-A-5,223,409. En otro enfoque, se sintetizan bibliotecas combinatorias de polímeros inmovilizados en un chip usando fotolitografía; ver, por ejemplo, la patente de EEUU Nº 5.143.854, y los documentos WO 90/15070 y WO 92/10092. Se ponen en contacto los polímeros inmovilizados con un receptor marcado y se explora la presencia del marcador para identificar polímeros unidos al receptor.

La síntesis y selección de bibliotecas de péptidos en soportes continuos de membrana de celulosa que pueden usarse para identificar ligandos de unión del polipéptido de ADNasa X y por lo tanto posibles inhibidores y activadores están descritos, por ejemplo, en Kramer, Methods Mol. Biol. 87 (1998), 25-39. Este procedimiento puede usarse también, por ejemplo, para determinar los sitios de unión y los motivos de reconocimiento en los polipéptidos de ADNasa X. De igual manera, se determinó la especificidad de sustrato del chaperón DnaK y los sitios de contacto entre interleucina 6 humana y su receptor; ver Rudiger, EMBO J. 16 (1997), 1501-1507 y Weiergraber, FEBS Lett. 379 (1996), 122-126, respectivamente.

Además, los procedimientos mencionados anteriormente pueden usarse para la construcción de supertopes de unión derivados del polipéptido de la invención. Un enfoque similar se describió exitosamente para antígenos peptídicos del anticuerpo monoclonal anti-p24 (VIH-1); ver Kramer, Cell 91 (1997), 799-809. En Kramer, Mol. Immunol. 32 (1995), 459-465 se describe una vía general para análisis de huella digital de interacciones péptido-anticuerpo usando la biblioteca de péptidos de aminoácidos agrupada. Además, los antagonistas de la ADNasa X pueden derivarse e identificarse a partir de anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con el polipéptido de la invención de acuerdo con los procedimientos descritos en Doring, Mol. Immunol. 31 (1994), 1059-1067.

Más recientemente, el documento WO 98/25146 describió además procedimientos para seleccionar bibliotecas de complejos para compuestos que tienen una propiedad deseada, especialmente, la capacidad de actuar como agonistas, unirse a, o antagonizar un polipéptido de ADNasa X o su receptor celular. Los complejos en tales bibliotecas comprenden un compuesto bajo prueba, un marcador que registra al menos una etapa en la síntesis del compuesto, y una cadena susceptible de modificación por una molécula informadora. La modificación de la cadena se usa para significar que un complejo contiene un compuesto que tiene una propiedad deseada. El marcador puede decodificarse para revelar al menos una etapa en la síntesis de tal compuesto. Otros procedimientos para identificar compuestos que interactúan con los polipéptidos de ADNasa X o moléculas de ácidos nucleicos de ADNasa X que codificar tales moléculas son, por ejemplo, la selección in vitro con el sistema de presentación de fagos así como los ensayos de unión con filtros o la medición "en tiempo real" de la interacción usando, por ejemplo el aparato BIAcore (Pharmacia).

Todos estos procedimientos pueden usarse de acuerdo con la presente invención para identificar activadores/agonis-
tas e inhibidores/antagonistas del polipéptido de ADNasa X o polipéptido relacionado, de la presente invención.

Pueden usarse diversas fuentes para la estructura básica de tal activador o inhibidor y comprenden, por ejemplo, análogos miméticos del polipéptido de la invención. Los análogos miméticos del polipéptido de ADNasa X de la invención o los fragmentos biológicamente activos del mismo pueden generarse mediante, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos que se espera sean esenciales para la actividad biológica con, por ejemplo, estereoisómeros, es decir D-aminoácidos; ver por ejemplo, Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-3541. Además, en caso de usar fragmentos para diseñar promiméticos análogos biológicamente activos pueden incorporarse componentes en un péptido para reestablecer al menos algunas de las propiedades conformacionales que pudieran haberse perdido tras la eliminación de parte del polipéptido original; ver, por ejemplo, Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359-370.

Además, el polipéptido de ADNasa X puede usarse para identificar péptidos miméticos químicos sintéticos que se unen o pueden funcionar como un ligando, sustrato, acompañante de unión o receptor del polipéptido de la invención de manera tan eficaz como el polipéptido natural; ver, por ejemplo, Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284-2292. Por ejemplo, las simulaciones de pliegue y rediseño por ordenador de los motivos estructurales del polipéptido de la invención pueden realizarse usando programas informáticos adecuados (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). La modelación por ordenador del plegamiento proteico puede usarse para el análisis conformacional y energético de los péptidos u modelos de proteínas detallados (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). En particular, pueden usarse los programas adecuados para la identificación de sitios interactivos de los polipéptidos de ADNasa X y sus posibles ligandos u otras proteínas que interaccionan por medio de búsquedas asistidas por ordenador par secuencias de péptidos complementarias (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120. Otros sistemas computados adecuados para el diseño de proteínas y péptidos están descritos en la técnica anterior, por ejemplo en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991.

Los resultados obtenidos mediante los análisis por ordenador descritos anteriormente pueden usarse para, por ejemplo, la preparación de peptidomiméticos de la proteína de ADNasa X o fragmentos de los mismos. Tales análogos pseudopéptidos de la secuencia natural de aminoácidos pueden imitar muy eficazmente a la proteína relacionada (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218-33224). Por ejemplo, la incorporación de restos aminoácido fácilmente disponibles en una proteína de la invención o un fragmento de los mismos da como resultado la sustitución de enlaces amida por unidades polimetileno de una cadena alifática, proporcionando así una estrategia conveniente para construir un peptidomimético (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769-777).

Los análogos peptidomiméticos superactivos de hormonas peptídicas pequeñas en otros sistemas están descritos en la técnica anterior (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996), 327-331). Los peptidomiméticos adecuados de la proteína de la presente invención pueden identificarse por medio de la síntesis de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos a través de amidoalquilación sucesiva y probando los compuestos resultantes, por ejemplo, en cuanto a sus propiedades de unión e inmunológicas. Los procedimientos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715.

Además, puede usarse una estructura tridimensional y/o cristalográfica del polipéptido de ADNasa X para diseñar inhibidores de peptidomiméticos con actividad biológica del polipéptido de la invención (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

El diseño y síntesis de moléculas sintéticas de bajo peso molecular que imitan la actividad del polipéptido biológicamente nativo basado en la estructura está descrito además en, por ejemplo, Dowd, Nature Biotechnol. 16 (1998), 190-195; Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8 (1997), 435-441; Moore, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 115-119; Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40 (1997), 121-125; Mukhija, European J. Biochem. 254 (1998), 433-438.

Los expertos en la técnica conocen también la posibilidad de diseñar, sintetizar y evaluar miméticos de compuestos orgánicos pequeños que, por ejemplo, pueden actuar como sustrato o ligando para los polipéptidos de ADNasa X usados en la invención o el péptido relacionado. Por ejemplo, se ha descrito que miméticos de D-glucosa de hapalosina exhibieron eficacia similar a hapalosina para antagonizar proteínas asociadas a asistencia con resistencia multifármaco en citotoxicidad; ver Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998), 981-987.

La molécula de ácido nucleico de ADNasa X puede también servir como diana para activadores e inhibidores. Los activadores pueden comprender, por ejemplo, proteínas que se unen al ARNm de un gen que codifica un polipéptido de ADNasa X, estabilizando de esta manera la conformación nativa del ARNm y facilitando la transcripción y/o traducción, por ejemplo de una manera tal que la proteína Tat actúa en ARN-VIH. Además, en la bibliografía están descritos los procedimientos para identificar moléculas de ácidos nucleicos tales como un fragmento de ARN que imita la estructura de una molécula diana de ARN definida o indefinida a la que se une un compuesto dentro de una célula dando como resultado el retraso del crecimiento celular o la muerte celular; ver, por ejemplo, el documento WO 98/18947 y las referencias citadas en el mismo. Estas moléculas de ácido nucleico pueden usarse para identificar compuestos desconocidos de interés farmacéutico y/o agrícola, y para identificar dianas de ARN desconocidas para uso en el tratamiento de una enfermedad. Estos procedimientos y composiciones pueden usarse en la selección de nuevos antibióticos, bacteriostáticos, o modificaciones de los mismos o para identificar compuestos útiles para alterar los niveles de expresión de proteínas codificadas por una molécula de ácido nucleico.

Como alternativa, puede usarse por ejemplo la estructura conformacional del fragmento de ARN que imita el sitio de unión en un diseño racional de fármacos para modificar antibióticos conocidos para hacer que se unan con más avidez a la diana. Uno de tales procedimientos es la resonancia magnética nuclear (RMN), que es útil para identificar fármacos y estructuras conformacionales de ARN. Otros procedimientos más son, por ejemplo, los procedimientos de diseño de fármacos descritos en los documentos WO 95/35367, US-A-5,322,933, en los que puede deducirse la estructura cristalina del fragmento de ARN y se utilizan programas informáticos para diseñar nuevos compuestos de unión que pueden actuar como antibióticos.

Algunos cambios genéticos llevan a estados conformacionales de proteínas alterados. Por ejemplo, algunos mutantes de polipéptidos asociados con lesión colorrectal de la invención pueden poseer una estructura terciaria que provoca que sean mucho menos capaces de sufrir degradación proteica. Restaurar la conformación normal o regulada de las proteínas mutantes es el medio más elegante y específico para corregir estos defectos moleculares, aunque puede resultar difícil. Al respecto, es de particular interés el dominio de consenso del polipéptido asociado a lesión colorrectal de la invención.

Los compuestos que pueden probarse e identificarse de acuerdo con los procedimientos de la invención pueden ser bibliotecas de expresión, por ejemplo, bibliotecas de expresión de ADNc, péptidos, proteína, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, hormonas, peptidomiméticos, PNA o similares (Milner, Nature Medicine 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell 79 (1994), 193-198 y las referencias citadas supra). Además, los genes que codifican un regulador supuesto del polipéptido de ADNasa X y/o que ejercen sus efectos secuencia arriba o secuencia abajo del polipéptido de ADNasa X pueden identificarse usando, por ejemplo, mutagénesis de inserción, por ejemplo vectores dirigidos a genes conocidos en la técnica. Dichos compuestos pueden ser también derivados funcionales o análogos de inhibidores o activadores conocidos. Tales compuestos útiles pueden ser por ejemplo fractores de interacción que se unen al polipéptido de la invención asociado al tumor o secuencias reguladoras del gen que lo codifica. La identificación de los factores de interacción puede realizarse usando procedimientos convencionales de la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook, supra, y Ausubel, supra).

Para determinar si una proteína se une a la proteína de ADNasa X o a secuencias reguladoras, pueden realizarse análisis de cambio en gel nativo convencional. Con el objetivo de obtener un factor de interacción que se una a la proteína o secuencia reguladora puede usarse la proteína o la secuencia reguladora como un reactivo de afinidad en procedimientos convencionales de purificación de proteínas, o como una sonda para seleccionar una biblioteca de expresión.

La identificación de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que interactúan con la ADNasa de la invención descrita anteriormente puede también lograrse, por ejemplo, como describe Scofield (Science 274 (1996), 2063-2065) mediante el uso del llamado "sistema de dos híbridos" en levaduras. En este sistema el polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención o una parte más pequeña del mismo se une al dominio de unión a ADN del factor de transcripción GAL4. Una cepa de levadura que expresa este polipéptido de fusión y que comprende un gen informador lacZ guiado por un promotor adecuado, que es reconocido por el factor de transcripción GAL4, es transformado con una biblioteca de ADNc que expresará proteínas o péptidos de plantas de los mismos fusionados con un dominio de activación. Por lo tanto, si un péptido codificado por uno de los ADNc es capaz de interactuar con el péptido de fusión que comprende un péptido de un polipéptido de ADNasa X de la invención, el complejo es capaz de dirigir la expresión del gen informador. De esta manera las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la invención y el péptido codificado pueden usarse para identificar péptidos y proteínas que interaccionan con la proteína de ADNasa X. Resulta evidente para el experto en la técnica que éste y otros sistemas similares pueden posteriormente explotarse más para la identificación de inhibidores de unión de proteínas de
ADNasa X.

Una vez que se identifica el factor de interacción, puede investigarse la modulación de su unión al polipéptido de ADNasa X o la regulación de la expresión, comenzando con, por ejemplo, la selección de inhibidores contra la unión del factor de interacción con la proteína de ADNasa X de la presente invención. A continuación puede lograrse la activación o represión de las proteínas de ADNasa X de la invención en animales aplicando el factor de interacción (o su inhibidor) o el gen que lo codifica, por ejemplo en un vector de expresión. Además, si la forma activa del factor de interacción es un dímero, podrán conseguirse mutantes negativos dominantes con el objetivo de inhibir su actividad.

Además, tras la identificación del factor de interacción, pueden identificarse otros componentes en la vía que conduce a la activación (por ejemplo la transducción de señales) o represión de un gen involucrado en el control del polipéptido de la invención asociado al tumor. A continuación puede investigarse la modulación de las actividades de estos componentes, con el objetivo de desarrollar fármacos adicionales y procedimientos para modular el metabolismo de la degradación de proteínas en animales. Por lo tanto, la presente invención también se refiere al uso del sistema de dos híbridos como se definió anteriormente para la identificación del polipéptido de la invención asociado al tumor o activadores o inhibidores del polipéptido de ADNasa X de la invención.

Los compuestos aislados mediante los procedimientos anteriores sirven también como compuestos líderes para el desarrollo de compuestos análogos. Los análogos deberán tener una configuración electrónica estabilizada y conformación molecular que permita la presentación de grupos funcionales clave al polipéptido de ADNasa X o su posible receptor en sustancialmente la misma forma que el compuesto líder. En particular, los compuestos análogos tienen propiedades electrónicas espaciales comparables con la región de unión, pero pueden ser moléculas más pequeñas que el compuesto líder, que tienen frecuentemente un peso molecular inferior a 2 kD y de preferencia inferior a aproximadamente 1 kD.

La identificación de compuestos análogos puede realizarse a través del uso de técnicas tales como análisis de datos autoconsistentes (SCF), análisis de interacción de configuración (CI), y análisis dinámico en modo normal. Los programas informáticos para implementar estas técnicas están disponibles; por ejemplo, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions (Alan Liss, New York, 1989). Los procedimientos para la preparación de derivados químicos y análogos son bien conocidos por los expertos en la técnica y están descritos en, por ejemplo, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edición Nueva York Inc., 175 Fifth Avenue, Nueva York, N.Y. 10010 EEUU y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, EEUU. Además, dichos derivados y análogos pueden probarse para observar sus efectos de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica; ver también supra. Además, pueden usarse peptidomiméticos y/o derivados adecuados diseñados con asistencia de ordenador, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.

En una forma de realización de los procedimientos de la invención descritos anteriormente, dicha célula es una célula de, u obtenida por un procedimiento de la invención o está comprendida en el animal no humano transgénico descrito anteriormente.

Una vez que se ha identificado y obtenido el compuesto descrito, se proporciona de preferencia en una forma terapéuticamente aceptable.

Debe entenderse, que los compuestos y procedimientos descritos a lo largo de este texto son aplicables a cualquier individuo mamífero. Por lo tanto los compuestos y procedimientos pueden aplicarse a animales así como a seres humanos y son útiles en medicina veterinaria como en objetivos médicos. Los animales que pueden ser de especial interés con respecto a la presente invención son animales de compañía, tales como gatos, perros, etc. animales de interés agrícola tales como vacas, cerdos, caballos, animales de laboratorio tales como ratas, ratones, cobayas, conejos, etc. y cualquier otro animal, que pueda estar afectado por un trastorno caracterizado por el crecimiento celular anormal.

La presente invención proporciona compuestos y procedimientos útiles para la detección y el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras. En un aspecto la presente invención proporciona un procedimiento para la detección de carcinomas y sus lesiones precursoras basado en la determinación de la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión de moléculas de ADNasa X en muestras biológicas. Este procedimiento de detección puede por ejemplo usarse en el curso de la detección temprana de neoplasias y etapas precursoras de tumores. En un segundo aspecto la presente invención proporciona un procedimiento para el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras para la modulación de productos de genes de ADNasa X como agentes terapéuticamente activos. La invención también proporciona procedimientos terapéuticos basados en la modulación de la actividad de polipéptidos de ADNasa X. Es un aspecto de la invención proporcionar un procedimiento para el manejo racional de tumores basado en la detección de productos de genes de ADNasa X en muestras de pacientes y la confección de un tratamiento correlacionado con la sobre expresión detectada de dichos productos de genes de ADNasa X. Además la presente invención proporciona un equipo de investigación o de diagnóstico para realizar las reacciones incluidas en la detección de la presencia o ausencia y/o el nivel de sobre expresión de genes de ADNasa X. Finalmente la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas aplicables en el tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras que comprenden compuestos de ADNasa X como se describieron en este documento.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Espécimen Inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; A: carcinoma de colon; B: tejido normal correspondiente; se sometió el espécimen de carcinoma de colon así como el tejido normal a una reacción de tinción inmunoquímica usando un anticuerpo primario dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; en el tejido normal, las células endocrinas intraepiteliales muestran inmunorreactividad para ADNasa X en el citoplasma; para los detalles experimentales ver el
Ejemplo 1.

Figura 2: Espécimen inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; A: carcinoma gástrico; B: tejido normal correspondiente; se sometió un espécimen de carcinoma gástrico así como el correspondiente tejido normal a una reacción de tinción inmunoquímica usando un anticuerpo primario dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; en el tejido normal, las células endocrinas glandulares muestran inmunorreactividad para ADNasa X en el citoplasma; para los detalles experimentales ver el Ejemplo 1.

Figura 3: Espécimen inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; se sometió un espécimen de carcinoma de pulmón a una reacción de tinción inmunocitoquímica usando un anticuerpo primario dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; para detalles experimentales ver el Ejemplo 1.

Figura 4: Espécimen inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; A: adenocarcinoma en la unión gastroesofágica; B: tejido esofágico normal correspondiente; se sometió un espécimen de carcinoma esofágico así como el tejido normal correspondiente a una reacción de tinción inmunoquímica usando un anticuerpo primario dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; no se observa tinción en el tejido normal; para detalles experimentales ver el Ejemplo 1.

Figura 5: Espécimen inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; se sometió un espécimen de displasia cervical (CINIII) a una reacción de tinción inmunoquímica usando un anticuerpo primario dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; para detalles experimentales ver el Ejemplo 1.

Figura 6: Espécimen inmunohistológico teñido con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X; se sometió un carcinoma canalicular in situ a una reacción de tinción inmunoquímica usando un anticuerpo dirigido contra ADNasa X; la figura muestra tinción nuclear positiva para ADNasa X en las células tumorales; el tejido normal circundante no muestra tinción para ADNasa X; para detalles experimentales ver el Ejemplo 1.

Los siguientes ejemplos se brindan sólo con finalidad ilustrativa y no tienen la intención de limitar el alcance de la invención descrita en este documento.

Ejemplo 1

Detección inmunoquímica de la sobre expresión de ADNasa X en muestras de tejido de carcinomas

Se tiñeron secciones de muestras de tejido del colon incluidas en parafina, fijadas con formalina usando anticuerpos específicos para ADNasa X.

Se rehidrataron las secciones incubando en xileno y etanol graduado, y se transfirieron a agua bidestilada. La Recuperación de Antígeno se llevó a cabo con tampón citrato 10 mM (pH 6,0). Por consiguiente se calentaron los portaobjetos en un baño de agua durante 40 minutos a 95ºC. Se enfriaron los portaobjetos hasta TA durante 20 minutos y se transfirieron al tampón de lavado (PBS/Tween20 al 0,1%).

Para la inactivación de la peroxidasa endógena se incubaron las muestras con H_{2}O_{2} al 3% durante 20 minutos a TA y a continuación se lavaron con PBS/Tween20 al 0,1% durante 5 a 10 minutos.

Posteriormente se incubaron los portaobjetos con el anticuerpo primario, anti-ADNasa X de rata (1:25) (durante 1 hora a TA, a continuación se aclararon los portaobjetos con un tampón de lavado y se colocaron en un baño con tampón fresco durante 5 minutos. El anticuerpo usado está dirigida contra la secuencia peptídica

c a s l t k k r l d k l e l r t e p g f

de ADNasa X humana.

Posteriormente se incubaron los portaobjetos con el anticuerpo secundario (anti rata de cabra (1:500)). El lavado se realizó 3 veces durante 5 minutos. Se eliminó el exceso de tampón y se cubrió el espécimen con 100 \mul de reactivo de visualización durante 30 minutos a TA. Se lavaron los portaobjetos como anteriormente, se cubrieron con 200 \mul de solución de sustrato cromogénico (DAB) durante 10 minutos. Se lavaron los portaobjetos como anteriormente y se contratiñó durante 3 minutos en un baño de hematoxilina. Se aclaró la hematoxilina residual con agua destilada y se montaron los especímenes y se cubrieron con cubreobjetos con un medio de montaje acuoso.

El examen microscópico de los portaobjetos revela, que pueden encontrarse células inmunorreactivas para
ADNasa X en las muestras, que pueden identificarse microscópicamente como muestras de carcinoma colorrectal. En carcinomas, la tinción específica para ADNasa X se concentra en el núcleo celular. En contraste, en las muestras de control pudieron teñirse muy pocas células. En todas las células no cancerosas la tinción es citoplasmática, mientras que en células de carcinomas y sus lesiones precursoras, la tinción tiene localización nuclear. Especialmente en tejidos gastrointestinales las células endocrinas muestran tinción citoplasmática para ADNasa X. Ninguna otra célula de tejidos gastrointestinales puede teñirse. En otros tejidos probados no hay tinción positiva. En estos casos la tinción se localiza en el citoplasma de las células.

El procedimiento de tinción inmunohistoquímica descrito anteriormente se aplicó además a tejidos de carcinomas de mama, pulmón, cervical (CINIII), gástrico, esofágico, endometrial y de ovario. En todos estos casos pudo observarse tinción nuclear para ADNasa X en las células cancerosas. En el tejido normal se identificó muy poca o ninguna tinción.

Además se analizaron metástasis de carcinoma colorrectal localizadas en el hígado por medio de procedimientos inmunoquímicos como los descritos anteriormente. El resultado mostró tinción nuclear en las células tumorales y ninguna tinción en el tejido normal circundante.

El análisis inmunoquímico de sangre periférica venosa, médula ósea y linfocitos por medio de los procedimientos descritos no reveló inmunorreactivodad para ADNasa X en muestras obtenidas de individuos normales de control. Esto indica, que las células tumorales diseminadas que son inmunorreactivas con ADNasa X podrían identificarse en estas muestras mediante tinciones inmunoquímicas específicas con anticuerpos dirigidos contra ADNasa X.

Los resultados muestran, que la tinción con reactivos específicos para ADNasa X permite identificar carcinomas en muestras biológicas. En carcinomas y sus lesiones precursoras hay tinción nuclear para ADNasa X con el anticuerpo usado, mientras que en tejido normal sólo pueden teñirse muy pocas células en el citoplasma.

Ejemplo 2

Detección de células tumorales diseminadas en ganglios linfáticos de individuos

Se usaron muestras de ganglios linfáticos de pacientes obtenidas en el curso de la resección quirúrgica de adenocarcinomas del colon para determinar la presencia de células que muestran inmunorreactividad con agentes de unión específicos de ADNasa X. En total se incluyeron muestras de 7 pacientes con carcinomas de colon.

La tinción inmunohistoquímica se realizó como en el Ejemplo 1.

El experimento reveló que la tinción con el anticuerpo dirigido contra ADNasa X puede detectarse en muestras de pacientes con carcinoma.

Una tinción inmunohistoquímica para ADNasa X en las muestras puedo mejorar la detectabilidad de células tumorales diseminadas en el tejido linfático.

Ejemplo 3

Diagnóstico Temprano de carcinoma canalicular in situ por detección de ADNasa X en células contenidas en fluido de lavado canalicular

En este estudio se incluyó un colectivo de 14 individuos. Se identificaron 7 pacientes con calcificaciones en conductos mamarios indicativos de estadío temprano de carcinoma canalicular in situ por examen por mamografía. 7 individuos no mostraron signos indicativos de lesión neoplásica de mama.

Se realizaron lavados canaliculares con los 14 individuos y se aislaron células del fluido de lavado.

Se realizaron preparaciones citológicas a partir de los fluidos de lavado por medio de tecnología ThinPrep TM. Se realizó la tinción inmunoquímica como se describió en el Ejemplo 1.

El experimento revela la presencia de células inmunorreactivas para ADNasa X en las preparaciones citológicas de 9 individuos. En las muestras de todos los pacientes con un diagnóstico por mamografía indicativo de carcinoma canalicular in situ, pudieron identificarse células inmunorreactivas para ADNasa X.

El resultado muestra, que los procedimientos convencionales para identificación de estadíos tempranos de neoplasias en la mama pueden mejorarse mediante procedimientos basados en la detección de inmunorreactividad para ADNasa X presentados en este documento.

Claims

1. Un procedimiento para el diagnóstico de carcinomas y sus lesiones precursoras y/o el pronóstico del curso de enfermedades que comprende:

a) detectar el nivel y/o la localización subcelular de moléculas de ADNasa X en células de una muestra tisular de un individuo;

b) comparar el nivel y/o la localización subcelular de moléculas de ADNasa X dentro de dicha muestra con el contenido dentro de una muestra correspondiente de control, no afectada por la enfermedad que se está probando;

c) en el que el diagnóstico o pronóstico del curso de la enfermedad se predice a partir de considerar un nivel significativamente aumentado con relación al nivel de moléculas de ADNasa X de tipo salvaje en dicha muestra tisular y/o núcleo celular como indicativo de dicho trastorno o del pronóstico del curso de la enfermedad.

2. El procedimiento según la Reivindicación 1, en el que la detección de las moléculas de ADNasa X comprende la detección de la accesibilidad de regiones particulares de las moléculas de ADNasa X.

3. El procedimiento según la Reivindicación 1 ó 2, en el que la muestra se selecciona del grupo que comprende sangre, plasma, suero, licor, linfa, médula ósea, frotis, lavados, secreciones, trasudados, exudados, esputo, heces, orina, semen, muestras de células y tejidos, punciones o biopsias.

4. El procedimiento según una cualquiera de las Reivindicaciones anteriores, en el que el carcinoma se selecciona de un grupo que comprende cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer del tracto respiratorio, cáncer del tracto gastrointestinal, cáncer de la piel y sus apéndices, cáncer del sistema nervioso central y periférico, cáncer del sistema urinario, cáncer del sistema reproductor, cáncer del sistema endocrino, cáncer de tejidos blandos y hueso, cáncer del sistema linfopoyético y hematopoyético, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer cervical, cáncer colorrectal o cáncer anogenital.

5. Un procedimiento según una cualquiera de las Reivindicaciones 1-4, en el que la detección del nivel de las moléculas de ADNasa X se lleva a cabo usando al menos una sonda de unión específica a las moléculas marcadoras a detectar.

6. Un procedimiento según la Reivindicación 5, en el que la sonda está marcada de manera detectable.

7. El procedimiento de la Reivindicación 6, en el que el marcador se selecciona del grupo constituido por un radioisótopo, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto fluorescente, un quelato de metal, una estructura de unión biológicamente relevante tal como biotina o digoxigenina o una enzima.

8. El procedimiento según las Reivindicaciones 5-7, en el que al menos una sonda es un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un peptidomimético que comprende un epítopo de unión al antígeno o un minianticuerpo.

9. El procedimiento según la Reivindicación 8, en el que la detección comprende un procedimiento inmunocitoquímico de detección.

10. El procedimiento según las Reivindicaciones 5-7, en el que al menos una sonda que es un ácido nucleico que hibrida un ácido nucleico marcador se usa para la detección de las moléculas marcadoras de ADNasa X.

11. El procedimiento según la Reivindicación 10, en el que la reacción de detección comprende una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

12. El uso de ADNasa X para detectar e identificar células tumorales, caracterizado porque una cantidad detectable de moléculas de ADNasa X en la muestra de tejido o núcleo celular se considera indicativa de células tumorales.

13. Un procedimiento para identificar y obtener un fármaco candidato para tratamiento de carcinomas y sus lesiones precursoras que comprende las siguientes etapas:

a) poner un polipéptido de ADNasa X o una célula que expresa dicho polipéptido en presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta a la actividad ADNasa X, proliferación celular o diferenciación celular, en contacto con dicho fármaco candidato a ser seleccionado bajo condiciones que permitan la actividad ADNasa X, la proliferación celular o cambios en la diferenciación celular y

b) detectar la presencia o ausencia de una señal o aumento de la señal generada por la actividad ADNasa X, la proliferación celular o diferenciación celular, siendo la presencia o aumento de la señal indicativo para un supuesto fármaco.