ES2286892T3 - Virus de influenza equina adaptados en frio. - Google Patents

Abstract

Un virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en huevos enbrionados de gallina en un rango de temperatura desde 26 °C a 30 °C.

Description

Virus de influenza equina adaptados en frío.

La presente invención se refiere a los virus de influenza equina adaptados en frío generados experimentalmente, y particularmente a los virus de influenza equina adaptados en frío que tienen fenotipos adicionales, tales como atenuación, interferencia dominante, o sensibilidad a la temperatura. La invención además incluye virus de influenza A recatalogados, los cuales contienen al menos un segmento de genoma de tal virus de influenza equina, tal que el virus recatalogado incluye ciertos fenotipos del virus de influenza equina donante. La invención además incluye virus de influenza equina diseñados genéticamente, producidos a través de genéticas inversas, los cuales comprenden ciertos fenotipos de identificación de un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención. La presente invención además se refiere al uso de estos virus en composiciones terapéuticas para proteger animales de enfermedades causadas por los virus de influenza.

Antecedentes de la invención

El virus de influenza equina ha sido reconocido desde alrededor de 1956 como el principal patógeno respiratorio en caballos. Los síntomas de la enfermedad causada por el virus de influenza equina pueden ser severos, y son a menudo seguidos por infecciones bacterianas secundarias. Dos subtipos de virus de influenza equina son reconocidos, a saber, subtipo-1 siendo el prototipo A/Equino/Praga/1/56 (H7N7), y subtipo-2 siendo el prototipo A/Equino/Miami/1/63 (H3N8). En el momento presente, el subtipo de virus predominante es el subtipo-2, el cual además ha divergido entre el Eurasiático y el Norte Americano aislados en años recientes.

La vacuna autorizada actualmente para la influenza equina es una vacuna de virus desactivado (muerto). Esta vacuna proporciona una mínima, si alguna, protección para caballos, y puede producir efectos colaterales indeseables, por ejemplo, reacciones inflamatorias en el sitio de la inyección. Ver, por ejemplo, Mumford, 1987, Equina Infectious Disease IV, 207-217, y Mumford, et al., 1993, Vaccine 11, 1172-1174. Además, las modalidades actuales no pueden ser usadas en potros jóvenes, ya que ellos no pueden vencer la inmunidad materna, y pueden inducir tolerancia en un animal más joven. En base a la severidad de la enfermedad, permanece una necesidad en composiciones terapéuticas efectivas y seguras para proteger caballos contra la enfermedad de la influenza equina.

La producción de composiciones terapéuticas que contienen virus de influenza humana adaptados en frío está descrita, por ejemplo, en Maassab, et al., 1960, Nature 7,612-614, and Maassab, et al., 1969, J. Immunol. 102, 728-732. Además, estos investigadores notaron que los virus de influenza humana adaptados en frío, por ejemplo, los virus que han sido adaptados para crecer a temperaturas menores que la normal, tienden a tener un fenotipo en el que el virus es sensible a la temperatura; esto es, el virus no crece bien a ciertas temperaturas no permisivas más altas a las cuales los virus de tipo silvestre crecerán y se replicarán. Varios virus de influenza A humana adaptados en frío, producidos por recatalogación con los virus de influenza A humana adaptados en frío existentes, ha sido demostrado que producen buenas respuestas inmunes en individuos vacunados, y ciertos virus de influenza A humana adaptados en frío recatalogados vivos atenuados han probado que protegen a los humanos contra la exposición con el virus tipo silvestre. Ver, por ejemplo, Clements, et al., 1986, J. Clin. Microbiol. 23, 73-76. En U.S. Patent No. 5.149.531, por Youngner, et al., publicado en Septiembre 22, 1992, los inventores de la presente invención además demostraron que ciertos virus de influenza A humana adaptados en frío recatalogados también poseen una interferencia fenotípica dominante, o sea ellos inhiben el crecimiento de sus correspondientes cepas de tipo silvestre progenitoras así como virus de influenza A heterólogos. La U.S. No. 4.683.137, por Coggins et al., publicada en Julio 28, 1987, y la U.S. No. 4.693.893, por Campbell, publicada en Septiembre 15, 1987, revelan composiciones terapéuticas atenuadas producidas por recatalogación de virus de influenza equina tipo silvestre con virus de influenza A humana adaptados en frío atenuados. Aunque estas composiciones terapéuticas parecen ser en general seguras y efectivas en caballos, ellos plantean un peligro significativo de introducir dentro del ambiente un virus que contiene ambos genes de influenza humanos y equinos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona virus de influenza equina adaptados en frío generados experimentalmente, virus de influenza A recatalogados que comprenden al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación en frío tal que el segmento de genoma de virus de influenza equina confiere al menos un fenotipo identificado de un virus de influenza equina adaptado en frío sobre el virus recatalogado, y virus de influenza equina producidos genéticamente, producidos a través de genética inversa, la cual comprende al menos un fenotipo de identificación de un virus de influenza equina adaptado en frío. Los fenotipos de identificación incluyen adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación. La invención además suministra una composición terapéutica para proteger un animal contra la enfermedad causada por un virus de influenza A, en la que la composición terapéutica incluye un virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza A recatalogado, o un virus de influenza equina producido genéticamente de la presente invención. También hay suministrado un método para proteger un animal de enfermedades causadas por un virus de influenza A el cual incluye la administración de tal composición terapéutica. También hay suministrados métodos para producir un virus de influenza equina adaptado en frío y métodos para producir un virus de influenza A recatalogado el cual comprende al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina adaptado en frío en el que el segmento de genoma de influenza equina confiere sobre el virus recatalogado al menos un fenotipo de identificación del virus de influenza equina adaptado en frío.

Un virus de influenza equina adaptado en frío es uno que se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura en el rango desde alrededor de 26ºC hasta alrededor de 30ºC. Preferiblemente, un virus de influenza equina adaptado en frío, virus de influenza A recatalogado, o un virus de influenza equina producido genéticamente de la presente invención es atenuado, tal que no causará enfermedad en un animal sano.

En una realización, un virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza A recatalogado, o un virus de influenza equina producido genéticamente de la presente invención es también sensible a la temperatura, tal que el virus se replica en los huevos embrionados de gallina a una temperatura en el rango desde alrededor de 26ºC hasta alrededor de 30ºC, forma placas en los tejidos en células de cultivo de tejido a una temperatura permisiva de alrededor de 34ºC, pero no forma placas en células de cultivo de tejido a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC.

En una realización, tal virus sensible a la temperatura comprende dos mutaciones: una primera mutación que inhibe la formación de placa a una temperatura de alrededor de 39ºC, esa mutación que cosegrega con el segmento de genoma que codifica el gen de nucleoproteína viral; y una segunda mutación que inhibe todas las síntesis proteicas virales a una temperatura de alrededor de 39ºC.

En otra realización, un virus de influenza equina sensible a la temperatura, adaptado en frío, de la presente invención se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura en el rango desde alrededor de 26ºC hasta alrededor de 30ºC, forma placas en los tejidos en células de cultivo de tejido a una temperatura permisiva de alrededor de 34ºC pero no forma placas en células de cultivo de tejido o expresa proteínas virales tardías a una temperatura no permisiva de alrededor de 37ºC.

Típicamente, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención es producido por el pasaje de un virus de influenza equina de tipo silvestre una o más veces, y entonces por la selección de virus que crecen establemente y se replican a una temperatura reducida. Un virus de influenza equina adaptado en frío producido de este modo incluye, en ciertas realizaciones, un fenotipo de interferencia dominante, esto es, el virus, cuando se coinfecta con un virus de influenza A equina progenitor o un virus de influenza A de tipo silvestre heterólogo, inhibirá el crecimiento de ese virus.

Ejemplos de virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención incluyen EIV-P821, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2625; EIV-P824, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2624; EIV-MSV+5, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2627; y la progenie de tales virus.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen desde alrededor de 10^{5} unidades de TCID_{50} hasta alrededor de 10^{8} unidades de TCID_{50}, y preferiblemente alrededor de 2 x 10^{6} de TCID_{50}, de virus de influenza equina adaptados en frío, virus de influenza A recatalogados, o virus de influenza equina producidos genéticamente de la presente invención.

La presente invención también incluye un método para proteger un animal de la enfermedad causada por un virus de influenza A, el cual incluye el paso de administrar al animal una composición terapéutica que incluye un virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza A recatalogado, o virus de influenza equina producidos genéticamente de la presente invención. Los animales preferidos para proteger incluyen los équidos, con caballos y ponis siendo los particularmente preferidos.

Aun otra realización de la presente invención es un método para generar un virus de influenza equina adaptado en frío. El método incluye los pasos de pasaje de un virus de influenza equina de tipo silvestre; y la selección de virus que crecen a una temperatura reducida. En una realización, el método incluye la repetición de los pasajes y los pasos de selección una o más veces, mientras se reduce progresivamente la temperatura. El pasaje del virus de influencia equina preferiblemente toma lugar en huevos embrionados de gallina.

Otra realización es un método para producir un virus de influencia A recatalogado a través de la recatalogación genética de los segmentos de genoma de un virus de influenza equina adaptado en frío donante de la presente invención con los segmentos de genoma de un virus de influenza A receptor. Los virus de influencia A recatalogados de la presente invención son producidos por un método que incluye los pasos de: (a) mezclar los segmentos de genoma de un virus de influenza equina adaptado en frío donante con los segmentos de genoma de un virus de influenza A receptor, y (b) seleccionar los virus los cuales incluyen al menos un fenotipo de identificación del virus de influenza equina donante. Los fenotipos de identificación incluyen adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación. Preferiblemente, tales virus recatalogados al menos incluyen el fenotipo de atenuación del virus donante. Un virus recatalogado típico tendrá la antigenicidad del virus receptor, esto es, retendrá los fenotipos de hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) del virus receptor.

La presente invención además proporciona métodos para propagar virus de influenza equina adaptados en frío o virus de influenza A recatalogados de la presente invención. Estos métodos incluyen la propagación en huevos embrionados de gallina o en células de cultivo de tejido.

\newpage

Descripción detallada de la invención

La presente invención suministra virus de influenza equina adaptados en frío generados experimentalmente que comprenden ciertos fenotipos definidos, los que son divulgados aquí. Es para ser notado que el término "un" o "uno" entidad, se refiere a uno o más de esa entidad, por ejemplo, "un virus de influenza equina adaptado en frío" puede incluir uno o más virus de influenza equina adaptados en frío. Así como, los términos "un" (o "uno"), "uno o más", y "al menos uno" pueden ser usados intercambiablemente aquí. Es también para ser notado que los términos "que comprende", "que incluye" y "que tiene" pueden ser usados intercambiablemente. Además de esto, un articulo "seleccionado entre el grupo que consta de" se refiere a uno o más de los artículos en ese grupo, que incluyen combinaciones de ellos.

Un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención es un virus que ha sido generado en el laboratorio, y como tal, no es un virus que ocurre en la naturaleza Ya que la presente invención también incluye aquellos virus que tienen fenotipos de identificación de tal virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza equina aislado de una mezcla de virus que ocurren naturalmente, por ejemplo, retirados de sus medio ambientes naturales, pero que tienen los fenotipos reivindicados, está incluido en la presente invención. Un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención no requiere ningún nivel específico de pureza. Por ejemplo, un virus de influenza equina adaptado en frío crecido en huevos embrionados de gallina puede estar en una mezcla con el fluido alantóico (FA), y un virus de influenza equina adaptado en frío crecido en células de cultivo de tejido puede estar en una mezcla con células desestabilizadas y un medio de cultivo de tejido.

Como se usó aquí, un "virus de influenza equina" es un virus de influenza que infecta y crece en équidos, por ejemplo, caballos o ponis. Como se usó aquí, el "crecimiento" de un virus denota la habilidad del virus para reproducirse o "replicarse" a sí mismo en una célula hospedera permisiva. Así como, los términos "crecimiento de un virus" o "replicación de un virus" son usados intercambiablemente aquí. El crecimiento o replicación de un virus en una célula hospedera particular puede ser demostrado y medido por métodos convencionales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de virología. Por ejemplo, las muestras que contienen virus infecciosos, por ejemplo, como los contenidos en las secreciones nasofaríngeas de un caballo infectado, son probadas para su habilidad de causar efectos citopáticos (CPE), por ejemplo, placas de virus, en células de cultivos de tejido. Los virus infecciosos pueden también ser detectados por inoculación de una muestra dentro de la cavidad alantóica de huevos embrionados de gallina, y entonces probando el FA de los huevos así inoculados para su habilidad de aglutinar las células rojas de la sangre, por ejemplo, causa hemaglutinación, debido a la presencia de la proteína hemaglutinina (HA) del virus de influenza en el FA.

De ocurrencia natural, por ejemplo, los virus de influenza equina de tipo silvestre se replican bien a una temperatura desde alrededor de 34ºC hasta alrededor de 39ºC. Por ejemplo, el virus de influenza equina de tipo silvestre se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 34ºC, y se replica en células de cultivo de tejido a una temperatura desde alrededor de 34ºC hasta alrededor de 39ºC. Como se usó aquí, un virus de influenza equina "adaptado en frío" es un virus de influenza equina que ha sido adaptado para crecer a una temperatura más baja que la temperatura optima de crecimiento para el virus de influenza equina. Un ejemplo de virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención es un virus que se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 30ºC. Un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención preferido se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 28ºC. Otro virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención preferido se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 26ºC. En general, los virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención preferidos se replican en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de alrededor de 26ºC a 30ºC, o sea en un rango de temperaturas en el cual el virus de tipo silvestre crece pobremente o no crece en lo absoluto. Debe ser notado que la habilidad de tales virus para replicarse dentro de ese rango de temperatura no imposibilita su habilidad para también replicarse a temperaturas más altas o más bajas. Por ejemplo, una realización es un virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 26ºC, pero también se replica en células de cultivo de tejido a una temperatura desde alrededor de 34ºC. Como con los virus de influenza equina de tipo silvestre, el virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención generalmente forma placas en células de cultivo de tejido, por ejemplo Madin Darby Canine Kidney Cells (MDCK) a una temperatura de alrededor de 34ºC. Ejemplos de virus de influenza equina adaptados en frío adecuados y preferidos de la presente invención son revelados aquí.

Una realización de la presente invención es un virus de influenza equina adaptado en frío que es producido por un método el cual incluye el pasaje de un virus de influenza equina de tipo silvestre, y entonces seleccionar virus que crecen a una temperatura reducida. Los virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención pueden ser producidos, por ejemplo, pasando secuencialmente un virus de influenza equina de tipo silvestre en huevos embrionados de gallina a temperaturas progresivamente inferiores, de ello seleccionando ciertos miembros de la mezcla de virus los cuales se replican establemente a la temperatura reducida. Un ejemplo del procedimiento de paso es revelado en detalle en la sección de Ejemplos. Durante el procedimiento de pasaje, una o más mutaciones aparecen en ciertos segmentos de ARN monocatenarios que comprenden el genoma del virus de influenza, los cuales alteran el genotipo, por ejemplo, la secuencia nucleótida primaria de esos segmentos de ARN. Como es usado aquí, una "mutación" es una alteración de la secuencia nucleótida primaria de cualquier segmento de ARN dado creando un genoma de virus de influenza. Ejemplos de mutaciones incluyen la sustitución de uno o más nucleótidos, la supresión de uno o más nucleótidos, la inserción de uno o más nucleótidos, o la inversión de una elasticidad de dos o más nucleótidos. Por la selección de esos miembros de la mezcla de virus que se replican establemente a una temperatura reducida, un virus con fenotipo adaptado en frío es seleccionado. Como es usado aquí, un "fenotipo" es una característica observable o mensurable de una entidad biológica tal como una célula o un virus en la que la característica observada es atribuible a una configuración genética específica de esa entidad biológica, por ejemplo, un cierto genotipo. Como tal, un genotipo adaptado en frío es el resultado de una o más mutaciones en el genoma del virus. Como son usados aquí, los términos "una mutación", "un genoma", "un genotipo" o "un fenotipo" se refieren a una o más, o al menos una, mutación, genoma, genotipo o fenotipo, respectivamente.

Fenotipos observables, adicionales, en virus de influenza equina adaptados en frío pueden ocurrir, y serán generalmente el resultado de una o más mutaciones adicionales en el genoma de tal virus. Por ejemplo, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención puede, en adición, ser atenuado, exhibir interferencia dominante, y/o ser sensible a la temperatura.

En una realización, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención tiene un fenotipo caracterizado por la atenuación. Un virus de influenza equina adaptado en frío es "atenuado", cuando la administración del virus a un animal susceptible al virus de influenza equina resulta en signos clínicos reducidos o ausentes en ese animal, comparados con los signos clínicos observados en animales que están infectados con el virus de influenza equina de tipo silvestre. Por ejemplo, un animal infectado con el virus de influenza equina de tipo silvestre presentará fiebre, estornudos, tos, depresión, y descargas nasales. En contraste, una animal administrado con el virus de influenza equina adaptado en frío atenuado de la presente invención presentará signos de enfermedad clínica mínimos o no, por ejemplo, indetectables.

En otra realización, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención comprende un fenotipo sensible a la temperatura. Como es usado aquí, un virus de influenza equina en frío sensible a la temperatura se replica a temperaturas reducidas, pero no se replica más o forma placas en células de cultivo de tejido a ciertas temperaturas superiores de crecimiento en las cuales los virus de tipo silvestre se replicarán y formarán placas. Mientras no esté siendo comprometida por la teoría, se cree que esa replicación de virus de influenza equina con un fenotipo sensible a la temperatura es mayormente restringido a los pasajes fríos del tracto respiratorio superior, y no se replica eficientemente en el tracto respiratorio inferior, en el que el virus es más propenso a causar signos de enfermedad. Una temperatura en la cual un virus sensible a la temperatura crecerá es referido aquí como una temperatura "permisiva" para ese virus sensible a la temperatura, y una temperatura más alta a la cual el virus sensible a la temperatura no crecerá, pero en la cual un correspondiente virus silvestre crecerá, es referido aquí como una "temperatura no permisiva" para ese virus sensible a la temperatura. Por ejemplo, ciertos virus de influenza equina adaptados en frío sensibles a la temperatura de la presente invención se replican en huevos embrionados de gallina a una temperatura de o por debajo de 30ºC, preferiblemente alrededor de 28ºC o alrededor de 26ºC, y formará placas en células de cultivo de tejido una temperatura permisiva de alrededor de 34ºC, pero no formará placas en células de cultivo de tejido a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC. Otros virus de influenza equina adaptados en frío sensibles a la temperatura de la presente invención se replican en huevos embrionados de gallina a una temperatura de o por debajo de alrededor de 30ºC, preferiblemente alrededor de 28ºC o alrededor de 26ºC, y formará placas en células de cultivo de tejido a una temperatura permisiva de alrededor de 34ºC, pero no formará placas en células de cultivo de tejido a una temperatura no permisiva de alrededor de 37ºC.

Ciertos virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención tienen un fenotipo de interferencia dominante; esto es, ellos dominan una infección cuando son coinfectados dentro de la células con otro virus de influenza A, así deterioran el crecimiento de ese otro virus. Por ejemplo, cuando un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención, que tiene un fenotipo de interferencia dominante, es coinfectado dentro de células MDCK con el virus de influenza equina progenitor de tipo silvestre, A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8), el crecimiento del virus progenitor es deteriorado. Así en un animal que ha sido recientemente expuesto a, o puede ser pronto expuesto a, un virus de influenza virulento, o sea, un virus de influenza que causa signos de enfermedad, la administración de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo de interferencia dominante dentro del tracto respiratorio de ese animal estropeará el crecimiento del virus virulento, mejorando o reduciendo así la enfermedad en ese animal, incluso en la ausencia de una respuesta inmune al virus
virulento.

La interferencia dominante de un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo sensible a la temperatura puede ser medido por los métodos virológicos convencionales. Por ejemplo, monoestratos separados de células MDCK pueden ser infectadas con (a) un virus de influenza A de tipo silvestre, (b) un virus de influenza equina adaptado en frío sensible a la temperatura, y (c) ambos virus en una coinfección, con todas las infecciones hechas a multiplicidad de infección (MOI) de alrededor de 2 unidades formadoras de placas (pfu) por célula. Después de la infección, los virus producidos por las varias células infectadas son medidos por ensayos de placa duplicada realizados a la temperatura permisiva para los virus de influenza equina adaptados en frío y a la temperatura no permisiva de ese virus. Un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo de temperatura sensitiva es incapaz de formar placas a su temperatura no permisiva, mientras que el virus de tipo silvestre es capaz de formar placas a ambas temperaturas permisiva y no permisiva. De esta manera es posible medir el crecimiento del virus de tipo silvestre en presencia del virus adaptado en frío por la comparación del virus producido a la temperatura no permisiva de las células individualmente infectadas con el virus de tipo silvestre contra el producido a la temperatura no permisiva del virus de tipo silvestre en células infectadas doblemente.

Los virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención son caracterizados principalmente por uno o más de los siguientes fenotipos de identificación: adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y/o atenuación. Como está usado aquí, la frase "un virus de influenza equina consta de fenotipo(s) de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y/o atenuación" se refiere a un virus que tiene tal fenotipo(s). Ejemplos de tales virus incluyen, pero no están limitados a, EN-P821, identificado por Nº de acceso ATCC VR___, EIV-P824, identificado por Nº de acceso ATCC VR___, y el EIV-MSV+5, identificado por Nº de acceso ATCC VR___, así como los EIV-MSV0, EIV, MSV+1, EIV-MSV+2, EIV-MSV+3, y EIV-MSV+4. La producción de tales virus está descrita en los ejemplos. Por ejemplo, el virus de influenza equina adaptado en frío EN-P821 está caracterizado por, o sea, tiene los fenotipos de identificación de (a) adaptación en frío, por ejemplo, se habilidad para replicarse en huevos embrionados de gallina, a una temperatura de alrededor de 26ºC; (b) sensibilidad a la temperatura, por ejemplo, su inhabilidad para formar placas en células de cultivo de tejido, y para expresar productos de gen tardíos a temperatura no permisiva de alrededor de 37ºC, y su inhabilidad para formar placas en célula de cultivo de tejido y para sintetizar ningunas proteínas virales a temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC; (c) su atenuación en la administración a un animal susceptible al virus de influenza equina; y (d) interferencia dominante, por ejemplo, su habilidad, cuando es coinfectado dentro de una célula con un virus de influenza A de tipo silvestre para interferir con el crecimiento de ese virus de tipo silvestre. Similarmente, el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P824 está caracterizado por (a) adaptación en frío, por ejemplo, su habilidad para replicarse en huevos embrionados de gallina a temperatura de alrededor de 28ºC; (b) sensibilidad a la temperatura, por ejemplo, su inhabilidad para formar placas en células de cultivo de tejido a temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC; y (c) interferencia dominante, por ejemplo, su habilidad, cuando es coinfectado dentro de una célula con un virus de influenza A de tipo silvestre, para interferir con el crecimiento de ese virus de tipo silvestre. En otro ejemplo, el virus de influenza equina adaptado en frío ENMSV+5 está caracterizado por (a) adaptación en frío, por ejemplo, su habilidad para replicarse en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 26ºC; (b) sensibilidad a la temperatura, por ejemplo, su inhabilidad para formar placas en células de cultivo de tejido a temperaturas no permisivas de alrededor de 39ºC; y (c) su atenuación en la administración a un animal susceptible al virus de influenza equina.

En ciertos casos, el segmento ARN sobre el cual una o más mutaciones asociadas con un cierto fenotipo ocurren puede ser determinado a través del análisis de recatalogación por métodos convencionales, como se reveló aquí. En una realización, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención comprende un fenotipo sensible a la temperatura que se correlaciona con al menos dos mutaciones en el genoma de ese virus. En esta realización, una de las dos mutaciones, localizada por el análisis de recatalogación como es revelado aquí, inhibe, o sea, bloquea o impide, la habilidad del virus para formar placas en células de cultivo de tejido a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC. Esta mutación cosegrega con el segmento del genoma del virus de influenza equina que codifica el gen nucleoproteína (NP) del virus, o sea, la mutación es localizada en el mismo segmento ARN como el gen NP. En esta realización, la segunda mutación inhibe toda síntesis de proteína a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC. Como tal, a la temperatura no permisiva, el genoma del virus es incapaz de expresar cualesquiera proteínas virales. Ejemplos de virus de influenza equina adaptados en frío que poseen esas características son los EIV-P821 y EIV MSV+5. El EIV-P821 fue generado por el pasaje en serie de un virus de influenza equina de tipo silvestre en huevos embrionados de gallina por los métodos descritos en el Ejemplo 1A. El EIV MSV+5 fue derivado por ulteriores pasajes en serie del EIV-P821, como se describió en el Ejemplo 1E.

Además, un virus de influenza equina adaptado en frío sensible a la temperatura que comprende dos mutaciones las cuales inhiben la formación de placas y la síntesis de proteína viral a temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC pueden comprender una o más mutaciones adicionales, las cuales inhiben la habilidad de los virus para sintetizar productos de gen tardíos y formar placas en células de cultivo de tejido a temperatura no permisiva de alrededor de 37ºC. Un ejemplo de virus de influenza equina adaptado en frío que posee estas características es el EIV-P821. Este virus aislado se replica en huevos embrionados de gallina a una temperatura de alrededor de 28ºC y no forma placas o expresa ningunas proteínas virales a una temperatura de alrededor de 39ºC, Además, el EIV-P821 no forma placas en las células MDCK a temperatura no permisivas de alrededor de 37ºC, y a esta temperatura, la expresión tardía del gen es inhibida en tal forma que las proteínas tardías no son producidas, o sea, niveles normales de proteína NP son sintetizados, reducidos o niveles indetectables de proteínas M1 o HA son sintetizados, y niveles mejorados de proteínas polimerasas son sintetizados. Dado que este fenotipo es tipificado por la síntesis de proteína viral diferencial, este es distinto del fenotipo de síntesis de proteína visto a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC, la cual es tipificada por la inhibición de la síntesis de todas las proteínas virales.

Consecuente a 37 CFR \NAK 1.802 (a-c), los virus de influenza equina adaptados en frío, designados aquí como EIV-P821, un EIV-P824 fueron precipitados con American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) bajo el tratado de Budapest como ATCC NºNº de acceso ATCC VR-___, y ATCC VR-___, respectivamente, en Julio 11, 1998. Consecuente con 37 CFR\NAK 1.806, las precipitaciones son hechas por un término de al menos treinta (30) años y al menos cinco (5) años después de la más reciente petición para la habilitación de una muestra del depósito que fue recibida por el depositario. Consecuente con 37 CFR \NAK 1.808 (a)(2), todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad para el público deberá ser irrevocablemente retirada bajo la concesión de la patente.

Los virus de influenza equina adaptados en frío preferidos de la presente invención tienen el fenotipo de identificación de los EIV-P821, EIV-P824, y EIV-MSV+5. Particularmente los virus de influenza equina adaptados en frío preferidos incluyen los EIV-P821, EIV-_P824, EIV-_MSV+5, y la progenie de estos virus. Como es usado aquí, las "progenies" son "descendencias", y como tales pueden ser fenotipos ligeramente alterados comparados con los virus progenitores, pero retienen fenotipos de identificación de los virus progenitores, por ejemplo, adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, o atenuación. Por ejemplo, el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-MSV+5 es una "progenie" del virus de influencia equina adaptado en frío EIV-P821. La "progenie" también incluye los virus de influenza A recatalogados que comprende uno o más fenotipos de identificación del virus progenitor donante.

Los virus de influenza A recatalogados de la presente invención son producidos por recatalogación genética de los segmentos de genoma de un virus de influencia equina adaptado en frío donante de la presente invención con los segmentos de genoma de un virus de influenza A receptor, y entonces por la selección de un virus recatalogado que deriva al menos uno de sus ocho segmentos de genoma del virus donante, tal que el virus recatalogado adquiere al menos un fenotipo de identificación del virus de influenza equina adaptado en frío donante. Los fenotipos de identificación incluyen adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura e interferencia dominante. Preferiblemente, los virus de influenza A recatalogados de la presente invención derivan al menos el fenotipo de atenuación del virus donante. Los métodos para aislar los virus de influenza recatalogados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica de virología y son divulgados, por ejemplo, en Fields, et al., 1996, Fields Virology, 3d ed., Lippincott-Raven; y Palese, et al., 1976, J. Virol., 17, 876-884. Fields, et al., ibid. y Palese, et al., ibid.

Un adecuado virus de influenza equina donante es un virus de influencia equina adaptado en frío de la presente invención, por ejemplo, el EIV-P821, identificado por Nº de acceso ATCC VR___, el EIV-P824, identificado por Nº de acceso ATCC VR___, o el EIV-MSV+5, identificado por Nº de acceso ATCC VR___. Un adecuado virus de influenza A receptor puede ser otro virus de influencia equina, por ejemplo, un virus de influenza equina Eurasiático de subtipo 2 tal como el A/equino/Suffolk/89 (H3N8) o un virus de influencia equina de subtipo 1 tal como el A/Praga/1/56 (H7N7). Un virus de influenza A receptor puede también ser cualquier virus de influenza A capaz de formar un virus recatalogado con un virus de influenza equina adaptado en frío donante. Ejemplos de tales virus de influenza A incluyen, pero no están limitado a, virus de influenza humana tales como A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), A/Hong Kong/156/97 (H5N1), A/Singapur/1/57 (H2N2), y A/Hong Kong/1/68 (H3N2); virus de cerdo tales como A/Cerdo/Iowa/15/30 (H1N1); y virus aviarios tales como A/ánade/New York/6750/78 (H2N2) y A/gallina/Hong Kong/258/97 (H5N1). Un virus recatalogado de la presente invención puede incluir cualquier combinación de segmentos de genes donantes y receptores, siempre que el virus recatalogado resultante posea al menos un fenotipo de identificación del virus donante.

Un ejemplo de virus recatalogado de la presente invención es un virus recatalogado "6 + 2", en el que seis "segmentos internos de gen", o sea, aquellos que comprenden los genes NP, PB2, PB1, PA, M, y NS, son derivados del genoma de virus de influenza equina adaptado en frío donante, y los dos "segmentos externos de gen", o sea, aquellos que comprenden los genes HA y NA, son derivados del virus de influenza A receptor. Un virus resultante así producido tiene el fenotipo atenuado, adaptado en frío, sensible a la temperatura, y/o interferencia dominante del virus de influenza equina adaptado en frío donante, pero la antigenicidad de la cepa receptora.

Todavía en otra realización, un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención puede ser producido a través de medios recombinantes. En esta aproximación, una o más mutaciones específicas, asociadas con la adaptación en frío identificada, la atenuación, la sensibilidad a la temperatura, o los fenotipos de interferencia dominantes, son identificados y son introducidos de vuelta dentro de la cepa de virus de influenza equina de tipo silvestre por el uso de una aproximación genética inversa. La genética inversa conlleva el uso de complejos de polimerasa ARN aislados de las células infectadas por virus para transcribir segmentos de genoma de virus de influenza artificiales que contienen la mutación(es), que incorporan el segmento(s) de ARN sintetizado dentro de partículas de virus por el uso de un virus auxiliar, y entonces seleccionar los virus que contienen los cambios deseados. Los métodos de genética inversa para los virus de influenza están descritos, por ejemplo, en Enami, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 3802-3805; y en U.S. Patent No. 5.578.473, por Palese, et al., publicado en Noviembre 26, 1996. Esta aproximación permite a un experto en la técnica producir virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención sin la necesidad de ir a través de procesos de adaptación en frío prolongados, y el proceso de seleccionar mutantes ambos in vitro e in vivo con los fenotipos de virus deseados.

Un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención puede ser propagado por los métodos virológicos convencionales bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, ejemplos de los cuales son revelados aquí. Por ejemplo, un virus de influenza equina adaptado en frío puede ser crecido en huevos embrionados de gallina o en células eucarióticas de cultivo de tejido. Las líneas de célula eucariótica continuas adecuadas bajo las cuales para crecer virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención incluyen esas que apoyan el crecimiento de virus de influenza, por ejemplo, las células MDCK. Otras células adecuadas bajo las cuales para crecer un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, cultivos de células primarias de riñón de mono, cría de ganado, hámster o gallina.

En una realización, la presente invención proporciona una composición terapéutica para proteger un animal de una enfermedad causada por un virus de influenza A, en la que la composición terapéutica incluye o un virus de influenza equina adaptado en frío o un virus de influenza A recatalogado que incluyen al menos un segmento de genoma de virus de influenza equina generado por adaptación en frío, en el que el segmento de genoma de virus de influenza equina confiere al menos un fenotipo de identificación del virus de influenza equina adaptado en frío. Además, una composición terapéutica de la presente invención puede incluir un virus de influencia equina que ha sido producido por ingeniería genética para comprender una o más mutaciones, en la que esas mutaciones han sido identificadas para conferir un cierto fenotipo de identificación a un virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención. Como es usado aquí, la frase "enfermedad causada por un virus de influenza A" se refiere a las manifestaciones clínicas observadas en un animal el cual ha sido infectado con un virus de influenza A virulento. Ejemplos de tales manifestaciones clínicas incluyen, pero no están limitados a, fiebre, estornudos, tos, descargas nasales, estertores, anorexia y depresión. Además, la frase "enfermedad causada por un virus de influenza A" es definida aquí para incluir el derramamiento del virus virulento por el animal infectado. La verificación de que las manifestaciones clínicas observadas en un animal se correlacionan con la infección por el virus de influenza equina virulento puede ser hecha por varios métodos, que incluyen la detección de un anticuerpo específico y/o las respuestas de las células T al virus de influenza equina en el animal. Preferiblemente, la verificación de que esas manifestaciones clínicas observadas en un animal se correlacionan por un virus de influenza A virulento es hecha por el aislamiento del virus del animal infectado, por ejemplo, estregando con un aplicador la cavidad nasofaríngea de ese animal para obtener secreciones que contienen virus. La verificación del aislamiento de virus puede ser hecha por la detección de CPE en células de cultivo de tejido inoculadas con las secreciones aisladas, por la inoculación de las secreciones aisladas dentro de huevos embrionados de gallina, en los que la replicación de virus es detectada por la habilidad de la FA de los huevos inoculados para aglutinar eritrocitos, que sugieren la presencia de la proteína hemaglutinina del virus de influenza, o por el uso de una prueba diagnóstica disponible comercialmente, por ejemplo, la prueba Directigen® FLU A.

Como es usado aquí, el término "proteger" incluye, por ejemplo, para prevenir o para tratar la infección por virus de influenza A en el animal en cuestión. Como tal, una composición terapéutica de la presente invención puede ser usada, por ejemplo, como una vacuna profiláctica para proteger un animal en cuestión de la enfermedad de influenza por la administración de la composición terapéutica a ese animal en un tiempo anterior a la exposición de ese animal al virus virulento.

Una composición terapéutica de la presente invención, que comprende virus de influenza equina que tienen un fenotipo de interferencia dominante, puede ser también usada para tratar un animal que ha sido recientemente infectado con un virus de influenza A virulento o es probable que sea expuesto subsiguientemente en unos días, tal que la composición terapéutica interfiera inmediatamente con el crecimiento del virus virulento, previo a la producción de anticuerpos al virus virulento por el animal. Una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo de interferencia dominante puede ser eficazmente administrado previo a la subsiguiente exposición por un tiempo de duración que se corresponde al tiempo de duración aproximado en que el virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención se replicará en el tracto respiratorio superior de un animal tratado, por ejemplo, hasta alrededor de los siete días. Una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo de interferencia dominante puede ser eficazmente administrado a continuación de la exposición a un virus de influenza equina virulento por una duración de tiempo que se corresponde al tiempo requerido para que un animal infectado muestre signos de enfermedad, por ejemplo, hasta alrededor de dos días.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención pueden ser administradas a cualquier animal susceptible a la enfermedad de influenza viral, por ejemplo, humanos, cerdos, caballos y otros équidos, aves acuáticas, domésticas y aves de corral, focas, visones y ballenas. Preferiblemente, una composición terapéutica de la presente invención es administrada en équidos. Inclusive más preferiblemente, una composición terapéutica de la presente invención es administrada a un caballo, para protegerlo en contra de la enfermedad de influenza equina.

Las vacunas actuales disponibles para proteger caballos en contra de la enfermedad del virus de influenza equina no son eficaces en la protección de los potros jóvenes, lo más probable porque ellas no pueden superar el anticuerpo materno presente en estos animales jóvenes, y a menudo, la vacunación en una edad temprana, por ejemplo a los 3 meses de edad, puede conducir a la tolerancia antes que a la inmunidad. En una realización, y en contraste a la existencia de vacunas de virus de influenza, una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina de la presente invención aparentemente puede producir inmunidad en animales jóvenes. Como tal, la composición terapéutica de la presente invención puede ser segura y eficazmente administrada a potros jóvenes, tan jóvenes como con 3 meses de edad, para protegerlos en contra de la enfermedad de influenza equina sin la inducción de
tolerancia.

En una realización, una composición terapéutica de la presente invención puede ser multivalente. Por ejemplo, puede proteger a un animal de más de una cepa de virus de influenza A al suministrar una combinación de uno o más virus de influenza equina adaptado en frío de la presente invención, uno o más virus de influenza A recatalogado, y/o uno o más virus de influenza equina obtenidos por ingeniería genética de la presente invención. Las composiciones terapéuticas multivalentes pueden incluir al menos dos virus de influenza equina adaptados en frío, por ejemplo, en contra del virus Norte Americano subtipo-2 aislado como A/equino/Kentucky/1/91 (H1N8), y el virus Eurasiático subtipo-2 aislado como A/equino/Suffolk/89 (H3N8); uno o más virus subtipo-2 aislados y un virus subtipo-2 aislado como A/equino/Praga/1/56 (H7N7). Similarmente, una composición terapéutica multivalente de la presente invención puede incluir un virus de influenza equina adaptado en frío y un virus de influenza A recatalogado de la presente invención, o dos virus de influenza A recatalogados de la presente invención. Una composición terapéutica multivalente de la presente invención puede también contener una o más formulaciones para proteger contra uno o más de otros agentes infecciosos además del virus de influenza A. Tales otros gentes infecciosos incluyen, pero no están limitados a: virus; bacterias; hongos y microorganismos relacionados con hongos; y parásitos. Las composiciones terapéuticas multivalentes preferidas incluyen, pero no están limitadas a, un virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza A recatalogado, o un virus de influenza equina producido por ingeniería genética de la presente invención o una o más composiciones protectoras contra uno o más agentes infecciosos que afectan a los caballos. Los agentes infecciosos adecuados para protegerse en contra incluyen, pero no están limitados a, los virus de anemia infecciosa equina, los herpes virus equino, los virus de encefalitis equina orientales, occidentales o venezolanos, el tétanos, estreptococo equi, y Ehrlichia resticii.

Una composición terapéutica de la presente invención puede ser formulada en un excipiente que el animal a ser tratado pueda tolerar. Ejemplos de tales excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank, y otras soluciones salinas acuosas balanceadas fisiológicamente. Los excipientes pueden contener pequeñas cantidades de aditivos, tales como sustancias que acentúan la isotonicidad y la estabilidad biológica o química. Ejemplos de tampones incluyen el tampón de fosfato, el tampón de bicarbonato, y el tampón Tris, mientras los ejemplos de estabilizadores incluyen el estabilizador A1/A2, disponible de Diamond Animal Health, Des Moines, IA. Las formulaciones convencionales pueden ser o líquidas o sólidas las cuales pueden ser tomadas en un líquido adecuado como una suspensión o solución para la administración a un animal. En una realización, una formulación no líquida puede comprender las sales excipientes, tampones, estabilizadores, etc., a los cuales pueden ser añadidas agua estéril o solución salina antes de la administración.

Una composición terapéutica de la presente invención puede también incluir uno o más adyuvantes o portadores. Los adyuvantes son típicamente sustancias que acentúan la respuesta inmune de un animal a un antígeno específico, y los portadores incluyen aquellos compuestos que incrementan la vida promedio de una composición terapéutica en el animal tratado. Una ventaja de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío o un virus de influenza A recatalogado de la presente invención es que los adyuvantes y los portadores no son requeridos para producir una vacuna eficaz. Además, en muchos casos conocidos por aquellos expertos en la técnica, las ventajas de una composición terapéutica de la presente invención podrían ser impedidas por el uso de algunos adyuvantes o portadores. Sin embargo, debe ser notado que el uso de adyuvantes o portadores no es excluido por la presente invención.

Las composiciones terapéuticas de la presente invención incluyen una cantidad de virus de influenza equina adaptados en frío que es suficiente para proteger un animal de las exposiciones con los virus de influenza equina virulentos. En una realización, una composición terapéutica de la presente invención puede incluir una cantidad de virus de influenza equina adaptados en frío en el orden de alrededor de 10^{5} unidades de dosis-50 (TCID_{50}) de un virus de cultivo de tejido infeccioso de alrededor de 10^{8} unidades de virus TCID_{50}. Como es usado aquí, una "unidad de TCID_{50}" es una cantidad de virus la cual resulta en efecto citopático en el 50% de esas células de cultivo infectadas. Los métodos para medir y calcular las TCID_{50} son conocidas por aquellos expertos en la técnica y están disponibles, por ejemplo, en Reed and Muench, 1938, Am. J. of Hyg. 27, 493-497. Una composición terapéutica preferida de la presente invención comprende desde alrededor de 10^{8} unidades de TCID_{50} hasta alrededor de 10^{7} unidades de un virus de influenza equina adaptado en frío o de virus de influenza A recatalogados de la presente invención. Aún más preferida es una composición terapéutica que comprende alrededor de 2 x 10^{6} unidades de TCID_{50} de virus de influenza equina adaptados en frío o de virus de influenza A recatalogados de la presente invención.

La presente invención también incluye los métodos para proteger un animal contra la enfermedad causada por un virus de influenza A que comprenden administrar al animal una composición terapéutica de la presente invención. Los referidos son esos métodos los cuales protegen un équido contra la enfermedad causada por el virus de influenza equina, donde esos métodos comprenden administrar al équido un virus de influenza equina adaptado en frío. Los protocolos aceptables para administrar las composiciones terapéuticas en una manera efectiva incluyen la dimensión de la dosis individual, el número de dosis, la frecuencia de administración de la dosis, y el modo de administración. La determinación de tales protocolos puede ser realizada por aquellos expertos en la técnica, y los ejemplos son comunicados aquí.

Un método preferible para proteger un animal contra la enfermedad causada por un virus de influenza A incluye administrar a ese animal una única dosis de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío, un virus de influenza A recatalogado, o un virus de influenza equina producido por ingeniería genética de la presente invención. Una adecuada dosis única es una dosis que es capaz de proteger un animal de la enfermedad cuando es administrada una o más veces sobre un adecuado período de tiempo. El método de la presente invención puede también incluir la administración subsiguiente, o dosis potenciadoras de una composición terapéutica. Las administraciones de potenciador pueden ser dadas desde alrededor de 2 semanas hasta varios años después de la administración original. Las administraciones de potenciador preferiblemente son administradas cuando la respuesta de inmunidad del animal se hace insuficiente para proteger al animal de la enfermedad. Ejemplos de programas de dosificación adecuada y preferida son divulgados en la sección de Ejemplos.

Una composición terapéutica de la presente invención puede ser administrada a un animal por una variedad de medios, tal que el virus entra y se replica en las células mucosas en el tracto respiratorio superior del animal tratado. Tales medios incluyen, pero no están limitados a, administración intranasal, administración oral, y administración intraocular. Debido a que los virus de influenza naturalmente infectan la mucosa del tracto respiratorio superior, un método preferible para administrar una composición terapéutica de la presente invención es por la administración intranasal. Tal administración puede ser realizada por el uso de una jeringuilla ajustada con una cánula, o por el uso de un nebulizador ajustado sobre la nariz y la boca del animal a ser vacunado.

La eficacia de la composición terapéutica de la presente invención para proteger un animal contra la enfermedad causada por el virus de influenza A puede ser ensayada en una variedad de formas que incluyen, pero no limitadas a, la detección de anticuerpos por, por ejemplo, pruebas de inhibición de hemaglutinación (HAI), detección de inmunidad celular en el animal tratado, competencia del animal tratado con el virus de influenza equina virulento para determinar si el animal tratado es resistente al desarrollo de la enfermedad. Además, la eficacia de la composición terapéutica de la presente invención que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que tiene un fenotipo de interferencia dominante para mejorar o reducir los síntomas de la enfermedad en un animal previamente inoculado o susceptible a inoculación con un virus de influenza equina de tipo silvestre puede ser ensayado por el filtrado para la reducción o ausencia de los signos de la enfermedad en el animal tratado.

La presente invención también incluye los métodos para producir una composición terapéutica de la presente invención. Los métodos adecuados y preferidos para hacer una composición terapéutica de la presente invención son revelados aquí. Los pasos pertinentes involucrados en producir un tipo de composición terapéutica de la presente invención, o sea, un virus de influenza equina adaptado en frío, incluyen (a) pasar un virus de influenza equina de tipo silvestre in vitro, por ejemplo, en huevos embrionados de gallina; (b) seleccionar virus que crecen a temperatura reducida; (c) repetir el pasaje y los pasos de selección una o más veces, a temperaturas progresivamente más bajas, hasta que las poblaciones de virus son seleccionadas las cuales crecen establemente a la temperatura más baja deseada; y (d) mezclar la preparación de virus resultante con excipientes adecuados.

Los pasos pertinentes involucrados en la producción de otro tipo de composición terapéutica de la presente invención, o sea, un virus de influenza A recatalogado que tiene al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación, incluye los pasos de (a) mezclar los segmentos de genoma de virus de influenza equina adaptado en frío donantes, los cuales preferiblemente también tienen los fenotipos de atenuación, sensibilidad a la temperatura, o interferencia dominante, con los segmentos de genoma de un virus de influenza A receptor, y (b) seleccionar los virus recatalogados que tienen al menos un fenotipo de identificación de un virus de influenza equina donante. Identificar los fenotipos a seleccionar para incluir la atenuación, adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, e interferencia dominante. Los métodos de filtrado para estos fenotipos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica, y son divulgados aquí. Es preferible filtrar los virus que al menos tienen el fenotipo de atenuación.

El uso de este método para generar un virus de influenza A recatalogado que tenga al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación en frío, un tipo de virus recatalogado a seleccionar es un "6 + 2" recatalogado, donde los seis "segmentos de genes internos", o sea, esos que codifican para los genes NP, PB2, PB1, PA, M, y NS, son derivados del genoma del virus de influenza equina adaptado en frío donante, y los dos "segmentos de gen externos", o sea, esos que codifican para los genes HA y NA, son derivados de el virus de influenza A receptor. Un virus resultante así producido puede tener los fenotipos adaptados en frío, atenuados, sensibles a la temperatura, y/o interferencia del virus de influenza equina adaptado en frío donante, pero la antigenicidad de la cepa receptora.

La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico aisladas de la cepa de tipo silvestre del virus de influenza equina A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8), y el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821.

En conformidad con la presente invención, una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico que ha sido removida de su medio natural (o sea, que ha sido sometida a manipulación humana) y puede incluir ADN, ARN, o derivados de cualquier ADN o ARN. Como tal, "aislada" no refleja la magnitud a la cual la molécula de ácido nucleico ha sido purificada.

La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas de virus de influenza equina adaptados en frío y de tipo silvestre. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención pueden ser preparadas por métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, o sea, la tecnología de ADN recombinante. Las moléculas de ácido nucleico preferidas tienen cepas codificantes que comprenden las secuencias de ácido nucleico SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 12, SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, SEC ID Nº: 18, SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 23, SEC ID Nº: 25, y/o complementos de ellas. Los complementos son definidos como dos cadenas monocatenarias de ácido nucleico en las cuales la secuencia nucleótida es tal que ellas se hibridizarán como un resultado del apareamiento de base a través de su longitud total. Dada una secuencia nucleótida, un experto en la técnica puede deducir el complemento.

Las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican las proteínas de influenza M son nei_{wt}M_{1023}, nei_{wt}M_{1023}, nei_{wt2}M_{1023}, nei_{wt}M_{756}, nei_{wt1}M_{756}, nei_{wt2}M_{756}, neica1M_{1023}, nei_{ca2}M_{1023}, nei_{ca1}M_{756}, y/o nei_{ca2}M_{756}, las cadenas codificantes de las cuales son representadas por las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, y/o la SEC ID Nº: 6.

Las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican las proteínas de influenza equina HA son nei_{wt}HA_{1762}, nei_{wt}HA_{1695}, nei_{ca1}HA_{1762}, nei_{ca2}HA_{1762}, nei_{ca1}HA_{1695}, y/o nei_{ca2}HA_{1695}, las cadenas codificantes de las cuales son representadas por las SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, y/o la SEC ID Nº: 12.

Las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican las proteínas de influenza equina PB2-N son nei_{wt}PB2-N_{1241}, nei_{wt}PB2-N_{1214}, nei_{ca1}PB2-N_{1241}, ne_{ca2}PB2-N_{1241}, nei_{ca1}PB2-N_{1214}, y/o nei_{ca2}PB2-N_{1214}, , las cadenas codificantes de las cuales son representadas por las SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, y/o la SEC ID Nº: 18.

\newpage

Las moléculas de ácido nucleico preferidas que codifican las proteínas de influenza equina PB2-C son nei_{wt1}PB2-C_{1233}, nei_{wt2}PB2-C_{1232}, nei_{wt}PB2-C_{1194}, nei_{ca1}PB2-C_{1232}, nei_{ca2}PB2-C_{1231}, y/o nei_{ca1}PB2-C_{1194}, las cadenas codificantes de las cuales son representadas por las SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, y/o la SEC ID Nº: 25.

La presente invención incluye las proteínas que comprenden las SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 14, SEC ID Nº: 17, SEC ID Nº: 20 y/o la SEC ID Nº: 24 así como las moléculas de ácido nucleico que codifican tales proteínas.

Las proteínas de influenza M preferidas de la presente invención incluyen las proteínas codificadas por moléculas de ácido nucleico que comprenden nei_{wt}M_{1023}, nei_{wt1}M_{1023}, nei_{wt2}M_{1023}, nei_{wt}M_{756}, nei_{wt1}M_{756}, nei_{wt2}M_{756}, nei_{ca1}M_{1023}, nei_{ca2}M_{1023}, nei_{ca1}M_{756}, y/o nei_{ca2}M_{756}. Las proteínas de influenza equina M preferidas son Pei_{wt}M_{252}, Pei_{ca1}M_{252}, y/o Pei_{ca2}M_{252}. En una realización, una proteína de influenza equina M preferida de la presente invención es codificada por las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, y/o la SEC ID Nº: 6, y, como tal, tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEC ID Nº: 2 y/o la SEC ID Nº: 5.

Las proteínas de influenza equina HA preferidas de la presente invención incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico que comprende nei_{wt}HA_{1762}, nei_{wt}HA_{1695}, nei_{ca1}HA_{1762}, nei_{ca2}HA_{1762}, nei_{ca1}HA_{1695}, y/o nei_{ca2}HA_{1695}. Las proteínas de influenza equina HA son P Pei_{wt}HA_{565}, Pei_{ca1}HA_{565}, y/o Pei_{ca2}HA_{565}. En una realización, una proteína de influenza equina HA preferida de la presente invención es codificada por SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, y/o SEC ID Nº: 12, y, como tal, tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEC ID Nº: 8 y/o la SEC ID Nº: 11.

Las proteínas de influenza equina PB2-N preferidas de la presente invención incluyen proteínas codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprenden nei_{wt}PB2-N_{1241}, nei_{wt}PB2-N_{1214}, nei_{ca1}PB2-N_{1241}, nei_{ca2}PB2-N_{1241}, nei_{ca1}PB2-N_{1214}, y/o nei_{ca2}PB2-N_{1214}. Las proteínas de influenza equina PB2-N preferidas son P_{wt}PB2-N_{404}, P_{ca1}PB2-N_{404}, y/o P_{ca2}PB2-N_{404}. En una realización, una proteína de influenza equina PB2-N preferida de la presente invención es codificada por las SEC ID Nº: 13, SEC ID Nº: 15, SEC ID Nº: 16, y/o la SEC ID Nº: 18, y, como tal, tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEC ID Nº: 14 y/o la SEC ID Nº: 17.

Las proteínas de influenza equina PB2-C preferidas de la presente invención incluyen proteínas codificadas por una molécula de ácido nucleico que comprenden nei_{wt1}PB2-C_{1233}, nei_{wt2}PB2-C_{1232}, nei_{wt}PB2-C_{1194}, nei_{ca1}PB2-C_{1232}, nei_{ca2}PB2-C_{1231}, y/o nei_{ca1}PB2-C_{1194}. Las proteínas de influenza equina PB2-C preferidas son P_{wt}PB2-C_{398}, P_{ca1}PB2-C_{398}, y/o P_{ca2}PB2-C_{398}. En una realización, una proteína de influenza equina PB2-C preferida de la presente invención es codificada por las SEC ID Nº: 19, SEC ID Nº: 22, SEC ID Nº: 21, SEC ID Nº: 23, y/o la SEC ID Nº: 25, y, como tal tiene una secuencia de aminoácidos que incluye la SEC ID Nº: 20 y/o SEC ID Nº: 24.

La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 1 representa la secuencia de consenso deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificadas por PCR denotadas aquí como nei_{wt1}M_{1023} y nei_{wt2}M_{1023}, la producción de las cuales es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 4 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificadas por PCR denotadas aquí como nei_{ca1}M_{1023} y nei_{ca2}M_{1023}, la producción de las cuales es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 7 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{wt}HA_{1762}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 10 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotadas aquí como nei_{ca1}HA_{1762} y nei_{ca2}HA_{1762}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. . La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 13 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{wt}PB2-N_{1241}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 16 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{ca1}PB2-N_{1241} y nei_{ca2}PB2-N_{1241}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 19 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{wt1}PB2-C_{1233}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 22 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{wt2}PB2-C_{1232}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. La secuencia de ácido nucleico SEC ID Nº: 23 representa la secuencia deducida de la cadena codificante de moléculas de ácido nucleico amplificada por PCR denotada aquí como nei_{ca1}PB2-C_{1232}, la producción de la cual es revelada en los Ejemplos. Adicionales moléculas de ácido nucleico, secuencias de ácido nucleico, secuencias de proteínas y aminoácidos son descritas en los Ejemplos.

La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico que comprenden virus de influenza equina adaptados en frío que codifican una proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 5. Otra realización de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que codifica una proteína HA que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 11. Otra realización de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que codifica una proteína PB2-N que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 17. Otra realización de la presente invención incluye una molécula de ácido nucleico que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío que codifica una proteína PB2-C que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 24.

Debe ser notado que ya que la tecnología de secuenciación de ácido nucleico no es enteramente libre de errores, las secuencias de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos presentadas aquí representan, respectivamente, aparentes secuencias de moléculas de ácido nucleico de la presente invención y aparentes secuencias de amino ácidos M, HA, y proteínas PB2-N y PB2-C de la presente invención.

Otra realización de la presente invención es un anticuerpo que selectivamente se liga a la proteína M, HA, PB2-N, PB2-C, PB2 de un virus de tipo silvestre de la presente invención. Otra realización de la presente invención es un anticuerpo que selectivamente se liga a la proteína M, HA, PB2-N, PB2-C, PB2 de un virus adaptado en frío de la presente invención. Los anticuerpos preferidos se ligan selectivamente a las SEQ ID Nº: 2, SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 8, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 14, SEQ ID Nº: 17, SEQ ID Nº: 20 y/o SEQ ID Nº: 24.

Los siguientes ejemplos son suministrados para los propósitos de ilustración y no están proyectados para limitar el alcance de la presente invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1

Este ejemplo revela la producción y la caracterización fenotípica de varios virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención.

A. El virus de influenza equina progenitor, A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8) (obtenido de Tom Chambers, Universidad de Kentucky, Lexington, KY) fue sometido a adaptación en frío en una especie hospedera ajena, o sea, huevos embrionados de gallina, en la siguiente manera. Huevos embrionados de gallina de 10 ó 15 días, disponibles, por ejemplo de Truslow Farms, Chestertown, MD o de HyVac, Adel, IA, fueron inoculados con el virus de influenza equina progenitor por inyección de alrededor de 0,1 mililitro (ml) de FA no diluido que contiene aproximadamente 10^{6} unidades deformación de placas (pfu) de virus dentro de la cavidad alantóica a través de un pequeño orificio perforado en la cáscara del huevo. Los orificios en los huevos fueron sellados con pintura de uñas y los huevos fueron incubados en un equipo incubador humidificado a la temperatura apropiada durante tres días. A continuación de la incubación, fueron vistos a trasluz y ninguno de los huevos no viables fue descartado. El FA fue cosechado de los embriones viables removiendo asépticamente una porción de la cáscara del huevo, separando la membrana corioalantóica (CAM) con pinzas estériles y removiendo el FA con una pipeta estéril. El FA cosechado fue congelado entre los pasajes. El FA fue entonces usado, o no diluido o diluido 1:1000 en tampón salino de fosfato (PBS) como se registró en la Tabla 1, para inocular un nuevo conjunto de huevos para un segundo pasaje, y así en adelante. Un total de 69 pasajes fue completado. Los pasajes iniciales fueron hechos ambos alrededor de los 34ºC (pasajes 1-2) o alrededor de los 30ºC y en los subsecuentes pasajes, la temperatura de incubación fue cambiada hacia abajo ambas a alrededor de los 28ºC, o alrededor de los 26ºC. Para incrementar la posibilidad de la selección de los fenotipos deseados de un virus atenuado, estable, la serie inicial de pasajes fue ampliada para incluir cinco brotes diferentes del árbol de la serie de pasajes, A hasta E, como se muestra en la Tabla 1.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Historia del pasaje de los brotes A hasta E

1

B. Los virus aislados llevados a través del procedimiento de adaptación en frío descrito en la sección A fueron ensayados para sensibilidad de temperatura, o sea, un fenotipo en el cual el virus adaptado en frío crece a la temperatura más baja o permisiva (por ejemplo, alrededor de los 34ºC, pero no forma más placas a una temperatura más alta o no permisiva (por ejemplo, alrededor de los 37ºC o alrededor de los 39ºC), como sigue. En cada pasaje de adaptación en frío, el FA fue detenido por ensayo de placa a alrededor de los 34ºC. Periódicamente, las placas individuales del ensayo fueron clonalmente aisladas por excisión del área de la placa y colocación del agar extirpado taponado en 96 bandejas que contienen un monoestrato de células MDCK. Las 96 bandejas fueron incubadas por una noche y la producción ensayada para la sensibilidad a la temperatura por la prueba CPE en las 96 bandejas duplicadas incubadas a alrededor de los 34ºC y alrededor de los 39ºC. El porciento de los clones que fue registrado como mutantes sensibles a la temperatura por este ensayo, o sea, el número de placas virales que crecieron a 34ºC pero no crecen a 39ºC, dividido por el número total de placas, fue calculado, y es mostrado en la Tabla 2. Las temperaturas sensitivas aisladas fueron entonces evaluadas para la síntesis de proteína a la temperatura no permisiva por la visualización de las proteínas sintetizadas de virus radiorotulados por electroforesis de gel de policrilamida (SDS-PAGE).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Porciento de Clones aislados que fueron sensibles a la temperatura

2

De los aislamientos clonales probados para sensibilidad a la temperatura, dos fueron seleccionados para estudio ulterior. El clon EIV-P821 fue seleccionado entre el pasaje 49 del brote B y el clon EIV-P824 fue seleccionado entre el pasaje 48 del brote C, como está definido en la Tabla 1. Ambos de estos virus aislados fueron sensibles a la temperatura, con formación de placa de ambos aislamientos inhibida a una temperatura de alrededor de 39ºC. A esta temperatura, la síntesis de proteína fue completamente inhibida por el EIV-P821, pero el EIV-P824 exhibió niveles normales de síntesis de proteína. Además, la formación de placa por el EIV-P821 fue inhibida a una temperatura de alrededor de 37ºC, y a esta temperatura, la expresión de gen tardío fue inhibida, o sea, niveles normales de proteína NP fueron sintetizados, reducidas o ningunas proteínas M1 o HA fueron sintetizadas, y niveles mejorados de las proteínas polimerasas fueron sintetizados. El fenotipo observado a 37ºC, siendo tipificado por síntesis de proteína viral diferencial, fue distinto del fenotipo de síntesis de proteína visto a alrededor de 39ºC, el cual fue tipificado por la inhibición de la síntesis de todas las proteínas virales. El virus EIV-P821 ha sido sedimentado con la American Type Culture Collection (ATCC) bajo Nº de acceso ATCC VR-___, y el virus EIV-P824 ha sido sedimentado con la ATCC bajos la accesión ATCC VR-___.

C. Ulteriores caracterizaciones de las mutaciones en el aislamiento del EIV-P821 fueron realizadas por análisis de recatalogación, como sigue.

El análisis de recatolagación en los virus de influenza permite a un experto en la técnica, bajos ciertas circunstancias, correlacionar los fenotipos de un virus dado con mutaciones putativas en ciertos de los ocho segmentos de ARN que comprenden un genoma de virus de influenza A. Esta técnica está descrita, por ejemplo, en Palese, et al., ibid. Una infección mixta de EIV-P821 y un virus aviar de influenza, A/ánade/New York/6750/78 fue realizada como sigue. Células MDCK fueron coinfectadas con EIV-P821 a una multiplicidad de infecciones (MOI) de 2 células pfu y A/ánade/New York/6750/78 a una MOI de ó 2, 5, ó 10 células pfu. Las células infectadas fueron incubadas a una temperatura de alrededor de 34ºC. Los resultados de las varias coinfecciones fueron titulados y las placas individuales fueron aisladas a alrededor de 34ºC, y los resultantes aislamientos clónicos fueron caracterizados como si ellos fueran capaces de crecer a alrededor de 39ºC y alrededor de 37ºC, y expresar sus genes, o sea, sintetizar proteínas virales a alrededor de 39ºC, alrededor de 37ºC, y alrededor de 34ºC. La síntesis de proteína fue evaluada por análisis SDS-PAGE de disoluciones de células infectadas radiorotuladas. Las proteínas HA, NP y NS-1 de los dos virus progenitores, cada uno de los cuales está codificado por un segmento de genoma separado, fueron distinguibles por el anális SDS-PAGE, ya que esas proteínas virales particulares, como las derivadas de virus de influencia equina o virus de influenza aviar, migran a pesos moleculares aparentes diferentes. En esta forma fue posible, al menos para los genes HA, NP, y NS-1, evaluar si ciertos fenotipos de los virus progenitores, o sea, la temperatura sensitiva y los fenotipos de síntesis de proteína, cosegregados con los segmentos de genoma portan estos genes. Los resultados del análisis de recatalogación que investigan la cosegregación de a) la mutación que inhibe la formación de placa, por ejemplo, la inducción de CPE, a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC o b) la mutación que inhibe la síntesis de proteína a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC con cada una de las proteínas EN-P821 HA, NP y NS-1 son mostradas en las Tablas 3 y 4, respectivamente.

TABLA 3 Análisis de recatalogación del fenotipo de formación de placas EIV-P821 a 39ºC con el virus de influenza aviar A/ánade/New York/6750/78

3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Análisis de la recatalogación del fenotipo de síntesis de la proteína EN-P821a 39ºC con el virus de influenza aviar A/ánade/New York/6750/78

4

Los resultados demostraron una asociación del gen equino NP con una mutación que causa la inhabilidad del EIV-P821 para formar placas a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC, pero los resultados no sugieren una asociación de cualquiera de los genes HA, NP, o NS-1 con una mutación que causa la inhabilidad del EIV-P821 para expresar proteínas virales a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC. De esta manera los datos también demostraron que el fenotipo de formación de placa y el fenotipo de síntesis de proteína observados en el virus EIV-P821 fueron resultados de mutaciones separadas.

D. Los estudios fueron también conducidos a determinar si los virus de influenza equina adaptados en frío de la presente invención tienen un fenotipo de interferencia dominante, esto es, si ellos dominan en infección mezclada con el virus progenitor tipo silvestre A/Kentucky/1/91 (H3N8). Los fenotips de interferencia dominante de los virus EIV-P821 y EIV-P824 fueron evaluados en la siguiente manera. Los monoestratos separados de células MDCK fueron infectados individualmente con el virus progenitor A/Kentucky/1/91 (H3N8) en un MOI de 2, infectados individualmente con el virus adaptado en frío EIV-P821 o EIV-P824 en un MOI de 2, o doblemente infectados simultáneamente con ambos virus progenitores y uno de los virus adaptados en frío a un MOI de 2+2, todos a una temperatura de alrededor de 34ºC. A las 24 horas después de la infección,el medio de los cultivos fueron cosechados y los virus producidos de las varias células infectadas fueron medidos por ensayos de placas duplicadas realizados a temperaturas de alrededor de 34ºC y alrededor de 39ºC. Este ensayo tomó ventaja del hecho de que los virus de influenza equina EIV-P821 o EIV-P824 son sensibles a la temperatura y son por tanto incapaces de formar placas a una temperatura no permisiva de alrededor de 39ºC, mientras el virus progenitor es capaz de formar placas a ambas temperaturas, así haciendo posible medir el crecimiento del virus progenitor en la presencia del virus adaptado en frío. Específicamente, el efecto de interferencia dominante del virus adaptado en frío sobre el crecimiento del virus progenitor fue cuantificado por la comparación del virus producido a alrededor de 39ºC de las células infectadas individualmente con el virus progenitor para la producción del virus progenitor en las células doblemente infectadas. El EIV-P821, en la infectación mezclada, fue capaz de reducir la producción del virus progenitor en aproximadamente 200 veces, mientras que el EIV-P824, en la infección mezclada, redujo la producción de virus progenitores en aproximadamente 3.200 veces. Este ensayo por lo tanto mostró que los virus EIV-P821 y EIV-P824 adaptados en frío ambos exhiben el fenotipo de interferencia dominante.

E. El virus aislado EIV-MSV+5 fue derivado del EIV-P821, como sigue. El EIV-P821 fue pasado una vez en huevos, como se describió arriba, para producir un Virus Semilla Maestro aislado, denotado aquí como EIV-MSV0. El EIV-MSV0 fue entonces sometido a pasar tres veces adicionales en huevos, el virus se aisla al final de cada pasaje siendo designados EIV-MSV+1, EIV-MSV+2, y EIV-MSV+3, respectivamente. El EN-MSV+3 fue entonces sometido a dos pasajes adicionales en células MDCK, como sigue. Las células MDCK fueron crecidas en 150 cm^{2} de cultivo de tejido en frascos en un medio MEM de cultivo de tejido con Sales de Hanks, que contienen el 10% de suero de becerro. Las células fueron entonces lavadas con solución estéril PBS y el medio de crecimiento fue reemplazado con alrededor de 8 ml por frasco de un medio infeccioso (medio de cultivo de tejido que comprende MEM con Sales de Hanks, 1 \mug/ml de solución de Tripsina, 0,125% de albúmina de suero bovino (BSA y 10 mM de tampón HEPES). Las células fueron inoculadas con FA que contiene el virus EN-MSV+3 (para el primer pasaje en células MDCK), y se permitió a los virus absorber por 1 hora alrededor de 34ºC. La vacuna fue removida de los monoestratos celulares, las células fueron lavadas otra vez con PBS, y alrededor de 100 \mul del medio infeccioso fue añadido por frasco. Las células infectadas fueron incubadas a alrededor de 34ºC por 24 horas. Las células infectadas con virus MDCK fueron cosechadas sacudiendo los frascos vigorosamente para desestabilizar el monoestrato celular, que resulta en virus aislados EIV-MSV+4 (el primer pasaje en células MDCK), y EIV-MSV+5 (el segundo pasaje en células MDCK).

Los virus EN-MSV0 y EN-MSV+5 fueron sometidos al análisis fenotípico, como se describió en la sección B arriba, para determinar su habilidad para formar placas y sintetizar proteínas virales a temperaturas de alrededor de 34ºC, alrededor de 37ºC, y alrededor de 39ºC. Ambos EIV-MSV0 y EN-MSV+5 formaron placas en células de cultivo de tejido a una temperatura de alrededor de 34ºC, y ningún virus aislado formó placas o exhibió síntesis de proteína viral detectable a una temperatura de alrededor de 39ºC. El virus EIV-MSV0 tuvo un fenotipo sensible a la temperatura como el EIV-P821 a una temperatura de alrededor de 37ºC, o sea, fue inhibido en formación de placa, y la expresión de gen tardío fue inhibida. Sin embargo, el EIV-MSV+5, a diferencia de su virus progenitor, EIV-P821, formó placas en el cultivo de tejido a una temperatura de alrededor de 37ºC, y a esta temperatura, el virus sintetizó cantidades normales de todas las proteínas. El virus EIV-MSV+5 ha sido sedimentado con la ATCC bajo Nº de acceso ATCC VR-___.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2

Las composiciones terapéuticas de la presente invención fueron producidas como sigue.

A. Una amplia reserva de EIV-P821 fue propagada en huevos como sigue. Alrededor de 60 huevos de gallina embrionados libres de patógenos fueron vistos a trasluz y los huevos no viables fueron descartados. La reserva de virus fue diluída a alrededor de 1,0 x 10^{5} pfu/ml en solución estéril PBS. Los virus fueron inoculados dentro de la cavidad alantóica de los huevos como se describió en el Ejemplo 1A. Después de una incubación de 3 días en una cámara humidificada a una temperatura de alrededor de 34ºC, el FA fue cosechado de los huevos de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 1A. El FA cosechado fue mezclado con una solución estabilizadora, por ejemplo, estabilizador A1/A2, disponible de Diamond Animal Health, Des Moines, IA, al 25% de VN (estabilizador/FA). El FA cosechado fue procesado por lotes en un tubo centrífugo y fue clarificado por centrifugación por 10 minutos a 1,000 rpm en una centrífuga refrigerada tapada de mesa IEC Centra-7R fijada a un rotor de cubeta giratorio. El fluido fue distribuido en criofrascos de 1 ml y fue congelado a alrededor de -70ºC. Las reservas de virus fueron tituladas en células MDCK por CPE y ensayo de placa a alrededor de 34ºC.

B. Un amplio inventario de EIV-P821 fue propagado en células MDCK como sigue. Las células MDCK fueron crecidas en frascos de cultivo de virus de 150 cm^{2} en un medio de cultivo de virus MEM con sales de Hanks, que contienen suero de becerro al 10%. Las células fueron entonces lavadas con solución estéril PBS y el medio de crecimiento fue reemplazado con alrededor de 8 ml por frasco del medio infeccioso. Las células MDCK fueron inoculadas con una reserva de virus en un rango de MOI desde alrededor de 0,5 pfu por célula hasta alrededor de 0,005 pfu por célula, y a los virus se les permitió absorber por 1 hora a alrededor de 34ºC. La vacuna fue removida de los monoestratos celulares, las células fueron lavadas de nuevo con PBS, y alrededor de 100 ml del medio infeccioso fueron añadidos por frasco. Las células infectadas fueron incubadas a alrededor de 34ºC por 24 horas. Las células infectadas MDCK fueron cosechadas sacudiendo los frascos vigorosamente para desestabilizar el monoestrato celular y una solución estabilizadora fue añadida a los frascos al 25% de V/V (estabilizador/solución de virus). Los sobrenadantes fueron distribuidos asépticamente en criofrascos y congelados a -70ºC.

C. Las composiciones terapéuticas que comprenden ciertos virus de influenza equina sensibles a la temperatura adaptados en frío de la presente invención fueron formulados como sigue. Justo antes de los procedimientos de vacunación, tales como esos descritos en los Ejemplos 3-7 más adelante, los frascos de reservas de agua, EIV-P821 o EN-MSV +5 fueron descongelados y fueron diluidos en un excipiente que comprende o agua, o PBS, o un medio de cultivo de tejido en MEM con Sales de Hanks, que contiene el 0,125% de albúmina de suero bovino (solución BSA-MEM) a la dilución deseada para la administración a los animales. Las composiciones de vacunas fueron mantenidas en hielo antes de las vacunaciones. Todas las composiciones terapéuticas fueron tituladas en células MDCK por métodos convencionales justo antes de las vacunaciones y siempre que fue posible, una cantidad de la composición, tratada idénticamente a aquellas administradas a los animales, fueron tituladas después de las vacunaciones para asegurar que el virus permaneció viable durante los procedimientos.

Ejemplo 3

Una composición terapéutica que comprende el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821 fue probado para seguridad y su habilidad para replicarse en tres caballos que muestran inmunidad anterior detectable al virus de influenza equina como sigue. El EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1A , fue crecido en huevos como se describió en el Ejemplo 2A y fue formulado en una composición terapéutica que comprende una solución BSA-MEM de 10^{7} pfu de EIV-P821 ½ ml como se describió en el Ejemplo 2C.

Los tres ponis que tienen títulos de inhibición de hemaglutinación (HAI) detectable anterior al virus de influenza equina fueron inoculados con una composición terapéutica que comprende el EIV-P821 por el siguiente método. A cada poni le fue dada una dosis de 2 ml de EIV-P821, administrada intranasalmente usando una jeringuilla fijada a una cánula despuntada lo suficientemente larga para alcanzar más allá de la pseudo fosa nasal, 1 ml por fosa nasal.

Los ponis fueron observados por 30 minutos aproximadamente inmediatamente a continuación y aproximadamente cuatro horas después de la vacunación para algún tipo inmediato de reacciones alérgicas tales como estornudos, salivación, respiración trabajosa o irregular, temblores, anafilaxis o fiebre. Los animales fueron además monitoreados en los días 1 al 11 post-vacunación para buscar algunos tipos de reacciones alérgicas tardías, tales como letargia o anorexia. Ninguno de los tres ponis en este estudio exhibió ninguna de las reacciones alérgicas de la vacunación.

Los ponis fueron observados diariamente, a aproximadamente al mismo tiempo cada día, comenzando dos días después de la vacunación y continuando hasta el día 11 a continuación de la vacunación para buscar síntomas clínicos consistentes con la influenza equina. Los ponis fueron observados para descarga nasal, descarga ocular, anorexia, disposición, ritmo cardíaco, tiempo de rellenado capilar, ritmo respiratorio, disnea, tos, sonidos pulmonares, presencia de revestimiento tóxico de la encía superior, y temperatura corporal. Además los gánglios linfáticos parietales fueron palpados y ninguna anormalidad fue reportada. Ninguno de los tres ponis en este estudio exhibió alguna reacción anormal o síntomas clínicos ostensibles durante el período de observación.

Para probar el derramamiento viral en los animales, en los días 0 hasta el 11 a continuación de la vacunación, las torundas nasofaríngeas fueron recolectadas de los ponis como está descrito en Chambers, et al., 1995, Equina Practice, 17, 19-23. Chambers, et al., ibid.. Concretamente, dos aplicadores emboquillados de poliester Dacrón estériles disponibles, por ejemplo, de Hardwood Products Co., Guilford, ME) fueron insertados, juntos, dentro de cada fosa nasal de los ponis. Las torundas, (cuatro en total, dos para cada fosa nasal) fueron separadas dentro de un tubo centrífugo cónico de 15 ml que contiene 2,5 ml del medio de transporte enfriado que comprende 5% de glicerol, penicilina, estreptomicina, neomicina, y gentamicina en PBS a pH fisiológico. Manteniendo las muestras en hielo mojado, las torundas fueron asépticamente exprimidas dentro del medio y las muestras nasofaríngeas fueron divididas en dos partes alícuotas. Una parte alícuota fue usada para intentar el aislamiento del EIV por inoculación de los huevos embrionados, usando el método descrito en el Ejemplo 1. El FA de los huevos inoculados fue entonces probado para su habilidad para causar hemaglutinción por mérodos convencionales, que indican la presencia del virus de influenza equina en el FA. En los días 3 y 4 post vacunación, otras partes alícuotas fueron probadas para el virus por la prueba Directigen® Flu A, disponible de Becton-Dickinson (Cockeysville, MD).

Los intentos de aislar el EIV de las secreciones nasofaríngeas de los tres animales por inoculación en huevo fueron infructuosos. Sin embargo, en los días 2 y 3, todos los animales resultaron positivos a la presencia de derramamiento de virus usando la prueba de Directigen Flu A, consistente con la hipótesis de que el EIV-P821 fue replicándose en los ponis seropositivos.

Para probar los títulos de anticuerpo al EIV en los animales inoculados descritos en este ejemplo, así como en los animales descritos en los Ejemplos 4-7, la sangre fue recolectada de los animales antes de la vacunación y en los días designados post vacunación. El suero fue aislado y fue tratado o con tripsina/periodato o caolín para bloquear los inhibidores no específicos de hemaglutinación presentes en el suero normal. Las muestras de suero fueron probadas para los títulos de inhibición de hemaglutinación (HAI) contra un reciente EIV aislado por métodos convencionales, descritos, por ejemplo, en "Método de ensayo suplementario para conducir en ensayo de inhibición de hemaglutinación para anticuerpo de virus de influenza equina" (SAM 124), sumistrado por el Laboratorio Nacional de Servicios Veterinarios U.S.D.A. bajo la 9 CFR 113.2.

Los títulos HAI de los tres ponis son mostrados en la Tabla 5. Como puede ser visto, independientemente del título inicial, los títulos HAI de suero se incrementaron al menos cuatro veces en todos los tres animales después de la vacunación con el EIV-P821.

Estos datos demuestran que el virus EIV-P821 de influenza equina adaptado en frío es inocuo y no reactogénico en ponis seropositivos, y que estos animales exhibieron un incremento en el título de anticuerpo al virus de influenza equina, aún si bien ellos tuvieron títulos demostrables anteriores.

TABLA 5 Títulos HAI de animales vacunados*

5

Ejemplo 4

Este Ejemplo revela un estudio animal para evaluar la seguridad y la eficacia de una composición terapéutica que comprende el virus EIV-P821 de influenza equina adaptado en frío.

Una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821 fue probado para la atenuación, así como para su habilidad para proteger caballos de la exposición con virus de influenza equina virulento, como sigue. El EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1, fue crecido en huevos como se describió en el Ejemplo 2A y fue formulado en una composición terapéutica que comprende 10^{7} pfu de virus/2 ml de agua, como se describió en el Ejemplo 2C. Ocho ponis seronegativos al EIV fueron usados en este estuido. Tres de los ocho ponis fueron vacunados con una dosis de 2 ml que comprende 10^{7} pfu de la composición terapéutica EIV-P821, administrada intranasalmente, usando métodos similares a aquellos descritos en el Ejemplo 3. A un poni le fueron dados 10^{7} pfu de una composición terapéutica EIV-P821, administrada oralmente, por inyección de 6 ml del virus dentro de la faringe, usando una jeringuilla de 10 ml la cual fue adaptada para crear una rociada fina por el siguiguiente método. El "asiento" protuberante para la fijación de las agujas fue sellado usando plastilina y su tapa fue dejada en su lugar. Alrededor de 10 agujeros fueron perforados a través del fondo de la jeringuilla, o sea, alrededor del "asiento", usando una aguja de calibre 25. La jeringuilla fue colocada en el espacio interdental y el virus fue fuertemente inyectado en la parte trasera de la boca. Los restantes cuatro ponis fueron mantenidos como controles no vacunados.

Los ponis vacunados fueron observados por aproximadamente 30 minutos inmediatamente a continuación y a aproximadamente cuatro horas después de la vacunación para reacciones de tipo alérgico inmediatas, y los animales fueron ulteriormente monitoreados en los días 1-11 post vacunación para reacciones de tipo alérgico tardías, ambas como se describieron en el Ejemplo 3. Ninguno de los cuatro ponis vacunados en este estudio exhibieron ningunas reacciones anormales de la vacunación.

Los ponis fueron evaluados diariamente, a aproximadamente el mismo tiempo cada día, comenzando dos días antes de la vacunación de virus y continuando hasta el día 11 a continuación para buscar signos clínicos, tales como esos descritos en el Ejemplo 3. Ninguno de los cuatro ponis en este estudio exhibió ninguno de los signos clínicos durante el período de observación. Este resultado demostró que el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821 exhibe el fenotipo de atenuación.

Para probar el derramamiento viral en los animales vacunados, en los días 0 hasta 11 a continuación de la vacunación, las torundas nasofaríngeas fueron recolectadas de los ponis como se describió en el Ejemplo 3. Las muestras nasofaríngeas fueron probadas en huevos de gallina embrionados de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3.

Como se muestra en la Tabla 6, el virus fue aislado de solamente un animal vacunado usando el método del huevo. Sin embargo, como se nota en el Ejemplo 3, la ausencia de aislamiento por este método no excluye que la replicación de virus esté ocurriendo, ya que la replicación puede ser detectada por métodos más sensitivos, o sea, la prueba de Directigen Flu A.

TABLA 6 Aislamiento de virus en huevos después de la vacunación

6

Para probar los títulos de anticuerpo al virus de influenza equina en animales vacunados, la sangre fue recolectada de los animales antes de la vacunación y en los días 7, 14, 21 y 28 post vacunación. Las muestras de suero fueron aisladas y fueron probadas para los títulos de inhibición de hemaglutinación contra un reciente virus EIV aislado de acuerdo a los métodos descritos en el Ejemplo 3.

Los títulos HAI de los cuatro ponis vacunados son mostrados en la Tabla 7.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7

Títulos HAI después de la vacunación
Títulos HAI (días después de la vacunación)

7

A diferencia del incremento del título HAI observado con los tres animales descritos en el estudio en el Ejemplo 3, los animales en este estudio no exhibieron un significativo incremento, o sea, mayor que cuatro veces, en el título HAI a continuación de la vacunación con EIV-P821.

Aproximadamente cuatro y medio meses después de la administración del virus vacuna, todos los 8 ponis, o sea, los cuatro que fueron vacunados y los cuatro de control no vacunados, fueron expuestos por el siguiente método. Para cada animal, 10^{7} pfu de la cepa de virus de influenza equina virulenta A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8) fue suspendida en 5 ml de agua. Una máscara fue conectada a un nebulizador, y la máscara fue colocada sobre el hocico del animal, incluyendo las fosas nasales. Cinco (5) ml fueron nebulizados para cada animal, usando colocaciones tales que tomó de 5-10 minutos entregar el total de los 5 ml. Las observaciones clínicas, como se describió en el Ejemplo 3, fueron realizadas en todos los animales tres días antes de la exposición y diariamente por 11 días después de la exposición.

A pesar del hecho de que los animales vacunados no exhibieron marcados incrementos en sus títulos HAI al virus de influenza equina, todos los cuatro animales vacunados fueron protegidos contra la exposición del virus de influenza equina. Ninguno de los animales vacunados mostró signos clínicos ostensibles o fiebre, aunque uno de los animales tuvo una respiración dificultosa menor por dos días. Por otra parte, todos los ponis no vacunados derramaron virus y desarrollaron signos clínicos y fiebre típicos de la infección de virus de influenza equina. De esta forma, este ejemplo demuestra que una composición terapéutica de la presente invención puede proteger a los caballos de la enfermedad de la influenza equina.

Ejemplo 5

Este Ejemplo revela un estudio animal adicional para evaluar la atenuación de una composición terapéutica que comprende el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821, y su habilidad para proteger a los caballos vacunados de subsecuentes exposiciones con el virus de influenza equina virulento. Además, este estudio evaluó el efecto del estrés de ejercicio en la seguridad y eficacia de la composición terapéutica.

Una composición terapéutica que comprende el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821 fue probada para seguridad y eficacia en caballos, como sigue. El EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1, fue cultivado en huevos como se describió en el ejemplo 2A y fue formulado en una composición terapéutica que comprende 10^{7} pfu de virus/5ml en agua, como se describió en el Ejemplo 2C. Quince ponis fueron usados en este estudio. Los ponis fueron aleatoriamente asignados a tres grupos de cinco animales cada uno, como se muestra en la Tabla 8, estando allí dos grupos vacunados y un grupo de control no vacunado. Los ponis en el grupo 2 fueron estresados con ejercicio antes de la vacunación, mientras los ponis en el grupo 1 vacunado fueron mantenidos en un establo.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 8 Vacunación/Protocolo de Exposición

8

Los ponis en el grupo 2 fueron sometidos a estrés por ejercicio en una noria antes de la vacunación, como sigue. Los ponis fueron aclimatados para el uso de la noria por 8 horas de uso de la noria al paso solamente. El estrés real por ejercicio implicó un régimen diario de ejercicio comenzando 4 días antes y teminando en el día de la vacunación (inmediatamente antes de la vacunación). El régimen de ejercicio en la noria está mostrado en la Tabla 9.

TABLA 9 Régimen de ejercicio para ponis en el Grupo 2

9

A los grupos 1 y 2 les fue dada una composición terapéutica que comprende 10^{7} pfu de EIV-P821, por el método de nebulización descrito para la exposición descrito en el Ejemplo 4. Ninguno de los ponis vacunados en este estudio exhibieron ningunas reacciones alérgicas inmediatas o tardías de la vacunación.

Los ponis fueron observados diariamente, a aproximadamente el mismo tiempo cada día, comenzando dos días antes de la vacunación y continuando hasta el día 11 a continuación de la vacunación para buscar síntomas clínicos, tales como los descritos en el Ejemplo 3. Ninguno de los ponis vacunados en este estudio exhibió síntomas clínicos ostensibles durante el período de observación.

Para probar para el derramamiento viral en los animales vacunados, antes de la vacunación y en los días 1 hasta el 11 a continuación de la vacunación, las torundas nasofaríngeas fueron recolectadas de los ponis como se describió en el Ejemplo 3. Las muestras nasofaríngeas fueron probadas para virus en huevos de gallina embrionados de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3. El virus fue aislado de los animales vacunados, o sea, los Grupos 1 y 2, como se muestra en la Tabla 10.

TABLA 10

Aislamiento de virus después de la vacunación
Aislamiento de virus (días después de la vacunación)

10

Para probar los títulos de anticuerpo al virus de la influenza equina en los animales vacunados, la sangre fue recolectada antes de la vacunación y en los días 7, 14, 21 y 28 post vacunación. Las muestras de suero fueron aisladas y fueron probadas para títulos HAI contra un EIV reciente aislado de acuerdo a los métodos descritos en el Ejemplo 3. Esos títulos son mostrados en la Tabla 11.

TABLA 11 Títulos HAI después de la vacunación y después de la exposición en 90 días

11

En el día 90 post vacunación, todos los 15 ponis fueron expuestos con 10^{7} pfu de cepa de virus de influenza equina A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8) por un método nebulizador como se describió en el Ejemplo 4. Las observaciones clínicas, como se describieron en el Ejemplo 3, fueron realizadas en todos los animales tres días antes de la exposición y diariamente por 11 días después de la exposición. No hubo signos clínicos ostensibles observados en ninguno de los ponis vacunados. Cuatro de los cinco ponis no vacunados desarrollaron fiebre y signos clínicos típicos de infección de virus de influenza equina.

De este modo, este ejemplo demuestra que una composición terapéutica de la presente invención protege a los caballos contra la enfermedad de la influenza equina, aún si los animales están estresados antes de la vacunación.

Ejemplo 6

Este Ejemplo comparó las infectividades de las composiciones terapéuticas de la presente invención crecidas en huevos y crecidas en células de cultivo de tejido. Desde un punto de vista de producción, hay una ventaja para crecer composiciones terapéuticas de la presente invención en cultivo de tejido en lugar de en huevos embrionados de gallina. El virus de influenza equina, sin embargo, no crece a tan alto título en células como en huevos. Además, la hemaglutinina del virus requiere una hendidura proteolítica extracelular por tripsina parecida a las proteasas para la infectividad. Ya que el suero contiene inhibidores de la tripsina, el crecimiento del virus en la célula de cultivo debe ser propagado en un medio libre de suero que contiene tripsina para ser infeccioso. Es bien conocido por aquellos expertos en la técnica que tales condiciones son menos que óptimas para la viabilidad de las células de cultivo de tejido. Además, estas condiciones de crecimiento pueden seleccionarse para virus con afinidad de enlace alterado para células equinas, las cuales pueden afectar la infectividad viral ya que el virus necesita enlazarse eficientemente a la mucosa nasal del animal para replicarse y estimular la inmunidad. Así, el objetivo del estudio revelado en este ejemplo fue evaluar si tanto la infectividad de las composiciones terapéuticas de la presente invención fue adversamente afectada por el crecimiento para los múltiples pasajes de cultivo de tejido in vitro.

El EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1, fue crecido en huevos como se describió en el Ejemplo 2 A o en células MDCK como se describió en el Ejemplo 2B. En cada instancia, el virus fue pasado cinco veces. El EIV-P821 fue probado para su adaptación en frío y fenotipos sensibles a la temperatura después de cada pasaje. Las preparaciones de virus pasados en huevos y células fueron formuladas en composiciones terapéuticas que comprenden 10^{7} pfu de virus/2 ml de solución BSA-MEM, como se describió en el Ejemplo 2C, resultantes en una composición terapéutica crecida en huevo EIV-P821 y en una composición terapéutica crecida en células MDCK, respectivamente.

Ocho ponis fueron usados en este estudio. El suero de cada animal fue probado para títulos HAI al virus de influenza equina antes del estudio. Los animales fueron aleatoriamente asignados en uno o dos grupos de cuatro ponis cada uno. El Grupo A recibió una composición terapéutica crecida en huevo EIV-P821 y el Grupo B recibió una composición terapéutica crecida en células MDCK EIV-P821, preparadas como se describió en el Ejemplo 2B. Las composiciones terapéuticas fueron administradas intranasalmente por el método descrito en el Ejemplo 3.

Los ponis fueron observados diariamente, a aproximadamente el mismo tiempo cada día, comenzando dos días antes de la vacunación y continuando hasta el día 11 a continuación de la vacunación para buscar reacciones alérgicas o signos clínicos como se describió en el Ejemplo 3. Ninguna reacción alérgica o signos clínicos ostensibles fueron observados en ninguno de los animales.

Las torundas nasofaríngeas fueron colectadas antes de la vacunación y diariamente por 11 días después de la vacunación. La presencia de material viroso en las torundas nasales fue determinada por la detección de CPE en las células infectadas como se describió en el Ejemplo 1, o por inoculación dentro de los huevos y el exámen de la habilidad del FA infectado para causar hemaglutinación, como se describió en el Ejemplo 3. El material fue probado para la presencia de virus solamente, y no para títulos de virus en la muestra. Los resultados del aislamiento de virus son listados en la Tabla 12. La sangre fue recolectada y las muestras de suero de los días, 7. 14. 21 y 28 después de la vacunación fue probada para títulos de anticuerpos de inhibición de hemaglutinación contra un aislado reciente. Los títulos HAI son también listados en la Tabla 12.

TABLA 12 Títulos HAI y aislamiento de virus después de la vacunación

12

Los resultados en la Tabla 12 muestran que no hay diferencias significantes en la infectividad o inmunogenicidad entre las composiciones terapéuticas EIV-P821 crecidas en huevo y las crecidas en células MDCK.

Ejemplo 7

Este ejemplo evaluó la dosis mínima de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío requerido para proteger a un caballo de la infección por el virus de influenza equina.

Los estudios de animal revelados en los Ejemplos 3-6 indicaron que una composición terapéutica de la presente invención fue eficaz y segura. En estos estudios, una dosis de 10^{7} pfu, la cual se correlaciona a aproximadamente 10^{8} unidades de TCID_{50}, fue usada. Sin embargo, desde un punto de vista de costo y seguridad, es ventajoso usar el mínimo título de virus que protegerá a un caballo de la enfermedad causada por el virus de influenza equina. En este estudio, los ponis fueron vacunados con cuatro dosis diferentes de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío para determinar la dosis mínima la cual protegerá a un caballo contra la exposición a un virus de influenza equina virulento.

El EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1A, fue pasado y crecido en células como se describió en el Ejemplo 2B y fue formulado en una composición terapéutica que comprende o 2 x 10^{4}, 2 x 10^{5}, 2 x 10^{6}, o 2 x 10^{7} unidades de TCID_{50}/1 ml de solución BSA-MEM como se desribió en el Ejemplo 2C. Diecinueve caballos de varias edades y razas fueron usados en este estudio. Los caballos fueron asignados a cuatro grupos de vacuna, un grupo de tres caballos y tres grupos de cuatro caballos, y un grupo de control de cuatro caballos (ver Tabla 13). A cada uno de los ponis en los grupos de vacuna le fue dada una dosis de 1 ml de la composición terapéutica indicada, administrada intranasalmente por métodos similares a esos descritos en el Ejemplo 3.

TABLA 13 Protocolo de vacunación

13

Los ponis fueron observados por aproximadamente 30 minutos inmediatamente a continuación y aproximadamente cuatro horas después de la vacunación para reacciones de tipo inmediato, y los animales fueron más adelante monitoreados en los días 1-11 post vacunación para reacciones de tipo tardío, como se describió en el Ejemplo 3. Ninguno de los ponis vacunados en este estudio exhibió ningunas reacciones anormales o signos clínicos ostensibles de la vacunación.

Los análisis de suero y sangre fueron recolectados 3 días antes de la vacunación, en los días 7, 14, 21 y 28 después de la vacunación, y después de la exposición en los días 35 y 42. Las muestras de suero fueron probadas para títulos HAI contra un EIV aislado reciente de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 3. Estos títulos son mostrados en la Tabla 14. Antes de la exposición en el día 29, 2 de los 3 animales en el grupo 1, 4 de los 4 animales en el grupo 2, 3 de los 4 animales en el gupo 3, y 2 de los 4 animales en el grupo 4 mostraron al menos incrementos en 4 veces en los títulos HAI después de la vacunación. Además, 2 de los 4 caballos de control también exhibieron incrementos en los títulos HAI. Una interpretación de estos resultados es que los caballos de control fueron expuestos al virus vacuna transmitido de los caballos vacunados, ya que todos los caballos en este estudio fueron albergados en el mismo establo.

TABLA 14 Títulos HAI post vacunación y post exposición, y resultados de la exposición

14

En el día 29 post vacunación, todos los 19 ponis fueron expuestos con la cepa del virus de influenza equina A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8) por el método nebulizador como se describió en el Ejemplo 4. La dosis de exposición fue prospectivamente calculada para contener alrededor de 10^{8} unidades de TCID_{50} de virus de exposición en un volumen de 5 ml por cada animal. Las observaciones clínicas, como se describieron en el Ejemplo 3, fueron monitoreadas comenzando dos días antes de la exposición, el día de la exposición, y por 11 días a continuación de la exposición. Como se mostró en la Tabla 14, ningún animal en los grupos 1 o 2 exhibieron signos clínicos indicativos de la enfermedad de influenza equina, y solamente y ninguno fuera de los cuatro animales en el grupo 3 enfermó. Dos fuera de los cuatro animales en el grupo 4 enfermó, y solamente dos de los cuatro animales de control enfermaron. Los resultados en la Tabla 14 sugieren una correlación entre la seroconversión y la protección de la enfermedad, ya que, por ejemplo, los dos animales de control que mostraron títulos HAI incrementados durante el período de vacunación no mostraron signos clínicos de la enfermedad de influenza equina a continuación de la exposición. Otra interpretación, sin embargo, fue que el título real del virus de exposición puede haber sido menor que la cantidad de 10^{8} unidades de TCID_{50} calculada, ya que, basado en los resultados anteriores, este nivel de exposición debió haber causado enfermedad en todos los animales de control.

Sin embargo, los niveles de seroconversión y la falta de signos clínicos en el grupo que recibió una composición terapéutica que comprende al menos 2 x 10^{6} unidades de virus de influenza equina adaptado en frío TCID_{50} sugiere que esta cantidad fue suficiente para proteger un caballo contra la enfermedad de influenza equina. Además, una dosis de 2 x 10^{5} unidades de TCID_{50} indujo la seroconversión y dio protección clínica de exposición en 3 fuera de los 4 caballos, y de esta manera aún esta cantidad puede ser suficiente para conferir protección significante en caballos contra la enfermedad de influenza equina.

Ejemplo 8

Este ejemplo revela un estudio animal para evaluar la duración de la inmunidad de una composición terapéutica que comprende virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821

Una composición terapéutica que comprende el virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821, producido como se describió en el Ejemplo 1, fue crecido en huevos similarmente al procedimiento descrito en el Ejemplo 2A, fue expandido por el pasaje en células MDCK similarmente al procedimiento descrito en el Ejemplo 2B, y fue formulado en una composición terapéutica como se describió en el Ejemplo 2C. Treinta caballos de aproximadamente 11 a 12 meses de edad fueron usados para este estudio. Diecinueve de los caballos fueron vacunados intranasalmente en una fosa nasal usando una jeringuilla con un dispositivo de entrega de boquilla sujeto a su extremo, con una dosis de 1,0 ml que comprende 6 registros de unidades de TCID_{50} de una composición terapéutica EIV-P821. Las vacunas fueron realizadas en el día 0.

Los caballos fueron observados en el día 0 (antes de la vacunación y hasta 4 horas post vacunación) y en los días de estudio 1, 2, 3, 7, 15, y 169 post vacunación. En esos días, un examen a distancia por un período de al menos 15 minutos fue realizado. Este examen a distancia incluyó la observación para la conducta, comportamiento, tos, estornudo, y descarga nasal. El examen en el día 169 también sirvió para confirmar que los caballos estaban en una condición de salud adecuada para transportarlos al sitio de exposición el cual estaba situado aproximadamente a 360 millas del sitio de vacunación.

Los animales fueron aclimatados al sitio de exposición y fueron observados aproximadamente diariamente por un veterinario o técnico en animales para evidencia de enfermedad. Un examen físico general fue realizado en el día 171 post vacunación para monitorear lo siguiente: conducta, comportamiento, tos, estornudo, y descarga nasal. De los días 172 a 177, similares observaciones así como la temperatura rectal fueron registradas, de acuerdo con el juicio del veterinario que atendió a cada caballo individual con presentación clínica anormal.

Los caballos no vacunados mostraron ninguna reacción adversa port vacunación. Uno vacunado fue encontrado muerto alrededor de dos meses después de la vacunación. Este caballo mostró ninguna evidencia de reacción adversa cuando fue observado por al menos un mes después de la vacunación. Aunque ninguna causa de muerte pudo ser firmemente establecida, la muerte no fue instantánea y fue considerada a ser consistente con factores de contribución posibles tales como cólico, fractura de hueso, o carga severa de gusanos. Ya que no había otra evidencia de ninguna de las reacciones adversas por vacunación en ninguno de los otros vacunados, es altamente improbable que la vacuna contribuyera a ninguna reacción adversa en este caso.

Las exposiciones fueron realizadas en el día 181 post vacunación. El siguiente virus de influenza equina aislado tipo silvestre previamente mostrado para causar enfermedad en los caballos fue usado como el virus de exposición: A/equino/2/Kentucky/91. Antes de la infección de cada grupo expuesto, el material de exposición fue rápidamente descongelado a aproximadamente 37ºC. El virus fue diluido con solución salina tamponada con fosfato a un volumen total de aproximadamente 21 ml. El material diluido fue almacenado enfriado en hielo hasta inmediatamente antes de la inoculación. Antes de la inoculación y al final de la nebulización de cada grupo expuesto, una muestra del virus de exposición diluido fue recolectada para la confirmación del título de virus pre y post inoculación. Los vacunados y los de control fueron aleatoriamente asignados a 4 grupos de exposición de 6 caballos cada uno y un grupo de exposición de 5 caballos de tal forma que cada grupo de exposición contenía una mezcla de 4 vacunados y 2 de control o 3 vacunados y 2 de control.

El virus de exposición en forma de aerosol fue entregado a través de un tubo insertado a través de una abertura central pequeña en el techo plástico con un nebulizador ultrasónico (por ejemplo, De Vilbiss Model 099HD, De Vilbiss Healthcare Inc., Somerset, Pennsylvania) por un período de aproximadamente 10 minutos. Los caballos quedaron en la cámara por un período ulterior de aproximadamente 30 minutos después de que la nebulización había sido completada (tiempo total de exposición, aproximadamente 40 minutos). En ese momento, el plástico fue removido para ventilar la cámara, y los caballos fueron liberados y devueltos a su corral. El procedimiento de exposición fue repetido para cada grupo.

Todos los métodos estadísticos en este estudio fueron realizados usando SAS (SAS Institute, Cary, NC), y un P < 0,05 fue considerado ser significante estadísticamente. Comenzando en el día 178 post vacunación (tres días antes de la exposición) hasta el día 191 (día 10 post exposición), los caballos fueron observados diariamente por ambos exámenes distante e individual. Las temperaturas rectales fueron medidas en esos momentos. Los datos desde el día 0 (día de la exposición) hasta el día 10 fueron incluidas en los análisis, ver Tabla 15.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 15 Efecto de la exposición en las temperatures diarias (ºC) en caballos vacunados y de control (promedio mínimo de cuadrados)

15

La Tabla 15 muestra que en los días 2 hasta el 8, los caballos vacunados tuvieron temperaturas más bajas (P<0,05) que los caballos de control no vacunados.

El examen a distancia consistió de un período de 20 minutos en los que las siguientes observaciones fueron hechas: tos, descarga nasal, respiración, y depresión. Los criterios de puntaje son mostrados en la Tabla 16.

TABLA 16 Síntomas clínicos e índice de puntaje

16

Cada caballo fue punteado para cada una de estas categorías. Adicionalmente, los nódulos linfáticos submandibulares fueron palpados para monitorear una posible infección bacterial. En cualquier caso en el que hubo un valor difefente registrado para un puntaje de signo clínico subjetivo de una observación en el mismo día a la distancia contra la observación individual, el mayor puntaje fue usado en la compilación y análisis de los resultados. Para los propósitos de evaluar la salud de los caballos antes de la disposición final, los exámenes a distancia fueron realizados a los 14, 18, y 21 días post exposición. Los datos desde los días 1 hasta el 10 post vacunación fueron incluidos en el análisis. Estos puntajes fueron sumados en cada día para cada caballo, y los vacunados y los de control fueron comparados usando la prueba de sumas de rango de Wilcoxon. Además, estos puntajes fueron sumados a través de todos los días para cada caballo, y comparados en la misma manera. Los rangos medios y los puntajes clínicos medios son mostrados en las Tablas 17 y 18, respectivamente. Cinco días post exposición, el rango medio de los puntajes en los caballos vacunados fue menor (P < 0,05) que en los caballos de control no vacunados; y este efecto continuó en los días 6, 7, 8, 9, y10 (P < 0,05). El rango acumulativo sobre el período de prueba completo fue también más bajo (P<0,05) en los caballos vacunados que en los de control no vacunados.

TABLA 17 Efecto de la exposición en los puntajes de los signos clínicos en caballos vacunados y de control (rango medio)

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 18 Efecto de la exposición en los puntajes de los signos clínicos en caballos vacunados y de control (puntajes medios)

18

Las torundas nasofaríngeas fueron obtenidas en el día anterior a la exposición y en los días 1 a 8 post exposición, como se describió en el Ejemplo 3, y probados para virus derramados por el ensayo de cultivo de células. El porciento de caballos que derraman virus de exposición en cada grupo es mostrado en la Tabla 19. El porciento de caballos que deraman virus de exposición en el grupo vacunado fue menor (P<0,05) en los días 5 y 6 post exposición que en los de control no vacunados.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 19 Porciento de caballos que derraman virus por día post exposición y número medio de días de derramamiento por grupo

19

Los puntajes de los signos clínicos relevantes a la influenza y las mediciones de la temperatura objetiva ambas demostraron una reducción estadística significante en el grupo de vacunados cuando se comparó con aquellos del grupo de control; esto es consistente con una interpretación de que la vacuna confiere protección significante de la enfermedad.

La habilidad de los caballos para derramar virus de influenza post exposición fue también significativamente reducida en los vacunados comparados a los de control en ambos la incidencia de caballos positivos para el derramamiento en ciertos días post exposición y el número medio de días de derramamiento por caballo. Este derramamiento disminuido por los vacunados es importante en que debe servir para reducir el potencial por exposición de animales susceptibles al virus de tipo silvestre en una epidemia de influenza.

Los resultados de este estudio son consistentes con la interpretación de que la vacuna seguramente confirió protección por 6 meses para la enfermedad clínica causada por la influenza equina y redujo el potencial para la diseminación de virus de influenza equina virulento que ocurre naturalmente. Mientras el grado de protección de la enfermedad no fue completo (13 fuera de 19 vacunados fueron protegidos, mientras 10/10 de control enfermaron), hubo una clara reducción en la severidad y duración de la afección clínica y un notable efecto en el potencial para el derramamiento viral después de la exposición a una cepa virulenta de influenza equina. El hallazgo de que ambos vacunados y de control fueron seronegativos inmediatamente antes de la exposición a 6 meses post inmunización sugiere que la inmunidad mediada por algo aparte del suero anticuerpo puede ser de primaria importancia en la habilidad de esta vacuna para conferir protección medible y durable.

Ejemplo 9

Este ejemplo revela un estudio animal para evaluar la habilidad de una composición terapéutica que comprende un virus de influenza equina adaptado en frío EIV-P821 para ayudar en la prevención de la enfermedad a continuación de la exposición a una cepa heteróloga de virus de influenza equina.

La cepa heteróloga probada fue la A/equino/2/Saskatoon/90, descrita genéticamente como una cepa Eurasiática (obtenida de Hugh Townsend, Universidad de Saskatchewan). Veinte (hembras) caballos Percherón de aproximadamente 15 meses de edad (en el momento de la vacunación) fueron usados para la eficacia del estudio. Los caballos fueron asignados a dos grupos, un grupo de 10 a ser vacunados y otro grupo de 10 para servir como de control no vacunados. En el día 10, el grupo vacunado fue vacunado en la manera descrita en el Ejemplo 8.

El material de exposición, o sea, la cepa equina de influenza A/equino/2/Saskatoon/90 [H3N8] fue preparada similarmente a la preparación en el Ejemplo 8. Los vacunados y de control fueron aleatoriamente asignados a 4 grupos de exposición de 5 caballos cada uno tal que cada grupo de exposición contenía una mezcla de 2 vacunados y 3 de control o viceversa. El procedimiento de exposición fue similar a ese descrito en el Ejemplo 8. Las exposiciones fueron realizadas el día 28 post vacunación.

Las observaciones clínicas fueron realizadas para los vacunados y de control en el día -4 y en los días de estudio 0 (antes de la vacunación y hasta 4 horas post vacunación), 1 a 7, 12, 15 a 17, 19 a 23, 25 a 38, y 42. Por los días en los cuales las observaciones clínicas fueron realizadas durante los días -4 a 42, las observaciones clínicas que incluyen la temperatura rectal fueron puntuadas de acuerdo al juicio del veterinario que atiende a cualquier caballo con presentación clínica anormal. Los caballos fueron punteados usando el mismo criterio como en el Ejemplo 8 (Tabla 15). Los exámenes a distancia fueron realizados en esos días como se describió en el Ejemplo 8. En el día 20 y en los días 25 a 38, los caballos fueron observados por ambos exámenes a distancia e individual. (también como como se describió en el Ejemplo 8).

Las temperaturas rectales fueron medidas diariamente comenzando 3 días antes de la exposición, y continuaron hasta 10 días post exposición. El día 0 es el día relativo a la exposición. Los datos de los días 0 hasta 10 fueron incluidos en el análisis. Los métodos y criterios fueron idénticos a esos usados en el Ejemplo 8. En los días 2, 5 y 7, los caballos vacunados tuvieron temperaturas corporales más bajas estadísticamente significantes que los caballos de control no vacunados (Tabla 20).

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 20 Efecto de la exposición en las temperaturas diarias (ºC) en caballos vacunados y de control (medias cuadráticas mínimas)

20

Los datos de los días de los días 1 hasta 10 post vacunación fueron incluidos en el análisis. Estos puntajes fueron sumados en cada día para cada caballo, y los vacunados y los de control fueron comparados usando la prueba de sumas de rango de Wlicoxon. Todos los métodos estadísticos fueron realizados como se describió en el Ejemplo 9. Además, estos puntajes fueron sumados a través de todos los días para cada caballo, y comparados de la misma manera. Los rangos medios son mostrados en la Tabla 21.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 21 Efecto de la exposición sobre los signos clínicos en caballos vacunados y de control (rango medio)

21

En el día 4 post exposición, el rango medio de los puntajes en los caballos vacunados fue más bajo (P<0,05) que en los caballos de control no vacunados, y este efecto continuó a través del resto del estudio (P<0,05). El rango acumulativo sobre el período de prueba completo fue también más bajo en los caballos vacunados que en los de control no vacunados (P<0,05).

Las torundas nasofaríngeas fueron recolectadas en los días 1 y 8 post exposición, como se describió en el Ejemplo 3. Las muestras nasales fueron analizadas para la presencia de virus por inoculación celular con detección de virus por efecto citopatogénico (CPE) o por inoculación de huevo con detacción de virus por hemaglutinación (HA). Los ensayos de célula de cultivo fueron realizados como generalmente está descrito por Youngner et al., 1994, J. Clin. Microbiol. 32, 750-754. Las muestras nasales diluidas en serie fueron añadidas a pozos que contienen monoestratos de células Madin Darby Canine Kidney (MDCK). Después de la incubación, los pozos fueron examinados para la presencia y el grado del efecto citopatogénico. La cantidad de virus en unidades TCID_{50} fue calculada por la técnica de Reed-Muench. El ensayo de infectividad del huevo fue realizado como se describió en el Ejemplo 1. El prociento de caballos que derraman virus de exposición para cada ensayo en cada grupo es mostrado en las Tablas 22 y 23. El porciento de caballos que derraman virus de exposición en el grupo vacunado fue más bajo (P<0,05) en los días 2 hasta 7 post vacunación por otro método. Ningunas diferencias fueron vistas en los días 1 u 8 post exposición. El número de días que el virus de exposición fue derramado fue también más bajo (P<0,05) en el grupo vacunado comparado al de control no vacunado; ver Tablas 22 y 23.

TABLA 22 Porciento de caballos que derraman virus a continuación del ensayo de exposición en cultivo de células

22

TABLA 23 Porciento de caballos con derramamiento de virus a continuación del ensayo de infectividad de la exposición en huevos

23

La extensión (severidad y duración) de los signos clínicos de influenza entre los vacunados fue sustancialmente reducida en relación a los de control. Los puntajes de los signos clínicos pertinentes a la influenza y las mediciones de temperatura objetiva ambos demostraron una reducción significante estadísticamente en el grupo vacunado cuando se compararon a esos del grupo de control; lo que indica que la vacuna confiere protección significante de la enfermedad por la cepa heteróloga.

La habilidad de los caballos para derramar virus de influenza post exposición fue también significativamente reducida en los vacunados como opuestos a los de control en ambos la incidencia de caballos positivos para el derramamiento en ciertos días post exposición y el número medio de días de derramamiento por caballo. El derramamiento disminuído por los vacunados es importante en que debe servir para reducir el potencial para la exposición de animales susceptibles al virus de tipo silvestre en una epidemia de influenza.

Sobre todo, los resultados de este estudio muestran que la vacuna confiere protección contra una exposición heteróloga por un miembro del linaje Euroasiático de cepas de virus de influenza equina.

Ejemplo 10

Este Ejemplo revela un estudio animal para evaluar la habilidad de una composición terapéutica que comprende el virus de influeza equina adaptado en frío EIV-P821 para ayudar en la prevención de la enfermedad a continuación a la exposición a una cepa heteróloga del virus de influenza equina.

La cepa heteróloga probada fue A/equino/2/Kentucky/98 [H3N8] (obtenida de Tom Chambers, Universidad de Kentucky). Ocho ponis de edades de 5 a 7 meses fueron probados para la eficacia del estudio. Estos caballos fueron asignados a dos grupos, un grupo de 4 a ser vacunados y otro grupo de 4 para servir como no vacunados de control. Los ponis fueron vacunados como se describió en el Ejemplo 8, en el día 0.

Las observaciones clínicas fueron realizadas para los vacunados en el día de estudio 0 (antes de la vacunación y 4 horas post vacunación), así como en los días 1 a 8, 23, 30 a 50, y 57 post vacunación. Los de control fueron observados clínicamente en los días 29 a 50 y 57. Las observaciones fueron realizadas y punteadas como se describió en el Ejemplo 8.

El material de exposición, o sea, la cepa de influenza equina Kentucky/98, fue preparada pasando el virus aislado dos veces en huevos. La inoculación de cada caballo fue preparada por descongelación de 0,5 ml del virus, entonces diluyéndolo en 4,5 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato. La inoculación fue administrada por nebulización usando una máscara para cada caballo individual en el día 36 post vacunación.

Los puntajes de las observaciones clínicas fueron sumados en cada día para cada caballo, y los caballos fueron clasificados de acuerdo al puntaje total acumulativo de los días 1 a 9 post exposición. Estos resultados son mostrados en la Tabla 24.

TABLA 24 Observación de signos clínicos: puntajes totales, clasificados por puntaje

24

Los resultados de la Tabla 24 muestran que los puntajes para los vacunados fueron entre 0 y 2, los cuales fueron significativamente más bajos que el puntaje para los de control, los cuales fueron entre 21 y 26.

Las temperaturas rectales fueron medidas diariamente comenzando 6 días antes de la exposición, y continuando hasta 9 días post exposición. El día 0 es el día relativo a la exposición. Los datos de los días 0 hasta 9 fueron incluidos en el análisis. Los resultados son mostrados en la Tabla 25.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 25 Efecto de la exposición sobre las temperaturas medias (ºC) en caballos vacunados y de control

25

Las temperaturas de los caballos de control fueron más altas que las temperaturas de los caballos vacunados en todos los días. La temperatura en los caballos de control fue significativamente más alta en el día 2.

Las torundas nasofaríngeas fueron recolectadas en los días 1 y 8, post exposición, como se describió en el Ejemplo 3. Estas muestras fueron probadas para derramamiento de virus por un ensayo de infectividad de huevo como se describió en el Ejemplo 1. Los resultados del ensayo son mostrados en la Tabla 26.

TABLA 26 Derramamiento de virus post exposición detectado por infectación de huevos

26

Los resultados de la Tabla 26 muestran que el número de caballos positivos por día fue más alto para los de control que para los vacunados. Adicionalmente, los caballos de control fueron positivos para más días que los vacunados.

Los puntajes de los signos clínicos relevantes a la influenza y las mediciones de temperatura objetiva ambos demostraron diferencias significantes en el grupo de vacunados cuando se comparó al grupo de control, esto muestra que la vacuna confiere protección significante para la enfermedad causada por la cepa heteróloga Kentucky/98.

La habilidad de los caballos para derramar virus de influenza post exposición fue también significantemente reducida en los vacunados contra los de control en el número medio de días de derramamiento por caballo. El derramamiento disminuido por los vacunados es importante en que debe servir para disminuir el potencial a la exposición de los animales susceptibles al virus de tipo silvestre en una epidemia de influenza.

Sobre todo, los resultados de este estudio muestran que la vacuna seguramente confirió protección a la exposición heterlóloga para un aislamiento reciente y clínicamente relevante. Cuando los resultados de este estudio son vistos a la luz de la protección previamente demostrada contra la exposición con la cepa Euroasiática (Ejemplo 9), hay clara evidencia para apoyar la aserción de que esta vacuna viva modificada puede conferir protección contra la heteróloga así como a la infección de influenza equina homóloga.

Ejemplo 11

Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de moléculas de ácido nucleico proteínico de la influenza equina M (matriz) por los virus de influenza equina adaptados en frío y de tipo silvestre.

A. Las moléculas de ácido nucleico que codifican la proteína del virus de influenza equina adaptado en frío de tipo silvestre M, fueron producidos como sigue. Un producto PCR que contiene un gen M equino fue producido por amplificación PCR del ADN del virus de influenza equina, y los cebadores w584 y w585, designados SEQ ID Nº: 26, y SEQ ID Nº: 27, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico de 1023 nucleótidos, denominada nei_{wt}M_{1023}, con una cadena codificante que tiene una secuencia de ácido nucleico designada SEQ ID Nº: 1 fue producida por amplificación ulterior usando el producto PCR arriba descrito como una plantilla y clonada en un vector para clonar pCR 2.1®TA, disponible de Invitrogen, Carlsbad, CA, usando los procediemientos convencionales recomendados por el fabricante. Los cebadores usados fueron el cebador T7, designado por la SEQ ID Nº: 29 y el cebador REV, designado por la SEQ ID Nº: 28. El plásmido de AND fue purificado usando un método de mini preparación disponible de Qiagen, Valencia, CA. Los productos PCR fueron preparados por secuenciación usando un equipo PRISM^{TM} Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, un equipo PRISM^{TM} dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, o un equipo PRISM^{TM} BigDye^{TM} Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction, todos disponibles de PE Applied Biosystems, Foster City, CA, siguiendo el protocolo del fabricante. Las condiciones específicas PCR usadas con el equipo fueron una rampa rápida a 95ºC, mantenida por 10 segundos seguida por una rampa rápida a 50ºC con 5 segundos mantenidos entonces una rampa rápida a 60ºC con 4 minutos mantenidos, repitiendo por 25 ciclos. Diferentes conjuntos de cebadores fueron usados en diferentes reacciones: Los T7 y REV fueron usados en una reacción; los w584 y w585 fueron usados en una segunda reacción; y efM-a1, designado SEQ ID Nº: 31 y efM-s1, designado SEQ ID Nº: 30 fueron usados en una tercera reacción. Los productos PCR fueron purificados por precipitación de cloruro de etanol/magnesio. La secuenciación automatizada de las muestras de AND fue realizada usando un ABI PRISM^{TM} Modelo 377 con un Secuenciador de ADN con actualización XL, disponible de PE Applied Biosystems.

La traducción de la SEQ ID Nº: 1 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{wt}M_{1023} codifica una proteína M de influenza equina de longitud total de alrededor de 252 aminoácidos, referidos aquí como Pei_{wt}M_{252}, que tiene una secuencia de amino ácido SEQ ID Nº: 2, asumiendo un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 25 hasta el nucleótido 28 de la SEQ ID Nº: 1 y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 781 hasta el nucleótido 783 de la SEQ ID Nº: 1. La región codificante Pei_{wt}M_{252}, designada nei_{wt}M_{756}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 25 a 780 de la SEQ ID Nº:1, es representada por la SEQ ID Nº:3.

La SEQ ID Nº: 1 y la SEQ ID Nº: 3 representan la secuencia de consenso obtenida de dos moléculas de ácido nucleico de tipo silvestre, las cuales difieren en un nucleótido. El nucleótido 663 de nei_{wt1}M_{1023}, o sea, el nucleótido 649 de nei_{wt}M_{756}, fue adenina, mientras el nucleótido 663 de nei_{wt2}M_{1023}, o sea, el nucleótido 649 de nei_{wt2}M_{756}, fue guanina. La traducción de estas secuencias no resulta en un cambio de aminoácido al aminoácido correspondiente; ambas traducen a valina al residuo 221 en Pei_{wt}M_{252}.

B. Una molécula de ácido nucleico de 1023 nucleótidos que codifica un virus de influenza equina adaptado en frío M, denominado nei_{ca1}M_{1023}, con una cadena codificante que tiene una secuencia designada SEQ ID Nº: 4 fue producido por amplificaciones PCR ulteriores y clonado en el vector de clonación romo pCR® disponible de Invitrogen, usando las condiciones recomendadas por el fabricante, y los cebadores T7 y REV. La purificación de ADN plásmido y el ciclo de secuenciación fue descrito en el Ejemplo 11, parte A. La traducción de la SEQ ID Nº: 4 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{ca1}M_{1023} codifica una longitud total de proteína M de influenza equina de alrededor de 252 aminoácidos, referida aquí como Pei_{ca1}M_{252}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 5, asumiendo un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 25 hasta el nucleótido 28 de la SEQ ID Nº: 4 y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 781 hasta el nucleótido 783 de la SEQ ID Nº: 4. La región codificante Pei_{ca1}M_{252}, designada nei_{ca1}M_{756}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 25 a 780 de la SEQ ID Nº: 4, es representada por la SEQ ID Nº: 6. La amplificación PCR de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína M de influenza equina adaptada en frío en la misma manera resultó en moléculas nei_{ca2}M_{1023}, idénticas a nei_{ca1}M_{1023}, y nei_{ca2}M_{756}, idénticas a nei_{ca1}M_{756}.

C. La comparación de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas codificantes de nei_{wt}M_{1023} (SEQ ID Nº: 1) y nei_{ca1}M_{1023} (SEQ ID Nº: 4) por alineación de ADN revela las siguientes diferencias: un cambio de G a T en la base 67, un cambio de C a T en la base 527, y un cambio de G a C en la base 886. La comparción de las secuencias de aminoácidos de las proteínas Pei_{wt}M_{252} (SEQ ID Nº: 2) y Pei_{ca1}M_{252} (SEQ ID Nº: 5) revela las siguientes diferencias: un cambio de V a L en el aminoácido 23 que relaciona al cambio de G a T en la base 67 en las secuencias de ADN; y un cambio de T a I en el aminoácido 187 que relaciona al cambio C a T en la base 527 en las secuencias de ADN.

Ejemplo 12

Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de moléculas de ácido nucleico proteínico de influenza HA (hemaglutinina) por virus de tipo silvestre de influenza equina o adaptados en frío.

A. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas HA de virus de influenza equina de tipo silvestre o adaptados en frío fueron producidas como sigue. Un producto PCR que contiene un gen HA equino fue producido por amplificación PCR de ADN de virus de influenza equina y cebadores w578 y w579, designados SEQ ID Nº: 32 y SEQ ID Nº: 33, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico de 1762 nucleótidos que codifica una proteína HA de tipo silvestre, denominada nei_{wt}HA_{1762}, con una cadena codificante que tiene una secuencia de ácido nucleico designada SEQ ID Nº: 7 fue producida por amplificació PCR ulterior usando el producto PCR descrito arriba como una plantilla y clonada en un vector de clonación pCR 2.1®TA como se describió en el Ejemplo 11A. El ADN plásmido fue purificado y secuenciado como en el Ejemplo 11A, excepto que los cebadores usados en los equipos de secuenciación fueron T7 o REV en un caso, o HA-1, designados SEQ ID Nº: 34, y HA-2, designado SEQ ID Nº: 35, en un segundo caso.

La traducción de la SEQ ID Nº: 7 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{wt}HA_{1762} codifica una proteína HA de influenza equina de longitud total de alrededor de 565 aminoácidos, referida aquí como Pei_{wt}HA_{565}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 8, asumiendo un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 30 hasta el nucleótido 33 de la SEQ ID Nº: 7 y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 1725 hasta el nucleótido 1727 de la SEQ ID Nº: 7. La región codificante Pei_{wt}HA_{565}, designada nei_{wt}HA_{1695}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 30 a 1724 de la SEQ ID Nº: 9 es representada por la SEQ ID Nº: 9.

B. Una molécula de ácido nucleico de 1762 nucleótidos que codifica la proteína HA de un virus de influenza equina adaptado en frío, denominado nei_{ca1}HA_{1762}, con una cadena codificante que tiene una secuencia designada SEQ ID Nº: 10 fue producida como se describió en el Ejemplo 11B. La purificación del ADN plásmido y el ciclo de secuenciación fueron realizados como se describió en el Ejemplo 12, parte A. La traducción de la SEQ ID Nº: 10 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{ca1}HA_{1762} codifica una proteína HA de influenza equina de longitud total de alrededor de 565 aminoácidos, referida aquí como Pei_{ca1}HA_{565}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 11, asumiendo un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 30 hasta el nucleótido 33 de la SEQ ID Nº: 10 y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 1725 hasta el nucleótido 1727 de la SEQ ID Nº: 10. La región codificante Pei_{wt}HA_{565}, designada nei_{wt}HA_{1695}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 30 a 1724 de la SEQ ID Nº: 10 es representada por la SEQ ID Nº: 12. La amplificación de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína HA de influenza equina adaptada en frío en la misma manera resultó en moléculas nei_{ca2}HA_{1762}, idénticas a nei_{ca1}HA_{1762}, y nei_{ca2}HA_{1695}, idénticas a nei_{ca1}HA_{1695}.

C. La comparación de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas codificantes de nei_{wt}HA_{1762} (SEQ ID Nº: 7) y nei_{ca1}HA_{1762} (SEQ ID Nº: 10) por alineación de ADN revela las siguientes diferencias: un cambio de C a T en la base 55, un cambio de G a A en la base 499, un cambio de G a A en la base 671, un cambio de C a T en la base 738, un cambio de T a C en la base 805, un cambio de G a A en la base 1289, y un cambio de A a G en la base 1368. La comparación de las secuencias de aminoácidos de proteínas Pei_{wt}HA_{565} (SEQ ID Nº: 8) y Pei_{ca1}HA_{565} (SEQ ID Nº: 11) revela las siguientes diferencias:

un cambio de P a L en el aminoácido 18 que se relaciona al cambio de C a L en la base 55 en las secuencias de ADN; un cambio de G a E en el aminoácido 166 que se relaciona con el cambio de G a A en la base 499 en las secuencias de ADN; un cambio de R a W en el aminoácido 246 que se relaciona con el cambio de C a T en la base 738 en las secuencias de ADN; un cambio de M a T en el aminoácido 268 que se relaciona con el cambio de T a C en la base 805 en las secuencias de ADN; un cambio de K a E en el aminoácido 456 que se relaciona con el cambio de A a G en la base 1368 en las secuencias de ADN. No hay cambio en la serina (S) en el residuo 223 que se relaciona con el cambio de G a A en la base 671 en las secuencias de ADN.

Ejemplo 13

Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de moléculas de ácido nucleico (ARN-ARN polimerasa dirigida) de la proteína de influenza equina PB2 que corresponde a la porción terminal N de la proteína, por virus de tipo silvestre de influenza equina o adaptados en frío.

A. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas PB2-N de virus de influenza equina de tipo silvestre o adaptados en frío fueron producidas como sigue. Un producto PCR que contiene una porción terminal N del gen equino PB2 fue producido por amplificación PCR del ADN del virus de influenza equina, y los cebadores w570 y w571, designados SEQ ID Nº: 36 y SEQ ID Nº: 37, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico de 1241 nucleótidos que codifican una proteína PB2-N de tipo silvestre denominada nei_{wt}PB2-N_{1241}, con una cadena codificante que tiene una secuencia de ácido nucleico designada SEQ ID Nº: 13 fue producida por amplificación PCR ulterior usando el producto PCR descrito arriba como una plantilla y clonado como se describió en el Ejemplo 11B. El ADN plásmido fue purificado y secuenciado como en el Ejemplo 11B, excepto que solamente los cebadores T7 y REV fueron usados en los equipos de secuenciación.

La traducción de la SEQ ID Nº: 13 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{wt}PB2-N1_{241} codifica una porción terminal N de proteína PB2 de influenza de alrededor de 404 aminoácidos, referida aquí como P_{wt}PB2-N_{404}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 14, que asume un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 28 hasta el nucleótido 30 de la SEQ ID Nº: 13, y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 1237 hasta el nucleótido 1239. La región codificante P_{wt}PB2-N_{404}, designada nei_{wt}PB2-N_{1214}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 28 a 1239 de la SEQ ID Nº: 13 es representada por la SEQ ID Nº: 15.

B. Una molécula de ácido nucleico de 1239 nucleótidos que codifica una porción terminal N de la proteína PB2-N de un virus de influenza equina PB2 adaptado en frío denominado nei_{ca1}PB2-_N_{1241}, con una cadena codificante que tiene una secuencia designada SEQ ID Nº: 16 fue producido, y secuenciado como se describió en el Ejemplo 12, parte A.

La traducción de la SEQ ID Nº: 16 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{ca1}PB2-N_{1241} codifica una porción terminal N de la proteína PB-2 de influenza equina de alrededor de 404 aminoácidos, referida aquí como P_{ca1}PB2-N_{404}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 17, asumiendo un marco de lectura abierto en el cual el codón de iniciación se extiende desde el nucleótido 28 hasta el nucleótido 30 de la SEQ ID Nº: 16, y el codón de terminación se extiende desde el nucleótido 1237 hasta el nucleótido 1239.

La región codificante P_{ca1}PB2-N_{404}, designada nei_{ca1}PB2-N_{1214}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 28 a 1239 de la SEQ ID Nº: 16, es representada por la SEQ ID Nº: 18.

La amplificación PCR de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PB2-N de influenza equina adaptada en frío en la misma manera resultó en moléculas nei_{ca2}PB2-_N_{1241}, idénticas a nei_{ca1}PB2-_N_{1241}, y nei_{ca2}PB2-_N_{1214}, idénticas a nei_{ca1}PB2-_{1414}.

C. La comparación de las secuencias de ácido nucleico de las cadenas codificantes de nei_{wt}PB2-N_{1241} (SEQ ID Nº: 13) y nei_{ca1}PB2-N_{1241} (SEQ ID Nº: 16) por alineación de ADN revela la siguiente diferencia: un cambio de T a C en la base 370. La comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas P_{wt}PB2-_N_{404} (SEQ ID Nº: 14) y P_{ca1}PB2-N_{404} (SEQ ID Nº: 17) revela la siguiente diferencia: un cambio de Y a H en el aminoácido 124 que se relaciona al cambio de T a C en la base 370 en la secuencia de ADN.

Ejemplo 14

Este ejemplo describe la clonación y secuenciación de moléculas de ácido nucleico (ARN-ARN polimerasa dirigida) de la proteína de influenza equina PB2 que corresponde a la porción terminal C de la proteína, por virus de tipo silvestre de influenza equina o adaptados en frío.

A. Las moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas PB2-C de virus de influenza equina de tipo silvestre o adaptado en frío fueron producidas como sigue. Un producto PCR que contiene la porción terminal C de un gen PB2 equino fue producido por amplificación PCR usando ADN del virus de influenza equina y cebadores w572 y w573, designados SEQ ID Nº: 38 y SEQ ID Nº: 39, respectivamente. Una molécula de ácido nucleico de 1233 nucleótidos que codifica una proteína PB2-C de tipo silvestre, denominada nei_{wt}PB2-C_{1233}, con una cadena codificante que tiene una secuencia de ácido nucleico designada SEQ ID Nº: 19 fue producida por amplificación PCR ulterior usando el producto PCR descrito arriba como una plantilla y clonado como se describió en el Ejemplo 11B. El ADN plásmido fue purificado y secuenciado como en el Ejemplo 11 A, excepto que cebadores diferentes fueron usados en los equipos de secuenciación. El T7 y REV fueron usados en una instancia; el efPB2-a1, designado SEQ ID Nº: 40 y el efPB2-s1, designado SEQ ID Nº: 41 fueron usados en otra instancia, y el efPB2-a2, designado SEQ ID Nº: 42 y el efPB2-s2, designado SEQ ID Nº: 43 fueron usados en otra instancia.

La traducción de la SEQ ID Nº: 19 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{wt1}PB2-C_{1233} codifica la porción terminal C de la proteína PB2 de influenza de alrededor de 398 aminoácidos, referida aquí como P_{wt}PB2-C_{398}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº: 20, asumiendo un marco de lectura abierto que tiene un primer codón que se extiende desde el nucleótido 3 hasta el nucleótido 5 y un codón de terminación el cual se extiende desde el nucleótido 1197 hasta el nucleótido 1199 de la SEQ ID Nº: 19. Puesto que la SEQ ID Nº: 19 es solamente una secuencia de gen parcial, no contiene un codón de iniciación. La región codificante P_{wt}PB2-C_{398}, designada nei_{wt}PB2-C_{1194}, y que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 3 a 1196 de la SEQ ID Nº: 19 es representada por SEQ ID Nº: 21.

La amplificación PCR de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PB2-N de influenza equina de tipo silvestre en la misma manera resultó en una molécula de 1232 nucleótidos denominados nei_{wt2}PB2-N_{1232}, con una cadena codificante con una secuencia designada SEQ ID Nº: 22. La nei_{wt2}PB2-N_{1232} es idéntica a nei_{wt1}PB2-C_{1233}, excepto que nei_{wt2}PB2-N_{1232} carece de un nucleótido en el terminal 5'. La traducción de la SEQ ID Nº: 22 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{wt1}PB2-C_{1233} también codifica la P_{wt}PB2-C_{398} (SEQ ID Nº: 20), asumiendo una marco de lectura abierto que tiene un primer codón el cual se extiende desde el nucleótido 2 hasta el nucleótido 4 y un codón de terminación que se extiende desde el nucleótido 1196 hasta el nucleótido 1198 de la SEQ ID Nº: 22. Puesto que la SEQ ID Nº: 22 es solamente una secuencia de gen parcial, no contiene un codón de iniciación. La molécula de ácido nucleico que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 2 a 1195 de la SEQ ID Nº: 22, denominada nei_{wt2}PB2-C_{1194}, es idéntica a la SEQ ID Nº: 21.

B. Una molécula de ácido nucleico de 1232 nucleótidos que codifica una porción terminal C de proteína PB2 de virus de influenza equina adaptado en frío denominado nei_{ca1}PB2-C_{1232}, y que tiene una cadena codificante que tiene una secuencia designada SEQ ID Nº: 23 fue producida como se describió en el Ejemplo 14, parte A, excepto que el vector de clonación pCR®-romo fue usado.

La traducción de la SEQ ID Nº:23 indica que la molécula de ácido nucleico nei_{ca1}PB2-C_{1232} codifica una porción terminal C de la proteína PB-2 de influenza equina de alrededor de 398 aminiácidos, referida aquí como P_{ca1}PB2-C_{398}, que tiene una secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº:24, asumiendo un marco de lectura abierto que tiene un primer codón el cual se extiende desde el nucleótido 2 hasta el nucleótido 4 y un codón de terminación que se extiende desde el nucleótido 1196 hasta el nucleótido 1198 de la SEQ ID Nº: 23. Puesto que la SEQ ID Nº: 23 es solamente una secuencia de gen parcial, no contiene un codón de iniciación. La región que codifica P_{ca1}PB2-C_{398}, designado nei_{ca1}PB2-C_{1194}, que tiene una cadena codificante que comprende los nucleótidos 2 a 1195 de la SEQ ID Nº: 23, es representada por la SEQ ID Nº: 25.

La amplificación PCR de una segunda molécula de ácido nucleico que codifica una proteína PB2-C de influenza equina adaptada en frío en la misma manera resultó en moléculas nei_{ca2}PB2-C_{1231}, que contienen un nucleótido menos en el terminal 3' que la nei_{ca1}PB2-N_{1241}; y la nei_{ca2}PB2-N_{1214}, idéntica a la nei_{ca1}PB2-N_{1214}.

C. La comparación de las secuencias de ácido nucleico de la cadenas codificantes de nei_{wt1}PB2-_C_{1233} (SEQ ID Nº: 19) y nei_{ca1}PB2-C_{1232} (SEQ ID Nº: 23) por alineación de ADN revela las siguientes diferencias: un cambio de la base A a C en la base 153 de la SEQ ID Nº: 19, y un cambio de la base G a A en la base 929 de la SEQ ID Nº:19. La comparación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas P_{wt}PB2-C_{398} (SEQ ID Nº: 20) y P_{ca1}PB2-_{398} (SEQ ID Nº: 24) revela la siguiente diferencia: un cambio de K a Q en el aminoácido 51 cuando se relaciona al cambio de base A a C en la base 153 en las secuencias de ADN. No hay cambio de aminoácido resultante del cambio de base de G a A en la base 929.

Mientras varias realizaciones de la presente invención han sido descritas en detalle, es aparente que las modificaciones y adaptaciones de esas realizaciones ocurrirán para aquellos expertos en la técnica. Es para ser expresamente entendido, sin embargo, que tales modificaciones y adaptaciones están dentro del alcance de la presente invención, como se establece en adelante en las siguientes reivindicaciones.

<110> LA UNIVERSIDAD DE PITTSBURGH, DEL COMMONWEALTH

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> DE INFLUENZA EQUINA ADAPTADO EN FRÍO V

\vskip0.400000\baselineskip

<130> HKZ-033CPPC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> no asignado aún

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-08-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/133,921

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-08-13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1023

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(780)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

29

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 756

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

31

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1023

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(780)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

35

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 756

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(1724)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

38

39

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

41

42

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1695

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(1724)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1695

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

53

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(1239)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

55

56

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1214

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(1239)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

62

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1196)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

69

70

71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

72

73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(1195)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de Influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de Influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaaaagca ggtagatatt gaa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaaca aggtagtttt ttac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgcacta gccagctg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcctgtac catctgcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: :Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcaaaagca ggggatattt ctg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaaca agggtgtttt taa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatccctg actatg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatctgtta agtcaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaaaagca ggtcaaatat attca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaacacca tggctacaat tattgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattcaca atggtcggaa gaagagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaaca aggtcgtttt taaacaa

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<110> The University of Pittsburg, of the Commonwealth

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> DE INFLUENZA EQUINA ADAPTADO EN FRÍO V

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> HKZ-033CPPC

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<140> no asignado aún

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 1999-08-12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> 09/133,921

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 1998-08-13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.0

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1023

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(780)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

85

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 756

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1023

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

<2211> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(780)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<200> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 756

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cds

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(1724)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

92

93

94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

95

96

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1695

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1762

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)..(1724)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

100

101

102

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 565

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

104

105

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1695

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

107

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> cds

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28).. (1239)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

109

110

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus DE la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

114

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la Influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(1239)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

115

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

117

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(1196)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

120

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

122

123

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

125

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

126

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1232

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)..(1195)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

128

129

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

131

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1194

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la influenza equina H3N8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

133

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial:Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

Agcaaaagca ggtagatatt gaa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaacagtagtttt agggtagtttt ttac

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgacc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia Artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taatacgact cactataggg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggtgcacta gccagctg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgcctgtac catctgcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaaaagca ggggatattt ctg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaaca agggtgtttt taa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gacatccctg actatg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcatctgtta agtcaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcaaaagca ggtcaaatat attca

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaacacca tggctacaat tattgc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agaattcaca atggtcggaa gaagagc

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagaaaca aggtcgtttt taaacaa

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agccgtacct tcatctggg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcactgaga gagtggtgg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaagaggca attccccag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de Secuencia artificial: Plantilla sintética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagcttttcc gttccttg

\hfill

18

Claims (22)

1. Un virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en huevos enbrionados de gallina en un rango de temperatura desde 26ºC a 30ºC.

2. Un virus de influenza equina A recatalogado que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC, dicho virus recatalogado que comprende (a) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina donante generado por adaptación en frío, dicho virus de influenza equina que tiene un fenotipo de identificación seleccionado entre el grupo que consta de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación en el que dicho segmento de genoma de virus de influenza equina confiere al menos uno de dichos fenotipos de identificación a dicho virus recatalogado y (b) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina A que tiene hemaglutinina de identificación y fenotipos de neuraminidasa.

3. Una composición terapéutica para proteger un animal contra la enfermedad causada por un virus de influenza A, que comprende un virus seleccionado entre un grupo que consta de: (a) un virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC; y (b) un virus de influenza A recatalogado que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de alrededor de 26ºC hasta alrededor de 30ºC, dicho virus recatalogado que comprende (1) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación en frío, dicho virus de influenza equina que tiene un fenotipo de identificación seleccionado entre un grupo que consta de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación, en el que dicho segmento de genoma de virus de influenza equina confiere al menos uno de dichos fenotipos de identificación a dicho virus recatalogado y (2) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina A receptor que tiene hemaglutinina de identificación y fenotipos de neuraminidasa.

4. El uso de una composición terapéutica que comprende un virus seleccionado entre el grupo que consta de: (a) un virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC; y (b) un virus de influenza A recatalogado que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC, dicho virus recatalogado que comprende (1) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación en frío, dicho virus de influenza equina que tiene un fenotipo de identificación seleccionado entre un grupo que consta de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación, en el que dicho segmento de genoma de virus de influenza equina confiere al menos uno de dichos fenotipos de identificación a dicho virus recatalogado y (2) al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina A receptor que tiene hemaglutinina de identificación y fenotipos de neuraminidasa, en la fabricación de un medicamento para proteger un animal contra la enfermedad causada por un virus de influenza A.

5. Un método para producir virus de influenza equina adaptado en frío que se replica en en huevos embrionados de gallina a una temperatura en el rango de alrededor de 26ºC hasta 30ºC que comprende los pasos de:

(a)

el pasaje de un virus de influenza equina de tipo silvestre; y

(b)

la selección de los virus que crecen a una temperatura reducida.

6. Un método para producir un virus de influenza equina A recatalogado que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC, dicho virus recatalogado que tiene al menos un segmento de genoma de un virus de influenza equina generado por adaptación en frío, dicho virus de influencia equina que tiene un fenotipo de identificación seleccionado entre un grupo que consta de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación, que comprende los pasos de:

a)

mezclar los segmentos de genoma de un virus de influenza equina donante con los segmentos de genoma de un virus de influenza equina A; y

b)

seleccionar un virus recatalogado que comprende (a) al menos un fenotipo de dicho virus de influenza equina donante, en el que el dicho fenotipo es seleccionado entre un grupo que consta de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación; y (b) los fenotipos de hamaglutinina y neuraminidasa de dicho virus de influenza equina A receptor.

7. Un método para propagar un virus de influenza equina que se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC que comprende un método seleccionado entre el grupo que consta de la propagación de dicho virus en huevos y la propagación de dicho virus en células de cultivo de tejido.

8. Una molécula de ácido nucleico de influenza equina aislada, en la que dicha molécula de ácido nucleico de influenza equina es seleccionada del grupo que consta de las SEQ ID Nº: 4, SEQ ID Nº: 6, SEQ ID Nº: 10, SEQ ID Nº: 12, SEQ ID Nº: 16, SEQ ID Nº: 18, SEQ ID Nº: 23, y SEQ ID Nº: 25, y una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico la cual es totalmente complementaria a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico.

\newpage

9. Una molécula de ácido nucleico de influenza equina aislada, en la que dicha molécula de ácido nucleico de influenza equina codifica una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de las SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 17, y SEQ ID Nº: 24.

10. Una proteína de influenza equina aislada, en la que dicha proteína de influenza equina comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de las SEQ ID Nº: 5, SEQ ID Nº: 11, SEQ ID Nº: 17, y SEQ ID Nº: 24.

11. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío referido a las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho virus de influenza A recatalogado referido a las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6, está atenuado.

12. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío A referido a las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho virus de influenza A recatalogado referido a las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6, es sensible a la temperatura.

13. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío A referido a las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho virus de influenza A recatalogado referido a las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6, se replica en huevos embrionados de gallina en un rango de temperatura de 26ºC a 30ºC, pero no forma placas en células de cultivo de tejido a una temperatura de 39ºC.

14. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que un fenotipo que comprende una temperatura no permisiva de 39ºC es conferido a dicho virus de influenza equina adaptado en frío referido a las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho virus de influenza equina recatalogado A referido en las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6, por al menos dos mutaciones en el genoma de dicho virus, que comprende una primera mutación y una segunda mutación.

15. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de la reivindicación 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío comprende un fenotipo de interferencia dominante.

16. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío referido en las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho segmento de genoma referido en las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6 es derivado de la cepa A/equino/Kentucky/1/91 (H3N8).

17. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío referido en las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho segmento de genoma referido en las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6 comprende el fenotipo de identificación de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación de un virus seleccionado entre el grupo que consta de: EIV-P821, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2625; EIV-P824, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2624; y MSV+5, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2627.

18. El virus de influenza equina adaptado en frío de la reivindicación 1, el virus de influenza recatalogado A de la reivindicación 2, la composición terapéutica de la reivindicación 3, el uso de la reivindicación 4, o el método de las reivindicaciones 5, 6 o 7, en las que dicho virus de influenza equina adaptado en frío referido en las reivindicaciones 1, 3, 4, 5, 7 o dicho segmento de genoma referido en las reivindicaciones 2, 3, 4, o 6 es seleccionado entre el grupo que consta de: EIV-P821, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2625; EIV-P824, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2624; MSV+5, identificado por Nº de acceso ATCC VR-2627; y la progenie la cual retiene los fenotipos de identificación de adaptación en frío, sensibilidad a la temperatura, interferencia dominante, y atenuación de cualquiera de dichos virus que tienen cualquiera de dichos números de accesión.

19. El método de acuerdo a la reivindicación 6, en la que dicho virus de influenza A receptor comprende los fenotipos de hemaglutinina y neuraminidasa diferentes a aquellos de dicho virus de influenza equina donante, y en el que dicho virus recatalogado comprende los fenotipos de hemaglutinina y neuraminidasa de dicho virus receptor.

20. La composición terapéutica de acuerdo a la reivindicación 3 o el uso de acuerdo a la reivindicación 4, en las que dicha composición terapéutica o medicamento es para la administración a dicho animal por una ruta que permitirá a los virus entrar en las células mucosas del tracto respiratorio superior.

21. La composición terapéutica de acuerdo a la reivindicación 3 o el uso de acuerdo a la reivindicación 4, en las que dicha composición terapéutica comprende un virus de influenza equina adaptado en frío, en el que dicha enfermedad es causada por el virus de influenza equina, y en el que dicha composición terapéutica es para administrar profilácticamente a un équido, para despertar una respuesta inmune contra el virus de influenza equina en dicho équido.

22. La molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 8, en la que dicha molécula de ácido nucleico codifica una proteína seleccionada de un grupo que consta de: una proteína M, dicha proteína M que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 5; una proteína HA, dicha proteína HA que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 11; una proteína PB2-N, dicha proteína PB2-N que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 17; y una proteína PB2-C, dicha proteína PB2-C que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID Nº: 24.