ES2286832T3 - Cortistatina: neuropeptidos,composiciones y procedimientos. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE EN GENERAL A ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UN NEUROPEPTIDO DESIGNADO COMO CORTISTATINA. LOS ACIDOS NUCLEICOS DE LA CORTISTATINA, ASI COMO SUS PROTEINAS Y POLIPEPTIDOS, JUNTO CON ANTICUERPOS ANTI - CORTISTATINA SON UTILES TANTO EN PROCEDIMIENTOS DE CLASIFICACION COMO EN LOS DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICO RELACIONADOS CON LA MODULACION DEL SUEÑO Y SUS TRASTORNOS.
Description
Cortistatina: neuropéptidos, composiciones y
procedimientos.
Esta invención se realizó con ayuda del Gobierno
de los Estados Unidos y el Gobierno de los Estados Unidos tiene
ciertos derechos en la invención en conformidad con el Contrato de
Servicio de Salud Pública de Estados Unidos GM32355 y NS22111.
La presente invención se refiere en general al
descubrimiento de un neuropéptido, llamado cortistatina, que
comparte similitud estructural con la somatostatina aunque, a
diferencia de la somatostatina, potencia el sueño de ondas lentas.
El ácido nucleico de cortistatina y los polipéptidos codificados
junto con los anticuerpos anti-cortistatina son
útiles en ambos procedimientos de selección, es decir,
procedimientos de diagnóstico y procedimientos terapéuticos
relacionados con la modulación del sueño y trastornos del mismo.
Los cambios en el estado de vigilia del
despertar al sueño están acompañados por cambios drásticos en el
electroencefalograma (EEG). El patrón de frecuencias altas, de
amplitud baja del EEG del despertar queda dominado por actividad
sincronizada de frecuencia baja, amplitud alta en el sueño de ondas
lentas (SOL), seguido posteriormente por un sueño con movimientos
oculares rápidos (MOR) (Steriade y col., Science,
262:679-685 (1993)). La acetilcolina (ACh) juega un
papel clave en la transición de las diferentes fases del sueño
(Shiromani y col., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.,
27:137-156 (1987)). El SOL necesita bajos niveles de
ACh mientras que el sueño MOR está caracterizado por alto contenido
de ACh. Se ha demostrado también que estas fases del sueño son
sensibles de diferente manera a citocinas y neuropéptidos
endógenos, incluyendo somatostatina, que se sabe aumenta el sueño
MOR sin afectar significativamente otras fases (Borbely y col.,
Physiol. Rev., 69:605-670 (1989).
La presente invención describe la clonación y
caracterización de cortistatina, se ha descubierto que este nuevo
neuropéptido es una molécula moduladora del sueño con efectos
opuestos a aquellos mediados por somatostatina. La cortistatina,
sin embargo, exhibe una fuerte similitud estructural con la
somatostatina. Por consiguiente la obtención de un clon de ADNc a
partir de bibliotecas de selección específicas de cerebro, el ARNm
de cuyo clon se traduce en una proteína activa que se presenta
fisiológicamente, es otro ejemplo de tales moléculas descritas en
las Patentes de EEUU Nº 4.900.811 y 5.242.798.
Aunque ahora se ha determinado que la
cortistatina es el producto de un gen diferente, dada su similitud
estructural con la somatostatina como así también con los aspectos
funcionales descritos en este documento, la cortistatina es un
nuevo miembro de la familia de las somatostatinas cuya distribución
está principalmente restringida a las interneuronas corticales
GABAérgicas.
Se ha demostrado que las neuronas GABAérgicas
modulan finamente la salida de neuronas principales de la corteza
cerebral y el hipocampo (Buhl y col., Nature
368:823-828 (1994)), áreas que han sido implicadas
en el estado de activación y en funciones cognitivas complejas, que
incluyen el aprendizaje y la memoria (Wilson y col., Science,
265:676-679 (1994).
El neuropéptido somatostatina se describió en
primer lugar como un péptido hipotalámico que inhibe la liberación
de hormona del crecimiento (Brazeau y col., Science,
179:77-79 (1973)), y desde entonces se lo ha
implicado en muchos fenómenos fisiológicos, que incluyen la función
del hipocampo y la generación del sueño MOR (Danguir, Brain Res.,
367:26-30 (1986)). En el hipocampo, la somatostatina
está presente fundamentalmente en una serie particular de neuronas.
Ver, Hendry y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU,
81:6526-6530 (1984); Schemehel y col., Neurosci.
Lett., 47:227-232 (1984); y Morrison y col., Brain
Res., 262:344-351 (1983). La somatostatina puede
modular la salida de neuronas piramidales principalmente deprimiendo
la excitabilidad neuronal, en parte a través del aumento de la
corriente M de potasio dependiente del voltaje. Ver, Moore y col.,
Science, 239:278-280 (1988) y Schweitzer y col.,
Nature, 346:464-466 (1990). Los estudios
farmacológicos han mostrado que la somatostatina también interactúa
con sistemas colinérgicos (Araujo y col., J. Neurochem.,
55:1546-1555 (1990) y Mancillas y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., EEUU, 83:7518-7521 (1986)) y GABAérgicos
(Freund y col. Nature, 336:170-173 (1988)), entre
otros, modulando de esta manera sistemas que se piensa que son la
base de diferentes aspectos del comportamien-
to.
to.
Como se muestra en la presente invención, a
pesar de las similitudes físicas entre somatostatina y cortistatina,
la administración de cortistatina in vivo deprime la
actividad eléctrica neuronal pero, a diferencia de la
somatostatina, induce ondas de baja frecuencia en la corteza
cerebral y antagoniza los efectos de acetilcolina en las mediciones
de excitabilidad corticales y del hipocampo, proporcionando de esta
manera un mecanismo para la sincronización cortical relacionado con
el sueño.
\newpage
Fukusumi y col. (Biochemical and Biophysical
Research Communications, vol. 232, Nº 1, 6 de marzo de 1997,
páginas 157-163) describen el clonado y
caracterización del gen de cortistatina humana y del péptido
codificado por el mismo.
El documento
EP-A-0 197 558 describe la secuencia
de aminoácidos de la somatostatina.
Actualmente se ha descubierto, clonado,
secuenciado y caracterizado para su actividad biológica un
neuropéptido de mamífero, llamado cortistatina. La cortistatina se
expresa en interneuronas corticales y del hipocampo de mamíferos,
tiene una secuencia de aminoácidos similar pero distinta de
somatostatina, y tiene propiedades neurológicas que incluyen
depresión neuronal, modulación del sueño y potenciación del sueño de
ondas lentas.
El descubrimiento básico de un nuevo polipéptido
de esta naturaleza proporciona una diversidad de formas de
realización, que incluyen composiciones, procedimientos para su uso
y procedimientos de selección para la identificación de otras
composiciones útiles.
En una forma de realización, la invención
describe una proteína cortistatina sustancialmente aislada y un
polipéptido de cortistatina que incluye una secuencia de restos
aminoácido que definen un polipéptido de cortistatina que tiene una
secuencia que corresponde a una secuencia en el Listado de
Secuencias seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº 2, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y 24. El polipéptido puede ser sintético,
recombinante o una proteína de fusión. También se describen
análogos de polipéptidos de cortistatina.
La invención también describe un ácido nucleico
sustancialmente purificado que tiene una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido de cortistatina que tiene una secuencia
que corresponde a una secuencia en el Listado de Secuencias
seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9,
10, 11, 12, 23 y 24. El ácido nucleico puede estar unido de manera
operativa a un promotor en un vector de expresión. También se
describen los vectores para expresar cortistatina y las células que
contienen dichos vectores. Se describen también los cebadores de
polinucleótidos útiles para hibridar a genes y productos genéticos
de cortistatina (por ejemplo, ARNm).
La invención también contempla un anticuerpo que
inmunorreacciona con cortistatina o con un polipéptido que tiene
una secuencia que corresponde a una secuencia en el Listado de
Secuencias seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº 2, 5,
6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y 24. El anticuerpo puede ser también un
anticuerpo monoclonal.
La invención también contempla un equipo para
detectar la presencia de cortistatina en una muestra del cuerpo
humano que comprende un anticuerpo
anti-cortistatina, polipéptido de cortistatina u
oligonucleótido de la invención.
La invención además contempla procedimientos
para detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica
cortistatina en una muestra del cuerpo humano que contiene ácido
nucleico que comprende las etapas de:
(a) hibridar el ácido nucleico en la muestra del
cuerpo humano con un oligonucleótido que incluye al menos 10
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC
ID Nº 1 desde el nucleótido 324 hasta el nucleótido 366 para formar
un producto de hibridación; y
(b) detectar la presencia del producto de
hibridación.
En un procedimiento relacionado la invención
describe un procedimiento para detectar la presencia de un antígeno
de cortistatina en una muestra del cuerpo humano que comprende las
etapas de:
(a) poner una muestra del cuerpo humano en
contacto con un anticuerpo anti-cortistatina que
inmunorreacciona con cortistatina humana o con un polipéptido que
tiene la secuencia de restos aminoácido mostrada en SEC ID Nº 8
durante un período de tiempo suficiente para que dicho anticuerpo
inmunorreaccione con dicho antígeno presente en la muestra y forme
un complejo de inmunorreacción; y
(b) detectar la presencia de un complejo de
inmunorreacción, detectando de esta manera dicho antígeno.
También se describen procedimientos de selección
para identificar un ligando que se une al receptor de cortistatina
que comprenden:
(a) poner una célula de mamífero que tiene un
receptor de cortistatina en contacto con un ligando candidato bajo
condiciones que permitan la unión de un ligando conocido del
receptor de cortistatina con dicho receptor de cortistatina; y
(b) detectar la presencia de cualquiera de
dichos ligandos candidatos unido a dicho receptor, o:
(a) poner una célula de mamífero que tiene un
receptor de cortistatina en contacto con un ligando candidato bajo
condiciones que permitan la unión de un ligando conocido del
receptor de cortistatina en presencia de un ligando del receptor de
cortistatina marcado; y
\global\parskip0.930000\baselineskip
(b) detectar la presencia de cualquiera de
dichos ligandos marcados unido a dicho receptor.
Pueden también usarse polipéptidos de
cortistatina para detectar directamente la presencia de un receptor
de cortistatina en una muestra de tejido que comprende las etapas
de:
(a) poner una muestra de tejido en contacto con
un ligando de cortistatina aislado bajo condiciones que permitan
unir un ligando conocido de cortistatina a dicho receptor de
cortistatina; y
(b) detectar la presencia del ligando de
cortistatina aislado unido a dicha muestra de tejido.
Los procedimientos terapéuticos para alterar la
expresión genética de cortistatina en una célula están contemplados
y comprenden la introducción en dicha célula de un oligonucleótido
capaz de hibridar específicamente con el gen de cortistatina. Como
alternativa, está contemplado un procedimiento para activar la
respuesta fisiológica del receptor de cortistatina tras unirse a
cortistatina y comprende poner a dicho receptor de cortistatina en
contacto con una composición farmacéutica que comprende un vehículo
fisiológicamente aceptable y una cantidad activadora eficaz de un
agonista del receptor de cortistatina. De manera similar, puede
usarse un antagonista del receptor de cortistatina para inhibir al
receptor.
Pueden ensayarse las mutaciones en el gen de
cortistatina de un mamífero que comprenden una expansión del
dominio CTG del gen de cortistatina, y comprende las etapas de:
(a) determinar la secuencia de nucleótidos del
dominio CTG del gen de cortistatina en una muestra de ácido
nucleico de dicho mamífero; y
(b) comparar la secuencia de nucleótidos
determinada con la secuencia conocida del dominio CTG en un gen
normal de cortistatina para identificar la presencia de una
secuencia de expansión en el dominio CTG, y por consiguiente dicha
mutación.
Puede explotarse la actividad farmacológica de
un polipéptido de cortistatina en un procedimiento para inducir el
sueño en un mamífero, que comprende administrar una composición
fisiológicamente tolerable que contiene una cantidad de un análogo
de cortistatina terapéuticamente eficaz a dicho mamífero. De manera
similar, puede inhibirse el sueño mediante el uso de un antagonista
del receptor de cortistatina.
Los expertos en la técnica encontrarán evidentes
otras formas de realización.
La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos
y la secuencia de aminoácidos predicha de cortistatina de rata como
se describe en el Ejemplo 1. El clon de ADNc de preprocortistatina
muestra un marco de lectura abierto de 336 nucleótidos con un
péptido señal en el extremo N terminal cuyo sitio de escisión está
indicado con una flecha. La repetición de CTG contenida dentro de
la región que codifica la señal del péptido está subrayada. Dos
sitios de escisión proteolítica (KK o KR en negrita) podrían dar
lugar a péptidos con una longitud de 13 aminoácidos (caja con línea
de trazos) y 14 aminoácidos (caja con línea continua), o al
precursor de 29 restos.
La Figura 2 ilustra la alineación de las
secuencias de cortistatina de 29 restos aminoácido (CTS) y
somatostatina de 28 restos aminoácido (SST) como se describen en el
Ejemplo 1.
La Figura 3 ilustra la secuencia de nucleótidos
y la secuencia de aminoácidos predicha de cortistatina de ratón
como se describe en el Ejemplo 1. El clon de ADNc de
preprocortistatina muestra un marco de lectura abierto de 327
nucleótidos con un péptido señal en el extremo N terminal cuyo sitio
de escisión está indicado con una flecha. La repetición de CTG
contenida dentro de la región que codifica el péptido señal está
subrayada. Dos sitios de escisión proteolítica (KS o KK) podrían
dar lugar a péptidos de 13 aminoácidos (caja con línea de trazos) y
a péptidos de 14 aminoácidos (caja con línea continua).
La Figura 3a ilustra la alineación de las
secuencias de nucleótidos de ADNc de preprocortistatina de rata, de
ratón y de ser humano. El ADNc de preprocortistatina humana muestra
un marco de lectura abierto de 315 nucleótidos. La repetición de
CTG que codifica el aminoácido leucina, y que tiene longitud
variable entre especies está subrayada. Dos posibles señales de
poliadenilación están marcadas con un asterisco. Los nucleótidos
conservados entre las tres especies se muestran en la casilla
superior, y aquellos no conservados se muestran en la casilla
inferior.
La Figura 3b ilustra la alineación de las
secuencias de aminoácidos deducidas de los precursores de
cortistatina de rata, de ratón y de ser humano. Los supuestos
sitios de escisión dibásicos se indican en negrita. Se indican los
restos de consenso. Los sitios de escisión proteolítica en
cortistatina humana (RR o RK en negrita) podrían dar lugar a un
péptido de 31 aminoácidos (caja con línea de trazos), un péptido de
29 aminoácidos, y un péptido de 17 aminoácidos (caja con línea
continua).
La Figura 4 ilustra una fotografía de una
transferencia Northern que contiene dos microgramos de ARN
seleccionado con poliA+ de cerebro, pituitaria anterior, glándula
suprarrenal, bazo, timo, ovario y testículos de rata hibridado con
una sonda de ADNc de cortistatina como se describe en el Ejemplo
4.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 5A ilustra el desplazamiento de
^{125}I-somatostatina unida a células pituitarias
GH_{4} por los péptidos, somatostatina-14 y
cortistatina-14, como se describe en el Ejemplo 5.
El desplazamiento por cortistatina-14 se muestra en
los círculos rellenos mientras que el desplazamiento por
somatostatina-14 se muestra en círculos blancos.
Los conteos por minuto por miligramo de somatostatina yodinada
(cpm/mg de proteína) X 10^{-3} se muestran en el eje Y mientras
que la molaridad (M) de los péptidos libres se muestra en el eje X.
Los datos combinados para cuatro experimentos independientes se
trazaron como valores medios \pm el error estándar. Los controles
incluyeron TRH y VIP como se describe en el Ejemplo 5.
La Figura 5B ilustra la estimulación de AMP
cíclico en células GH_{4} tras el tratamiento con VIP, TRH,
somatostatina-14 y cortistatina-14.
El eje Y traza los niveles de AMPc en picomoles por miligramo de
proteína (pmol/mg de proteína) X 10. Las concentraciones de los
reactivos probados se indican en el eje X. Los resultados del
ensayo se discuten en el Ejemplo 5.
La Figura 5C ilustra la inhibición de niveles de
AMPc estimulados por somatostatina-14 y
cortistatina-14. Este ensayo se realizó como se
describe en el Ejemplo 5. En el eje Y se indica el cambio de
concentración de AMPc en pmol/mg de proteína X 10 contra la
concentración de los péptidos para inducción con VIP o TRH en el
eje X. Cada dato representa 2-4 réplicas y los
experimentos se realizaron dos veces.
La Figura 6A ilustra el registro en curso de una
neurona CA1 despolarizada manualmente a -65 mV (el potencial de
reposo de membrana era -70 mV) para provocar un disparo de
potenciales de acción (deflexiones ascendentes, truncadas) por
superfusión con cortistatina-14 1M (registro de
barras ascendentes). El ensayo y los resultados se discuten en el
Ejemplo 8.
La Figura 6B ilustra el registro de fijación de
voltaje de una neurona CA1 mantenida a -43 mV tras el tratamiento
con cortistatina a -1 \muM durante 7 minutos; se evocó una
relajación I_{M} con una etapa de hiperpolarización de 10
mV. Las flechas indican la amplitud de relajación I_{M}
mientras que las líneas de puntos indican una corriente de control
de estado estacionario externa. El ensayo y los resultados se
discuten en el Ejemplo 8.
La Figura 6C ilustra los efectos de
cortistatina-14 en amplitudes de espigas de
población (PS) en neuronas CA1 in vivo. Los ensayos y
resultados se discuten en el Ejemplo 8. Las curvas de respuesta al
estímulo se indican con la amplitud de PS trazada en el eje Y en mV
contra el nivel de estímulo trazado en el eje X en tres niveles de
respuesta: umbral, mitad del máximo y máximo (amplitud media de PS
de mitad del máximo de control = 4,7 mV \pm 0,5; n = 5).
Las Figuras 7A-1 a
7A-4 ilustran el efecto de la administración
intracerebroventricular de cortistatina-14 en el
ciclo de despertar del sueño de la rata. Las Figuras
7A-1, 7A-2, 7A-3 y
7A-4 muestran respectivamente estado de desvelo,
sueño de ondas lentas 1 (SOL1), sueño de ondas lentas 2 (SOL2) y
sueño de movimientos oculares rápidos (MOR). Todos los gráficos
tienen la media \pm el error estándar del porcentaje medio (%) del
tiempo total de los registros trazados en el eje Y contra la
cantidad variable de cortistatina-14 o el control
trazados en el eje X. El ensayo y los resultados se discuten en el
Ejemplo 8.
La Figura 7B ilustra los efectos de acetilcolina
(ACh) (0,9 M) aplicada iontoforéticamente,
somatostatina-14 (1,5 mM) y
cortistatina-14 en respuestas PP en neuronas CA1
in vivo. El porcentaje de respuesta P2/P1 se traza en el eje
Y contra el intervalo interestímulo en milisegundos (mseg) trazado
en el eje X. El control se traza con un círculo vacío mientras que
ACh se indica con una línea de trazos y un cuadrado relleno. Los
resultados con somatostatina-14 se indican con una
línea de trazos marcada con un triángulo abierto y el tratamiento
combinado ACh/cortistatina-14 se indica con una
línea de trazos marcada con un círculo relleno. El ensayo y los
resultados se discuten en el Ejemplo 8.
Las Figuras 7C a 7F representan registros de
potenciales de campo provocados en CA1 por estimulación de comisura
en intervalos de 80 milisegundos. El registro de línea de base se
traza en la Figura 7C con las barras de calibración de 2 mV y 10
ms. La Figura 7D muestra la disminución de inhibición de PP con
administración iontoforética de ACh. La Figura 7E muestra que la
aplicación simultánea de cortistatina-14 con ACh
antagonizó el efecto observado en la Figura 7D. La Figura 7F
muestra la disminución de inhibición de PP obtenida con
somatostatina-14 (barras de calibración de 1 mV y
10 ms). El ensayo y los resultados se discuten en el Ejemplo 8.
La Figura 7G ilustra los efectos de ACh y
cortistatina-14 aplicados microiontoforéticamente
(100-250 nA) en la actividad del EEG registrado en
el córtex visual. El ensayo y los resultados se discuten en el
Ejemplo 8. El espectro de potencia de EEG promedio se traza en el
eje Y en mV2 contra la actividad rápida de respuestas en la línea
de base (columna rellena), tratamiento con ACh (columna con líneas
verticales), tratamiento con cortistatina-14
(columna punteada) y tratamiento con
ACh/cortistatina-14 (columna vacía). El ensayo y los
resultados se discuten en el Ejemplo 8.
Resto Aminoácido: Un aminoácido formado tras la
digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces
peptídicos. Los restos aminoácido descritos en este documento son de
preferencia de la forma isomérica "L". Sin embargo, los restos
de forma isomérica "D" pueden sustituirse por cualquier resto
aminoácido L, siempre que se mantenga la propiedad funcional del
polipéptido. NH_{2} se refiere al grupo amino libre presente en
el extremo amino terminal de un polipéptido. COOH de refiere al
grupo carboxi libre presente en el extremo carboxi terminal de un
polipéptido. Manteniendo la nomenclatura convencional de
polipéptidos (descrita en J. Biol. Chem.,
243:3552-3559 (1969) y adoptada en 37 CFR \NAK
1.822(b)(2)), las abreviaturas para los restos aminoácido se
muestran en la siguiente Tabla de Correspondencia:
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA DE
CORRESPONDENCIA
Deberá notarse que todas las secuencias de
restos aminoácido representados en este documento por medio de
fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la
dirección convencional de amino terminal a carboxi terminal.
Además, la frase "resto aminoácido" se define ampliamente para
incluir los aminoácidos presentados en la lista de la Tabla de
Correspondencia y aminoácidos modificados e inusuales, tales como
aquellos presentados en 37 CFR 1.822(b)(4), e incorporados
en este documento por referencia. Además, deberá notarse que un
trazo en el comienzo o en el final de una secuencia de un resto
aminoácido indica un enlace peptídico con otra secuencia de uno o
más restos aminoácido o un enlace covalente con un grupo amino
terminal tal como NH_{2} o acetilo o con un grupo carboxi
terminal tal como COOH.
\newpage
Molécula de ADNr Recombinante (ADNr): una
molécula de ADN producida uniendo operativamente dos segmentos de
ADN. Por consiguiente, una molécula de ADN recombinante es una
molécula de ADN híbrida que comprende al menos dos secuencias de
nucleótidos que no se encuentran juntas normalmente en la
naturaleza. Se dice que los ADNr sin un origen biológico común, es
decir, diferentes con respecto a evolución, son
"heterólogos".
Vector: una molécula de ADNr capaz de replicar
de manera autónoma en una célula y a la que puede estar unido de
manera operativa un segmento de ADN, por ejemplo un gen o
polinucleótido, para provocar la replicación del segmento unido.
Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes que codifican
uno o más polipéptidos son llamados "vectores de expresión" en
este documento.
Receptor: Un receptor es una molécula, tal como
una proteína, glicoproteína y similar, que puede unirse
específicamente (no aleatoriamente) a otra molécula.
Anticuerpo: El término anticuerpo en sus
diversas formas gramaticales se usa en este documento para referirse
a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente
activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que
contienen un sitio de combinación de anticuerpo o paratope. Los
ejemplos de moléculas de anticuerpos son moléculas de
inmunoglobulinas intactas, moléculas de inmunoglobulinas
sustancialmente intactas y porciones de una molécula de
inmunoglobulina, que incluye aquellas porciones conocidas en la
técnica como Fab, Fab', F(ab)'_{2} y F(v).
Sitio de Combinación de Anticuerpo: Un sitio de
combinación de anticuerpo es aquella porción estructural de la
molécula de anticuerpo que comprende una cadena pesada y una cadena
liviana y regiones hipervariables que se unen específicamente
(inmunorreacciona) con un antígeno. El término inmunorreacciona es
sus diversas formas significa unión específica entre una molécula
que contiene un determinante antigénico y una molécula que contiene
un sitio de combinación de anticuerpo tal como una molécula completa
de anticuerpo o una porción de la misma.
Anticuerpo Monoclonal: Un anticuerpo monoclonal
es sus diversas formas gramaticales se refiere a una población de
moléculas de anticuerpos que contienen sólo una especie de sitio de
combinación de anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un epítopo
particular. Un anticuerpo monoclonal puede por consiguiente contener
una molécula de anticuerpo con una pluralidad de sitios de
combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para un
epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
biespecífico. Aunque históricamente la producción de un anticuerpo
monoclonal se producía inmortalizando una línea celular secretora de
inmunoglobulina pura, puede también prepararse una población pura
de moléculas de anticuerpos por medio de procedimientos de la
presente invención.
Secuencia Arriba: En dirección opuesta a la
dirección de la transcripción de ADN, y por consiguiente desde 5'
hacia 3' en la hebra no codificadora, o desde 3' hacia 5' en el
ARNm.
Secuencia Abajo: Más a lo largo de la secuencia
de ADN en dirección de la transcripción o lectura de secuencia,
esto es en una dirección desde 3' hacia 5' a lo largo de la hebra no
codificadora de ADN o desde 5' hacia 3' a lo largo del transcripto
de ARN.
Marco de Lectura: Secuencia particular de
tripletes de nucleótidos continuos (codones) usados en la traducción
que define la porción de un gen, o gen estructural que codifica la
proteína estructural. El marco de lectura depende de la
localización del codón de inicio de la traducción.
Polipéptido: Una serie lineal de restos
aminoácido conectados uno al otro por medio de enlaces peptídicos
entre el grupo alfa amino y el grupo carboxi de los restos
aminoácido contiguos.
Proteína: Una serie lineal de más de 50 restos
aminoácido conectados uno al otro como en un polipéptido.
Sustancialmente Purificado o Aislado: Cuando se
usa en el contexto de polipéptidos o proteínas, la frase describe
aquellas moléculas que han sido separadas de componentes que
naturalmente las acompañan. Típicamente, una proteína monomérica es
sustancialmente pura cuando al menos aproximadamente 60% hasta 75%
de una muestra exhibe un esqueleto polipeptídico único. Variantes o
modificaciones químicas menores típicamente comparten la misma
secuencia de polipéptidos. Una proteína sustancialmente pura
comprenderá típicamente más de aproximadamente 85% hasta 90% de una
muestra de proteína, más usualmente aproximadamente 95%, y de
preferencia será mas que aproximadamente 99% pura. La pureza u
homogeneidad de proteínas o polipéptidos puede indicarse por medio
de una cantidad de medios bien conocidos en la técnica, tal como la
electroforesis en gen de poliacrilamida de una muestra, seguida por
visualización de la misma mediante tinción. Para ciertos objetivos,
se necesita alta resolución y se usa cromatografía líquida de alto
rendimiento (HPLC) o un medio similar para purificación.
Péptido Sintético: Una cadena de restos
aminoácido producida químicamente unidos juntos por medio de enlaces
peptídicos que está libre de proteínas que se presentan
naturalmente y de fragmentos de las mismas.
Se ha clonado, secuenciado y caracterizado la
cortistatina de una diversidad de especies de mamíferos, lo que
indica que es un neuropéptido que se encuentra en todos los
mamíferos, inclusive en seres humanos, roedores, ratones y
mamíferos similares. El neuropéptido no es idéntico en secuencia de
restos aminoácido entre especies de mamíferos, pero es lo
suficientemente similar para permitir generalizaciones con respecto
a función, y asegura que puede identificarse y aislarse el gen de
cortistatina en cualquier especie de mamífero.
Por consiguiente, las variaciones a nivel de
secuencia de aminoácidos y de secuencia de nucleótidos están
descritas en aislados de cortistatina, y tales variaciones no deben
interpretarse como limitantes. Por ejemplo, la variación alélica
dentro de especies de mamíferos puede tolerar un porcentaje variado
de diferencias entre aislados de cortistatina, cuyas diferencias
comprenden variantes de restos aminoácido no perjudiciales. Por
consiguiente una proteína con aproximadamente 95% de homología, y de
preferencia al menos 98% de homología, con una cortistatina
descrita se considera una variante alélica de la cortistatina
descrita, y por consiguiente se considera una cortistatina de esta
invención.
Como se describe en este documento, la
cortistatina se produce en primer lugar in vivo en forma de
precursor, y a continuación se procesa dando polipéptidos más
pequeños con actividad biológica como se describe en este
documento. En la medida en que estas diferentes formas de
polipéptidos se contemplan como útiles, el término proteína o
polipéptido de cortistatina incluye necesariamente a todas las
especies de polipéptidos que tienen una secuencia de restos
aminoácido derivada del gen de cortistatina.
La secuencia de nucleótidos codificadores
completa de ADNc de preprocortistatina de rata tiene una longitud
de 438 nucleótidos como se muestra en la Figura 1 y se presenta en
SEC ID Nº 1. El clon de ADNc de preprocortistatina completo
presenta un marco de lectura abierto (ORF) de 336 nucleótidos con un
péptido señal N terminal cuyo sitio de escisión está entre las
posiciones 27 y 28 de aminoácidos que corresponden al sitio de
escisión tras la posición de nucleótidos 110.
La traducción de esta secuencia de ADNc de rata
codifica una proteína nueva de 112 restos aminoácido, llamada
preprocortistatina de rata. La secuencia de aminoácidos de
preprocortistatina de rata se presenta también en SEC ID Nº 1 con
la secuencia de nucleótidos y sola en SEC ID Nº 2.
La escisión de las preproespecies para dar
procortistatina de rata produce una proteína madura que se procesa
en cualquiera de dos pares de aminoácidos básicos conjuntos, KK
(lys-lys) o KR (lys-arg) para
producir proteínas de cortistatina maduras llamadas
cortistatina-29 y cortistatina-14.
Este patrón de escisión es análogo a la escisión de
preprosomatostatina en los restos 28 y 14 como describen Glushankov
y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU, 81:6662-6666
(1984). Como alternativa, la escisión en ambos pares básicos da como
resultado la cortistatina-13 madura además de
cortistatina-14. Las preproespecies de rata junto
con las proespecies y productos de escisión maduros se presentan en
los Ejemplos en la Tabla 1 que incluye sus secuencias de restos
aminoácido conocidas.
Aunque la cortistatina-13 no
está relacionada con especies conocidas, la
cortistatina-14 comparte 11 de 14 restos con la
somatostatina-14 como se discute en el Ejemplo
1.
Por consiguiente, las diferencias de aminoácidos
y nucleótidos conocidas entre somatostatina y cortistatina indican
claramente que son productos de genes separados.
El homólogo de ratón al ADNc de
preprocortistatina de rata tiene una secuencia de nucleótidos
completa de 427 nucleótidos de longitud, como se muestra en la
Figura 3 y se presenta en SEC ID Nº 4. El clon de ADNc de
preprocortistatina completo presenta un marco de lectura abierto
(ORF) de 327 nucleótidos con un péptido señal N terminal cuyo sitio
de escisión está entre las posiciones 25 y 26 de aminoácidos que
corresponde con un sitio de escisión tras la posición de nucleótido
99.
La traducción de esta secuencia de ADNc de ratón
proporciona una proteína nueva de 109 restos aminoácido, llamada de
manera provisoria preprocortistatina. La secuencia de aminoácidos de
preprocortistatina de ratón se presenta en SEC ID Nº 4 con la
secuencia de nucleótidos y sola en SEC ID Nº 5.
De manera similar a la preprocortistatina de
rata, la escisión de las preproespecies de ratón para dar
procortistatina genera una proteína madura que se procesa en
cualquiera de dos pares de aminoácidos básicos conjuntos, KS
(lys-ser) y KK (lys-lys), para
producir cortistatina-29 de ratón y
cortistatina-14 de ratón. Como en los patrones de
escisión de rata, se producen dos especies pequeñas de cortistatina
de ratón de 13 y 14 restos aminoácido cuando la escisión tiene
lugar en ambas series de restos básicos. Las preproespecies de ratón
junto con las proespecies y las proteínas maduras se presentan en
la Tabla 1 en los Ejemplos que incluyen sus secuencias de restos
aminoácidos conocidas.
Introduciendo dos huecos, las secuencias de
nucleótidos de ratón y de rata son 86% idénticas. Asumiendo que el
producto de inicio de traducción de ratón comienza en el segundo
triplete de metioninas, contiene 108 aminoácidos comparado con 112
para rata. Una vez más, tras introducir dos huecos, las proteínas de
ratón y de rata comparten 82% de identidad. La secuencia de
nucleótidos de ratón que corresponde a
cortistatina-14 y el doblete de lisina adyacente
que sirve como su sitio de liberación proteolítica de su precursos
fueron idénticos a la misma región en la secuencia de rata,
confirmando de esta manera una conservación funcional del péptido
maduro. La secuencia de ADN secuencia arriba desde el sitio de
procesamiento de cortistatina-14 mostró varios
puntos de divergencia, que incluyen algunos que dan como resultado
sustituciones no conservativas de aminoácidos.
En vista de los dominios conservados y los
sitios de escisión para generar proteínas de cortistatina maduras
para dos mamíferos, ratas y ratones, resultan identificables
patrones de escisión y especies de proteínas resultantes similares
en otros mamíferos incluyendo seres humanos.
El homólogo humano al ADNc de preprocortistatina
de rata tiene una secuencia de nucleótidos codificadores completa
de 701 nucleótidos de longitud, como se muestra en la Figura 3a y se
presenta en SEC ID Nº 25. El clon de ADNc de preprocortistatina
completo presenta un marco de lectura abierto de 315 nucleótidos,
comenzando en la posición 78 de SEC ID Nº 25.
La traducción de esta secuencia de ADNc humano
proporciona una proteína nueva de 105 restos aminoácido, llamada de
manera provisoria preprocortistatina humana. La secuencia de
aminoácidos de preprocortistatina humana se muestra en la Figura
3b, y se presenta en SEC ID Nº 26.
De manera similar a la preprocortistatina de
rata, la escisión de las preproespecies humanas para dar
procortistatina genera una proteína madura que se procesa en
cualquiera de dos pares de aminoácidos básicos conjuntos, RR
(arg-arg), para producir
cortistatina-29 humana (posiciones 77 a 105 de SEC
ID Nº 26) y cortistatina-17 humana (posiciones 89 a
105 de SEC ID Nº 26). Las preproespecies humanas junto con las
proespecies y las proteínas maduras se presentan en la Tabla 1 en
los Ejemplos que incluyen sus secuencias de restos aminoácidos
conocidas.
Las secuencias de nucleótidos de rata y de ser
humano son 71% idénticas. La cortistatina-17 humana
comparte 13 de los últimos 14 restos con la
cortistatina-14 de rata y de ratón. El doblete de
lisina que se encuentra en posición N terminal a
cortistatina-14 en rata y en ratón no está
conservado en la secuencia humana. La secuencia de ADN secuencia
arriba desde el sitio de procesamiento de
cortistatina-14 no está muy conservada a través de
las especies. Sin embargo, la cortistatina-31 de
rata y la cortistatina-31 de ser humano (posiciones
44 a 74 de SEC ID Nº 26) comparten 13 restos agrupados en sus
regiones N terminales que están conservadas entre las secuencias de
prohormona de rata, de ratón y de ser humano.
Una proteína cortistatina de esta invención
puede estar en una diversidad de formas, dependiendo del uso de la
misma, como se describe en este documento. Por ejemplo, una
cortistatina puede aislarse de un tejido natural.
Como alternativa, una cortistatina de esta
invención puede ser una proteína recombinante, esto es, producida
por medio de procedimientos de ADN recombinante (ADNr) como se
describe en este documento. Una proteína cortistatina recombinante
no precisa necesariamente ser sustancialmente pura, o inclusive
aislada, para ser útil en ciertas formas de realización, aunque los
procedimientos de producción recombinante son los medios de
preferencia para producir una fuente para otra purificación para
dar una composición de receptor aislada o sustancialmente pura. Una
proteína cortistatina puede estar presente en una línea celular de
mamífero o en extractos brutos de una línea celular de
mamífero.
En una forma de realización, una proteína
cortistatina está sustancialmente libre de otros neuropéptidos, de
manera que la pureza de un reactivo de cortistatina y el hecho de
estar libre de proteínas farmacológicamente distintas permite el
uso en los procedimientos de selección. Los procedimientos de
producción recombinante se establecen de manera ideal para producir
pureza absoluta al respecto, aunque también están contemplados
procedimientos bioquímicos de purificación de fuentes naturales. Con
respecto a esto, una proteína cortistatina está sustancialmente
libre de otros neuropéptidos si hay insuficiente cantidad de otros
neuropéptidos de manera que no se detecta reactividad farmacológica
cruzada en ensayos de selección convencionales para unión de
ligandos o ensayos de actividad biológica.
De preferencia, una proteína cortistatina de
esta invención está presente en una composición en una forma
aislada, es decir, que comprende al menos aproximadamente 0,1 por
ciento en peso de la composición total, de preferencia al menos 1%,
y de más preferencia al menos aproximadamente 90%. Resulta de
particular preferencia una preparación pura de cortistatina, esto
es al menos 90% en peso, y de más preferencia al menos 99% en peso.
Los procedimientos bioquímicos útiles para el enriquecimiento y
preparación de una cortistatina aislada en base a las propiedades
químicas de un polipéptido son bien conocidos, y pueden usarse de
manera rutinaria para la producción de proteínas enriquecidas en
más del 99% en peso.
Puede usarse una proteína cortistatina
recombinante de esta invención para una diversidad de objetivos,
como se describe además en este documento. Puede usarse una
proteína cortistatina como un inmunógeno para producir anticuerpos
inmunorreactivos con cortistatina. Las proteínas de cortistatina
pueden usarse en ensayos de unión de ligandos in vitro para
identificar especificidades de unión a ligandos, y agonistas y
antagonistas de los mismos, para caracterizar compuestos
farmacéuticos candidatos útiles para modular la función de la
cortistatina, y como agentes terapéuticos para provocar funciones
de cortistatina. Otros usos resultarán evidentes para los expertos
en la técnica.
Además, la invención contempla análogos de una
proteína cortistatina de esta invención. Un análogo es una variante
hecha por el hombre que exhibe las cualidades de una cortistatina de
esta invención en términos de reactividad inmunológica, capacidad
de unión a ligandos o propiedades funcionales similares a las de una
proteína cortistatina de esta invención. Un análogo puede, por
consiguiente, ser un producto de escisión de cortistatina, puede
ser un polipéptido que corresponde a una porción de cortistatina,
puede ser un polipéptido de cortistatina en el que se ha eliminado
el anclaje a membrana, y puede ser una secuencia variante de
cortistatina en la que algunos restos aminoácido han sido
alterados, para nombrar unas pocas permutaciones.
En la medida en que la presente descripción
identifica cortistatina de diferentes especies de mamíferos, la
presente invención no estará limitada a una proteína cortistatina
derivada de una o pocas especies de mamíferos. Por consiguiente, la
invención contempla una proteína cortistatina de mamífero, que puede
derivar, por ADNr o purificación bioquímica de fuentes naturales,
de cualquiera de una diversidad de especies que incluyen ser
humano, ratón, conejo, rata, perro, gato, oveja, vaca, y especies
similares de mamíferos, sin limitación. Resultan particularmente de
preferencia las especies animales relevantes desde el punto de vista
humano y agrícola.
Las especies ejemplares de cortistatina
identificadas en este documento son la cortistatina de ratón, de
rata y de ser humano.
La secuencia de nucleótidos (ADNc) de
preprocortistatina de rata se muestra en SEC ID Nº 1, y la secuencia
correspondiente de aminoácidos de preprocortistatina de rata se
muestra en SEC ID Nº 2. La secuencia de restos aminoácido de
procortistatina de rata se muestra en SEC ID Nº 6, y los productos
de escisión se muestran en SEC ID Nº 7, 8 y 9.
La secuencia de nucleótidos (ADNc) de
preprocortistatina de ratón se muestra en SEC ID Nº 4, y la
secuencia correspondiente de aminoácidos de preprocortistatina de
ratón se muestra en SEC ID Nº 5. La secuencia de restos aminoácido
de procortistatina de rata se muestra en SEC ID Nº 10, y los
productos de escisión se muestran en SEC ID Nº 8, 11 y 12.
La secuencia de nucleótidos (ADNc) de
preprocortistatina humana se muestra en SEC ID Nº 25, y la secuencia
correspondiente de aminoácidos de preprocortistatina humana se
muestra en SEC ID Nº 26. Las secuencias de aminoácidos de productos
de escisión están localizadas en las posiciones 44 y 74
(cortistatina-31 humana), posiciones 77 a 105
(cortistatina-29 humana), y posiciones 89 a 105
(cortistatina-17 humana) de SEC ID Nº 26. El
péptido llamado cortistatina-14 está muy conservado
entre las especies, y es idéntico en secuencia entre ratón y rata y
comparte 13 de los últimos 14 restos con la
cortistatina-17 humana. La secuencia de restos
aminoácido cortistatina-14 de ratón y de rata se
muestra en SEC ID Nº 8, y la secuencia de restos aminoácido de
cortistatina-17 humana se muestra en las posiciones
89 a 105 de SEC ID Nº 26.
Puede prepararse una proteína cortistatina de
esta invención a través de una diversidad de medios, aunque resulta
de preferencia la expresión en una célula de mamífero usando un
vector de expresión de ADNr. En los Ejemplos se describen
procedimientos de producción ejemplares para una cortistatina
recombinante.
Por consiguiente, la invención también
proporciona un procedimiento para la producción de proteínas de
cortistatina aisladas, como proteínas de cortistatina intactas,
como proteínas de fusión o como fragmentos de polipéptidos más
pequeños de cortistatina. El procedimiento de producción
generalmente incluye la inducción de células para expresar una
proteína cortistatina de esta invención, recuperando la cortistatina
de las células resultantes, y purificando la cortistatina
recuperada de esa manera mediante procedimientos bioquímicos de
fraccionamiento, usando un anticuerpo específico de esta invención,
u otros procedimientos químicos.
La etapa de inducción puede comprender la
inserción de un vector de ADNr que codifica una proteína
cortistatina, o fragmento de la misma, de esta invención, cuyo ADNr
es capaz de expresar una cortistatina, en una célula huésped
adecuada, y expresar el gen de cortistatina del vector.
Como se usa en este documento, la frase
"polipéptido de cortistatina" se refiere a un polipéptido que
tiene una secuencia de restos aminoácido que comprende una
secuencia de restos aminoácido que corresponde, y de preferencia es
idéntica, a una porción de una cortistatina de esta invención.
Un polipéptido de cortistatina de la presente
invención tiene una diversidad de usos de acuerdo con la presente
invención.
Por consiguiente, un polipéptido de cortistatina
de esta invención está caracterizado por su capacidad para imitar
inmunológicamente un epítopo (determinante antigénico) expresado por
una cortistatina de esta invención. Tal polipéptido es útil en este
documento como un componente en un inóculo para producir anticuerpos
que inmunorreaccionan con la cortistatina nativa y como un antígeno
en procedimientos inmunológicos. En este documento se muestran
polipéptidos de cortistatina de preferencia y representativos para
uso como un inmunógeno en un inóculo.
Como se usa en este documento, la frase "imita
inmunológicamente" en sus diversas formas gramaticales se refiere
a la capacidad de un polipéptido de cortistatina de esta invención
para inmunorreaccionar con un anticuerpo de la presente invención
que reconoce un epítopo nativo conservado de una cortistatina como
se define en este documento.
Deberá entenderse que un polipéptido del tema no
necesita ser idéntico a la secuencia de restos aminoácido de un
receptor de cortistatina, siempre que incluya la secuencia
necesaria.
\global\parskip0.880000\baselineskip
Además, ciertos polipéptidos de cortistatina
derivados de porciones de cortistatina de unión al receptor tienen
la capacidad de inhibir la unión de la cortistatina que normalmente
se uniría al receptor de cortistatina. Por consiguiente, la
invención también contempla polipéptidos de cortistatina que están
específicamente diseñados para su capacidad para imitar regiones
expuestas a cortistatina involucradas en las interacciones de unión
de cortistatina al receptor y por consiguiente en la función del
receptor. Por lo tanto, estos polipéptidos tienen la capacidad de
funcionar como análogos de cortistatina, y por consiguiente bloquean
la función. Tales inhibidores de unión son denominados polipéptidos
terapéuticos por su capacidad inhibidora.
Además, los polipéptidos correspondientes a los
dominios expuestos tienen la capacidad de inducir moléculas de
anticuerpos que inmunorreaccionan con una cortistatina de esta
invención en porciones de cortistatina involucradas en la función
de la proteína como receptor, y por consiguiente los anticuerpos son
también útiles en la modulación de la función normal de la
cortistatina.
Un polipéptido de cortistatina de preferencia
tiene una longitud de no más de aproximadamente 120 restos
aminoácido por razones de facilidad de síntesis. Por consiguiente,
resulta de más preferencia que un polipéptido de cortistatina tenga
una longitud de no más de aproximadamente 100 restos aminoácido, de
más preferencia aún no más de aproximadamente 50 restos, y de mayor
preferencia menos de aproximadamente 30 restos aminoácido cuando se
usan procedimientos sintéticos de producción.
Por consiguiente, la presente invención también
contempla un polipéptido de cortistatina que tiene una secuencia de
restos aminoácido que corresponde con la secuencia de la proteína
cortistatina mostrada en el listado de secuencias, e incluye una
secuencia de restos aminoácido representada por una fórmula
seleccionada del grupo constituido por los polipéptidos mostrados
en los listados de secuencias. En esta forma de realización, el
polipéptido además está caracterizado por tener la capacidad de
imitar un epítopo de cortistatina y por consiguiente inhibe la
función de cortistatina en un ensayo clásico de activación del
receptor de cortistatina, como se describe en este documento.
Debido a la estructura tridimensional de una
molécula plegada de cortistatina nativa, la presente invención
contempla que múltiples regiones de cortistatina están involucradas
en la función de receptor de cortistatina, cuyas múltiples y
diversas regiones están definidas por medio de los diversos
polipéptidos de cortistatina descritos anteriormente. La capacidad
de los polipéptidos descritos anteriormente para inhibir la unión de
ligando a receptor puede medirse fácilmente en un ensayo de unión
de ligandos como se muestra en los Ejemplos en este documento. De
manera similar, la capacidad de los polipéptidos mencionados
anteriormente para inhibir la función de receptor de cortistatina
puede medirse fácilmente en un ensayo de receptor como se describe
en este documento.
Por consiguiente, en otra forma de realización,
la invención contempla composiciones de polipéptidos de cortistatina
que comprenden uno o más de los polipéptidos de cortistatina
descritos anteriormente que inhiben la función de receptor de
cortistatina, en una mezcla en combinaciones para proporcionar la
inhibición simultánea de múltiples sitios de contacto en el
receptor de cortistatina.
Un polipéptido en cuestión incluye cualquier
análogo, fragmento o derivado químico de un polipéptido cuya
secuencia de restos aminoácido se muestra en este documento siempre
que el polipéptido sea capaz de imitar un epítopo de cortistatina.
Por consiguiente, un polipéptido presente puede estar sometido a
diversos cambios, sustituciones, inserciones y deleciones en los
que tales cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. Al
respecto, un polipéptido de cortistatina de esta invención
corresponde con, si no es idéntico a, la secuencia de una proteína
cortistatina en la que tras hacer uno o más cambios mantiene la
capacidad de inducir la producción de anticuerpos que
inmunorreaccionan con una cortistatina de esta invención.
El término "análogo" incluye cualquier
polipéptido que tiene una secuencia de restos aminoácido
sustancialmente idéntica a la secuencia mostrada específicamente en
este documento en la que uno o más restos han sido sustituidos de
manera conservativa con un resto funcionalmente similar y que
muestra la capacidad de inducir la producción de anticuerpos como
se describe en este documento. Los ejemplos de sustituciones
conservativas incluyen la sustitución de un resto no polar
(hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por
otro, la sustitución de un resto polar (hidrófilo) por otro tal
como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre
glicina y serina, la sustitución de un resto básico tal como lisina,
arginina o histidina por otro, o la sustitución de un resto ácido,
tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.
La frase "sustitución conservativa" también
incluye el uso de un resto químicamente derivatizado en lugar de un
resto no derivatizado siempre que dicho polipéptido muestre la
actividad de unión requerida.
"Derivado químico" se refiere a un
polipéptido del tema que tiene uno o más restos químicamente
derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. Tales
moléculas derivatizadas incluyen por ejemplo, aquellas moléculas en
las que los grupos amino libres han sido derivatizados para formal
clorhidratos de amina, grupos p-toluensulfonilo,
grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo,
grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres
pueden derivatizarse para formar sales, metil y etil ésteres u otros
tipos de ésteres o hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden
derivatizarse para formar derivados O-acilo u
O-alquilo. El nitrógeno de imidazol de histidina
puede derivatizarse para formar
N-im-bencilhistidina. También se
incluyen como derivados químicos aquellos péptidos que contienen
uno o más derivados de aminoácidos que se presentan naturalmente de
los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo:
4-hidroxiprolina puede ser sustituida por prolina;
5-hidroxilisina puede ser sustituida por lisina;
3-metilhistidina puede ser sustituida por histidina;
homoserina puede ser sustituida por serina; y ornitina puede ser
sustituida por lisina. También pueden incluirse
D-aminoácidos en lugar de uno o más
L-aminoácidos. Los polipéptidos de la presente
invención también incluyen cualquier polipéptido que tenga una o
más adiciones y/o deleciones o restos relacionados con la secuencia
de un polipéptido cuya secuencia se muestra en este documento,
siempre que se mantenga la actividad requerida.
El término "fragmento" se refiere a
cualquier polipéptido del tema que tiene una secuencia de restos
aminoácido más corta que aquella del polipéptido cuya secuencia de
restos aminoácido se muestra en este documento.
Cuando un polipéptido de la presente invención
tiene una secuencia que no es idéntica a la secuencia de un
polipéptido de cortistatina, esto es típicamente porque se han hecho
una o más sustituciones no conservativas, usualmente se han
sustituido no más de aproximadamente 30 por ciento, más usualmente
no más de 20 por ciento, y de preferencia no más de 10 por ciento
en número de restos aminoácido. Pueden también agregarse restos
adicionales en cada extremo con el objetivo de proporcionar un
"conector" por el que los polipéptidos de esta invención
pueden fijarse convenientemente a un marcado o matriz sólida, o
vehículo. De preferencia los restos conectores no forman un epítopo
de cortistatina, es decir, no son similares en estructura a la
proteína cortistatina.
Los marcadores, matrices sólidas y vehículos que
pueden usarse con los polipéptidos de esta invención se describen a
continuación.
Los restos aminoácido conectores son usualmente
al menos un resto y pueden ser 40 o más restos, más frecuentemente
1 a 10 restos, pero no forman un epítopo de cortistatina. Los restos
aminoácido típicos que se usan para conectar son tirosina,
cisteína, lisina, ácido glutámico y ácido aspártico o similar.
Además, un polipéptido del tema puede deferir, a menos que se
especifique de otra manera, de la secuencia natural de una proteína
cortistatina por la modificación de la secuencia por acilación del
extremo NH_{2} terminal, por ejemplo, acetilación, o amidación de
ácido tioglicólico, por carboxilamidación terminal, por ejemplo, con
amoniaco, metilamina y similares.
Cuando está acoplado con un vehículo para formar
lo que se conoce en la técnica como un conjugado
vehículo-hapteno, un polipéptido de cortistatina de
la presente invención es capaz de inducir la producción de
anticuerpos que inmunorreaccionan con cortistatina. En vista de del
principio bien establecido de reactividad inmunológica cruzada, la
presente invención contempla por consiguiente variantes
antigénicamente relacionadas de los polipéptidos mostrados en este
documento. Una "variante antigénicamente relacionada" es un
polipéptido del tema que es capaz de inducir la producción de
moléculas de anticuerpos que inmunorreaccionan con un polipéptido
descrito en este documento y con una proteína cortistatina de esta
invención.
Puede usarse cualquier péptido de la presente
invención en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los
ácidos adecuados capaces de formar sales con los péptidos de la
presente invención incluyen ácidos inorgánicos tales como ácido
clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido perclórico, ácido nítrico,
ácido tiociánico, ácido sulfúrico, ácido acético fosfórico, ácido
propiónico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido pirúvico, ácido
oxálico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido
fumárico, ácido antranílico, ácido cinámico, ácido
naftalensulfónico, ácido sulfanílico o similares.
Las bases adecuadas capaces de formar sales con
los péptidos de la presente invención incluyen bases inorgánicas
tales como hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de
potasio y similares; y las bases orgánicas tales como mono-, di- y
tri-alquil y aril aminas (por ejemplo trietilamina,
diisopropilamina, metilamina, dimetilamina y similares) y
etanolaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo, etanolamina,
dietanolamina y similares).
Un polipéptido de cortistatina de la presente
invención, también denominado polipéptido del tema en este
documento, puede sintetizarse por medio de cualquier técnica
conocida por aquellos expertos en la técnica de polipéptidos,
incluyendo técnicas de ADN recombinante. Las técnicas de síntesis
química, tales como la síntesis en fase sólida de tipo Merrifield,
son de preferencia por razones de pureza, especificidad antigénica,
resultados libres de productos secundarios, facilidad de producción
y similares. Puede encontrarse un excelente resumen de muchas
técnicas disponibles en J. M. Steward y J. D. Young, "Solid Phase
Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M.
Bodanszky, y col., "Peptide Synthesis", John Wiley & Sons,
Segunda Edición, 1976 y J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and
Peptides", Volumen 2, página 46, Academic Press (Nueva York),
1983 para síntesis en fase sólida, y E. Schroder y K. Kubke, "The
Peptides", Volumen 1, Academic Press (Nueva York), 1965 para
síntesis clásica en solución. Otros procedimientos de síntesis de
péptidos están descritos por Sutcliffe en las Patente de EEUU Nº
4.900.811 y 5.242.798. Los grupos protectores adecuados utilizables
en tales síntesis están descritos en los textos anteriores y en J.
F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum
Press, Nueva York, 1973.
En general, los procedimientos de síntesis en
fase sólida contemplados comprenden el agregado secuencial de uno o
más restos aminoácido o restos aminoácido protegidos adecuadamente a
una cadena peptídica en crecimiento. Normalmente, el grupo amino o
el grupo carboxilo del primer resto aminoácido se protege por medio
de un grupo protector adecuado que se puede eliminar
selectivamente. Para aminoácidos que contienen un grupo lateral
reactivo tal como lisina se usa un grupo protector diferente, que
se puede eliminar selectivamente.
Usando una síntesis en fase sólida como las
ejemplificadas, el aminoácido protegido o derivatizado se une a un
soporte sólido inerte a través de su grupo carboxilo o amino
desprotegido. A continuación se elimina selectivamente el grupo
protector del grupo amino o carboxilo y se mezcla el siguiente
aminoácido en la secuencia que tiene el grupo complementario (amino
o carboxilo) adecuadamente protegido y se hace reaccionar bajo
condiciones adecuadas para formar el enlace amida con el resto ya
unido al soporte sólido. Posteriormente se elimina el grupo
protector del grupo amino o carboxilo de este resto aminoácido nuevo
agregado, y se agrega el siguiente aminoácido (protegido
adecuadamente), y así sucesivamente. Una vez que todos los
aminoácidos deseados se unieron en la secuencia adecuada, se
eliminan de manera secuencial o simultánea cualquier grupo protector
lateral y terminal (y el soporte sólido), para dar el polipéptido
final.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Un polipéptido de cortistatina puede usarse,
inter alia, en los procedimientos y sistemas de diagnóstico
de la presente invención para detectar un receptor de cortistatina
o la cortistatina misma presente en una muestra del cuerpo, o puede
usarse para preparar un inóculo como se describe en este documento
para la preparación de anticuerpos que inmunorreaccionan con
epítopos conservados en cortistatina.
Además, ciertos de los polipéptidos de
cortistatina de esta invención pueden usarse en procedimientos
terapéuticos de la presente invención para inhibir la función de
cortistatina como se describe además en este documento.
Los segmentos de ADN de la presente invención se
caracterizan por incluir una secuencia de ADN que codifica una
proteína cortistatina de esta invención. Esto es, los segmentos de
ADN de la presente invención se caracterizan por la presencia de
algo o parte de un gen estructural de cortistatina. De preferencia
el gen está presente como una serie lineal ininterrumpida de
codones donde cada codón codifica un resto aminoácido que se
encuentra en la proteína cortistatina, es decir, un gen libre de
intrones.
Una forma de realización de preferencia es un
segmento de ADN que codifica una secuencia de restos aminoácido que
define una proteína cortistatina como se define en este documento, y
el segmento de ADN es capaz de expresar una proteína cortistatina
de esta invención. Un segmento de ADN de preferencia codifica una
secuencia de restos aminoácido sustancialmente igual a y, de
preferencia constituida esencialmente por, una secuencia de restos
aminoácido mostrada en el listado de secuencias para una proteína
cortistatina, tal como en SEC ID Nº 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,
26, posiciones 44 a 74 de SEC ID Nº 26, posiciones 77 a 105 de SEC
ID Nº 26, y posiciones 89 a 105 de SEC ID NO 26. Los segmentos de
ADN particularmente de preferencia tienen una secuencia de
nucleótidos derivada de la secuencia mostrada en SEC ID Nº 1, 4 ó
25. Los segmentos de ADN de preferencia y representativos están
descritos en los Ejemplos.
También están contempladas las secuencias de ARN
y ADN homólogas que codifican la proteína cortistatina anterior.
La secuencia de restos aminoácido de una
proteína o polipéptido está directamente relacionada a través del
código genético con la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN)
del gen estructural que codifica la proteína. Por consiguiente, un
gen o segmento de ADN estructural puede definirse en términos de
secuencia de restos aminoácido, es decir, la proteína o polipéptido
que codifica.
Una característica importante y bien conocida
del código genético es su redundancia. Esto es, para la mayoría de
los aminoácidos usados para formar proteínas, más de un triplete de
nucleótidos codificante (codón) puede codificar o designar un resto
aminoácido particular. Por consiguiente, una cantidad de secuencias
de nucleótidos diferentes puede codificar una secuencia de restos
aminoácido particular. Se considera a tales secuencias de
nucleótidos funcionalmente equivalentes ya que pueden dar como
resultado la producción de la misma secuencia de aminoácidos en
todos los organismos. Ocasionalmente, pueden incorporarse una
variante metilada de purina o pirimidina a una secuencia de
nucleótidos dada. Sin embargo, tales metilaciones no afectan la
relación de codificación de ninguna manera.
Un ácido nucleico es cualquier polinucleótido o
fragmento de ácido nucleico, ya sea un polirribonucleótido o
polidesoxirribonucleótido, es decir, ARN o ADN, o análogos de los
mismos. En formas de realización de preferencia, una molécula de
ácido nucleico está en la forma de una segmento de ADN de doble
hebra, es decir, un segmento de ADN, aunque para ciertos
procedimientos biológicos, resulta de preferencia el ADN o ARN de
una hebra.
Los segmentos de ADN (es decir, oligonucleótidos
sintéticos) que codifican porciones de proteínas cortistatina
pueden sintetizarse fácilmente por medio de técnicas químicas, por
ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci, y col. (J. Am.
Chem. Soc., 103:3185-3191, 1981) o usando
procedimientos automatizados de síntesis. Además, pueden prepararse
segmentos de ADN más largos fácilmente mediante procedimientos bien
conocidos, tales como la síntesis de un grupo de oligonucleótidos
que definen el segmento de ADN, seguido por la hibridación y unión
de los oligonucleótidos para construir un segmento completo.
Por supuesto, sintetizando químicamente la
secuencia codificadora, puede realizarse fácilmente cualquier
modificación deseada simplemente sustituyendo las bases adecuadas
por aquellas que codifican la secuencia de restos aminoácido
nativa.
Además, pueden obtenerse segmentos de ADN
constituidos esencialmente por genes estructurales que codifican
una proteína cortistatina a partir de moléculas de ADN recombinante
que contienen un gen que define una proteína cortistatina de esta
invención, y pueden modificarse posteriormente, por ejemplo mediante
mutagénesis dirigida, para introducir cualquier sustitución
deseada.
Los genes de cortistatina de esta invención
pueden clonarse por medio de una diversidad de procedimientos de
clonación y a partir de cualquier especie de mamífero. La clonación
se basa en la observación de que hay un grado de homología
significativo entre especies de mamíferos para cualquier
cortistatina dada de esta invención, y por consiguiente puede
realizarse según los procedimientos generales descritos en los
Ejemplo, usando estrategias de homología de ácidos nucleicos.
Un típico grado de homología necesario para
clonar de manera exitosa una cortistatina es una homología de al
menos 80% a nivel de ADN, y una homología de al menos 90% a nivel de
proteína. Las estrategias de clonación de preferencia para aislar
una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de
cortistatina de esta invención están descritas en los Ejemplos, e
incluyen la enumeración de sondas de polinucleótidos útiles para la
selección de bibliotecas de moléculas de ácidos nucleicos que se
cree contienen un gen diana de cortistatina. Las sondas
particularmente de preferencia codifican la región conservada
definida como "cortistatina-14" como se
describe en este documento.
Las fuentes de bibliotecas para clonar un gen de
cortistatina de esta invención pueden incluir ADN genómico o ARN
mensajero (ARNm) en la forma de una biblioteca de ADNc de un tejido
que se cree expresa una cortistatina de esta invención. Los tejidos
de preferencia son tejidos cerebrales, particularmente tejido de
hipocampo o de corteza cerebral.
Las similitudes entre cortistatina de rata y de
ratón se extienden además a la identificación de una secuencia para
iteración de repeticiones de trinucleótidos CTG. Para la rata,
existe una secuencia de seis iteraciones de repeticiones de
trinucleótidos CTG que codifican restos leucina. En el ratón, está
presente una secuencia de tres iteraciones del trinucleótido CTG,
también dentro de la región que codifica la secuencia señal. Por
consiguiente, la presencia de las iteraciones está típicamente
localizada dentro de la región que codifica el péptido señal.
Se ha implicado a tal expansión de tripletes en
otros genes como la causa de enfermedades neurológicas, por
ejemplo, distrofia miotónica como describen Brook y col., Cell,
68:799-808 (1992) y el síndrome de X frágil como
describen Fu y col., Cell, 67:1047-1058 (1991). En
los pacientes con distrofia miotónica que están afectados
levemente, están presentes al menos 50 repeticiones de CTG. En los
individuos afectados gravemente, la expansión puede presentarse
hasta en varias kilobases. Por el contrario, en la población normal,
la secuencia de repetición es altamente variable desde 5 hasta 27
copias. Los individuos con gravedad variable del síndrome de X
frágil fueron caracterizados de manera similar.
Por consiguiente, el análisis de la presencia de
una región de ADN en la que están presentes las repeticiones ya sea
en forma normal, en menor o en mayor extensión pueden proporcionar
una base genética para el diagnóstico de algunas enfermedades. Lo
mismo puede valer para cortistatina, en el hecho de que la expansión
de la región puede contribuir a la base de un trastorno o
enfermedad relacionado con el sueño o relacionado con depresión
neuronal del cerebro.
El hecho de que la secuencia de iteración en
ratón sea más corta que en rata puede indicar que la secuencia de
iteración es inestable y objeto a expansión como se ha visto con
otros estados de enfermedad.
La invención también contempla oligonucleótidos
útiles para procedimientos para detectar la presencia de un gen de
cortistatina o un transcripto de gen (ARNm) en un tejido por medio
de procedimientos de detección diagnósticos basados en la
especificidad de reacciones de hibridación de ácido nucleico o
extensión de cebadores.
Por consiguiente, en una forma de realización,
está contemplada cualquier sonda de polinucleótidos que tenga una
secuencia de una porción de un gen de cortistatina de esta
invención, o una secuencia relacionada y específica.
Las sondas de hibridación pueden tener
longitudes variables desde aproximadamente 10 hasta 5.000
nucleótidos, aunque típicamente tendrán una longitud de
aproximadamente 20 a 500 nucleótidos. Los procedimientos de
hibridación son extremadamente conocidos en la técnica y no se
describirán más en este documento.
En una forma de realización relacionada, la
detección de genes de cortistatina puede llevarse a cabo por medio
de reacciones de extensión de cebadores tal como la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR). Con este fin, se utilizan cebadores
de PCR en pares, como es bien sabido, en base a la secuencia de
nucleótidos del gen a detectar.
Los cebadores de PCR particularmente de
preferencia pueden derivar de cualquier porción de una secuencia de
ADN de cortistatina, pero son de preferencia regiones no conservadas
en otras proteínas celulares.
En los Ejemplos se describe un par de cebadores
de PCR de preferencia útil para detectar genes de cortistatina y
expresión del gen de cortistatina. Los cebadores de nucleótidos de
la región correspondiente a cortistatina descrita en este documento
se preparan fácilmente y se usan como cebadores de PCR para la
detección de la presencia o expresión del gen correspondiente en
cualquiera de una diversidad de tejidos.
\newpage
Además, la invención contempla una molécula de
ADN recombinante (ADNr) que contiene un segmento de ADN de esta
invención que codifica una proteína cortistatina como se describe en
este documento. Puede producirse un ADNr uniendo de manera
operativa un vector a un segmento de ADN de la presente
invención.
Como se usa en este documento, el término
"vector" se refiere a una molécula de ADN capaz de replicarse
de manera autónoma en una célula y a la que está unido de manera
operativa otro segmento de ADN de manera de provocar la replicación
del segmento unido. En este documento se denomina "vector de
expresión" a un vector adaptado para la expresión de un producto
de un gen y capaz de dirigir la expresión de un gen de cortistatina.
Por consiguiente, una molécula de ADN recombinante es una molécula
de ADN híbrido que comprende al menos dos secuencias de nucleótidos
que no se encuentran normalmente juntas en la naturaleza.
La elección del vector al que se une de manera
operativa un segmente de ADN de la presente invención depende
directamente, como es bien sabido en la técnica, de las propiedades
funcionales deseadas, por ejemplo, expresión de proteínas y célula
huésped a transformar, siendo estas limitaciones inherentes a la
técnica de construcción de moléculas de ADN recombinantes. Sin
embargo, un vector contemplado por la presente invención es al menos
capaz de dirigir la replicación, y de preferencia también la
expresión, de un gen estructural de cortistatina incluido en
segmentos de ADN a los que está unido de manera operativa.
En una forma de realización, un vector
contemplado por la presente invención incluye un replicón
procariota, es decir, una secuencia de ADN que tiene la capacidad
para dirigir la replicación y mantenimiento autónomo de la molécula
de ADN recombinante de manera extra cromosómica en una célula
huésped procariota tal como una célula huésped transformada con el
mismo. Tales replicones son bien conocidos en la técnica. Además,
aquellas formas de realización que incluyen un replicón procariota
incluyen también un gen cuya expresión confiere resistencia a
fármacos a un huésped bacteriano transformado con el mismo. Los
genes bacterianos de resistencia a fármacos típicos son aquellos
que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina.
Aquellos vectores que incluyen un replicón
procariota pueden también incluir un promotor procariota capaz de
dirigir la expresión (transcripción y traducción) de un gen de
cortistatina en una célula huésped bacteriana, tal como E.
coli, transformada con el mismo. Un promotor es un elemento de
control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite
la unión de ARN polimerasa y que se produzca la transcripción. Las
secuencias de promotores compatibles con huéspedes bacterianos se
proporcionan típicamente en vectores plasmídicos que contienen
sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento
de ADN de la presente invención. Algunos de los plásmidos vectores
típicos son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 disponibles en Biorad
Laboratories, (Richmond, CA), pRSET disponible en Invitrogen (San
Diego, CA) y pPL y pKK223 disponibles en Pharmacia, Piscataway,
N.J.
Los vectores de expresión compatibles con
células eucariotas, de preferencia aquellos compatibles con células
de vertebrados, pueden usarse también para formar las moléculas de
ADN recombinante de la presente invención. Los vectores de
expresión en células eucariotas son bien conocidos en la técnica y
están disponibles en varias fuentes comerciales. Típicamente, se
proporcionan tales vectores conteniendo sitios de restricción
convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado.
Ejemplos típicos de tales vectores son pSVL y
pKSV-10 (Pharmacia), pBPV-1/pML2d
(International Biotechnologies, Inc.), pTDT1 (ATCC, Nº 31255),
pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), el vector pCMV4 descrito en este
documento, y vectores de expresión eucariotas similares.
En formas de realización de preferencia, los
vectores de expresión de células eucariotas usados para construir
las moléculas de ADN recombinante e la presente invención incluyen
un marcador de selección eficaz en una célula eucariota, de
preferencia un marcador de selección de resistencia a fármacos. Un
marcador de resistencia a fármacos de preferencia es el gen cuya
expresión da como resultado la resistencia a neomicina, es decir,
el gen de fosfotransferasa de neomicina (neo). Southern y col., J.
Mol. Appl. Genet., 1:327-341 (1982). Como
alternativa, el marcador seleccionable puede estar presente en un
plásmido separado, y los dos vectores se introducen por
cotransfección de la célula huésped y se seleccionan cultivando en
el fármaco adecuado para el marcador seleccionable.
Según una forma de realización de la invención,
las moléculas de ácidos nucleicos pueden usarse en procedimientos
para la inhibición de expresión de cortistatina, inhibiendo de esta
manera la función de la interacción cortistatina:receptor de
cortistatina bloqueando la expresión de cortistatina.
Con este fin, la invención contempla moléculas
de ácidos nucleicos aisladas, de preferencia moléculas de ácidos
nucleicos de una hebra (oligonucleótidos), que tienen una secuencia
complementaria a una porción de un gen estructural que codifica una
proteína cortistatina de esta invención. La inhibición basada en
ácidos nucleicos es bien conocida y se la llama generalmente
tecnología "antisentido" en virtud del uso de secuencias de
nucleótidos que tienen complementariedad que puede hibridad con la
hebra "sentido" o ARNm, y perturbar de esta manera la
expresión genética.
\newpage
Los oligonucleótidos típicos para este objetivo
tienen una longitud de aproximadamente 10 a 5.000, de preferencia
aproximadamente de 20 a 1.000, nucleótidos y tienen una secuencia
capaz de hibridar específicamente con una región de la proteína
estructural de la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína
cortistatina de esta invención.
En una forma de realización, la invención
contempla unidades repetitivas de la secuencia de nucleótidos
complementaria a una porción de un gen estructural de cortistatina
para que presente múltiples sitios par unirse de manera
complementaria al gen estructural. Esta característica puede
proporcionarse en un segmento de ácido nucleico simple con
secuencias repetidas que definen porciones múltiples de un gen
estructural, por medio de conjugación física de segmentos de ADN
conteniendo cada uno una porción única de un gen estructural, o una
combinación de los mismos que comprenden conjugados de segmentos de
ADN, teniendo cada uno una o más secuencias complementarias a un
gen estructural.
También está contemplado que puedan hacerse
modificaciones de bases de nucleótidos para proporcionar ciertas
ventajas a un segmento de ADN de esta invención, denominados
análogos de nucleótidos.
Un análogo de nucleótido se refiere a restos que
funcionan de manera similar a secuencias de nucleótidos en una
molécula de ácido nucleico de esta invención pero que tienen
porciones que no se presentan naturalmente. Por consiguiente, los
análogos de nucleótidos pueden tener restos azúcar o enlaces inter
azúcares alterados. Son ejemplos el fosforotioato y otras especies
que contienen azufre, análogos que tienen unidades de bases
alteradas, u otras modificaciones coherentes con el espíritu de esta
invención.
Las modificaciones de preferencia incluyen, pero
no se limitan a, las modificaciones de etil o metilfosfonato
descritas en la Patente de EEUU Nº 4.469.863 y los
desoxirribonucleótidos modificados por fosforotioato descritos por
LaPlanche y col., Nucl. Acids Res., 14:9081, 1986; y Stec y col., J.
Am. Chem. Soc., 106:6077, 1984. Estas modificaciones proporcionan
resistencia a la degradación nucleolítica, contribuyendo de esa
manera a la semivida aumentada en estas modalidades terapéuticas.
Las modificaciones de preferencia son las modificaciones en el
extremo 3' terminal usando modificación de sulfuración con
fosfotioato (PS) descrita por Stein y col., Nucl. Acids Res.,
16:3209, 1988.
Según los procedimientos de esta invención en
ciertas formas de realización, al menos algunos de los enlaces
fosfodiéster de la secuencia de nucleótidos puede sustituirse con
una estructura que funcione para aumentar la capacidad de las
composiciones para penetrar en las regiones de las células en las
que está localizado el gen estructural de cortistatina a inhibir.
Resulta de preferencia que tales enlaces sean enlaces que contengan
azufre como se discutió anteriormente, tales como enlaces
fosforotioato. Otras sustituciones pueden incluir enlaces alquilo
fosfotioato, N-alquilfosforamidatos,
fosforoditioatos, alquilfosfonatos y alquilos de cadena corta o
estructuras cicloalquilo. Según otras formas de realización de
preferencia, se sustituyen enlaces fosfodiéster con estructuras que
son a la vez, sustancialmente no iónicas y no quirales.
Un anticuerpo de la presente invención, es
decir, un anticuerpo anti-cortistatina, en una forma
de realización está caracterizado por comprender moléculas de
anticuerpos que inmunorreaccionan con una proteína cortistatina de
esta invención. De preferencia, un anticuerpo además
inmunorreacciona con una proteína cortistatina in situ, es
decir, en una sección de tejido.
Por consiguiente, la invención describe un
anticuerpo anti-cortistatina que inmunorreacciona
con cualquier polipéptido de cortistatina de esta invención, de
preferencia también inmunorreacciona con la proteína cortistatina
recombinante correspondiente, y de más preferencia también reacciona
con una proteína nativa in situ en una sección de tejido. De
preferencia, un anticuerpo está sustancialmente libre de
inmunorreacción con una proteína somatostatina o neuropéptidos
diferentes de cortistatina. Los ensayos para inmunorreacción útiles
para evaluar la inmunorreactividad se describen en este
documento.
En una forma de realización, se describen
moléculas de anticuerpos que inmunorreaccionan con un polipéptido
receptor de cortistatina de la presente invención y que tienen la
capacidad de inmunorreaccionar con un sitio expuesto en la
cortistatina que es necesario para la unión al receptor de
cortistatina. Por consiguiente, las moléculas de anticuerpos de
preferencia en esta forma de realización también inhiben la función
del receptor de cortistatina, y son por lo tanto útiles
terapéuticamente para bloquear la función del receptor.
Los anticuerpos inhibidores de cortistatina
ejemplares inmunorreaccionan con un polipéptido de cortistatina
descrito en este documento que define una región expuesta de una
proteína cortistatina que está involucrada en la función del
receptor de cortistatina, tal como en la unión de ligandos.
Un anticuerpo de la presente invención se
produce típicamente inmunizando un mamífero con un inóculo que
contiene un polipéptido de cortistatina de esta invención y por
ello induce en el animal la producción de anticuerpos que tienen
inmunoespecificidad para el polipéptido inmunizante. A continuación
se recogen las moléculas de anticuerpos del mamífero y se aíslan en
la cantidad deseada por medio de técnicas bien conocidas tales como,
por ejemplo, usando DEAE Sephadex para obtener la fracción de IgG.
En los Ejemplos en este documento se describen procedimientos
ejemplares de preparación de anticuerpos usando polipéptidos de
cortistatina en el inmunógeno.
El término "anticuerpo" en sus diversas
formas gramaticales se usa en este documento como un nombre
colectivo que se refiere a una población de moléculas de
inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de
combinación de anticuerpo o paratope.
Un "sitio de combinación de anticuerpo" es
la porción estructural de una molécula de anticuerpo comprendida
por regiones variables e hipervariables de cadenas pesadas y
livianas que se une específicamente al antígeno.
La frase "molécula de anticuerpo" en sus
diversas formas gramaticales como se usa en este documento contempla
tanto a una molécula intacta como a una porción activa
inmunológicamente de una molécula de inmunoglobuli-
na.
na.
Las moléculas de anticuerpos ejemplares para uso
en los procedimientos y sistemas de diagnóstico de la presente
invención son moléculas de inmunoglobulinas intactas, moléculas de
inmunoglobulinas sustancialmente intactas y aquellas porciones de
una molécula de inmunoglobulina que contiene el paratope, que
incluye aquellas porciones conocidas en la técnica como Fab, Fab',
F(ab')_{2} y F(v).
Las porciones Fab y F(ab')_{2} de
anticuerpos se preparan por la reacción proteolítica de papaína y
pepsina, respectivamente, sobre anticuerpos sustancialmente
intactos por medio de procedimientos bien conocidos. Ver, por
ejemplo la Patente de EEUU Nº 4.342.566 de Theofilopolous y Dixon.
Las porciones Fab' de los anticuerpos son también bien conocidas y
se producen a partir de porciones F(ab')_{2} seguido por la
reducción de los enlaces disulfuro que unen a las dos porciones de
cadenas pesadas con mercaptoetanol, y a continuación mediante
alquilación de la mercaptan proteína resultante con un reactivo tal
como yodoacetamida. Resulta de preferencia un anticuerpo que
contiene moléculas intactas, y se usan como se ilustra en este
documento.
La preparación de anticuerpos contra
polipéptidos es bien conocida en la técnica. Ver Staudt y col., J.
Exp. Med., 157:687-704 (1983), o las enseñanzas de
Sutcliffe, J. G., como están descritas en la Patente de EEUU Nº
4.900.811.
Brevemente, para producir una composición de
anticuerpos para péptidos de esta invención, se inocula un mamífero
de laboratorio con una cantidad inmunológicamente eficaz de un
polipéptido de cortistatina, típicamente como está presente en una
vacuna de la presente invención. Las moléculas de anticuerpos
anti-cortistatina inducidas de esa manera se
recogen a continuación del animal y se aíslan aquellas
inmunoespecíficas tanto para el polipéptido de cortistatina como
para la proteína cortistatina recombinante correspondiente hasta la
cantidad deseada por medio de técnicas bien conocidas tales como,
por ejemplo, por medio de cromatografía de inmunoafinidad.
Para aumentar la especificidad del anticuerpo,
los anticuerpos se purifican de preferencia por cromatografía de
inmunoafinidad usando un polipéptido inmunizante fijado a una fase
sólida. El anticuerpo se pone en contacto con el polipéptido
inmunizante fijado a la fase sólida durante un período de tiempo
suficiente para que el polipéptido inmunorreaccione con las
moléculas de anticuerpo para formar un inmunocomplejo fijado a la
fase sólida. Los anticuerpos unidos se separan del complejo por
medio de técnicas convencionales.
El término "inóculo" en sus diversas formas
gramaticales se usa en este documento para describir a una
composición que contiene un polipéptido de cortistatina de esta
invención como un ingrediente activo usado para la preparación de
anticuerpos contra un polipéptido de cortistatina. Cuando se usa un
polipéptido en un inóculo para inducir la producción de anticuerpos
se entenderá que el polipéptido puede usarse en diversas formas de
realización, por ejemplo, solo o unido a un vehículo como un
conjugado, o como un polímero de polipéptido. Sin embargo, para
simplificar la expresión y en el contexto de un inóculo de
polipéptido, las diversas formas de realización de los polipéptidos
de esta invención se denominan colectivamente en este documento con
el término "polipéptido" y sus diversas formas
gramaticales.
Para un polipéptido que contiene menos de
aproximadamente 35 restos aminoácido, resulta de preferencia usar
el péptido unido a un vehículo con el objetivo de inducir la
producción de anticuerpos.
Pueden agregarse uno o más restos aminoácido
adicionales al extremo amino o carboxi terminal del polipéptido
para ayudar en la unión del polipéptido al vehículo. Se ha
encontrado que los restos cisteína agregados a los extremos amino o
carboxi terminales de un polipéptido son particularmente útiles para
formar conjugados a través de enlaces disulfuro. Sin embargo,
pueden también usarse otros procedimientos bien conocidos en la
técnica para preparar conjugados.
Las técnicas de conjugación o acoplamiento de
polipéptidos a través de grupos funcionales actualmente conocidas
en la técnica son particularmente aplicables. Ver, por ejemplo,
Aurameas, y col., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Supl.
7:7-23 (1978) y las Patentes de EEUU Nº 4.493.795,
Nº 3.791.932 y Nº 3.839.153. Además, puede llevarse a cabo una
reacción de acoplamiento dirigida a un sitio para minimizar
cualquier pérdida de actividad debida a la orientación del
polipéptido tras el acoplamiento. Ver, por ejemplo, Rodwell y col.,
Biotech., 3:889-894 (1985), y la Patente de EEUU Nº
4.671.958.
Los ejemplos de procedimientos de unión
adicionales incluyen el uso de productos de reacción de adición de
Michael, dialdehídos tales como glutaraldehído, Klipstein, y col.,
J. Infect. Dis., 147:318-326 (1983) y similares, o
el uso de tecnología de carbodiimida como en el uso de una
carbodiimida soluble en agua para formar enlaces amida con el
vehículo. Como alternativa, puede usarse en entrecruzador
heterobifuncional SPDP
(N-succinimidil-3-(2-piridiltio)
propionato)) para conjugar péptidos, en el que se ha introducido
una cisteína carboxi terminal.
Los vehículos útiles son bien conocidos en la
técnica, y son generalmente proteínas. Los ejemplos de tales
vehículos son hemocianina de lapa (KLH), edestina, tiroglobulina,
albúminas tales como seroalbúmina bovina (BSA) o seroalbúmina
humana (HSA), glóbulos rojos tales como eritrocitos de oveja (SRBC),
toxoide tetánico, toxoide colérico así como poliaminoácidos tales
como poli D-lisina:ácido D-glutámico
y similares.
La elección del vehículo depende más del uso
final del inóculo y se basa en criterios no incluidos
particularmente en la presente invención. Por ejemplo, deberá
elegirse un vehículo que no genere una reacción adversa en el
animal particular a inocular.
El presente inóculo contiene una cantidad
inmunogénica, eficaz de un polipéptido de esta invención,
típicamente como un conjugado unido a un vehículo. La cantidad
eficaz de polipéptido por unidad de dosis suficiente para inducir
una respuesta inmune para el polipéptido inmunizante depende, entre
otras cosas, de la especie animal inoculada, el peso corporal del
animal y la elección del régimen de inoculación es bien conocida en
la técnica. Los inóculos típicamente contienen concentraciones de
polipéptido desde aproximadamente 10 microgramos (\mug) hasta
aproximadamente 500 miligramos (mg) por inoculación (dosis), de
preferencia desde aproximadamente 50 microgramos hasta
aproximadamente 50 miligramos por dosis.
El término "dosis unitaria" con relación a
los inóculos se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas
como dosificaciones unitarias para animales, cada unidad contiene
una cantidad predeterminada de material activo calculado para
producir el efecto inmunogénico deseado en asociación con el
diluyente requerido; es decir, transporte o vehículo. Las
especificaciones para la dosis unitaria nueva de un inóculo de esta
invención están dictadas por y son directamente dependientes de (a)
las características únicas del material activo y el efecto
inmunológico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes
a la técnica de componer tal material activo para uso inmunológico
en animales, como se describe en detalle en este documento, siendo
éstas características de la presente invención.
Los inóculos se preparan típicamente a partir
del conjugado de polipéptido sólido seco dispersando el conjugado
de polipéptido en un diluyente fisiológicamente tolerable
(aceptable) tal como agua, solución salina o solución salina
tamponada con fosfato para formar una composición acuosa.
Los inóculos pueden también incluir un adyuvante
como parte del diluyente. Los adyuvantes tales como el adyuvante
completo de Freund (CFA), el adyuvante incompleto de Freund (IFA) y
alum son materiales bien conocidos en la técnica, y están
comercialmente disponibles de varias fuentes.
El anticuerpo producido de esta manera puede
usarse, inter alia, en los procedimientos y sistemas de
diagnóstico de la presente invención para detectar cortistatina
presente en una muestra tal como una sección de tejido o una
muestra fluida del cuerpo. Los anticuerpos
anti-cortistatina que inhiben la función de
cortistatina pueden usarse también in vivo en procedimientos
terapéuticos como se describe en este documento.
Un anticuerpo anti-cortistatina
de preferencia es un anticuerpo monoclonal.
La frase "anticuerpo monoclonal" en sus
diversas formas gramaticales se refiere a una población de moléculas
de anticuerpos que contienen sólo una especie de anticuerpos que
combina un sitio capaz de inmunorreaccionar con un epítopo
particular. Un anticuerpo monoclonal por consiguiente exhibe
típicamente una única afinidad de unión por cualquier epítopo con
el que inmunorreacciona. Un anticuerpo monoclonal puede por lo tanto
contener una molécula de anticuerpo que tiene una pluralidad de
sitios de combinación de anticuerpo, cada uno inmunoespecífico para
un epítopo diferente, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
biespecífico.
Un anticuerpo monoclonal de preferencia de esta
invención comprende moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan
con un polipéptido de cortistatina de la presente invención como se
describe para los anticuerpos anti-cortistatina de
esta invención. De más preferencia, el anticuerpo monoclonal también
inmunorreacciona con la proteína cortistatina completa producida de
manera recombinante.
Un anticuerpo monoclonal está compuesto
típicamente por anticuerpos producidos por clones de una célula
única llamada hibridoma que secreta (produce) sólo una clase de
molécula de anticuerpo. La célula de hibridoma se forma fusionando
una célula productora de anticuerpos y un mieloma u otra línea
celular que se autoperpetúa. La preparación de tales anticuerpos
fue descrita por primera vez por Kohler y Milstein, Nature,
256:495-497 (1975). Los sobrenadantes de los
hibridomas preparados de esta manera pueden seleccionarse con
respecto a la presencia de moléculas de anticuerpos que
inmunorreaccionan con un polipéptido de cortistatina, o para la
inhibición de unión de cortistatina al receptor de cortistatina como
se describe en este documento.
Brevemente, para formar el hibridoma a partir
del que se produce la composición de anticuerpo monoclonal, se
fusiona un mieloma u otra línea celular que se autoperpetúa con
linfocitos obtenidos del bazo de un mamífero hiperinmunizado con un
antígeno de cortistatina, tal como está presente en un polipéptido
de cortistatina de esta invención. La tecnología de hibridomas
inducidos por polipéptidos está descrita por Niman y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU, 80:4949-4953 (1983).
Resulta de preferencia que la línea celular de
mieloma usada para preparar un hibridoma sea de la misma especie
que los linfocitos. Típicamente, resulta de preferencia un ratón de
la cepa 129 GIX+. Los mielomas de ratón adecuados para uso en la
presente invención incluyen las líneas celulares sensibles a
hipoxantina-aminopterina-timidina
(HAT) P3X63-Ag8,653, y Sp2/0-Ag14
disponibles en la American Type Culture Collection, Rockville, Md.,
bajo las denominaciones CRL 1580 y CRL 1581, respectivamente.
Los esplenocitos se fusionan típicamente con
células de mieloma usando polietilenglicol (PEG) 1500. Los híbridos
fusionados se seleccionan por su sensibilidad a HAT. Los hibridomas
que producen un anticuerpo monoclonal de esta invención se
identifican usando el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas
(ELISA) que se describe en los Ejemplos.
Un anticuerpo monoclonal de la presente
invención puede producirse también iniciando un cultivo de hibridoma
monoclonal que comprende un medio nutritivo que contiene un
hibridoma que produce y secreta moléculas de anticuerpo con la
especificidad de polipéptido adecuada. El cultivo se mantiene bajo
condiciones y durante un período de tiempo suficiente para que el
hibridoma secrete las moléculas de anticuerpo en el medio. A
continuación se recoge el medio que contiene los anticuerpos. Las
moléculas de anticuerpo pueden posteriormente aislarse más por
medio de técnicas bien conocidas.
Los medios útiles para la preparación de estas
composiciones son bien conocidos en la técnica y están disponibles
comercialmente e incluyen medios de cultivos sintéticos, ratones
endogámicos y similares. Un medio sintético ejemplar es el Medio
Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM; Dulbecco y col., Virol. 8:396
(0,1959)) suplementado con 4,5 gm/l de glucosa, glutamina 20 mM y
suero bovino fetal al 20%. Una cepa de ratón endogámico ejemplar es
la Balb/c.
Otros procedimientos para producir un anticuerpo
monoclonal, una célula de hibridoma, o un cultivo de células de
hibridoma son también bien conocidos. Ver, por ejemplo, el
procedimiento de aislamiento de anticuerpos monoclonales a partir
de un repertorio inmunológico como describen Sastry, y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. EEUU, 86:5728-5732 (1989); y Huse
y col., Science, 246:1275-1281 (1989).
Los anticuerpos monoclonales de esta invención
pueden usarse de la misma manera a la que se describe en este
documento para anticuerpos de la presente invención.
Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal puede
usarse en los procedimientos terapéuticos, de diagnóstico o in
vitro descritos en este documento en los que se desea la
inmunorreacción con cortistatina.
Esta invención también contempla la célula de
hibridoma, y los cultivos que contienen una célula de hibridoma que
produce un anticuerpo monoclonal de esta invención.
La presente invención contempla diversos
procedimientos de ensayo para determinar la presencia, y de
preferencia la cantidad, de cortistatina en una muestra del cuerpo
tal como una muestra de tejido, que incluye la masa de tejido o
sección de tejido, o en una muestra de un fluido biológico usando un
polipéptido, anticuerpo policlonal o anticuerpo monoclonal de esta
invención como reactivo inmunoquímico para formar un producto de
inmunorreacción cuya cantidad se relaciona, directa o
indirectamente, con la cantidad de cortistatina en la muestra.
Los expertos en la técnica entenderán que
existen numerosos procedimientos químicos de diagnóstico clínico
bien conocidos en los que se usa un reactivo inmunoquímico de esta
invención para formar un producto de inmunorreacción cuya cantidad
está en relación con la cantidad de cortistatina en una muestra del
cuerpo. Por consiguiente, puesto que los procedimientos de ensayo
se describen en este documento, la invención no está limitada en ese
sentido.
Por ejemplo, en vista de la propiedad demostrada
de que la cortistatina se una al receptor de cortistatina, puede
usarse una proteína cortistatina de esta invención como una sonda
para la detección de un receptor de cortistatina por medio de la
unión a éste.
Además, pueden usarse sondas de moléculas de
ácidos nucleicos descritas en este documento para detectar la
presencia en una célula o tejido de un gen de cortistatina o gen
expresado en la forma de ARNm que codifica una proteína
cortistatina de esta invención, como se describe además en este
documento. Los ensayos basados en sondas adecuados están descritos
por Sutcliffe en la Patente de EEUU Nº 4.900.811 y 5.242.798.
Pueden usarse diversos protocolos homogéneos y
heterogéneos, ya sea competitivos o no competitivos, para realizar
un procedimiento de un ensayo de esta invención.
Por ejemplo, una forma de realización contempla
un procedimiento para ensayar la cantidad de proteína cortistatina
en una muestra que usa un anticuerpo
anti-cortistatina para inmunorreaccionar con la
proteína cortistatina en una muestra. En esta forma de realización,
el anticuerpo inmunorreacciona con la cortistatina para formar un
complejo de inmunorreacción cortistatina-anticuerpo,
y el complejo se detecta indicando la presencia de cortistatina en
la muestra.
Un procedimiento de inmunoensayo que usa una
molécula de anticuerpo anti-cortistatina para
ensayar la cantidad de cortistatina en una muestra típicamente
comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción
mezclando (poniendo en contacto) una muestra con un anticuerpo
anti-cortistatina de al presente invención, de
preferencia un anticuerpo monoclonal. La muestra está típicamente en
la forma de una sección de tejido fijada en una fase sólida tal que
la mezcla de inmunorreacción tiene una fase líquida y una fase
sólida, y el anticuerpo funciona como reactivo de detección por la
presencia de cortistatina en la muestra.
De preferencia, la muestra es una muestra de
tejido cerebral que se ha preparado por tinción inmunohistológica
como es bien conocido, aunque pueden adsorberse otras muestras de
tejido en una fase sólida, incluyendo extractos de tejidos o
fluidos corporales. En ese caso la adsorción sobre una fase sólida
puede realizarse como está descrito en los procedimientos bien
conocidos de transferencia Western.
(b) Mantener la mezcla de inmunorreacción bajo
condiciones biológicas de ensayo durante un período de tiempo
predeterminado tal como aproximadamente 10 minutos hasta
aproximadamente 16-20 horas a una temperatura desde
aproximadamente 4ºC hasta aproximadamente 45ºC, siendo tal tiempo
suficiente para que la cortistatina presente en la muestra
inmunorreaccione (se una inmunológicamente) con el anticuerpo y
forme un producto de inmunorreacción que contiene cortistatina
(inmunocomplejo).
Las condiciones biológicas de ensayo son
aquellas que mantienen la actividad biológica de los reactivos
inmunoquímicos de esta invención y de la cortistatina que se quiere
ensayar. Aquellas condiciones incluyen un intervalo de temperaturas
entre aproximadamente 4ºC y aproximadamente 45ºC, un intervalo de
valores de pH de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9 y una
fuerza iónica que varía desde la del agua destilada hasta la de una
solución de cloruro de sodio aproximadamente uno molar. Los
procedimientos para optimizar tales condiciones son bien conocidas
en la técnica.
(c) Determinar (detectar) la presencia, y de
preferencia la cantidad, de producto de inmunorreacción que contiene
cortistatina formada en la etapa (b), determinando de esta manera
la cantidad de cortistatina presente en la muestra.
La determinación de la presencia o cantidad del
producto de inmunorreacción, ya sea directa o indirectamente, puede
llevarse a cabo por medio de técnicas de ensayo bien conocidas en la
técnica, y típicamente depende del tipo de medios indicadores
usados.
De preferencia, la determinación de la etapa (c)
comprende las etapas de:
(i) mezclar el producto de la inmunorreacción
que contiene cortistatina con un segundo anticuerpo para formar una
segunda mezcla de inmunorreacción (de detección), dicha segunda
molécula de anticuerpo con la capacidad para inmunorreaccionar con
el primer anticuerpo (primario) en el producto de
inmunorreacción.
Los anticuerpos útiles como segundo anticuerpo
incluyen preparaciones de anticuerpos policlonales o monoclonales
dirigidos contra el anticuerpo primario.
(ii) mantener dicha segunda mezcla de
inmunorreacción durante un período de tiempo suficiente para que
dicho segundo anticuerpo forme un complejo con el producto de
inmunorreacción y forme un segundo producto de inmunorreacción,
y
(iii) determinar la cantidad del segundo
anticuerpo presente en el segundo producto de inmunorreacción y
determinar de esta manera el producto de inmunorreacción formado en
la etapa (c).
En una forma de realización, el segundo
anticuerpo es un anticuerpo marcado (por ejemplo, un anticuerpo de
detección) tal que el marcador proporciona un medio indicador para
detectar la presencia del segundo producto de inmunorreacción
formado. El marcador se mide en el segundo producto de
inmunorreacción, indicando de esta manera la presencia, y de
preferencia la cantidad, de segundo anticuerpo en la fase
sólida.
Como alternativa, puede determinarse la cantidad
de segundo anticuerpo por medio de la preparación de una mezcla de
reacción adicional que tiene un medio indicador que reacciona
específicamente (se une a) con el segundo anticuerpo, como es bien
sabido. Los ejemplos son terceras mezclas de inmunorreacción con una
molécula de anticuerpo anti inmunoglobulina marcada específica para
el segundo anticuerpo. Tras la tercera inmunorreacción, se detecta
el tercer producto de inmunorreacción formado a través de la
presencia del marcador.
Los procedimientos ejemplares incluyen el uso de
procedimientos de inmunorreacción in situ usando secciones
de tejidos, o procedimientos de transferencia Western, como describe
Sutcliffe en la Patente de EEUU Nº 4.900.811.
Está contemplada otra forma de realización para
ensayar la cantidad de proteína cortistatina o anticuerpo
anti-cortistatina administrados terapéuticamente en
una muestra de fluido corporal tal como líquido cefalorraquídeo
(LCR), sangre, plasma o suero. El procedimiento usa una reacción de
competición en la que un polipéptido de cortistatina o una molécula
de anticuerpo anti-cortistatina de esta invención
está presente en la fase sólida como un reactivo inmunoquímico
inmovilizado y el otro de los dos reactivos está presente en
solución en la fase líquida, en la forma de un reactivo marcado. Se
mezcla una mezcla de fluido en la misma para formar una mezcla de
inmunorreacción de competición, y la cantidad resultante de marcador
en la fase sólida es proporcional, ya sea directa o indirectamente,
a la cantidad de polipéptido de cortistatina o anticuerpo en la
muestra de fluido, dependiendo del formato.
Por consiguiente una versión de esta forma de
realización comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción de
competición mezclando (poniendo en contacto) una muestra de fluido
con:
- (1)
- un anticuerpo anti-cortistatina de acuerdo con esta invención que contiene moléculas de anticuerpo que inmunorreaccionan con una proteína cortistatina de esta invención, estando dicho anticuerpo unido de manera operativa a una matriz sólida tal que la mezcla de inmunorreacción de competición tiene una fase líquida y una fase sólida, y
- (2)
- un polipéptido o proteína cortistatina recombinante de la presente invención que es inmunorreactiva con el anticuerpo añadido. La mezcla polipéptido/proteína en la fase líquida (antígeno competidor marcado) está unida de manera operativa a un medio indicador como se describe en este documento.
(b) Mantener a continuación la mezcla de
inmunorreacción de competición durante un período de tiempo
suficiente para que el antígeno competidor y el antígeno de la
muestra corporal presentes en la fase líquida compitan por la
inmunorreacción con el anticuerpo en la fase sólida. Tales
condiciones de inmunorreacción se describieron previamente y dan
como resultado la formación de un producto de inmunorreacción que
contiene un medio indicador que comprende el antígeno competidor
marcado en la fase sólida.
(c) Determinar a continuación la cantidad de
medio indicador presente en el producto formado en la etapa (b),
determinando de esta manera la presencia, y de preferencia la
cantidad del antígeno de la muestra presente en la muestra de
fluido.
Posteriormente se realiza la determinación del
medio indicador en la fase sólida por medio de procedimientos
convencionales que se describen en este documento.
Una versión inversa de esta forma de realización
comprende las etapas de:
(a) Formar una mezcla de inmunorreacción de
competición mezclando una muestra de fluido con:
- (1)
- un anticuerpo anti-cortistatina de acuerdo con la presente invención; y
- (2)
- un polipéptido de cortistatina o proteína cortistatina recombinante de la presente invención (antígeno de captura) que es inmunorreactiva con el anticuerpo y está unida de manera operativa a una matriz sólida tal que la mezcla de inmunorreacción de competición tiene una fase líquida y una fase sólida.
(b) Mantener a continuación la mezcla de
inmunorreacción de competición durante un período de tiempo
suficiente para que cualquier antígeno de cortistatina o anticuerpo
anti-cortistatina en el fluido compitan con las
moléculas de anticuerpo mezcladas para inmunorreaccionar con el
antígeno de captura de la fase sólida y formen un producto de
inmunorreacción que contiene el anticuerpo en la fase sólida.
(c) Determinar a continuación la cantidad de
anticuerpo presente en el producto formado en la etapa (b),
determinando de esta manera la presencia y/o cantidad del material
diana en la muestra de fluido.
En formas de realización de preferencia, el
anticuerpo está unido de manera operativa a un medio indicador tal
que la determinación en la etapa (c) comprende determinar la
cantidad de medio indicador presente en el producto formado en la
etapa (b).
De preferencia, se proporciona la muestra de
fluido a una mezcla de inmunorreacción de competición como una
cantidad conocida de LCR, sangre, o un producto derivado de la
sangre tal como suero o plasma. Resultan además de preferencia las
formas de realización en las que la cantidad de reactivo
inmunoquímico en la fase líquida de la mezcla de inmunorreacción es
una cantidad en exceso con relación a la cantidad de reactivo en la
fase sólida. Típicamente, se establece una serie paralela de
inmunorreacciones de competición usando una cantidad conocida de
cortistatina recombinante o polipéptidos purificados en una serie de
diluciones para poder desarrollar una curva patrón, como es bien
sabido. Por consiguiente se compara la cantidad de producto formado
en la etapa (c) cuando se usa una muestra de fluido con la curva
patrón, determinando de esta manera la cantidad de antígeno diana
presente en el flui-
do.
do.
En otra forma de realización, el procedimiento
para ensayar la cantidad de cortistatina en una muestra usa un
primer anticuerpo de captura para capturar e inmovilizar la
cortistatina en la fase sólida y un segundo anticuerpo indicador
para indicar la presencia del antígeno de cortistatina capturado. En
esta forma de realización, un anticuerpo inmunorreacciona con una
proteína cortistatina para formar un complejo de inmunorreacción
cortistatina-anticuerpo, y el otro anticuerpo es
capaz de inmunorreaccionar con la cortistatina mientras está
presente en el complejo de inmunorreacción
cortistatina-anticuerpo. Esta forma de realización
puede realizarse en dos formatos con el anticuerpo de captura
inmovilizado como cualquiera de los dos anticuerpos identificados
anteriormente y el anticuerpo indicador como el otro de los dos
anticuerpos.
Cuando un anticuerpo está en la fase sólida como
reactivo de captura, un medio de preferencia para determinar la
cantidad de producto de reacción en la fase sólida es por medio del
uso de un polipéptido de cortistatina marcado, seguido por los
medio de detección descritos en este documento para otros productos
marcados en la fase sólida.
También están contemplado los ensayos
inmunológicos capaces de detectar la presencia de formación de
productos de inmunorreacción sin el uso de un marcador. Tales
procedimientos usan un "medio de detección", cuyos medios son
bien conocidos en el diagnóstico químico clínico y constituyen una
parte de esta invención sólo en la medida en que se usan con otros
procedimientos y sistemas de polipéptidos nuevos. Los medios de
detección ejemplares incluyen procedimientos conocidos como
biosensores e incluyen procedimientos que biosensan basados en la
detección de cambios en la reflectividad de una superficie, cambios
en la absorción de una onda evanescente por medio de fibras ópticas
o cambios en la propagación de ondas acústicas de superficie.
La presente invención también describe un
sistema de diagnóstico, de preferencia en la forma de un equipo,
para ensayar la presencia de una cortistatina de esta invención en
una muestra corporal, tal como tejido cerebral, suspensiones
celulares o secciones de tejidos, o muestras de fluidos corporales
tales como LCR, sangre, plasma o suero, en los que se desea
detectar la presencia, y de preferencia la cantidad, de una proteína
cortistatina en la muestra de acuerdo con los procedimientos de
diagnóstico descritos en este documento.
En una forma de realización relacionada, puede
usarse una molécula de ácido nucleico como una sonda (un
oligonucleótido) para detectar la presencia de un gen o ARNm en una
célula que es diagnóstico para la presencia o expresión de una
cortistatina en la célula. Las sondas de moléculas de ácidos
nucleicos se describieron en detalle anteriormente.
El sistema de diagnóstico incluye, en una
cantidad suficiente para realizar al menos un ensayo, un polipéptido
de cortistatina del tema, un anticuerpo del tema o anticuerpo
monoclonal y/o una sonda de molécula de ácido nucleico del tema de
la presente invención, como un reactivo envasado por separado.
En otra forma de realización, se contempla un
sistema de diagnóstico, de preferencia en la forma de un equipo,
para ensayar la presencia de un polipéptido de cortistatina o un
anticuerpo anti-cortistatina en una muestra de
fluido corporal tal como para controlar el destino de un polipéptido
de cortistatina o anticuerpo anti-cortistatina
administrado terapéuticamente. El sistema incluye, en una cantidad
suficiente para realizar al menos un ensayo, un polipéptido de
cortistatina del tema y/o un anticuerpo del tema como un reactivo
inmunoquímico envasado por separado.
Típicamente también se incluyen las
instrucciones para uso del reactivo(s)
envasado(s).
Como se usa en este documento, el término
"envase" se refiere a una matriz o material sólido tal como
vidrio, plástico (por ejemplo polietileno, polipropileno o
policarbonato), papel y similar capaz de llevar dentro de límites
fijados un polipéptido, anticuerpo policlonal o anticuerpo
monoclonal de la presente invención. Por consiguiente, por ejemplo,
un envase puede ser un vial de vidrio para contener cantidades en
miligramos de un polipéptido o anticuerpo contemplado o puede ser
una placa de pocillos de microvaloración a la que se han fijado
operativamente polipéptidos o anticuerpos contemplados en cantidades
de microgramos, es decir, fijados de manera tal que un anticuerpo o
antígeno sea capaz de unirse a ellos inmunológicamente,
respectivamente.
Las "instrucciones de uso" típicamente
incluyen una expresión tangible que describe la concentración de
reactivo o al menos un parámetro del procedimiento de ensayo tales
como las cantidades relativas de reactivo y muestra a mezclar, los
períodos de tiempo que deben mantenerse las mezclas
reactivo/muestra, temperatura, condiciones de tampón y
similares.
Un sistema de diagnóstico de la presente
invención también incluye un medio marcador o indicador capaz de
señalar la formación de un inmunocomplejo que contiene un
polipéptido o una molécula de anticuerpo de la presente
invención.
El término "complejo" como se usa en este
documento se refiere al producto de una reacción de unión específica
tal como una reacción antígeno-anticuerpo o
receptor-ligando. Son ejemplos de complejos los
productos de inmunorreacción.
Como se usa en este documento, el término
"marcador" y la frase "medio indicador" en sus diversas
formas gramaticales se refieren a átomos únicos y moléculas que
directa o indirectamente están involucrados en la producción de una
señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Cualquier
marcador o medio indicador puede unirse o puede incorporarse a una
proteína expresada, polipéptido, o molécula de anticuerpo que es
parte de una composición de anticuerpo o anticuerpo monoclonal de
la presente invención, o usarse por separado, y aquellos átomos o
moléculas pueden usarse solos o en combinación con reactivos
adicionales. Tales marcadores son bien conocidos en el diagnóstico
químico clínico y constituyen una parte de esta invención sólo en la
medida en que se usan con otros procedimientos y/o sistemas de
proteínas nuevas.
El medio de marcado puede ser un agente de
marcado fluorescente que se une químicamente a los anticuerpos o
antígenos sin desnaturalizarlos para formar un fluorocromo
(colorante) que es útil como trazador inmunofluorescente. Los
agentes de marcado fluorescentes adecuados son fluorocromos tales
como isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocianato de
fluoresceína (FITC), cloruro de
5-dimetilamina-1-naftalensulfonilo
(DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lisamina,
sulfonilcloruro de rodamina 8200 (RB 200 SC) y similares. Una
descripción de técnicas de análisis de inmunoflurorescencia se
encuentra en DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", en
Antibody As a Tool, Marchalonis, y col., ed., John Wiley & Sons,
Ltd., páginas 189-231 (1982).
En formas de realización de preferencia, los
grupos indicadores son una enzima, tal como la peroxidasa del
rábano picante (HRP), glucosa oxidasa o similares. En los casos en
que el grupo indicador principal es una enzima, tal como HRP o
glucosa oxidasa, se necesitan reactivos adicionales para visualizar
la formación (inmunorreacción) del complejo
receptor-ligando. Tales reactivos adicionales para
HRP incluyen peróxido de hidrógeno y un precursor de un colorante
de oxidación tal como diaminobencidina. Otro reactivo adicional útil
con glucosa oxidasa es el ácido
2,2'-amino-di-(3-etil-benztiazolin)-G-sulfónico
(ABTS).
Los elementos radioactivos son también agentes
de marcado útiles y se usan de forma ilustrativa en este documento.
Un agente de radiomarcado ejemplar es un elemento radiactivo que
produce emisiones de rayos gama. Los elementos que emiten rayos
gama por si mismos, tales como ^{124}I, ^{125}I, ^{128}I,
^{132}I y ^{51}Cr representan una clase de grupos indicadores
con elementos radioactivos que producen emisión de rayos gama.
Resulta particularmente de preferencia ^{125}I. Otro grupo de
medios de marcado útiles son aquellos elementos tales como ^{11}C,
^{18}F, ^{15}O y ^{13}N que por si mismos emiten positrones.
Los positrones así emitidos producen rayos gama tras encontrarse
con electrones presentes en el cuerpo del animal. También es útil un
emisor de rayos beta, tal como ^{111}indio o ^{3}H.
La unión de los marcadores, es decir, el marcado
de polipéptidos y proteínas es bien conocida en la técnica. Por
ejemplo, pueden marcarse las moléculas de anticuerpo producidas por
un hibridoma por medio de la incorporación metabólica de
aminoácidos que contienen radioisótopos proporcionados como un
componente en el medio de cultivo. Ver, por ejemplo, Galfre y col.,
Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981). Las técnicas de
conjugación o acoplamiento de proteínas a través de grupos
funcionales activados son particularmente aplicables. Ver, por
ejemplo, Aurameas, y col., Scand. J. Immunol., Vol. 8 Supl.
7:7-23 (1978), Rodwell y col., Biotech.,
3:889-894 (1984), y la Patente de EEUU Nº
4.493.795.
Los sistemas de diagnóstico pueden también
incluir, de preferencia como un envase separado, un agente de unión
específica. Un "agente de unión específica" es una entidad
molecular capaz de unir selectivamente una especie reactiva de la
presente invención o un complejo que contiene tal especie, pero que
no es por si mismo una composición de polipéptidos o moléculas de
anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos de agentes de
unión específicos son las moléculas de anticuerpos secundarios,
proteínas del complemento o fragmentos de las mismas, proteína A de
S. aureus, y similares. De preferencia el agente de unión
específico une las especies reactivas cuando las especies están
presentes como parte de un complejo.
En formas de realización de preferencia, el
agente de unión específica está marcado. Sin embargo, cuando el
sistema de diagnóstico incluye un agente de unión específica que no
está marcado, el agente se usa típicamente como un medio o reactivo
de amplificación. En estas formas de realización, el agente de unión
específica marcado es capaz de unirse específicamente al medio
amplificación cuando el medio de amplificación está unido a un
complejo reactivo que contiene las especies.
Los equipos de diagnóstico de la presente
invención pueden usarse en un formato "ELISA" para detectar la
cantidad de cortistatina en una muestra. "ELISA" se refiere a
un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas que usa un anticuerpo
o antígeno unido a una fase sólida y un conjugado
enzima-antígeno o enzima-anticuerpo
para detectar y cuantificar la cantidad de un antígeno presente en
una muestra. Una descripción de la técnica de ELISA se encuentra en
el Capítulo 22 de la 4º Edición de Basic and Clinical Immunology de
D. P. Sites y col., publicado por Lange Medical Publications de Los
Altos, CA en 1982 y en las Patentes de EEUU Nº 3.654.090; 3.850.752;
y 4.016.043.
Por consiguiente, en algunas formas de
realización, un polipéptido de cortistatina, un anticuerpo o
anticuerpo monoclonal de la presente invención puede estar fijado a
una matriz sólida para formar un soporte sólido que comprende un
envase en el sistema de diagnóstico del tema.
Típicamente se fija un reactivo a una matriz
sólida por adsorción desde un medio acuoso aunque pueden usarse
otros modos de fijación aplicables a proteínas y polipéptidos que
son bien conocidos por los expertos en la técnica. En este
documento se describen ejemplos de procedimientos de adsorción.
También se conocen en la técnica matrices
sólidas útiles. Tales materiales son insolubles en agua e incluyen
el dextrán entrecruzado disponible bajo la marca registrada SEPHADEX
de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ); agarosa; perlas de
poliestireno con un diámetros desde aproximadamente 1 micrometro
(\mu) hasta aproximadamente 5 milimetros (mm) disponibles en
Abbott Laboratories de North Chicago, IL; cloruro de polivinilo,
poliestireno, poliacrilamida entrecruzada, redes basadas en
nitrocelulosa o en nylon tales como láminas, tiras o palas; o
tubos, placas o pocillos de una placa de microvaloración tales como
aquellas fabricadas a partir de poliestireno o
polivinilcloru-
ro.
ro.
Las especies de reactivos, agentes de unión
específica marcados o reactivos de amplificación de cualquier
sistema de diagnóstico descrito en este documento pueden
proporcionarse en solución, como una dispersión líquida o como un
polvo sustancialmente seco, por ejemplo en forma liofilizada. Cuando
el medio indicador es una enzima, el sustrato de la enzima puede
también proporcionarse en un envase separado de un sistema. También
pueden incluirse en este sistema de ensayo de diagnóstico un
soporte sólido tal como la placa de microvaloración descrita
anteriormente y uno o más tampones como elementos envasados por
separado.
Los materiales de envasado discutidos en este
documento en relación con los sistemas de diagnóstico son aquellos
usados en la actualidad en sistemas de diagnóstico.
La invención también contempla una célula
huésped transformada con una molécula de ADN recombinante (ADNr) de
la presente invención. La célula huésped puede ser procariota o
eucariota, aunque resultan de preferencia las células eucariotas,
particularmente células de mamífero. Las células de preferencia se
aíslan, esto es, sustancialmente homogéneas y libres de otros tipos
celulares u otras células que tienen una proteína cortistatina
expresada en las mismas.
Una célula que expresa una cortistatina de esta
invención tiene una diversidad de usos de acuerdo con esta
invención. Resultan particularmente de preferencia los usos para la
producción de cortistatina en grandes cantidades, para el objetivo
de proporcionar inmunógeno para la producción de anticuerpos, para
suministrar proteínas terapéuticas para unir directamente o para
seleccionar bancos de compuestos farmacéuticos para analizar la
presencia de ligandos específicos del receptor de cortistatina, es
decir, en ensayos de selección de fármacos como se describe en este
documento. Por consiguiente, resulta particularmente de preferencia
las células que contienen una molécula de ADNr que expresa una
proteína cortistatina de esta invención.
En una forma de realización, se produce una
célula para trasplantar dentro de un tejido corporal, que expresa
por ello cortistatina y proporciona tratamiento de reemplazo. La
célula puede ser singeneica, y típicamente será una célula derivada
de tejido cerebral, tal como una célula del hipocampo, una célula de
tejido cerebral neonatal, glioma y células de tejidos neuronales
similares. El transplante se realiza usando procedimientos
quirúrgicos disponibles para un neurocirujano en los que el
transplante debe realizarse dentro del cerebro, tallo cerebral u
otros tejidos neurológicos. En formas de realización de preferencia,
la célula contiene un vector para la expresión de cortistatina en
el que el medio de expresión está bajo el control de un promotor
regulable, como es bien sabido, de manera que puede regularse la
expresión de cortistatina.
Las células eucariotas útiles para la expresión
de una proteína cortistatina no están limitadas, siempre que la
célula o línea celular sea compatible con los procedimientos de
cultivo celular y compatible con la propagación del vector de
expresión y la expresión del producto del gen de la proteína
cortistatina. Las células huésped eucariotas de preferencia
incluyen levadura y células de mamífero, de preferencia células de
vertebrado tales como aquellas de un ratón, rata, mono, línea
celular fibroblástica humana. Las células huésped eucariotas de
preferencia incluyen células de ovario de hámster chino (CHO)
disponibles en ATCC como CCL61, células de embrión de ratón Suizo
NIH NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), células HELA (ATCC CCL 2), células de
riñón de cría de cobaya (BHK), COS-7,
COS-1, HEK293 (ATCC CRL 1573),
Ltk-1, AV-12 (ATCC CRL 9595), y
líneas celulares de cultivo tisular eucariota similares.
La transformación de células huésped adecuadas
con una molécula de ADN recombinante de la presente invención se
realiza por medio de procedimientos bien conocidos que dependen
típicamente del tipo de vector usado. Con respecto a la
transformación de células huésped procariotas, ver, por ejemplo,
Cohen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU, 69:2110 (1972); y
Maniatis y col., Molecular Cloning, A Laboratory Mammal, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982).
Con respecto a la transformación de células de
vertebrados que contienen ADNr, ver, por ejemplo, Graham y col.,
Virol., 52:456 (1973); Wigler y col., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU,
76:1373-76 (1979), y las enseñanzas en este
documento.
Las células transformadas exitosamente, es
decir, las células que contienen una molécula de ADNr de la presente
invención, pueden identificarse por medio de técnicas bien
conocidas. Por ejemplo, las células que resultan de la introducción
de un ADNr de la presente invención pueden clonarse a poblaciones de
células homogéneas desde el punto de vista clonal que contienen el
ADNr. Las células de aquellas colonias pueden cultivarse, lisarse y
puede examinarse su contenido de ADN para verificar la presencia del
ADNr usando un procedimiento tal como el descrito por Southern, J.
Mol. Biol., 98:503 (1975) o Berent y col., Biotech., 3:208
(1985).
Además de ensayar directamente la presencia de
ADNr, la transformación exitosa puede confirmarse por medio de
procedimientos inmunológicos conocidos cuando el ADNr es capaz de
dirigir la expresión de cortistatina o mediante la detección de
actividad de unión de cortistatina.
Por ejemplo, las células transformadas de manera
exitosa con un vector de expresión producen proteínas que exhiben
antigenicidad o actividad biológica de cortistatina. Se recogen
muestras de células que se supone han sido transformadas y se
ensayan buscando actividad biológica o antigenicidad de
cortistatina.
Por consiguiente, además de las células huésped
transformadas la presente invención también contempla un cultivo de
aquellas células, de preferencia un cultivo monoclonal, (clonalmente
homogéneo), o un cultivo derivado de un cultivo monoclonal, en un
medio nutritivo. De preferencia, el cultivo también contiene una
proteína que exhibe actividad biológica o antigenicidad de
cortistatina.
Los medios nutritivos útiles para cultivar
células huésped transformadas son bien conocidos en la técnica y
pueden obtenerse de varias fuentes comerciales. En formas de
realización en las que la célula huésped es una célula de mamífero,
puede usarse un medio "libre de suero".
La capacidad para unir selectivamente/modular la
función de un receptor de cortistatina por medio de un ligando de
cortistatina es el fondo de la utilidad de la farmacología de la
cortistatina, y depende de la identificación de moléculas
farmacológicas que puedan actuar como ligandos selectivos, agonistas
o antagonistas para un receptor de cortistatina. Con este fin, la
dilucidación de nuevas proteínas cortistatina, tales como aquellas
descritas en este documento, proporciona herramientas valiosas para
la búsqueda de reactivos selectivos, herramientas útiles en ensayos
de unión, y en ensayos de selección que indican la respuesta
selectiva de fármacos con el receptor de cortistatina.
Por consiguiente, la invención contempla
procedimientos para determinar si una molécula se une a, y de
preferencia si la molécula activa, un receptor de cortistatina
preseleccionado.
El procedimiento comprende realizar un ensayo de
unión para identificar moléculas que se unen al receptor de
cortistatina, como se describen en cualquiera de los ensayos en este
documento. Por consiguiente, el procedimiento comprende (1) poner
en contacto una molécula candidato con una célula que tiene un
receptor de cortistatina bajo condiciones que permitan la unión de
cortistatina al receptor, determinando de este modo si el candidato
se une al receptor. El receptor es típicamente una proteína de
superficie de la célula cuando es expresado por las células.
Como alternativa, puede usarse un formato de
competición para identificar análogos de cortistatina usando una
cortistatina marcada, y midiendo la cantidad de marcador unido en
presencia de un ligando candidato, que indica si el candidato
compite con la cortistatina marcada por la unión al receptor. En
este documento se describe un ejemplo de ensayo de competición.
También es posible usar el procedimiento
anterior para determinar si la molécula que se une al receptor de
cortistatina también activa o modula la función del receptor, es
decir, actúa como un agonista, o determinar si la molécula inhibe
la función del receptor, es decir, actúa como un antagonista. Por
consiguiente, por medio de la evaluación en la etapa de detección
si se activa el receptor de cortistatina, puede determinarse si la
molécula candidato es bioactiva.
Los procedimientos para detectar bioactividad de
la molécula candidato pueden variar, pero típicamente incluyen la
medición de cambios a nivel intracelular de un segundo mensajero
producidos como resultado de la unión, detectar cambios en el
potencial eléctrico, observar sus efectos fisiológicos o de
comportamiento relacionados con la función de la cortistatina, y
procedimientos similares. En los Ejemplos se describen ejemplos de
ensayos para unión o para bioactividad específica de cortistatina e
incluyen la medición de hiperpolarización de células del hipocampo,
medición de inducción de la forma de onda del sueño de onda lenta
dos (SOL2), unión directa a una célula que tiene un receptor de
cortistatina, ensayo de acumulación de AMPc, y ensayos
similares.
Se advierte que el receptor de cortistatina no
ha sido caracterizado en gran detalle. Se sabe que la cortistatina
se une al receptor de somatostatina, para el que existen varias
especies de receptor, y se sabe que la cortistatina también se une
a un receptor más específico, llamado por conveniencia receptor
"verdadero" de cortistatina, aunque la reacción de unión con
el receptor de somatostatina es probablemente un acontecimiento
fisiológico real, lo que lo hace un receptor "verdadero" para
algunos objetivos. Por ello, cualquier receptor que une
cortistatina puede denominarse receptor de cortistatina para los
objetivos de un ensayo de selección, aunque resultan de preferencia
los receptores con mayor afinidad y especificidad por cortistatina.
En la realización de los presentes procedimientos de selección,
puede usarse cualquiera de una diversidad de líneas celulares o
tejidos que poseen un receptor de cortistatina, incluyendo los
ejemplos de líneas celulares y tejidos descritos en este documento.
La invención no deberá interpretarse como limitante mientras que los
ensayos de unión o bioactividad incluyan el uso de un receptor de
cortistatina. En formas de realización de preferencia, debería
usarse un receptor específico para cortistatina. La especificidad
puede demostrarse por medio de procedimientos bien conocidos de
unión de ligandos y activación mediada por ligandos.
Por consiguiente, una forma de realización
relacionada contempla un procedimiento de selección para identificar
una molécula candidato que pueda unirse, inhibir o activar un
receptor de cortistatina preseleccionado funcionando como un
agonista o antagonista de cortistatina. El procedimiento
comprende:
(a) poner en contacto una célula de mamífero con
dicho fármaco candidato bajo condiciones que permitan la activación
de dicho receptor de cortistatina por la cortistatina; y
\global\parskip0.900000\baselineskip
(b) detectar el estado de activación de dicho
receptor de cortistatina, y determinar de esta manera si el fármaco
activa o inhibe a dicho receptor.
Está contemplado que ciertos reactivos descritos
en la presente invención tengan la capacidad para modular la
función del receptor de cortistatina, tales como agonistas o
antagonistas, y por consiguiente son útiles en procedimientos
terapéuticos para afecciones mediadas por el receptor de
cortistatina.
Los polipéptidos de cortistatina que imitan las
regiones expuestas de cortistatina tienen la capacidad para
funcionar como análogos y competir por la unión al receptor de
cortistatina, inhibiendo de esta manera la unión de cortistatina al
receptor.
Además, los anticuerpos y anticuerpos
monoclonales de la presente invención que se unen a regiones
expuestas de cortistatina tienen la capacidad de alterar la función
del receptor de cortistatina bloqueando las interacciones naturales
con la cortistatina que interactúa normalmente en el sitio. Los
ejemplos de anticuerpos son los anticuerpos
anti-cortistatina descritos anteriormente.
Finalmente, en este documento se describen
oligonucleótidos que son complementarios con el ARNm que codifica
una proteína cortistatina de esta invención y que son útiles para
reducir la expresión genética y la traducción del ARNm de
cortistatina, alterando de esta manera los niveles de cortistatina
en un tejido.
Por consiguiente, en una forma de realización,
la presente invención proporciona un procedimiento para modular la
función de cortistatina en un paciente animal o ser humano que
comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente
eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que contiene un
polipéptido de cortistatina, análogo o peptidomimético, anticuerpo
o anticuerpo monoclonal anti-cortistatina, agonista
o antagonista de cortistatina, o un oligonucleótido de la presente
invención.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
polipéptido de cortistatina, como un ejemplo para llevar a cabo la
invención, es una cantidad predeterminada calculada para alcanzar el
efecto deseado, es decir, para inhibir la interacción del receptor
con su objetivo normal, e interferir de esta manera con la función
normal del receptor.
De manera similar, una cantidad terapéuticamente
eficaz de un anticuerpo anti-cortistatina es una
cantidad predeterminada calculada para alcanzar el efecto deseado,
es decir, para inmunorreaccionar con la cortistatina, e inhibir de
esta manera la capacidad del receptor para interactuar con su
objetivo normal, cortistatina, e interferir de esta manera con la
función normal del receptor.
La inhibición in vivo de la función del
receptor de cortistatina usando un polipéptido de cortistatina, un
anticuerpo anti-cortistatina, o un agonista o
antagonista de cortistatina de esta invención es una forma de
realización particularmente de preferencia y es deseable en una
diversidad de escenarios clínicos, tales como cuando el paciente
exhibe síntomas de un receptor de cortistatina sobre o sub
activado.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
polipéptido, agonista o antagonista de cortistatina de esta
invención es típicamente una cantidad tal que cuando se administra
en una composición fisiológicamente tolerable es suficiente para
alcanzar una concentración plasmática de entre aproximadamente 0,1
micromolar (\muM) y aproximadamente 100 \muM, y de preferencia
desde entre aproximadamente 0,5 \muM hasta aproximadamente 10
\muM.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de un
anticuerpo de esta invención es típicamente una cantidad de
anticuerpo tal que cuando se administra en una composición
fisiológicamente tolerable es suficiente para alcanzar una
concentración plasmática de entre aproximadamente 0,1 microgramos
(\mug) por mililitro (ml) y aproximadamente 100 \mug/ml, y de
preferencia desde entre aproximadamente 1 \mug/ml hasta
aproximadamente 5 \mug/ml.
La eficacia del tratamiento puede determinarse
observando la ablación de los síntomas asociados con la función del
receptor de cortistatina inhibido.
Las composiciones terapéuticas que contienen un
polipéptido, agonista o antagonista de cortistatina o anticuerpo
anti-cortistatina de esta invención se administran
convenientemente por vía intravenosa o por medio de un
procedimiento de administración al tejido cerebral, como por ejemplo
mediante la inyección de una dosis unitaria. La frase "dosis
unitaria" cuando se la usa en referencia a una composición
terapéutica de la presente invención se refiere a unidades
físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para
el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de
material activo calculado para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el diluyente necesario; es decir,
transportador o vehículo.
La administración a un tejido cerebral o LCR
puede llevarse a cabo mediante una diversidad de medios, que
incluyen la inyección directa, por medio del uso de una cánula en el
tejido diana, por medio de aplicación directa en un procedimiento
quirúrgico, por adsorción a través de la barrera hematoencefálica
tras la administración intravenosa, y medios similares.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los compuestos y composiciones terapéuticas se
administran generalmente para que contacten con las células o
tejidos que contienen células que contienen el receptor de
cortistatina diana. La administración puede realizarse por
introducción de la composición internamente tal como por vía oral,
intravenosa, intramuscular, intranasal o a través de inhalaciones
de aerosoles que contienen la composición, y similares, mediante una
cánula dentro del tejido cerebral, o por introducción en o sobre un
sistema de tejidos como por introducción transdérmica, tópica o
intralesión, en supositorios, o por inyección intraorbital, y
similares.
Las composiciones se administran de una manera
compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad
terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del
sujeto a tratar, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar
el ingrediente activo, y el grado de efecto terapéutico deseado. Las
cantidades precisas de ingrediente activo necesarias a administrar
dependen del juicio del médico y son particulares para cada
individuo. Sin embargo, los intervalos de dosificaciones adecuados
para aplicación sistémica están descritos en este documento y
dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para
la administración inicial y para las administraciones posteriores
de refuerzo son también variables, pero están tipificados por una
administración inicial seguida por dosis repetidas en intervalos de
una o más horas mediante una inyección posterior u otra
administración. Como alternativa, está contemplada la infusión
intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en el
LCR o en la sangre en los intervalos especificados para tratamientos
in vivo.
Como ayuda para la administración de cantidades
terapéuticas eficaces de un polipéptido, agonista, antagonista,
anticuerpo o anticuerpo monoclonal de cortistatina (de aquí en
adelante un "agente terapéutico") resulta útil un
procedimiento de diagnóstico de esta invención para detectar un
agente terapéutico en el LCR o sangre del sujeto para caracterizar
el destino del agente terapéutico administrado. Los ensayos de
diagnóstico (control) adecuados se describen en este documento.
En otra forma de realización, la invención
contempla el uso de ácidos nucleicos que codifican porciones de un
gen de cortistatina para inhibir la expresión y función
genética.
Por consiguiente, la presente invención
proporciona un procedimiento para inhibir la expresión de productos
del gen de cortistatina y por consiguiente inhibir la función del
péptido de cortistatina diana. Los segmentos de ADN y sus
composiciones tienen una cantidad de usos, y pueden usarse in
vitro o in vivo. In vitro, las composiciones
pueden usarse para bloquear la función y/o la expresión de
cortistatina en cultivos celulares, tejidos, órganos y materiales
similares que pueden expresar cortistatina. In vivo, las
composiciones pueden usarse de manera profiláctica o terapéutica
para inhibir la expresión de un gen de cortistatina, y para inhibir
enfermedades o afecciones médicas asociadas con la expresión o
función del gen de cortistatina o el estado de actividad de su
receptor.
Los procedimientos comprenden, en una forma de
realización, contactar las células o tejidos con una cantidad
terapéuticamente eficaz de una composición farmacéuticamente
aceptable que comprende un segmento de ADN de esta invención. En
una forma de realización relacionada, el contacto incluye la
introducción de la composición del segmento de ADN en las células
que expresan una proteína cortistatina.
El segmento de ADN puede estar en una diversidad
de formas, pero de preferencia es una forma de hebra única para
facilitar la hibridación complementaria con el ARNm diana en la
célula en la que se quiere alterar la expresión del gen de
cortistatina.
El término "células" tiene la intención de
incluir una pluralidad de células así como células únicas. Las
células pueden estar aisladas, o pueden ser células que forman una
organización mayor de células para formar un tejido u órgano.
En otra forma de realización, la invención
contempla un procedimiento para inhibir la expresión de genes de
cortistatina en un paciente que comprende la administración a un
paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición
de segmentos de ADN de esta invención en un excipiente
farmacéuticamente aceptable. En casos en los que se cree que la
distribución de la cortistatina está diseminada en el cuerpo, la
administración del oligonucleótido terapéutico puede ser sistémica.
Como alternativa, la cortistatina diana puede estar localizada en
un tejido, y el procedimiento terapéutico puede igualmente dirigirse
administrando el segmento de ADN terapéutico al tejido que se
quiere tratar.
La concentración del ingrediente activo de
segmentos de ADN en una composición terapéutica variará, dependiendo
de la dosificación deseada, el uso, la frecuencia de administración
y similar. La cantidad usada será una cantidad terapéuticamente
eficaz y dependerá de una cantidad de factores, que incluyen la vía
de administración, la formulación de la composición, el número y
frecuencia de tratamientos y la actividad de la formulación
usada.
El uso de segmentos de ADN terapéuticos, y por
consiguiente la administración de aquellos segmentos de ADN en
células en las que son eficaces, ha sido descrito en una diversidad
de escenarios. Por lo general se sabe que pueden alcanzarse los
niveles intracelulares de ácidos nucleicos terapéuticamente
eficaces, y particularmente de ácidos nucleicos más pequeños tales
como segmentos de ADN y oligonucleótidos, ya sea exponiendo células
a soluciones que contienen ácidos nucleicos o mediante la
introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células.
Tras la exposición, los ácidos nucleicos son incorporados por las
células donde ejercen su eficacia. Además, la introducción directa
dentro de la célula puede proporcionarse mediante diversos medios,
que incluyen microinyección, administración mediante el uso de
vehículos específicos de incorporación, y similares.
La composición farmacéutica que contiene el
oligonucleótido terapéutico de preferencia también contiene
vehículos fisiológicamente aceptable, en particular vehículos
hidrófobos que facilitan el transporte del oligonucleótido a través
de la membrana celular o barrera hematoencefálica.
Ejemplos de descripciones de la administración
de segmentos de ADN y oligonucleótidos terapéuticos dentro de
células pueden encontrarse en las enseñanzas de las Patentes de EEUU
Nº 5.04.820, 4.806.463, 4.757.055, y 4.689.320.
Una cantidad terapéuticamente eficaz es una
cantidad predeterminada calculada para alcanzar el efecto deseado,
es decir, para unirse al gen de cortistatina presente y de esta
manera inhibir la función del gen.
Como resulta evidente para los expertos en la
técnica, el número de copias de un gen de cortistatina puede
variar, presentando de esta manera una cantidad variable de dianas
con las que hibridar. Por consiguiente resulta de preferencia que
el procedimiento terapéutico alcance una concentración intracelular
de un segmento de ADN terapéutico de esta invención en exceso molar
con respecto al número de copias del gen en la célula, y de
preferencia al menos un exceso de diez veces, de más preferencia al
menos un exceso de cien veces, y aún de más preferencia un exceso
de al menos mil veces de segmentos de ADN terapéuticos con relación
al número de copias del gen por célula. Una cantidad eficaz de
preferencia es una concentración intracelular de entre
aproximadamente 1 nanomolar (nM) y aproximadamente 100 micromolar
(\muM), particularmente desde aproximadamente 50 nM hasta
aproximadamente 1 \muM.
Como alternativa, puede expresarse una cantidad
terapéuticamente eficaz como una concentración extracelular. Por
ello resulta de preferencia exponer una célula que contiene un gen
de cortistatina a una concentración de entre aproximadamente 100 nM
y aproximadamente 10 milimolar (mM), y de preferencia desde
aproximadamente 10 \muM hasta 1 mM. Por consiguiente, en formas
de realización en las que la administración de una composición
terapéutica de segmentos de ADN está diseñada para exponer células
al ácido nucleico para la incorporación celular, resulta de
preferencia que la concentración local del segmento de ADN en el
área del tejido a tratar alcance las concentraciones extracelulares
nombradas anteriormente.
Para las dosificaciones en pacientes, usando un
segmento de ADN de doble hebra con 20 bases de nucleótidos como el
patrón, una dosificación típica de una composición terapéutica para
un ser humano de 70 kilogramos (kg) contiene entre aproximadamente
0,1 miligramos (mg) y aproximadamente 1 gramo, de segmento de ADN
20-mero por día, y más usualmente desde
aproximadamente 1 mg hasta 100 mg por día. Indicado de manera
diferente, está contemplada una dosificación desde aproximadamente
1 \mug/kg/día hasta aproximadamente 15 mg/kg/día, y de
preferencia desde aproximadamente 15 hasta 1500 \mug/kg/día.
La inhibición de la expresión y/o función del
gen de cortistatina in vivo por medio de una composición
terapéutica de esta invención es deseable en una diversidad de
escenarios clínicos, tales como cuando el paciente está en riesgo
por una enfermedad basada en la expresión del gen de
cortistatina.
La presente invención contempla composiciones
terapéuticas útiles para la práctica de los procedimientos
terapéuticos descritos en este documento. Las composiciones
terapéuticas de la presente invención contienen un vehículo
fisiológicamente tolerable junto con un reactivo terapéutico de esta
invención, a saber un polipéptido de cortistatina, un anticuerpo o
anticuerpo monoclonal anti-cortistatina, u
oligonucleótidos como se describen en este documento, disueltos o
dispersados en el mismo como un ingrediente activo. En una forma de
realización de preferencia, la composición terapéutica no es
inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero o ser
humano para fines terapéuticos.
Como se usa en este documento, los términos
"farmacéuticamente aceptable", "fisiológicamente
tolerable" y las variaciones gramaticales de los mismos, cuando
se refieren a composiciones, vehículos, diluyentes y reactivos, se
usan de manera indistinta y representan que los materiales son
capaces de ser administrados a un mamífero sin la producción de
efectos fisiológicos indeseables tales como náuseas, mareos,
malestar gástrico y similar.
La preparación de una composición farmacológica
que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en la
misma es bien entendida en la técnica. Típicamente tales
composiciones se preparan como inyectables ya sea como soluciones o
suspensiones líquidas, sin embargo, pueden también prepararse formas
sólidas adecuadas para solución o suspensiones, en líquidos previo
al uso. La preparación también puede estar emulsionada.
El ingrediente activo puede mezclarse con
excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con
el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para uso en los
procedimientos terapéuticos descritos en este documento. Los
excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina,
dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los
mismo. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades
menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o
emulsivos, agentes tamponadores de pH y similares que aumentan la
eficacia del ingrediente activo.
La composición terapéutica de la presente
invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los
componentes de la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables
incluyen sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino
libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales
como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos
orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las
sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden también
derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de
sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y de bases orgánicas tales
como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino
etanol, histidina, procaína y similares.
Los vehículos fisiológicamente tolerables son
bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de vehículos líquidos
son soluciones acuosas estériles que no contienen ningún otro
material además de los ingredientes activo y agua, o contienen un
tampón tal como fosfato de sodio a un valor fisiológico de pH,
solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina
tamponada con fosfato. Más aún, los vehículos acuosos pueden
contener más de una sal tampón, así como también sales tales como
cloruros de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros
solutos.
Como se describe en este documento, para la
administración intracelular de oligonucleótidos, pueden usarse
vehículos especializados que facilitan el transporte del
oligonucleótido a través de la membrana celular. Éstos típicamente
son composiciones hidrófobas, o incluyen reactivos adicionales que
dirigen la administración hacia las células y/o al interior de las
células.
Las composiciones líquidas pueden también
contener fases líquidas además de agua y excluyendo agua. Los
ejemplos de tales fases líquidas adicionales son glicerina, aceites
vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones
agua-aceite.
Una composición terapéutica contiene una
cantidad de un polipéptido de cortistatina o molécula de anticuerpo
anti-cortistatina de la presente invención
suficiente para inhibir la función de la cortistatina. Típicamente
ésta es una cantidad de al menos 0,1 por ciento en peso, y de más
preferencia al menos 1 por ciento en peso, de péptido o anticuerpo
por peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso
es una proporción en peso de péptido o anticuerpo con respecto a la
composición total. Por consiguiente, por ejemplo 0,1 por ciento en
peso es 0,1 gramos de polipéptido por 100 gramos de composición
total.
Los siguientes ejemplos tienen la intención de
ilustrar pero no deben interpretarse como limitantes de ninguna
manera de la memoria descriptiva y reivindicaciones.
Para seleccionar ARNm nuevos, se obtuvo un clon
de ADNc de 140 pares de bases (pb) de una biblioteca deducida de
hipocampo de rata y a continuación se usó como una sonda para
seleccionar una biblioteca de ADNc de cerebro de rata en el
plásmido pHG327 como describen Forss-Petter y col.,
J. Mol. Neurosci., 1:63-75 (1989). La biblioteca de
ADNc se construyó como describieron Staeheli y col., Cell,
44:147-158 (1986), cuya descripción se incorpora en
este documento por referencia.
Brevemente, la biblioteca de ADNc deducida se
construyó esencialmente como describieron Usui y col., J. Neurosci.,
14:4915-4926 (1994) y fue el resultado de deducir
una biblioteca de ADNc a partir de hipocampos de ratas que habían
sido estimuladas con frecuencia elevada in vivo (denominada
biblioteca diana por Ursui y col.) con una biblioteca de ADNc
obtenida a partir de hipocampo contralateral de las mismas ratas
(denominada biblioteca conductora de ADNc). Los clones de esta
biblioteca deducida se montaron en filtros réplica de nylon y se
hibridaron con sondas constituidas por los clones de ADNc de las
bibliotecas diana y conductora de ADNc hibridando con la diana pero
no con la conductora y además se analizaron por secuenciación
dideoxi (Sanger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU,
74:5463-5467 (1977)) e hibridación in situ
(de Lecea y col., Mol. Brain Res., 25:286-296
(1994)). La secuencia de nucleótidos de 140 pares de bases (pb) del
clon 1D4 (más tarde denominado preprocortistatina), que se usó como
la sonda de selección descrita anteriormente, se comparó a
continuación con secuencias de la base de datos GenBank y se vio
que tenía un grado significativo (82%) de similitud con la secuencia
de nucleótidos informada para somatostatina.
Otras selecciones de bibliotecas de ADNc de
cerebro de rata completo e hipocampo produjeron otros cinco clones
con una longitud de hasta 438 nucleótidos, incluyendo dos que
mostraron un codón de iniciación de metionina. La secuencia de
nucleótidos de los clones aislados se determinó usando el
procedimiento dideoxi como describieron Sanger y col., Proc. Natl.
Acad. Sci., EEUU, 74:5463-5467 (1977). La alineación
de secuencias se realizó con el programa BESTFIT (grupo GCG,
Universidad de Wisconsin).
De los cinco clones de ADNc obtenidos de la
selección de las bibliotecas identificadas anteriormente, se
recopiló una secuencia de nucleótidos codificadora completa de ADNc
de preprocortistatina de rata, con una longitud de 438 nucleótidos,
como se muestra en la Figura 1 y se presenta en la SEC ID Nº 1. El
clon de ADNc completo de cortistatina muestra un marco de lectura
abierto (ORF) de 336 nucleótidos con un péptido señal
N-terminal cuyo sitio de escisión está indicado por
una flecha entre las posiciones 27 y 28 de aminoácidos
correspondientes a un sitio de escisión tras la posición de
nucleótido 110. Una secuencia de seis iteraciones de las
repeticiones del trinucleótido CTG que codifican restos leucina
contenidos dentro de la región codificadora del péptido señal está
subrayada. En otros genes se ha implicado a tal expansión de
tripletes como causa de enfermedades neurológicas, por ejemplo,
distrofia miotónica como describen Brook y col., Cell,
68:799-808 (1992).
La traducción de esta secuencia de ADNc de rata
indicó que la proteína nueva de 112 restos aminoácido, llamada
preprocortistatina de rata, se codificó como se muestra en la Figura
1 alineada bajo la secuencia de ADNc. La secuencia de aminoácidos
deducida de preprocortistatina de rata se presenta también en la SEC
ID Nº 1 con la secuencia de nucleótidos y en SEC ID Nº 2 sola.
La escisión de las preproespecies de
cortistatina producirá una proteína madura que se procesa en
cualquiera de dos pares de aminoácidos básicos juntos, KK
(lys-lys) o KR (lys-arg) mostrados
en negrita en la Figura 1, para producir
cortistatina-29 y cortistatina-14,
la última se muestra en la Figura 1 en la caja con línea continua,
análogo con la escisión de preprosomatostatina en los restos 28 y 14
como describieron Glushankov y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU,
81:6662-6666 (1984), o en ambos pares básicos para
producir además cortistatina-13, que se muestra en
la Figura 1 con la caja con línea de trazos. Mientras que la
cortistatina-13 no está relacionada con especies
conocidas, la cortistatina-14 comparte 11 de 14
restos con somatostatina-14. La alineación de
preprocortistatina de rata con la secuencia de 116 restos aminoácido
de preprosomatostatina se muestra en la Figura 2 marcados
respectivamente como CST y SST. Los puntos únicos entre las
secuencias indican sustituciones no conservativas de aminoácidos
mientras que los puntos dobles verticales indican sustituciones
conservativas de aminoácidos. Las líneas verticales entre las
secuencias indican identidad entre CST y SST. Los puntos únicos
entre la secuencia continua de CST indica un espaciado para acomodar
la alineación con SST. La secuencias de restos aminoácido de CST
mostrada en la Figura 2 corresponde a las posiciones 10 a 112 en la
SEC ID Nº 2. La secuencia de restos aminoácido de SST se presenta
en SEC ID Nº 3.
Los aminoácidos compartidos entre
preprocortistatina y preprosomatostatina incluyen dos restos
cisteína que tienen probabilidad de convertir el péptido en cíclico
y los restos aminoácido FWKT (SEC ID Nº 2 desde la posición 104
hasta 107) que son críticos para la unión de somatostatina a sus
receptores como describieron Veber y col., Nature,
280:512-514 (1979). Sin embargo, la identidad
extendida de aminoácidos se observa sólo en sus extremos
C-terminales. Ambas estatinas comparten los restos
críticos para la unión a los receptores como se muestra en negrita
en la figura y las cisteínas que tienen probabilidad de convertir
los péptidos en cíclicos.
Como se muestra en la Figura 2, para la porción
de las secuencias de preprostatinas que empiezan después de KK en
negrita para CST y de RK en negrita para SST que indican péptidos
con 14 aminoácidos, la cortistatina-14 y
somatostatina-14 están permutadas por un aminoácido.
Por consiguiente, la alineación de cortistatina comienza en el
segundo aminoácido del péptido de somatostatina-14,
que corresponde al resto aminoácido de la posición 104 en la Figura
2, y la cortistatina finaliza con un resto lisina que extiende un
resto aminoácido, que corresponde a la posición de aminoácido 112
de CST, más allá de la cisteína C-terminal de
somatostatina. Esta diferencia y sus secuencias de ADNc indican
claramente que son productos de genes separados.
Una biblioteca de ADNc de corteza cerebral de
ratón (C57/B16), construida en el vector pT7T3D (Pharmacia,
Piscataway, NJ) se seleccionó de manera similar para obtener el
homólogo de ratón del ADNc de preprocortistatina de rata obtenido
anteriormente. Las selecciones produjeron cuatro clones adicionales
con una longitud de hasta 430 nucleótidos, que incluyen dos que
muestran un codón iniciador de metionina. La secuencia de
nucleótidos de los clones aislados se determinó como se describió
anteriormente alineando las secuencias.
De los cuatro clones de ADNc obtenidos de la
selección de las bibliotecas definidas anteriormente, se recopiló
una secuencia codificante de nucleótidos completa de ADNc de
preprocortistatina con una longitud de 427 nucleótidos, como se
muestra en la Figura 3 y se presenta en SEC ID Nº 4. El clon de ADNc
de preprocortistatina exhibe un marco de lectura abierto (ORF) de
327 nucleótidos con un péptido señal N-terminal cuyo
sitio de escisión está indicado por una flecha entre las posiciones
de aminoácidos 25 y 26 que corresponden a un sitio de escisión
después de la posición de nucleótido 99. Una secuencia de tres
iteraciones del trinucleótido CTG que codifican restos leucina
contenidos dentro de la región codificadora para el péptido señal
está subrayada.
La traducción de esta secuencia de ADNc de ratón
indicó que la proteína nueva de 109 restos aminoácido, llamada
preprocortistatina de ratón, se codificó como se muestra en la
Figura 3 alineada bajo la secuencia de ADNc. La secuencia de
aminoácidos deducida de preprocortistatina de ratón se presenta
también en la SEC ID Nº 4 con la secuencia de nucleótidos y en SEC
ID Nº 5 sola.
De manera similar a la preprocortistatina de
rata, la escisión de las preproespecies para dar procortistatina
produce una proteína madura que se procesa en cualquiera de dos
pares de aminoácidos básicos juntos, KS (lys-ser) y
KK (lys-lys) mostrados en negrita en la Figura 3,
para producir cortistatina-29 de ratón y
cortistatina-14 de ratón, la última se muestra en
la Figura 3 en la caja con línea continua, o en ambos pares básicos
para producir además cortistatina-13 de ratón, que
se muestra en la Figura 3 con la caja con línea de trazos.
Tras la introducción de dos huecos, las
secuencias de nucleótidos de ratón y de rata fueron idénticos en un
86%. Asumiendo que el producto de inicio de traducción en ratón
comienza en el segundo triplete de metionina, contiene 108
aminoácidos en comparación con 112 para rata. Una vez más, tras la
introducción de dos huecos, las proteínas codificadas de rata y de
ratón comparten una identidad de 82%. La secuencia de nucleótidos de
ratón que corresponde a cortistatina-14 y el
doblete de lisina adyacente que sirve como su sitio de liberación
proteolítica desde su precursor fueron idénticos a la misma región
en la secuencia de rata, respaldando de esta manera una
conservación funcional del péptido maduro. La secuencia de ADN
secuencia arriba desde el sitio de procesamiento de
cortistatina-14 mostró varios puntos de divergencia,
incluyendo algunos que dan como resultado sustituciones no
conservativas de aminoácidos. La secuencia que corresponde al
péptido señal de preprocortistatina contiene sólo tres iteraciones
de CTG que codifican el aminoácido leucina, en contraste con seis
iteraciones del mismo triplete en el precursor del péptido de rata,
que indica que esta secuencia es inestable y sometida a
expansión.
El homólogo humano se obtiene de manera similar
a partir de la selección de bibliotecas de ADNc de cerebro humano
esencialmente como se describió anteriormente para ácidos nucleicos
y proteínas de rata y ratón. Para seleccionar ARNm nuevos, se aisló
un fragmento de 120 pb de la secuencia codificadora humana mediante
PCR usando cebadores degenerados de las secuencias de ratón y de
rata. La secuencia de nucleótidos de este fragmento se comparó con
la base de datos EST y se encontró una secuencia con similitud
significativa con cortistatina. Se obtuvo un nucleótido de 250 pb y
se usó como una sonda para seleccionar una biblioteca humana de ADNc
de cerebro completo. Las selecciones produjeron dos clones de ADNc,
de 450 y 270 nucleótidos de longitud, y se determinó la secuencia
del más largo. Se amplificó el ADNc de preprocortistatina humana por
PCR usando cebadores para la secuencia C-terminal
de cortistatina. Se clonó el fragmento de PCR, se marcó con cebador
aleatoriamente y se usó para seleccionar una biblioteca de ADNc
preparada de ARNm de cerebro humano completo (Clontech).
Se recopiló una secuencia de nucleótidos
completa codificadora de ADNc de preprocortistatina humana, de 701
nucleótidos de longitud, como se muestra en la Figura 3a y se
presenta en la SEC ID Nº 25. Una secuencia de cuatro iteraciones
del trinucleótido CTG que codifica resto leucina contenidos dentro
de la región codificadora del péptido señal está subrayada en la
Figura 3a. El clon de ADNc completo de preprocortistatina exhibe un
ORF de 315 nucleótidos, que comienza en la posición 78 de la SEC ID
Nº 25.
La traducción de esta secuencia de ADNc humana
indicó que estaba codificada una proteína nueva de 105 restos
aminoácido, denominada preprocortistatina humana, como se muestra en
la Figura 3b. La secuencia deducida de aminoácidos de
preprocortistatina humana se presenta en SEC ID Nº 26.
De manera similar a la preprocortistatina de
rata, la escisión de las preproespecies humanas para dar
procortistatina genera una proteína madura que se procesa en
cualquiera de dos pares de aminoácidos básicos juntos RR
(arg-arg), para producir
cortistatina-29 humana y
cortistatina-17 humana. Las preproespecies humanas
junto con las proespecies y la proteína madura se presentan en la
Tabla 1 en los Ejemplos incluyendo sus secuencias de restos
aminoácido informadas.
Las secuencias de nucleótidos de ser humano y de
rata son idénticas en un 71%. La cortistatina-17
humana comparte 13 de los últimos 14 restos con la
cortistatina-14 de rata y de ratón. El doblete de
lisina que está justo en el extremo N-terminal de
cortistatina-14 en la rata y en ratón no está
conservado en la secuencia humana. La secuencia de ADN secuencia
arriba desde el sitio de procesamiento de
cortistatina-14 no está muy conservada entre las
especies. Sin embargo, la cortistatina-31 de rata y
la cortistatina-31 humana comparten 13 restos
agrupados en sus regiones N-terminales que están
conservadas en las secuencias de prohormonas de de rata, ratón y
ser humano. La secuencia que corresponde al péptido señal de
preprocortistatina contiene sólo cuatro iteraciones de CTG que
codifican el aminoácido leucina, en contrasta con seis iteraciones
del mismo triplete en el precursor de rata o tres en ratón, lo que
indica que esta secuencia es inestable y sometida a expansión.
Se inserta la preprocortistatina de rata (SEC ID
Nº 1) en los sitios BamHI del vector pHG237, tanto el ADN como el
vector se describieron anteriormente. Tras la digestión con enzima
de restricción BamHI, se inserta el fragmento de 450 pb resultante
directamente en el sitio BgIII de la región policonectora del vector
pCM4 (David W. Russell, Dept. of Molecular Genetics, Universidad de
Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX). Este vector usa el
promotor de citomegalovirus (CMV) para dirigir la expresión de
proteínas extrañas en células de mamífero. Se agregaron varios, de
ocho a diez aminoácidos "etiquetas" del epítopo por medio de
PCR al extremo N-terminal de preprocortistatina para
permitir la visualización del producto procesado en células de
mamífero.
Por ejemplo, los respectivos oligonucleótidos
sintéticos 5' y 3', escritos en dirección desde 5' hacia 3',
5'ATCGA
GATCTAAGGAGGATGGGTGGCTGCAG3' (SEC ID Nº 13) y 5'ACTGTCTAGATCATAGGTCTTCTTCTGATAT
TAGTTTTTGTTCCTTGCACGAGGAGAAGGTTTTCCAG3' (SEC ID Nº 14) se usaron como cebadores en PCR para amplificar la preprocortistatina empezando en la posición de nucleótido 23 en la (SEC ID Nº 1) con un sitio BgIII insertado agregado en su extremo 5' hacia el extremo 3' que tiene una etiqueta de epítopo c-myc insertado. El cebador 5' se denomina también un cebador secuencia arriba, sentido o hacia adelante. El cebador 3' se denomina también cebador secuencia abajo, antisentido o hacia atrás. Los productos de PCR resultantes son tales que, cuando se subclonan en el pCMV o vectores relacionados y se transfectan en células de mamífero (células CHO, AtT-20 o GH4), producen un producto de proteína procortistatina con una etiqueta myc que se visualiza por medio de transferencia Western o inmunocitoquímica, sin necesidad de anticuerpos específicos para cortistatina. Para la visualización in vivo del proceso, la secuencia de preprocortistatina amplificada como se describió anteriormente podría insertarse en el vector pGFP-N1 Clontech, Palo Alto, CA), que contiene proteína fluoresceína verde (GFP) de Aequorea victoria.
GATCTAAGGAGGATGGGTGGCTGCAG3' (SEC ID Nº 13) y 5'ACTGTCTAGATCATAGGTCTTCTTCTGATAT
TAGTTTTTGTTCCTTGCACGAGGAGAAGGTTTTCCAG3' (SEC ID Nº 14) se usaron como cebadores en PCR para amplificar la preprocortistatina empezando en la posición de nucleótido 23 en la (SEC ID Nº 1) con un sitio BgIII insertado agregado en su extremo 5' hacia el extremo 3' que tiene una etiqueta de epítopo c-myc insertado. El cebador 5' se denomina también un cebador secuencia arriba, sentido o hacia adelante. El cebador 3' se denomina también cebador secuencia abajo, antisentido o hacia atrás. Los productos de PCR resultantes son tales que, cuando se subclonan en el pCMV o vectores relacionados y se transfectan en células de mamífero (células CHO, AtT-20 o GH4), producen un producto de proteína procortistatina con una etiqueta myc que se visualiza por medio de transferencia Western o inmunocitoquímica, sin necesidad de anticuerpos específicos para cortistatina. Para la visualización in vivo del proceso, la secuencia de preprocortistatina amplificada como se describió anteriormente podría insertarse en el vector pGFP-N1 Clontech, Palo Alto, CA), que contiene proteína fluoresceína verde (GFP) de Aequorea victoria.
Las proteínas procortistatina para usar en esta
invención se producen también en bacterias y se purifican
subclonando la secuencia codificadora de procortistatina descrita
anteriormente y que puede verse en la Figura 1 en el vector PRSET B
(Invitrogen, San Diego, CA), que contiene la secuencia de
nucleótidos que codifican 6 histidinas previo a la inserción de la
secuencia de procortistatina. El vector contiene el promotor T7 que
dirige la expresión de proteínas etiquetadas con 6 His en E.
coli. Para este aspecto, los respectivos oligonucleótidos
sintéticos 5' y 3', 5'ATCGA
GATCTGTCCTGGAGA3' (SEC ID Nº 15) y 5'ACTGAATTCAGGCCACGGCTGCATTCACAG3' (SEC ID Nº 16), se usan como cebadores en PCR para amplificar la secuencia de preprocortistatina de rata sin el péptido señal en los sitios BgIII y EcoRI del vector pRSET B. Una vez expresada, la secuencia de procortistatina etiquetada con 6 histidinas se purifica a continuación por cromatografía de afinidad en una resina de afinidad de metales TALON (Clontech).
GATCTGTCCTGGAGA3' (SEC ID Nº 15) y 5'ACTGAATTCAGGCCACGGCTGCATTCACAG3' (SEC ID Nº 16), se usan como cebadores en PCR para amplificar la secuencia de preprocortistatina de rata sin el péptido señal en los sitios BgIII y EcoRI del vector pRSET B. Una vez expresada, la secuencia de procortistatina etiquetada con 6 histidinas se purifica a continuación por cromatografía de afinidad en una resina de afinidad de metales TALON (Clontech).
Se produce una proteína de fusión
procortistatina-glutation-S-transferasa
en E. coli subclonando la secuencia de procortistatina en
los sitios adecuados del vector pGEX2 (Pharmacia), como se describió
anteriormente.
Por consiguiente, los procedimientos descritos
en este documento son útiles para la generación de proteínas
cortistatina recombinantes y proteínas de fusión de cortistatina
recombinantes. Con los procedimientos de expresión descritos
anteriormente, se preparan homólogos de ratón y de ser humano de la
procortistatina de rata junto con las proteínas cortistatina y
péptidos restantes de rata y ratón que se presentan a continuación
en la Tabla 1. La clonación y expresión de proteínas y polipéptidos
de cortistatina de esta invención son técnicas bien conocidas por
los expertos en la técnica y están descritos, por ejemplo, en
"Current Protocols in Molecular Biology", ed. Ausebel y col.,
Wiley & Sons, Inc., Nueva York (1989).
Una vez expresados, las proteínas y polipéptidos
de cortistatina recombinantes junto con las proteínas de fusión de
los mismos son útiles en procedimientos de selección, procedimientos
de diagnóstico y modalidades terapéuticas como se describe a
continuación. Específicamente, con respecto a los procedimientos de
selección, las cortistatinas recombinantes se usan en la fase
sólida en ensayos que incluyen transferencia Western, ELISA, RIA, y
similares, todas ellas técnicas bien conocidas. De manera similar,
las moléculas descritas en este documento se usan en fase líquida
en ensayos que incluyen ensayos de unión a receptor para unión
directa o por competición de unión (ver Ejemplo 5), para ensayos de
activación con AMPc (ver Ejemplo 5), para identificar receptores
específicos de cortistatina (ver Ejemplo 7), y similares. La
determinación e identificación de análogos y antagonistas de
cortistatina se facilita también con el uso de proteínas y
polipéptidos cortistatina recombinantes como se describe en el
Ejemplo 6. Los usos terapéuticos de las moléculas recombinantes se
describen de manera similar en el Ejemplo 8. También están
contemplados otros usos de las moléculas de la presente invención
no descritos en este documento.
Un procedimiento alternativo para preparar
proteínas y polipéptidos de cortistatina recombinantes es preparar
versiones sintéticas de los mismos. Para este procedimiento, se
sintetizaron los polipéptidos usando técnicas de síntesis en fase
sólida convencionales, por ejemplo, los descritos por Merrifield,
Adv. Enzymol., 32:221-296 (1969), y Fields, G. B. y
Noble, R. L., Int. J. Peptide Protein Res.,
35:161-214 (1990) y como están descritas en las
Patentes de EEUU Nº 4.900.811 y 5.242.798.
De aquí en adelante se hará referencia a las
diversas proteínas y péptidos de cortistatina de esta invención por
sus denominaciones como se presentan en la Tabla 1. En la Tabla 1 se
presenta también la SEC ID Nº correspondiente para cada
péptido.
El péptido cortistatina-14, que
tiene la misma secuencia de restos aminoácido para ser humano, rata
y ratón, se sintetizó en la forma amida
carboxi-terminal. A continuación se analizó por
medio de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa
(HPLC) en una columna Vydac C-18 (Alltech
Associates, Inc., IL) con un gradiente lineal de acetonitrilo
0-60% en ácido trifluoro acético al 0,1%.
Posteriormente se purificó el péptido hasta homogeneidad mediante
HPLC preparativa usando las condiciones óptimas sugeridas por la
cromatografía analítica. La composición y concentración de
aminoácidos del péptido aislado se determinó con una hidrólisis de
24 horas con HCl 6N en tubos evacuados a 110 grados Celsius (110ºC)
y posterior análisis en un Analizador de Alto Rendimiento Beckman
Model 6300.
Tras la purificación, se resuspendió el péptido
por separado en agua destilada para formar una solución de péptido
disuelto a una concentración final de 2,5 mM. Posteriormente, se
agregó un décimo del volumen de tampón concentrado 10 veces,
denominado TBS-Az que contiene clorhidrato de Tris
hidroximetil aminometano (Tris-HCl) 0,05 M a un pH
de 7,4, cloruro de sodio (NaCl) 0,1 M, solución de azida sódica
(NaN_{3}) al 0,02%. Se controló el pH de la solución y de ser
necesario, se ajustó hasta pH 7,4 con cantidades valoradas de
base-Tris 1 M.
Las proteínas y péptidos de cortistatina
restantes que se presentan en la Tabla 1 se sintetizaron y
purificaron de manera similar para uso en la práctica de esta
invención.
Para la preparación de un péptido inmunógeno, se
preparó un polipéptido de cortistatina-14 sintético
como se describió en el Ejemplo 2. Se acopló el péptido sintetizado
a edestina (Sigma, St. Louis, MO) usando un agente de
entrecruzamiento heterobifuncional,
N-succinimidil-3-(2-piridilditio)
propionato (SPDP) (Pierce Biochemicals, Rockford, IL). Para el
procedimiento de acoplamiento, se mezclaron 80 microlitros (\mul)
de una solución de SPDP (concentración: 10 mg/ml) disueltos en
dimetilformamida gota a gota con 400 \mul de edestina
(concentración: 15 mg/ml) en fosfato 0,1 M, NaCl 0,1 M a pH 8,5 bajo
condiciones de agitación continua durante 30 minutos a 22ºC para
formar edestina activada con SPDP.
Posteriormente se dializó exhaustivamente la
edestina activada con SPDP resultante a 4ºC frente a una solución
tamponada de fosfato 0,1 M y NaCl 0,1 M a pH 7,4 para eliminar el
SPDP no acoplado. En primer lugar se disolvieron seis mg del
péptido preparado en fosfato 0,1 M y NaCl 0,1 M a pH 7,4 y a
continuación se mezcló con edestina activada con SPDP preparada
anteriormente bajo condiciones de agitación continua. El grado de
acoplamiento del péptido con edestina se controló diluyendo una
alícuota de la mezcla 1:100 en el tiempo cero, y cada hora a partir
de entonces y midiendo la liberación de
piridin-2-tiona a 343 nm en un
espectrofotómetro. El punto final de acoplamiento se determinó como
un aumento de 0,2 en la absorbancia o tras visualizar el precipitado
en cuyo momento se formó el péptido conjugado con edestina,
denominado inmunógeno de
cortistatina-14-edestina.
Para preparar los antisueros específicos para
los péptidos restantes presentados en la Tabla 1 para
preprocortistatina y procortistatina específicos de especie, las
preparaciones de péptidos y proteínas descritas en el Ejemplo 2 se
prepararon de manera similar a los inmunógenos.
Para formar anticuerpos antipéptido, se
emulsionó el inmunógeno
cortistatina-14-edestina preparado
anteriormente usando Adyuvante Completo de Freund (DIFCO
Laboratories, Detroit, MI) para la primera inyección y Adyuvante
Incompleto de Freund (DIFCO) para todas las inyecciones posteriores
de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se incorporó el
inmunógeno en la emulsión en una concentración de 2 mg/ml. Se
inyectó medio ml de una emulsión preparada por vía subcutánea en
cada uno de dos conejos blancos de Nueva Zelanda tras recoger
muestras de suero preinmunización. Se inyectó a los conejos tres
veces en intervalos semanales siguiendo el protocolo de inyección
detallado. Dos semanas después de la última inyección, se recogieron
muestras de sangre para controlar el valor de anticuerpos contra el
péptido específico
cortistatina-14-edestina usado como
un inmunógeno por medio del ensayo ELISA que se describe a
continuación en el Ejemplo 3C. Se almacenaron las muestras de
sangre recogidas a 4ºC durante 12 horas, a continuación se
centrifugaron las muestras a 3000 x g durante 20 minutos. Se
recogió el sobrenadante resultante que contiene anticuerpos
antipéptido, denominados anticuerpos policlonales anti péptido
cortistatina y se almacenaron a -20ºC.
La inmunización de conejos por separado para la
producción de antisuero contra cada uno de los péptidos y proteínas
preparados en el Ejemplo 2 se realizó como se describe en este
documento. Posteriormente se seleccionan los antisueros resultantes
por medio de ELISA como se describe a continuación.
Se determinaron los valores de anticuerpos anti
péptido y la inmunoespecificidad en los sueros recogidos de ratones
en el Ejemplo 3B en ensayos de unión a moléculas de cortistatina
nativas en preparaciones tisulares (es decir, in situ) como
se describe en la Memoria Descriptiva o por medio de un ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA) como se describe a
continuación. Los antígenos usados en el ensayo ELISA incluyen el
péptido inmunizante así como también proteínas y polipéptidos
recombinantes descritos en el Ejemplo 2.
Para determinar la inmunoespecificidad de
antisueros de ratones obtenidos en el Ejemplo 2C, se realizaron
análisis ELISA. Brevemente, se mezclaron por separado 50 \mul de
concentraciones 50 \muM de péptidos cortistatina preparados en el
Ejemplo 1 y presentados en la Tabla 1 en un tampón constituido por
carbonato de sodio (Na_{2}CO_{3}) 0,05 M y NaN3 al 0,02% a pH
9,0 en pocillos de placas de microvaloración. Se mantuvieron las
placas a 37ºC durante una hora para permitir que los antígenos se
fijen operativamente a las paredes del pocillo. Tras lavar los
pocillos recubiertos con antígeno con TBS, se bloquearon los
pocillos con 250 \mul/pocillo de seroalbúmina bovina (SAB) al 10%
(Sigma) en TBS durante una hora a 22ºC. Posteriormente se eliminó la
solución de bloqueo y se lavaron los pocillos cinco veces con 250
\mul/pocillo de tampón de mantenimiento (Tris-HCl
0,05 M, NaCl 0,1 M, NaN_{3} al 0,02%, SAB 1 mg/ml, CaCl_{2} 5
mM, Tween 20 al 0,01% a pH 7,4).
A continuación se mezclaron cincuenta \mul de
diluciones en serie de antisuero específico o no inmune de conejo
en tampón de mantenimiento en los pocillos lavados para formar una
mezcla de inmunorreacción, que se mantuvo durante una hora a 37ºC
para permitir la formación de productos de inmunorreacción en fase
sólida-líquida. A continuación se lavaron los
pocillos tres veces con tampón de mantenimiento seguido por la
mezcla de 50 \mul de 1,0 \mug/ml de anticuerpo secundario (IgG
anti conejo de cabra policlonal biotinilada) (Pierce Biohemicals,
Rockford, IL) diluido en tampón de mantenimiento a cada pocillo para
la detección de productos de inmunorreacción. Se mantuvieron las
placas durante una hora a 37ºC y posteriormente se eliminó la
solución de anticuerpo secundario.
Tras lavar los pocillos como se describió
anteriormente, se agregaron 50 \mul de fosfatasa
alcalina-estreptavidina a una concentración de 1,0
\mug/ml (Pierce Biohemicals) en tampón de mantenimiento a cada
pocillo y se mantuvo durante 30 minutos a 37ºC. La detección de los
productos de inmunorreacción específicos se obtuvo agregando 150
\mul/pocillo de p-nitrofenilfosfato (PNPP) en una
concentración de 5 mg/ml (Pierce en dietanolamina 0,1 M y NaN_{3}
al 0,02% a pH 9) seguido por la medición del cambio de absorbancia a
405 nm a través del tiempo usando el lector EL312 Microplate
Bio-Kinetics Reader y el Programa Informático
KinetiCalc (Biotek Instruments, Inc., VT). Se consideró la unión no
específica como la absorbancia medida en pocillos bloqueados con
SAB al 10% que sirven como controles negativos sin el previo
recubrimiento de una proteína o péptido específico. Bajo las
condiciones descritas, la unión no específica nunca supera más del
5% de la unión específica. Se seleccionaron los antisueros de
conejo anti péptido que exhibieron inmunorreactividad que produjo un
cambio de densidad óptica a 405 nm usando el programa cinético en
comparación con la inmunorreactividad del suero preinmune para con
los péptidos, para uso como anticuerpo antipéptido y se
seleccionaron también para otra purificación como se describe en
este documento.
Los antisueros de conejo para los otros péptidos
inmunógenos se seleccionaron de manera similar para comprobar su
inmunorreactividad con los respectivos péptidos inmunógenos. Los
antisueros de conejo que exhibieron inmunorreactividad
significativa en comparación con el suero preinmune para con cada
péptido inmunógeno se purificaron además y analizaron como se
describe a continuación.
La purificación de la fracción IgG de antisueros
de conejo, que mostraron reactividad significativa para con los
péptidos inmunizantes descritos anteriormente se llevó a cabo
mediante precipitación con sulfato de amonio
(0-45%) seguida por la purificación de IgG en una
columna de intercambio iónico Mono Q (Pharmacia LKB, Piscataway,
NJ) conectada con un sistema de cromatografía líquida rápida de
proteínas (FPLC) (Pharmacia). Para cada antisuero, se realizó la
purificación por inmunoafinidad de la fracción IgG inmunorreactiva
combinada haciendo pasar aproximadamente 100 mg de la IgG a través
de una columna de 5 ml que contenía 3 mg de cortistatina específica
de especie acoplada a Sepharose 4B (Pharmacia). Tras un minucioso
lavado de la columna con cinco volúmenes de la columna de
Tris-HCl 0,05 M y NaCl 1 M pH 7,4 para eliminar
anticuerpos no unidos, se eluyó la IgG unida con dos volúmenes de
la columna de glicina-HCl 0,1 M a pH 2,5. La
proteína eluida se controló por medio de absorbancia a 280 nm y se
determinaron las concentraciones de IgG a partir del coeficiente de
extinción de 13,5. Inmediatamente se dializó la IgG eluida contra
TBS-Az, concentrado contra sacarosa al 50% durante
aproximadamente tres a cuatro horas y una vez más se dializó
exhaustivamente contra TBS-Az hasta una
concentración final de 3-4 mg/ml.
Para preparar anticuerpos monoclonales para las
proteínas y polipéptidos de cortistatina preparados en el Ejemplo
2, se prepararon inmunógenos para cada uno como se describió
anteriormente. Se inmunizaron ratones Balb/c ByJ (The Scripps
Research Institute, La Jolla, CA) por vía intraperitoneal (i.p.) con
50 \mug de inmunógeno preparado en adyuvante completo de Freund
(CFA) seguido por una segunda y una tercera inmunización usando el
mismo inmunógeno, cada inmunización separada por tres semanas, en
adyuvante incompleto de Freund (IFA). Los ratones recibieron un
estímulo de 50 \mug del péptido preparado por vía intravenosa
(i.v.) en solución salina normal cuatro días antes a la fusión y un
segundo estímulo de perfusión similar un día más tarde.
Los animales tratados de esta manera se
sacrificaron y se recogió el bazo de cada ratón. A continuación se
preparó una suspensión de células del bazo. Posteriormente se
extrajeron las células del bazo de la suspensión celular por
centrifugación durante aproximadamente diez minutos a 1000 rpm, a
23ºC. Tras eliminar el sobrenadante resultante, se resuspendió el
sedimento celular en 5 ml de en tampón de lisado cloruro de amonio
(NH_{4}Cl) frío, y se mantuvo durante aproximadamente 10
minutos.
Se mezclaron diez ml de Medio Eagle Modificado
de Dulbecco (DMEM) (GIBCO) y tampón HEPES [ácido
4-(2-hidroxietil)-1-piperidinetansulfónico]
con la suspensión celular lisada para formar una mezcla que se
centrifugó durante aproximadamente diez minutos a 1000 rpm a
23ºC.
Una vez decantado el sobrenadante resultante, se
resuspendió el sedimento en 15 ml de DMEM y HEPES y se centrifugó
aproximadamente durante diez minutos a 1000 rpm a 23ºC. Se repitió
el procedimiento anterior.
A continuación se resuspendió el sedimento en 5
ml de DMEM y HEPES. Posteriormente se extrajo una alícuota de la
suspensión de células del bazo para conteo. Las fusiones se
realizaron de la siguiente manera usando la línea celular de
mieloma no secretor de ratón P3X63Ag 8.653.1, un subclon de la línea
P3X63Ag 8.653 (ATCC1580). Con una proporción de células de mieloma
a células de bazo de aproximadamente 1 a 10 o aproximadamente 1 a
5, se centrifugó una cantidad suficiente de células de mieloma para
formar un sedimento, se lavó dos veces en 15 ml de DMEM y HEPES, y
posteriormente se centrifugó durante diez minutos a 1000 rpm a
23ºC.
Se combinaron las células de bazo y las células
de mieloma en tubos de 15 ml de base redonda. Se centrifugó la
mezcla celular durante diez minutos a 1000 rpm a 23ºC y se eliminó
el sobrenadante mediante aspiración. A continuación, se mezclaron
200 \mul de solución acuosa de polietilenglicol al 50% (peso sobre
volumen) de peso molecular 4000 (PEG); (ATCC Baltimore, Md.)
aproximadamente a 37ºC con el sedimento usando una pipeta de 1 ml
con agitación vigorosa para desarmar el sedimento. Posteriormente se
mezclaron suavemente las células durante entre 15 y 30 segundos. La
mezcla resultante se centrifugó durante cuatro minutos a 700
rpm.
Aproximadamente a los ocho minutos del agregado
de PEG, se mezclaron 5 ml de tampón DMEM más HEPES lentamente con
el sedimento, sin agitar las células. Tras un minuto, se rompió la
mezcla resultante con una pipeta de 1 ml y se mantuvo durante otros
cuatro minutos. Se centrifugó la mezcla durante 7 minutos a 1000
rpm. Se decantó el sobrenadante resultante, se mezclaron lentamente
5 ml de medio HT (hopoxantina/timidina) con el sedimento, y se
mantuvo la mezcla en reposo durante cinco minutos. Posteriormente se
rompió el sedimento en pedazos grandes y se colocó la suspensión
celular final en matraces T75 (2,5 ml por matraz) que contenían 7,5
ml de medio HT. Se mantuvo la suspensión celular resultante a 37ºC
para cultivar las células fusionadas. Tras 24 horas, se agregaron
10 ml de medio HT a los matraces y seis horas más tarde se agregaron
0,3 ml de aminopterina 0,04 mM. Cuarenta y ocho horas tras la
fusión, se agregaron a los matraces 10 ml de medio HAT
(hipoxantina/aminopterina/timidina).
Tres días tras la fusión, se colocaron las
células viables en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a razón
de 2 x 104 células por pocillo (768 pocillos en total) en medio
tampón HAT como describieron Kennett y col., Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 81:77 (1978). Se cultivaron las células durante siete días
tras la fusión con medio HAT y a partir de entonces en intervalos
de cuatro a cinco días aproximadamente con medio HT según
necesidad. Se siguió el crecimiento por medio de microscopía y se
recogieron sobrenadantes de cultivo aproximadamente dos semanas más
tarde. Los sobrenadantes de cultivos resistentes a HAT se analizaron
posteriormente para verificar la presencia del anticuerpo
específico para cortistatina respectivo por medio de ELISA en fase
sólida como se describe en el Ejemplo 3C y se seleccionaron como
hibridomas que producen un anticuerpo de esta invención.
Los anticuerpos
anti-cortistatina son útiles para detectar la
presencia de antígeno cortistatina en un tejido humano o muestra
corporal a través de la formación de un complejo de inmunorreacción
como se obtienen en los ensayos de unión in situ,
procedimientos de ELISA, por medio de procedimientos
inmunohistoquímicos que incluyen tinción de tejidos y citometría de
flujo, o por medio de análisis de transferencia Western. Además, los
anticuerpos anti-cortistatina preparados en este
documento son útiles en procedimientos para inhibir la respuesta
fisiológica del receptor de cortistatina tras la ocupación y
activación por cortistatina como se describe a continuación en el
Ejemplo 8.
Para caracterizar la cortistatina, se evaluó la
distribución de ARNm de preprocortistatina por medio de análisis de
transferencia Northern. Se preparó ARN celular total a partir de
tejidos homogeneizados incluyendo cerebro, pituitaria anterior,
glándula suprarrenal, hígado, bazo, timo, ovario y testículo de
rata, de acuerdo con el procedimiento descrito por Chirgwin y col.,
Biochem., 18:5294-5299 (1979). Se enriqueció el ARN
formando ARN poli(A)+ por cromatografía en celulosa con
oligo(dt) como describieron Aviv y col., Proc. Natl. Acad.
Sci., EEUU, 69:1408-1412 (1972). Se fraccionaron 2
\mug de ARN seleccionado con poli(A)+ mediante
electroforesis en gel y se transfirieron a nitrocelulosa. A
continuación se hibridó este último con una sonda de ADNc de
cortistatina marcada con la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº 1).
Las condiciones de hibridación fueron esencialmente como las
descritas por Forss-Petter y col., J. Mol.
Neurosci., 1:63-75 (1989). Se hibridó una sonda de
ciclofilina descrita por Danielson y col., DNA,
7:261-267 (1988) con la misma transferencia como
control para concentración e integridad de las muestras de ARN.
Los resultados de la selección de ARNm se
muestran en la Figura 4. Se detectó una banda única de
aproximadamente 600 pb en muestras preparadas de cerebro pero no en
las muestras de gándula suprarrenal, hígado, bazo, timo, ovario,
testículo o pituitaria anterior. El resultado sugiere que el clon de
preprocortistatina de rata cuya secuencia se muestra en la Figura 1
es prácticamente de longitud total.
En base a la distribución limitada de ARNm de
preprocortistatina en cerebro, la distribución de ARNm de
cortistatina se determinó por hibridación in situ (ISH) en
secciones de cerebro de rata en secciones de libre flotación como
describieron anteriormente deLecea y col., Mol. Brain Res.,
25:286-296 (1994). Para ISH doble, se incubaron
ambas sondas (digoxigenina- y
^{35}-S-marcada) juntas en las
secciones de tejido y a continuación se lavó y se realizó una
segunda incubación de las secciones con un fragmento Fab de anti
digoxigenina conjugado a fosfatasa alcalina (1:3000; Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN) como describe el fabricante. Para la
combinación hibridación in situ-inmunohistoquímica, primero
se realizó la hibridación in situ. A continuación se
equilibraron las secciones en PBS, se bloqueó con SAB al 4% y se
incubó con un antisuero de somatostatina descrito por Morrison y
col., Brain Res., 262:344-351 (1983) (S309 diluido
1:2000). Este anticuerpo reconoce epítopos en el extremo
N-terminal de somatostatina-28 y por
consiguiente es poco probable que reaccione de manera cruzada con
cortistatina-14. Las células que contenían más de 20
granos de plata sobre el cuerpo celular se consideraron positivas,
y se contaron como un promedio en ocho secciones diferentes de tres
animales diferentes.
Se detectaron señales sólo en células dispersas
por toda la corteza cerebral y el hipocampo. Debe destacarse que no
se detectó señal en el hipotálamo, un importante sitio de expresión
de somatostatina. En la corteza, las señales fueron especialmente
abundantes en las capas II-III y IV. La corteza
visual/temporal mostró aproximadamente dos veces la cantidad de
neuronas positivas para cortistatina que la corteza somatosensorial.
En el hipocampo, la expresión de ARNm de cortistatina se encontró
en algunas células no piramidales en subiculum y en el stratum
oriens de los campos CA1 y CA3, lo que sugiere que podría estar
presente ARNm de cortistatina en interneuronas GABAérgicas.
Para evaluar este aspecto, se realizó
hibridación doble in situ para detectar la coexpresión de
cortistatina y ARNm de GAD65/GAD67, que codifican las enzimas
sintéticas para GABA como describieron Erlander y col., Neuron,
7:91-100 (1991). Todas las células que expresan
cortistatina también contenían ARNm de GAD_{65} o de GAD_{67},
proporcionando de este modo evidencias de la naturaleza GABAérgica
de estas neuronas.
Por medio de inmunohistoquímica e hibridación
in situ combinadas, la cortistatina y la somatostatina
aparecen en diferentes poblaciones de interneuronas; mientras que
la cortistatina se expresa selectivamente en células de la corteza
cerebral y el hipocampo, las neuronas que contienen somatostatina
tienen una distribución más amplia. Más aún, cortistatina y
somatostatina pueden existir en diferentes poblaciones de
interneuronas, como lo demuestra la colocalización limitada de
inmunorreactividad de somatostatina y ARNm de cortistatina. En las
capas corticales II-III, la mayoría de las
interneuronas positivas expresaron somatostatina o cortistatina
pero no ambas, aunque en algunas otras áreas corticales (por
ejemplo, la capa VI de la corteza visual) un 40% de células
positivas para cortistatina también contenían inmunorreactividad
similar a somatostatina. En los campos CS del hipocampo, la mayoría
(>80%) de las células positivas para cortistatina fueron también
positivas para inmunorreactividad de somatostatina. La cortistatina
no estuvo presente en el hilus, que resultó rico en células
positivas para somatostatina.
La hibridación a transferencias northern de
tejidos de ratón reveló la presencia de dos bandas en cerebro pero
no en hígado, riñón o timo. También se observaron dos bandas en la
muestra de cerebro humano.
Como se describió anteriormente en el Ejemplo 1,
los ADNc de preprocortistatina de rata, ser humano y ratón se
caracterizan por tener múltiples iteraciones del triplete CTG en la
secuencia de nucleótidos que codifican restos lisina en una porción
de la secuencia señal. Para la secuencia de rata, están presentes
seis iteraciones del trinucleótido CTG muestras que en la secuencia
del ratón están presentes tres repeticiones CTG para codificar
leucina. De manera similar, para la secuencia humana están presentes
cuatro iteraciones de repeticiones CTG.
Como se mencionó anteriormente, se determinó que
las expansiones de tripletes son las bases genéticas de enfermedades
neurológicas, por ejemplo, distrofia miotónica como describieron
Brook y col., Cell, 68:799-808 (1992) y síndrome de
X frágil como describieron Fu y col., Cell,
67:1047-1058 (1991). En pacientes con distrofia
miotónica con afectación leve, están presentes al menos 50
repeticiones de CTG. En individuos afectados gravemente, puede
presentarse la expansión de hasta varios pares de kilobases. Por el
contrario, en la población normal, la secuencia repetida es
altamente variable y varía desde 5 hasta 27 copias. Los individuos
con gravedad variable de síndrome de X frágil se caracterizaron de
manera similar.
Por consiguiente, la selección de la presencia
de una región de ADN en la que están presentes las repeticiones en
forma normal, en subexpansión o sobreexpansión, pueden proporcionar
una base genética para diagnosticar algunas enfermedades. Lo mismo
puede valer para cortistatina ya que la expansión de la región puede
contribuir a las bases del sueño relacionado o una enfermedad
relacionada con una actividad cortical del cerebro. En
consecuencia, un aspecto de la presente invención es un
procedimiento para realizar la selección genética para determinar
la naturaleza de los tripletes que codifican lisina en una región
específica de la secuencia de nucleótidos de cortistatina.
Seleccionando una gran cantidad de muestras de una población de
individuos normales junto con aquellos con alteraciones o
trastornos del sueño, puede determinarse el intervalo de
variabilidad normal así como la correlación de la longitud de
repetición con un trastorno y gravedad del mismo.
Por consiguiente, en vista de la similitud de la
secuencia de nucleótidos entre la preprocortistatina de rata y de
ratón como se muestra en las Figuras 1 y 3 respectivamente, se han
diseñado secuencias de cebadores de oligonucleótidos para permitir
la amplificación posicional por reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) de muestras de ácidos nucleicos diana. Para seleccionar la
cortistatina transcrita, la muestra de ácido nucleico deriva de
biopsia de tejido cerebral. Como alternativa, los cebadores
diseñados son útiles para amplificar ADN genómico obtenido de
células fácilmente disponibles, tales como leucocitos de sangre
periférica.
Los cebadores 5' para rata y ratón codifican
respectivamente la secuencia de restos aminoácido
Gly-Lys-Arg-Pro-Ser-Ala
(SEC ID Nº 17) y
Gly-Lys-Trp-Pro-Ser-Ala
(SEC ID Nº 18). La secuencia de nucleótidos para el cebador 3' es
la misma para la secuencia de rata y ratón que codifica la secuencia
de restos aminoácido
Trp-Trp-His-Glu-Trp-Ala
(SEC ID Nº 19) escritas en dirección desde el extremo amino
terminal hacia el carboxi terminal de la proteína cortistatina como
se muestran en las Figuras 1 y 3 y en las respectivas SEC ID Nº 2 y
5. Las secuencias de nucleótidos de preferencia para cebadores que
corresponden a los aminoácidos en SEC ID Nº 17, 18 y 19 son
respectivamente 5'GGCAAGCGGCCGTCAGCC3' (SEC ID Nº 20),
5'GGCAAGTGGTCAGCC3' (SEC ID Nº 21) y 5'AGACTCATGCCACCA3' (SEC ID Nº
22).
Las amplificaciones por PCR se realizan
posteriormente con una muestra de ácido nucleico de acuerdo con
procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica y como
están descritos en "Current Protocols in Molecular Biology",
Ausubel y col., ed, Capítulo 15, Wiley & Sons, Inc., Nueva York
(1989).
El ADN amplificado resultante se analizó a
continuación por electroforesis en gel para verificar la presencia
de expansiones de tripletes en la región entre los dos pares de
cebadores, cuyas regiones para rata y ratón tienen respectivamente
171 y 159 nucleótidos de longitud. La región amplificada de rata
corresponde a las posiciones de nucleótidos 51 a 221 en SEC ID Nº 1
y para ratón las correspondientes posiciones de nucleótidos en la
SEC ID Nº 4 son desde 49 hasta 207. Un aumento en el peso molecular
del fragmento es indicativo de expansión de una repetición de un
triplete seleccionado. Para confirmar la presencia de expansión y/o
compresión de la región, se secuenciaron los fragmentos de PCR.
Posteriormente se realizan diagnósticos adecuados con facilidad.
Para determinar la especificidad de unión de
cortistatina y en vista de su similitud con somatostatina, se
realizaron ensayos para evaluar la unión de péptido
cortistatina-14 lineal, sintetizado químicamente,
preparado en el Ejemplo 2 a receptores de somatostatina en células
GH_{4} de pituitaria.
Las células GH_{4}, obtenidas de Dr. Kaare M.
Gautvik (Universidad de Oslo) o ATCC, se cultivaron en medio MEM
con 12% de suero bovino fetal en placas de 6 pocillos a razón de
10^{6} células/ml. Cada pocillo recibió a continuación 10^{6}
cpm/ml de ^{125}I somatostatina-14 (NEN, DuPont,
Wilmington, DB) sola o con concentraciones crecientes de péptido
somatostatina-14 (Sigma) o péptido
cortistatina-14 (95%, purificado por HPLC en fase
inversa entre 10^{-10} M a 10^{-6} M). Se incluyó aprotinina y
leupeptina (Sigma; 2 mg/ml) ya que reducen la unión no específica
hasta 20% de la radiactividad unida total. La unión de ^{125}I
somatostatina en presencia de somatostatina 10^{-7} M se
consideró como unión inespecífica como describieron Schonbrunn y
col., J. Biol. Chem., 235:6473-6483 (1978).
Como se muestra en la Figura 5A, tanto la
cortistatina-14 (círculos rellenos) como la
somatostatina-14 (círculos vacíos) desplazaron
eficazmente la unión de ^{125}I somatostatina-14
en una manera dependiente de la dosis, con K_{d} estimada de 5 x
10^{-9}, muy cerca de la informada previamente para somatostatina
como describieron Schonbrunn y col., J. Biol. Chem.,
235:6473-6483 (1978). Los datos combinados de cuatro
experimentos independientes se trazaron como valores medios \pm
error estándar. Como control, la hormona liberadora de tirotropina
(TRH) (Calbiochem, La Jolla, CA) y el péptido intestinal vasoactivo
(VIP) (Bachem, Suiza) no mostraron desplazamiento de ^{125}I
somatostatina-14.
Los ensayos paralelos se realizan fácilmente con
las proteínas y péptidos de cortistatina y presentados en la Tabla
1, preparados por medios recombinantes o sintéticos descritos
anteriormente.
Se realizaron ensayos de unión comparables, como
se describen en el Ejemplo 6, con células GH_{4} o células
positivas específicas de cortistatina o tejidos que contienen tales
células para identificar un análogo de cortistatina, denominado
también como ligando receptor de cortistatina.
Para investigar si la cortistatina modula la
activación del receptor de somatostatina, se determinó la
concentración de AMP cíclico (AMPc) tras la estimulación de células
GH_{4} con VIP o TRH en presencia o en ausencia de cortistatina o
somatostatina.
Para los ensayos de AMPc, se cultivaron células
GH_{4} bajo las mismas condiciones de los ensayos de unión. Se
lavaron las células con MEM sin suero, pero con leupeptina,
aprotinina y
3-isobutil-metil-xantina
(IBMX) 1 mM. Las células se trataron previamente con
somatostatina-14 y cortistatina-14
durante 15 minutos previo al agregado de VIP en una concentración
de 10^{-6} M o TRH 10^{-7} M. Se agregó a cada pocillo ^{3}H
AMPc antes de retirar el contenido, para calcular la recuperación.
Para las mediciones de AMPc, se usó un equipo de RIA (Amersham,
Arlington Heights, IL) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Cada punto temporal representa 2-4
réplicas y los experimentos se realizaron dos veces.
Como se muestra en la Figura 5B, tanto VIP como
TRH en sus respectivas concentraciones de 10^{-6} M o 10^{-7} M
aumentaron la concentración intracelular de AMPc mientras que los
péptidos somatostatina y cortistatina en concentración 10^{-6} M
no tuvieron efecto en comparación con el control.
Como se muestra en la Figura 5C, ambos péptidos
estatina mostraron inhibición eficaz indistinguible de la
estimulación con VIP y TRH de AMPc en células. Ambos péptidos en
concentración 10^{-8} M inhibieron completamente la acción de
TRH, mientras que atenuaron el efecto de VIP de una manera
dependiente de la dosis en aproximadamente 50% en una concentración
10^{-6} M.
Por consiguiente, en vista de los resultados
mostrados en las Figuras 5A-5C, la cortistatina
parece actuar como un agonista en los receptores endógenos de
somatostatina expresados por células GH_{4}, aunque estas células
pueden expresar una población heterogénea de receptores y la
actividad agonista puede no ser necesariamente su papel en sus
sitios de expresión. Aunque ya se ha identificado un receptor
específico de cortistatina, los ensayos descritos en el Ejemplo 7
usando las proteínas y polipéptidos de cortistatina presentados en
la Tabla 1, preparados por medios recombinantes o sintéticos están
diseñados para facilitar tal identificación de un receptor
específico de cortistatina.
Los ensayos de unión a receptores y de
activación de AMPc descritos en el Ejemplo 5 se usan en esta
invención para seleccionar análogos de cortistatina así como
también antagonistas, éstos últimos incluyen anticuerpos
específicos para cortistatina. Los anticuerpos
anti-cortistatina que son antagonistas de
cortistatina se denominan también antagonistas de receptores porque
el anticuerpo bloquea la unión del ligando de cortistatina a su
receptor, evitando de esta manera la ocupación y activación.
En el ensayo de unión al receptor, se
identifican análogos de cortistatina de la misma manera usada para
identificar a la cortistatina como un antagonista de receptores de
somatostatina. En un ensayo paralelo, se identifica un antagonista
de cortistatina, tal como una preparación de anticuerpo anti péptido
de cortistatina como se describió en el Ejemplo 4, bloqueando la
capacidad de cortistatina-14 para desplazar la
somatostatina marcada de la unión a células que llevan receptores
de somatostatina o a células que llevan receptores de cortistatina.
En un ensayo de unión a receptor modificado usando ^{125}I
cortistatina-14 o cualquier proteína o polipéptido
de cortistatina marcado de esta invención, de preferencia
procortistatina, puede identificarse un antagonista de cortistatina
si se demuestra que la molécula candidato desplaza la unión del
péptido de cortistatina marcado a células GH_{4} o células que
llevan receptores específicas de cortistatina.
La confirmación de un antagonista de
cortistatina se proporciona en los ensayos de AMPc por incubación de
la molécula con el péptido cortistatina-14
previamente al agregado de los activadores de AMPc. Se identifica a
un antagonista de cortistatina por medio de la inhibición medida de
acumulación de AMPc en ensayos realizados como se describió para
los datos mostrados en la Figura 5C. Se identifican análogos de
cortistatina por medio de la inhibición eficaz de acumulación de
AMPc en paralelo con el mostrado en la Figura 5C.
En los ensayos electrofisiológicos in
vitro e in vivo descritos en el Ejemplo 8 se proporciona
más confirmación de la identificación de un análogo o antagonista
de cortistatina, en los que las respuestas fisiológicas funcionales
por cortistatina son distintas de aquellas provocadas por
somatostatina, cuyas respuestas dependen de la activación del
receptor específico.
Los agonistas de cortistatina se identifican
también por sus patrones de unión en criosecciones de cerebro de
rata, como describieron para somatostatina Pelletier y col., Meth.
Enzymol., 124:607-615 (1986), cuya descripción se
incorpora en este documento por referencia.
Para identificar un receptor específico de
cortistatina en el cerebro, se detectan sitios de unión específicos
de cortistatina como describieron Tran y col., Eur. J. Pharmacol.,
101:307-309 (1984), cuya descripción se incorpora
en este documento por referencia. Brevemente, se marcan análogos
sintéticos de cortistatina presentados en código de letras únicas,
(YPCKNFFWKTFSSCK (SEC ID Nº 23) o PCKNFFYKTFSSCK (SEC ID Nº 24)),
por varios procedimientos con ^{125}I y se purifican por HPLC en
fase inversa. Posteriormente se incuban diferentes cantidades de
análogos de cortistatina marcados con ^{125}I con criosecciones de
cerebro de rata en presencia del análogo competitivo frío en
concentración 10^{-6} M.
Como alternativa, se sintetizaron análogos
tritiados y se usaron para autorradiografía in situ.
Los receptores específicos de cortistatina se
identifican también mediante la unión de análogos de cortistatina
marcados, que incluyen proteínas y polipéptidos de cortistatina
presentados en la Tabla 1, preparados por medios recombinantes o
sintéticos como se describió anteriormente, a preparaciones
bioquímicas de membranas de la corteza. La cortistatina sintética
se inmoviliza en columnas de agarosa activadas (tales como las
columnas BioGel 10 de BioRad) y se usan para purificar proteínas de
unión a cortistatina de extractos de cerebro. Tales procedimientos
son bien conocidos en la técnica.
Se sabe que la somatostatina hiperpolariza
neuronas centrales aumentando las conductancias de potasio como
describieron Inoue y col., J. Physiol., 407:177-198
(1988), incluyendo la corriente M de potasio dependiente del
voltaje (ver Moore y col., Science, 239:278-280
(1988) y Jacquin y col., Proc. Natl. Acad. Sci., EEUU,
85:948-952 (1988)). Para completar la
caracterización del papel fisiológico de cortistatina, se realizaron
ensayos para determinar si la cortistatina tenía efectos similares
a la somatostatina en neuronas de hipocampo por medio de registros
de fijación de voltaje y corriente en la preparación de cortes de
hipocampo.
Se obtuvieron registros intracelulares en cortes
de hipocampo de rata usando micropipetas con punta de vidrio como
describieron previamente Schweitzer y col., J. Neurosci.,
13:2033-2049 (1993). Los registros se realizaron de
11 células piramidales CA1 de hipocampo con un potencial de membrana
en reposo promedio de -70 \pm 1 mV (media \pm eem) y un
potencial de acción de -103 \pm 2 mV. Los registros de fijación de
corriente en una neurona CA1 despolarizada manualmente hasta - 65
mV (el potencial de membrana en reposo era de -70 mV) para provocar
un disparo de potenciales de acción (deflexiones ascendentes,
truncadas) se muestran en la Figura 6A.
La superfusión de péptido
cortistatina-14 1 \muM (registro de barras hacia
abajo), preparada como se describió en el Ejemplo 3, como
somastostatina-14, hiperpolarizó estas neuronas (10
de 11 células), en asociación con la inhibición del disparo de
potenciales de acción, seguido por la recuperación de los niveles de
control tras el lavado celular del péptido. A diferencia de
somastostatina, el efecto mediado por
cortistatina-14 se desarrolló lentamente,
alcanzando un efecto estacionario máximo seis a ocho minutos tras el
inicio de la respuesta. Esto contrastó con el tiempo hasta el pico
de efecto de somastostatina en estas neuronas bajo las mismas
condiciones experimentales que fue mucho más corto
(2-3 minutos).
Para determinar el mecanismo de la inhibición
inducida por cortistatina, se evaluó el efecto de la cortistatina
en la corriente M (I_{M}), una corriente de potasio
dependiente del voltaje no inactivadora que se observa en las
neuronas del hipocampo como describieron Halliwell y col., Brain
Res., 250:71-92 (1982).
En los ensayos de fijación de voltaje, se
observó la relajación de I_{M} aplicando etapas de
hiperpolarización (5 a 25 mV) desde un potencial controlado de -43
a -48 mV. La Figura 6B muestra los registros de fijación de voltaje
de una neurona CA1 mantenida a -43 mV; se evocó una relajación de
I_{M} con una etapa de hiperpolarización de 10 mV.
Como se describió anteriormente para
somastostatina (Moore y col., Science, 239:278-280
(1988) y Schweitzer y col., Nature, 346:464-466
(1990)), la superfusión de cortistatina-14 (1
\muM, 7 minutos) aumentó la amplitud de la relajación de
I_{M} en un 60% (ver flechas) conjuntamente con una
corriente de estado estacionario externa, como se muestra en la
Figura 6B con la línea de puntos como corriente controlada control,
con recuperación a los niveles de control tras el lavado
celular.
Los efectos inhibitorios de la cortistatina en
la excitabilidad de neuronas piramidales CA1 como puede verse por
las amplitudes de espigas de población (PS) fueron paralelos in
vivo en la preparación anestesiada. Para los estudios in
vivo, se anestesiaron ratas macho Sprague-Dawley
con halotano (0,9-1,1%). Se estimuló la vía de
comisuras y se provocaron potenciales de campo en la región CA1
esencialmente como describieron Steffensen y col., Brain Res.,
538:46-53 (1991). Se disolvió cortistatina (1 mg/ml)
en solución salina y se administró mediante iontoforesis a través
de un depósito de una micropipeta multidepósito. Como se muestra en
la Figura 6C, se generaron curvas de respuesta a estímulos y se
relacionó monotónicamente la amplitud de PS con la intensidad de
estímulos probadas en tres niveles de respuesta: umbral, mitad del
máximo y máximo (amplitud media de PS de mitad del máximo de
control = 4,7 mV \pm 0,5; n = 5). Los asteriscos representan
niveles de significación con P < 0,05. Los datos se recopilaron
con el programa informático (LabView Instruments, National
Instruments, Austin, TX) como describieron Steffensen y col., Brain
Res., 538:46-53 (1991).
La estimulación de la entrada aferente
monosináptica de la región CA1 evocó una espiga de población
característica (PS) que representa el disparo sincrónico de células
piramidales, superpuestos en una forma de ondas de campo de
potencial sináptico como describieron Anderson y col., Exp. Brain
Res., 13:208-221 (1971). Como resulta evidente en
la Figura 6C, la aplicación microiontoforética de cortistatina,
igual que la somastostatina, disminuyó significativamente las
amplitudes de PS en los niveles máximo medio y máximo de
estimulación.
Como la cortistatina se expresa en interneuronas
localizadas en la corteza cerebral y el hipocampo, sus efectos en
las medidas corticales de excitabilidad neuronal se determinaron
posteriormente in vivo. Se administraron por infusión hasta
6 nmoles de péptido de cortistatina-14 sintético
purificado por HPLC preparado en el Ejemplo 3 dentro de los
ventrículos cerebrales de ratas (n = 5) y se registró el
electroencefalograma (EEG) durante cuatro horas tras la inyección
del péptido. Además, se observó el posible cambio en el
comportamiento espontáneo de las ratas a través de una ventana de
un sentido. Se usaron metodologías convencionales para preparación
electrofisiológica crónica y adquisición de datos. Los
procedimientos para registrar los EEG y los estudios de PP se
realizaron como describieron Próspero-García y col.,
Pharmacol. Biochem. Behav., 49:413 (1994) y Steffensen y col.,
Brain Res., 652:149 (1994).
Las Figuras 7A-1,
7A-2, 7A-3 y 7A-4
muestran los efectos de la administración intracerebroventricular de
cortistatina en el ciclo de despertar del sueño de la rata.
Las Figuras 7A-1,
7A-2, 7A-3 y 7A-4
ilustran respectivamente estado de desvelo, sueño de ondas lentas 1,
sueño de ondas lentas 2 y sueño MOR. Los efectos del ciclo del
sueño se evaluaron con dosificaciones de
cortistatina-14 de 100 ng, 500 ng, 1 \mug y 10
\mug como se trazan de izquierda a derecha en el gráfico de barras
que se muestra contra un control de solución salina. Los asteriscos
representan niveles de significación con P < 0,05; ANOVA.
Los animales tratados con el péptido
cortistatina-14 demostraron un comportamiento
hipoactivo claro comparados con las ratas a las que se les inyectó
solución salina, pero mantuvieron sus ojos abiertos y exhibieron
otros signos de desvelo durante un período de tiempo corto
(15-20 minutos). En estos animales, el EEG mostró un
importante aumento en las ondas lentas corticales
(1-4 Hz). Como se muestra en referencia a las
Figuras 7A-1 a 7A-4, el control
poligráfico de los estados de activación posteriores a la
administración de cortistatina también indicó que las ratas pasaron
hasta el 75% de las cuatro horas registradas en sueño de onda lenta
comparado con el 40% en animales control tratados con solución
salina. También se observó una reducción significativa en el sueño
paradójico (MOR) con la dosis más alta de cortistatina, en claro
contraste con el aumento informado en el sueño MOR tras la
administración de dosis similares de somastostatina como
describieron Danguir y col., Brain Res., 367:26-30
(1986).
Además, se probaron dos dosis de cortistatina
(0,1 y 1 \mug) en ratas con ciclos de sueño inversos (n =
7/grupo). Mientras que en este modelo los animales alcanzaron ya su
demanda fisiológica de sueño como describieron Inoue y col.,
Neurosci. Lett., 49:207-209 (1984), sería más
evidente la eficacia de cortistatina como una molécula inductora
del sueño. La cortistatina disminuyó significativamente el estado de
desvelo (49,1 \pm 2% en ratas control tratadas con solución
salina; 31 \pm 2,6% con 100 ng de cortistatina; 32 \pm 8,78%
con 1 \mug) e incrementó el sueño de onda lenta 2 (38,8 \pm 1,8%
en los controles; 51,5 \pm 3,8% con 100 ng; 53,7 \pm 7,3% con 1
\mug) pero no afectó significativamente el sueño de onda lenta 1
(8,8 \pm 1,7% en ratas control; 8,1 \pm 0,9% con 100 ng; 5,6
\pm 1,4% con 1 \mug) o el sueño MOR (6,2 \pm 1,4% en los
controles; 9,3 \pm 1,7% con 100 ng; 7,7 \pm 1,3% con 1 \mug).
Estos resultados respaldan firmemente el descubrimiento de la
presente invención de que la cortistatina es una sustancia
moduladora del sueño.
Para investigar los mecanismos por los que la
cortistatina podría facilitar las ondas lentas corticales y reducir
la duración del sueño MOR, se investigó la posibilidad de que la
cortistatina produjera estos efectos, en parte, modulando la
actividad de acetilcolina (ACh) como describieron Steriade y col.,
Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 27:137-156 (1987).
Se examinaron las interacciones entre cortistatina y ACh en neuronas
CA1 de hipocampo usando un paradigma de estimulación evocado de
pulsos pareados (PP) para probar los procedimientos inhibitorios
hacia adelante y hacia atrás mediados en parte por interneuronas del
hipocampo (ver Andersen y col., J. Neurophysiol.,
27:607-619 (1964) y Kandel y col., J. Neurophysiol.,
24:243-259 (1961).
Los efectos de ACh (0,9 M), somastostatina (1,5
mM) y cortistatina aplicados mediante iontoforesis en las
respuestas PP en neuronas CA1 in vivo se muestran en la
Figura 7B. La intensidad de estimulación se ajustó tras el
tratamiento con el fármaco para alcanzar amplitudes de PS de control
previo a la realización de los estudios de PP.
Sin ACh, la estimulación en los niveles de
estímulo máximo medio revelaron una curva de respuesta PP bifásica
característica como describieron Steffensen y col., Brain Res.,
538:46-53 (1991). La aplicación por
microiontoforesis de ACh antagonizó significativamente la fase
inhibitoria típica de las respuestas PP observadas en los intervalos
interestímulo desde 60 hasta 80 mseg (los asteriscos corresponden a
un nivel de significación de P < 0,05; ver Figura 7B; los datos
de intervalos de 80 mseg se muestran en las Figuras
7C-E). Las Figuras 7C-7F representan
cada una registros de potenciales de campos provocados en CA1 por
estimulación de comisura. En la línea de base los registros
mostrados en la Figura 7C (barras de calibración: 2 mV y 10 mseg),
la segunda respuesta está completamente inhibida en este intervalo
interestímulo (80 mseg). La administración de ACh por iontoforesis
redujo la inhibición de PP como se muestra en la Figura 7D. Este
efecto fue antagonizado mediante la aplicación simultánea de
cortistatina como se muestra en la Figura 7E. En la Figura 7F, la
somastostatina disminuyó marcadamente la inhibición de PP (barras
de calibración: 1 mV y 10 mseg).
Para resumir, la cortistatina sola (no mostrado)
no tuvo efectos en las respuestas de PP en CA1 pero, como se
muestra en la Figura 7E, antagonizó completamente los efectos de ACh
(P<0,05). Los efectos de somastostatina en las respuestas de PP
fueron similares a los de ACh (Figura 7B; los datos de 80 mseg se
muestran en la Figura 7F) pero fueron significativamente diferentes
de aquellos de cortistatina (los asteriscos corresponden con
niveles de significación de P < 0,05).
Para investigar más si la cortistatina
interactúa también con sistemas colinérgicos que regulan la función
cortical, se determinaron los efectos de cortistatina en la
desincronización inducida por ACh de EEG en corteza cerebral en
ratas anestesiadas. Por consiguiente se aplicó mediante
microiontoforesis (100-250 nA) ACh y cortistatina
en la actividad local del EEG registrada en la corteza visual. De
los datos mostrados en la Figura 7G, derivaron los resultados de
los grupos experimentales de determinaciones de actividad espectral
promedio del EEG y se expresaron como medias \pm eem (Los
asteriscos representan niveles de significación P < 0,05 desde la
línea de base; dos asteriscos representan niveles de significación
P < 0,05 de ACh: ANOVA).
Como se muestra en la Figura 7G, la aplicación
electroforética de Ach desincronizó marcadamente el EEG local
aumentando la potencia de las bandas theta (4,5-8
Hz) y beta (13-20 Hz), es decir, aumentó los
espectros de potencia promedio del EEG (cuatro segundos sobre tres
minutos) en el intervalo de bandas de frecuencia de
8-16 Hz. Por el contrario, los EEG promedio durante
la infusión de cortistatina sola o ACh y cortistatina combinadas no
fueron diferentes de los registros de la línea de base de ondas
lentas de 0,05-4 Hz. El efecto de ACh se evitó
eficazmente por medio de la aplicación electroforética simultánea de
péptido cortistatina-14 que antagonizó el aumento
en la actividad de frecuencia rápida producido por ACh sola.
Para estudiar más los procedimientos de
diagnóstico y tratamiento, se realizaron los ensayos
electrofisiológicos descritos en este documento con las otras
proteínas y polipéptidos de cortistatina presentados en la Tabla 1,
preparados por medios recombinantes o sintéticos como se describió
anteriormente. Además, los anticuerpos
anti-cortistatina de esta invención son útiles para
ensayos in vitro así como para aplicaciones in vivo
como se describió anteriormente para facilitar el alivio
terapéutico de un trastorno del sueño, tal como narcolepsia, ya que
los anticuerpos anti-cortistatina evitan la
activación del receptor de cortistatina por la unión de
cortistatina.
La presente invención describe el descubrimiento
y el aislamiento de un clon de ADNc de un ARNm que codifica el
precursor de un nuevo miembro de la familia de somatostatina cuya
distribución está restringida principalmente a las interneuronas
corticales GABAérgicas. Se ha demostrado que las neuronas
GABAérgicas modulan finamente la salida de neuronas principales de
la corteza cerebral y el hipocampo como describieron Buhl y col.,
Nature 368:823-828 (1994), áreas que han sido
implicadas en el estado de activación y en funciones cognitivas
complejas, que incluyen el aprendizaje y la memoria (ver Wilson y
col., Science, 265:676-679 (1994). La cortistatina
puede por consiguiente jugar un papel en la elaboración de estas
funciones.
Los péptidos, cortistatina-14 y
somatostatina-14, parecen tener efectos similares en
la fisiología de las neuronas del hipocampo. Como se muestra en los
Ejemplos anteriormente, ambos péptidos se unen a receptores de
somatostatina en células GH_{4} con afinidad muy similar, causan
hiperpolarización neuronal y aumentan la corriente M en neuronas
del hipocampo, sugiriendo de este modo que podrían actuar a través
de los mismos receptores in vivo. La presencia de los restos
aminoácido comunes FWKT (SEC ID Nº 2 desde la posición 104 hasta
107), que ha demostrado ser crítica para la unión de somatostatina,
también respalda la idea de la unión de cortistatina a receptores
de somatostatina.
Sin embargo, los efectos de la cortistatina en
la actividad de las neuronas del hipocampo in vivo y en la
fisiología del sueño son claramente distintos de aquellos de la
somatostatina. Por consiguiente, la cortistatina podría unirse de
manera diferencial a diferentes subtipos de receptores de
somatostatina de los analizados en este documento, o podría actuar
en receptores de \mu-opioides, como se ha
demostrado para el análogo de somatostatina, octeotrida y el
antagonista del receptor CTOP como describieron Maurer y col., Proc.
Natl. Acad. Sci., EEUU, 79:4815-4817 (1982). La
cortistatina y la somatostatina coexisten en algunas interneuronas
en las capas profundas de la corteza y el hipocampo, sugiriendo de
este modo que estas estatinas pueden competir por los mismos
receptores, o pueden ser liberadas a partir de diferentes botones
sinápticos en respuesta a estímulos diferentes.
La cortistatina parece ser un neuromodulador
inhibitorio en el hipocampo. La hiperpolarización observada en los
registros de fijación de corriente es debida probablemente, al menos
en parte, al aumento de la corriente M de potasio no inactivadora.
Sin embargo, como con la somatostatina, podría participar otro
mecanismo de canal de K^{+} en el efecto inhibitorio inducido por
cortistatina (ver Schweitzer y col., J. Neurosci.,
13:2033-2049 (1993). De hecho los efectos retardados
observados en el corte de hipocampo, junto con las diferencias
observadas en las respuestas funcionales, pueden sugerir receptor de
cortistatina distinto, no caracterizado. En los estudios de unión a
receptores de somatostatina clonados, la cortistatina exhibió una
afinidad comparable con somatostatina por el receptor de
somatostatina 1 (SSTR1), pero una afinidad mucho menor por SSTR
2-5. Dado que SSTR3 y 4 son los SSTR predominantes
en las regiones del cerebro en las que se expresa la cortistatina,
la existencia de un receptor no caracterizado está favorecida. Como
alternativa, los efectos retardados podrían indicar simplemente una
incorporación más ávida, degradación o acceso más limitado al corte
de tejido debido a una carga positiva adicional presente en la
cortistatina, en comparación con somatostatina. Estos factores
podrían necesitar más tiempo de saturación y superfusión prolongada
antes de que pudiera presentarse la activación del receptor.
La administración de cortistatina en los
ventrículos del cerebro indujo una mejora marcada del sueño de onda
lenta y disminuyó la fase MOR de una manera dependiente de la dosis.
Estos efectos son opuestos a aquellos descritos para somatostatina,
que facilita la generación de sueño MOR como describieron Danguir y
col., Brain Res., 367:26-30 (1986). Más aún, el
comportamiento exhibido por ratas tratadas con cortistatina fue
claramente diferente de los comportamientos característicos (es
decir, hipermotilidad, rotación) descritos previamente para ratas
tratadas con somatostatina (ver, Rezek y col., Pharmacol. Biochem.
Behavior, 5:73-77 (1976) y Vecsei y col., Peptides,
10:1153-1157 (1989). Los datos proporcionados en
este documento que indican que la cortistatina mejora el sueño de
onda lenta y reduce el sueño MOR sugieren que los efectos de
cortistatina se producen, en parte, por modulación de la función
colinérgica.
La inducción del sueño de onda lenta se
caracteriza por la aparición de ondas de frecuencia lenta en la
actividad cortical y la reducción de la disponibilidad de ACh en la
corteza cerebral, como se muestra en varias preparaciones (ver
Kodama y col., Neurosci. Lett., 114:277-282 (1990) y
Marrosu y col., Brain Res., 671:329-332 (1995).
Estudios electrofisiológicos recientes in vivo demostraron
que la expresión del sueño de onda lenta en la corteza cerebral de
ratas coincide con un aumento en la inhibición de pulso pareado en
la región CA1 del hipocampo como describieron
Próspero-García y col., Neurosci. Lett.,
156:158-162 (1993). Por el contrario, durante el
desvelo activo y el sueño MOR existe una reducción marcada en la
inhibición de PP, cuando la disponibilidad de ACh es mucho mayor.
La falta de efecto de cortistatina en la inhibición de PP contrasta
con el potente efecto inhibitorio de somatostatina en esta medición
observada en la presente invención, que es respaldada por la
reducción de somatostatina en los potenciales sinápticos mediados
por GABA en neuronas piramidales CA1 informados previamente por
Scharfman y col., Brain Res., 493:205-211
(1989).
Al mismo tiempo, esto proporciona otra
diferencia funcional entre cortistatina y somatostatina. Estos
resultados son coherentes con aquellos en ratas en fase inversa y
despiertas, en las que la cortistatina redujo marcadamente la
duración de la actividad eléctrica cortical que está asociada con el
sistema colinérgico, así como la desincronización inducida por ACh
del EEG local. Por consiguiente, la cortistatina antagoniza los
efectos de ACh tanto en el hipocampo como en la corteza cerebral
in vivo. Los hallazgos informados en este documento
proporcionan por lo tanto las bases fisiológicas de que este nuevo
neuropéptido, cortistatina, funciona como un regulador de la
actividad neuronal y del sueño. Como tal, la cortistatina, análogos
y antagonistas de la misma, son reactivos valiosos en el uso de
procedimientos de diagnóstico y tratamiento de esta invención.
Cualquier referencia a la cortistatina humana en
este documento es sólo con objetivo ilustrativo y como tal no es
parte de la invención.
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Sutcliffe, Gregor J.
\hskip4cmde Lecea, Luis
\hskip4cmSiggins, George R.
\hskip4cmHenriksen, Steven J.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CORTISTATINA: NEUROPÉPTIDOS, COMPOSICIONES Y PROCEDIMIENTOS
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 26
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 10666 North Torrey Pines Road, TPC-8
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENDOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOLICITUD NÚMERO: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Schomonsees, William
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 31.796
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/AGENTE: 22908-0002
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (415) 324-7041
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (415) 324-0638
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 438 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 30..368
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 110 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 427 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 25..354
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 109 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 85 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Arg Pro Pro Leu Gln Gln Pro Pro His
Arg Asp Lys Lys Pro}
\sac{Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser
Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser
Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Arg Pro Pro Leu Gln Gln Pro Pro His
Arg Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 84 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Arg Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro His
Leu Asp Lys Lys Pro}
\sac{Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Ser
Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 13 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Glu Arg Pro Pro Pro Gln Gln Pro Pro His
Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGAGATCT AAGGAGGATG GGTGGCTGCA G
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 68 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCGAGATCT GCCCTCCCCC TGGAGA
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTGAATTCA GGCCACGGCT GCATTCACAG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Arg Pro Ser Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Trp Pro Ser Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Trp Trp His Glu Trp Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAAGCGGC CGTCAGCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAAGTGGC CCTCAGCC
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCCCACTCA TGCCACCA
\hfill18
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Pro Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe
Ser Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Cys Lys Asn Phe Phe Tyr Lys Thr Phe Ser
Ser Cys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 701 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 25:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 105 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº 26:
Claims (21)
1. Un polipéptido de cortistatina aislado y
purificado que comprende una secuencia seleccionada del grupo
constituido por las SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y
24.
2. Un ácido nucleico purificado que tiene una
secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de cortistatina
que comprende una secuencia seleccionada del grupo constituido por
las SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y 24.
3. El ácido nucleico de la reivindicación 2, en
el que dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo
constituido por la SEC ID Nº 1 y la SEC ID Nº 4.
4. Un vector que comprende un ácido nucleico
según la reivindicación 2, en el que dicho vector está adaptado
para la expresión de dicho polipéptido de cortistatina
codificado.
5. Una célula de mamífero aislada que comprende
un vector según la reivindicación 4.
6. Un cebador de oligonucleótidos para hibridar
el ácido desoxirribonucleico que codifica un polipéptido de
cortistatina, teniendo dicho cebador una secuencia de nucleótidos
seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 13, 14, 15, 16,
20, 21 y 22.
7. Un anticuerpo que inmunorreacciona
específicamente con un polipéptido de cortistatina seleccionado del
grupo constituido por SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y
24.
8. Un equipo para detectar la presencia de
cortistatina en una muestra del cuerpo humano, que comprende medios
de envasado que comprenden un primer envase que contiene un
anticuerpo inmunoespecífico anti-cortistatina en
una cantidad suficiente para al menos un ensayo, en el que dicho
anticuerpo inmunorreacciona con cortistatina humana o un
polipéptido que tiene una secuencia de restos aminoácido,
seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 2, 5 y 8, y
opcionalmente un segundo envase que contiene un anticuerpo detector
que se une al anticuerpo anti-cortistatina.
9. Un equipo para detectar la presencia de genes
que codifican cortistatina en una muestra corporal, que comprende
medios de envasado que comprenden un primer envase que contiene un
oligonucleótido en una cantidad suficiente para al menos un ensayo,
en el que dicho oligonucleótido incluye una secuencia de nucleótidos
que codifica un polipéptido de cortistatina que tiene una secuencia
de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 2,
5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y 24, o incluye una secuencia de
nucleótidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº: 13,
14, 15, 16, 20, 21 y 22.
10. Un procedimiento para detectar la presencia
de un ácido nucleico que comprende ADN complementario (ADNc) o ARN
mensajero (ARNm) que codifica cortistatina en una muestra del cuerpo
humano que contiene el ácido nucleico, que comprende las etapas
de:
(a) hibridar el ácido nucleico en la muestra del
cuerpo humano con un oligonucleótido que incluye al menos 10
nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC
ID Nº 1 desde el nucleótido 324 hasta el nucleótido 366 para formar
un producto de hibridación; y
(b) detectar la presencia del producto de
hibridación.
11. Un procedimiento para detectar la presencia
de un antígeno de cortistatina en una muestra de cuerpo humano que
comprende las etapas de:
(a) poner una muestra del cuerpo humano en
contacto con un anticuerpo anti-cortistatina que
inmunorreacciona con un polipéptido que comprende una secuencia de
restos aminoácido seleccionada del grupo constituido por SEC ID Nº:
2, 5 y 8 durante un período de tiempo suficiente para que dicho
anticuerpo inmunorreaccione con dicho antígeno presente en la
muestra y forme un complejo de inmunorreacción; y
(b) detectar la presencia del complejo de
inmunorreacción, detectando de esta manera dicho antígeno.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que la muestra comprende células mononucleares de sangre
periférica.
13. Un procedimiento para detectar la presencia
de una mutación en un gen de cortistatina de un mamífero, que
comprende una expansión del dominio CTG del gen de cortistatina
según la reivindicación 2, que comprende las etapas de:
(a) determinar la secuencia de nucleótidos del
dominio CTG del gen de cortistatina en una muestra de ácido
nucleico de dicho mamífero; y
(b) comparar la secuencia de nucleótidos
determinada con la secuencia conocida del dominio CTG en un gen
normal de cortistatina para identificar la presencia de una
secuencia de expansión en el dominio CTG, y por consiguiente dicha
mutación.
14. Un oligonucleótido que codifica un
polipéptido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº:
17, 18 y 19.
15. El uso de un polipéptido de cortistatina
seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7,
8, 10, 11, 23 y 24, para la fabricación de un medicamento para
inducir el sueño.
16. El uso de un antagonista del receptor de
cortistatina, que es un anticuerpo anti-cortistatina
de la reivindicación 7, para la fabricación de un medicamento para
inhibir el sueño.
17. Un procedimiento para la preparación de un
polipéptido de cortistatina seleccionado del grupo constituido por
las SEC ID Nº: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 23 y 24, comprendiendo
dicho procedimiento el aislamiento de dicho polipéptido de una
muestra de tejido natural o un procedimiento recombinante.
18. El procedimiento de la reivindicación 17 en
el que dicho procedimiento recombinante comprende:
expresar un polipéptido de cortistatina en
células,
recuperar el polipéptido de cortistatina de
dichas células, y
purificar el polipéptido de cortistatina
obtenido de esa manera.
19. El anticuerpo de la reivindicación 7, siendo
dicho anticuerpo un anticuerpo monoclonal.
20. El procedimiento de la reivindicación 18, en
el que dichas células son células de mamífero.
21. Una composición terapéutica que contiene el
polipéptido de cortistatina de la reivindicación 1 ó el anticuerpo
de la reivindicación 7.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/648,322 US6074872A (en) | 1996-05-15 | 1996-05-15 | Cortistatin: nucleic acids that encode these neuropeptides |
| US648322 | 1996-05-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2286832T3 true ES2286832T3 (es) | 2007-12-01 |
Family
ID=24600336
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES97926602T Expired - Lifetime ES2286832T3 (es) | 1996-05-15 | 1997-05-15 | Cortistatina: neuropeptidos,composiciones y procedimientos. |
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| US (6) | US6074872A (es) |
| EP (1) | EP0901526B1 (es) |
| AT (1) | ATE360695T1 (es) |
| AU (1) | AU729422C (es) |
| CA (1) | CA2254783A1 (es) |
| DE (1) | DE69737651T2 (es) |
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