ES2286450T3

ES2286450T3 - Proteinas de regulacion del crecimiento.

Info

Publication number: ES2286450T3
Application number: ES03745382T
Authority: ES
Inventors: Ernst Hafen; Hugo Stocker; Pierre Daram; Benno Schindelholz; Sebastian Breuer
Original assignee: Genetics Co Inc; Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Current assignee: Genetics Co Inc; Zurich Universitaet Institut fuer Medizinische Virologie
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2023-03-28
Also published as: EP1487981B1; JP2005537783A; US20050164194A1; EP1487981A2; ATE362533T1; WO2003083113A3; DE60313855T2; US7192706B2; AU2003215857A1; DE60313855D1; WO2003083113A2; CN1646688A

Abstract

Un método in vitro para la identificación de una enfermedad hiperproliferativa o una predisposición genética a la misma, el cual comprende detectar en un fluido corporal o en una muestra de tejido de un individuo un cambio en el nivel de expresión de una proteína de la secuencia Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5 y/o al menos una mutación dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica a dicha proteína o detecta un reordenamiento en el locus genómico que codifica a dicha proteína.

Description

Proteínas de regulación del crecimiento.

Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional estadounidense no. 60/368.457 cuya divulgación se incorpora aquí en su totalidad.

Campo de la técnica

La invención se relaciona con una nueva familia de proteínas que tienen actividad inhibidora del crecimiento y su uso diagnóstico y terapéutico.

Antecedentes en el estado de la técnica

El crecimiento está íntimamente relacionado no solamente con el desarrollo normal sino también con condiciones anormales tales como la génesis de tumores y el cáncer. A pesar de su importancia, sabemos relativamente poco acerca de cómo se regula el crecimiento a nivel celular, a nivel de tejidos y órganos o a nivel del organismo completo. Ya que el crecimiento está normalmente asociado con la multiplicación celular, mucho esfuerzo en comprender los mecanismos que regulan el crecimiento se ha enfocado en los mecanismos de regulación del ciclo celular. En realidad, nuestro conocimiento de cómo progresan las células a través del ciclo celular se ha incrementado sustancialmente (Nurse 2000). La preocupación con el control de la división celular ha conducido a asumir que el crecimiento está regulado por factores que controlan el ciclo celular. Sin embargo, experimentos elegantes en discos relacionados con el insecto Drosophila en su forma adulta, nos recordaron viejos hallazgos en levadura, cuyo crecimiento regula el ciclo celular y no al contrario (Nurse 1975). En los experimentos con Drosophila se observó que acelerando el período del ciclo celular en los clones de las células no estimuló el crecimiento neto de acuerdo a lo medido por el área ocupada por el clon, sino que produjo más células aunque más pequeñas que ocupan la misma área que los clones de control. A la inversa, retrasando el ciclo celular por medio de la sobreexpresión del RBF homólogo de RB que generó células más grandes pero más pocas que nuevamente ocupan la misma área (Neufeld, de la Cruz y colaboradores 1998). Por lo tanto, la comprensión de la regulación del crecimiento durante el desarrollo normal y anormal requiere más que la comprensión del control del ciclo celular. Comprender cómo se regula el crecimiento a nivel celular y del tejido también proveerá nuevos acercamientos y objetivos para la terapia del cáncer. En realidad, los inhibidores que bloquean el crecimiento celular tales como la Rapamicina están actualmente en ensayo clínico como drogas contra el cáncer (Hidalgo y Rowinsky 2000). Existe por lo tanto una necesidad urgente de medios, que permitan el diagnóstico y la terapia en enfermedades hiperproliferativas.

La secuencia de un nuevo miembro (epsina 4) de la familia de las epsinas ha sido publicada en la base de datos EMBL bajo el número d acceso No. AF434813. No se ha divulgado la función de esta secuencia.

Divulgación de la invención

En consecuencia, un objetivo general de la presente invención es la de proveer una proteína que contenga un dominio de ENTH y que tenga actividad inhibidora del crecimiento.

El término dominio de ENTH (dominio de Homología con el NH_{2} Terminal de la Epsina) como se lo utiliza aquí describe a un dominio conservado de una proteína que fue encontrado primero en proteínas de la familia de la epsina. Típicamente, este dominio se localiza en el N-terminal de las proteínas y dicho dominio se caracteriza por 16 residuos absolutamente conservados: N-x(12-13)-V-x2-A-T-x(34-36)-R-x(7-8)-W-R-x3-K-x11-G-x-E-x15 -L-x(10-11)-D-x-G-x3-R-x11-D-x7-R.

En una modalidad preferida dichas proteínas carecen de un dominio de NPF que interactúa con Eps15 y carece de un dominio de DPW que se enlaza al adaptador AP2 de clatrina.

En una modalidad adicional preferida dichas proteínas tienen una secuencia de aminoácidos que es al menos 40%, preferiblemente 50%, más preferiblemente 60%, aún más preferiblemente 80% y lo más preferible 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 (ELP de humano), o la Seq. Id. No. 5 (hELP 18aa) o la Seq. Id. No. 4 (ELP de Drosophila).

En una modalidad preferida particular dicha proteína tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de la Seq. Id. No. 2 (Homo sapiens), de la Seq. Id. No. 4 (Drosophila melanogaster) o la Seq. Id. No. 5 (Homo sapiens h-ELP18aa).

Otro objetivo de la presente invención son las secuencias de ácido nucleico que codifican a una proteína de la presente invención. En una modalidad preferida dicha secuencia de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste de la Seq. Id. No. 1 (h-ELP) y de la Seq. Id. No. 3 (dELP).

Otro objetivo de la presente invención es un método para determinar si un individuo, por ejemplo un paciente humano, está en riesgo de un desorden caracterizado por la proliferación celular no deseada o el control aberrante de la diferenciación.

Otro aspecto de la presente invención proporciona anticuerpos y preparaciones de anticuerpo específicamente reactivos con un epítopo de una proteína tipo epsina.

Otro objetivo de la presente invención es el uso de proteínas y/o ácidos nucleicos de la presente invención para propósitos de terapia génica.

En aún otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de proteínas y/o de ácidos nucleicos de la presente invención para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas tales como por ejemplo cáncer.

La presente invención se relaciona en un aspecto adicional con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína de la presente invención. Típicamente, un vector comprende a las secuencias reguladoras requeridas para lograr la expresión en una célula huésped y puede contener las secuencias necesarias para la replicación del plásmido con el propósito de que exista en un estado episomal, o que pueda ser diseñado para integración cromosomal. El término secuencia reguladora como se la utiliza aquí abarca tanto a la secuencia reguladora nativa de un gen de la presente invención como a secuencias reguladoras heterólogas.

Además, la presente invención provee una célula huésped transformada con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de la presente invención. Cualquier célula huésped que sea capaz de expresar una proteína de la presente invención puede ser utilizada, por ejemplo células bacteriales, de vertebrado y de invertebrado. Dichas células pueden ser utilizadas por ejemplo para la producción de proteínas tipo epsina.

En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona con un método para la producción de proteínas tipo epsina en donde las células huésped adecuadas se transforman con un vector que contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica a una proteína tipo epsina, el cultivo de dichas células huésped bajo condiciones que permitan la expresión de la proteína y el aislamiento de las proteínas tipo epsina producidas. Se puede utilizar cualquier célula huésped que sea capaz de expresar una proteína de la presente invención, por ejemplo células bacteriales, de vertebrados y de invertebrados.

Breve descripción de los dibujos

La invención será mejor entendida y los objetivos diferentes a aquellos expuestos anteriormente se harán claros cuando se considere la siguiente descripción detallada de la misma. Tal descripción hace referencia a los dibujos anexos, en donde:

La Figura 1A muestra una electromicrografía de barrido de un ojo de D. melanogaster de tipo natural como control;

La Figura 1B muestra una electromicrografía de barrido de un ojo compuesto en gran medida conformado por tejido mutante dELP homocigoto. El ojo muestra un incremento dramático de tamaño. La fotografía fue tomada de una hembra del genotipo y w eyflp/y w; FRT82 dELP^{4k2}/FRT82w+ c13R3;

La Figura 2 muestra una alineación de secuencia de dELP (Seq. Id. No. 4) y hELP (Seq. Id. No. 2). Cajas oscuras: residuos idénticos. Cajas grises: residuos conservados;

La Figura 3 muestra una alineación Clustal W de las 2 isoformas h-ELP: h-ELP (Seq. Id. No. 2) (secuencia de la base de datos) y h-ELP18aa (Seq. Id. No. 5) (secuencia de EST). Los aminoácidos idénticos se muestran por medio de asteriscos debajo de la alineación;

La Figura 4A muestra la expresión de los transcritos h-ELP en tejido humano y

La Figura 4B muestra la expresión de los transcritos h-ELP en múltiples líneas celulares. Las transcripciones de Northern (Clonetech) fueron hibridadas con una sonda h-ELP marcada con ^{32}P (nucleótidos 751 a 1951). La hibridación fue con ExpressHyb (Clonetech) a 68ºC con un lavado final utilizando 0,1 x SSC y 0,1% de SDS a 68ºC durante 10 minutos.

La Figura 5 muestra la expresión del transcrito hELP. Las membranas de Cancer Profiling Array (catálogo 7841-1 de BD Biosciences) fueron hibridadas con una sonda hELP marcada 5' (nucleótidos 751 a 1951). La hibridación se llevó a cabo a 68ºC, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante con un lavado final utilizando 0,2 x SSC y 0,5% de SDS a 68ºC durante 15 minutos. Para la referencia de la muestra ver el catálogo de BD Bioscience.

La Figura 6 muestra los fenotipos de crecimiento causados por la sobreexpresión de delp en el ojo y en el ala en moscas adultas. A) La sobreexpresión de dELP en el ojo en desarrollo induce los fenotipos de inhibición del crecimiento en el ojo del adulto, mientras que la sobreexpresión en el ala conduce a una severa reducción en el tamaño del ala, lo cual puede involucrar también igualmente efectos apoptóticos. B) y D) líneas UAS delp como control. Genotipos: A) y w UAS-delp 3.15; eyGal4/+ B) y w UAS-delp 3.15; +/+ C) y w MS 1096/UAS-delp 3.15 D) y w 3.15 UAS-delp; +/+; MKRS/TM3.

Formas de llevar a cabo la invención

Para identificar los genes específicamente involucrados en el crecimiento a nivel celular, de tejido y de organismo, los inventores escogieron una aproximación genética en Drosophila. Ellos llevaron a cabo una amplia selección del genoma por las mutaciones recesivas que interfieren o promueven el crecimiento celular sin afectar la diferenciación celular. Estas selecciones se llevaron a cabo tomando ventaja de un sistema de recombinación específico para el tejido (Newsome, Asling y colaboradores 2000) que genera moscas genéticamente mosaico. Estas moscas son homocigotos para mutaciones inducidas en forma aleatoria en el tejido de la cabeza pero homocigotos para la misma mutación en el cuerpo y en la línea germinal. Las mutaciones en los genes cuyos productos promueven selectivamente el crecimiento (oncogenes potenciales) producirán moscas con cabezas pequeñas mientras que las mutaciones en los genes cuyos productos ejercen una función de inhibición en el crecimiento (genes potenciales supresores del tumor) dan como resultado moscas con cabezas más grandes de lo normal. La validez de esta selección para hallar los genes involucrados en la tumorogénesis se ejemplifica por medio de la identificación de mutaciones en homólogos de Drosophila de oncogenes conocidos como el Blanco de Rapamicina TOR, Myc, Ras que causa un fenotipo de cabeza pequeña y mutaciones en homólogos conocidos del gen supresor de tumores semejantes a PTEN, LAST y TS1 que causan u fenotipo de cabeza grande (Huang, Potter y colaboradores, 1999; Oldham, Montagne y colaboradores, 2000).

Las mutaciones en el gen descritas en esta invención produjeron moscas con cabezas más grandes de lo normal (Fig. 1) sugiriendo fuertemente una función esencial de inhibición del crecimiento. El gen fue identificado posteriormente como nuevo y denominado Proteína tipo Epsina (ELP) debido a un dominio común con la proteína Epsina de Drosophila. Este dominio, conocido como dominio de Homología con el NH_{2} Terminal de la Epsina (ENTH) (Kay, Yamabhai y colaboradores, 1999), se encuentra en todas las proteínas de la familia de la Epsina (Rosenthal, Chen y colaboradores, 1999) que han sido implicadas en la endocitosis mediada por el receptor y en la regulación de los receptores de crecimiento (Carbone 1997; Nakashima, Morinaka y colaboradores, 1999). Sin embargo, la ELP pierde dos dominios esenciales de Epsina involucrados en la endocitosis: el dominio de NPF C-terminal que interactúa con Eps15 (Chen, Fre y colaboradores, 1998) y el motivo central DPW que se enlaza al adaptador AP2 de clatrina (Robinson PJ, Liu JP, Trends in neuroscience, 1994) y Clatrina (Rosenthal, Chen y colaboradores, 1999). Ya que la estructura tridimensional del dominio de ENTH se parece a aquella de la repetición del Armadillo, se ha postulado que este dominio puede mediar también el movimiento acompasado de ida y vuelta citoplasmático del núcleo (Hyman, Chen y colaboradores 2000; Vecchi, Polo y colaboradores, 2001).

Se ha descrito que el dominio de ENTH se enlaza al fosfatidilinositol-4,5-bis fosfato (PIP2) (PIP2) (Itoh, Koshiba y colaboradores, 2001), la forma desfosforilada del fosfolípido PI(3,4,5)P3 de la membrana, que juega un papel de pivote en la propagación de la señal de los receptores de la membrana para los componentes secuencia abajo (Martín, 2001), Así, en analogía con las proteínas que contienen un dominio de PH, conocidas por enlazarse a, y ser reguladas por los niveles de PIP3, la localización y la función de las proteínas que contienen al dominio de ENTH puede ser regulada por los niveles de PIP2.

El hecho de que el fenotipo de crecimiento observado en las células que carecen del gen LAST supresor de tumores sea muy similar a aquel de las células homocigotos por mutaciones en el gen descrito aquí indica que la ELP puede constituir también un gen supresor de tumores.

En el alcance de la presente invención se identificaron la proteína ELP de D. melanogaster y dos isoformas de la ELP humana así como los genes correspondientes.

Un primer aspecto de la presente invención se relaciona con proteínas tipo epsina (ELP) que se caracterizan por la presencia de un dominio de ENTH y su actividad inhibidora del crecimiento. En el alcance de la presente invención las proteínas tipo epsina de Drosophila melanogaster y humanas han sido clonadas y caracterizadas.

Se puede mostrar que la sobreexpresión de dELP induce la muerte celular en el ala de la mosca y reduce fuertemente el tamaño del ojo compuesto (nuevamente una indicación de su efecto negativo sobre el crecimiento) y que la sobreexpresión de los transgenes hELP y dELP en el fondo de D. melanogaster mutante transheteroalélico rescata parcialmente la letalidad del mutante homocigoto desde las etapas larval tardía hasta pupa. Estos hallazgos prueban que la proteína de la drosophila y la proteína humana tienen la misma función.

La actividad de inhibición del crecimiento de dichas proteínas indica que los genes del tipo para la epsina funcionan como supresores tumorales.

Incluidos dentro del término proteína ELP están también fragmentos funcionales, variantes o derivados de cualquiera de las proteínas definidas aquí anteriormente. Las proteínas de la presente invención pueden ser proveídas como proteínas quiméricas por ejemplo como proteínas recombinantes de fusión.

Una "proteína quimérica" o una "proteína de fusión" es una fusión de una primera secuencia de aminoácidos que codifica a uno de los polipéptidos ELP objetivo con una segunda secuencia de aminoácidos que define un dominio foráneo a y no sustancialmente homólogo con cualquier dominio de una de las proteínas ELP. Una proteína quimérica puede presentar un dominio foráneo que se encuentra (aunque en una proteína diferente) en un organismo que también expresa la primera proteína, o pueden ser estructuras de una proteína de fusión "interespecie", "intergénica", etc., expresadas por diferentes clases de organismos. En general, una proteína puede ser representada por la fórmula general X-ELP-Y, en donde ELP representa una porción de la proteína que se deriva de una de las proteínas ELP, y X y Y están independientemente ausentes o representan secuencias de aminoácidos que no están relacionadas con una de las secuencias de la ELP en un organismo, incluidos los mutantes de ocurrencia natural.

En un segundo aspecto la presente invención se relaciona con secuencias de ácido nucleico que codifican a las proteínas ELP. Los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en la secuencia de aminoácidos de ELP también están incluidos en la presente invención. Alguien capacitado en la técnica se dará cuenta que estas variaciones en uno o más nucleótidos (aproximadamente hasta 3-5% de los nucleótidos) de los ácidos nucleicos que codifican a los polipéptidos que tienen una actividad de un polipéptido ELP pueden existir entre individuos de una especie dada debido a una variación alélica natural. Los fragmentos de los ácidos nucleicos que codifican a una porción activa de las proteínas tipo epsina están también dentro del alcance de la invención. Como se lo utiliza aquí, un fragmento del gen elp se refiere a un ácido nucleico que tiene más pocos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia completa de aminoácidos de ELP representada en Seq. Id. No. 2, Seq. Id. No. 4 o Seq. Id. No. 5, no obstante codifica preferiblemente a un péptido que retiene alguna actividad biológica de la proteína de longitud completa o recobra alguna actividad biológica en presencia de un agonista/antagonista adecuado. Los fragmentos de ácido nucleico dentro del alcance de la presente invención incluyen a aquellos capaces de hibridar bajo condiciones de rigurosidad media o alta con ácidos nucleicos de otra especie para el uso en protocolos de selección para detectar y aislar otros alelos elp y/o homólogos, así como aquellos capaces de hibridar con ácidos nucleicos de especimenes humanos para ser usados en la detección de la presencia de un ácido nucleico que codifica a una proteína ELP, incluidas las isoformas alternas, por ejemplo variantes de empalme de ARNm. Los ácidos nucleicos dentro del alcance de la invención pueden contener también secuencias enlazadoras, sitios modificados de endonucleasa de restricción y otras secuencias útiles para clonación molecular, expresión o purificación de formas recombinantes de los polipéptidos objetivo despachados.

En un aspecto adicional la presente invención se relaciona con un método para la determinación de si un individuo, por ejemplo un paciente humano, está en riesgo de padecer un desorden caracterizado por una proliferación celular no deseada o un control aberrante de diferenciación. El método incluye detectar, en una muestra de tejido de un individuo, la presencia o la ausencia de una lesión genética caracterizada al menos por una mutación en un gen como el de la epsina o la pérdida de expresión de un gen como el de la epsina.

Para ilustración, se pueden generar sondas de nucleótido a partir de los genes de la presente invención lo cual facilita la selección histológica de un tejido intacto y de muestras de tejido por la presencia (o la ausencia) de transcritos que codifican ELP. El uso de sondas dirigidas a mensajes de ELP, o a secuencias genómicas de ELP, pueden ser utilizadas tanto para evaluación predictiva como terapéutica de mutaciones alélicas que pueden manifestarse, por ejemplo en desordenes neoplásicos como hiperplásicos (por ejemplo, crecimiento celular no deseado). Las sondas de oligonucleótido pueden ayudar a facilitar la determinación de la base molecular para un desorden de desarrollo que puede involucrar alguna anormalidad asociada con la expresión (o carencia de la misma) de una proteína del tipo epsina. Por ejemplo, la variación en la síntesis de polipéptidos se puede diferenciar de una mutación en una secuencia de codificación.

Por ejemplo, por medio de experimentos de transferencia puntiforme que comparan la expresión por medio del ARN de la ELP en tejido tumoral vs. tejido normal, se podría encontrar una significativa reducción de la expresión por medio del ARN de la ELP en conexión con diferentes cánceres, en particular muestras de cáncer de pulmón y muestras de cáncer de estómago.

En modalidades preferidas, el método de diagnóstico se puede caracterizar por comprender: detectar, en una muestra de tejido del individuo (por ejemplo, un paciente humano), la presencia o la ausencia de una lesión genética caracterizada al menos por (i) una mutación de un gen que codifica a una proteína tipo epsina o (ii) la perdida de expresión de una proteína tipo epsina. Como ilustración, tales lesiones genéticas se pueden detectar por medio de la determinación de la existencia al menos de (i) una supresión de uno o más nucleótidos de un gen que codifica a una proteína tipo epsina, (ii) una adición de uno o más nucleótidos a un gen que codifica a una proteína tipo epsina, (iv) un reordenamiento cromosomal tosco de un gen que codifica a una proteína tipo epsina, (v) una alteración tosca en el nivel de un trascrito de ARN mensajero de un gen que codifica a una proteína tipo epsina, (vi) la presencia de un patrón de empalme de tipo no natural de un trascrito de ARN mensajero de un gen que codifica a una proteína tipo epsina, (vii) un nivel de tipo no natural de una proteína tipo epsina y (viii) una mutación en la región 5' no traducida o en la región 3' no traducida de un gen elp.

En un aspecto de la invención se provee una sonda/iniciador que comprende un oligonucleótido que contiene una región de secuencia nucleótida que es capaz de hibridar a una secuencia sentido o antisentido de la Seq. Id. No: 1, o mutantes de ocurrencia natural de la misma, o secuencias 5' ó 3' de flanqueo o secuencias intrónicas naturalmente asociadas con un gen de la presente invención. La sonda se expone al ácido nucleico de una muestra de tejido; y la hibridación de la sonda para que la muestra de ácido nucleico sea detectada. En ciertas modalidades, la detección de la lesión comprende la utilización de la sonda/iniciador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (ver, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4.683.195 y 4.683.202), o alternativamente, en una reacción en cadena para ligación (LCR) (Landergren, Kaiser y colaboradores, 1988; Nakazawa, English y colaboradores, 1994) la última de las cuales puede ser particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en genes. Alternativamente, se pueden emplear inmunoensayos para determinar el nivel de proteínas.

En una modalidad preferida, la mutación en el gen elp se localiza dentro de la región de codificación del dominio de ENTH, en la región 5' no traducida del gen elp o en la región del gen justamente adyacente al dominio de ENTH.

Otro aspecto de la presente invención provee anticuerpos y preparaciones de anticuerpos específicamente reactivos con un epítopo de una proteína tipo epsina.

Por ejemplo, por medio del uso de inmunógenos derivados de proteínas ELP, por ejemplo con base en las secuencias de ADNc, se puede elaborar antisuero antiproteína/antipéptido o anticuerpos monoclonales por medio de protocolos estándar (Ver, por ejemplo, (Harlow y Lane, 1988)). Un mamífero, tal como un ratón, un hámster o un conejo se pueden inmunizar con una forma inmunogénica del péptido (por ejemplo, un polipéptido despachado de vertebrado o un fragmento antigénico que es capaz de provocar una respuesta de un anticuerpo). Las técnicas para conferir inmunogenicidad sobre una proteína o péptido incluyen conjugación con portadores u otras técnicas conocidas en el estado el arte. Se puede administrar una porción inmunogénica de una proteína ELP en presencia de adyuvante. El progreso de la inmunización se puede monitorear por medio de la detección de las concentraciones de anticuerpo en plasma o suero. Se pueden utilizar ELISA estándar u otros inmunoensayos con el inmunógeno como antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos.

En una modalidad preferida, los anticuerpos son inmunoespecíficos para los determinantes antigénicos de una proteína ELP de un organismo vertebrado, tal como un mamífero. Después de la inmunización de un animal con una preparación antigénica de una proteína ELP, se puede obtener antisuero anti-ELP y, si se desea, anticuerpos policlonales anti-ELP aislados del suero. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden cosechar células que producen anticuerpos (linfocitos) a partir de un animal inmunizado y se las fusiona por medio de procedimientos estándar de fusión de células somáticas con células de inmortalización tal como células de mieloma para producir células de hibridoma. Tales técnicas son conocidas en el estado del arte, e incluyen, por ejemplo, la técnica de hibridoma (originalmente desarrollada por (Kohler y Milstein 1975)), la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbar 1983), y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole 1985). Las células de hibridoma se pueden seleccionar inmunoquímicamente para la producción de anticuerpos específicamente reactivos con una proteína ELP y anticuerpos monoclonales aislados de un cultivo que contiene a tales células de hibridoma.

El término anticuerpo como se lo utiliza aquí está destinado a incluir fragmentos del mismo que sean también específicamente reactivos con uno de los polipéptidos ELP. Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos seleccionados por su utilidad en la misma forma como se describió anteriormente para los anticuerpos completos. Por ejemplo, los fragmentos F(ab)_{2} se pueden generar por medio del tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)_{2} resultante puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab. El anticuerpo de la presente invención pretende incluir además moléculas biespecíficas y quiméricas que tienen afinidad por una proteína ELP conferida al menos por una región CDR del anticuerpo.

Tanto los anticuerpos monoclonal y policlonal (Ab) dirigidos contra polipéptidos ELP, o variantes de ELP, y fragmentos de anticuerpo tales como Fab y F(ab)_{2}, pueden ser utilizados para bloquear la acción de una o más de las proteínas ELP y permiten el estudio del papel de estas proteínas, por ejemplo, en la embriogénesis y/o el mantenimiento de tejido diferencial. En una aproximación similar, se pueden implantar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales anti-ELP, o geles biodegradables en los cuales se suspenden anticuerpos anti-ELP, en un sitio proximal o dentro del área en la cual se pretende bloquear la acción de la ELP. Los experimentos de esta naturaleza pueden ayudar a descifrar el papel de este y de otros factores que pueden estar involucrados en la regulación del crecimiento. Los anticuerpos son también adecuados como herramientas para ser utilizadas en ensayos diagnósticos para la identificación de enfermedades asociadas con proteínas ELP o una predisposición a las mismas, por ejemplo por medio de la detección de la expresión reducida o mejorada de la proteína Elp, por medio de la detección de una localización celular errada de una proteína ELP o por medio de la detección de proteínas ELP anormales en un tejido o muestra de fluido corporal, por ejemplo sangre, de un individuo. Dichas formas anormales de proteína ELP pueden por ejemplo ser el resultado de un empalme incompleto o diferente y conducir a proteínas ELP más largas o más cortas con una actividad mejorada o reducida o diferente que la proteína ELP natural. Además, dichas formas de la proteína ELP anormal pueden ser proteínas quiméricas en donde la proteína ELP de longitud completa o fragmentos de la misma se fusionan a otra proteína o a fragmentos de la misma. Dicha proteína quimérica puede por ejemplo haber surgido de una supresión entre dos genes o ser el resultado de un reordenamiento genómico. La persona capacitada en el arte conoce métodos adecuados para la detección de proteínas utilizando anticuerpos en un tejido y/o muestra de fluido corporal. Dichos métodos incluyen pero no se limitan a transferencias de Western, Inmunoensayo Ligado a Enzimas ("ELISA"), ELISA basado en células, inmunoprecipitaciones, transferencias puntiforme o de rendija, radioinmunoensayos, e inmunoensayos fluorescentes.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso de proteínas y/o de ácidos nucleicos de la presente invención (ya sea de longitud completa o un fragmento deseable) para la terapia génica de enfermedades hiperproliferativas asociadas con ELP. Un vector apropiado para el suministro puede ser fácilmente seleccionado por alguien capacitado en el arte. Los vectores para terapia génica se encuentran fácilmente disponibles a partir de una variedad de fuentes, e incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados [solicitud internacional de patente No. PCT/US91/03440], vectores adenovirus (Ishibashi, Brown y colaboradores, 1993; Kay, Landen y colaboradores, 1994), u otros vectores virales, por ejemplo, diferentes virus que causan erupciones pustulosas, vacunas, etc. Los métodos para la inserción de un gen deseado, por ejemplo BAP-1, y la obtención de la expresión in vivo de la proteína codificada, son bien conocidos por aquellos capacitados en el arte.

Las proteínas y/o los ácidos nucleicos de la presente invención son también adecuados para el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, por ejemplo en la forma de una preparación farmacéutica. La preparación farmacéutica puede -si se desea- ser mezclada con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, preservantes, estabilizantes, agentes de humectación, emulgentes, sales para influenciar la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no reaccionan en forma nociva con los compuestos activos.

Las proteínas se pueden administrar por medio de inyección (esto es, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intratumoral, intraperitoneal, preferiblemente intramuscular), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica, administración tópica o administración rectal, preferiblemente por inyección, administración transdérmica o tópica. Dependiendo de la ruta de administración, los péptidos en la composición farmacéutica pueden ser recubiertos en un material para protegerlos de la acción de ciertas enzimas. Una persona capacitada en el arte estaría familiarizada con el recubrimiento que sería el adecuado para el suministro del péptido a un sitio particular. Sustancias orgánicas pueden también ser incluidas en la composición para prolongar la acción farmacológica de los péptidos. Ejemplos de tales sustancias orgánicas incluyen gelatina no antigénica, carboximetilcelulosa, éster sulfonato o éster fosfato de ácido algínico, dextrano, polietilén glicol y otros glicoles, ácido fítico, ácido poliglutámico, y
protamina.

Para propósitos de terapia, un péptido activo de la ELP o un fragmento de la misma pueden ser administrados también en forma de un conjugado con una molécula portadora apropiada. La molécula portadora permite una mejor asimilación celular del péptido ELP dentro de la célula y/o el suministro del péptido ELP a células blanco específicas, por ejemplo, células tumorales. Las moléculas portadoras adecuadas son por ejemplo transferrina o proteínas de entrada a la célula viral.

La invención se relaciona además con moléculas antisentido que pueden ser utilizadas para reducir la expresión de moléculas ELP en las células. El reactivo antisentido pueden ser oligonucleótidos antisentido (ODN), particularmente ODN sintético que tiene modificaciones químicas de ácidos nucleicos nativos, o de construcciones de ácido nucleico que expresan a tales moléculas antisentido como el ARN. La secuencia antisentido es complementaria al ARNm del gen objetivo, e inhibe la expresión de los productos génicos objetivo. Las moléculas antisentido inhiben la expresión génica a través de diferentes mecanismos, por ejemplo por medio de la reducción de la cantidad de ARNm disponible para traducción, a través de la activación de ribonucleasa H, o impedimento estérico. Se puede administrar una o una combinación de moléculas antisentido, donde una combinación puede comprender múltiples secuencias
diferentes.

Las moléculas antisentido pueden ser producidas por medio de la expresión de toda o de una parte de la secuencia del gen objetivo en un vector apropiado, donde la iniciación transcripcional se orienta de tal manera que se produce una cadena antisentido como una molécula de ARN. Alternativamente, la molécula antisentido es un oligonucleótido sintético. Los oligonucleótidos antisentido serán generalmente aproximadamente de al menos 7, usualmente aproximadamente al menos 12, más usualmente aproximadamente al menos 20 nucleótidos de longitud, y aproximadamente no más de 500, usualmente aproximadamente no más de 50, más usualmente aproximadamente no más de 35 nucleótidos de longitud, donde la longitud está gobernada por la eficiencia de la inhibición, la especificidad, incluida la ausencia de reactividad cruzada, y similares. Se ha encontrado que los oligonucleótidos cortos, de 7 a 8 bases de longitud, pueden ser inhibidores fuertes y selectivos de expresión génica (ver (Wagner, Matteucci y colaboradores,
1996)).

Otro aspecto de la invención se relaciona con el silenciamiento post transcripcional de los genes elp por medio de interferencia de ARN (ARNi). El ARNi es una forma de silenciamiento génico post transcripcional mediado por los ARN bicatenarios cortos (dsARN) que han sido descrito en plantas, nemátodos, organismos invertebrados y cultivos celulares de mamífero ((Ngo, Tschudi y colaboradores, 1998) (Vaucheret y Fagard 2001) (Kennerdell y Carthew, 1998; Caplen, Fleenor y colaboradores, 2000; Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001; Timmons, Court y colaboradores, 2001). Se ha mostrado que los ARN bicatenarios (dsARN) inducen una respuesta de degradación en la cual el ARN monocatenario complementario con el dsARN corto se degrada rápidamente (Montgomery y FIRE, 1998; Montgomery, Xu y colaboradores, 1998). El ARNi se puede utilizar entonces para reducir la expresión génica por ejemplo en organismos completos o líneas celulares de invertebrados o de vertebrados (Kennerdell y Carthew, 1998; Caplen, Fleenor y colaboradores, 2000; Clemens, Worby y colaboradores, 2000; Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001). El dsARN de ELP se puede elaborar a partir de ADNc o de moldes de ADN genómico, mientras que la mayoría del dsARN corresponde a regiones de exón. Normalmente, las regiones objetivo de 700 a 800 pares de bases son las más activas. Sin embargo, se sabe que los dsARN tan cortos como de 200 pares de bases y tan largos como de 2000 pares de bases tienen una potente actividad de interferencia. Ambas cadenas de ARN pueden ser sintetizadas simultáneamente a partir de un fragmento PCR, que contiene por ejemplo un promotor T7, SP6 o T3 sobre cada extremo. Este fragmento PCR puede ser generado por medio de amplificación del ADNc de la ELP o ADN genómico con 2 iniciadores que contienen por ejemplo sitios de enlazamiento T7-polimerasa. La reacción PCR puede entonces ser llevada a cabo con un molde adecuado que contiene secuencias de ELP. La taq polimerasa da los mejores resultados, pero otra polimerasa como Pfu puede ser utilizada también. Los primeros 10 ciclos deben tener una etapa de templado a 40ºC, seguida por 35 ciclos con una etapa de templado a 55ºC. Se puede añadir DMSO hasta una concentración final de 5% cuando se requiera. El extracto en cloroformo-fenol y la precipitación con etanol en NH_{4}OAc pueden ser utilizados para aislar al molde de PCR de la mezcla de reacción, aunque se pueden utilizar también otro kit de purificación por PCR comercialmente disponible. La reacción de síntesis de ARN se puede llevar a cabo en un volumen de 50 \mul con 1 \mug del molde de ADN por PCR utilizando una ARN polimerasa apropiada. Los kits MEGscript^{TM} de Ambion funcionan muy bien. El ARN se vuelve bicatenario durante la reacción de síntesis. El molde de ADN se puede remover con ADNasa libre de ribonucleasa y el dsARN se puede purificar por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Los rendimientos típicos de ARN de un molde de 1 \mug de ADN están en el rango de 80 a 120 \mug. El dsARN puede ser almacenado como un precipitado en NaOAc/etanol a -80ºC hasta inmediatamente antes de
usarlo.

La calidad del dsARN puede ser monitoreada por medio de electroforésis en gel de agarosa nativa en TBE. Únicamente se deben utilizar preparaciones en las cuales la movilidad electroforética de la mayor parte del ARN se cambia a la movilidad esperada para el dsARN (muy cercana a la movilidad del doblete de ADN) de la longitud apropiada. Para reducir la expresión de la ELP en células de mamífero, se debe utilizar preferencialmente dsARN corto de 20-23 mer (Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001; Elbashir, Lendeckel y colaboradores, 2001). Tal dsARN corto tiene una proyección 3' como se describe en (Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001) y puede ser sintetizado in vitro por medio de métodos estándar.

Diferentes métodos para introducir dsARN en células se pueden encontrar en la literatura y dichos métodos son conocidos por alguien capacitado en la técnica.

La invención se ilustra ahora adicionalmente por medio de ejemplos.

Estos ejemplos se suministran únicamente como ilustración de los diferentes aspectos de la invención y no deben ser considerados como limitantes de la invención en ninguna forma.

Parte experimental

Para identificar a los genes específicamente involucrados en el crecimiento a nivel celular, de un tejido y de un organismo, los inventores tomaron una aproximación genética en Drosophila. Ellos llevaron a cabo una amplia selección genómica para mutaciones recesivas que interfieren o promueven el crecimiento celular sin afectar la diferenciación celular. Estas selecciones se llevaron cabo tomando ventaja de sistemas de recombinación específicos para un tejido (Newsome, Asling y colaboradores, 2000) que generan moscas genéticamente mosaico. Estas moscas son homocigotos para mutaciones inducidas en forma aleatoria en el tejido de la cabeza pero heterocigotos para la misma mutación en el cuerpo y en la línea germinal. Las mutaciones en genes cuyos productos promueven selectivamente el crecimiento (oncogenes) producirán moscas con cabezas pequeñas mientras que las mutaciones en los genes cuyos productos ejercen una función de inhibición del crecimiento (genes supresores tumorales) resultan en moscas con cabezas mayores a las normales. La validez de esta selección se ejemplifica por medio de la identificación de mutaciones en el gen que codifica para el Blanco de Rapamicina (TOR) que causa un fenotipo de cabeza pequeña y mutaciones en el gen que codifica al gen supresor tumoral PTEN que causa un fenotipo de cabeza mayor (Huang, Potter y colaboradores, 1999; Oldham, Montagne y colaboradores, 2000).

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Ejemplo I Selección del cabeza de alfiler

Las mutaciones en los componentes de la ruta de señalización del receptor de insulina afectan el crecimiento celular en una forma autónoma para la célula (Bohni, Riesgo-Escovar y colaboradores 1999; Verdu, Buratovich y colaboradores 1999; Weinkove, Neufeld y colaboradores 1999; Brogiolo, Stocker y colaboradores 2001). Los clones de células mutantes soportan una severa desventaja en el crecimiento y permanecen pequeños comparados con sus clones hermana de tipo natural. Si se fuerza que se presente una recombinación mitótica por medio del suministro constante de recombinasa flp y se consigue eliminar al clon hermana por medio de una mutación letal para la célula, estos clones pueden, sin embargo, cubrir fracciones sustanciales de órganos completos. Dirigiendo la expresión de la recombinasa flp bajo el control de secuencia reguladoras ciegas resulta en la formación de clones específicos para el tejido en los discos relacionados con el ojo del insecto únicamente. En combinación con una mutación letal para la célula sobre el cromosoma homólogo, este sistema permite la generación de ojos y de cápsulas principales compuestas principalmente de células que son mutantes homocigotos para el gen de interés (Newsome, Asling y colaboradores, 2000). Tales moscas mosaico que carecen de la función del Chico homólogo de IRS o del receptor de insulina (Inr) específicamente en los descendientes del disco relacionado con el ojo del insecto muestran un fenotipo muy característico. Mientras que sus cuerpos son de tamaño normal, sus ojos y cabezas están dramáticamente reducidos (Bohni, Riesgo-Escovar y colaboradores, 1999; Brogiolo, Stocker y colaboradores, 2001). Con el propósito de identificar las mutaciones en los genes que modulan el crecimiento con base en fenotipos similares, se sometió a los machos que portan los sitios objetivo para la recombinasa flp cerca de la base del brazo derecho del tercer cromosoma (82FRT) a mutagénesis EMS y se los cruzó con hembras que traían cuatro elementos: la fuente de la recombinasa (ey-flp), sitios FRT en la posición correspondiente, un marcador dominante del ojo (w+) y una mutación letal para la célula (c13R3). En las moscas mosaico de la generación F1, los efectos de homocigosidad para mutaciones recientemente inducidas sobre 3R pueden ser observados en las cabezas y en los ojos. La presencia de tejido de mutante homocigoto se puede visualizar fácilmente por medio de la perdida del marcador del pigmento w+ resultante en tejido ocular blanco.

Selección de moscas mosaico

Los machos que portan los sitios FRT sobre el brazo derecho del cromosoma 3 (FRT82; (Xu y Rubin, 1993)) fueron alimentados con EMS 33 mM de acuerdo con protocolos estándar y se los cruzó con hembras del genotipo y w ey-flp; FRT82 w+ c13R3/TM6B y+. c13R3 s una mutación recesiva letal para la célula que ha sido generada sobre el cromosoma FRT82 w+ (Newsome, Asling y colaboradores, 2000). La mitad de la progenie F1 fue del genotipo y w ey-flp/+ o Y; FRT82*/FRT82 w+ c13R3 y fue anotada para ojos y cabezas de tamaño anormal. Los positivos fueron cruzados nuevamente con y w ey-flp; FRT82 w+ c13R3/TM6B y+ para revisar la transmisión por línea germinal. Se seleccionaron aproximadamente 50.000 moscas mosaico hasta alcanzar la saturación, y se establecieron 69 mutaciones que causaron un fenotipo de cabeza grande.

Análisis del grupo de complementación

52 de las 69 mutaciones que causan un fenotipo de cabeza grande caen dentro de nueve grupos de complementación. Un grupo de complementación se define por medio de un número de al menos dos alelos en cualquier combinación por parejas falla en complementar la letalidad asociada con la homocigosidad de cada uno de los alelos. Las mutaciones que pertenezcan a cuatro de estos grupos de complementación resultaron en un fenotipo hiperproliferativo: la ommatidia supernumeraria causó la formación de pliegues que le dieron a los ojos apariencia de tumoral (Figura 1, panel derecho).

Mapeo meiótico y de SNP

Uno de los cuatro grupos de complementación que muestra un fenotipo hiperproliferativo consistió de cuatro alelos. Se mapeo meióticamente un alelo representativo utilizando los siguientes marcadores genéticos: un elemento P que soporta un mini w+ en la posición citológica 87E, un elemento P que soporta a w+ en 90E, y un elemento P que soporta a y+ en 96E ((Xu y Rubin, 1993)). La posición aproximada en el mapa fue confirmada y refinada por medio de análisis de complementación utilizando deficiencias dentro de la misma región. Se hizo un mapeo más restrictivo evaluando la frecuencia de recombinación entre alelos y las inserciones marcadas cerca del elemento P. Los elementos P utilizados para el mapeo fueron EP(3)0738 (94A1-2), 1(3)j5B5 (94A1-2) y 1(3)L3560 (94A5-7). De esta forma la posición genética de las mutaciones podría ser limitada a la posición 94A en el cromosoma muy cerca de la inserción del elemento P 1(3)L3560.

El análisis genético posicionó al sitio de mutación en un intervalo de 300 kbp aproximadamente de 120 kb dentro del andamiaje AE003738 (nucleótidos 344000-464000). Para determinar específicamente el sitio molecular de la mutación, se mapearon los recombinantes utilizando los SNP como marcadores moleculares en esa región específica. Los SNP se resolvieron por medio de análisis de desnaturalización con HPLC utilizando un sistema WAVE ((Underhill, Jin y colaboradores, 1996)). El sitio de la mutación se estrechó hasta un intervalo de 30 kbp. La ubicación precisa de una mutación fue identificada por medio de análisis de genes candidatos utilizando el sistema WAVE y la posterior secuenciación.

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Ejemplo II Expresión de ELP en Drosophila melanogaster

Un transgén específico se puede expresar en Drosophila en el organismo completo, en un órgano particular o en un tipo de célula específico, durante toda la vida o únicamente durante una etapa específica de desarrollo, y en diferentes niveles. Una visión de conjunto de los métodos estándar utilizados en la genética de la Drosophila se puede encontrar en [Brand, 1993; Perrimon, 1998; Perrimon, 1998]. Como un gen putativo supresor de tumores, se espera que la sobreexpresión de la proteína ELP mutante o de tipo natural, interfiera con el crecimiento. Para probar esta hipótesis, se cruzaron moscas transgénicas que portan a los transgenes UAS que codifican a la proteína ELP natural de Drosophila, con moscas que tienen expresado Gal4 bajo el control de diferentes promotores específicos para el tejido (Figura 6 y Tabla 2). Las construcciones que dirigen a Gal4 incluyen pero no se limitan a Gal4 de ciego, Gal4 de vestiga1, Gal4 de MS1096 (Capdevila y Guerrero, 1994). En forma similar, es posible analizar la función de proteínas mutantes con sustituciones de aminoácidos o supresiones internas.

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TABLA 2 Sobreexpresión de DELP en diferentes tejidos

Los animales transgénicos que soportan dos inserciones independientes de delp fueron cruzados con las fuentes respectivas de GAL4 en la primera fila para sobreexpresar dELP en una variedad de tejidos.

Abreviaturas: ojos mp omm #\downarrow : ojos muy pequeños, número de ommatidia reducido; +/- venas: venas adicionales o perdidas en el ala; alas ru.: alas rudimentarias, de tamaño muy pequeño; fen. no vis.: fenotipo no visible; subviable: por debajo de la viabilidad

1

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Con el fenotipo visible obtenido por medio de la sobreexpresión de la ELP natural (como en la Figura 6) o probablemente la ELP mutante, este sistema puede ser utilizado para llevar a cabo el análisis de la estructura/función de la proteína ELP. Tal fenotipo también puede ser utilizado para seleccionar las mutaciones dominantes o recesivas de perdida de función en otros genes, lo que resulta en una supresión del fenotipo. Alternativamente, utilizando el Elemento Reforzador-Promotor (EP) (Rorth, 1996) se puede llevar a cabo una selección para los genes que suprimen al fenotipo cuando ellos se sobreexpresan. En este caso, se provoca la sobreexpresión de un gen aleatorio por medio de la integración de un elemento EP en el extremo 5' de este gen.

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Ejemplo III Clonación del homólogo humano

La ELP humana (hELP) (Seq. Id. No. 1, 2, 5) fue identificada por medio de una búsqueda en la base de datos pública de secuencias para las secuencias de codificación predichas y las etiquetas de secuencia expresada (las EST) que tienen homología con la secuencia de dELP utilizando el programa Blast (http://www.ch.embnet.org/software, aBlast.html). dElp mostró una similitud estadísticamente significativa con un gen predicho sobre el cromosoma V y con diferentes EST. El ADNc de longitud completa de hELP se obtuvo a partir del conjunto de clones de ADNc humano de longitud completa de Resgen (Acceso AL529948 Id del Clon CS0DD005Y J09 Biblioteca LTI_NFL001_NBC4). Este conjunto de los ADNc se derivó de las bibliotecas construidas utilizando iniciador oligodT y transcriptasa inversa Superscript II. Después del proceso de montaje, se verificó la secuencia por medio de una revisión cruzada con secuencias de ADN genómico y los datos que se encuentran disponibles en forma pública.

Para confirmar la homología funcional entre ELP humana y de Drosophila, se clonaron el ADNc de la ELP de longitud completa humano y de Drosophila en un vector de expresión de Drosophila tal como el vector de transformación pUAS (Phelps y Brand, 1998). Las moscas transgénicas se pueden generar de acuerdo con el método descrito en (Baster y Hafen, 1988). Los transgenes cruzados en las moscas que son transheterocigotas para cualquiera de los dos alelos mutantes elp y que también contienen un transgén Gal-4 que permite expresión omnipresente o específica para el tejido y/o la etapa de los transgenes UAS. Los transgenes Gal4 incluyen pero no se limitan a la actina-Gal4, tubulina-Gal4, y choque térmico-Gal4. Como se muestra en la Tabla 1, la expresión omnipresente del transgén humano o de Drosophila rescató al menos parcialmente la letalidad asociada con la transheterocigosidad de loa alelos mutantes elp de las etapas larval final hasta de pupa. Esto demuestra que el gen auxiliar es el homólogo funcional del gen elp de Drosophila (ver Figura 6).

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TABLA 1 Análisis de rescate de alelos delp por medio de sobreexpresión omnipresente de ELP

Se utilizaron transgenes UAS Elp para sobreexpresar Elp en una situación de mutante homocigoto transhetero-
alélico.

Transgenes UAS-Elp utilizados: 2.4a: UAS-hElp18aa; 5.20d: UAS-DElp-ENTH. Alelos Elp utilizados: Delp^{1G1}: mutación V266F; Delp^{4K2}: mutación E27G; Delp^{1U1}: transición en 5'UTR; Delp^{2W2}: transición en 5'UTR. Fuentes de GAL4 utilizadas: Gal4 de brazo; Gal4 de armadillo; hsGal4; Gal4 de choque térmico, Act5CGal4: Gal4 de Actina5C. Los transgenes UAS y las cepas de Gal4 fueron marcadas por w^{+}.

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Alternativamente, el ADNc de longitud completa de Drosophila y de humano se pueden insertar en la siguiente secuencia en un vector d transformación que contiene un promotor de tubulina: promotor de tubulina - FRT - ADNc de DETENCIÓN - FTR - Gal4 (abreviado: tub:>ADNc>Gal4). De esta forma, el transgén de rescate es controlado directamente por medio del promotor de tubulina dando como resultado niveles menores y posiblemente más fisiológicos de expresión de ELP que con el sistema Gal4. Además, en un fondo mutante de la ELP el ADNc de elp puede ser cortado en clones de células por medio de la expresión de la FLP recombinasa ya sea bajo un promotor inducible por choque térmico o bajo un promotor específico para el tejido. Las células mutantes generadas de esta forma se pueden reconocer por medio de un reportero UAS-GFP ya que en estas células GAL4 es dirigido por el promotor de tubulina. Este método ha sido recientemente descrito por Kramps y colaboradores (Cell 109: 47-60, 2002).

Ejemplo IV Uso del ADN de ELP como sonda de hibridación

El siguiente método describe el uso de una secuencia no repetitiva de nucleótidos de elp como sonda de hibridación. El método se puede aplicar también para seleccionar los homólogos de la ELP. El ADN que contiene la secuencia de elp (como la mostrada en la Seq. Id. Nos. 1 y 3) se emplea como sonda para seleccionar los ADN homólogos (tales como aquellos incluidos en el ADNc o en bibliotecas genómicas).

La hibridación y el lavado de los filtros que contienen a cualquiera de los ADN de la biblioteca se llevan a cabo condiciones estándar de gran rigurosidad (Sambrook, Fritsch y colaboradores, 1989). Se pueden utilizar clones positivos para seleccionar adicionalmente blindajes mayores de la biblioteca de ADNc. Los clones representativos de ADNc son clonados posteriormente en pBluescript (pBS, Stratagene) o en vectores de clonación similares, y secuenciados.

Ejemplo V Uso de elp como una sonda de hibridación para hibridación in situ

La hibridación in situ del ARNm de elp de Drosophila puede ser realizada en embriones como se describe en (Tautz y Pfeifle, 1989). Sin embargo, con pequeñas modificaciones también puede ser utilizada para detectar cualquier transcrito de ARNm en secciones de tejido de vertebrado o de Drosophila. Las sondas marcadas de ARN se pueden preparar a partir de ADNc linealizado de elp, o de un fragmento del mismo, por ejemplo utilizando del Kit de marcación DIG RNA (SP6/T7) (Boehringer Mannheim) o marcación con ^{32}P siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se puede utilizar un método similar con help como sonda de hibridación para evaluar tejidos humanos (ver Figura
4, y 5).

Ejemplo VI Expresión de proteínas ELP en E. coli

El siguiente método describe la expresión recombinante de ELP en células bacteriales. Alternativamente, las proteínas recombinantes se pueden producir y aislar a partir de células de insecto o de mamífero (Sambrook, Fritsch y colaboradores, 1989). El ADN que codifica una forma de ELP de longitud completa o truncada, se fusiona secuencia debajo de una etiqueta de epítopo o ADNc de glutationa-S-transferasa (GST) y un sitio de escisión para trombina contenido dentro de un vector inducible de expresión bacterial. Tales etiquetas de epítopo incluyen a las etiquetas poli-his, proteína S, tioredoxina, e inmunoglobina. Se pueden emplear una variedad de plásmidos, incluido un plásmido comercialmente disponible tal como pGEX-4T (Pharmacia).

En resumen, un plásmido de expresión bacterial que contiene la secuencia de la ELP, por ejemplo fusionada a una secuencia de GST se transforma por medio de métodos convencionales en una E. coli deficiente en proteasa tal como BL21 (por ejemplo, Stratagene). Una colonia bacterial que contiene al plásmido se expande luego durante la noche en medio de selección para alcanzar la saturación. A la mañana siguiente, se diluye este cultivo 1:100 y se le permite a las bacterias que crezcan hasta una densidad óptica de 0,6 (OD600). La producción de la proteína se inicia por medio de la adición de un inductor del promotor bajo el cual se expresa la proteína de fusión GST-ELP. Se pueden emplear una variedad de inductores dependiendo del vector de expresión utilizado, incluyendo IPTG.

La ELP marcada con etiqueta expresada de GST puede ser purificada entonces, por ejemplo, utilizando glóbulos de afinidad o cromatografía de afinidad, tal como glóbulos de glutationa (comercialmente disponible, por ejemplo de Pharmacia). Los extractos se preparan lisando la bacteria que expresa Lgs en un amortiguador de sonicación (Tris HCl 10 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, sarkosil al 1,5%, Triton X-100 al 2%, DTT 1 mM e inhibidores de proteasa), seguido de una corta sonicación sobre hielo (por ejemplo, 3 veces durante 20 segundos a potencia media) y centrifugación. Los sobrenadantes aclarados se incuban luego bajo rotación suave por ejemplo con glóbulos de glutationa durante 1 hora a 4ºC. Luego se lavan los glóbulos varias veces en amortiguador de lavado (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, NP40 al 0,5%), y finalmente se los almacena en amortiguador para almacenamiento (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 10%, NP40 al 0,5%, e inhibidores de proteinasa). Alternativamente, se puede purificar una ELP marcada con etiqueta IgG o marcada con etiqueta his utilizando cromatografía de afinidad sobre quelato con Ni^{2+} o cromatografía en columna sobre Proteína A o sobre Proteína G, respectivamente.

La calidad de las preparaciones se puede revisar, por ejemplo por medio de electroforesis en gel de SDS y coloración de plata o transferencias de Western.

En caso de que el epítopo marcado con etiqueta tenga que ser escindido, se encuentran disponibles varios métodos dependiendo de la presencia de un sitio de escisión entre el epítopo marcado con etiqueta y la proteína ELP. Por ejemplo, es posible producir una proteína de fusión GST-ELP que contiene un sitio de escisión de trombina justo antes del primer aminoácido de la ELP. En resumen, una preparación de GST-ELP sobre glóbulos de afinidad de glutationa se lava varias veces en amortiguador de escisión (Tris HCl 50 mM pH 7,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM). Se añade luego trombina y se incuban las muestras durante 16 horas a temperatura ambiente. Se recolectan luego los sobrenadantes y se analiza la escisión exitosa de la ELP de los glóbulos por medio de electroforesis sobre gel de poliacrilamida y coloración de plata o transferencias de Western. Las proteínas purificadas pueden ser utilizadas, por ejemplo, para generar anticuerpos anti-ELP como se describe en (Harlow y Lane, 1988).

Ejemplo VII Interacciones proteína-proteína que involucran ELP

Se puede llevar acabo un ensayo in vitro de coinmunoprecipitación para encontrar o confirmar los compañeros de interacción con ELP. Por ejemplo, las células HEK293 con una confluencia del 50% se transfectan por medio de un método de lipofección. Para este propósito, se combinan vectores de expresión de mamífero que contienen ADNc que codifican para la ELP marcada con etiqueta y compañeros potenciales de interacción, con un reactivo de transfección de Lipofectamina (Life Technologies, Inc.) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y cubierto sobre monocapas de células. Las células son lisadas 25 horas después de la transfección en amortiguador co-IP (Tris HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, Triton-X100 al 1%, glicerol al 10%, vanadato de sodio 1 mM, NaF 50 mM, e inhibidores de proteasa). Las inmunoprecipitaciones se llevan a cabo en amortiguador co-IP utilizando anticuerpos anti-etiqueta (por ejemplo, anti-HA, clon 3F10, Boehringer Mannheim) conjugados a agarosa-proteína G (Boehringer Mannheim). Las inmunoprecipitaciones de control se llevan a cabo utilizando IgG de rata o de ratón (Sigma-Aldrich). Después de 3 horas de incubación a 4ºC, se lavan los glóbulos 4 veces en amortiguador de lavado (Tris HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, Triton-X100 al 1%, vanadato de sodio 1 mM, NaF 50 mM) y se resuspenden en 25 \mul de amortiguador de Laemmli. Se analizan los complejos inmunes por medio del ensayo SDS-PAGE/inmunotransferencias utilizando anticuerpos policlonales anti-ELP suministrados por la invención o por los anticuerpos anti-etiqueta, seguido por el anticuerpo secundario conjugado de peroxidasa de rábano picante (Amersham Pharmacia Biotech). La detección se puede llevar a cabo utilizando un método mejorado de detección de quimoluminiscencia (por ejemplo, ECL, Amersham Pharmacia Biotech).

Se puede llevar a cabo un ensayo de enlazamiento in vitro de proteína de fusión-GST por ejemplo para mapear los dominios de enlazamiento, confirmar un compañero de interacción o encontrar proteínas adicionales que interactúen. Para ese propósito, las proteínas son traducidas in vitro (IVT) utilizando lisados de reticulocito (lisados de TNT, Promega Corporation) que contienen metionina [35S] siguiendo las instrucciones suministradas por el fabricante. Las proteínas de fusión glutationa S-transferasa (GST), producidas como se ilustra en el Ejemplo VI, se inmovilizan sobre glutationa-Sefarosa y se bloquean en amortiguador de enlazamiento (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, glicerol al 10%, NP40 al 0,5%, BSA al 0,05% e inhibidores de proteinasa) durante 45 minutos. Se incuban luego 2 \mug de proteínas GST inmovilizadas, durante 1,5 horas con 0,5-4 \mul de proteínas IVT en amortiguador de enlazamiento. Los glóbulos se lavan cuatro veces en amortiguador de lavado (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, NP40 al 0,5%) y se llevan a ebullición en amortiguador de Laemmli para la muestra con SDS. El uso de cantidades equivalentes de proteínas de fusión GST intactas e IVT exitoso de los ADNc tiene que ser confirmado por medio del análisis SDS-PAGE utilizando coloración de Coomassie o autoradiografía, respectivamente.

Se puede llevar a cabo adicionalmente un ensayo híbrido doble de levadura para confirmar los resultados de los ensayos de enlazamiento in vitro descritos anteriormente o para seleccionar una biblioteca de ADNc para nuevos compañeros de interacción (Fields y Sternglanz, 1994). Para confirmar un enlazamiento específico o para mapear la región de enlazamiento entre la ELP y un compañero de interacción, los ADNc deseados se subclonan en vectores apropiados de expresión de levadura que los enlazan ya sea a un dominio de enlazamiento del ADN de Lex (por ejemplo, pLexA, Clontech) o a un dominio ácido de activación (por ejemplo, pGJ4-5, Clontech). El par de plásmidos apropiado se transforma después junto con un plásmido reportero (por ejemplo, pSH18-34, Clontech) dentro de una cepa apropiada de levadura (por ejemplo, EGY48) por medio del método de acetato de litio-polietilén glicol y cultivada sobre medio selectivo (Sambrook, Fritsch y colaboradores, 1989). Los transformantes se analizan por la actividad del gen reportero como lo describe el fabricante del plásmido vector-reportero utilizado. Para establecer la reproducibilidad, se analizan las interacciones en ambas direcciones.

Para aislar las nuevas proteínas de enlazamiento a ELP (Bartel, Fileds, "The Yeast two-Hybrid System", Oxford UP, 1997), se transforma una cepa adecuada de levadura con un plásmido reportero de beta-galactosidasa, un vector de expresión de levadura que contiene ADNc para la ELP, o partes del mismo, fusionados a la secuencia del dominio de enlazamiento del ADN de LexA ("vector de cebado") y un segundo vector de expresión de levadura que contiene un dominio de activación transcripcional fusionado a un conjunto de secuencias de ADNc (biblioteca del "vector presa", por ejemplo biblioteca de embriones RFLY10-12h, descrita en PNAS 93, 301 1ff). Los transformantes triples que contienen al plásmido reportero, y los vectores de cebado y presa se desarrollan entonces sobre medio selectivo, y se seleccionan por la activación que depende de la interacción de los reporteros auxotrópico y beta-galactosidasa. A partir de los clones seleccionados se aísla nuevamente la respectiva construcción presa y se evalúa la especificidad de la interacción cebado/presa, por medio del chequeo de la ausencia de interacción con construcciones de cebado no relacionadas. Finalmente, se secuencian los que interactúan entre sí en forma confirmada y se reúnen los ADNc de longitud completa y se prueba nuevamente la interacción específica con el de cebado.

Ejemplo VIII Inmunohistoquímica

La localización de la proteína ELP se puede realizar sobre un embrión de Drosophila, discos relacionados con el insecto, secciones de tejido de adulto, líneas celulares de tumor de vertebrado, o tejidos de vertebrado utilizando los anticuerpos anti-ELP suministrados por esta invención. Por ejemplo, si se utiliza una línea de células transformadas tal como las células HEK 293 (ATCC), las células se siembran en cámaras de 8 pozos recubiertas con polilisina (Nalge-Nunc Internat.) y se cultivan durante la noche a 37ºC. Al día siguiente, las células se fijan con formaldehído al 3,7% en PBS durante 10 minutos, se permeabilizan en Triton-X-100 al 0,5% durante otros 10 minutos, y se bloquean con una dilución 1:1000 de preinmunosuero en BSA-PBS al 2% durante 1 hora a temperatura ambiente. Se incuban luego las células con una dilución 1:2000 de inmunosuero policlonal de conejo anti-ELP proveído por esta invención durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavan los portaobjetos tres veces durante 5 min en PBS y se los incuba con una dilución 1:200 (v/v) de inmunoglobulina anticonejo de cerdo conjugada con TRITC (Dako, Inc.). Se repite la etapa de lavado antes de aplicar cubreobjetos utilizando medio de montaje Vectashield® (Vector Laboratories, Inc.). Como control positivo para coloración específica, se pueden transfectar parte de las células, por ejemplo por medio de un método de lipofección con un plásmido de expresión de ELP, tal como pcDNA3.1 (Invitrogen). Dos días después de la transfección, se colorean las células de control con anticuerpos anti-ELP como se describió anteriormente.

Ejemplo IX Experimentos con ARN de interferencia

El ARN de interferencia (ARNi) es una forma de silenciar al gen post-transcripcional mediada por los ARN bicatenarios cortos (dsARN) que han sido descritos en plantas, nemátodos, organismos invertebrados y en cultivos de células de mamífero ((Ngo, Tschudi y colaboradores, 1998; Vaucheret y Fagard, 2001) (Kennerdell y Carthew, 1998; Caplen, Fleenor y colaboradores, 2000; Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001; Timmons, Court y colaboradores, 2001). Se ha mostrado que los dsARN inducen una respuesta de degradación en la cual se degrada rápidamente el ARN monocatenario complementario del dsARN corto (Montgomery y Fire, 1998; Montgomery, Xu y colaboradores, 1998). El ARNi puede ser utilizado luego para reducir la expresión génica por ejemplo en organismos completos o en líneas de células de invertebrados y vertebrados (Kennerdell y Carthew, 1998; Caplen, Fleenor y colaboradores, 2000; Clemens, Worby y colaboradores, 2000; Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001). Se pueden encontrar en la literatura diferentes métodos para introducir el dsARN dentro de las células. A manera de ejemplo, describimos aquí el tratamiento de células de Drosophila con dsARN de delp.

Preparación de dsARN para la ELP

El dsARN de la ELP se puede elaborar a partir de moldes de ADNc o de ADN genómico, mientras que la mayor parte del dsARN corresponde a regiones del exón. Normalmente, las regiones objetivo de 700 a 800 pares de bases son las más activas. Sin embargo, se sabe que los dsARN tan cortos como 200 pares de bases y tan largos como 2000 pares de bases tienen una potente actividad de interferencia. Ambas cadenas de ARN se pueden sintetizar simultáneamente a partir de un fragmento de PCR, que contiene por ejemplo un promotor T7, SP6 o T3 en cada extremo. Este fragmento PCR se puede generar por medio de amplificación del ADNc para la ELP o del ADN genómico con 2 iniciadores que contienen por ejemplo sitios de enlazamiento para la polimerasa T7. Las secuencias complementarias de los iniciadores deben ser de 20 a 24 nucleótidos de longitud con un óptimo de 22 nucleótidos y una Tm óptima de 60ºC. El extremo 5' de cada iniciador debe corresponder a, por ejemplo, una secuencia promotora T7 de 27 nucleótidos. La reacción PCR se lleva a cabo entonces con un molde adecuado que contiene secuencias de la ELP. La taq polimerasa proporciona los mejores resultados, pero se puede utilizar también otra Pfu como polimerasa. Los primeros 10 ciclos deben tener una etapa de templado a 40ºC, seguida por 35 ciclos con una etapa de templado a 55ºC. Se puede añadir DMSO hasta una concentración final de 5% cuando se requiera. El extracto en cloroformo-fenol y la precipitación con etanol en NH_{4}OAc pueden ser utilizados para aislar al molde de PCR de la mezcla de reacción, aunque se pueden utilizar también otro kit de purificación por PCR comercialmente disponible. La reacción de síntesis de ARN se puede llevar a cabo en un volumen de 50 \mul con 1 \mug del molde de ADN por PCR utilizando una ARN polimerasa apropiada. Los kits MEGscript^{TM} de Ambion funcionan muy bien. El ARN se vuelve bicatenario durante la reacción de síntesis. El molde de ADN se puede remover con ADNasa libre de ribonucleasa y el dsARN se puede purificar por extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol. Los rendimientos típicos de ARN de un molde de 1 \mug de ADN están en el rango de 80 a 120 \mug. El dsARN puede ser almacenado como un precipitado en NaOAc/etanol a -80ºC hasta inmediatamente antes de usarlo.

La calidad del dsARN puede ser monitoreada por medio de electroforésis en gel de agarosa nativa en TBE. Únicamente se deben utilizar preparaciones en las cuales la movilidad electroforética de la mayor parte del ARN se cambia a la movilidad esperada para el dsARN (muy cercana a la movilidad del doblete de ADN) de la longitud apropiada.

Transfección del dsARN para la ELP dentro de células S2 de Drosophila

Las células S2 se propagan en medio de Drosophila S2 de Schneider (GIBCO) suplementado con FCS al 10%. Un día antes de la transfección se siembran un millón de células en placas de 6 pozos y se las deja crecer durante la noche a 25ºC. Se transfectan luego las células utilizando el lípido catiónico CellFectine (GIBCO) usando una adaptación del protocolo del fabricante. En resumen, se forma un complejo con un total de 5 \mug de ADN y dsARN con 20 \mul de la mezcla del lípido CellFectine en 1,2 ml de medio de crecimiento libre de suero (por ejemplo, medio de expresión DES de Invitrogen, Carlsbad, Estados Unidos). Los complejos se incuban durante 15 min a temperatura ambiente y luego se los añade a las células a las cuales se les ha remplazado el medio normal de crecimiento con 1 ml de medio libre de suero. Cuatro horas después, se añaden 1,2 ml de medio de crecimiento suplementado con FCS al 30% a las células. Un día después de la transfección se reemplaza el medio con medio fresco que contiene FCS al 10%. Las células se pueden analizar a partir de los 2 días después de la transfección (por ejemplo, por el nivel de proteína ELP o por la actividad transcripcional de Tcf).

En forma similar, la expresión de la ELP de mamífero se puede reducir utilizando el método descrito en (Elbashir, Harborth y colaboradores, 2001).

Ejemplo X Identificación y clonación de una variante alternativa de empalme auxiliar y de una est quimérica

Se encontraron dos isoformas est humanas de ELP en la base de datos pública de est: una versión corta y una larga. La corta carece de 54 bases cerca del c-terminal, probablemente debido a empalme diferente o incompleto (Figura 3). Ambas isoformas fueron clonadas por medio de técnicas estándar de biología molecular utilizando iniciadores específicos para el gen y clones de est/ADNc (corto: BE615647, BE61693, BG528377; largo: clon de ADNc AL529948).

hElp reside en 5q, una región cromosómica frecuentemente suprimida en algunos tipos de cáncer (Genomics 2000 Mayo 15; 66(1):26-34). Se postula que, la pérdida de material genético de esta región cromosómica en asocio con un síndrome específico es sugestiva de un mecanismo recesivo de tumorogénesis, y que las bandas suprimidas del cromosoma albergan un supresor tumoral. La actividad inhibidora del crecimiento de la ELP indica que la ELP puede ser la supresora tumoral en esta región.

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Para soportar esta hipótesis, los inventores encontraron por medio de la secuenciación completa de uno de las est de hELP ordenados a partir de la base de datos pública, una est quimérica compuesta del C-terminal de h-ELP fusionada a AF156165, un gen descubierto por medio de mapeo de la región 5q del cromosoma (Genomics 2000, Mayo 15; 66(1):26-34). H-ELP y AF156165 se localizan entre las regiones 5q23 y 5q33 y las 5q31 y 5q32, respectivamente. La est quimérica puede haber surgido de una supresión entre los dos genes y produce una proteína ELP incompleta que carece del dominio de ENTH.

Ejemplo XI Expresión del ARN para la ELP en tejidos normales vs. tumorales

Se hibridaron membranas Cancer Profiling Array (BD Biosciences catálogo No. 7841-1) con una sonda hELP marcada en 5' (nucleótidos 751 a 1951). La hibridación se llevó a cabo a 68ºC, de acuerdo con la recomendación del fabricante con un lavado final utilizando 0,2 x SCC y SDS al 0,5% a 68ºC durante 15 minutos. Para la referencia de la muestra ver el catálogo de BD bioscience. Una transferencia puntiforme que muestra la expresión de ARN para la ELP en un conjunto de tejidos normales vs. tumorales se encuentra en la Figura 5 que muestra la expresión del transcrito de hELP y el porcentaje de tumores que tienen una expresión mayor y menor de ELP se resume en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3 Resumen de los datos de la Figura 5

3

Se observaron reducciones en la expresión de ARNm de hELP comparadas con sus tejidos normales respectivos en la mayoría de las muestras de cáncer de pulmón, de riñón y de estómago. La reducción en la expresión del ARN de la ELP se encontró en alrededor de ¾ de todos los cánceres de pulmón y por encima de la ½ de las muestras de cáncer de riñón y de estómago (indicación de una función potencial de supresión tumoral: "los tumores desean conseguir librarse de él").

Mientras se muestran y se describen las modalidades actualmente preferidas de la invención, se debe entender claramente que la invención no está limitada a ellas sino por el contrario, se pueden incorporar y ser practicadas de diferentes maneras dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

La divulgación de toda la literatura/publicaciones citadas a todo lo largo de la descripción se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

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<110> The Genetics Company

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<120> Proteínas para Regulación del Crecimiento

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<130> 06259PC

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<160> 5

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 2096

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (76)..(1950)

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<223>

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 625

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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<210> 3

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<211> 2705

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<212> ADN

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<213> Drosophila melanogaster

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<220>

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<221> CDS

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<222> (262)..(2208)

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<223>

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<400> 3

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<210> 4

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<211> 649

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<212> PRT

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<213> Drosophila melanogaster

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<400> 4

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<210> 5

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<211> 643

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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Claims

1. Un método in vitro para la identificación de una enfermedad hiperproliferativa o una predisposición genética a la misma, el cual comprende detectar en un fluido corporal o en una muestra de tejido de un individuo un cambio en el nivel de expresión de una proteína de la secuencia Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5 y/o al menos una mutación dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica a dicha proteína o detecta un reordenamiento en el locus genómico que codifica a dicha proteína.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la enfermedad son tumores benignos o malignos.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2 en donde dicha mutación se localiza dentro de la región del ADN que codifica para el dominio de ENTH, en la región no traducida 5', en un codón que codifica a un aminoácido evolucionariamente conservado, en el promotor o en un sitio de empalme.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde dicha mutación conduce a una proteína no funcional, a una expresión reducida de una proteína o no proteína, o a una proteína de fusión.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína es la Seq. Id. No. 1 ó la secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de la secuencia Seq. Id. No. 5.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la enfermedad es cáncer de pulmón.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la enfermedad es cáncer de riñón.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la enfermedad es cáncer de estómago.

9. Un método para la producción de una proteína tipo epsina que comprende la transformación de células huésped adecuadas con un ácido nucleico que codifica a la proteína de la Seq. Id. No. 5 en una construcción para expresión, cultivo de dichas células bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína, y el aislamiento de las proteínas producidas.

10. El uso de un anticuerpo capaz de enlazarse específicamente a un epítopo de la proteína de la secuencia Seq. Id. No. 2 o Seq. Id. No. 5 en un método in vitro para la identificación de una enfermedad hiperproliferativa o una predisposición genética a la misma.

11. El uso del ácido nucleico de la Seq. Id. No. 1 para la producción de un medicamento para el tratamiento por medio de terapia génica de una enfermedad hiperproliferativa asociada con una proteína de la Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5.

12. Una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad hiperproliferativa, que comprende a una proteína como la expuesta en la Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5 y una secuencia de ácido nucleico como la expuesta en la Seq. Id. No. 1 o que codifica a la proteína de la Seq. Id. No. 5.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 para el tratamiento de tumores benignos y malignos.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en donde la enfermedad hiperproliferativa es cáncer de pulmón.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en donde la enfermedad hiperproliferativa es cáncer de riñón.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, en donde la enfermedad hiperproliferativa es cáncer de estómago.

17. El uso de un oligonucleótido que específicamente hibrida a una región de un ARNm que codifica a la proteína de la Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5 para la producción de un medicamento para la terapia de enfermedades hiperproliferativas y/o de enfermedades caracterizadas por una incorrecta diferenciación celular.

18. El uso de la reivindicación 17, en donde dicho oligonucleótido comprende modificaciones químicas.

19. El uso de un ARN bicatenario (dsARN) para silenciamiento génico in vitro en donde dicho ARN tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región de exón de un gen que codifica una proteína de la secuencia Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5.

20. El uso de un ARN bicatenario (dsARN) para la producción de un medicamento para la terapia de enfermedades hiperproliferativas y/o de enfermedades caracterizadas por una incorrecta diferenciación celular, en donde dicho ARN tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región de exón de un gen que codifica a la proteína de la Seq. Id. No. 2 o la Seq. Id. No. 5.

21. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en donde dicho ARN tiene una longitud aproximadamente de 200-2000 pares de bases, preferiblemente 700-800 pares de bases.

22. El uso de la reivindicación 19 ó 20, en donde dicho ARN tiene una longitud aproximadamente de 18-25 pares de bases, preferiblemente 20-22 pares de bases.