ES2286845T3

ES2286845T3 - Microparticulas para suministrar acidos nucleicos.

Info

Publication number: ES2286845T3
Application number: ES98904700T
Authority: ES
Inventors: Mary Lynne Hedley; Joanne M. Curley; Robert S. Langer; Lynn B. Lunsford
Original assignee: MGI Pharma Biologics Inc
Current assignee: MGI Pharma Biologics Inc
Priority date: 1997-01-22
Filing date: 1998-01-22
Publication date: 2007-12-01
Anticipated expiration: 2018-01-22
Also published as: WO1998031398A1; ATE359831T1; EP1005374A4; EP1837017A3; PT1005374E; DE69837602T2; JP2001509178A; EP1005374B1; EP1005374A1; EP1837017A2; JP2009261411A; DE69837602D1; AU724294B2; DK1005374T3; CA2278450A1; AU6250698A

Abstract

Una preparación de micropartículas, cada una de las cuales incluye una matriz polimérica y un ácido nucleico, matriz polimérica que consiste en uno o más polímeros sintéticos que tienen una solubilidad en agua de menos que 1 mg/L, en la que: Al menos 90% de las micropartículas tienen un diámetro menor que 100 micrómetros; y El ácido nucleico es un vector de expresión que consiste en moléculas circulares de DNA de un plásmido, al menos 50% de las cuales están superenrrolladas.

Description

Micropartículas para suministrar ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a métodos para suministrar ácidos nucleicos a las células.

La terapia génica es una técnica altamente prometedora para el tratamiento de enfermedades hereditarias, por ejemplo, la fibrosis cística. La terapia génica también puede usarse cuando se desea la expresión en la célula huésped de productos derivados de genes desde genes que no se encuentran en la naturaleza, por ejemplo, desde genes que codifican proteínas citotóxicas fijadas como diana para que se expresen en células cancerígenas.

La terapia génica se divide en varias categorías. Algunas veces es deseable reemplazar un gen defectuoso durante toda la vida de un mamífero, como en el caso de una enfermedad heredada tal como la fibrosis cística, fenilcetonuria, o la enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID). En otros casos, puede desearse tratar a un mamífero con un gen que exprese un polipéptido terapéutico durante un periodo de tiempo limitado, por ejemplo durante una infección. Los ácidos nucleicos, en forma de ribozimas u oligonucleótidos antisentido, también pueden usare terapéuticamente. Por otra parte, los polipéptidos codificados por ácidos nucleicos pueden ser agentes estimuladores efectivos de la respuesta inmune en mamíferos.

Para introducir genes en las células se han usado varias técnicas, que incluyen infección con vectores víricos, transferencia biolística, inyección de DNA "puro" (patente de EE.UU. nº 5.580.859), y suministro vía liposomas o partículas poliméricas.

En el documento WO 9524929 se fabrican plásmidos encapsulados de DNA superenrrollado circular en un procedimiento que comprende la separación con disolventes.

Sumario de la invención

La invención se basa en el descubrimiento de que pueden fabricarse micropartículas que contengan ácidos nucleicos que tengan un tamaño apropiado para la fagocitosis sin afectar adversamente a la integridad de los ácidos nucleicos. Estas micropartículas son vehículos muy efectivos para el suministro de polinucleótidos a las células
fagocíticas.

En general, la invención caracteriza una preparación de micropartículas (también llamadas microesferas), cada una de las cuales incluye una matriz polimérica y un vector de expresión de ácidos nucleicos. La matriz polimérica incluye uno o más polímeros sintéticos que tienen una solubilidad en agua de menos que aproximadamente 1 mg/L; en el contexto presente, sintético se define como que no se encuentra en la naturaleza. Al menos 90% de las micropartículas tienen un diámetro menor que aproximadamente 100 micrómetros. El ácido nucleico es RNA, al menos 50% (y preferiblemente al menos 70% o incluso 80%) del cual está en forma de círculos cerrados, o moléculas circulares de DNA de plásmidos, al menos 25% (y preferiblemente al menos 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, o incluso 80%) de las cuales están superenrrolladas. En algunos casos, es deseable que al menos el 90% de las micropartículas tengan un diámetro menor que aproximadamente 20 micrómetros, y preferiblemente menos que aproximadamente 11 micrómetros. El ácido nucleico puede distribuirse a lo largo de toda la micropartícula o puede estar en el núcleo de una micropartícula de núcleo hueco.

La preparación también puede incluir un compuesto estabilizante (por ejemplo, un hidrato de carbono, un compuesto catiónico o un agente de condensación con el DNA). Un compuesto estabilizante es un compuesto que actúa para proteger al ácido nucleico (por ejemplo, para mantenerlo superenrrollado) en cualquier momento durante la producción de micropartículas. Ejemplos de compuestos estabilizantes incluyen dextrosa, sacarosa, dextrano, poli(alcohol vinílico), ciclodextrina, sulfato de dextrano, péptidos catiónicos y lípidos tales como bromuro de hexadeciltrimetilamonio. El compuesto estabilizante puede permanecer asociado con el DNA después de una liberación posterior desde de la matriz polimérica.

Otra realización de la invención caracteriza una micropartícula de un diámetro menor que aproximadamente 20 micrómetros, que incluye una matriz polimérica y un ácido nucleico. La matriz polimérica se fabrica de uno o más polímeros sintéticos que tengan una solubilidad en agua menor que aproximadamente 1 mg/L. Al menos 50% (y preferiblemente al menos 70% o incluso más) de las moléculas del ácido nucleico están en forma de DNA
superenrrollado.

La matriz polimérica puede ser biodegradable. En la presente memoria biodegradable se usa con el significado de que los polímeros se degraden con el tiempo para dar compuestos que se sabe se desprenden de las células huésped mediante las rutas metabólicas normales. En general, un polímero biodegradable será metabolizado sustancialmente antes de aproximadamente 1 mes después de la inyección a un paciente, y con seguridad antes de aproximadamente 2 años. En ciertos casos, la matriz polimérica puede fabricarse de un único copolímero sintético biodegradable, por ejemplo poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA). La relación de ácido láctico a ácido glicólico en el copolímero puede estar dentro del intervalo de aproximadamente 1:2 a aproximadamente 4:1 en peso, preferiblemente dentro del intervalo de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 2:1 en peso, y mucho más preferiblemente aproximadamente 65:35 en peso. En algunos casos, la matriz polimérica también incluye una molécula que fija la diana tal como un ligando, un receptor o un anticuerpo, para aumentar la especificidad de la micropartícula por un tipo de célula o de tejido dado.

Para ciertas aplicaciones, la micropartícula tiene un diámetro de menos que aproximadamente 11 micrómetros. La micropartícula puede suspenderse en una disolución acuosa (por ejemplo, para la administración por inyección) puede estar en la forma de un sólido seco (por ejemplo, para almacenar o administrar vía inhalación o implantación). El ácido nucleico puede ser una secuencia de control de expresión operativamente unida a una secuencia de codificación. Las secuencias de control de expresión incluyen, por ejemplo, cualquier secuencia de ácido nucleico que se sabe regula la transcripción o la traslación, tales como promotores, potenciadores o silenciadores. En los ejemplos preferidos, al menos 60% ó 70% del DNA está superenrrollado. Más preferiblemente, al menos 80% está
superenrrollado.

En otra realización, la invención caracteriza una micropartícula de un diámetro menor que aproximadamente 20 micrómetros, que incluye una matriz polimérica y una molécula de ácido nucleico (preferiblemente en forma cerrada, circular), en la que la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de control de expresión operativamente unida a una secuencia de codificación. El producto de expresión codificado por la secuencia de codificación puede ser un polipéptido de al menos 7 aminoácidos de longitud, que tiene una secuencia esencialmente idéntica a la secuencia de un fragmento de una proteína de un mamífero que se encuentra en la naturaleza o un fragmento de una proteína que se encuentra en la naturaleza de un agente que infecta o de cualquier otra manera daña a un mamífero; o un péptido que tiene una longitud y una secuencia que le permiten enlazarse a una molécula de MHC clase I ó II. En el documento WO 94/04171 se ponen de manifiesto ejemplos, que de este modo se incorporan a la presente memoria como
referencia.

En el contexto de una secuencia de DNA o de un polipéptido, en la presente memoria esencialmente idéntica se define para indicar que no difiere en más de un 25% de una secuencia que se encuentra en la naturaleza, cuando con la secuencia de referencia se hace el alineamiento más próximo posible y cuando las diferencias no afectan adversamente a la función deseada del DNA o del polipéptido en los métodos de la invención. La frase fragmento de una proteína se usa para indicar cualquier cosa menor que la proteína completa.

El péptido o polipéptido puede estar unido a una secuencia traficante. La expresión "secuencia traficante" se refiere a una secuencia se aminoácidos que provoca que un polipéptido al que está fusionada sea secretado de la célula o transportado a un compartimento específico de la célula, por ejemplo, el núcleo, el retículo endoplasmático, un lisosoma o un endosoma.

En la realización en la que el producto de expresión incluye un péptido que tiene una longitud y secuencia que le permite enlazarse a una molécula de MHC clase I ó II, el producto de expresión es típicamente inmunógeno. El producto de expresión puede tener una secuencia se aminoácidos que difiere de la secuencia de una proteína que se encuentra en la naturaleza reconocida por una célula T en la identidad de no más que 25% de sus residuos aminoácidos, siempre que aún pueda ser reconocida por la misma célula T y pueda alterar el perfil de citoquina de la célula T (es decir, un "ligando de péptidos alterado"). Las diferencias entre el producto de expresión y la proteína que se encuentra en la naturaleza pueden, por ejemplo, modificarse genéticamente para aumentar la reactividad cruzada con cepas víricas patógenas o el enlace a moléculas del alotipo HLA.

Ejemplos de productos de expresión incluyen secuencias de aminoácidos al menos 50% idénticas a la secuencia de un fragmento de proteína básica de mielina (MBP), proteína de proteolípidos (PLP), cadena invariante, GAD65, antígeno de células islote, desmogleína, \alpha-cristalina, \beta-cristalina, en los que el fragmento puede enlazarse a la molécula de MHC clase II. La tabla 1 lista muchos de tales productos de expresión que se piensa están involucrados en la enfermedad autoinmune. Los fragmentos de estas proteínas pueden ser esencialmente idénticos a una cualquiera de las SEQ ID nºs: 1-46, tales como residuos 80-102 de MBP (SEQ ID nº: 1), residuos 170-191de PLP (SEQ ID nº: 2), o residuos 80-124 de cadena invariante (SEQ ID nº: 3). Otros fragmentos se listan en la tabla
2.

Alternativamente, el producto de expresión puede incluir una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica a la secuencia de una porción antígena de cualquiera de los antígenos tumorales listados en la tabla 3, tales como los codificados por los genes E6 y E7 del papilomavirus de ser humano, el gen Her2/neu, el gen de antígenos específicos de la próstata, el gen de antígeno de melanoma reconocido por células T (MART), o el gen de antígeno de melanoma (MAGE). De nuevo, el producto de expresión puede modificarse genéticamente para aumentar la reactividad
cruzada.

Aún en otros casos, el producto de expresión una secuencia de aminoácidos esencialmente idéntica a la secuencia de un fragmento antígeno de una proteína expresada en la naturaleza por un virus, por ejemplo, un virus que infecta crónicamente células, tales como el papilomavirus de ser humano (HPV), el virus de la inmunodeficiencia de ser humano (HIV), el virus del herpes simple (HSV), el virus de la hepatitis B (HBV), o el virus de la hepatitis C (HCV); una bacteria, tal como una micobacteria; o un organismo eucariota parásito, tal como las especies Plasmodium. En la tabla 4 se incluye una lista representativa de tales fragmentos que se enlazan a moléculas de clase I así como a fragmentos de antígenos tumorales.

En otra realización, la invención caracteriza una micropartícula de un diámetro menor que aproximadamente 20 micrómetros, que incluye una matriz polimérica y una molécula de ácido nucleico, en la que la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de control de expresión operativamente unida a una secuencia de codificación. El producto de expresión codificado por la secuencia de codificación es una proteína que, cuando es expresada, regula aguas abajo una respuesta inmune. Ejemplos de tales proteínas incluyen proteínas de tolerancia, péptidos que bloquean moléculas MHC, receptores, factores de transcripción y citoquinas.

En otra realización. La invención caracteriza un procedimiento para preparar micropartículas. Se mezcla (por ejemplo, con sonicación, formando vórtice o en un microfluidizador) una primera disolución, que incluye un polímero disuelto en un disolvente orgánico, con una segunda disolución, que incluye un ácido nucleico disuelto o suspendido en un disolvente polar o hidrófilo (por ejemplo, una disolución acuosa amortiguadora del pH que, por ejemplo, contiene ácido etilenodiaminotetra-acético, o tris(hidroximetil)aminometano, o sus combinaciones, que opcionalmente incluye un agente de condensación de DNA tal como un péptido catiónico, un lípido o un dendrímero). La mezcla forma una primera emulsión. La primera emulsión se mezcla entonces con una tercera disolución que incluye un compuesto orgánico (por ejemplo, poli(alcohol vinílico)), para formar una segunda emulsión que contiene micropartículas de una matriz polimérica y un ácido nucleico. Las etapas de mezclado pueden ejecutarse, por ejemplo, en un homogeneizador, un mezclador por vórtice, un microfluidizador o un equipo sonicador. Ambas etapas de mezclado se llevan a cabo de una manera que minimice someter a cizalla al ácido nucleico mientras se producen micropartículas de un diámetro promedio más pequeño que 100 micrómetros.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Autoantígenos

1

TABLA 2 Péptidos asociados a moléculas de clase II

2

TABLA 3 Antígenos tumorales

3

TABLA 4 Péptidos patógenos y tumores asociados con moléculas clase I

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4

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La segunda disolución puede prepararse, por ejemplo, por cromatografía en columna o purificar de cualquier otra manera el ácido nucleico (por ejemplo, por precipitación en etanol o en isopropanol), suspender a continuación el ácido nucleico purificado o precipitado en una disolución acuosa, polar, o hidrófila.

La segunda disolución puede incluir opcionalmente un tensioactivo, un agente de condensación con DNA o un compuesto estabilizante (por ejemplo, dextrosa 1-10%, sacarosa, dextrano, u otros hidratos de carbono, poli(alcohol vinílico), ciclodextrina, bromuro de hexadeciltrimetilamonio o sulfato de dextrano) que puede estabilizar el ácido nucleico o la emulsión manteniendo el ácido nucleico superenrrollado durante la encapsulación o a lo largo de la formación de las micropartículas.

La segunda emulsión se mezcla opcionalmente con una cuarta disolución que incluye un compuesto orgánico tal como poli(alcohol vinílico). La segunda emulsión puede exponerse opcionalmente (es decir, sola o como una mezcla con la cuarta emulsión) a una elevada temperatura (por ejemplo, de temperatura ambiente a aproximadamente 60ºC) para, por ejemplo, facilitar la evaporación más rápida de los disolventes.

El procedimiento puede incluir la etapa adicional de lavar las micropartículas con una disolución acuosa para separar compuestos orgánicos, produciendo de este modo micropartículas lavadas. Las micropartículas lavadas pueden someterse a continuación a una temperatura por debajo de 0ºC para producir micropartículas congeladas, las cuales, a su vez, se liofilizan para producir micropartículas liofilizadas. Las micropartículas pueden opcionalmente suspenderse en un excipiente, tal como Tween-80, manitol, sorbitol o carboximetilcelulosa, antes o después de la liofilización (si la hay).

Cuando se desea, el procedimiento puede incluir la etapa adicional de tamizar las micropartículas para separara aquellas de un diámetro mayor que 100 micrómetros (o incluso 20 micrómetros).

Aún otra realización de la invención caracteriza una preparación de micropartículas que incluye una matriz polimérica, un determinante antígeno proteínico y una molécula de DNA que codifica a un polipéptido antígeno que puede ser diferente de, o el mismo que, el determinante antígeno proteínico anteriormente mencionado. El determinante antígeno contiene un epítope que puede obtener una respuesta de anticuerpos. El polipéptido antígeno expresado a partir del DNA puede inducir una respuesta de las células T (por ejemplo, una respuesta CTL). El DNA puede ser un DNA de plásmido y puede combinarse en la misma micropartícula con el determinante antígeno, o los dos pueden estar en micropartículas distintas que a continuación se mezclan conjuntamente. En algunos casos un oligonucleótido, más que un determinante antígeno proteínico, puede encapsularse conjuntamente con un plásmido de ácido nucleico. El oligonucleótido puede tener, por ejemplo, actividad antisentido o ribozoma.

En otra realización, la invención caracteriza un método de administrar un ácido nucleico a un animal introduciendo en el animal (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano, un primate no humano, un caballo, una vaca, un cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un ratón, una cobaya, un hámster o un hurón) cualquiera de las micropartículas descritas en los párrafos anteriores. Las micropartículas pueden proporcionarse suspendidas en una disolución (por ejemplo, una disolución acuosa) o en cualquier otra formulación adecuada, y, por ejemplo, pueden inyectarse o implantarse (por ejemplo, quirúrgicamente) en el animal, o administrarse por inhalación (por ejemplo, intranasalmente). Opcionalmente, pueden suministrase en unión de una proteína tal como una citoquina, una hormona, un interferón o un antígeno.

En otra realización, la invención caracteriza una preparación de micropartículas, cada una de las cuales incluye una matriz polimérica, un compuesto estabilizante y un vector de expresión de un ácido nucleico. La matriz polimérica incluye uno o más polímeros sintéticos que tengan una solubilidad en agua de menos que aproximadamente 1 mg/L; en el contexto presente, sintético se define como que no se encuentra en la naturaleza. Al menos 90% de las micropartículas tienen un diámetro menor que aproximadamente 100 micrómetros. El ácido nucleico es RNA, al menos 50% (y preferiblemente al menos 70% o incluso 80%) del cual está en la forma de círculos cerrados.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto normal en la técnica a la que pertenece esta invención. Los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1A a 1C son una serie de mapas de tres plásmidos, de los plásmidos pvA2.1/4, luciferasa y VSV-Npep, respectivamente.

La figura 2 es una representación gráfica de la distribución de tamaño de micropartículas que contienen DNA tal y como se analizaron con un contador COULTER^{TM}.

Las figuras 3A y 3B son una serie de fotografías de dos geles de agarosa de electroforesis que indican el grado de superenrrollamiento del DNA en función de diferentes duraciones y velocidades de homogeneización.

Las figuras 4A y 4B son un par de impresos FACS que comparan poblaciones celulares en ausencia o presencia de micropartículas.

Las figuras 5 a 9 son representaciones gráficas de lisis específicas frente la relación efector:diana.

Descripción de las realizaciones preferidas

Las micropartículas de la invención se formulan de una de dos formas: (1) para maximizar el suministro en las células fagocíticas del paciente, o (2) para formar un depósito en los tejidos del paciente, desde el cual el ácido nucleico se libera gradualmente a lo largo del tiempo; tras la liberación desde la micropartícula, el ácido nucleico es absorbido por las células vecinas (que incluyen células que presentan antígenos o APCs). En ambos casos, el mantenimiento de la integridad del DNA es una prioridad. Para un DNA de plásmido, esto quiere decir maximizar el porcentaje de moléculas de plásmido que están superenrrolladas y por tanto son más estables o más capaces de una transfección o expresión más eficiente que los plásmidos no superenrrollados (es decir, entallados o lineales). Los medios para proteger la integridad del ácido nucleico incluyen minimizar las fuerzas de cizalla a las que el ácido nucleico está necesariamente expuesto en el proceso de formación de las micropartículas, limitar la sonicación y los tiempos de mezclado durante la preparación y añadir disoluciones amortiguadoras u otros compuestos estabilizantes durante el aislamiento y la encapsulación del ácido nucleico. Por ejemplo, es necesario conseguir un equilibrio entre el tiempo y la intensidad de sonicación. Estas técnicas se discuten más adelante.

Las micropartículas de la invención pueden usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de, por ejemplo, el cáncer, cualquiera de las enfermedades autoinmunes listadas en la tabla 1, o cualquier otra enfermedad tratable con un ácido nucleico definido particular.

La fagocitosis de micropartículas por macrófagos, células dendríticas y otras APCs es un medio efectivo para introducir el ácido nucleico en estas células. Puede aumentarse la fagocitosis mediante estas células manteniendo un tamaño de partícula por debajo de aproximadamente 20 \mum, y preferiblemente por debajo de 11 \mum. Como se discute más adelante, el tipo de polímero usado en la micropartícula también puede afectar a la eficiencia de la absorción por las células fagocíticas.

Cuando se desea la absorción por las células fagocíticas del sistema reticuloendotelial (RES), las micropartículas pueden suministrase directamente en el torrente sanguíneo (es decir, por inyección o infusión intravenosa o intra-arterial). Alternativamente, puede fijarse, vía inyección subcutánea, la absorción por las células fagocíticas de los nódulos linfáticos drenantes. Las micropartículas también pueden introducirse intradérmicamente (es decir, en las APCs de la piel, tales como las células dendríticas y las células de Langerhans), intramuscularmente, o intranasalmente o vía otros sitios mucosales (es decir, para inmunidad mucosal). Finalmente, cuando las micropartículas son recogidas por los macrófagos alveolares, las micropartículas pueden introducirse en el pulmón (por ejemplo, por inhalación de micropartículas en polvo o de una disolución nebulizada o en forma de aerosol que contenga las micropartículas).

Una vez que una célula fagocítica fagocita la micropartícula, el ácido nucleico se libera en el interior de la célula. Tras la liberación, puede realizar su función pretendida: por ejemplo, expresión mediante la maquinaria celular normal de transcripción/translación (para un vector de expresión), o alteración de procesos celulares (para moléculas antisentido o ribozimas).

Debido a que estas micropartículas están pasivamente dirigidas a macrófagos y otros tipos de células fagocíticas, representan un medio de modular la función inmune. Los macrófagos y las células dendríticas sirven como APCs profesionales, que expresan tanto moléculas de MHC de clase I como de clase II. El suministro, vía micropartículas de un vector de expresión que codifica un antígeno extraño que se enlaza a una molécula de MHC de clase I o de clase II inducirá una respuesta de las células T del huésped contra el antígeno, confiriendo de este modo inmunidad al huésped.

Cuando el vector de expresión codifica un péptido bloqueante (véase, por ejemplo, el documento WO 94/04171) que se enlaza a una molécula de MHC de clase I o de clase II involucrada en la autoinmunidad, se impide la presentación del propio péptido asociado a la enfermedad autoinmune por la molécula de clase II, y se alivian los síntomas de la enfermedad autoinmune.

En otro ejemplo, un péptido que se enlaza a una molécula MHC que es idéntico o casi idéntico a un péptido que induce autoinmunidad puede afectar a la función de las células T tolerando o energizando a la célula T. Alternativamente, el péptido podría diseñarse para modular la función de las células T alterando los perfiles de secreción de las citoquinas que siguen al reconocimiento del complejo MHC/péptido. Los péptidos reconocidos por las células T pueden inducir la secreción de citoquinas que provocan que las células B produzcan anticuerpos de una clase particular, inducir inflamación, y además promover repuestas de las células T del huésped.

La inducción de respuestas inmunes puede requerir varios factores. Es esta naturaleza multifactorial la que proporciona ímpetus a los intentos de manipular células inmunes relacionadas en múltiples frentes, usando las micropartículas de la invención. Por ejemplo, pueden prepararse micropartículas que porten tanto DNA como polipéptidos dentro de cada micropartícula. Estas micropartículas de doble función se discuten más adelante.

Respuestas CTL

Las moléculas de clase I presentan péptidos antígenos a las células T inmaduras. Para activar completamente las células T se requieren otros factores diferentes al péptido antígeno. Las proteínas no específicas tales como la interleuquina-2 (IL-2), IL-12 y el gamma interferón (\gamma-IFN) promueven respuestas CTL y pueden proporcionarse junto con un DNA que codifique polipéptidos que incluyan epítopes CTL. Alternativamente, pueden incluirse proteínas que porten determinantes ayudantes de células T (T_{H}) con DNA que codifique el epítope CTL. Los epítopes T_{H} promueven la secreción de citoquinas desde células T_{H} y juegan un papel en la diferenciación de células T nacientes en CTLs.

Alternativamente, podrían incluirse en micropartículas proteínas o ácidos nucleicos que promuevan la migración de linfocitos y macrófagos a un área particular junto con moléculas de DNA apropiadas. Como resultado, se potencia la absorción del DNA, porque la liberación de la proteína provocaría una afluencia de células fagocíticas y de células T cuando la micropartícula se degrade. Los macrófagos fagocitarían las micropartículas restantes y actuarían como APC, y las células T llegarían a ser células efectoras.

Respuestas de anticuerpos

La eliminación de ciertos agentes infecciosos del huésped puede requerir tanto respuestas CTL como de anticuerpos. Por ejemplo, cuando el virus de la gripe entra en un huésped, los anticuerpos pueden con frecuencia impedirle que infecte a las células del huésped. Sin embargo, si las células son infectadas, entonces se requiere una respuesta CTL para eliminar las células infectadas e impedir la producción continua de virus dentro del huésped.

En general, las respuestas de anticuerpos se dirigen contra determinantes conformacionales y, por tanto, requieren la presencia de una proteína o de un fragmento de proteína que contenga tal determinante. En contraste, los epítopes de células T son determinantes lineales, típicamente de una longitud justo de 7-25 residuos. Así, cuando existe una necesidad de inducir tanto una respuesta CTL como de anticuerpos, las micropartículas pueden incluir tanto una proteína antígeno como el DNA que codifique un epítope de células T.

La liberación lenta de la proteína desde las micropartículas conduciría al reconocimiento de las células B y a la subsiguiente secreción de anticuerpos. Además, la fagocitosis de las micropartículas provocaría que las APCs: (1) expresaran el DNA de interés, generando de este modo una respuesta de células T; y (2) digirieran a la proteína liberada desde las micropartículas, generando de este modo péptidos que son subsiguientemente presentados por moléculas de clase I o de clase II, o por ambas. La presentación por moléculas de clase II promueve tanto respuestas CTL como de anticuerpos, ya que las células T_{H} activadas por los complejos molécula clase II/péptido secretarían citoquinas no específicas.

Inmunosupresión

Ciertas respuestas inmunes conducen a alergia y a auntoinmunidad, y por tanto pueden ser perjudiciales para el huésped. En estos casos, existe la necesidad de inactivar a las células inmunes que dañan a los tejidos. La inmunosupresión puede lograrse con micropartículas que porten DNA que codifique ligandos peptídicos alterados, péptidos tolerantes, o epítopes que regulan aguas abajo células T_{H} y CTLs (por ejemplo, péptidos "bloqueantes"). En estas micropartículas, el efecto del DNA inmunosupresor podría amplificarse incluyendo con el DNA ciertas proteínas en las micropartículas portadoras. Una lista de tales proteínas incluye anticuerpos, receptores, factores de transcripción, hormonas e interleuquinas.

Por ejemplo, los anticuerpos para citoquinas estimulantes, receptores de la superficie celular o proteínas involucradas en el tráfico celular, tales como las integrinas o las moléculas de adhesión intercelular (ICAMs), pueden aumentar la eficacia del epítope de DNA inmunosupresor. Estas proteínas sirven para inhibir las respuestas de células T ya activadas, mientras que el DNA además impide la activación de células T nacientes. La inducción de respuestas reguladoras de células T puede ser influida por el ambiente de citoquinas presente cuando está comprometido el receptor de células T (TCR). Las citoquinas, tales como IL-4, IL-10 e IL-6 promueven la diferenciación T_{H}2 en respuesta al epítope codificado por DNA. Las respuestas T_{H}2 pueden inhibir la formación de células T_{H}1 y las correspondientes respuestas perjudiciales que se producen en las patologías de artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes juvenil.

La inclusión de proteínas que comprenden formas solubles de moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD-40, gp-39, B7-1 y B7-2) o de moléculas involucradas en la apoptosis (por ejemplo, receptores Fas, FasL, Bcl2, caspasa, bax, TNF\alpha y TNF) es otra forma de inhibir la activación de respuestas particulares de células T y/o de células B. Por ejemplo, B7-1 está involucrado en la activación de células T_{H}1 y B7-2 activa a las células T_{H}2. Dependiendo de la respuesta que se requiera, podrían incluirse en la micropartícula unas u otras de estas proteínas con el DNA, o podrían suministrase en micropartículas separadas mezcladas con las micropartículas que contienen DNA.

Micropartículas para implantar

Se pretende que una segunda formulación de micropartículas de la invención no sea absorbida directamente por las células, sino más bien que sirva principalmente como un reservorio de liberación lenta de ácido nucleico que es absorbido por las células sólo tras la liberación desde la micropartícula por medio de biodegradación. El ácido nucleico puede estar complejado a un compuesto estabilizante (por ejemplo, para mantener la integridad del ácido nucleico durante el proceso de liberación lenta). Por lo tanto, en esta realización, las partículas poliméricas deben ser lo suficientemente grandes como para excluir la fagocitosis (es decir, mayores que 5 \mum y preferiblemente mayores que 19 \mum). Tales partículas son producidas mediante los métodos anteriormente descritos para fabricar las partículas más pequeñas, pero con mezclado menos vigoroso de las primera y segunda emulsiones anteriormente mencionadas. Es decir, para obtener partículas que tengan un diámetro de alrededor 100 \mum más que 5 \mum pueden usarse una velocidad de homogeneización, una velocidad de mezclado por vórtice o una exposición a la sonicación más baja. El tiempo de mezclado, la viscosidad de la primera emulsión o la concentración de polímero en la primera disolución también pueden alterarse para que afecten a la dimensión de las partículas.

Las micropartículas más grandes pueden formularse como una suspensión, un polvo o un sólido implantable, para suministrarse por inyección intramuscular, subcutánea, intradérmica, intravenosa o intraperitoneal; vía inhalación (intranasal o intrapulmonar); oralmente; o por implantación. Estas partículas son útiles para suministrar cualquier vector de expresión u otro ácido nucleico para el que se desea una liberación lenta durante un plazo de tiempo relativamente largo: por ejemplo, una molécula antisentido, una terapia de reemplazamiento génico, un medio de terapia de suministro basado en citoquinas, basado en antígenos o basado en hormonas, o un agente inmunosupresor. La velocidad de degradación, y consecuentemente de liberación, varía con la formulación polímera. Este parámetro puede usarse para controlar la función inmune. Por ejemplo, si se quisiera una liberación relativamente lenta para suministrar Il-4 o Il-10, y una liberación relativamente rápida para suministrar IL-2 o \gamma-IFN.

Composición de partículas de polímeros

El material polímero se obtiene de fuentes comerciales o puede prepararse por métodos conocidos. Por ejemplo, pueden generarse polímeros de ácido láctico y de ácido glicólico como se describe en la patente de EE.UU. nº 4.293.539 o comprarse en Aldrich.

Alternativamente, o además de, la matriz polimérica puede incluir polilactida, poliglicolida, poli(lactida-co-glicolida), un polianhídrido, un poliortoéster, policaprolactona, polifosfaceno, un polímero proteínico, un polipéptido, un poliéster o un poliortoéster.

Las sustancias de liberación controlada preferidas que son útiles en las formulaciones de la invención incluyen polianhídridos, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico en los que la relación en peso de ácido láctico a ácido glicólico no es mayor que 4:1, y poliortoésteres que contengan un catalizador que potencien la degradación, tal como un anhídrido, por ejemplo anhídrido maleico al 1%. Puesto que el poli(ácido láctico) tarda al menos un año en degradarse in vivo, este polímero debe usarse por sí mismo sólo en circunstancias en las que sea deseable una degradación extendida.

Asociación de un ácido nucleico y de partículas de polímeros

Pueden fabricarse partículas de polímeros que contienen ácidos nucleicos usando una técnica de doble emulsión. En primer lugar, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico. Un polímero preferido es poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), con una relación en peso de ácido láctico/ácido glicólico de 65:35, 50:50 ó 75:25. A continuación, se añade una muestra de ácido nucleico suspendido en una disolución acuosa a la disolución de polímero y las dos disoluciones se mezclan para formar la primera emulsión. Las disoluciones pueden mezclarse agitando formando vórtice o sacudiendo, o la mezcla puede sonicarse. La emulsión puede fabricarse en un microfluidizador. Es más preferible cualquier método mediante el que el ácido nucleico reciba la menor cantidad de daño en forma de formación de entalla, cizalla o degradación, mientras que aún se permite la formación de una emulsión apropiada. Por ejemplo, pueden obtenerse resultados aceptables con un sonicador Vibra-cell modelo VC-250 con una sonda con micropunta de 0,317 cm, regulado en el nº 3, o controlando la presión en el microfluidizador.

Durante este procedimiento se forman gotitas de agua (que contienen ácido nucleico) dentro del disolvente orgánico. Si se desea, en este punto puede aislarse una pequeña cantidad de ácido nucleico con el fin de evaluar su integridad, por ejemplo mediante electroforesis en gel.

Se encuentra que la precipitación con un alcohol, u otros modos de purificación, del ácido nucleico antes de la suspensión en la disolución acuosa puede mejorar la eficiencia de la encapsulación. La precipitación con etanol dio lugar a un aumento del DNA incorporado de hasta 147% y la precipitación con isopropanol aumentó la incorporación en hasta 170%.

La naturaleza de la disolución acuosa puede afectar el rendimiento de DNA superenrrollado. Por ejemplo, la presencia de detergentes tales como polimixina B, que se usan con frecuencia para separar endotoxinas durante la preparación y purificación de muestras de DNA, puede conducir a un aumento en la eficiencia de encapsulación de DNA. Puede ser necesario equilibrar los efectos negativos sobre la eficiencia de la encapsulación con los efectos positivos del superenrrollamiento, especialmente cuando durante la encapsulación se usan detergentes, agentes tensioactivos y/o agentes estabilizantes. Además, la adición de disoluciones amortiguadoras del pH que contengan tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA), o una combinación de TRIS y EDTA (TE) dio lugar a la estabilización de DNA del plásmido superenrrollado, según el análisis por electroforesis en gel. También se observan efectos del pH. También se encontró que otros compuestos estabilizantes, tales como sulfato de dextrano, dextrosa, dextrano, CTAB, ciclodextrina y sacarosa, aumentan la estabilidad y grado de superenrrollamiento del DNA, solos o en combinación con la disolución amortiguadora TE. Para aumentar la cantidad de DNA superenrrollado encapsulado pueden usarse combinaciones de compuestos estabilizantes. Los compuestos estabilizantes tales como lípidos cargados (por ejemplo, CTAB), péptidos catiónicos o dendrímeros (J. Controlled Release, 39:357, 1996) pueden condensar o precipitar el DNA. Por otra parte, los compuestos estabilizantes pueden tener un efecto sobre la naturaleza física de las partículas formadas durante el procedimiento de encapsulación. Por ejemplo, la presencia de azúcares o tensioactivos durante el procedimiento de encapsulación puede generar partículas porosas con estructuras porosas interiores o exteriores, que permiten una salida más rápida de un fármaco de la partícula. Los compuestos estabilizantes pueden actuar en cualquier momento durante la preparación de las microesferas: por ejemplo, durante la encapsulación o la liofilización, o ambas.

A continuación, la primera emulsión se añade a una disolución orgánica, permitiendo la formación de micropartículas. La disolución puede estar compuesta de, por ejemplo, cloruro de metileno, acetato de etilo o acetona, que preferiblemente contiene poli(alcohol vinílico) (PVA) y que más preferiblemente tiene una relación 1:100 del peso de PVA al volumen de la disolución. En general, la primera emulsión se añade a la disolución orgánica con agitación en un homogeneizador (por ejemplo, un homogeneizador Silverson modelo L4RT (sonda de 1,587 cm) posicionado a 7000 rpm durante aproximadamente 12 segundos; un tiempo de homogeneización de 60 segundos sería demasiado largo a esta velocidad de homogeneización) o en un microfluidizador.

Este procedimiento forma una segunda emulsión que se añade subsiguientemente a otra disolución que contiene un compuesto orgánico (por ejemplo, PVA) con agitación (por ejemplo, en un homogeneizador o sobre una placa de agitación). Esta etapa provoca que el primer disolvente orgánico (por ejemplo, diclorometano) sea liberado y las microesferas se transformen en duras. Alternativamente, para acelerar la evaporación del disolvente puede usarse calor. La liberación lenta del disolvente orgánico (por ejemplo, a temperatura ambiente) da lugar a partículas "esponjosas" que tiene una estructura altamente porosa por todas partes, mientras que una liberación rápida (por ejemplo, a elevada temperatura) da lugar a micropartículas de núcleo hueco. La última disolución puede, por ejemplo, ser de PVA al 0,05% p/v. Si se añaden al DNA azúcar u otros compuestos, puede añadirse una concentración igual del compuesto a la tercera o cuarta disolución para igualar la osmolaridad, disminuyendo efectivamente la pérdida de ácido nucleico de la microesfera durante el proceso de endurecimiento. Las micropartículas resultantes se lavan varias veces con agua para separar los compuestos orgánicos. Las partículas pueden pasarse a través de tamices para separar selectivamente las mayores que las del tamaño deseado. Si el tamaño de las micropartículas no es crucial, la etapa de tamizado puede evitarse. Después del lavado, las partículas pueden usarse inmediatamente o liofilizarse para almacenar.

Pueden obtenerse partículas más grandes, tales como las usadas para implantes, usando condiciones de emulsionamiento menos vigorosas cuando se fabrica la primera emulsión, como ya se ha descrito anteriormente con prolijidad. Por ejemplo, pueden obtenerse partículas más grandes alterando la concentración del polímero, alterando la viscosidad de la emulsión, alterando el tamaño de partícula de la primera emulsión (por ejemplo, pueden fabricarse partículas más grandes disminuyendo la presión usada mientras se crea la primera emulsión en un microfluidizador), u homogeneizando con, por ejemplo, el homogeneizador Silverson posicionado a 5000 rpm durante aproximadamente 12 segundos.

Las micropartículas recuperadas pueden suspenderse en un excipiente sin afectar negativamente a la cantidad de DNA del plásmido superenrrollado dentro de las microesferas. Los excipientes se usan con frecuencia en la formulación de fármacos, y en la presente invención proporcionan una resuspensión eficiente de las microesferas, actúan para impedir la sedimentación, y retienen a las microesferas en suspensión. Según el análisis por electroforesis en gel, los excipientes (que incluyen Tween 80, manitol, sorbitol y carboximetilcelulosa) no tienen ningún efecto sobre la estabilidad o el superenrrollamiento del DNA.

Después de recuperar las microesferas o la suspensión de microesferas en un excipiente, las muestras pueden congelarse y liofilizarse para su uso futuro.

Caracterización de micropartículas

La distribución de tamaño de las micropartículas preparadas por el método anterior puede determinarse con un contador COULTER^{TM}. Este instrumento proporciona un perfil y un análisis estadístico de distribución de tamaño de las partículas. Alternativamente, el tamaño medio de las partículas puede determinarse por visualización en un microscopio equipado con un portaobjetos o un ocular para medir el tamaño.

Si se desea, el ácido nucleico puede extraerse de las micropartículas para analizar por el siguiente procedimiento. Se disuelven las micropartículas en un disolvente orgánico tal como cloroformo o cloruro de metileno en presencia de una disolución acuosa. El polímero permanece en la fase acuosa mientras que el DNA se transfiere a la fase acuosa. La interfase entre las fases puede hacerse más distintiva por centrifugación. El aislamiento de la fase acuosa permite la recuperación del ácido nucleico. Para ensayar la degradación, el ácido nucleico extraído puede analizarse por HPLC o por electroforesis en gel.

Para aumentar la recuperación del ácido nucleico pueden añadirse a las micropartículas disueltas disolventes orgánicos adicionales, tales como fenol y cloroformo, antes de la adición de la disolución acuosa. Tras la adición de la disolución acuosa, el ácido nucleico entra en la fase acuosa, el cual puede repartirse fácilmente desde la fase orgánica después de mezclar. Para obtener una interfase limpia entre las fases acuosa y orgánica, las muestras deben centrifugarse. El ácido nucleico recuperarse de la fase acuosa por precipitación con una sal y etanol según métodos estándares.

Suministro intracelular de micropartículas

Se resuspenden micropartículas que contienen DNA en una disolución salina tamponada con sales, un medio de cultivo de tejidos u otro vehículo fisiológicamente aceptables. Para uso in vitro/ex vivo, la suspensión de micropartículas puede añadirse a células adherentes de mamíferos cultivadas o a una suspensión celular. Tras un período de incubación de 1-24 horas, se separan las partículas no absorbidas por aspiración o centrifugación en suero de ternero fetal. Las células pueden analizarse inmediatamente o volver a cultivarse para un análisis futuro.

La absorción de micropartículas que contienen un ácido nucleico en las células puede detectarse por PCR, o ensayando la expresión del ácido nucleico. Por ejemplo, podría medirse la transcripción del ácido nucleico con un ensayo de manchas Northern, PCR de transcriptasa inversa o cartografiando el RNA. La expresión de proteína puede medirse con un ensayo apropiado basado en anticuerpos, o con un ensayo funcional ajustado a la función del polipéptido codificado por el ácido nucleico. Por ejemplo, pueden ensayarse células que expresan un ácido nucleico que codifica la luciferasa como sigue: después de lisar en la disolución amortiguadora apropiada (por ejemplo, reactivo de cultivo para lisis celular, Promega Corp, Madison, WI), se añade el lisado a un sustrato que contenga luciferina (Promega Corp) y se mide la emisión de luz en un luminómetro o en un contador de centelleo. La emisión de luz es directamente proporcional a la expresión del gen de la luciferasa.

Si el ácido nucleico codifica un péptido conocido por interaccionar con una molécula de MHC de clase I o de clase II, puede usarse un anticuerpo específico para ese complejo molécula de MHC/péptido, para detectar el complejo sobre la superficie celular de la célula, usando un equipo clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). Tales anticuerpos pueden fabricarse usando técnicas estándar (Murphy et al. Nature, vol. 338, 1989, pp. 765-767). Tras la incubación con micropartículas que contienen un ácido nucleico que codifica al péptido, las células se incuban durante 10-20 minutos con el anticuerpo específico en el medio de cultivo de tejidos. El exceso de anticuerpo se separa lavando las células en el medio. Con las células se incuba un anticuerpo secundario etiquetado fluorescentemente, el cual se enlaza al primer anticuerpo. Estos anticuerpos secundarios están con frecuencia comercialmente disponibles, o pueden prepararse usando métodos conocidos. El anticuerpo secundario en exceso tiene que separarse por lavado antes del análisis por FACS.

También puede ensayarse mirando células efectoras T o B. Por ejemplo, puede medirse la proliferación de células T, la actividad citotóxica, la apoptosis o la secreción de citoquinas.

Alternativamente, puede demostrarse directamente el suministro intracelular de las partículas usando ácidos nucleicos que estén etiquetados fluorescentemente, y analizando las células por FACS. La internalización del ácido nucleico etiquetado fluorescentemente provoca que la célula emita fluorescencia por encima de los valores de fondo. Debido a que es rápido y cuantitativo, el análisis FACS es especialmente útil para optimizar las condiciones para suministrar ácidos nucleicos in vitro o in vivo. Tras tal optimización, se para el uso de la etiqueta fluorescente.

Si el ácido nucleico por sí mismo afecta directamente a la función celular, por ejemplo, si es un ribozima o una molécula antisentido, o se transcribe en una, puede usarse un ensayo funcional apropiado. Por ejemplo, si el ribozima o el ácido nucleico antisentido se diseña para disminuir la expresión de una proteína celular particular, puede monitorizarse la expresión de esa proteína.

Suministro in vivo de micropartículas

Pueden inyectarse en mamíferos micropartículas que contienen un ácido nucleico intramuscularmente, intravenosamente, intra-arterialmente, intradérmicamente, intraperitonealmente, intranasalmente o subcutáneamente, o pueden introducirse en el tracto gastrointestinal o en el tracto respiratorio, por ejemplo, por inhalación de un disolución o polvo que contenga a las micropartículas. La expresión del ácido nucleico se monitoriza mediante un método apropiado. Por ejemplo, la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteína inmunógena de interés se ensaya buscando un anticuerpo o una respuesta de células T a la proteína.

Las respuestas de los anticuerpos pueden medirse ensayando suero en un ensayo ELISA. En este ensayo, la proteína de interés se reviste sobre una placa de 96 pocillos y en cada pocillo se pipetean diluciones en serie de suero del sujeto de ensayo. A continuación, se añade a los pocillos un anticuerpo secundario unido a una enzima, tal como un anticuerpo anti-humano unido a peroxidasa de rábano. Si en el suero del sujeto a ensayar están presentes anticuerpos para la proteína de interés, se enlazarán a la proteína fijada sobre la placa, y a su vez serán enlazados por el anticuerpo secundario. Se añade a la mezcla un sustrato de la enzima y el cambio colorimétrico se cuantifica en un equipo lector de placas ELISA. Una respuesta positiva del suero indica que la proteína inmunógena codificada por el DNA de las micropartículas se expresó en el sujeto de ensayo, y estimuló una respuesta de los anticuerpos. Alternativamente, puede emplearse un ensayo ELISA de manchas.

La proliferación de células T en respuesta a una proteína tras el suministro intracelular de micropartículas que contienen un ácido nucleico que codifica la proteína se mide ensayando las células T presentes en el bazo, los nódulos linfáticos, o los linfocitos de la sangre periférica de un animal de ensayo. Las células T obtenidas de tal fuente se incuban con APCs singénicas en presencia de la proteína o péptido de interés, la proliferación de células T se monitoriza mediante la absorción de ^{3}H-timidina, según métodos estándar. La cantidad de radioactividad incorporada en las células está directamente relacionada con la intensidad de la respuesta proliferativa inducida en el sujeto de ensayo por la expresión del ácido nucleico suministrado en las micropartículas. Una respuesta positiva indica que la micropartícula que contiene DNA que codifica la proteína o el péptido fue absorbida o expresada por APCs in vivo.

La generación de células T citotóxicas puede demostrarse en un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr. En estos ensayos se cultivan células de bazo o linfocitos de sangre periférica obtenidos del sujeto a ensayar, en presencia de de APCs singénicas y de la proteína de interés o de un epítope derivado de esta proteína. Después de un período de 4-6 días, las células T citotóxicas efectoras se mezclan con células diana marcadas con ^{51}Cr que expresan un epítope derivado de la proteína de interés. Si el sujeto de ensayo experimenta una respuesta de las células T citotóxicas a la proteína o el péptido codificado por el ácido nucleico contenido dentro de al micropartícula, las células T citotóxicas lisarán a las dianas. Las dianas lisadas liberarán el ^{51}Cr radiactivo en el medio. Partes alícuotas del medio se ensayan respecto a la radioactividad en un contador de centelleo. Para medir los perfiles de citoquinas también pueden usarse ensayos, tales como ELISA.

Lo que sigue son ejemplos de la práctica de la invención. No son para que de ninguna manera se interpreten como limitantes del alcance de la invención.

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Ejemplo 1

Incorporación de DNA; análisis de tamaño de partícula y de integridad del DNA Preparación del DNA para incorporar

Se preparó un DNA de plásmido mediante métodos estándar usando un juego de ensayo MEGA-PREP^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para todas las manipulaciones del DNA se usó un juego de disoluciones amortiguadoras exentas de endotoxinas (Qiagen). El DNA se resuspendió en agua estéril, destilada y desionizada, para dar una concentración final de 3 \mug/\muL. La figura 1 muestra mapas de plásmidos de vectores de expresión de DNA que codifican: a) luciferasa, b) un epítope de un péptido del virus de la estomatitis vesicular (VSV) denominado VSV-Npep, y c) un epítope de un péptido del virus del papiloma de ser humano denominado A2.1/4.

Asociación de DNA con PLGA

Se disolvieron 200 mg de poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) (Aldrich, relación 65:35 de ácido láctico a ácido glicólico) en 5-7 mL de cloruro de metileno. Se añadieron a la disolución de PLGA 300 \muL de la disolución de DNA preparada anteriormente, que contenían 900 \mug de DNA. La mezcla se sonicó en un SONIC DISMEMBRATOR^{TM} modelo 550 (Fisher Scientific) en la posición de regulación nº 3 durante 5-60 segundos y se analizó la emulsión resultante. Se añadió a un vaso de precipitados que contenía 50 mL de disolución acuosa de poli(alcohol vinílico) (PVA) (intervalo de Mw: 30-70 Kdal) al 1% p/v una emulsión en la que se verificó que contenía partículas del tamaño deseado que tenían DNA de integridad satisfactoria (como se determina más adelante). La mezcla se homogeneizó en un homogeneizador POWERGEN^{TM} (Fisher Scientific) programado a 3000-9000 rpm durante 5-60 segundos. Se analizó la integridad del DNA otra vez. En los casos en los que se encontró que el DNA estaba suficientemente intacto, la segunda emulsión resultante se transfirió con agitación constante a un segundo vaso de precipitados que contenía 100 mL de disolución acuosa de PVA al 0,05%. La agitación se continuó durante
2-3 horas.

La disolución de micropartículas se vertió en un tubo de centrífuga de 250 mL y se hizo girar a 2000 rpm durante 10 minutos. El contenido de los tubos se decantó y las partículas sedimentadas se resuspendieron en 100 mL de agua desionizada. Después de repetir las etapas de centrifugación y de decantación, las partículas se congelaron en nitrógeno líquido y finalmente se liofilizaron hasta sequedad.

Análisis del perfil de tamaños de las micropartículas

Se resuspendieron en 200 \muL de agua 5 mg de micropartículas liofilizadas. La suspensión resultante se diluyó hasta aproximadamente 1:10.000 para el análisis con un contador COULTER^{TM}. La figura 2 es un documento impreso del contador COULTER^{TM} que indica que aproximadamente 85% de las micropartículas tenían un diámetro entre 1,1 y 10 \mum.

Determinación de la integridad del DNA

Se humectaron 2-5 \mug de las micropartículas con 10 \muL de agua en un tubo EPPENDORF^{TM}. Se añadieron 500 \muL de cloroformo con mezclado completo para disolver la matriz polimérica. Se añadieron, de nuevo con mezclado, 500 \muL de agua. La emulsión resultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos. La capa acuosa se transfirió a un tubo EPPENDORF^{TM} limpio, junto con 2 volúmenes equivalentes de etanol y 0,1 volúmenes equivalentes de una disolución acuosa de acetato de sodio 3 M. La mezcla se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos. Después de la aspiración del sobrenadante, el DNA paletizado se resuspendió en 50 \muL de agua. Se sometieron a electroforesis 5 \mug de DNA en un gel de agarosa al 0,8% próximo a un patrón que contenía el DNA de entrada. El DNA sobre el gel se visualizó en una caja de luz UV. La comparación con el patrón da una indicación de la integridad del DNA de las micropartículas.

El procedimiento de formación de micropartículas se juzgó exitoso si el DNA incorporado retenía un alto porcentaje de DNA superenrrollado con relación al DNA de entrada.

Como se indica en las figuras 3A y 3B, la velocidad y la duración de la homogeneización están inversamente relacionadas con la integridad del DNA. La figura 3A representa el DNA aislado de micropartículas preparadas por homogeneización a 7000 rpm durante 1 minuto (calle 1), DNA aislado de micropartículas preparadas por homogeneización a 5000 rpm durante 1 minuto (calle 2) y DNA de entrada superenrrollado (calle 3).

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Ejemplo 2

Preparación de DNA y de microesferas Preparación de DNA

Se vertieron en botellas de centrífuga de 1 litro 500 mL de cultivos bacterianos. Los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm a 20ºC durante 20 minutos. Los medios se separaron por vertido de las bacterias paletizadas. El pelet bacteriano se resuspendió completamente en 50 mL de disolución amortiguadora del pH P1 (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; EDTA 10 mM; 100 \mug/mL de RNAsa), sin dejar ningún grumo. Se añadieron agitando formando un suave remolino laminar 50 mL de disolución amortiguadora del pH P2 (NaOH 200 mM, SDS 1%), y las suspensiones se incubaron a temperatura ambiente durante cinco minutos. Se añadieron con mezclado suave e inmediato 50 mL de disolución amortiguadora del pH P3 (acetato de potasio 3,0 M, pH 5,5, enfriado a 4ºC). Las suspensiones se incubaron en hielo durante 30 minutos y a continuación se centrifugaron a 4000 rpm y 4ºC durante 30 minutos.

Se humectó con agua un filtro redondo plegado. Cuando se terminó la centrifugación, el sobrenadante se vertió inmediatamente a través del filtro. El sobrenadante filtrado se recogió en una botella de centrífuga limpia de 250 mL.

Se añadieron al lisado filtrado 15 mL de disolución amortiguadora Qiagen ER mezclando invirtiendo la botella 10 veces. El lisado se incubó en hielo durante 30 minutos.

Se equilibró una columna Qiagen-tip 2500 aplicando 35 mL de disolución amortiguadora QBT (cloruro de sodio 750 mM; MOPS 50 mM, pH 7,0; isopropanol 15%; y Triton X-100 0,15%). Se permitió que la columna se vaciara por flujo por gravedad. Se aplicó el lisado incubado a la columna y se permitió que entrara por flujo por gravedad. La columna se lavó con 4 x 50 mL de disolución amortiguadora Qiagen QC exenta de endotoxinas (NaCl 1,0 M; MOPS 50 mM, pH 7,0; isopropanol 15%). El DNA se eluyó de la columna con 35 mL de disolución amortiguadora QN (NaCl 1,6 M; MOPS 50 mM, pH 7,0; isopropanol 15%) en un tubo de centrífuga cerrado con una tapa roscada. La suspensión de DNA se dividió en dos tubos vertiendo aproximadamente 17,5 mL de la suspensión en un segundo tubo de 50 mL cerrado con una tapa roscada.

Se añadieron a cada tubo 12,25 mL de isopropanol usando una pipeta estéril de 10 mL. Los tubos se cerraron hasta estanqueidad y se llevó a cabo una mezcla exhaustiva de sus contenidos. El contenido de cada tubo se vertió en tubos de centrífuga Corex (VWR) de 30 mL. Cada tubo Corex se cubrió con PARAFILM®. Los tubos se centrifugaron a 11.000 rpm y 4ºC durante 30 minutos.

Se aspiró el sobrenadante de cada tubo y el pelet se lavó con 2 mL de etanol al 70%. El etanol se separó por aspiración. El pelet se secó en aire durante 10 minutos, a continuación se resuspendió en 0,5-1,0 mL de agua y se transfirió a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL.

Preparación de microesferas

En un tubo de cultivo de 14 mL se disolvieron 200 mg de PLGA en 7 mL de cloruro de metileno. Se programó en la posición 6 a la velocidad 4,5 un homogeneizador Fisher Scientific PowerGen 700 equipado con un cabezal de mezclado de 7 mm. Se posicionó en la posición 3 un sonicador Sonic Dismembrator de Fisher Scientific.

Se añadieron a la disolución de PLGA 1,2 mg de DNA en 300 \muL de H_{2}O y la mezcla resultante se sonicó durante 15 segundos. Se vertieron 50 mL de PVA al 1,0% en un vaso de precipitados de 100 mL y se colocaron en un homogeneizador. La sonda del homogeneizador se sumergió hasta que estuvo a aproximadamente 4 mm del fondo del vaso de precipitados y se suministró energía al homogeneizador. La mezcla de DNA/PLGA se vertió inmediatamente en el vaso de precipitados y la emulsión resultante se homogenizó durante 10 segundos. El homogeneizado se vertió en el vaso de precipitados que contenía PVA al 0,05%.

La emulsión resultante se agitó durante dos horas, se vertió en una centrífuga cónica de 250 mL y se hizo girar a 200 rpm durante 10 minutos. Las microesferas paletizadas se lavaron con 50 mL de agua, se transfirieron a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 mL y se hicieron girar a 2000 rpm durante 10 minutos. El pelet se lavó con otros 50 mL de agua y se hizo girar de nuevo a 2000 rpm durante 10 minutos. El pelet se congeló en nitrógeno líquido y a continuación se liofilizó durante toda la noche.

Extracción de DNA de las microesferas para análisis en gel

Se separaron en un tubo de microcentrífuga 1 mL de microesferas suspendidas en un líquido y se hicieron girar a 14.000 rpm durante 5 minutos. Se separó la mayor parte del sobrenadante. Se añadieron 50 \muL de disolución amortiguadora TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM) y las microesferas se resuspendieron golpeando el lado del tubo.

Para aislar microesferas liofilizadas o secadas a vacío se pesaron 2-4 mg de microesferas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Se añadieron 70 \muL de disolución amortiguadora y las microesferas se resuspendieron.

Se añadieron 200 \muL de cloroformo y los tubos se agitaron sacudiendo vigorosa, pero no violentamente, durante dos minutos para mezclar las capas acuosa y orgánica. Los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos. Se separaron cuidadosamente 30 \muL de la fase acuosa en un tubo nuevo.

Análisis con reactivo picogreen y en gel de microesferas

Se pesaron 3,5-4,5 mg de microesferas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Se añadieron 100 \muL de DMSO a cada tubo y los tubos se hicieron rotar a temperatura ambiente durante 10 min. Las muestras se separaron del equipo rotante y se inspeccionaron visualmente para verificar que las muestras se disolvieron completamente. Cuando fue necesario se usó la punta de una pipeta para romper cualquier grumo que quedara. No se permitió que ninguna de las muestras permaneciera en DMSO durante más de 30 minutos.

Para cada muestra a ensayar se pipetearon 990 \muL de TE en tres tubos de microcentrífuga separados. En cada 990 \muL de SE TE pipetearon con mezclado 10 \muL de la disolución de DMSO/microesferas. Las mezclas se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 minutos.

Para cada muestra, se añadieron partes alícuotas de 1,2 mL de TE en un tubo de centrífuga de 5 mL de fondo redondo y con tapa de cierre rápido. 50 \muL de de la mezcla de 1 mL de TE/DMSO/microesferas a los 1,2 mL de TE. Se añadieron a cada tubo 1,25 mL de reactivo picogreen y se midió la fluorescencia en un fluorímetro.

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Ejemplo 3

Precipitación con un alcohol Precipitación con etanol

Se preparó DNA como en el ejemplo 2. Se precipitaron 3 muestras, conteniendo cada una 1,2 mg de DNA, mediante la adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol. El DNA se resuspendió en agua hasta una concentración final de 4 mg/mL. En dos de las muestras, el DNA se resuspendió inmediatamente antes de su uso, y en la tercera muestra el DNA se resuspendió y a continuación se hizo rotar durante 4 horas a temperatura ambiente. El DNA testigo con una concentración de 4 mg/mL no se precipitó en etanol.

Cada una de las cuatro muestras se encapsuló en microesferas por el procedimiento descrito en el ejemplo 2. La cantidad de DNA por mg de microesferas se determinó por análisis con reactivo picogreen como se describió en el ejemplo 2. Se obtuvieron los siguientes resultados:

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Los resultados indican que la precipitación con etanol de DNA antes de la encapsulación en microesferas dio lugar a un aumento de la incorporación que varió de 31% a más que 56%, representando un aumento del 44-62% de la cantidad de DNA encapsulado

Los siguientes experimentos verifican que los efectos de la precipitación con etanol observados anteriormente son independientes de los procedimientos de preparación del DNA.

Se preparó DNA de tres modos diferentes. La muestra nº 2 se preparó como en el ejemplo 2, pero sin la adición de disolución amortiguadora de separación ER. La muestra nº 3 se preparó en un ensayo de fabricación de escalado por fermentación. Las tres muestras de DNA fueron representativas de dos plásmidos diferentes (DNA-1 y DNA-3 fueron idénticos) de tamaños de 4,5 kb y 10 kb. Las tres muestras de DNA se ensayaron respecto al aumento de la eficiencia de encapsulación por precipitación con etanol. Se precipitaron 3 muestras de DNA, conteniendo cada una 1,2 mg, mediante la adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes de etanol. El DNA se resuspendió en agua hasta una concentración final de 4 mg/mL. Tres DNA testigos con una concentración de 4 mg/mL no se precipitaron en etanol.

Cada una de las cuatro muestras se encapsuló mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2.

La cantidad de DNA por mg de microesferas se determinó por análisis con reactivo picogreen como se describió en el ejemplo 2. Se obtuvieron los siguientes resultados:

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Los datos muestran que la precipitación en etanol aumentó la cantidad de DNA encapsulado en microesferas en 29-59%. Se demostró que el efecto se mantenía independientemente del tamaño y de la técnica de preparación.

Precipitación con isopropanol versus etanol

Se precipitó un DNA de plásmido con etanol o isopropanol y a continuación se resuspendió en agua durante 4 horas ó 16 horas. El DNA testigo no se precipitó. Se hicieron microesferas según el protocolo del ejemplo 2. Se obtuvieron los siguientes resultados:

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Estos datos demuestran que la precipitación con un alcohol aumentó la eficiencia de la encapsulación de DNA, independientemente del tipo de alcohol usado para precipitar DNA y del tiempo que sigue a la precipitación del DNA.

Conductividad

Se determinaron las conductividades de las muestras de DNA no precipitadas y precipitadas en etanol usando un conductivímetro. Se encontró que la precipitación del DNA condujo a una disminución de la cantidad de sal presente. La conductividad sin precipitación en etanol fue 384 \mu\Omega, mientras que la conductividad después de la precipitación en etanol fue de 182 \mu\Omega. Por tanto, la precipitación en alcohol, o cualquier otro medio de separar sales/contaminación es probable que aumente la eficiencia de la encapsulación. Por tanto, parece que es probable que los tratamientos que dan lugar a DNA exento de contaminantes aumenten la eficiencia de la encapsulación de DNA.

A continuación, el DNA se precipitó en etanol o en presencia de NaCl 0,4 M y bromuro de hexadeciltrimetilamonio al 5% (CTAB). A continuación, el DNA se encapsuló como se describió anteriormente. El DNA se extrajo y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Los resultados indicaron que la precipitación del DNA con CTAB condujo a un marcado aumento de la cantidad de DNA superenrrollado dentro de las microesferas.

Ejemplo 4

Adición de compuestos estabilizantes Disolución amortiguadora TE

Tras la precipitación en etanol, en un intento de aumentar la estabilidad del DNA se resuspendió DNA de plásmido en disolución amortiguadora TE. A continuación se prepararon las microesferas como se describió en el ejemplo 2. Se extrajo DNA de las microesferas y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Se cargó una calle con el plásmido de entrada (pIiPLPLR); otra calle con el DNA del plásmido tras la precipitación en etanol, resuspensión en agua y encapsulación en microesferas; y aún otra calle con el DNA del plásmido tras la precipitación en etanol, resuspensión en disolución amortiguadora TE y encapsulación en microesferas. Los resultados indicaron que la cantidad de DNA superenrrollado dentro de las microesferas fue incrementada por la resuspensión en la disolución amortiguadora TE.

Otros dos plásmidos, designados pbkcmv-n-p y E3PLPLR, se sometieron a las condiciones descritas anteriormente. Este experimento confirmó que los otros dos plásmidos también fueron estabilizados por la disolución amortiguadora TE.

El siguiente experimento se llevó a cabo para determinar el momento del efecto de la disolución amortiguadora TE. Se disolvieron 2 g de PLGA en 18 mL de cloruro de metileno. Se precipitaron en etanol 500 \mug de DNA y se disolvieron en 3,6 mL de TE o de agua. Las dos disoluciones se mezclaron invirtiendo varias veces y a continuación se sonicaron en el aparato de Fisher (véase el ejemplo 2) en la posición 3 durante 10 segundos con una micropunta de 0,317 cm. En varios momentos después de la sonicación (es decir, 5, 15, 30, 45 y 60 minutos) se separó de cada tubo una muestra de 1 mL, se añadieron 100 \muL de agua, la muestra se centrifugó en una centrífuga Eppendorf y la capa superior de la muestra centrifugada se separó en un tubo separado. A continuación, las muestras se analizaron por electroforesis en gel.

Los resultados indican que en el proceso de encapsulación la disolución amortiguadora TE actuó para estabilizar el DNA pronto, durante la formación de la emulsión aceite en agua.

Para determinar el efecto de Tris y/o EDTA en la disolución amortiguadora TE, se resuspendió DNA en agua, disolución amortiguadora TE, TRIS 10 mM o EDTA 1 mM antes de encapsular en microesferas por el método del ejemplo 2. El DNA se extrajo de las microesferas y se analizó en gel de agarosa. Se encontró que TRIS y EDTA eran similares a la disolución amortiguadora TE completa en su capacidad de proteger al DNA durante el proceso de encapsulación y durante la liofilización.

Se llevó a cabo un experimento para determinar el efecto del pH sobre la encapsulación (todos los pHs de las disoluciones de EDTA, tris y TE en el experimento previo fueron similares). Se fabricaron microesferas encapsulando DNA que había sido precipitado en etanol y se resuspendieron en Tris de diferentes pHs o en una disolución salina tamponada con fosfatos (PBS). El DNA se extrajo después de la liofilización de las partículas y se analizó en gel de agarosa. Los resultados indicaron que había un efecto significativo del pH sobre la estabilidad del DNA encapsulado. La resuspensión del DNA en agua (pH 6,5), PBS (pH 7,3) y Tris (pH 6,8) condujo en todos los casos a una disminución en la relación de DNA superenrrollado con relación al DNA total dentro de las microesferas. Aumentar el pH a 7,5 o más alto tuvo un efecto positivo sobre la cantidad de superenrrollamiento, sugiriendo que los valores básicos de pH son importantes para mantener la estabilidad del DNA. El aumento de pH también tuvo un efecto sobre la eficiencia de la encapsulación:

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Otros compuestos amortiguadores del pH

También se ensayaron disoluciones amortiguadoras de boratos y fosfatos respecto a sus efectos sobre la calidad del DNA encapsulado. Se precipitó DNA en etanol, se resuspendió en varias disoluciones amortiguadoras y se encapsularon según el procedimiento del ejemplo 2. El DNA se extrajo de las microesferas y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Todas las disoluciones TE, BE y PE dieron un % de superenrrollamiento mayor que 50% en el DNA encapsulado. También se descubrió un beneficio añadido para el DNA, que resultó de EDTA en presencia de Tris, borato o fosfato.

Otros compuestos estabilizantes

Además de compuestos amortiguadores del pH, se ensayaron otros compuestos respecto a su capacidad para proteger al DNA durante el procedimiento de encapsulación. Se precipitó DNA de plásmido en etanol y se resuspendió en agua o en una disolución de sulfato de dextrano. A continuación, se prepararon microesferas según el método del ejemplo 2. Se extrajo DNA de las microesferas antes y después de liofilizar y se analizó por electroforesis en gel de agarosa.

Los resultados sugirieron que la adición de un compuesto estabilizante condujo a la encapsulación de más DNA superenrrollado que la resuspensión de DNA solo en agua. La mayor mejora en la estructura del DNA se observó con una disolución de sulfato de dextrano al 10%. Aparentemente, la protección se produjo en dos niveles. Un efecto del sulfato de dextrano se vio en la pre-liofilización del DNA, ya que, tras la encapsulación, una mayor de DNA permaneció en el estado superenrrollado con cantidades crecientes de sulfato de dextrano. La protección dada por el compuesto estabilizante también se produjo durante el procedimiento de liofilización ya que la presencia del compuesto estabilizante durante este procedimiento aumentó el porcentaje de DNA que permanecía en el estado superenrrollado.

Para determinar si los efectos de TE y de otros compuestos estabilizantes fueron aditivos o no, se resuspendió DNA precipitado en etanol en TE o en agua, con o sin una disolución de otro compuesto estabilizante (por ejemplo, sacarosa, dextrosa, CTAB, ciclodextrina o dextrano). Se prepararon microesferas según el método del ejemplo 2. Se extrajo DNA de las microesferas y se analizó por electroforesis en gel de agarosa.

Los resultados demostraron que la resuspensión de DNA en una disolución de TE/compuesto estabilizante es mejor que o equivalente al uso de solo TE en tanto y cuanto un mayor porcentaje de DNA permanece en el estado superenrrollado después de encapsular en estas condiciones.

También se añadieron compuestos estabilizantes en combinación para determinar si los efectos de los compuestos estabilizantes son aditivos o no. Se precipitó DNA en etanol y se resuspendió en varias disoluciones de compuestos estabilizantes. El DNA se encapsuló como se describió en el ejemplo 2, se extrajo y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. Los resultados indicaron que pueden usarse combinaciones de compuestos estabilizantes para aumentar la cantidad de DNA superenrrollado encapsulado.

Ejemplo 5

Adición de excipientes

Para determinar si los compuestos excipientes tienen un efecto adverso o no sobre el DNA de plásmido encapsulado se prepararon microesferas a partir de DNA precipitado en etanol siguiendo el protocolo del ejemplo 2, con la excepción de que antes de liofilizar las microesferas se resuspendieron en disoluciones que contenían excipientes. A continuación, cada muestra se congeló y liofilizó como en el ejemplo 2. La concentración final de los excipientes en las microesferas tras la resuspensión en una concentración de a 50 mg/mL fue Tween 80 0,1%, D-sorbitol 5%, D-manitol 5% o carboximetilcelulosa (CMC) 0,5%. Se extrajo el DNA de las microesferas y se analizó sobre gel de agarosa.

Los resultados ilustraron que la adición de excipientes antes de liofilizar no afectó significativamente a la estabilidad del DNA o al grado de superenrrollamiento.

Ejemplo 6

Estudios con células in vitro Fagocitosis in vitro de micropartículas que contienen DNA

En cada uno de dos pocillos de una placa de cultivo de tejidos de seis pocillos se extendieron aproximadamente 10^{6} macrófagos en 3 mL de medio RPMI que contenía 10% de suero de ternero fetal. Se resuspendieron en 200 \muL de una disolución salina 5 mg de las micropartículas que contenían DNA que codificaba la luciferasa, y se añadieron 50 \muL de la suspensión resultante a uno de los pocillos que contenía microfagos. La placa se incubó a 37ºC durante 1-6 horas. La dispersión lateral versus a la frontal (es decir, la complejidad intracelular frente al tamaño) de las células se analizó por FACs usando un instrumento FACS Becton Dickinson. La figura 4 muestra los resultados. En la región 1 se encuentran las poblaciones celulares que no han fagocitado. Las células fagocitantes mantienen el mismo tamaño (perfil FSC) pero demuestran un perfil de dispersión lateral acrecentado. Estas células se encuentran en la región
R2.

Medida de la expresión de DNA tras la fagocitosis

En cada uno de dos pocillos de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos se extendieron aproximadamente 2,5 x 105^{6} macrófagos en 1 mL de medio RPMI que contenía 10% de suero de ternero fetal. La placa se incubó a 37ºC durante 6 horas. Se resuspendió en 400 \muL de una disolución salina 1 mg de las micropartículas liofilizadas que contenían DNA que codificaba la luciferasa. Se añadieron 6 \muL de la suspensión resultante a uno de los pocillos que contenía microfagos y a la otra se añadieron 25 \muL de suspensión. La placa se incubó a 37ºC durante 4 horas. El medio, incluyendo las micropartículas, se separó y se añadió a las células medio reciente. La placa se incubó de nuevo a 37ºC durante 1-5 días. Las células se cosecharon en un tubo y se hicieron rotar a 1500 rpm durante 5 minutos. Las células paletizadas se resuspendieron en 100 \muL de disolución tampón para lisis celular 1X (Promega) en un tubo EPPENDORF^{TM}. La mezcla se centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos con el fin de separar por precipitación cualquier residuo celular. El lisado celular se ensayó añadiendo 5 \muL del sobrenadante a 100 \muL de sustrato de luciferasa (Promega) y se midió la emisión de luz con una combinación TOPCOUNT^{TM} contador de centelleo/luminómetro (Packard Instruments).

Los datos de este experimento se dan en la tabla 5. Indican que las células que fagocitan micropartículas que, por ejemplo, contienen DNA de luciferasa, de hecho expresan el DNA. Así, se confirman la integridad y la funcionalidad del DNA. Los datos también indican que la absorción de las micropartículas mediante la fagocitosis no impide que el DNA alcance el núcleo.

TABLA 5 Fagocitosis de DNA encapsulado conduce a la expresión de un constructo de gen reportero de la luciferasa

14

Los datos se dan en cuentas por 0,01 minutos.

Ejemplo 7

Estudios con células in vivo Expresión in vivo de DNA incorporado

Se resuspendieron en 250 \muL de disolución salina 45 mg de cDNA de luciferasa en micropartículas. Se inyectaron 40 \muL de la suspensión resultante en cada músculo tibialis anterior de un ratón. Siete días después, cada tibialis anterior se diseccionó y se colocó en un tubo EPPENDORF^{TM} en hielo seco. Cada músculo tibialis anterior se molió hasta dar un polvo usando un mortero y un triturador enfriados con hielo seco y a continuación se retornó al tubo EPPENDORF^{TM}. Se añadieron 500 \muL de disolución tampón para lisis celular 1X (Promega). El tubo se agitó invirtiéndolo en un mezclador de vórtice a 4ºC durante 15 minutos. El tubo y su contenido se congelaron en nitrógeno líquido, a continuación se descongelaron a 37ºC. el ciclo de congelación/descongelación se repitió dos veces más. El tubo se centrifugó a 14.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se centrifugó de nuevo durante 5 minutos. Para ensayar la expresión, se añadieron 20 \muL del sobrenadante a 100 \muL de sustrato de luciferasa (Promega) y la emisión de luz se midió con una combinación TOPCOUNT^{TM} contador de centelleo/luminómetro (Packard Instruments).

Los datos de este experimento se dan en la tabla 6. Indican que las células musculares pueden expresar DNA liberado desde las micropartículas. Puesto que no se conoce que estas células fagociten, esto es un ejemplo de efecto depósito.

TABLA 6 Expresión en músculos de murina de DNA de luciferasa encapsulado

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Los datos se dan en cuentas por 0,01 minutos.

Generación de células T citotóxicas tras la inyección de micropartículas que contienen DNA

Se resuspendieron en 900 \muL de disolución salina 90 mg de micropartículas que contenían DNA que codificaba VSV-Npep. Se resuspendieron en 600 \muL de disolución salina 60 mg de micropartículas que contenían DNA vector testigo. Se resuspendieron en 300 \muL de disolución salina 300 \mug de DNA de plásmido VSV-Npep. Se resuspendieron en 300 \muL de disolución salina 300 \mug de DNA vector testigo. Se resuspendieron en disolución auxiliar de Freund incompleta (IFA) 150 \mug de péptido VSV-N.

Las cinco suspensiones se inyectaron intraperitonealmente, intramuscularmente o subcutáneamente, según el siguiente régimen:

1.: Intraperitoneal: a un primer grupo de 3 ratones se inyectaron intraperitonealmente 100 \muL de micropartículas que contenían DNA VSV-Npep (grupo 1). A un segundo grupo de 3 ratones se inyectaron 100 \muL de micropartículas que contenían DNA vector testigo (grupo 2).

2.: Intramuscular (en cada músculo tibialis anterior): a un tercer grupo de 3 ratones se inyectaron intramuscularmente 100 \muL de micropartículas que contenían DNA VSV-Npep (grupo 3). A un cuarto grupo de 3 ratones se inyectaron 100 \muL de micropartículas que contenían DNA vector testigo (grupo 4). A un quinto grupo de 3 ratones se inyectaron 50 \mug/pata de DNA de plásmido VSV-Npep (es decir, en ausencia de micropartículas) (grupo 5). A un sexto grupo de 3 ratones se inyectaron 50 \mug/pata de DNA de plásmido vector testigo (grupo 6).

3.: Subcutánea: a un séptimo grupo de 3 ratones se inyectaron subcutáneamente 100 \muL de micropartículas que contenían DNA VSV-Npep (grupo 7). A un octavo grupo de 3 ratones se inyectaron 50 \mug de péptido VSV-N/IFA (grupo 8).

Después de dos semanas a los grupos 5, 6 y 8 se les inyectó de nuevo, grupos que recibieron péptido sintético o DNA sin micropartículas. A los grupos 1-4 y 7, que inicialmente recibieron micropartículas no se les volvió a inyectar.

Siete días después de la última serie de inyecciones se cosecharon los bazos de murina. Se generaron suspensiones celulares simples por métodos estándar, se lisaron los glóbulos rojos y las células restantes se resuspendieron en RPMI con 10% de suero de ternero fetal para dar una concentración final de 4 x 10^{6} de células efectoras/mL. La mitad de las células de cada grupo se incubaron a continuación a 37ºC durante 6 días con un número igual de células estimulantes singénicas pulsadas con péptidos que previamente habían sido tratadas con mitomicina C. Las células restantes se incubaron solo con péptido 50 \muM.

Después del segundo día de incubación se añadieron 0,1 volúmenes equivalentes de sobrenadante que contenía IL-2, derivado de células incubadas en ConA. Después del sexto día de incubación, las células efectoras se cosecharon e incubaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo que contenían células diana pulsadas con péptido marcadas con ^{51}Cr a 37ºC durante 5 horas. La relación efector a diana en los pocillos varió de 200:1 a 1:1.

Para determinar el grado de lisis máxima se añadieron 200 \muL de disolución acuosa de dodecilsulfato de sodio al 10% (SDS) a ciertos pocillos que sólo contenían células diana. Para determinar el grado de lisis espontánea, se incubaron ciertos pocillos solamente con medio (es decir, células diana pero sin ninguna célula efectora). La lisis específica se calculó como sigue: [(lisis experimental)-(lisis espontánea)/(lisis máxima)-(lisis espontánea)] x 100 = lisis específica.

Los resultados se muestran en las figuras 5-9.

En el experimento asociado con la figura 5, se ensayaron células efectoras de ratones (grupo 1) intraperitonealmente inmunizadas con micropartículas que contenían DNA que codificaba un péptido de la proteína VSV-N respecto a la actividad citolítica contra varias células diana. El péptido VSV se enlaza con el receptor H-2K^{b} clase I de ratón. Las dianas singénicas expresan al receptor H-2K^{b} mientras que las dianas alógenas usadas en este experimento expresan el receptor H-2K^{b}.

La actividad CTL se ensayó en dianas singénicas (EL4) sin péptido, dianas singénicas (EL4/VSV) marcadas con péptido VSV, dianas singénicas (EL4/SV) marcadas con péptido SV (es decir, un péptido no específico), y dianas alógenas (P815/VSV) marcadas con péptido VSV.

Debido a que las dianas alógenas (P815/VSV) no expresan el receptor H-2K^{b} no deben ser reconocidas y lisadas por las células efectoras. Así, tampoco son lisadas las dianas P815 mezcladas con el péptido VSV no son lisadas. Las dianas singénicas (EL4) que no tienen el péptido VSV. Sólo son lisadas las dinas (EL4/VSV) que tienen tanto los receptores apropiados de MHC como el péptido apropiado.

Conjuntamente, los datos demuestran que la actividad CTL puede obtenerse por inmunización con micropartículas que contienen DNA que codifica un péptido VSV y la lisis es MHC restringida y péptido específica. En otras palabras, sólo el péptido apropiado con el receptor MHC apropiado es reconocido por los receptores de las células T del CTL generado por inmunización según la invención. Esto demostró que las micropartículas sirven a la función deseada.

A continuación, se comparó la respuesta CTL generada inmunizando ratones subcutáneamente con péptido sintético (grupo 8) con la respuesta CTL generada inmunizando ratones intraperitonealmente con micropartículas que contenían DNA que codifica el péptido VSV (grupos 1 y 2). En la figura 6 se muestra la lisis obtenida a una relación E:T de 100:1 para CTL generado inmunizando los ratones con micropartículas que incluyen DNA que codifica el péptido VSV-N (MS-VSV; grupo 1), micropartículas que incluían el DNA vector testigo que no codifica un péptido VSV (MS-VSV; grupo 2), o un péptido VSV-N (péptido; grupo 8). Las dianas fueron células singénicas (EL 4) marcadas con péptido VSV.

Los ratones inmunizados con el DNA de VSV-Npep in micropartículas (MS-VSV) generaron una respuesta CTL más fuerte (33% de lisis específica) que los ratones inmunizados con micropartículas testigo que contenían el DNA vector vacío (MS-vector) (lisis específica 10%). Los ratones inmunizados con el péptido VSV-N (péptido) generan una respuesta CTL más débil que los inmunizados con micropartículas que contienen DNA de VSV-Npep (MS-VSV). Por lo tanto, las micropartículas sirvieron para la función deseada.

Las respuestas CTL en ratones inmunizados intraperitonealmente con DNA de VSV-Npep contenido en micropartículas (MS-VSV) se compararon con las respuestas CTL de ratones inmunizados intramuscularmente con DNA de VSV puro (VSV). Las respuestas CTL en ratones inmunizados con las micropartículas que contenían DNA (MS-VSV; grupo 1) fueron más fuertes que las producidas en ratones inmunizados con DNA puro (VSV; grupo 5) a una relación E:T de 3:1 (fig. 7). Las dianas fueron células singénicas (EL 4) marcadas con péptido VSV. Los ratones que recibieron DNA puro fueron inmunizados dos veces, mientras que a los ratones inmunizados con micropartículas sólo se les dio un tratamiento. Por lo tanto, los datos de la figura 7 muestran que una inyección de DNA en micropartículas fue más efectiva que dos inyecciones de una mayor cantidad de DNA puro.

La figura 8 muestra los resultados de un experimento equivalente al relacionado en la figura 5, con la excepción de que las inyecciones fueron subcutáneas (ratones del grupo 8) en lugar de intraperitoneales. Este experimento demostró que las inyecciones subcutáneas de micropartículas que contienen DNA de VSV-Npep también son efectivas para producir respuestas CTL.

El experimento ilustrado en la figura 9 también es similar al de la figura 5, excepto que se usó DNA que codifica un péptido diferente con el fin de demostrar que los resultados obtenidos no fueron únicos para DNA de VSV-Npep. Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2 con micropartículas que contenían DNA que codifica un péptido del péptido E6 de papilomavirus (HPV) de ser humano. El péptido de HPV E6 denominado A2.1/4 se enlaza al receptor HLA-A2 de MHC de ser humano. El experimento evaluó la capacidad de los efectores CTL para lisar dianas singénicas (es decir, dianas que tienen el receptor HLA correcto) que estaban marcadas con el péptido HPV correcto (A2.1/4) u otro no marcado (ningún péptido). Las relaciones E:T se listan a lo largo del eje X.

Ejemplo 8

Tratamiento con micropartículas que contienen DNA

Según el procedimiento del ejemplo 1, se preparan micropartículas que contienen DNA que codifica un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos aproximadamente idéntica en un 50% a los residuos PLP 170-191 (SEQ ID nº: 2). A un paciente con esclerosis múltiple cuyas células T secretan citoquinas T_{H}1 en exceso (es decir, IL-2 y \gamma-IFN) en respuesta a autoantígenos se le inyecta intravenosamente 100 \muL a 10 ML de las micropartículas. La expresión del péptido semejante a PLP por APCs da lugar a la puesta en marcha del perfil de citoquinas de las células T, tal que en su lugar producen citoquinas T_{H}2 (es decir, IL-4 e IL-10) en respuesta a autoantígenos.

Ejemplo 9

Tolerización con micropartículas que contienen DNA

Según el procedimiento del ejemplo 1, se preparan micropartículas que contienen DNA que codifica un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se corresponde con los residuos 33-52 MBP (SEQ ID nº: 34). A un mamífero se le inyectó subcutáneamente 1-500 \muL de las micropartículas. La expresión del péptido MBP por APCs da lugar a la tolerización de células T que reconocen al autoantígeno.

Ejemplo 10

Implantación de micropartículas

Según el procedimiento del ejemplo 1, se asocia con un polímero para formar micropartículas una molécula de DNA, que incluye una secuencia de control de expresión unida operativamente a una secuencia que codifica tanto una secuencia traficante como un péptido esencialmente idéntico a los residuos 80-102 de la proteína básica de la mielina (MBP) (SEQ ID nº: 1). Separan las partículas más pequeñas de 100 \mum. El constituyente polímero de las micropartículas es poli(ácido láctico-co-ácido glicólico), en el que la relación de ácido láctico a ácido glicólico es 65:35 en peso. Las micropartículas resultantes se implantan quirúrgicamente subcutáneamente en un
paciente.

Ejemplo 11

Preparación de micropartículas que contienen tanto DNA como proteína

Se prepara DNA de plásmido por métodos estándar usando un juego MEGA-PREP^{TM} (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Para todas las manipulaciones del DNA se usa un juego de disoluciones amortiguadoras del pH exentas de endotoxinas (Qiagen). El DNA se resuspende en agua destilada, desionizada y estéril para dar una concentración final de 3 \mug/\muL. Adicionalmente, se añaden 0-40 mg de proteína purificada a aproximadamente 1 mL de la disolución de DNA. Se añade una masa de gelatina igual a aproximadamente 20% de la masa de proteína.

Se disuelven hasta 400 mg de PLGA (es decir, al menos diez veces la masa de proteína) en aproximadamente 7 mL de cloruro de metileno. La disolución de DNA/proteína se vierte en la disolución de PLGA y se homogeneiza o sonica para formar una primera emulsión. La primera emulsión se vierte en aproximadamente 50-100 mL de una disolución acuosa de un tensioactivo (por ejemplo, PVA de 0,05% a 2% en peso). La mezcla se homogeneiza a aproximadamente 3000-8000 rpm para formar una segunda emulsión. A continuación, las micropartículas se aíslan según el procedimiento del ejemplo 1.

Ejemplo 12

Tratamiento con micropartículas que contienen tanto DNA como proteína

Se preparan según el procedimiento del ejemplo 10 micropartículas que incluyen tanto una proteína antígeno que tiene los determinantes conformacionales necesarios para inducir una respuesta de células B contra el virus de la hepatitis B (HBV) como un DNA que codifica el epítope CTL de HBV. Se inmunizada con las micropartículas a un paciente infectado o en riesgo de sufrir infección con HBV.

La liberación lenta de la proteína desde las micropartículas no fagocitadas conduce al reconocimiento de los determinantes conformacionales de las células B y a la subsiguiente secreción de anticuerpos. La liberación lenta del DNA o la fagocitosis de otras micropartículas provoca APCs: (1) que se exprese el DNA de interés, generando de este modo una respuesta de las células T; y (2) que se digiera la proteína liberada desde las micropartículas, generando de este modo péptidos que son subsiguientemente presentados por moléculas de clase I o de clase II. La presentación por las moléculas de clase I promueve una respuesta CTL; la presentación por las moléculas de clase II promueve tanto respuestas de anticuerpos como de células T, puesto que las células T_{H} activadas por los complejos molécula clase II/péptido secretan citoquinas no específicas.

Los resultados son la eliminación del HBV del paciente y el impedimento continuo de la producción de virus dentro de las células del paciente.

Ejemplo 13

Fagocitosis por células dendríticas de murina de microesferas que contienen DNA de plásmido

Se prepararon microesferas mediante el procedimiento del ejemplo 2, excepto que durante el procedimiento de encapsulación se añadió un oligonucleótido fluorescente. Se aislaron células dendríticas esplénicas de ratones y se incubaron sin nada, con bolas fluorescentes, o con las microesferas preparadas. El análisis FACS de las células indicó que las bolas fluorescentes y las microesferas preparadas fueron ambas fagocitadas. Por otra parte, las microesferas preparadas no emitían fluorescencia a menos que hubieran sido ingeridas por las células dendríticas, sugiriendo que tras la fagocitosis las microesferas se hidrataban y degradaban, permitiendo la liberación del DNA encapsulado en el citoplasma celular.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): Solicitante: Pangea, Inc.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MICROPARTÍCULAS PARA EL SUMINISTRO DE UN ÁCIDO NUCLEICO

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 107

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(iv): DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Fish & Richardson, P.C.

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(B): CALLE: 225 Franklin Street

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: EE.UU.

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(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 02110-2804

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(v): FORMA LEÍBLE EN ORDENADOR

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(A): TIPO de MEDIO: disquete

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(B): ORDENADOR: IBM compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: Windows 95

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(D): PAQUETE INFORMÁTICO: FastSEQ para Windows versión 2.0

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(vi): FECHA DE SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/- - -

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-enero-1998

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(vii): FECHA DE SOLICITUD PREVIA:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/787.547

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 22-enero-1997

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Fraser, Janis K.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 34.819

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 08191/003W01

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(1) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 1:

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\sa{Gli Arg Tre Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Fen Fen Lis}

\sac{Asn Ile Val Tre Pro Arg Tre Pro Pro}

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Val Tir Val Tir Ile Tir Fen Asn Tre Trp Tre Tre Cis}

\sac{Gln Fen Ile Ala Fen Pro Fen Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Lis Met Arg Met Ala Tre Pro Leu Leu Met Gln Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tre Val Gli Leu Gln Leu Ile Gln Leu Ile Asn Val Asp Glu}

\sac{Val Asn Gln Ile Val Tre Tre Asn Val Arg Leu Lis Gln Gln}

\sac{Trp Val Asp Tir Asn Leu Lis Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ile Val Tre Tre Asn Val Arg Leu Lis Gln Gln Trp Val}

\sac{Asp Tir Asn Leu Lis Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Trp Val Asp Tir Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Gli Val Lis Lis Ile His Ile Pro Ser Glu Lis Ile Trp}

\sac{Arg Pro Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ile Val Lis Fen Tre Lis Val Leu Leu Gln Tir}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Tre Pro Pro Ala Ile Fen Lis Ser Tir Cis Glu Ile Ile}

\sac{Val Tre His Fen Pro Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lis Leu Gli Tre Trp Tre Tir Asp Gli Ser Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Lis Leu Gli Ile Trp Tre Tir Asp Gli Ser Val Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Tre Tir Asp Gli Ser Val Val Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Cis Cis Pro Asp Tre Pro Tir Leu Asp Ile Tre Tir His}

\sac{Fen Val Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Tre Pro Tir Leu Asp Ile Tre Tir His Fen Val Met Gln}

\sac{Arg Leu Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Ile Val Asn Val Ile Ile Pro Cis Leu Leu Fen Ser Fen}

\sac{Tre Gli Leu Val Fen Tir}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Val Ile Val Glu Leu Ile Pro Ser Tre Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tre His Val Met Pro Asn Trp Val Arg Lis Val Fen Ile}

\sac{Asp Tre Ile Pro Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Trp Val Arg Lis Val Fen Ile Asp Tre Ile Pro Asn Ile}

\sac{Met Fen Fen Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 18 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Pro Asn Ile Met Fen Fen Ser Tre Met Lis Arg Pro Ser}

\sac{Arg Glu Lis Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ala Glu Trp Lis Tir Val Ala Met Val Met Asp His}

\sac{Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ile Gli Tre Leu Ala Val Fen Ala Gli Arg Leu Ile Glu}

\sac{Leu Asn Gln Gln Gli}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Gln Tre Ile Glu Trp Ile Fen Ile Asp Pro Glu Ala Fen}

\sac{Tre Glu Asn Gli Glu Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ala His Tir Asn Arg Val Pro Ala Leu Pro Fen Pro Gli}

\sac{Asp Pro Arg Pro Tir Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Asn Ser Lis Ile Ala Fen Lis Ile Val Ser Gln Glu Pro}

\sac{Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tre Pro Met Fen Leu Leu Ser Arg Asn Tre Gli Glu Val Arg}

\sac{Tre}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Gli Fen Fen Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Fen}

\sac{Gli Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gli Fen Fen Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Fen Gli}

\sac{Ala Asn Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Fen Leu Leu Tre Arg Ile Leu Tre Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ile Leu Tre Ile Pro Gln Ser Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tre Pro Tre Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gli Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lis Tre Ile Ala Tir Asp Glu Glu Ala Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Val Tre Val Arg Ala Glu Arg Pro Gli}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gln Arg His Gli Ser Lis Tir Leu Ala Tre Ala Ser Tre}

\sac{Met Asp His Ala Arg His Gli}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Asp Tre Gli Ile Leu Asp Ser Ile Gli Arg Fen Fen Gli}

\sac{Gli Asp Arg Gli Ala Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Lis Ser His Gli Arg Tre Gln Asp Glu Asn Pro Val Val}

\sac{His Fen Fen Lis Asn Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Glu Asn Pro Val Val His Fen Fen Lis Asn Ile Val Tre}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Asn Pro Val Val His Fen Fen Lis Asn Ile Val Tre Pro}

\sac{Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Fen Fen Lis Asn Ile Val Tre Pro Arg Tre Pro Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Gli Fen Lis Gli Val Asp Ala Gln Gli Tre Leu Ser Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Asp Ala Gln Gli Tre Leu Ser Lis Ile Fen Lis Leu Gli}

\sac{Gli Arg Asp Ser Arg Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Met Gln Tir Ile Asp Ala Asn Ser Lis Fen Ile Gli Ile}

\sac{Tre Glu Leu Lis Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Tir Ile Lis Ala Asn Ser Lis Fen Ile Gli Ile Tre}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Asn Asn Fen Tre Val Ser Fen Trp Leu Arg Val Pro Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Fen Trp Leu Arg Val Pro Lis Val Ser Ala Ser His Leu}

\sac{Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Fen Ile Ile Lis Arg Tir Tre Pro Asn Asn Glu Ile Asp}

\sac{Ser Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Gln Ile Gli Asn Asp Pro Asn Arg Asp Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Arg Ala Val Fen Leu Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Arg pro Arg Pro Arg Arg Tir}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ala Asp Pro Tre Gli His Ser Tir}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ala Tir Gli Glu Pro Arg Lis Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Val Asp Pro Ile Gli His Leu Tir}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 52:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Leu Trp Gli Pro Arg Ala Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Ile Gli Ile Leu Tre Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Tre Val Ile Leu Gli Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tre Ala Pro Pro Ala His Gli Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Glu Lis Leu Ile Val Val Leu Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Leu Leu Ala Val Leu Tir Leu Tir Cis Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Fen Leu Pro Trp His Arg Leu Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Met Asn Gli Tre Met Ser Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Tre Trp Gli Gln Tir Trp Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Tre Asp Gln Val Pro Fen Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Leu Glu Pro Gli Pro Tre Val Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Asp Gli Tre Ala Tre Leu Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Glu Lis}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Tre Pro Pro Pro Gli Tre Arg Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Gli Arg Asn Ser Fen Glu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 69:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Ile Fen Gli Ser Leu Ala Fen Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Ile Ser Ala Val Val Gli Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cis Leu Tre Ser Tre Val Gln Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Leu Glu Asp Val Arg Leu Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Val Lis Ser Pro Asn His Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Fen Arg Glu Leu Val Ser Glu Fen Ser Arg Met}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Arg Leu Ser Glu pro Ala Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Pro Thr Gln Glu Pro Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Leu Gln Cis Val Asp Leu His Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Val Ala Ser Arg Gli Arg Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Met Ser Leu Leu Lis Asn Arg Fen Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Trp Asn Ser Tre Ala Fen His Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Leu Gln Ala Gli Fen Fen}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Leu Cis Leu Ile Fen Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Asp Tir Gln Gli Met Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Val Pro Fen Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Ile Leu Ser Pro Fen Met Pro Leu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Leu Leu Pro Ile Fen Fen Cis Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ile Leu Ser Tre Leu Pro Glu Tre Tre Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Leu Pro Ser Asp Fen Fen Pro Ser Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Leu His Leu Tir Ser His Pro Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Leu Met Pro Leu Tir Ala Cis Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Leu Tir Ser His Pro Ile Ile Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Leu Leu Ser Leu Gli Ile His Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Leu Leu Val Gli Ser Ser Gli Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Leu Ser Arg Tir Val Ala Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Ala Gln Fen Tre Ser Ala Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Met Asp Asp Val Val Leu Gli Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gli Leu Tir Ser Ser Tre Val Pro Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lis Leu Pro Gln Leu Cis Tre Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gln Tre Tre Ile His Asp Ile Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.500000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Fen Ala Fen Arg Asp Leu Cis Ile Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tir Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Tre}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tre Leu His Glu Tir Met Leu Asp Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Met Gli Tre Leu Gli Ile Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 107:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 8 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 107:

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\sa{Tre Leu Gli Ile Val Cis Pro Ile}

Claims

1. Una preparación de micropartículas, cada una de las cuales incluye una matriz polimérica y un ácido nucleico, matriz polimérica que consiste en uno o más polímeros sintéticos que tienen una solubilidad en agua de menos que 1 mg/L, en la que:

Al menos 90% de las micropartículas tienen un diámetro menor que 100 micrómetros; y

El ácido nucleico es un vector de expresión que consiste en moléculas circulares de DNA de un plásmido, al menos 50% de las cuales están superenrrolladas.

2. La preparación según la reivindicación 1, en la que al menos el 90% de las micropartículas tienen un diámetro menor que 20 micrómetros.

3. La preparación según la reivindicación 1, en la que el vector de expresión codifica un polipéptido antígeno y cada una de las micropartículas comprende un determinante proteínico antígeno.

4. La preparación según la reivindicación 3, en la que el determinante antígeno obtiene una respuesta de anticuerpos en un mamífero.

5. La preparación según la reivindicación 3, en la que el polipéptido antígeno obtiene una respuesta de células T.

6. La preparación según la reivindicación 5, en la que la respuesta de las células T es una respuesta de células T citotóxicas.

7. La preparación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el polipéptido antígeno es diferente del determinante antígeno.

8. Una micropartícula de un diámetro menor que 20 micrómetros, que comprende:

Una matriz polimérica que consiste en uno o más polímeros sintéticos que tienen una solubilidad en agua de menos que 1 mg/L; y

Moléculas de un ácido nucleico, al menos el 50% de las cuales son DNA superenrrollado de un plásmido circular.

9. La micropartícula según la reivindicación 8, en la que el DNA comprende una secuencia de control de expresión unida operativamente a una secuencia de codificación.

10. La micropartícula según la reivindicación 9, en la que la secuencia de codificación codifica un producto de expresión de al menos 7 aminoácidos de longitud que tiene una secuencia idéntica a la secuencia de: (a) un fragmento de una proteína de mamífero que se encuentra en la naturaleza o, (b) un fragmento de una proteína que se encuentra en la naturaleza de un agente infeccioso que infecta a un mamífero.

11. La micropartícula según la reivindicación 10, en la que el producto de expresión comprende una secuencia de aminoácidos al menos idéntica en un 50% a la secuencia de un fragmento de una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteína básica de mielina (MBP), proteína de proteolípidos (PLP), cadena invariante, GAD65, antígeno de células islote, desmogleína, \alpha-cristalina y \beta-cristalina, en la que el fragmento se enlaza a una molécula de MHC clase II.

12. La micropartícula según la reivindicación 10, en la que el producto de expresión comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID nºs 1-46.

13. La micropartícula según la reivindicación 10, en la que el producto de expresión comprende una secuencia traficante seleccionada del grupo que consiste en una secuencia que trafica con el retículo endoplasmático, una secuencia que trafica con un lisosoma, una secuencia que trafica con un endosoma y una secuencia que trafica con el núcleo.

14. La micropartícula según la reivindicación 10, en la que el producto de expresión comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de una porción anfígena de un antígeno tumoral.

15. La micropartícula según la reivindicación 14, en la que el antígeno tumoral se selecciona del grupo que consiste en los antígenos listados en la tabla 3.

16. La micropartícula según la reivindicación 10, en la que el producto de expresión comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de un fragmento antígeno de una proteína que es expresada en la naturaleza por un agente infeccioso seleccionado del grupo que consiste en un virus, una bacteria y un organismo eucariota
parasitario.

17. La micropartícula según la reivindicación 16, en la que el agente infeccioso se selecciona del grupo que consiste en papilomavirus de ser humano, virus de la inmunodeficiencia de ser humano, virus del herpes simple, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, especies Plasmodium, y micobacterias.

18. La micropartícula según la reivindicación 16, en la que el agente infeccioso en un virus crónico.

19. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que adicionalmente comprende un compuesto estabilizante.

20. La preparación o micropartícula según la reivindicación 19, en la que el compuesto estabilizante es un compuesto catiónico.

21. La preparación o micropartícula según la reivindicación 19, en la que el compuesto estabilizante es un hidrato de carbono o un agente de condensación con DNA.

22. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que la matriz polimérica es biodegradable.

23. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en la que la matriz polimérica consiste en un copolímero sintético biodegradable.

24. La preparación o micropartícula según la reivindicación 23, en la que el copolímero es poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA).

25. La preparación o micropartícula según la reivindicación 24, en la que la relación de ácido láctico a ácido glicólico en el copolímero está dentro del intervalo de 1:2 a 4:1 en peso.

26. La preparación o micropartícula según la reivindicación 24, en la que la relación de ácido láctico a ácido glicólico en el copolímero está dentro del intervalo de 1:1 a 2:1 en peso.

27. La preparación o micropartícula según la reivindicación 24, en la que la relación de ácido láctico a ácido glicólico en el copolímero es 65:35 en peso.

28. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en la que la matriz polimérica comprende además una molécula que fija la diana.

29. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 28, en la que la micropartícula o micropartículas tienen un diámetro de menos que 11 micrómetros.

30. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, en la que la micropartícula o micropartículas están suspendidas en una disolución acuosa.

31. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, en la que la micropartícula o micropartículas están en forma de un sólido seco.

32. La preparación o micropartícula según la reivindicación 19, en la que el compuesto estabilizante es un lípido.

33. La preparación o micropartícula según la reivindicación 32, en la que el lípido es un lípido cargado.

34. La preparación o micropartícula según la reivindicación 32, en la que el lípido es bromuro de hexadeciltrimetilamonio.

35. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en la que al menos 60% del DNA de plásmido circular está superenrrollado.

36. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en la que al menos 70% del DNA de plásmido circular está superenrrollado.

37. La preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, en la que al menos 80% del DNA de plásmido circular está superenrrollado.

38. Una preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, para usar como un medicamento o para administrar un ácido nucleico a un animal.

39. Uso de una preparación o micropartícula según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 37, para la preparación de un medicamento para tratar enfermedades cancerígenas o autoinmunes.

40. Un procedimiento para preparar micropartículas, que comprende:

(1): Proporcionar una primera disolución que comprende un polímero disuelto en un disolvente orgánico;

(2): Proporcionar una segunda disolución que comprende un ácido nucleico disuelto o suspendido en un disolvente polar o hidrófilo;

(3): Mezclar la primera y la segunda disolución para formar una primera emulsión; y

(4): Mezclar la primera emulsión con una tercera disolución que comprende un compuesto orgánico, para formar una segunda emulsión que comprende micropartículas de una matriz polimérica y de un ácido nucleico;

en la que ambas etapas de mezclado se llevan a cabo de una manera que minimiza la cizalla del ácido nucleico mientras que produce micropartículas que tienen un diámetro promedio en número más pequeño que 100 micrómetros, tal que al menos 50% del ácido nucleico consiste en DNA superenrrollado de un plásmido circular.

41. El procedimiento según la reivindicación 40, en el que la segunda disolución se prepara purificando el ácido nucleico y suspendiendo a continuación el ácido nucleico purificado en el disolvente polar o hidrófilo.

42. El procedimiento según la reivindicación 40, en el que la segunda disolución se prepara precipitando el ácido nucleico con un alcohol y suspendiendo a continuación el ácido nucleico precipitado en el disolvente polar o hidrófilo.

43. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 42, en el que la segunda disolución comprende además una disolución acuosa de un agente amortiguador del pH que comprende un compuesto amortiguador del pH seleccionado del grupo que consiste en ácido etilenodiaminotetra-acético, tris(hidroximetil)aminometano y sus combinaciones.

44. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 43, en el que la segunda disolución comprende además un compuesto estabilizante.

45. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 44, en el que la segunda disolución comprende además un tensioactivo.

46. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 45, en el que la segunda disolución comprende además un agente de condensación con DNA.

47. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 46, que además comprende resuspender las micropartículas en una disolución de un excipiente.

48. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 47, en el que la segunda emulsión se expone a una temperatura elevada.

49. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 48, que comprende la etapa adicional de mezclar la segunda emulsión con una cuarta disolución que comprende un compuesto orgánico.

50. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 49, que comprende la etapa adicional de lavar las micropartículas con una disolución acuosa, produciendo de este modo micropartículas lavadas.

51. El procedimiento según la reivindicación 50, que comprende las etapas adicionales de:

Someter las micropartículas lavadas a una temperatura por debajo de 0ºC, para producir micropartículas congeladas; y

Liofilizar las micropartículas congeladas, para producir micropartículas liofilizadas.

52. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 51, que comprende la etapa adicional de tamizar las micropartículas para separar esencialmente todas las que tengan un diámetro mayor que 100 micrómetros.

53. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 40 a 52, que comprende la etapa adicional de tamizar las micropartículas para separar esencialmente todas las que tengan un diámetro mayor que 20 micrómetros.

54. El procedimiento según la reivindicación 44, en el que el compuesto estabilizante es un lípido.

55. El procedimiento según la reivindicación 54, en el que el lípido es un lípido cargado.

56. El procedimiento según la reivindicación 54, en el que el lípido es bromuro de hexadeciltrimetilamonio.