ES2286844T3

ES2286844T3 - Expresion de proteinas heterologas.

Info

Publication number: ES2286844T3
Application number: ES98904318T
Authority: ES
Inventors: Cesira Galeotti
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: GSK Vaccines SRL; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1997-02-19
Filing date: 1998-02-18
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2018-02-18
Also published as: PT1007698E; EP1007698A1; JP2008173126A; US20020146793A1; DK1007698T3; JP4308916B2; WO1998037208A1; US6361969B1; GB9703406D0; DE69837604D1; JP2001514490A; DE69837604T2; ATE360079T1; EP1007698B1

Abstract

Un procedimiento para obtener proteínas(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante, que comprende purificar dicha(s) proteínas(s) heteróloga(s) a partir del extracto celular de un organismo hospedante en el cual (a) dicho organismo hospedante es transformado in vitro con un vector que comprende (i) un cassette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuro, en el que dicha proteína es una proteína disulfuro isomerasa (PDI) o tioredoxina (TRX); (ii) un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas, y (b) El organismo hospedante de la etapa (a) es cultivado en condiciones adecuadas para la expresión de una o más proteínas heterólogas; y (c) dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) es/son purificada(s) a partir del extracto celular del organismo hospedante, en donde dicho organismo hospedante es una especie microbiana eucariótica, una célula de insecto o una célula de mamífero.

Description

Expresión de proteínas heterólogas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de expresión que proporciona proteínas heterólogas expresadas por un organismo hospedante no nativo pero que tiene actividad y/o estructura biológica de tipo proteína nativa.

Antecedentes de la invención

Los avances durante la pasada década en biología molecular e ingeniería genética han hecho posible producir grandes cantidades de productos de proteínas usando sistemas de expresión heterólogos.

El uso de hospedantes heterólogos para la producción, por ejemplo, de proteínas terapéuticas puede conducir, sin embargo, a diferencias en las propiedades biológicas y/o estructurales del producto recombinante. Entre las modificaciones bioquímicas que se producen comúnmente en las proteínas durante o a continuación de su síntesis en la célula, la formación de enlaces de sulfuro es de relevancia, ya que esta modificación está emparejada al correcto plegamiento o ensamblado de proteínas unidas por disulfuros (examinado por J.C.A. Bardwell y J. Beckwith, Cell, 74: 769-771, 1993; R.B. Freedman, en Protein Folding, T.E. Creighton (ed.), W.H. Freeman and Co., New York, pag. 455-539, 1992).

En bacterias y otras células hospedantes, por ejemplo, bajo ciertas condiciones, algunas proteínas heterólogas son precipitadas en las células como estructuras "refráctiles" o de "inclusión". Estas estructuras refráctiles o de inclusión consisten en masa densas de proteína heteróloga reducida, parcialmente plegada, que está a menudo en una forma que no es biológicamente activa (S.B. Storrs et al., Protein Folding - American Chemical Society Symposium Series 470, Capitulo 15: 197-204, 1991). Se cree que la inactividad biológica de las proteínas heterólogas refractiles o de inclusión, nativamente unidas por enlaces de disulfuro, es debida a un plegamiento o ensamblado incorrecto de la proteína llevado a cabo por la no formación o malformación de los enlaces de disulfuro en las proteínas. La inactividad biológica de las proteínas heterólogas refráctiles o de inclusión, debida al procedimiento de un plegamiento o ensamblado incorrecto de la proteína, se cree que se produce antes o después de la precipitación intracelular o durante el aislamiento de las proteínas.

Además de ello, muy a menudo la función biológica de una proteína es regulada o al menos es influenciada por el estado de oxidación de sus grupos sulfhidrilo. Este es el caso de algunas actividades enzimáticas, en las que la reversibilidad y la duración de la oxidación de los grupos sulfhidrilo han sido propuestos como un mecanismo de control fisiológico.

Hay numerosos ejemplos de proteínas unidas por disulfuros en la bibliografía. Por ejemplo, la mayoría de las glicoproteínas virales y algunos factores de crecimiento se conoce que están unidos por disulfuros. En general, los enlaces de disulfuros son esenciales para corregir el plegamiento de las proteínas. Ejemplos de proteínas heterólogas recombinanates unidas por disulfuros que se ha mostrado que están mal plegadas cuando son expresadas, por ejemplo, en células de levaduras que incluyen proteínas de a superficie grande del virus de la hepatitis B (Biemans et al., DNACell Biol., 10: 191-200, 1991), \alpha-1-antitripsina (Moir y Dumais, Gene, 56: 209-217, 1987), y eritropoietina (Elliott et al., Gene, 79: 167-180, 1989). Ejemplos de proteínas recombinantes expresadas, por ejemplo, en células de insectos o mamíferos, para las que se ha mostrado que los enlaces de disulfuro son esenciales para el plegamiento de las proteínas, incluyen el factor de estimulación de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) (Kaushansky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 12131217, 1989), virus de la eritroleucemia (SFFV) glicoproteína gp55 (Gliniak et al., J. Biol. Chem., 266: 22991-22997, 1991), glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) (Grigera et al., J. Virol., 66: 3749-3757, 1992), proteína D de tensión superficial pulmonar (Crouch et al., J. Biol. Chem., 269: 15808-15813, 1994), receptor de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Bieri et al., Biochemistry, 34: 13059-13065, 1995), factor de crecimiento de tipo insulina (Nahri et al., Biochemistry, 32: 5214-5221, 1993), y enzima de conversión de angiotensinas (ACE) (Sturrock et al., Biochemistry, 35: 9560-9566, 1996). Debe apreciarse que en todos estos casos, la expresión de proteínas heterólogas en células hospedantes particulares solamente fue usada para producir cantidades suficientes de la proteína de referencia para hacer posible que se lleven a cabo estudios
estructurales.

Han sido caracterizados diversos factores de proteínas que catalizan la formación de enlaces de disulfuro. La proteína disulfuro isomerasa (PDI) es una proteína multifuncional abundante que se encuentra en el lumen del retículo endoplásmico (ER) que favorece la formación apropiada de enlaces de disulfuro en proteínas secretoras y de la superficie celular (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4453-4457, 1991; Farquhar et al., Gene, 108: 81-89, 1991; Freedman, Cell, 57: 1069-1072, 1989; Laboissiere et al., J. Biol. Chem., 270: 28006-28009, 1995).

Una función similar, pero en un compartimento celular diferente, ha sido adscrita a otra proteína ubicuota pequeña, tioredoxina (TRX) (Gan, J. Biol. Chem., 266: 1692-1696, 1991; Muller, J. Biol. Chem., 266: 9194-9202, 1991; Chivers et al., EMBO J., 15: 2659-2667, 1996), que tiene una secuencia de sitios activos similar a la de PDI. Las tioredoxinas son polipéptidos citosólicos capaces de catalizar la reducción de disulfuros usando glutatión como un reductor (Holmgren, J. Biol. Chem., 264: 13963-13966, 1989). Ha sido propuesto que la tioredoxina puede estar involucrada también la reducción de disulfuros prematuramente formados en proteínas que han entrado en el ER. Como la actividad biológica de un cierto número de enzimas claves involucradas en trayectorias metabólicas cruciales depende del sistema redox citosólico, es posible que la TRX desempeñe una función relevante en la modificación de proteínas involucradas en el plegamiento en compartimentos celulares distintos del citosol.

En numerosos organismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, células de mamíferos y células de insectos, que han sido genéticamente manipulados para (sobre)expresar proteínas heterólogas, el problema que se encuentra con la mayoría de los sistemas de expresión es la incapacidad de expresar proteínas que sean biológicamente activas.

Sumario de la invención

Resulta ahora que debido a la falta o a la cantidad ineficaz de las enzimas necesarias para corregir el plegamiento o ensamblado de proteínas heterólogas en hospedantes de expresión no nativos, estas proteínas heterólogas expresadas a menudo no son biológicamente activas y/o tienen una estructura incorrecta de las proteínas.

La presente invención supera este problema y permite la expresión de proteínas heterólogas biológicamente activas y/o correctamente estructuradas en hospedantes de expresión no nativos.

Se ha encontrado ahora que los cassettes de expresión que codifican PDI o TRX pueden ser usados para transformar un organismo hospedante, haciendo así posible la sobreexprese de PDI o TRX. Preferentemente, el organismo hospedante es una levadura. Las células de levaduras, por ejemplo, que sobreexpresan estas proteínas, pueden ser posteriormente o simultáneamente transformadas con vectores de expresión que codifiquen una o más proteínas heterólogas deseables. Las proteínas heterólogas expresadas en estas células de levaduras transformadas con PDI/TRX están en una forma biológicamente activa y apropiadamente plegada, debido a la actividad de formación de enlaces de disulfuros de las enzimas de PDI o RX co-expresadas en la misma célula.

Estos sistemas para producir proteínas heterólogas biológicamente activas pueden ser ventajosamente usados para la producción, por ejemplo, de proteínas para uso en terapéutica y/o diagnostico humano o veterinario u otras proteínas de intereses comercial o de investigación. La actividad biológica correcta y óptima efectuada mediante los métodos de la presente invención es destacada en la producción, por ejemplo, de fármacos eficaces y reactivos de diagnóstico.

La sobreexpresión de PDI en Saccharomyces cerevisiae se ha encontrado que mejora la secreción de homodímero de factor B de crecimiento derivado de plaquetas humanas (PDGF-BB) en el medio de cultivo (Robinson et al., Bio/Technology, 12: 381-384, 1994).

En la presente invención, se ha demostrado un nivel aumentado de eficacia de plegamiento de proteínas heterólogas en células.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un cassette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros.

Este vector da lugar deseablemente a la (sobre)expresión de la proteína en una célula hospedante transformada, proporcionando así las condiciones para un correcto pegado de la proteína heteróloga.

La proteína puede ser cualquier proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros y es preferentemente la proteína disulfuro isomerasa (PDI) o tioredoxina (TRX) o una combinación de las mismas. Los genes que codifican PDI y TRX son obtenidos preferentemente a partir de levadura, más preferentemente a partir de S. cerevisiae. Sin embrago, las fuentes de PDI y TRX pueden incluir también, por ejemplo, secuencias de cDNA de tipo humano salvaje y mutantes.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, la expresión "cassette de expresión" indica una secuencia de DNA que comprende al menos una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína y la expresión apropiada y, opcionalmente, secuencias de control para facilitar la expresión de la secuencia de DNA estructural.

El vector puede comprender más de una secuencia de DNA que codifique una proteína que es capaz de catalizar la formación de en enlaces de disulfuros, en uno o más cassettes de expresión. Las secuencias de DNA pueden ser repeticiones de la misma secuencia de DNA o pueden codificar proteínas diferentes capaces de catalizar la formación de enlaces de disulfuros. La provisión de copias múltiples de secuencias de DNA de las mismas o diferentes proteínas capaces de catalizar la formación de enlaces de disulfuros representa y una forma de conseguir la sobreexpresión deseable de las proteínas, y conseguir por tanto el efecto técnico ventajoso e inventivo.

El cassette de expresión puede comprender también una secuencia de DNA que codifica un péptido líder para la secreción funsionada al extremo 5' del gen que codifica la proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros. Al hacer esto, el constructo da lugar deseablemente a (1) la (sobre)expresión de la proteína en la célula transformada, y (2) la localización de la célula (sobre)expresada en el ER y/o otros compartimentos secretores, en donde puede ejercer su función, proporcionado así las condiciones para el correcto plegamiento de la proteína heteróloga.

El vector del primer aspecto de la invención puede comprender también adicionalmente un cassette de expresión que comprenda secuencia(s) de DNA que codifique(n) una o más proteínas heterólogas. Preferentemente, la proteína heteróloga es una glicoproteína de envoltura E2_{715} del virus de la hepatitis C (HCV) o el factor de crecimiento inducido por c-fos (FIGF).

El vector del primer aspecto de la invención puede ser integrativo o episomal cuando es transformado en un organismo hospedante. Preferentemente, el vector es capaz de una integración en el organismo hospedante.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un organismo hospedante transformado con un vector según el primer aspecto de la invención.

Nuevamente, pueden estar presentes múltiples copias del vector como vectores episomales o integradas en el genoma del organismo hospedante para ayudar a la (sobre)expresión de la proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros.

Según tercer aspecto de la invención, se proporciona un organismo hospedante del segundo aspecto de la invención adicionalmente transformado con un vector que comprende un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas. Este vector adicional puede ser integrativo o episomal cuando es transformado en el organismo hospedante.

El organismo hospedante puede ser co-transfectado con más de un vector que comprenda un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas.

El organismo hospedante puede ser cualquier organismo hospedante en el que la expresión de una proteína heteróloga sea propensa a una formación incorrecta de enlaces de disulfuros.

La proteína heteróloga puede ser cualquier proteína que no se produzca normalmente en el organismo hospedante y que, en ausencia de una (sobre)expresión de la proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros, se produzca en una forma con enlaces incorrectos de disulfuros. Preferentemente, la proteína heteróloga es glicoproteína de envoltura E2_{715} de HCV o FGIF humano.

Preferentemente, el organismo hospedante según el segundo y tercer aspectos de la invención es levadura y, más preferentemente, S. cerevisiae.

Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un organismo hospedante según el segundo aspecto de la invención, que comprende transformar un organismo hospedante con un vector del primer aspecto de la invención.

Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir un organismo hospedante según el tercer aspecto de la invención, que comprende transformar adicionalmente un organismo hospedante del segundo aspecto de la invención posteriormente o simultáneamente con un vector que comprende un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas.

Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona un método para expresar proteínas(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante, que comprende las etapas de:

(a) transformar un organismo hospedante con uno o más vectores según el primer aspecto de la presente invención;

(b) transformar adicionalmente el organismo hospedante de la etapa (a) posteriormente o simultáneamente con uno o más vectores que comprende(n) secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas; y

(c) cultivar el organismo hospedante de la etapa (b) en condiciones adecuadas para la expresión de una o más proteínas heterólogas.

Según un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un método para expresar proteínas(s) heteróloga(s) biológicamente activas y/o correctamente estructuradas en un organismo hospedante, que comprende:

(a) transformar un organismo hospedante según el segundo aspecto de la invención posteriormente o simultáneamente con uno o más vectores que comprende(n) secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas;

(b) cultivar el organismo hospedante de la etapa (a) en condiciones adecuadas para expresión de la(s) una o más proteínas heterólogas.

Según un octavo aspecto de la invención, se proporciona un método para expresar proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante, que comprende la etapa de cultivar un organismo hospedante transformado con uno o más vectores según el tercer aspecto de la invención en condiciones adecuadas para la expresión de una o más proteínas heterólogas.

Según un noveno aspecto de la invención, se proporciona un método para expresar una glicoproteína de envoltura E2_{715} de HCV o FIGF humano en un organismo hospedante.

Según un décimo aspecto de la invención, se proporciona un método para la preparación de una composición inmunogénica, que comprende poner una glicoproteína de envoltura de E2_{715} de HCV o FGIF humano producida mediante el método según el noveno aspecto de la invención en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante.

Descripción de realizaciones específicas

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología molecular, microbiología, DNA recombinante e inmunológica que están dentro de los conocimientos de la técnica. Estas técnicas están explicadas en detalle en la bibliografía (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 1989; D.N Glover (ed.), DNA Cloning, Volumes I and II, 1985; M.J. Gait (ed.), Oligonucleotide Synthesis, 1984; B.D. Hames y S.J. Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, 1984; B.D. Hames y S.J. Higgins (eds.), Transcription and Translation, 1984; R.I. Freshney (ed.), Animal Cell Culture, 1986; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, 1984; La serie, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; J.H. Miller y M.P. Calos (eds.), Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; Wu y Grossman (eds.) y Wu (ed.), Methods in Enzymology, Volúmemes 154 y 155, respectivamente; Mayer y Walker (eds.), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987; Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition, Springer-Verlag, New York, 1987; y D.M. Weir y C. C. Blackwell (eds.), Handbook of Experimental Immunology, Volúmenes I-IV, 1986).

Como se mencionó anteriormente, los ejemplos de la proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuros que pueden ser usada en la presente invención incluyen polipéptidos con variaciones menores de aminoácidos respecto a la secuencia de aminoácidos de la PDI o proteína de TRX específicamente descrita.

Una ventaja significativa de producir proteínas heterólogas mediante técnicas de DNA recombinate, en lugar de aislar y purificar una proteína a partir de fuentes naturales, es que pueden ser producidas cantidades equivalente de la proteína usando menos material de partida del que se necesitaría para aislar la proteína partir de una fuente natural. La producción de la proteína mediante técnicas recombinantes permite también que la proteína sea aislada en ausencia de algunas moléculas normalmente presentes en las células. De hecho, las composiciones de proteínas completamente exentas de cualquier resto de contaminantes de proteínas humanas pueden ser fácilmente producidas, por que la única proteína humana producida por el hospedante no humano recombinante es la proteína recombinante en cuestión. Son evitados también agentes virales potenciales de fuentes naturales y componentes virales patógenos para seres humanos.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para los individuos que reciben la composición. Los vehículos adecuados son normalmente macromoléculas grandes lentamente metabolizadas como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos polímeros, copolímeros de aminoácidos, agregados lípidos (como gotitas de aceite o liposomas) y partículas de virus inactivos. Estos vehículos son bien conocidos por los expertos ordinarios en la técnica. Adicionalmente, estos vehículos pueden funcionar como agentes (adyuvantes) inmunoestimulantes.

Los adyuvantes preferidos para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación, sales de aluminio (alum) como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., formulaciones de emulsiones de aceites, con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos, como péptidos de muramilo o componentes de la pared celular bacteriana, como por ejemplo (1) MF59 (solicitud de patente internacional publicada WO-A-90/14837, que contiene 5% de escualeno, 0,5% de Tween® 80, 0,5% de Span® 85 (que contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP-PE (véase con posterioridad), aunque no es necesario) formulados en forma de partículas submicrónicas usando un microfluidizador como el microfluidizador Model 110Y (Microfluidics, Newton, MA 02164, USA), (2) SAF, que contiene 10% de escualeno, 0,4% de Tween® 80, 5% de polímero L121 bloqueado con Pluronic al 5%, y thr-MDP (véase con posterioridad) microfluidizado en forma de una emulsión submicrónica o agitadas para generar una emulsión de tamaño de partículas mayor, y (3) sistema adyuvante RIBI® (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT, USA) que contiene 2% de escualeno, 0,2% de Tween® 80 y uno o más componentes de la pared celular bacterina del grupo que consiste en lípido de monofosforilo A (MPL), trehalosa dimicolato (TDM) y armazón de la pared celular (CWS) preferentemente MPL+CWS (Detox®), muramil-péptidos como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina(MTP-PE) etc., y citoquinas, como interleusinas (IL-1, IL-2 etc.), factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF) etc. Adicionalmente, pueden ser usados adyuvantes de saponina, como Stimulon® (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) o partículas generadas a partir de los mismos como ISCOMS (complejos inmunoestimulantes). Además de ello, pueden ser usados el adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA) el Alum y MF59 son preferidos.

Las composiciones inmunogénicas (por ejemplo, el antígeno, vehículo farmacéuticamente aceptable y adyuvantes) contendrán normalmente diluyentes como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes en estos vehículos sustancias auxiliares, como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes de pH y similares.

Normalmente, las composiciones inmunogénicas son preparadas como formas inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones liquidas; o formas sólidas adecuadas para una solución o suspensión en vehículos líquidos antes de que pueda ser preparada la inyección. La preparación también puede ser emulsionada o encapsulada en lipososmas para un efecto adyuvante aumentado, como se describió anteriormente para los vehículos farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de los polipéptidos antigénicos, así como cualquiera otro de los componentes anteriormente mencionados, en la medida necesaria. Mediante "cantidad inmunológicamente eficaz" se quiere indicar que la administración de esa cantidad a un individuo, en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para un tratamiento o prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y el estado físico del individuo que va a ser tratado, del grupo taxonómico de individuo que va ha ser tratado (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del facultativo encargado de la situación medica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga dentro de un intervalo relativamente amplio que puede ser determinado a través de ensayos rutinarios.

Las composiciones inmunogénicas son convenientemente administradas por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección por día subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales para otros modos de administración incluyen formulaciones orales o pulmonares, supositorios y aplicaciones trasdermales. El tratamiento de la dosificación puede seguir un esquema de dosis únicas o un esquema de dosis múltiples. La vacuna puede ser administrada conjuntamente con otros agentes inmunorreguladores.

La expresión "polinucleótido recombinante", como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye un polinucleótido de origen geonómico de cDNA, semisintético o sintético que, debido a su origen o manipulación: (1) no está asociado con la totalidad o una parte de un polinucleótido con el que está asociado por naturaleza, (2) está contado a un polinucleótido distinto de aquel al que está conectado por naturaleza o (3) no se produce en la naturaleza.

El termino "polinucleótido", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una forma polímera de nucleótidos de cualquier longitud, como ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Este término se refiere solamente a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, este término incluye DNA y RNA de cadena doble y sencilla. Incluye también tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcadores que son conocidos en la técnica, metilación, "remates en los grupos terminales", sustitución de uno o más de los nucleótidos que se producen de forma natural con un análogo, modificaciones de ínternucleótidos como, por ejemplo, aquellos con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fosfotioatos, fosforoditioatos, etc.), los que contienen grupos colgantes como, por ejemplo, proteínas (que incluyen, por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señales, poli-L-licina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psolaren, etc.), los que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), los que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anómeros, etc.), así como formas no modificadas del polinucleótido.

Un "repilicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc. que se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótidos en una célula; es decir, capaz de replicación bajo su propio control. Esto puede incluir marcadores seleccionables.

Un "vector" es un replicón en el que esta unido otro segmento de polinucleótido, de forma que lleva a cabo la replicación y/o expresión del segmento unido.

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que efectúan necesariamente la expresión de secuencias codificadoras a las que están ligadas. La naturaleza de estas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedante; en procariotas, estas secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión ribosomal y secuencia de terminación de la trascripción; en eucariotas, generalmente, estas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de transcripción. La expresión "secuencias de control" está destinada a incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y pueden incluir también componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes y secuencias asociadas de fusión.

"Funcionalmente conectado" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera prevista. Una secuencia de control "funcionalmente conectada" a una secuencia codificadora está ligada de forma que se consigue la expresión de la secuencia codificadora bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

Un "marco de lectura abierto" (ORF) es una región de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido. Esta región puede representar una parte de una secuencia codificadora o una secuencia codificadora total.

Una "secuencia codificadora" es una secuencia de polinucleótidos que es traducida en un polipéptido, habitualmente a través de mRNA, cuando es colocada bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los contornos de la secuencia codificadora son determinados mediante un codon de inicio de traducción en la terminación en 5' un codon de terminación de traducción en la terminación 3'. Una secuencia codificadora puede incluir, pero sin limitación, cDNA y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

"PCR" se refiere a la técnica de reacción de cadena de polimerasa como se describe por Saiki et al., Nature, 324: 163, 1986; Scharf et al., Science, 233: 1076-1078, 1986; patente de EE.UU. 4.683.195; y patente de EE.UU: 4.683.202.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, x es "heterólogo" con respecto a y si x no está asociado de forma natural con y de manera idéntica; es decir, x no está asociado con y por naturaleza o x no está asociado con y de la misma manera que se encuentra en la naturaleza.

"Homología" se refiere al grado de similitud entre x e y. La correspondencia entre la secuencia de una forma a otra puede ser determinada mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica. Por ejemplo, pueden ser determinadas mediante una comparación directa de la información de las secuencias de polinucleótidos. Alternativamente, la homología puede ser determinada mediante hibridación de los polinucleótidos bajo condiciones que formen dúplex estables entre regiones homólogas (por ejemplo, las que serían usadas antes de la digestión de S_{1}), seguido de digestión con nucleasa(s) específica(s) de cadena única, seguida de determinación de tamaños de los fragmentos digeridos.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el termino "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido. Este término no se refiere ni excluye tampoco las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Están incluidos dentro de la definición, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, que se producen de forma tanto natural como de forma no natural.

Un polipéptido o secuencia de aminoácidos "derivado de" una secuencia de ácidos nucleicos indicada se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos igual a la de un polipéptido codificado en la secuencia, o una parte del mismo, en el que la parte consiste en al menos 3-5 aminoácidos y, más preferentemente, al menos 8-10 aminoácidos, e incluso más preferentemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es inmunológicamente identificable con un polipéptido codificado en la secuencia. Esta terminología incluye también un polipéptido expresado a partir de una secuencia indicada de ácidos nucleicos.

La proteína puede ser usada para producir anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, específicos para la proteína. Los métodos para producir estos anticuerpos son conocidos en la técnica.

"Células hospedantes recombinantes", "células hospedantes", "células", "cultivos celulares" y otros términos de este tipo indican, por ejemplo, microorganismos, células de insectos y células de mamíferos que pueden ser, o pueden haber sido usadas como receptores para un vector recombinante u otro de DNA de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transformada. Debe entenderse que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente por completo idéntica en morfología o en complemento de DNA geonómico o total a la mutación parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada. Ejemplos de células hospedantes de mamíferos incluyen células de ovarios de hámster chino (CHO) y de riñón de mono (COS).

Específicamente, como se usa en la presente memoria descriptiva, "línea celular" se refiere a una población de células capaces de un crecimiento continuo o prologado y una división in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una única célula progenitora. Es adicionalmente conocido en la técnica que se pueden producir cambios espontáneos o inducidos en el cariotipo durante el almacenamiento o transferencia de estas poblaciones clonales. Por lo tanto, las células derivadas de la línea celular indicada pueden no ser precisamente iguales a las células o cultivos ancestrales, y la línea celular indicada incluye estas variantes. La expresión "línea celular" incluye también células inmortalizadas. Preferentemente, las líneas celulares incluyen líneas celulares no hibridadas o hibridomas solamente para dos tipos de células.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, el término "microorganismo" incluye especies microbianas procarióticas y eucarióticas como bacterias y hongos, y estos últimos incluyen hongos de levaduras y hongos filamentosos.

"Transformación", como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a la inserción de un polinucleótido exógeno en una célula hospedante independientemente del método usado para la inserción, por ejemplo, absorción directa, trasducción, cruzamiento f o electroporación. El polinucleótido exógeno puede ser mantenido en forma de un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido o alternativamente, puede estar integrado en el genoma del hospedante.

Mediante "genómico" se quiere indicar una colección o biblioteca de moléculas de DNA que son derivadas de fragmentos de restricción que han sido clonados en vectores. Esto puede incluir la totalidad o parte del material genómico en un organismo.

Mediante "cDNA" se quiere indicar una secuencia de DNA complementaria que se hibrida a una cadena complementaria de DNA.

Mediante "purificado" y "aislado" se quiere indicar, cuando se hace referencia a una secuencia de polipéptido o nucleótido, que la molécula indicada está presente en ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "purificado", como se usa en la presente memoria descriptiva, significa al menos un 75% en peso, más preferentemente al menos 85% en peso, todavía más preferentemente al menos 95% en peso y los más preferentemente al menos 98% en peso de las macromoléculas biológicas del mismo tipo está presente (pero pueden estar presentes agua tampones y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular de menos de 1.000).

Una vez que la secuencia codificadora apropiada es aislada, puede ser expresada en una diversidad de sistemas de expresión diferentes; por ejemplo, los usados con células de mamíferos, baculovirus, bacterias y levaduras.

i. Sistemas de mamíferos

Los sistemas de expresión de mamíferos son conocidos en la técnica. Un promotor de mamífero es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a RNA polimerasa de mamífero e iniciar la transcripción en dirección descendente (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una iniciadora de transcripción, que está habitualmente colocada próxima al extremo en 5' de la secuencia codificadora y una caja TATA, habitualmente colocada 25-30 paredes de bases (bp) en dirección ascendente del sitio de inicio de las trascripción. La caja TATA se cree que dirige la RNA polimerasa II para comenzar la síntesis de RNA en el lugar correcto. Un promotor de mamífero contendrá también un elemento promotor en dirección ascendente habitualmente colocado en 100 a 200 bp en dirección ascendente de la caja TATA. Un elemento promotor en dirección ascendente determina la velocidad a la que es iniciada la trascripción y puede actuar en cualquier orientación (Sambrook et al., "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989).

Los genes virales de mamíferos a menudo están altamente expresados y tienen una amplia gama de hospedantes; por lo tanto, las secuencias que codifican genes virales de mamíferos proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, promotor LTR de virus de tumor de mamas de ratón, promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP) y promotor de virus simple de herpes. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, como el gen de metalotioneína de murina, proporcionan también secuencias promotoras útiles. La expresión puede ser constitutiva o regulada (inducible) dependiendo del promotor que puede ser inducido con glucocorticoide en células sensibles a hormonas.

La presencia de un elemento mejorador (mejorador), combinada con los elementos promotores anteriormente descritos, aumentará habitualmente los niveles de expresión. Un mejorador es una secuencia de DNA reguladora que puede estimular la trascripción hasta mil veces cuando se une a promotores homólogos o heterólogos, con síntesis que comienzan en el sitio de inicio de RNA normal. Los mejoradores pueden ser también activos cuando son colocados en dirección ascendente o en dirección descendente del sitio de inicio de la transcripción, en orientación normal o alterada, o a una distancia de más de 1.000 nucleótidos del promotor (Maniatis et al., Science, 236: 1237, 1987; Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, 2nd ed., 1989). Los elementos mejoradores derivados de virus pueden ser particularmente útiles porque habitualmente tienen una gama de hospedantes más amplia. Ejemplos incluyen el mejorador génico temprano SV40 [Dijkema et al., EMBO J., 4: 761, 1985) y el mejorador/promotores derivados de la repetición terminal larga (LTR) del virus de sarcoma de Rous (Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6777, 1982b) y de citomegalovirus humano (Boshart et al., Cell, 41: 521, 1985). Adicionalmente, algunos mejoradores son regulables y resultan activos solamente en presencia de un inductor, como una hormona o ion metálico (Sassone-Corsi y Borelli, Trends Genet., 2: 215, 1986; Maniatis et al., Science, 236: 1237, 1987).

Una molécula de DNA puede ser expresada intracelularmente en células de mamíferos. Una secuencia promotora puede estar directamente conectada con la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el N terminal de la proteína recombinante será siempre una metionina, que es codificada por el codon de inicio ATG. Si se desea, el N termina puede ser escindido de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, las proteínas extrañas pueden ser secretadas también desde la célula a los medios de crecimiento creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporciona la secreción de la proteína extraña en células de mamíferos. Preferentemente, hay sitios de tratamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que puede ser escindido in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica habitualmente un péptido de señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula. El líder triparitario de adenovirus es un ejemplo de una secuencia líder que proporciona la secreción de una proteína extraña en células de mamíferos.

Habitualmente, las secuencias de terminación de la trascripción y poliadenilación reconocidas por células de mamíferos son regiones reguladoras colocadas en 3' respecto al codon de terminación de la traducción y, por tanto, junto con los elementos promotores, flanquea la secuencia codificadora. La terminación en 3' del RNA maduro se forma mediante escisión post-transcripcional específica para el sitio y poliadenilación (Birnstiel et al., Cell, 41: 349, 1985; Proudfoot y Whitelaw, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", en "Transcription and Splicing" (eds. B.D. Hames y D.M. Glover), 1988; Proudfoot, Trends Biochem. Sci., 14: 105, 1989). Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede ser traducido en el polipéptido codificado por el DNA. Ejemplos de señales de terminador de transcripción/poliavenilación incluyen las derivadas de SV40 (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Algunos genes pueden ser expresados más eficazmente cuando están presentes intrones (también denominados secuencias de intervención). Sin embargo, diversos cDNA han sido eficazmente expresados a partir de vectores que carecen de señales de empalme (también denominados sitios donantes y aceptores de empalmes) (véase, por ejemplo, Gothing y Sambrook, Nature, 293: 620, 1981). Los intrones son secuencias no codificadoras de intervención en una secuencia codificadora que contiene sitios donantes y aceptores de empalmes. Son suprimidos mediante un procedimiento denominado "empalme", seguido de una poliadenilación del trascripto primario (Nevins, Ann. Rev. Biochem., 52: 441, 1983; Green, Ann. Rev. Genet., 20: 671, 1986; Padgett et al., Ann. Rev. Biochem. 55: 1119, 1986; Krainer y Maniatis, "RNA splicing", en: Transcription and Splicing (eds. B.D. Hames y D.M. Glover), 1988).

Habitualmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, señal de poliadenilación y una secuencia de terminación de la trascripción, son puestos conjuntamente en forma de constructos de expresión. Los mejoradores, intrones con sitios donantes y aceptores de sección funcional, y las secuencias líderes, pueden ser incluidos también en un constructo de expresión si se desea. Los constructos de expresión son mantenidos a menudo en un replicón, como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un hospedante, como células de mamíferos o bacterias. Los sistemas de replicación de mamíferos incluyen los derivados de virus de animales, que requieren factores de trans-actuación para replicarse. Por ejemplo, los plásmidos que contienen los sistemas de replicación de papovavirus, como SV40 (Gluzman, Cell, 23: 175, 1981) o poliamovirus, se replican hasta un número de copias extremadamente elevado en presencia del antígeno viral T apropiado. Ejemplos adicionales de replicones de mamíferos incluyen los derivados de papilomavirus bovino y virus de Epstein-Barr. Adicionalmente, el replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que sea mantenido, por ejemplo, en células de mamíferos para la expresión y en un hospedante procariótico para la clonación y amplificación. Ejemplos de estos vectores de lanzamiento de bacterias de mamíferos incluyen pMT2 (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 9: 946, 1989) y pHEBO (Shimizu et al., Mol. Cell. Biol., 6: 1074, 1986).

El procedimiento de transformación usado depende del hospedante que va a ser transformado. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamíferos son conocidos en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del (o los) polinuclótido(s) en liposomas y microinyección directa del DNA en los núcleos.

Las líneas celulares de mamíferos disponibles como hospedantes para la expresión son conocidas en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC), que incluyen, pero sin limitación, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y un cierto número de otras líneas celulares.

ii Sistemas de baculovirus

El polinucleótido que codifica la proteína puede ser insertado también en un vector de expresión de insectos adecuado, y es funcionalmente conectado a los elementos de control con ese vector. La construccion de vectores emplea técnicas que son conocidas en el estado de la técnica.

Generalmente, los componentes del sistema de expresión incluyen un vector de transferencia, habitualmente un plásmido bacteriano, que contiene un fragmento del genoma de baculovirus y un sitio de restricción conveniente para la inserción del gen o genes heterólogos que van a ser expresados; un baculovirus de tipo salvaje con una secuencia homóloga al fragmento específico del baculovirus en el vector de transferencia (esto permite la recombinación homóloga del gen heterólogo en el genoma de baculovitus); y células hospedantes de insectos apropiados y medios de crecimiento.

Después de insertar la secuencia de DNA que codifica la proteína en el vector de transferencia, el vector y el genoma viral de tipo salvaje son transfectados en una célula hospedante de insecto en la que se permite que se recombinen el vector y el genoma viral. El virus recombinante envasado es expresado y las placas recombinantes son identificadas y purificadas. Los materiales y métodos para sistemas de expresión de baculovirus/células de insectos están disponibles en el comercio en forma de estuches de ensayos, entre otros, en la empresa Invitrogen, San Diego, CA, USA (estuche de ensayo "MaxBac"). Estas técnicas son generalmente conocidas por los expertos en la técnica y están descritas en detalle por Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555, 1987 (en lo sucesivo "Summers y Smith").

Antes de insertar la secuencia de DNA que codifica la proteína en el genoma de baculovirus, los componentes anteriormente descritos que comprenden un promotor, líder (si se desea), la secuencia codificadora de interés y la secuencia de terminación de la transcripción son habitualmente ensambladas en un constructo de trascolocación intermedia (vector de transferencia). Este constructo puede contener un único gen y elementos reguladores funcionalmente conectado; genes múltiples, que cada uno con su propio conjunto de elementos reguladores funcionalmente conectados; o genes múltiples, regulados por el mismo conjunto de elementos reguladores. Los constructos de transcolocación intermedios son mantenidos a menudo en un replicón, como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un hospedante, como una bacteria; el replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo así que sea mantenido en un hospedante adecuado para la clonación y amplificación.

Actualmente, el vector de transferencia más comúnmente usado para introducir genes extraños en AcNPV es pAc373. Han sido también diseñados muchos otros vectores, conocidos por los expertos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, pVL985 (que altera el codon de inicio de polihedrina desde de ATG hasta ATT, y que introduce 32 pares de bases del sitio de clonación BamHI en dirección descendente del ATT; véase Luckow y Summers, Virology, 17: 31, 1989).

El plásmido contiene también habitualmente la señal de poliadenilación de polihedrina (Miller et-al., Ann. Rev. Microbiol., 42: 177, 1988) y un gen procariótico de resistencia a la ampicilina (amp) y origen de replicación para la selección y propagación en Escherichia coli.

Los vectores de transferencia de baculovirus contienen habitualmente un promotor de baculovirus. Un promotor de baculovirus es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a RNA polimerasa de baculovirus e iniciar la transcripción en dirección descendente (5' a 3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que está colocada habitualmente próxima al extremo en 5' de la secuencia codificadora. Esta región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión de RNA polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un vector de transferencia de baculovirus puede tener también un segundo dominio denominado un mejorador que, si está presente, es habitualmente distal respecto al gen estructural. La expresión puede ser regulada o constitutiva.

Los genes estructurales, abundantemente transcritos en fases tardías en un ciclo de infección viral, proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen las secuencias derivadas del gen que codifica la proteína de polihedron viral (Friesen et al., "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", en: The Molecular Biology of Baculoviruses (ed. Walter Doerfler), 1986; y publicaciones de patentes Europeas nº 127.839 y 155.476) y el gen que codifica la proteína p10 (Vlak et al., J. Gen. Virol., 69: 765, 1988).

Las secuencias de señales adecuadas que codifican DNA pueden ser derivadas de genes para proteínas secretadas de insectos o baculovirus, como el gen de polihedrina de baculovirus (Carbonell et al., Gene, 73: 409, 1988). Alternativamente, como las señales para las modificaciones post-translacionales de células de mamíferos (como la escisión de péptidos de señales, escisión proteolítica y fosforilación) parece que son reconocidas por células de insectos, y las señales requeridas para la secreción y la acumulación nuclear parece que son conservadas entre las células de invertebrados y células de vertebrados, los líderes de origen no de insectos, como los derivados de genes que codifican \alpha-interferon humano (Maeda et al., Nature, 315: 592, 1985), péptido de liberación de gastrina humana (Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol., 8: 3129, 1988), IL-2 humana, Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8404, 1985), IL-3 humana (Miyajima et al., Gene, 58: 273, 1987) y glucocerebrosidasa humana (Martin et al., DNA, 7: 99, 1988), pueden ser usados también para proporcionar secreción en insectos.

Un polipéptido o poliproteína recombinante puede ser expresado intracelularmente o, si es expresado con las secuencias reguladoras apropiadas, puede ser secretado. Una buena expresión intercelular de proteínas extrañas no fusionadas requiere habitualmente genes heterólogos que tengan idealmente una secuencia líder corta que contenga señales de inicio de traducción adecuadas que precedan a una señal de inicio de ATG. Si se desea, la metionina en el N terminal puede ser escindida de la proteína madura mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Alternativamente, las poliproteínas o proteínas recombinantes que no son secretadas de forma natural pueden ser secretadas a partir de la célula de insecto creando moléculas de DNA quiméricas que codifiquen una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder que proporcione la secreción de la proteína extraña en insectos. El fragmento de la secuencia líder codifica habitualmente un péptido señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la traslocación de la proteína en el retículo endoplásmico.

Después de la inserción de la secuencia de DNA y/o el gen que codifica el precursor del producto de expresión de la proteína, un hospedante de células de insecto es co-transformado con el DNA heterólogo del vector de transferencia y el DNA genómico de baculovirus de tipo salvaje, habitualmente mediante co-transfección. La secuencia de terminación promotora y de transcripción del constructo comprenderá habitualmente una sección de 2-5 kb del genoma de baculovirus. Los métodos para introducir DNA heterólogo en el sitio deseado en el virus de baculovirus son conocidos en la técnica (véase Summers y Smith, supra; Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156, 1983; y Luckow y Summers, supra). Por ejemplo, la inserción puede ser en un gen como el gen de polihedrina, mediante recombinación cruzada doble homóloga; la inserción puede ser también en un sitio de enzima de restricción tratado por ingeniería genética en el gen de baculovirus deseado (Miller et al., Bioessays, 4: 91, 1989). La secuencia de DNA, cuando es clonada en lugar del gen de polihedrina en el vector de expresión, está flanqueada tanto en 5' como en 3' por las secuencias específicas de polihedrina y está ubicada en dirección descendente del promotor polihedrina.

El vector de expresión de baculovirus nuevamente formado es posteriormente envasado en un baculovirus recombinante infeccioso. La recombinación homóloga se produce a una baja frecuencia (entre aproximadamente 1% y aproximadamente 5%); por tanto, la mayoría del virus producido después de la co-transfección es todavía un virus de tipo salvaje. Por lo tanto, es necesario un método para identificar virus recombinantes. Una ventaja del sistema de expresión es una selección visual que permite que sean distinguidos los virus recombinantes. La proteína de polihedrina, que es producida mediante el virus nativo, es producida a niveles muy elevados en los núcleos de células infectadas en fases tardías después de la infección viral. La proteína de polihedrina acumulada forma estructuras de oclusión que contienen también partículas incrustadas. Estas estructuras de oclusión, con un tamaño de hasta 15 \mum, son altamente refráctiles, proporcionándoles una apariencia brillante que es fácilmente visualizada bajo el microscopio óptico. Las células infectadas con virus recombinantes carecen de estructuras de oclusión. Para distinguir los virus recombinantes de los virus de tipo salvaje, la materia sobrenadante de la transfección es dispuesta en placas en una monocapa de células de insectos mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. A saber, las placas son seleccionadas bajo el microscopio óptico en cuanto a la presencia (indicativa de virus de tipo salvaje) o ausencia (indicativa de virus recombinantes) de estructuras de oclusión (Ansubel et al. (eds.), "Current Protocols in Microbiology", Vol. 2 at 16.8 (Supp. 10), 1990; Summers y Smith, supra; Miller et al., supra).

Han sido desarrollados vectores de expresión de baculovirus recombinantes para una infección en diversas células de insectos. Por ejemplo, han sido desarrollados baculovirus recombinantes, entre otros, para Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, y Trichoplusia ni (publicación PCT nº WO 89/046699; Carbonell et al., J. Virol., 56: 153, 1985; Wright, Nature, 321: 718, 1986; Smith et al., Mol. Cell. Biol., 3: 2156, 1983; y véase de forma general, Fraser, et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 25: 225, 1989).

Las células y medios de cultivos celulares están disponibles en el comercio para una expresión tanto directa como de fusión de polipéptidos heterólogos en un sistema de bacuovirus/expresión; la tecnología del cultivo celular es generalmente conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Summers y Smith, supra).

Las células de insectos modificadas pueden hacerse crecer seguidamente en un medio nutriente apropiado, que permita un mantenimiento estable del (o de los) péptido(s) presente(s) en el hospedante del insecto modificado. Cuando el gen del producto de expresión está bajo un control inducible, es hospedante puede hacerse crecer hasta una densidad elevada, y ser inducida la expresión. Alternativamente, cuando la expresión es constitutiva, el producto será continuamente expresado en el medio y el medio nutriente debe hacerse circular continuamente, mientras se separa el producto de interés y se aumentan los nutrientes agotados. El producto puede ser purificado mediante técnicas como cromatografía, por ejemplo, HPLC cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, etc.; electroforesis; centrifugación gradiente de densidad; extracción con disolventes o similares. En la medida apropiada, el producto puede ser adicionalmente purificado, en la medida necesaria, con el fin de suprimir sustancialmente cualesquiera proteínas de insectos que son también secretadas en el medio como consecuencia de la lisis de las células de insecto, con el fin de proporcionar un producto que esta al menos sustancialmente excepto debris del hospedante, por ejemplo, proteínas, lípidos y polisacáridos.

Con el fin de obtener la expresión de proteínas, las células recombinantes del hospedante derivadas de los transformantes son incubadas bajo condiciones que permitan la expresión de la secuencia que codifica proteínas recombinantes. Estas condiciones variarán, dependiendo de la célula de hospedante seleccionada. Sin embrago, las condiciones son fácilmente determinables por los expertos ordinarios en la técnica, basándose en lo que es conocido en la técnica.

iii Sistemas Bacterianos

Son conocidas en el estado de la técnica técnicas de expresión bacteriana. Un promotor bacteriano es cualquier secuencia DNA capaz de unir RNA polimersa bacteriana e iniciar la transcripción en dirección descendente (3'') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que está colocada habitualmente proximal respecto al extremo en 5' de la secuencia codificadora. Está región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión de RNA polimerasa y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor bacteriano puede tener también un segundo dominio denominado un operador, que puede solapar un sitio de unión de RMA polimerasa adyacente en el que comienza la síntesis de RNA. El operador permite una transcripción regulada negativa (inducible), ya que una proteína represora de genes se puede unir al operador he inhibir así la transcripción de un gen específico. La expresión constitutiva se puede producir en ausencia de elementos reguladores negativos como el operador. Además la regulación positiva puede ser positiva mediante una secuencia de unión a proteínas activadoras de genes que, sí está presente, es habitualmente proximal (5') respecto a la secuencia de unión de RNA polimerasa. Un ejemplo de una proteína activadora de genes es la proteína activadora de catabolitos (CAP), que ayuda a iniciar la trascripción del operon lac en E. coli (Raibaud et al., Ann. Rev. Genet., 18: 173, 1984). Por lo tanto, la expresión regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o disminuyendo así la transcripción.

Las enzimas de trayectorias metabólicas que codifican secuencias proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen las secuencias promotoras derivadas de enzimas metabolizadoras de azúcares como galactosa, lactosa (lac) (Chang et al., Nature, 198: 1056, 1977), y maltosa. Ejemplos adicionales incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas biosintéticas como triptófano (trp) (Goeddel et al., Nuc. Acids Res., 8: 4.057, 1980; Yelverton et al., Nuc. Acids Res., 9: 731, 1981; patente de EE.UU. nº 4.738.921; y publicaciones de patentes Europeas nº 036.776 y 121.775). El sistema promotor de g-laotamasa (bla) (Weissmann, "The cloning of interferon and other mistakes", en: Interferon 3 (ed. I. Gresser), 1981), y los sistemas promotores de bacteriófagos lambda PL (Shimatake et al., Nature, 292: 128, 1981) y T5 (patente de EE.UU. nº 4.689.406) proporciona también secuencias promotoras útiles.

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores bacterianos. Por ejemplo, las secuencias de activación de la transcripción de un promotor bacteriano o bacteriófago pueden estar unidos con las secuencias de operones de otro promotor bacteriano o bacteriófago creando un promotor híbrido sintético (patente de EE.UU. nº 4.551.433). Por ejemplo, el promotor tac es un promotor híbrido de trp-lac comprendido por secuencias tanto de promotor trp como de operon lac que está regulado por el represor lac (Amann et al., Gene, 25: 167, 1983; de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21, 1983). Además de ello, un promotor bacteriano puede incluir promotores que se producen de forma natural de origen no bacteriano que tiene la capacidad de unir RNA polimerasa bacteriana e iniciar la transcripción. Un promotor que se produce de forma natural de origen no bacteriano puede ser acoplado también con una RNA polimerasa compatible para producir niveles elevados de expresión de algunos genes en procariotas. El sistema de bacteriófago T7 RNA polimerasa/promotor es un ejemplo de un sistema promotor acoplado (Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113, 1986; Tabor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1074, 1985). Además, un promotor híbrido puede estar comprendido también por un promotor bacteriófago y una región de operador de E. coli (publicación de patente Europea nº 267.851).

Además de una secuencia promotora de funcionamiento, un sitio de unión a ribosomas eficaz es útil también para la expresión de genes extraños en procariotas. En E. coli el sitio de unión a ribosomas se denomina secuencia de Shine-Dalgarno (SD) e incluye un codon de inicio (ATG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud, colocada 3-11 nucleótidos en dirección ascendente del codon de inicio (Shine et al., Nature, 254: 34, 1975). La secuencia de SD se cree que favorece la unión de mRNA a ribosoma mediante el emparejamiento de bases entre la secuencia de SD y el extremo en 3' de E. coli 16S rRNA (Steitz et al., "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", en: Biological Regulation and Development: Gene Expression (ed. R.F. Goldberger), 1979). Para expresar genes eucarióticos y genes procarióticos con un sitio de unión débil a ribosomas (Sambrook et al., "Expression of cloned genes in Escherichia coli", en: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989).

Una molécula de DNA puede ser expresada de forma intracelular. Una secuencia promotora puede estar directamente conectada con la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el N terminal será siempre una metionina, que es codificada por el codon de inicio de ATG si se desea, la metionina en el N terminal puede ser escindida de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno o mediante incubación in vivo o in vitro con una peptidasa N-terminal de metionina bacteriana (publicación de patente Europea nº 219237).

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para dirigir la expresión. Habitualmente, una secuencia de DNA que codifica la parte terminal en N de una proteína bacteriana endógena, u otra proteína estable, es fusionada al extremo en 5' de secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, este constructo proporciona una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de la célula lambda de bacteriófago puede ser conectado a la terminación en 5' de un gen extraño y expresado en bacterias. La proteína de fusión resultante retiene preferentemente un sitio para una enzima de tratamiento (factor Xa) para escindir la proteína del bacteriófago del gen extraño (Nagai et al., Nature, 309: 810, 1984). Las proteínas de fusión pueden ser preparadas también con secuencias de los genes lacZ (Jia et al., Gene, 60: 197, 1987), trpE (Allen et al., J. Biotechnol., 5: 93, 1987; Makoff et al., J. Gen. Microbiol., 135: 11, 1989), y Chey (publicación de patente Europea nº 324.647). La secuencia de DNA en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no codificar un sitio escindible. Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Está proteína de fusión es preparada con la región de ubiquitina que retiene preferentemente un sitio para una enzima de tratamiento, por ejemplo, proteasa de tratamiento específica para ubiquitina, para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. A través de este método, puede ser aislada proteína extraña nativa (Miller et al., Bio/Technology 7: 698, 1989).

Alternativamente, las proteínas extrañas pueden ser secretadas también a partir de la célula creando moléculas de DNA quiméricas que codifican una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia de péptido de señal que proporciona la secreción de la proteína extraña en bacterias (patente de EE.UU. nº 4.336.336). El fragmento de la secuencia de señal codifica habitualmente un péptido de señal comprendido por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína a partir de la célula. La proteína es secretada en los medios de crecimiento (bacterias gram-positivas) o en el espacio periplásmico, ubicado entre la membrana interna y externa de la célula (bacteria gram-negativa). Preferentemente, hay sitios de tratamiento que pueden ser escindidos in vivo o in vitro codificados entre el fragmento de péptido de señal y el gen extraño.

Las secuencias de señales adecuadas que codifican DNA pueden ser derivadas de genes para proteínas bacterianas secretadas, como el gen de proteína de membrana externa de E. coli (ompA) (Masui et al., en: Experimental Manipulation of Gene Expression, 1983; Ghrayeb et al., EMBO J., 3: 2437, 1984) y secuencia de señal de fosfatasa alcalina de E. coli (phoA) (Oka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 7212, 1985). Como un ejemplo adicional, la secuencia de señal del gen de alfa-amilasa de diversas cepas de Bacillus puede ser usado para secretar proteínas heterólogas de B. subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; publicación de patente Europea nº 244.042).

Habitualmente, las secuencias de terminación de la trascripción reconocidas por bacterias son generalmente regiones colocadas en 3' respecto al codon de terminación de traducción, por tanto, conjuntamente con el promotor flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede ser traducido en el polipéptido codificado por el DNA. Las secuencias de terminación de la transcripción incluyen frecuentemente secuencias de DNA de aproximadamente de 50 nucleótidos capaces de formar estructuras de tallo-bucle que ayudan a terminar la transcripción. Ejemplos incluyen secuencias de terminación de la transcripción derivadas de genes con promotores fuertes como el gen trp en E. coli y así como otros genes biosintéticos.

Habitualmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, una secuencia de señal (si se desea), la secuencia codificadora de interés y la secuencia de terminación de la transcripción, son puestos conjuntamente en constructos de expresión. Los constructos de expresión son mantenidos a menudo en un replicón, como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmidos) capaz de un mantenimiento estable en un hospedante, como bacterias. El replicón tendrá un sistema de replicación, permitiendo así que sea mantenido en un hospedante procariótico para la expresión o para la clonación y amplificación. Además, un replicón puede ser un plásmido con un número de copias elevado o bajo. Un plásmido con un número de copias elevado tendrá generalmente un número de copias que varía en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 200, y habitualmente aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedante que contenga un plásmido con un número de copias elevado contendrá preferentemente al menos aproximadamente 10 y, más preferentemente, al menos aproximadamente 20 plásmidos. Puede ser seleccionado un vector con un número de copias elevado o bajo, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña en el hospedante.

Alternativamente, los constructos de expresión pueden ser integrados en el genoma bacteriano con un vector de integración. Los vectores de integración contienen habitualmente al menos una secuencia homólogoa al cromosoma bacteriano, que permite que se integre el vector. Las integraciones parecen resultar de recombinaciones entre DNA homólogo en vector y el cromosoma bacteriano. Por ejemplo, los vectores de integración construidos con DNA de diversas cepas de bacillus se integran en el cromosoma de Bacillus (publicación de patente Europea nº 127328). Los vectores de integración pueden estar comprendidos también por secuencias de bacteriófagos transposon.

Habitualmente, los constructos de expresión extracromosomales e integrantes pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas bacterianas que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden ser expresados en el hospedante bacteriano y pueden incluir genes que hagan las bacterias resistentes a fármacos como ampicilina, cloranfenicol, eritromicina, kanamisina (neomisina) y tetraciclina (Davies et al., Ann. Rev. Microbiol., 32: 469, 1978). Los marcadores seleccionables pueden incluir también genes biosintéticos, como los de las trayectorias biosintéticas de histidina, triptófano y leucina.

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos se pueden poner conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos habitualmente por un marcador seleccionable que es mantenido en un replicón o desarrollado en un vector de integración, como se describió anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosomales o vectores de integración, han sido desarrollados, entre otros, para las siguientes bacterias: B. subtilis (Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; publicaciones de patentes Europeas nº 036.259 y 063.953; publicación PCT nº WO 84/04541), E. coli (Shimatake et al., Nature, 292: 128, 1981; Amann et al., Gene, 40: 183, 1985; Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113, 1986; publicaciones de patentes Europeas nº 036.776, 136.829 y 136.907), Streptococcus cremoris (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 655, 1988); Streptococcus lividans (Powell et al., Appl. Environ. Microbiol., 54: 655, 1988), y Streptomyces lividans (patente de EE.UU. nº 4.745.056).

Los métodos para introducir DNA exógeno en hospedantes bacterianos son bien conocidos en la técnica e incluyen habitualmente la transformación de bacterias tratadas con CaCl_{2} u otros agentes, como cationes divalentes y DMSO. Puede ser introducido también DNA en células bacterianas por electroporación. Los procedimientos de transformación varían habitualmente con la especie bacteriana que va a ser transformada (véase, por ejemplo, Masson et al., FEMS Microbiol. Lett., 60: 273, 1989; Palva et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5582, 1982; publicaciones de patentes Europeas nº 036.259 y 063.953; publicación PCT nº WO 84/04541 [Bacillus], Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 856, 1988; Wang et al., J. Bacteriol., 172: 949, 1990 [Campylobacter], Cohen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110, 1973; Dower et al., Nuc. Acids Res., 16: 6127, 1988; Kushner, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1derived plasmids", en: Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (eds. H.W. Boyer and S. Nicosia), 1978; Mandel et al., J. Mol. Biol., 53: 159, 1970; Taketo, Biochim. Biophys. Acta, 949: 318, 1988 [Escherichia], Chassy et al., FEMS Microbiol. Lett., 44: 173, 1987 [Lactobacillus], Fiedler et al., Anal. Biochem, 170: 38, 1988 [Pseudomonas], Augustin et al., FEMS Microbiol. Lett., 66: 203, 1990 [Staphylococcus], Barany et al., J. Bacteriol., 144: 698, 1980; Harlander, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", en: Streptococcal Genetics (ed. J. Ferretti and R. Curtiss III), 1987; Perry et al., Infec. Immun., 32: 1295, 1981; Powell et al., Appl. Environ. Microbiol. 54: 655, 1988; Somkuti et al., Proc. 4th Eur. Cong. Biotechnology, 1: 412, 1987 [Streptococcus]).

iv. Expresión de levaduras

Los sistemas de expresión de levaduras son también conocidos por un experto ordinario en la técnica. Un promotor de levaduras es cualquier secuencia de DNA capaz de unirse a RNA polimerasa de levadura e iniciar la transcripción en dirección descendente (3') de una secuencia codificadora (por ejemplo, gen estructural) en mRNA. Un promotor tendrá una región de inicio de la transcripción que es colocada habitualmente proximal respecto al extremo 5' de la secuencia codificadora. Esta región de inicio de la transcripción incluye habitualmente un sitio de unión de RMA polimerasa (la "caja TATA") y un sitio de inicio de la transcripción. Un promotor de levadura puede tener también un segundo dominio denominado una secuencia activadora en dirección ascendente (UAS) que, si está presente, es habitualmente distal respecto al gen estructural. La UAS permite una expresión regulada (indecible). La expresión constitutiva se produce en ausencia de una UAS. La expresión regulada puede ser positiva o negativa, aumentando o reduciendo así la transcripción.

La levadura es un organismo de fermentación con una trayectoria metabólica activa, por lo tanto, las enzimas que codifican secuencias en la trayectoria metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen alcohol deshidrogenasa (ADH) (publicación de patente Europea nº 284.044), enolasa, glucoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAP o GAPDH), hexoquinasa, fosfofructoquinasa, 3-fosfoglicerato mutasa, y piruvato quinasa (PyK) (publicación de patente Europea nº 329.203). El gen PHOS de levadura, que codifica fosfatasa ácida, proporciona también secuencias promotoras útiles (Myanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 1, 1983).

Además, los promotores sintéticos que no se producen en la naturaleza funcionan también como promotores de levaduras. Por ejemplo, las secuencias UAS de un promotor de levadura pueden estar unidas con la región de activación de la transcripción de otro promotor de levadura, creando un promotor híbrido sintético. Ejemplos de estos promotores híbridos sintéticos incluyen la secuencia reguladora de ADH unida a la región de activación de la transcripción de GAP (patentes de Estados Unidos nº 4.876.197 y 4.800.734). Otros ejemplos de promotores híbridos incluyen promotores que consisten en las secuencias reguladoras de los genes ADH2, GAL4, GAL10, o PHO5, combinados con la región de activación transcripcional de un gen de enzima glicolítica como GAP o PyK (publicación de patente Europea nº 164.556). Además de ello, un promotor de levadura puede incluir promotores que se producen de forma natural de origen que no es de levadura que tienen la capacidad de unirse a RNA polimerasa de levadura e iniciar la transcripción; ejemplos de estos promotores incluyen, entre otros, Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1078, 1980; Henikoff et al., Nature, 283: 835, 1981; Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96: 119, 1981; Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", en: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (eds. K.N. Timmis and A. Puhler), 1979; Mercerau-Puigalon et al., Gene, 11: 163, 1980; Panthier et al., Curr. Genet., 2: 109, 1980.

Una molécula de DNA puede ser expresada intracelularmente en levadura. Una secuencia promotora puede estar directamente unida con la molécula de DNA, en cuyo caso el primer aminoácido en el N terminal de la proteína recombinante será siempre una metionina, que es codificada por el codon de inicio de ATG. Si se desea, la metionina en el N terminal puede ser escindida de la proteína mediante incubación in vitro con bromuro de cianógeno.

Las proteínas de fusión proporcionan una alternativa para sistemas de expresión de levaduras, así como en sistemas de expresión de mamíferos, baculovirus y bacterianos. Habitualmente, una secuencia de DNA que codifica la parte terminal en N de una proteína de levadura endógena, u otra proteína adecuada, es fusionada al extremo en 5' de las secuencias codificadoras heterólogas. Tras la expresión, este constructo proporcionara una fusión de las dos secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, el gen de superóxido dismutasa humano (SOD) puede estar conectado en la terminación en 5' de un gen extraño y expresado en levadura. La secuencia de DNA en la unión de las dos secuencias de aminoácidos puede codificar o no codificar un sitio escindible (véase, por ejemplo, la publicación de patente Europea nº 196.056). Otro ejemplo es una proteína de fusión de ubiquitina. Esta proteína de fusión es preparada con la región de ubiquitina que retiene preferentemente un sitio para una enzima de tratamiento (por ejemplo, proteasa que trata específicamente ubiquitina) para escindir la ubiquitina de la proteína extraña. Por lo tanto, mediante este método, puede ser aislada proteína extraña nativa (véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 88/024066).

Alternativamente, las proteínas extrañas pueden ser también secretadas a partir de la célula en el medio de crecimiento creando moléculas de DNA quiméricas que codifiquen una proteína de fusión comprendida por un fragmento de secuencia líder, que proporcione la secreción en levadura de la proteína extraña. Preferentemente, hay sitios de tratamiento codificados entre el fragmento líder y el gen extraño que pueden ser escindidos in vivo o in vitro. El fragmento de secuencia líder codifica habitualmente un péptido de señal comprendida por aminoácidos hidrófobos que dirigen la secreción de la proteína desde la célula.

Las secuencias de señales adecuadas que codifican DNA pueden ser derivadas de genes para proteínas de levaduras secretadas, como el gen de invertasa de levadura (publicación de patente Europea nº 012.873; publicación de patente Japonesa nº 62.096.086) y el gen del factor A (patente de EE.UU. nº 4.588.684). Alternativamente, existen también líderes de origen no de levadura, como un líder de interferón, que proporcionan también la secreción en levadura (publicación de patente Europea nº 060.057).

Una clase preferida de líderes de secreción son los que emplean un fragmento del gen de factor alfa de levadura, que contiene tanto la secuencia de señal "pre" como una región "pro". Los tipos de fragmentos de factor alfa que pueden ser empleados incluyen el líder de factor alfa per-pro de longitud completa (aproximadamente 83 residuos de aminoácidos) así como los líderes de factor alfa truncados (habitualmente de forma aproximada 25 a aproximadamente 50 residuos de aminoácidos) (patentes de EE.UU. nº 4.546.083 y 4.870.008; publicación de patente Europea nº 324.274). Líderes adicionales que emplean un fragmento que líder factor alfa que proporciona la secreción incluyen líderes de factor alfa preparados con una presecuencia de una primera levadura, pero una pro-región de un factor alfa de un segundo factor alfa de levadura (véase, por ejemplo, la publicación PCT nº WO 89/02463).

Habitualmente, las secuencias de terminación de la transcripción reconocidas por la levadura son regiones reguladoras situadas en 3' respecto al codon de terminación de la traducción y, por tanto, junto con el promotor, flanquean la secuencia codificadora. Estas secuencias dirigen la transcripción de un mRNA que puede ser traducido en el polipéptido codificado por el DNA. Los ejemplos de secuencia terminadora de la transcripción y otras secuencias de terminación reconocidas por levaduras, como las que codifican enzimas glicolíticas, son bien conocidos.

Habitualmente, los componentes anteriormente descritos, que comprenden un promotor, líder (si se desea), secuencia codificadora de interés y secuencia de terminación de la transcripción, son puestos con conjuntamente en constructos de expresión. Los constructos de expresión son mantenidos a menudo en un replicón, como un elemento extracromosomal (por ejemplo, plásmido) capaz de un mantenimiento estable en un hospedante, como una levadura o bacteria. El replicón puede tener dos sistemas de replicación, permitiendo así que sea mantenido, por ejemplo, en la levadura para la expresión y en un hospedante procariótico para la clonación y amplificación. Ejemplos de estos vectores de lanzamiento de levaduras-bacterias incluyen YEp24 (Botstein, et al., Gene, 8: 17-24, 1979), pCl/1 (Brake, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 4642-4646, 1984), y YRpl7 (Stinchcomb, et al., J. Mol. Biol., 158: 157, 1982). Además, un replicón puede ser un plásmido de número de copias elevado o bajo. Un plásmido de número de copias elevado tendrá generalmente un número de copias que varía en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 y habitualmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 150. Un hospedante que contiene un plásmido de número de copias elevado tendrá preferentemente al menos aproximadamente 10, y más preferentemente al menos aproximadamente 20. Puede ser seleccionado un vector de número de copias elevado o bajo, dependiendo del efecto del vector y la proteína extraña sobre el hospedante (véase, por ejemplo, Brake et al., supra).

Alternativamente, los constructos de expresión pueden ser integrados en el genoma de levadura con un vector de integración. Los vectores de integración contienen habitualmente al menos una secuencia homóloga a un cromosoma de levadura que permite que el vector se integre y contienen preferentemente dos secuencias homólogas que flanquean el constructo de expresión. La integraciones parece que resultan de recombinaciones entre DNA homólogo en el vector y el cromosoma de levadura (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol., 101: 228-245, 1983). Un vector de integración puede ser dirigido a un lugar específico en una levadura seleccionando la secuencia homóloga apropiada para la inclusión en el vector (véase Orr-Weaver et al., supra). Uno o más constructos de expresión pueden integrar posiblemente niveles de afectación de proteína recombinante producida (Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 6750, 1983). Las secuencias cromosomales incluidas en el vector se pueden producir como un único segmento en el vector, lo que da lugar a al integración en el vector completo, o dos segmentos homólogoos a segmentos adyacentes en el cromosoma y que flanquean el constructo de expresión en el vector, lo que da lugar a la integración estable solamente del constructo de expresión.

Habitualmente, los constructos de expresión extracromosomales y de integración pueden contener marcadores seleccionables para permitir la selección de cepas de levaduras que han sido transformadas. Los marcadores seleccionables pueden incluir genes biosintéticos que pueden ser expresados en el hospedante de levadura, como ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, y ALG7, y el gen e resistencia G418, que confiere resistencia en células de levaduras a tunicamicina y G418, respectivamente. Además, un marcador seleccionable adecuado puede proporcionar también una levadura con la capacidad de crecer en presencia de compuestos, como metales. Por ejemplo, la presencia de CUP1 permite que la levadura crezca en presencia de iones de cobre (Butt et al., Microbiol. Rev., 51: 351, 1987).

Alternativamente, algunos de los componentes anteriormente descritos pueden ser puestos conjuntamente en vectores de transformación. Los vectores de transformación están comprendidos habitualmente por un marcador seleccionable que es mantenido en un replicón o desarrollado en un vector de integración, como se describió anteriormente.

Los vectores de expresión y transformación, ya sean replicones extracromosomales o vectores de integración, han sido desarrollados para una transformación en muchas levaduras. Por ejemplo, han sido desarrollados vectores de expresión, entre otras, para las siguientes levaduras: Candida albicans (Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6: 142, 1986), Candida maltose (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132: 3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202: 302, 1986), Kluyveromyces fragilis (Das et al., J. Bacteriol., 158: 1165, 1984), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154: 737, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135, 1990), Pichia guillerimondii (Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985), Pichia pastoris (Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3376, 1985; U.S. Patent Nos. 4.837.148 y 4.929.555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol., 153: 163, 1983), Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 300: 706, 1981) y Yarrowia lipolytica (Davidow et al., Curr. Genet., 10: 39, 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet., 10: 49, 1985).

Los métodos para introducir DNA exógeno en hospedantes de levaduras son bien conocidos en la técnica, e incluyen habitualmente la transformación de esferoplastos o de células de levaduras intactas tratadas con cationes alcalinos. Los procedimientos de transformación habitualmente varían con las especies de levaduras que van a ser transformadas (véase, por ejemplo, Kurtz et al., Mol. Cell. Biol., 6: 142, 1986; Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985 [Candida], Gleeson et al., J. Gen. Microbiol., 132: 3459, 1986; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet., 202: 302, 1986 [Hansenula], Das et al., J. Bacteriol., 158: 1165, 1984; De Louvencourt et al., J. Bacteriol., 154: 737, 1983; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8: 135, 1990 [Kluyveromyces], Cregg et al., Mol. Cell. Biol., 5: 3376, 1985; Kunze et al., J. Basic Microbiol., 25: 141, 1985; U.S. Patent Nos. 4.837.148 y 4.929.555 [Pichia], Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 1929, 1978; Ito et al., J. Bacteriol., 153: 163, 1983 [Saccharomyces], Beach y Nurse, Nature, 300: 706, 1981 [Schizosaccharomyces] y Davidow et al., Curr. Genet., 10: 39, 1985; Gaillardin et al., Curr. Genet., 10: 49, 1985 [Yarrowia]).

La presente invención se ilustrara seguidamente a modo de ejemplo con referencia a las siguientes figuras:

La Fig. 1A es un mapa de restricción lineal de cassette integrativo para la inserción del cassette de expresión YIpex en el lugar cromosomal ADE2 de S. cerevisiae, que muestra la dirección de transcripción de PDI desde el promotor GAL/CYC inducible (flecha blanca). Son mostrados los sitios de restricción.

La Fig. 1B es un mapa de restricción del cassette integrativo para la inserción del mismo cassette de expresión expuesto en la Fig. 1A en el lugar cromosomal LYS2 de S. cerevisiae.

La Fig. 1C es un mapa de restricción del cassette integrativo LYS2 que contiene la secuencia codificadora TRX2 de S. cerevisiae en insertada en el cassette de expresión.

La Fig. 1D es un mapa de restricción del cassette integrativo LYS2 que contiene la secuencia codificadora TEX2 de S. cerevisiae insertada en el cassette de expresión fusionado en un marco con la secuencia del péptido de señal de YEpsecl.

La Fig. 2A muestra un análisis por transferencia Northern de RNA extraído de cepas de S. cerevisiae que portan inserciones cromosomales del gen PDI usando una sonda específica para PDI. Las cabezas de las flechas indican el trascripto del gen endógeno (PDI) y los constructos de PDI integrados (::PDI).

La Fig. 2B muestra RNA extraído de cepas de S. cerevisiae que portan inserciones cromosomales del gen TRX2 y el plásmido Y-E2_{715} hibridado a una sonda específica para TRX2 (panel superior) y una sonda específica para E_{715} de HCV (panel inferior). Las cabezas de las flechas indican el trascripto del gen endógeno (TRX2), de los constructos de TRX2 integrados (::TRX2) y del cDNA de E2_{715} de HCV clonado en YEpsecl (Y-E2_{715}).

La Fig. 3 es muestra un análisis por transferencia Western de proteínas solubles de extractos celulares de cepas de levaduras modificadas que expresan E2_{715} de HCV usando un anticuerpo monoclonal anti-E2 (mAb). Las proteínas fueron separadas mediante SDS-PAGE en presencia (+ DTT) o en ausencia (- DTT) de un agente reductor.

La Fig. 4 muestra un análisis de transferencia de puntos de E2_{715} (10 \mug/punto) purificado por afinidad a partir de las cepas de levaduras modificadas. Una proteína mAb para E2_{715} de HCV expresada en células de insecto (3E5-1), un antisuero de chimpancé frente a E1E2 de HCV co-purificada a partir de células de HeLa (L559) (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12941298, 1994)y tres mAbs conformacionales específicos anti-E2_{715} (291A2, 5E5-H7, 6A1) (Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759-1763, 1996) son usados para la inmunotrasferencia.

La Fig. 5 muestra análisis de fluorescencia unida a células de MOLT-4 preincubadas con formas diferentes de proteína de E2 de HCV expresada por cepas de levaduras modificadas y células de CHO. Las células de MOLT-4 preincubadas son incubadas con mAb anti-E2, después de incubar con IgG de fragmento marcado fluorescente F(ab')2, la unión a células dianas es indirectamente detectada mediante citometría de flujo en forma de fluorescencia unida a las células (número de células relativas (eje y) frente a intensidad media de la fluorescencia (eje x)). Células de MOLT-4 preincubadas (sin proteínas de E2 de HCV) son el testigo negativo.

Ejemplos Cepas, plásmidos y medios

Una descripción de las cepas y plásmidos usados se presenta en la Tabla 1 y en las figuras 1A-D. Las figuras 1A a 1D exponen esquemáticamente los cassettes integrativos usados para las modificaciones.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Cepas de S. cerevisiae. Los compartimentos blancos representan las secuencias cromosomales de S. cerevisiae ade2 (Fig. 1A) y lys2 (Fig. 1B-D) usadas para la integración en los lugares cromosomales homólogos. Los marcadores genéticos usados para la selección de integrantes (HIS3 y TRP1) son mostrados en forma de flechas oscuras, mientras que las flechas blancas (GAL/CYC) indican la secuencia promotora. El compartimento oscuro (term) representa secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de vectores de plásmidos no son mostradas.

La cepa de E. coli HB101 (F^{-} hsdS2O recA13 ara-14 proA2 lacYl galK2 rpsL20 xyl-5 metl-l supE44) fue usada para las construcciones de plásmidos. La transformación de células de E. coli y el análisis de los plásmidos recombinantes se llevaron acabo como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989.

Las cepas de S. cerevisiae se hicieron crecer a 30ºC en un medio sintético que contenía 2% de fuente de carbono y 0,67% de base de nitrógeno de levadura (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) complementado con las aminoácidos necesarios (50 \mug/ml) o en medio completo que contenía 2% de glucosa (YPD) o galactosa (GalYP), 1% de extracto de levadura, 2% peptona y 0,3% KH_{2}PO_{4}.

Construcciones de plásmidos y manipulaciones genéticas

Las enzimas de restricción, T4 DNA ligasa y otras enzimas usadas para manipulaciones de DNA y RNA son obtenidas de la empresa New England Biolabs (Hitchin, Reino Unido) o Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania). La amplificación por PCR de fragmentos específicos de DNA se realiza con un ciclador térmico Perkin Elmer (Norwalk, CT,USA) usando oligonucleótidos sintéticos. El secuenciado de DNA se lleva a cabo usando un secuenciador de DNA modelo 373 de Applied Biosystems (Norwalk, CT, USA). El DNA o RNA total en la levadura se extrae según procedimientos estándar (Sherman et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1983). Todas las demás manipulaciones de DNA se realizan como se describe por Sambrook et al., supra las cepas de S. cerevisiae se transformaron mediante el método de LiCl (Rothstein, en: DNA Cloning (Glover, D.M. ed.), Vol. 11, pp. 45-66, IRL Press, 1985).

Son construidos dos cassettes integrativos para insertar el cassette de expresión en dos lugares cromosomales diferentes de S. cerevisiae, LYS2 y ADE2. El plásmido integrativo YIpLyT (Tabla 1) es obtenido clonando un fragmento de por PCR de EcoRI-HindIII que comprende 1.318 bp del gen LYS2 de S. cerevisiae entre los sitios EcoRI y HindI de plásmido pUC8. El plásmido resultante pUC8-Lys (Tabla 1) contiene un único sitio BglII colocado entre la secuencia LYS2 que es usada para clonar el marcador TRP1 seleccionable de S. cerevisiae obtenido mediante amplificación por PCR del gen TRP1 de plásmido YRpl7. El plásmido integrativo YIpAH (Tabla 1) es construido insertando en los sitios EcoRI-PstI de pUC8 el fragmento de Xbal de 1,059 bp del gen ADE2 de S. cerevisiae amplificado mediante PCR añadiendo un sitio EcoRI en el extremo 5' y un sitio Pstl en el extremo en 3'. El marcador seleccionable de S. cerevisiae HIS3 es amplificado por PCR añadiendo sitios de restricción BamHI-Spel-Notl en el extremo en 5' y un sitio BamHI en el extremo en 3'. El producto de PCR digerido con HIS3 BamHI es clonado en el sitio único BgIII de pUC8-Ade para proporcionar plásmido YIpAH.

El plásmido pUC18yex que porta el cassette de expresión es construido clonando un fragmento de 1.238 bp Notl amplificado por PCR de YEpsec1 (Baldari et al., EMBO J., 6: 229-234, 1987; Galeotti et al., patente de EE.UU. 5.432.082, de 11 de julio de 1995), extendiendo el promotor hasta las secuencias terminadoras en el vector pUC18Not (Herrero et al., J. Bacteriol., 172: 6557-6567, 1990). La inserción de la secuencia que codifica S. cerevisiae PDI (LaMantia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4453-4457, 1991) en el cassette de expresión de pUCyex es obtenido clonando un fragmento por PCR de Sacl-Pstl en los sitios Sacl-Pstl de pUC18yex. Análogamente, la secuencia codificadora TRX2 de S. cerevisiae (Muller, J. Biol. Chem., 266: 9194-9202, 1991) es amplificada por PCR añadiendo un sitio Sacl próximal al codon ATG y un sitio SaiII distal del codon de terminación TGA y clonado en los sitios Sacl-Sall de pUC18yex. La versión sTRX del clon es obtenida sustituyendo el cebador Sacl-ATG PCR con un cebador Smal PCR que amplifica la secuencia codificadora TRX2 desde el segundo codon (TAG) en un marco con la secuencia del péptido de señal de pUC18yex, y clonando el fragmento por PCR en los sitios Smal-Sall de pUC18yex. Todos los clones de PCR son secuenciados después de clonar en el plásmido pUC18yex.

El vector Ylpex2-PDI (Fig. 1A) es obtenido insertando el fragmento Notl-Xbal de pUC18yex que contiene el cassette de expresión de PDI en los sitios Notl-Spel de plásmido YIpAH (Tabla 1) con el fin de suprimir el sitio Xbal en el extremo en 3' del cassette de expresión y dejar solamente los sitios Xbal en las dos extremidades del cassette integrativo ADE2. La transformación de la cepa S150-2B con YIpex2-PDI digerido Xbal da lugar a la integración del cassette de expresión PDI en el lugar cromosomal ADE2 de la cepa S150-PA2 (Tabla 1).

La clonación del fragmento Notl de yex-PDI en el sitio Notl de YIpLyT (Tabla 1) da lugar a dos plásmidos que contienen el cassette de expresión PDI en orientación opuesta con respecto al lugar de integración de LYS2. El plásmido YIpexl-PDIA (Fig. 1B) tiene la misma orientación que YIpex2-PDI, mientras que en el plásmido YIpexl-PDIB en el inserto yex-PDI está en la orientación opuesta. La transformación de S. cerevisiae con YIpexl-PDIA/B se lleva a cabo usando un cassette integrativo restringido a SpeI. La cepa S150-PA1 (Tabla 1) es un integrante que porta la versión yex-PDIA, mientras que las cepas W303-PB1 y S150-PB1 (Tabla 1) resultan de la integración de yex-PDIB.

Los plámidos YIpexl-TRX2 y YIpexl-sTRX2 (Fig. 1C y 1D) son generados subclonando el fragmento NotI de pUC18yex-TRX y pUC18yex-sTRX respectivamente en el sitio NotI de pUC18yex. La orientación de los fragmentos clonados para producir integrantes de S. cerevisiae es la misma que la YIpex-PDIA. Los integrantes S150-X21 y SX2l-PA2 son obtenidos transformando cepas S150-2B y S150-PA2 (Tabla 1) con YIpexl-TRX2 digerido con SpeI, mientras que la transformación de Sl50-2B con YIpexl-sTRX2 genera integrante S150-sX21 (Tabla 1). Los diferentes integrantes de S. cerevisiae son posteriormente transformados con el plásmido YEpsecl-E2_{715} para la expresión de la glicoproteína de envoltura E2_{715} de HCV en levadura.

En un método similar, la cepa de levadura que (sobre)expresa PDI (Sl50-PA1, Tabla 1) ha sido usada también para obtener FIGF humano en una forma soluble. El mismo factor es insoluble cuando es expresado en la cepa de levadura de tipo salvaje (S150-2B).

Análisis de transcripción de los genes integrados

El RNA de diferentes integrantes crecidos bajo condiciones represoras (YPD) o inductoras (GalYP) es separado en un gel de formaldehído 2,2 M-1,2% de gel de agarosa, es transferido a una membrana de nitrocelulosa e hibridado a sondas específicas marcadas con P^{32} con el fin de determinar si el sitio de integración y/o la orientación del cassette de expresión ejercen influencia sobre las transcripción del PDI integrado o TRX2. El uso de una sonda específica de PDI para un análisis Northern de integrantes de PDI muestra que la transcripción del promotor inducible por galarosa de PDI integrado es correctamente regulado, es decir, reprimido mediante crecimiento en medio de glucosa (Fig. 2A). Además de ello, tanto la orientación de la unidad de transcripción como el sitio de integración ejercen una influencia sobre el nivel de transcripción. Una relación inferior entre el transcripto del PDI integrado y el del gen endógeno es observada en los integrantes que portan la orientación B(S150-PB1, W303-PB1) en lugar de la A(S150-PA1) del constructo, y la integración en ade2 (S150-PA2) conduce a una reducción incluso superior.

El análisis de la transcripción del cDNA de E2_{715} de HCV clonado en YEpsecl (Y-E2_{715}) en integrantes lys2::TRX2 y lys2::sTRX2 hechos crecer en GaIYP muestra que la inserción de un gen TRX2 regulado por galactosa en estas cepas no ejerce ninguna influencia sobre el nivel de mRNA de E2_{715}, incluso aunque la expresión de ambos genes requiera los mismos factores de transcripción (Fig. 2B).

La sobreexpresión de PDI y TRX2 facilita el plegamiento de E2_{715} de HCV en S. cerervisiae

Se preparan extractos celulares a partir de cultivos de levaduras descomponiendo células con gránulos de vidrio en un homogeneizador Braün (B. Braün Melsungen AG, Melsungen, Alemania) durante 20 s a 4ºC. Después de la descomposición, las suspensiones celulares son diluidas en PBS y purificadas por afinidad (véase con posterioridad). Las muestras de proteínas son analizadas mediante electroforesis sobre gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) como se describe por Laemmli (Laemmli, Nature, 227: 680-685, 1970) en tampón LSB (2% de SDS, 10% de glicerol, DTT 200 mM, Tris HCl 62,5 mM, pH 6,8) y transferidas a una membrana de nitrocelulosa (Nitrobind, MSI, Westborough, MA, USA) (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354, 1979). La membrana es incubada en un tampón que contiene PBS, 3% de polvo lácteo y 0,1% de Triton. Se usan para la inmunotransferencia un anticuerpo monoclonal (mAb) para un epitopo lineal de proteína E2_{715} de HCV expresada en células de insectos (3E51), dos mAbs conformacionales (291A2 y 5E5-H7) y un antisuero de chimpancé frente a E1E2 de HCV co-purificado a partir de células HeLa (L559) (Choo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 1294-1298, 1994; Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759-1763, 1996). Las inmunotransferencias son reveladas con quimioluminiscencia aumentada (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA).

La E2_{715} de HCV es purificada a partir de cultivos de levaduras mediante cromatografía de afinidad usando una columna de lecitina (lecitina de agarosa Galanthus nivalis (GNL); el GNL particular disponible en el comercio usad fue GNA, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). La columna es equilibrada con PBS a 40 cm/h, lavada con NaCl 0,9 M en PBS y la glicoproteína es eluida usando a-metil-D-manósido 1 M, NaCl 0,9 M en PBS. Las fracciones de la columna son dializadas frente a PBS, las concentraciones de proteínas son determinadas usando el método de Lowry (Bio-Rad DC Protein Assay, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) y analizadas mediante dot-blot con anticuerpos monoclonales anti-E2.

Los análisis por transferencia Western de proteínas purificadas por afinidad de extractos celulares de integrantes lys2::TRX2, lys2::PDI, lys2::TRX2-ade2::PDI que expresan E2_{715} de HCV ponen de manifiesto que una proporción de la glicoproteína E2_{715} puede entrar en el gel de separación en ausencia de DTT solamente en muestras de integrantes que sobreexpresan PDI. La cantidad relativa de glicoproteína que entra en el gel sin un agente reductor parece que es incluso mayor en la muestra del integrante doble SX21-PA2 (Fig. 3).

La inmunotransferencia de E2_{715} sin desnaturalizar de las diferentes cepas de levaduras muestra que la glicoproteína purificada a partir del integrante de PDI se une al 5E5-H7 y, en una menor medida, a los anticuerpos conformacionales 291A2 (Fig. 4).

Formas diferentes de proteína E2 de HCV expresadas en cepas de levaduras modificadas se unen a células MOLT-4

La proteína E2 de HCV es expresada en la naturaleza en células de mamíferos y se une a células humanas con una afinidad elevada. Para investigar si las proteínas E2 expresadas en levaduras modificadas tienen una actividad biólogica similar y pueden unirse a células humanas, células de la línea de linfoma de células T humanas, MOLT-4, son incubadas a 4ºC con diferentes formas de proteína E2 expresada en levadura modificada (8,7 \mug/ml). Como un testigo positivo, se usa proteína E2 expresada en CHO a la misma concentración. Como un testigo negativo, las células MOLT-4 son incubadas en ausencia de proteínas E2. Posteriormente, el sedimento celular es incubado con mAb surgido frente a E2. Después de una incubación con IgG anti-ratón de cabra de fragmento F(ab')_{2} marcado con ficoeritrina, la unión a células dianas es indirectamente detectada mediante citometría de flujo en forma de fluorescencia unida a las células (Fig. 5).

Como se muestra en la Figura 5, las células MOLT-4 preincubadas con proteína E2 de HCV expresada en CHO (E2 CHO GNL) tienen la intensidad de fluorescencia media más elevada (M = 133,78) en comparación con las células MOLT-4 preincubadas con proteínas E2 expresadas en levadura modificada (M = 26,24 (E2 Yeast PDI GNL); M = 5,32 (E2 Yeast TRX GNL)). Sin embargo, las células MOLT-4 preincubadas con proteína E2 expresada en levadura modificada, no obstante, tienen una mayor intensidad de la fluorescencia media que las células MOLT-4 preincubadas sin proteínas E2 (M = 3,97 (-ve/testigo)).

La unión de las diferentes formas de proteína E2 a las células MOLT-4 está influenciada por la estructura de las proteínas. La proteína E2 expresada en CHO tiene enlaces de disulfuro apropiadamente formados y, por lo tanto, está correctamente plegada y es biológicamente activa. La consecuencia de esto es una elevada afinidad de unión de la proteína E2 expresada en CHO por las superficies celulares de las células MOLT-4, dando lugar a una elevada intensidad media de la fluorescencia. Análogamente, las proteínas E2 expresadas en levaduras modificadas parece también que son biológicamente activas ya que se unen a células MOLT-4, dando lugar así a una mayor intensidad media de la fluorescencia en comparación con el testigo negativo.

Aunque la intensidad media de la fluorescencia (y, por lo tanto, la afinidad de unión por células MOLT-4) es inferior para as proteínas E2 expresadas en levaduras modificadas en comparación con la proteína E2 expresada en CHO, la proteína E2 en levadura no modificada (es decir, expresada en células de levaduras sin co-expresión de PDI o TRX) es incapaz de unirse a células MOLT-4 (véase Rosa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 1759-1763, 1996; particularmente las líneas 16 a 18 del párrafo de Resultados en la pagina 1760 y la Fig. 1). Por tanto, el sistema de expresión del hospedante modificado de la presente invención puede producir proteínas heterólogas de una actividad biológica y/o estructura similares a las proteínas nativas producidas por sus hospedantes naturales.

Claims

1. Un procedimiento para obtener proteínas(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante, que comprende purificar dicha(s) proteínas(s) heteróloga(s) a partir del extracto celular de un organismo hospedante en el cual

(a) dicho organismo hospedante es transformado in vitro con un vector que comprende

(i) un cassette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuro, en el que dicha proteína es una proteína disulfuro isomerasa (PDI) o tioredoxina (TRX);

(ii) un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) una o más proteínas heterólogas, y

(b) El organismo hospedante de la etapa (a) es cultivado en condiciones adecuadas para la expresión de una o más proteínas heterólogas; y

(c) dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) es/son purifi-
cada(s) a partir del extracto celular del organismo hospedante,

en donde dicho organismo hospedante es una especie microbiana eucariótica, una célula de insecto o una célula de mamífero.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha(s) una o más proteína(s) heteróloga(s) no forma(n) proteína(s) de fusión con dicha TRX.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el vector comprende adicionalmente secuencia(s) de DNA que codifica(n) uno o más péptidos líderes para la secreción al ER y/o otros compartimentos secretores.

4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, la en el que la proteína heteróloga es glicoproteína de envoltura E2_{715} del virus de la hepatitis C (HCV) o factor de crecimiento humano inducido por c-fos (FIGF).

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el vector es capaz de una integración en el genoma de un organismo hospedante.

6. Un procedimiento para obtener proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante, que comprende purificar dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) a partir del extracto celular de un organismo hospedante, en el cual

(a) dicho organismo hospedante es transformado in vitro con

(i) uno o más de los vectores definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y/o

(ii) uno o más vectores que comprenden un cassette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica una proteína capaz de catalizar la formación de enlaces de disulfuro, en que dicha proteína es proteína disulfuro isomerasa (PDI) o tioredoxina (TRX); y

(c) dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) es/son purifi-
cada(s) a partir del extracto celular del organismo hospedante; y

en el que cuando dicho organismo hospedante es transformado según (a) (ii), dicho organismo hospedante es adicionalmente transformado con uno o más vectores que comprenden un cassette de expresión que comprende secuen-
cia(s) de DNA que codifica(n) dicha(s) una o más proteínas heterólogas; y

en el que cuando dicho organismo hospedante es transformado con uno o más vectores que comprenden un casette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica TRX, dichas una o más proteínas heterólogas no forman proteína(s) de fusión con dicha TRX; y

en el que dicho organismo hospedante es una especie microbiana eucariótica, una célula de insecto o una célula de mamífero.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha transformación adicional se lleva a cabo de forma posterior o simultánea.

8. Un procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, en el que dicha transformación adicional se lleva a cabo con un vector que comprende un cassette de expresión que comprende secuencia(s) de DNA que codifica(n) glicoproteína de envoltura E2_{715} del virus de la hepatitis C (HCV) o FIGF humano.

9. Un procedimiento para a preparación de una composición inmunogénica que comprende:

A) obtener proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en un organismo hospedante no humano, que comprende purificar dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) del extracto celular de un organismo hospedante no humano, en donde

(a) dicho organismo hospedante es transformado in vitro con

en el que cuando dicho organismo hospedante es transformado según (a)(ii), dicho organismo hospedante es adicionalmente transformado con uno o más vectores que comprenden un cassette de expresión que comprende secuen-
cia(s) de DNA que codifica(n) dicha(s) una o más proteínas heterólogas;

en el que cuando dicho organismo hospedante es transformado con uno o más vectores que comprenden un casette de expresión que comprende una secuencia de DNA que codifica TRX, dicha(s) una o más proteínas heterólogas no forman proteína(s) de fusión con dicha TRX; y

B) poner dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) obtenida(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente un adyuvante;

en el que dicha(s) proteína(s) heteróloga(s) biológicamente activa(s) y/o correctamente estructurada(s) es/son glicoproteína(s) de envoltura de E2_{715} de HCV o FIG humano.