ES2286882T3 - Composiciones de proteina de fusion de quinasa wee1, secuencias de nucleotidos, sistemas de expresion y procedimientos de uso. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para identificar un compuesto que modula la actividad de la quinasa Cds1 que comprende las etapas de: a) combinar: i) un compuesto de prueba; ii) una proteína Wee1 truncada que comprende una región que es funcional como un sustrato de fosforilación de Cds1 y que carece de los residuos de aminoácidos 1-9 de la proteína Wee1 nativa (número de acceso Genbank M16508) y, estando la proteína Wee1 truncada operativamente unida a glutatión-S-transferasa (GST); y iii) una composición que comprende una proteína Cds1; b) mantener la combinación de la etapa (a) en condiciones suficientes para que Cds1 fosforile dicha proteína Wee1; y c) determinar la cantidad de proteína Wee1 fosforilada, mediante lo cual la cantidad de Wee1 fosforilada indica si dicho compuesto de prueba modula la actividad de Cds1.
Description
Composiciones de proteínas de fusión de quinasa
WEE1, secuencias de nucleótidos, sistemas de expresión y
procedimientos de uso.
La invención se refiere a procedimientos y
composiciones para seleccionar compuestos que inhiben o modulan la
fosforilación de proteínas de fusión de Wee1 mediante quinasa
Cds1.
Los puntos de control del ciclo celular
garantizan que el ADN cromosómico se replica y repara antes de la
división nuclear (Hartwell et al, Science, 246:629, 1989; L.
Hartwell, Cell, 71:543, 1992; y S.J. Elledge, Science, 274:1664,
1996). En células de mamífero, la pérdida de control en los puntos
de control da como resultado reorganizaciones, amplificación y
pérdida de cromosomas, acontecimientos que se asocian de manera
causal con el cáncer. En levaduras, son vitales los controles en
los puntos de control para la supervivencia cuando el ADN está
dañado o se inhibe la replicación.
Cdc2, la quinasa dependiente de ciclina que
inicia la mitosis, es la diana final de los puntos de control de la
reparación y la replicación del ADN y está regulada por quinasas de
los puntos de control que se acoplan a la mitosis a la finalización
de la replicación y reparación de ADN. La quinasa Chk1 del punto de
control de la reparación regula Cdc25, una fosfatasa que activa
Cdc2. En la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe,
Cdc2 está inhibida por fosforilación en la
tirosina-15. Esta fosforilación está catalizada por
las quinasas Wee1 y Mik1 y revertida por la fosfatasa Cdc25. La
fosforilación inhibidora de Cdc2 es crucial para los puntos de
control de la replicación y la reparación en células de levadura de
fisión y humanas (Enoch et al, Cell, 60:665, 1990; Lundgren
et al, Cell, 64:1111, 1991; Jin et al, J. Cell Biol.,
134:963 (1996); Blasina et al, Mol. Biol. Cell, 8:1013,
1997; y Rhind et al, Genes Dev., 11:504, 1997). Chk1
aparentemente hace cumplir el punto de control de la reparación de
ADN fosforilando e inhibiendo Cdc25 (Rhind et al, Genes
Dev., 11:504, 1997; Furnari et al, Science, 277:1495, 1997;
Sánchez et al, Science, 277:1497 (1997); y Peng et
al, Science, 277:1501, 1997). Sólo se requiere Chk1 para el
punto de control de la reparación, no para el punto de control de
la replicación activado por hidroxiurea (HU) (Walworth et
al, Nature, 363:368, 1993; y al-Khodairy et
al, Mol. Biol, Cell, 5:147, 1994).
Por tanto, la quinasa Wee1 participa en la
regulación de puntos de control del ciclo celular durante la mitosis
catalizando la fosforilación de la quinasa dependiente de ciclina
que inicia la mitosis, Cdc2. No se ha caracterizado bien el papel
de Wee1 en estos procesos reguladores para controlar el ciclo
celular.
La quinasa Cds1 también se ha implicado en el
proceso de los puntos de control, aunque no se comprende su papel
(Marukami et al, Nature, 374: 817, 1995).
Wu y Russell (Nature, 1993, 363:
738-741) describen un vector de expresión que
comprende una secuencia de nucleótidos aislada, que codifica una
proteína Wee1 recombinante que carece de los primeros 10 aminoácidos
N-terminales.
Coleman et al. (Cell, 1993,
72:919-929) describen fragmentos de Wee1 truncada,
que carecen del extremo amino o del carboxilo de la proteína.
Existe una necesidad de sistemas para
caracterizar el papel de Wee1 y Cds1 en la regulación o ciclo
celular, y para seleccionar compuestos que inhiben o modulan los
efectores de estos procesos, particularmente inhibidores de la
función de Wee1 o Cds1.
Se ha descubierto ahora que Wee1 está
fosforilado por Cds1, y que Cds1 tiene un importante papel en la
regulación del punto de control de la replicación para la mitosis.
También se ha descubierto que puede usarse Wee1 en diversas formas,
incluyendo proteínas truncadas basadas en Wee1, en composiciones y
procedimientos para evaluar los componentes de los procesos
dependientes de Wee1 relacionados con el punto de control de la
replicación, particularmente Cds1.
Por tanto, la invención se refiere, en un
aspecto, a ácidos nucleicos que codifican una proteína Wee1
truncada, incluyendo vectores de expresión que contienen los ácidos
nucleicos para la expresión de la proteína Wee1, según se define en
las reivindicaciones 9-13.
La invención también se refiere a
procedimientos, definidos en las reivindicaciones 1 y 14, para
identificar compuestos que modulan la función de Wee1, o que
modulan la capacidad de Cds1 para fosforilar Wee1.
Resultarán evidentes otros usos para el experto
en la técnica a la luz de las presentes descripciones.
Las figuras 1A-1D ilustran la
asociación de una quinasa regulada por HU con el extremo
NH_{2}-terminal de Wee1 tal como se describe en
el ejemplo 2.
La figura 1A es una fotografía de un análisis en
gel de SDS-poliacrilamida de GST:Wee1^{152} y los
productos de degradación producidos en bacterias y purificados con
GSH-Sepharose. Los productos de degradación
principales son GST fusionada a -70 aminoácidos de Wee1
(GST:Wee1^{70}) y GST no fusionada. Se tiñeron las proteínas con
azul de Coomassie.
La figura 1B es una fotografía de un análisis de
proteínas de células que se trataron con HU 12 mM durante un
transcurso de tiempo de 1 hora a 30ºC. Se incubaron los lisados
celulares con proteínas GST:Wee unidas a
GSH-Sepharose. Se lavó la
GSH-Sepharose y se sometió a ensayo para determinar
la actividad quinasa asociada. Se muestran las posiciones de
GST:Wee1^{152} y GST:Wee1^{70} tras electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida al 12%.
La figura 1C es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que la inactivación mutacional de cdc22, que
codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa,
potencia la fosforilación de GST:Wee1^{70}. Se hicieron crecer
células que portaban el alelo cdc22-M4S
sensible a la temperatura o células de tipo natural a 25ºC. Se
dividieron los cultivos y se mantuvieron a 25ºC o se incubaron a
35,5ºC durante 90 min. Se realizaron ensayos de fosforilación de
GST:Wee1 tal como se describió anteriormente.
La figura 1D es un fotomontaje de gráfica y
fotografía que ilustra la activación de la quinasa que fosforila
GST:Wee1^{70} en extractos de células
cdc25-22 liberadas en HU a partir de una
detención en G2. Se cambió un cultivo de células
cdc25-22 que se hizo crecer a 25ºC, a 35,5ºC
durante 4 h. se dividió el cultivo y se trató con HU 12 mM o se
trató de manera simulada durante 45 min. a 35,5ºC. Se devolvieron
ambos cultivos a 25ºC y se tomaron muestras cada 10 min. El índice
de tabicación marca la finalización de la mitosis. Se sometieron a
ensayo los lisados de cada punto de tiempo para determinar la
GST:quinasa Wee1^{70}. La fosforilación de GST:Wee1^{70} se
produjo en las muestras tratadas con HU tras la salida de M,
mientras que la fosforilación de GST:Wee1^{70} siguió siendo baja
en las muestras del cultivo tratado de manera simulada. En el
cultivo tratado de manera simulada, aumentó la actividad de la
quinasa que fosforila GST:Wee1^{152} a medida que las células
experimentaron la mitosis.
Las figuras 2A-2D ilustran que
Cds1 es la quinasa que fosforila GST:Wee1^{70} tal como se
describe en el ejemplo 2.
La figura 2A es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que la fosforilación de GST:Wee1^{70}
depende de Rad1 y Rad3. Se dividieron cultivos de cepas de tipo
natural, rad1 y rad3 y se trataron durante 1 h con
HU, o se trataron de manera simulada, y luego se sometieron a ensayo
para determinar la fosforilación de GST:Wee1^{70} tal como se
describe en la figura 1.
La figura 2B es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que la fosforilación de GST:Wee1^{70}
depende de Cds1 pero no de Chk1. Se dividieron cultivos de tipo
natural, chk1 y cds1 y se trataron durante 1 h con
HU, o se trataron de manera simulada. Se sometió a ensayo la
fosforilación de GST:Wee1.
La figura 2C es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que Cds1 interacciona con GST:Wee1 pero no
con GST. Se incubaron lisados de las células tratadas con HU que
expresan Cds1 marcado con epítopo (Cds1^{HAHIS}), expresado desde
el locus genómico cds1, con GST o proteínas GST:Wee1 unidas a
GSH-Sepharose. Tras lavado extenso, se resolvieron
las muestras mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida al 10% y se sometieron a
inmunotransferencia con anticuerpos contra HA y GST.
La figura 2D es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que Wee1 interacciona con GST:Cds1 pero no
con GST:Chk1 in vivo. Se hicieron crecer cepas que portan
constructos de nmt1:GST:chk1^{+} o
nmt1:GST:cds1^{+} integrados en medio mínimo (EMM2) sin
tiamina a 30ºC durante 16 h para inducir la expresión de proteínas
de fusión con GST. Se lisaron las células y se purificaron las
proteínas de fusión con GST con GSH-Sepharose. Tras
lavado extenso, se resolvieron las muestras mediante electroforesis
en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se sometieron
a inmunotransferencia con anticuerpos contra Wee1, Cdc25 y GST. Se
detectó una proteína de \sim110 kDa correspondiente a Wee1 en la
muestra de GST:Cds1, mientras que se detectó una proteína de
\sim80 kDa correspondiente a Cdc25 en la muestra de GST:Chk1. No
se detectó la proteína de \sim110 kDa en las muestras preparadas
a partir de células \Deltaweel. GST:Cds1 y GST:Chk1 migran
a posiciones correspondientes a \sim82 y \sim80 kDa,
respectivamente.
Las figuras 3A-3D ilustran que
HU estimula la actividad de la quinasa Cds1, la unión de Cds1 a
GST:Wee1^{70} en los lisados y la acumulación de Mik1 tal como se
describe en el ejemplo 2. La figura 3A es una fotografía de un
análisis de proteínas que ilustra que HU estimula la unión de Cds1 a
GST:Wee1^{70}. Se dividió un cultivo de células que expresan
Cds1^{HAHIS} desde el locus genómico cds1 y se trató
durante 3,5 h con HU o se trató de manera simulada. Se dividieron
los cultivos de nuevo y se procesaron las muestras para la
purificación con Ni^{2+}-NTA de Cds1^{HAHIS} en
condiciones desnaturalizantes o la purificación de las proteínas
que se unen a proteínas GST:Wee1 en condiciones no
desnaturalizantes. Tras lavado extenso, se resolvieron las muestras
mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
al 10% y se sometieron a análisis de inmunotransferencia.
La figura 3B es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra que HU activa la actividad de la quinasa
Cds1. En un experimento separado, se purificó Cds1^{HAHIS} en
condiciones nativas y se sometió a ensayo para determinar la
actividad de autofosforilación (panel superior). El análisis de
inmunotransferencia confirmó que se recuperaban cantidades
similares de Cds1^{HAHIS} en las muestras tratadas con HU y de
manera simulada (panel inferior).
La figura 3C es una fotografía de un análisis de
proteínas que ilustra un aumento dependiente de Cds1 y Rad3 -en la
abundancia de Mik1 en las células tratadas con HU. Se incubaron
células de tipo natural, cds1 y rad3 en las que mik1
genómico codificaba la proteína Mik1^{HAHIS} durante 4 h en YES a
25ºC con HU 12 mM o se trataron de manera simulada. Se purificó la
proteína Mik1^{HAHIS} mediante purificación con
Ni^{2+}-NTA en condiciones desnaturalizantes y se
detectó mediante inmunotransferencia con anticuerpos contra HA.
La figura 3D es una fotografía de cultivos
celulares que ilustra que Mik1 es importante para la supervivencia
al tratamiento con HU. Se cultivaron en placa diluciones en serie de
células de tipo natural y mik1 en medio YES complementado
con HU 0 ó 6 mM y se incubaron durante 2 días a 30ºC.
La figura 4 ilustra la detención del ciclo
celular producida por la expresión de grandes cantidades de GST:Cds1
tal como se describe en el ejemplo 2. Se incubaron las células que
tenían un constructo nmt1:GST:cds1^{+} integrado en medio
de represión de nmtl (promotor "off" ("de inactivación"))
o medio de inducción (promotor "on" ("de activación"))
durante 19 h a 30ºC. La expresión de GST:Cds1 indujo la detención
del ciclo celular en cepas de tipo natural, rad3 y chk1. El
análisis de citometría de flujo confirmó que estas células se
detuvieron con un contenido de ADN 2C. Las células que expresan
Cdc2Y15F, una forma de Cdc2 en la que se sustituye la tirosina en
la posición 15 por fenilalanina, no fueron sensibles a GST:Cds1.
Las figuras 5A-5B son gráficas
que ilustran que se suprime el punto de control de la replicación en
células cds1 chk1 tal como se describe en el ejemplo 2. La
figura 5A muestra que se obtuvieron cultivos sincrónicos mediante
elutriación centrífuga. Se controló la progresión a través de la
mitosis en presencia de HU 12 mM mediante la puntuación de células
septadas o binucleadas. Las células de doble mutante cds1
chk1 y rad3 experimentaron mitosis en presencia de HU, mientras
que se detuvo la división en cepas de control (de tipo natural,
mutantes individuales cds1 y chk1).
La figura 5B muestra que las células de doble
mutante cds1 chk1 yrad3 son igualmente hipersensibles a la
inactivación mediante HU 12 mM. Las célula de tipo natural y
chk1 no fueron sensibles a HU, mientras que las células
cds1 eran moderadamente sensibles.
La invención describe composiciones y sistemas
para seleccionar compuestos que afectan al papel de Wee1 en puntos
de control del ciclo celular. En particular, la invención describe
una proteína truncada recombinante que contiene Wee1 que puede
usarse en combinación con otros componentes del ciclo celular,
particularmente Cds1, Chk1, Cdc2, Cdc25 y proteínas de puntos de
control similares, en procedimientos para identificar y caracterizar
rutas reguladoras y para identificar compuestos que modulan y/o
inhiben componentes en las rutas, particularmente Cds1.
La invención describe proteínas de fusión
GST:Wee1, que son útiles en los ensayos. La invención también
describe una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una
proteína de fusión que contiene quinasa Wee1 truncada. También se
describen vectores de expresión para la expresión de una proteína de
fusión de esta invención.
Además, la invención describe un ensayo para
seleccionar moduladores de la regulación de puntos de control
usando proteínas de fusión de Wee1. Un ensayo particular selecciona
compuestos que modulan la actividad de la quinasa Wee1 o la quinasa
Cds1.
En el presente documento, se describen proteínas
Wee1 truncadas, ácidos nucleicos aislados que codifican proteínas
Wee1, y vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos
útiles para expresar una proteína Wee1 de esta invención. Las
proteínas Wee1 son útiles para la evaluación de la función de la
proteína Wee1, particularmente para identificar moduladores de la
actividad de Wee1 o Cds1.
En una realización, la invención se refiere al
uso de una proteína Wee1 truncada para evaluar la función de Wee1 y
para seleccionar moduladores de Wee1 o su molécula efectora, Cds1.
Una proteína Wee1 truncada es un polipéptido que tiene una
secuencia de residuos de aminoácidos derivada de una proteína Wee1
nativa, y que comprende la región de Wee1 que es un sustrato
funcional de Cds1. Preferiblemente, la proteína Wee1 truncada tiene
una secuencia que corresponde sustancialmente a la secuencia de
residuos de aminoácidos de Wee1 nativa, y más preferiblemente tiene
la misma secuencia de residuos de aminoácidos que se encuentra en la
proteína Wee1 nativa.
Por "corresponde sustancialmente a"
significa que puede haber sustituciones y/o deleciones en la
secuencia de residuos de aminoácidos de Wee1 nativa siempre que se
no se vea afectada sustancialmente la actividad biológica de la
proteína Wee1 como sustrato funcional de Cds1. Es decir, la proteína
Wee1 truncada con una secuencia modificada actúa en los ensayos tal
como se describe en los ejemplos para los fines de medir la
actividad de Wee1.
Se entiende que la longitud de una proteína Wee1
puede variar siempre que esté presente la región para actuar como
un sustrato funcional de la fosforilación de Cds1, tal como se
describe en el presente documento. Una proteína Wee1 truncada
preferida comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que
corresponde a los residuos de aminoácidos 11-70 de
Wee1 nativa, preferiblemente los residuos 11-72 ó
10-70 ó 10-72. Se prefiere
particularmente una proteína que comprende los residuos
11-72. En una realización relacionada, una proteína
Wee1 truncada comprende los residuos 11-152 o los
residuos 10-152. También pueden describirse y
construirse fácilmente otras combinaciones mediante los
procedimientos descritos en el presente documento, y por tanto, no
debe considerarse que la invención está limitada de este modo.
Wee1 es una proteína grande y la secuencia
completa de residuos de aminoácidos y la correspondiente secuencia
de nucleótidos de ADNc se conocen bien y están disponibles en la
base de datos Genbank con el número de acceso M16508.
Mediante el término "truncada" se quiere
decir que la proteína Wee1 no es la proteína Wee1 de tipo natural,
de longitud completa; en su lugar una proteína truncada contiene
deleciones de residuos de aminoácidos en el extremo
amino-terminal, y opcionalmente también en el
extremo carboxi-terminal de la secuencia de tipo
natural tal como se describe en el presente documento. Las
deleciones particularmente preferidas incluyen proteínas en las que
se han delecionado los residuos 1-9, los residuos
1-10, los residuos 73-152 o los
residuos 71-152.
Se describen proteínas Wee1 truncadas
particularmente preferidas en los ejemplos, y tienen una secuencia
de residuos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1 para el
constructo proteico GST:Wee1(11-72) y la
mostrada en SEC ID NO 3 para el constructo proteico
GST:Wee1(11-152).
Se proporciona una proteína Wee1 truncada objeto
en la forma de una proteína de fusión. Es decir, una proteína que
comprende una proteína Wee1 truncada de la presente invención
operativamente unida a
glutatión-S-transferasa (GST) en la
que la unión operativa está en forma de un enlace peptídico que se
encuentra normalmente entre los aminoácidos de un polipéptido. Las
proteínas de fusión se conocen bien en la técnica y se usan por las
ventajas proporcionadas por la presencia de una segunda función
proteica proporcionada por esa segunda proteína. Estas funciones
pueden incluir etiquetas para facilitar el aislamiento o la
identificación de la proteína de fusión, para producir una proteína
bifuncional, y funciones similares.
Se describen a modo de ejemplo proteínas de
fusión, nucleótidos, vectores de expresión y procedimientos para
preparar las proteínas de fusión, nucleótidos y vectores en los
ejemplos.
En otra realización, la invención contempla una
molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína Wee1
truncada de esta invención, y vectores de expresión que pueden
expresar la proteína desde el ácido nu-
cleico.
cleico.
El ácido nucleico tiene una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína de fusión GST:Wee1 tal como
se muestra en SEC ID NO 1 ó 3.
También se contemplan vectores de expresión para
la expresión de una proteína Wee1 truncada de la presente
invención. Un vector de expresión comprende un ácido nucleico de la
presente invención operativamente unido a los elementos de ácido
nucleico recombinantes necesarios para la transcripción y la
traducción del ácido nucleico para expresar la Wee1 codificada.
Tales elementos de control de la expresión, de la transcripción y
de la traducción se conocen bien en la técnica y la técnica no debe
considerarse como limitante. Estos elementos de control de la
expresión pueden incluir además potenciadores de la transcripción,
promotores de la transcripción, iniciadores y terminadores de la
traducción, y elementos similares.
Se describen vectores de expresión preferidos en
los ejemplos, o están disponibles comercialmente a partir de una
variedad de fuentes. Se prefieren particularmente los vectores de
expresión pGEX disponibles comercialmente. Se muestra la secuencia
de nucleótidos completa de dos vectores preferidos en SEC ID NO 2 y
4, y corresponden a
pGEX-GST:Wee1(11-72) y
pGEX-GST:Wee1(11-152),
respectivamente.
La invención también contempla una variedad de
procedimientos para evaluar la función de Wee1, y particularmente
para identificar moduladores de Wee1 o moduladores de Cds1, que
fosforila Wee1. Tal como se muestra mediante los ejemplos, el
análisis de los diversos componentes de la regulación del ciclo
celular, particularmente el punto de control de la replicación,
puede llevarse a cabo en una variedad de formatos, incluyendo
mediante el uso de proteínas aisladas, lisado celular que contiene
uno o más de los componentes, cepas genéticas de las células para
proporcionar diferentes componentes del punto de control, todos en
combinaciones con la proteína Wee1 truncada de esta
invención.
invención.
\newpage
Un procedimiento preferido implica la evaluación
de la interacción entre Cds1 y Wee1, en el que se observa que Wee1
es un sustrato de fosforilación para Cds1. El sitio en Wee1 para la
fosforilación está en la parte amino-terminal de la
proteína Wee1 designada como el sustrato funcional para la
fosforilación de Cds1 tal como se describe en el presente
documento.
Por tanto, en una realización, la invención
describe un procedimiento para identificar un compuesto que modula
la actividad de la quinasa Cds1 que comprende las etapas de:
a) combinar:
- i)
- un compuesto de prueba;
- ii)
- una proteína Wee1 truncada tal como se describió anteriormente; y
- iii)
- una composición que comprende una proteína Cds1;
b) mantener la combinación de la etapa (a) en
condiciones suficientes para que Cds1 fosforile dicha proteína Wee1
truncada; y
c) determinar la cantidad de proteína Wee1
fosforilada, mediante lo cual la cantidad de Wee1 fosforilada indica
si dicho compuesto de prueba modula la actividad de Cds1.
En este procedimiento, el compuesto de prueba
puede ser cualquier sustancia que se cree que tiene un efecto sobre
la capacidad de Cds1 para fosforilar Wee1, tal como una molécula o
sustancia de prueba que se cree que es un candidato a fármaco para
modular los puntos de control del ciclo celular inhibiendo la
interacción de fosforilación entre Cds1 y Wee1.
La mezcla de reacción de prueba contiene además
una proteína Wee1 truncada según la presente invención, y puede
proporcionarse en una variedad de formas, tal como se describe en el
presente documento. La mezcla contiene además una composición que
comprende una proteína Cds1 que puede fosforilar una proteína Wee1
truncada de esta invención en una cantidad suficiente para producir
fosforilación detectable en las condiciones de reacción.
La fuente de la proteína Cds1 en una composición
que contiene una proteína Cds1 puede variar ampliamente, y por
tanto, no debe considerarse que la invención está limitada de este
modo. Por ejemplo, la proteína puede estar en forma de una proteína
aislada proporcionada in vitro a una mezcla de reacción. La
proteína Cds1 puede aislarse mediante una variedad de
procedimientos conocidos que incluyen la extracción bioquímica o la
inmunoadsorción a partir de lisados celulares, la expresión de
proteínas recombinantes usando ADNc de Cds1 clonado, y
procedimientos similares conocidos en las técnicas de quinasas de
puntos de control.
También puede proporcionarse una proteína Cds1
preparando un lisado de una célula que contiene una proteína Cds1,
tal como se describe en el presente documento. Se dispone de muchas
cepas genéticas diferentes de células, tales como cepas de
levaduras (por ejemplo, S. pombe), que expresan proteínas
Cds1 de tipo natural (wt, "wild type") o genéticamente
variantes adecuadas para su uso en los procedimientos de la presente
invención, cepas y preparación y manejo de lisados celulares que se
describen con más detalle en los ejemplos. Además, tal como se
muestra en el presente documento, Cds1 se une a Wee1, y por tanto,
puede aislarse mediante el uso del aislamiento con perlas de
Sepharose de la proteína GST:Wee1 tras su mezcla con lisados
celulares que contienen Cds1, tal como se describe en los
ejemplos.
Se conocen generalmente bien en la técnica las
condiciones para mantener la mezcla combinada, para permitir la
fosforilación catalizada por Cds1 de Wee1, pueden variar ampliamente
dependiendo del formato de reacción y, por tanto, no han de
considerarse limitantes. Se describen ejemplos de las condiciones de
reacción en los ejemplos y en la técnica, e incluyen una variedad
de componentes de reacción para mantener la bioquímica de la
fosforilación de Wee1 por Cds1, incluyendo tampones, donadores de
fosfato y similares.
También pueden variar ampliamente los
procedimientos para determinar las cantidades de la reacción de
fosforilación, y dependen en parte de la naturaleza de la química
de la reacción. Normalmente, el donador de fosfato tiene un grupo
saliente de fosfato marcado, tal como
gamma-^{32}P, y un sustrato marcado similar. La
detección también puede implicar aislar la proteína Wee1 y medir la
cantidad de marcador presente en la proteína Wee1, tal como se
describe en los ejemplos usando electroforesis en gel de SDS y
autografía para medir la cantidad de radiactividad asociada con la
proteína Wee1.
Pueden determinarse las cantidades relativas de
fosforilación usando comparaciones con reacciones control con
cantidades de la proteína Cds1, la proteína Wee1 y condiciones de la
reacción control conocidas, tal como se conoce bien.
En una realización relacionada, la invención
contempla un procedimiento para identificar un compuesto que modula
la actividad de la quinasa Wee1 que comprende las etapas de:
a) combinar:
- i)
- un compuesto de prueba;
- ii)
- una proteína Wee1 truncada de SEC ID NO:1 ó 3; y
- iii)
- un reactivo para Wee1;
b) mantener la combinación de la etapa (a) en
condiciones adecuadas para que Wee1 reaccione con dicho reactivo;
y
c) determinar la cantidad en que reacciona Wee1
con dicho reactivo, mediante lo cual la cantidad de reacción indica
si dicho compuesto de prueba modula la actividad de Wee1.
Muchos aspectos del procedimiento anterior son
similares a los del procedimiento descrito anteriormente en el
presente documento para identificar moduladores de la fosforilación
por Cds1 de Wee1, y por tanto, no se tratarán de nuevo.
En el procedimiento, un reactivo para Wee1 se
refiere a cualquier compuesto o proteína que interacciona con Wee1
en una reacción detectable, y puede incluir un cofactor para la
reacción, un sustrato para la quinasa Wee1, o una enzima que
utiliza por sí misma Wee1 como sustrato, cualquiera de los cuales se
modifica en la reacción de tal manera que puede medirse la cantidad
de reacción.
Por tanto y por ejemplo, el reactivo puede ser
un sustrato donador de fosfato que reacciona en la mezcla de
reacción, tal como un sustrato de quinasa Cds1 que dona un fosfato
marcado a Wee1 en presencia de Cds1 (por ejemplo,
[gamma-^{32}P]ATP). En este caso, la
determinación comprende medir la fosforilación de la proteína Wee1.
Como alternativa, el reactivo puede ser un sustrato de Wee1 tal como
Cdc22 que se fosforila por Wee1 tal como se describe en el presente
documento, y la determinación comprende medir la fosforilación de
Cdc22 de manera similar a los procedimientos descritos en el
presente documento.
En los ejemplos, se describen otros formatos de
procedimiento a modo de ejemplo.
Los siguientes ejemplos ilustran, pero no
limitan, la presente invención.
Para estudiar el papel de Wee1 sobre Chk1, se
diseñó un sistema modelo usando proteínas de fusión basadas en
Wee1. Se desarrolló la justificación porque se sabía que sólo se
requiere Chk1 para el punto de control de la reparación, no para el
punto de control de la replicación activado por hidroxiurea (HU)
(Walworth et al, Nature, 363:368, 1993; y
al-Khodairy et al, Mol. Biol. Cell, 5:147,
1994). Sin embargo, se suprime rápidamente una detención del ciclo
celular inducida por Hu tras la inactivación de la proteína Wee1
sensible a la temperatura en un fondo de mik1, mostrando que el
punto de control de la replicación requiere la fosforilación
inhibidora de Cdc2. Wee1 y Mik1 no se requieren individualmente para
una detención por HU, lo que indica que Wee1 y Mik1 pueden estar
reguladas de manera coordinada por el punto de control de la
replicación. Para probar esta hipótesis, se preparó un constructo
para evaluar si Wee1 se fosforilaba por una quinasa activada por
HU, centrándose la atención en el dominio regulador
NH_{2}-terminal (Aligue et al, J. Biol.
Chem., 272:13320, 1997).
Para este fin, se diseñó y construyó una fusión
de proteína glutatión-S-transferasa
(GST) con los aminoácidos 10-152 de Wee1, y se
designa como GST:Wee1^{152} (también denominada en el presente
documento como GST:Wee1(11-152).
En primer lugar, se preparó un fragmento de PCR
que codifica los aminoácidos 10 a 152 de Wee1 usando la secuencia
de nucleótidos y la secuencia de residuos de aminoácidos conocidas
de la proteína Wee1 nativa, incorporando un sitio NdeI en 5' y un
sitio NotI/codón de terminación en 3' en el fragmento. Se clonó
entonces este fragmento en un vector pGEX modificado y se
transformó en el huésped de expresión E. coli BL21 (DE3)
[Shiozaki et al, Meth. Enz., 283:506 (1997)]. El constructo
de vector de expresión se denomina en el presente documento como
pGEX-GST:Wee1(11-152), y
tiene una secuencia de nucleótidos completa mostrada en SEC ID NO
4.
De manera similar, se diseñó y construyó una
fusión de proteína de GST con los aminoácidos 11-72
de Wee1, y se designa como GST:Wee1^{70} (también denominada en
el presente documento como GST:Wee1(11-72).
El constructo de vector de expresión se denomina en el presente
documento como
pGEX-GST:Wee1(11-72), y tiene
una secuencia de nucleótidos completa mostrada en SEC ID NO 2.
Se indujo la expresión de una proteína de fusión
GST:Wee1 por el vector de expresión pGEX en el huésped BL21
mediante la adición de IPTG (1 mM) a células con crecimiento
exponencial a DO600 = 0,6 en medio LB más ampicilina 50 \mug/ml a
37ºC. Tras 2 horas a 37ºC, se recogieron las células por
centrifugación y se almacenaron a -70ºC en alícuotas (volumen de
sedimento de 200 \mul). Se lisaron las células en 600 \mul de
tampón de lisis [Tris 50 mM (pH 8), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM,
glicerol al 10%, NP-40 al 0,1%,
leupeptina/aprotinina/pepstatina 5 \mug/ml, PMSF 1 mM] mediante
sonicación, se centrifugaron a 13.000 x g durante 10 min. a 4ºC. Se
añadió GSH-Sepharose (volumen de perla de 50
\mul) al sobrenadante y se incubó a 4ºC durante 30 min. Entonces
se lavaron las perlas 3 veces con 1 ml de tampón de lisis para
producir proteína de fusión GST:Wee1 recombinante aislada,
expresada.
Las preparaciones de proteína produjeron
GST:Wee1^{70} y GST:Wee1^{152} de longitud completa (figura 1A),
siendo éste último un producto de truncamiento que contiene -70
aminoácidos de la parte amino-terminal de la
proteína Wee1.
Se usaron las proteínas GST:Wee1^{152} y
GST:Wee1^{70} preparadas en el ejemplo 1 para estudiar funciones
celulares de levaduras. Para este fin, se unieron las proteínas
aisladas a glutatión (GSH)-Sepharose y se mezclaron
con lisados celulares de la levadura de fisión
Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) recogidos a
intervalos durante la incubación con hidroxiurea (HU).
Se obtuvieron los lisados celulares a partir de
una variedad de cepas de células de S. pombe que tienen los
siguientes genotipos: PR109, de tipo natural; NB2117, cds1::ura4+;
NB2118, cds1:2HA6His:ura4+; NR1826, rad3::ura4+; OM591,
cdc22-M45; NR1593, rad1::ura4+; NR1592, chk1::ura4+;
BF1758, nmt1:GST:chk1:leu1+; BF1916, nmt1:
GST:cds1:leu1+; OM2173, mik1:2HA6His:ura4+; OM2183, mik1:2HA6His:ura4+ cds1::ura4+; PR712, mik1::ura4+; y BF2115, cds1::ura4+ chk1::ura4+. Todas las cepas fueron leu1-32 ura4-D18. Se integraron todos los constructos de promotor nmt1 en el locus leu1-32. Se han descrito medios de crecimiento y procedimientos generales para S. pombe [Moreno et al, Meth. Enzymol., 194:795 (1991)]. A menos que se indique lo contrario, se hicieron crecer cultivos de levaduras en medio YES a 30ºC. YES está constituido por glucosa, extracto de levaduras y complementos de aminoácidos. Se usó hidroxiurea a una concentración de 12 mM. Se realizó la purificación de proteínas de fusión con GST y proteínas marcadas con etiqueta de hexahis expresadas en S. pombe, inmunotransferencia y ensayos de quinasa tal como se describe [Shiozaki et al, Nature, 378:739 (1995)].
GST:cds1:leu1+; OM2173, mik1:2HA6His:ura4+; OM2183, mik1:2HA6His:ura4+ cds1::ura4+; PR712, mik1::ura4+; y BF2115, cds1::ura4+ chk1::ura4+. Todas las cepas fueron leu1-32 ura4-D18. Se integraron todos los constructos de promotor nmt1 en el locus leu1-32. Se han descrito medios de crecimiento y procedimientos generales para S. pombe [Moreno et al, Meth. Enzymol., 194:795 (1991)]. A menos que se indique lo contrario, se hicieron crecer cultivos de levaduras en medio YES a 30ºC. YES está constituido por glucosa, extracto de levaduras y complementos de aminoácidos. Se usó hidroxiurea a una concentración de 12 mM. Se realizó la purificación de proteínas de fusión con GST y proteínas marcadas con etiqueta de hexahis expresadas en S. pombe, inmunotransferencia y ensayos de quinasa tal como se describe [Shiozaki et al, Nature, 378:739 (1995)].
Se lavaron las proteínas unidas a
GSH-Sepharose, se incubaron con
[gamma-^{32}P]ATP y se analizaron mediante
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (figura
1B). Se fosforiló GST:Wee1^{152} en la muestra de 0 min.,
mientras que la fosforilación de GST:Wee1^{70} era insignificante.
La fosforilación de ambas proteínas aumentó durante la incubación
en HU. No se fosforiló la GST no fusionada. Por tanto,
GST:Wee1^{70} se asocia con y se fosforila por una quinasa
regulada por HU, mientras que GST:Wee1^{152} se fosforila por esta
quinasa y otra que es activa antes del tratamiento con HU.
La hidroxiurea evita la de replicación de ADN
inhibiendo la ribonucleótido reductasa y reduciendo así las
reservas de desoxirribonucleótido, pero HU puede tener también otros
efectos. Sin embargo, la inactivación mutacional de cdc22, que
codifica la subunidad grande de la ribonucleótido reductasa
(Fernández-Sarabia et al, Mol. Gen. Genet.,
238:241, 1993), provocó la fosforilación de GST:Wee1^{70} en
lisados celulares (figura 1C), indicando que el efecto de HU se
debe a la inhibición de la replicación de ADN.
Se sometió a ensayo la fosforilación de
GST:Wee1^{70} en lisados de células cdc25-22 sensibles a la
temperatura que se detuvieron en G2, se incubaron en HU durante 45
min., y luego se liberaron de la detención en G2 en medio que
contenía HU. La hidroxiurea no pudo inducir la fosforilación de
GST:Wee1^{70} en lisados preparados a partir de células
cdc25-22 detenidas en G2 (figura 1D). Con la
liberación de G2, aumentaron la fosforilación de GST:Wee1^{70} y
la septación celular de manera coincidente. La septación marca el
final de la mitosis (M) y el comienzo de la replicación de ADN (S),
por tanto, aumentó la fosforilación de GST:Wee1^{70} a medida que
las células se encontraron con la detención por HU. No se detectó un
aumento en la fosforilación de GST:Wee1^{70} en un cultivo
tratado con HU simulado (figura 1D). Estas observaciones indican que
la quinasa que fosforila GST:Wee1^{70} se activa cuando las
células intentan producir la replicación de ADN con
desoxirribonucleótidos insuficientes.
Se suprimió la fosforilación de GST:Wee1^{70}
en lisados preparados a partir de los mutantes de los puntos de
control rad1 y rad3 (figura 2A), lo que sugiere que la
quinasa que fosforila GST:Wee1^{70} puede participar en el punto
de control de la replicación. Se llevaron a cabo experimentos para
identificar esta quinasa. Se excluyó Chk1 mediante experimentos que
usaban lisados preparados a partir de células chk1 (figura
2B). Se indicó la participación de Cds1, una proteína quinasa que es
importante para la supervivencia del tratamiento con HU (Murakami
et al, Nature, 374:817, 1995), por la observación de que se
suprimió la fosforilación de GST:Wee1^{70} en un lisado preparado
a partir de células cds1 tratadas con HU (figura 2B). Se
realizó un experimento para determinar si Cds1 coprecipitaba con
GST:Wee1^{70}. Se incubaron lisados de células tratadas con HU en
las que cds1 genómico codifica una proteína con una etiqueta
HAHIS COOH-terminal (constituida por dos epítopos
HA seguidos por hexahistidina) con proteínas GST:Wee1 o GST, se
lavaron y analizaron mediante inmunotransferencia. Cds1^{HAHIS}
precipitó con GST:Wee1 pero no con GST no fusionado (figura 2C).
Rad3 no se asoció con GST:Wee1. Cds1 purificado a partir de
levaduras de fisión fosforiló GST:Wee1^{70} in vitro,
produciendo un mapa bidimensional de fosfopéptidos trípticos que era
idéntico al mapa obtenido a partir de GST:Wee1^{70} fosforilada
por su quinasa asociada. Estos datos indican que Cds1 es la quinasa
regulada por HU que se asocia con y fosforila GST:Wee1^{70}.
También se examinó in vivo la asociación
de Cds1 y Wee1. se expresó GST:Cds1 a partir del promotor
nmt1 reprimible por tiamina.
Para marcar con etiqueta cds1+ genómico con una
secuencia que codifica dos copias del epítopo HA y hexahistidina,
se preparó por PCR un fragmento de PstI-NotI que
tenía los nucleótidos 205-1465 del marco de lectura
abierto de cds1+. Éste se introdujo en
pRIP42-Spc1HA6H tras digestión con las enzimas PstI
y NotI [Shiozaki et al, Meth. Enz., 283:506 (1997)]. Se
linealizó el constructo con NheI y se transformó en PR109. Se
confirmó la integración y el marcado con etiqueta mediante
hibridación de ADN de tipo Southern ADN e inmunotransferencia,
confirmándose la función de Cds1HAHIS por la carencia de
sensibilidad a HU. Se preparó el constructo nmt1:GST:cds1+ tal como
se describe para el constructo nmt1:GST:chk1+ (Furnari et al,
Science, 277:1495, 1997).
Como control, se utilizó una cepa que expresó
GST:Chk1. Se purificaron con GSH-Sepharose las
proteínas de fusión con GST y se analizaron mediante
inmunotransferencia. Cdc25 (pero no Wee1) se asoció con GST:Chk1,
mientras que Wee1 (pero nCdc25) se asoció con GST:Cds1 (figura
2D).
HU puede aumentar la abundancia de Cds1, o hacer
Cds1 competente para asociarse con Wee1, o quizá el punto de
control de la replicación potencia la actividad quinasa de Cds1. Se
trataron células que expresan Cds1^{HAHIS} con HU o se trataron
de manera simulada, se prepararon lisados y se precipitaron con
proteínas GST:Wee. Se detectó la asociación de Cds1^{HAHIS} con
GST:Wee1 en lisados de células tratadas con HU, mientras que
Cds1^{HAHIS} no se asoció con GST:Wee1 en muestras tratadas de
manera simulada (figura 3A). La precipitación con
Ni^{2+}-NTA de Cds1^{HAHIS} a través de la
secuencia de hexahistidina mostró que Cds1^{HAHIS} era igualmente
abundante en los lisados de células tratadas con HU o tratadas de
manera simulada. Por lo tanto, el tratamiento con HU potenció la
asociación de Cds1 con GST:Wee1. La interacción in vivo entre
GST:Cds1 y Wee1 mostrada en la figura 2D no requirió tratamiento
con HU, presumiblemente porque se sobreexpresó GST:Cds1.
También se purificó Cds1^{HAHIS} a partir de
células tratadas con HU o de manera simulada y se sometió a ensayo
en un ensayo de autofosforilación. Aumentó la fosforilación de Cds1
en las muestras de células tratadas con HU (figura 3B). Se
obtuvieron resultados similares usando GST:Wee1^{70} como
sustrato. Por tanto, HU aparentemente activa Cds1 como quinasa y
estimula la unión a Wee1.
La fosforilación de Wee1 por Cds1 puede
desempeñar un papel en el punto de control de la replicación de ADN.
Sin embargo los mutantes weel detuvieron la división en respuesta a
HU (Enoch et al, Cell, 60:665, 1990), por tanto, también
debe regularse otra proteína que controla la fosforilación de
Tyr^{15} de Cdc2 por el punto de control de la replicación. La
quinasa Mik1 fosforila Cdc2 en Tyr^{15} (Lundgren et al,
Cell, 64:1111, 1991), por tanto, se controló la abundancia de Mik1
en células tratadas con HU usando una cepa que expresa
Mik1^{HAHIS} desde el locus genómico. El análisis de
inmunotransferencia mostró que aumentó la cantidad de
Mik1^{HAHIS} en las células tratadas con HU (figura 3C). La
abundancia de ARNm de mik1 permaneció inalterada en células
tratadas con HU, por tanto, HU debe influir en la síntesis o
recambio de Mik1. Se suprimió enormemente el aumento inducido por
HU de Mik1^{HAHIS} en células cds1 y rad3 (figura
3C), lo que indica que esta respuesta estaba regulada por el punto
de control de la replicación. Mik1 es un inhibidor de la mitosis
dependiente de la dosis (Lundgren et al, Cell, 64:1111,
1991), por tanto, el aumento de la abundancia de Mik1 en células
tratadas con HU debe ayudar a reforzar el punto de control. De
hecho, los mutantes de mik1 mostraron una sensibilidad a HU
potenciada (figura 3D).
La expresión de una gran cantidad de GST:Cds1 a
partir del promotor nmt1 produjo una detención del ciclo
celular, tal como se indica mediante células sumamente alargadas
(figura 4). La detención se produjo en mutantes de rad3 y
chk1, lo que indica que Cds1 funciona aguas abajo de Rad3 e
independientemente de Chk1. La expresión de GST:Cds1 no tuvo efecto
en las células que expresan Cdc2Y15F, una forma de Cdc2 que no puede
fosforilarse por Wee1 o Mik1. Estos hallazgos respaldan la
conclusión de que Cds1 transmite una señal de punto de control.
Las células que carecen de Cds1 detienen la
división en respuesta a HU, lo que indica que la señal de Cds1 se
complementa mediante otras proteínas de los puntos de control
(Murakami et al, Nature, 374:817, 1995). Se examinó el punto
de control de la replicación en cultivos sincrónicos de células de
doble mutante cds1 chk1, mutantes individuales cds1, chk1,
rad3 o células de tipo natural.
En primer lugar se hicieron crecer las células
en medio YES (extracto de levaduras y glucosa) hasta una DO600 de
1,0 y luego se trataron con HU (12 mM) durante 90 min. a 30ºC. Se
obtuvieron entonces células sincrónicas mediante elutriación
centrífuga con un rotor de elutriación Beckman
JE-5.0. Se diluyeron estas células hasta una DO600
de 0,3 en YES que contenía HU 12 mM y se hicieron crecer a 30ºC
durante otras 4 h. Se puntuaron las células según la progresión a
través de la mitosis mediante observación al microscopio. Se
llevaron a cabo estudios de sensibilidad a HU con células que se
hicieron crecer hasta una DO600 de 0,3 en medio YES y luego se
diluyeron hasta 13.000 células/ml en medio YES que contenía HU (12
mM), seguido por crecimiento a 30ºC durante otras 8 h. Se tomaron
muestras (75 \mul) a intervalos regulares, se sembraron en placas
de YES y se hicieron crecer durante 4 días a 30ºC para determinar
la supervivencia.
HU detuvo la división en las células de tipo
natural, mutantes individuales cds1 y chk1 (figura
5A). Por el contrario, las células de doble mutante cds1
chk1 experimentaron división con una cinética que era similar a
la de las células rad3. Por tanto, se suprimió el punto de
control en las células cds1 chk1. De hecho, las células de
doble mutante cds1 chk1 eran extremadamente sensibles a la
inactivación por HU (figura 5B). Estos hallazgos concuerdan con un
estudio reciente (Lindsay et al, Genes Dev., 12:382, 1998) y
respaldan un modelo en el que Cds1 tiene un papel directo en
reforzar el punto de control de la replicación.
Estos hallazgos indican que Cds1 y Chk1 son
efectores duales del punto de control de la replicación. Chk1
regula Cdc25, mientras que parece que Cds1 fosforila Wee1 y se
requiere para aumentar la abundancia de Mik1. Se desconoce el
efecto de la fosforilación de Wee1 por Cds1 y sigue estando por
confirmar con estudios in vivo, pero es sorprendente que el
punto de control de la replicación aumente tanto la actividad
quinasa de Cds1 como estimule la unión a Wee1 en extractos
celulares. El gran aumento inducido por HU en la abundancia de Mik1
ayuda a explicar por qué las células de doble mutante cdc25
wee1 detienen la división en respuesta a HU y reafirma la
importancia de la fosforilación de Tyr^{15} de Cdc2 en el punto de
control de la replicación (Enoch et al, Genes Dev., 6:2035,
1993). Cds1 comparte una identidad de secuencia significativa con la
quinasa Rad53p, una proteína que participa en el punto de control
de la replicación de ADN en Saccharomyces cerevisiae (S.J.
Elledge, Science, 279:1664, 1996).
Previamente se desconocían los efectores del
punto de control de la replicación activados por hidroxiurea (HU).
El tratamiento de levaduras de fisión con HU estimuló la quinasa
Cds1 que fosforila la quinasa Wee1, un inhibidor de Cdc2. También
se requirió la proteína quinasa Cds1 para un gran aumento inducido
por HU en la cantidad de Mik1, un segundo inhibidor de Cdc2. Se
suprimió la detención inducida por HU de la división celular en
células cds1 chk1. Por tanto, Cds1 y Chk1 refuerzan
conjuntamente el punto de control de la replicación.
<110> INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN
SCRIPPS
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN
DE QUINASA WEE1, SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS, SISTEMAS DE EXPRESIÓN Y
PROCEDIMIENTOS DE USO
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> SCR2109S
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/US99/
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
26-03-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento 60/079.752
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-03-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 310
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína de fusión sintética GST:Wee1
(11-72).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 3175
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de nucleótidos sintética que codifica una
proteína de fusión GST:Wee1 (11-72).
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 379
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: proteína de fusión sintética GST:Wee1
(11-152).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 3867
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: secuencia de nucleótidos sintética que codifica una
proteína de fusión GST:Wee1 (11-152).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
Claims (21)
1. Un procedimiento para identificar un
compuesto que modula la actividad de la quinasa Cds1 que comprende
las etapas de:
a) combinar:
- i)
- un compuesto de prueba;
- ii)
- una proteína Wee1 truncada que comprende una región que es funcional como un sustrato de fosforilación de Cds1 y que carece de los residuos de aminoácidos 1-9 de la proteína Wee1 nativa (número de acceso Genbank M16508) y, estando la proteína Wee1 truncada operativamente unida a glutatión-S-transferasa (GST); y
- iii)
- una composición que comprende una proteína Cds1;
b) mantener la combinación de la etapa (a) en
condiciones suficientes para que Cds1 fosforile dicha proteína
Wee1; y
c) determinar la cantidad de proteína Wee1
fosforilada, mediante lo cual la cantidad de Wee1 fosforilada indica
si dicho compuesto de prueba modula la actividad de Cds1.
2. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la proteína Wee1 truncada carece de los residuos de
aminoácidos 1-10 de la proteína Wee1 nativa (número
de acceso Genbank M16508).
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el que la proteína Wee1 truncada comprende los residuos de
aminoácidos 10-152 de la proteína Wee1 nativa
(número de acceso Genbank M16508).
4. El procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la proteína Wee1 es una proteína de fusión
glutatión-S-transferasa (GST):Wee1
que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos mostrada en
SEC ID NO 1 o SEC ID NO 3.
5. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto de prueba es una
proteína seleccionada del grupo constituido por Cdc22, Cdc25, Chk1,
Mik1 y variantes genéticas de las mismas.
6. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las condiciones comprenden
un sustrato de quinasa Cds1 marcada con fosfato.
7. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que dicha composición que
comprende una proteína Cds1 es un lisado celular.
8. El procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha composición que comprende
una proteína Cds1 comprende una proteína Cds1 aislada.
9. Un polinucleótido aislado que codifica una
proteína Wee1 truncada constituida por los residuos de aminoácidos
10-152 de la proteína Wee1 nativa (número de acceso
Genbank M16508) operativamente unidos a
glutatión-S-transferasa (GST).
10. Un polinucleótido aislado que codifica una
proteína de fusión
glutatión-S-transferasa (GST):Wee1
que está constituida por una secuencia de residuos de aminoácidos
mostrada en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 3.
11. El polinucleótido según la reivindicación
10, estando dicho polinucleótido constituido por la secuencia
mostrada en SEC ID NO 2 o SEC ID NO 4.
12. Un vector de expresión que comprende el
polinucleótido según la reivindicación 10, pudiendo dicho vector
expresar dicha proteína de fusión
glutatión-S-transferasa (GST):WeeJ
codificada por dicho polinucleótido.
13. El vector de expresión según la
reivindicación 12, en el que dicho polinucleótido está constituido
por la secuencia mostrada en SEC ID NO 2 o SEC ID NO 4.
14. Un procedimiento para identificar un
compuesto que modula la actividad de la quinasa Wee1, que comprende
las etapas de:
a) combinar:
- i)
- un compuesto de prueba;
- ii)
- una proteína de fusión glutatión-S-transferasa (GST):Wee1 que está constituida por una secuencia de residuos de aminoácidos mostrada en SEC ID NO 1 o SEC ID NO 3; y
- iii)
- un reactivo para Wee1 que es un compuesto o proteína que interacciona con Wee1 en una reacción detectable;
b) mantener la combinación de la etapa (a) en
condiciones adecuadas para que Wee1 reaccione con dicho reactivo;
y
c) determinar la cantidad de Wee1 que reacciona
con dicho reactivo, mediante lo cual la cantidad de reacción indica
si dicho compuesto de prueba modula la actividad de Wee1.
15. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que el reactivo es un cofactor para la reacción y que se
modifica en la reacción de tal manera que puede medirse la cantidad
de reacción.
16. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que el reactivo es un sustrato para la quinasa Wee1 y que
se modifica en la reacción de tal manera que puede medirse la
cantidad de reacción.
17. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que el reactivo es una enzima que utiliza por sí misma
Wee1 como sustrato y que se modifica en la reacción de tal manera
que puede medirse la cantidad de reacción.
18. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que dicho reactivo es un sustrato de quinasa marcado.
19. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que dicha determinación comprende medir la fosforilación
de dicha proteína Wee1.
20. El procedimiento según la reivindicación
14, en el que dicha determinación comprende medir la fosforilación
de dicho reactivo.
21. El procedimiento según la reivindicación 14,
en el que dicho reactivo es proteína Cdc2.
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