ES2287115T3 - Procedimiento para la deteccion de una inflamacion y de estados inflamatorios. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento in vitro para el diagnóstico de una respuesta inflamatoria mediante la detección de la presencia de CD163 soluble en una muestra biológica, comprendiendo dicho procedimiento: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo de captura de CD163 para formar un complejo CD163-anticuerpo; y b) poner en contacto el complejo CD163-anticuerpo con un anticuerpo de detección de CD163, de manera que se detectan los niveles de CD163 en la muestra.
Description
Procedimientos para la detección de una
inflamación y de estados inflamatorios.
Los fagocitos mononucleares (monocitos y
macrófagos) son componentes críticos de la inmunidad innata y la
inmunidad adquirida, y se encuentran prácticamente en todos los
tejidos del cuerpo, incluyendo el sistema nervioso central. Los
fagocitos mononucleares participan en la citotoxicidad dependiente
de anticuerpos e independiente de anticuerpos, en la fagocitosis y
destrucción de bacterias, en la destrucción de eritrocitos
debilitados, en la presentación de antígenos para la activación de
células T, y en la secreción de una amplia variedad de citoquinas
inflamato-
rias.
rias.
La secreción de citoquinas inflamatorias, así
como las funciones efectoras de los fagocitos mononucleares, están
muy influenciadas por mediadores solubles. Por ejemplo, el cebado
por interferón gamma (IFNy) y la exposición a lipopolisacáridos,
factor de necrosis tumoral alfa (TNF\alpha),
interleucina-1 (IL-1) o factor
estimulante de colonias de granulocitos y monocitos
(GM-CSF) pueden estimular los fagocitos
mononucleares para secretar citoquinas inflamatorias, tales como
TNF\alpha, IL-1 e interleucina-6
(IL-6) (Auger, M.J. y J.A. Ross. 1992. En: The
Macrophage: the natural Immune System, Nueva York: Oxford University
Press, pp. 1-74). Se ha puesto de manifiesto que la
interleucina-10 (IL-10;
originalmente conocida como factor inhibidor de la síntesis de
citoquinas) inhibe la expresión de un amplio espectro de citoquinas
inflamatorias in vitro (Berkman, N. et al. 1995. J.
Immunol. 155: 4412-4418; de Waal Malefyt, R. et
al, 1991. J. Exp. Med. 174: 1209-1220), así como
in vivo (Chernoff, A.E. et al, 1995. J. Immunol.
154:5492-5499; van der Poll, T. et al, 1997.
J. Immunol. 158:1971-1975). También se ha puesto de
manifiesto que los glucocorticoides, la
interleucina-4 (IL-4) y la
interleucina-13 (IL-13) regulan a
la baja la expresión de citoquinas inflamatorias producidas por los
fagocitos mononucleares. Además de inhibir la liberación de
citoquinas inflamatorias, los glucocorticoides han demostrado
asimismo regular al alza la expresión de CD163 en fagocitos
mononucleares (Hogger, P. et al, 1998. Pharm. Res.
15:296-302; Hogger, P. y otros, 1998. J. Immunol.
161:1883-1890; Wenzel, I. et al, 1996. Eur.
J. Immunol. 26:2758-2763).
El CD163 es un antígeno específico de los
fagocitos mononucleares, que es un miembro de la familia de
receptores depuradores ricos en cisteína del grupo B. Los macrófagos
humanos normales se marcan con brillo para el CD163 y el tratamiento
con glucocorticoides in vivo aumenta la expresión de CD163
(Zwadlo-Klarwasser, G. y otros, 1992. Int. Arch.
Allergy Immunol. 97:178-180;
Zwadlo-Klarwasser, G. y otros, 1990. Int. Arch.
Allergy Immunol. 91:175-180). Se ha sugerido que
estos macrófagos brillantes con CD163 pueden tener un papel en la
resolución de inflamaciones, ya que se encuentran en grandes
cantidades en tejidos inflamados (Zwadlo, G. y otros 1987. Exp.
Cell Biol. 55:295-304), y se ha puesto de manifiesto
que liberan un mediador antiinflamatorio caracterizado de forma
incompleta (Zwadlo-Klarwasser, G. y otros 1995. Int.
Arch. Allergy Immunol. 107:430-431).
Un marcador de fagocitos mononucleares que
presenta una similitud considerable con el CD163 es el p155
(Morganelli, P. y otros, 1988. J. Immunol.
140:2296-2304). La expresión de esta glicoproteína
134 kDa (reducida)/155 kDa (no reducida) se limita a fagocitos
mononucleares, y se regula al alza mediante el tratamiento con
glucocorticoides. Ahora, se ha descubierto que el CD163 es idéntico
al p155 y que esta molécula podría tener actividad como molécula
antiinflamatoria. En consecuencia, se cree que esta glicoproteína es
útil como biomarcador para inflamaciones y estados y procesos
inflamatorios en humanos.
En la actualidad, se ha desarrollado un
procedimiento para la detección de CD163 en plasma humano. Este
procedimiento es útil para el seguimiento de inflamaciones y
procesos inflamatorios en humanos.
Un objeto de la presente invención consiste en
dar a conocer un procedimiento para el diagnóstico de una respuesta
inflamatoria mediante la detección de CD163 en una muestra
biológica, preferentemente una muestra de plasma, que comprende
poner en contacto la muestra con un anticuerpo de captura de CD163 y
un anticuerpo de detección de CD163, de manera que pueden
cuantificarse los niveles de CD163 en la muestra. El procedimiento
según la presente invención es particularmente útil para el
seguimiento de la evolución de un estado inflamatorio o un proceso
inflamatorio.
El CD163 es un miembro de la familia rica en
cisteína receptor depurador de proteínas. Se conoce el hecho de que
el CD163 se expresa en cantidades elevadas en macrófagos humanos,
pero se ha indicado que se encuentra en menos del 50% de los
monocitos de sangre periférica. En la actualidad, se ha descubierto
que, al contrario que en estudios anteriores, más del 99% de todos
los monocitos CD14 positivos expresan el CD163. También se ha
descubierto que la IL-10, tal como los
glucocorticoides, induce una expresión más elevada de CD163 en
monocitos humanos cultivados. La expresión de CD163 inducida por
glucocorticoides también se ha estudiado, y se ha descubierto que
es debida a un mecanismo independiente de la IL-10,
dado que no se inhibe con anti-IL-10
y se mostró aditiva con el tratamiento de IL-10.
También se ha descubierto que el p155, un marcador de
monocitos/macrófagos identificado anteriormente con una función
desconocida, es el mismo que el CD163. El hecho de que el CD163 se
regule al alza mediante mediadores antiinflamatorios potentes,
tales como los glucocorticoides y la
IL-10, indica que el CD163 puede ser una importante
molécula antiinflamatoria y un biomarcador potencial para
inflamaciones y estados antiinflamatorios.
Estudios anteriores que utilizaban RM3/1,
Ber-Mac3 y otros indicaban que únicamente entre un 0
y un 40% de los monocitos circulatorios son positivos para CD163
(Hogger, P. y otros, 1998. Pharm. Res. 15:296-302;
Hogger y otros, 1998. J. Immunol. 161:1883-1890;
Zwadlo, G. y otros, 1987. Exp. Cell Biol.
55:295-304; Backe, E. y otros, 1991. J. Clin. Path.
44: 946-953; van den Heuvel, M. y otros, 1999. J.
Leuk. Biol. 66:858-866). Sin embargo, estudios
anteriores con otro anticuerpo para p155, una molécula que se ha
demostrado idéntica al CD163, MAC2-48, han
demostrado consistentemente que prácticamente todos los monocitos
recién aislados son positivos para CD163. Para prevenir la
posibilidad de que una detección subóptima de los anticuerpos RM3/1
y Ber-Mac3 de menor afinidad (utilizados
anteriormente únicamente con anticuerpos secundarios marcados con
FITC) pudiera ser responsable de esta discrepancia, se marcaron PBMC
recién aisladas con AML 2,23 (anti-CD14) conjugado
con FITC y RM3/1 biotinilado o Ber-Mac3 biotinilado,
seguido de detección con SAPE.
Aunque la marcación con MAC2-48
fue ligeramente mayor, prácticamente todas las PBMC brillantes con
CD14 fueron positivas tanto para RM3/1 como para
MAC2-48, mientras que la mayoría de PBMC negativas o
tenues con CD14 fueron negativas. Cuando se bloquearon las PMBC
para las células brillantes con CD14, más del 99% fueron positivas
tanto para RM3/1 como para Mac2-48, mientras que el
control P3 mAb detectó menos del 1% de las células bloqueadas. Se
obtuvieron resultados prácticamente idénticos cuando se utilizaron
monocitos altamente purificados en lugar de PBMC frescas. Estos
resultados indican que el CD163 se expresa prácticamente en todos
los monocitos circulatorios positivos a CD14.
Con el fin de determinar si diferentes
citoquinas pueden influir en la expresión de CD163, se cultivaron
PBMC recién aisladas durante 24 horas en presencia de diversas
citoquinas, DEX 200 nm (como control positivo para regulación al
alza de CD163), o medio de control. A continuación se sometieron las
células a marcación y a análisis por flujo citométrico.
El tratamiento de las PBMC durante 24 horas sólo
con IL-10 o sólo con el glucocorticoide sintético
DEX aumentó la expresión de CD163 de los monocitos en un factor de
aproximadamente 4 y 7, respectivamente (p < 0,01). El tratamiento
combinado con DEX e IL-10 produjo una expresión de
CD163 significativamente mayor que cuando se cultivaron monocitos
sólo con DEX o sólo con IL-10, lo que indica un
efecto aditivo cuando se utilizó el tratamiento con glucocorticoides
junto con IL-10 (p < 0,01). Ninguna de las otras
citoquinas examinadas tuvo un efecto estadísticamente significativo
en la expresión de CD163 de los monocitos a las concentraciones
utilizadas, y ninguna de ellas aumentó o disminuyó la regulación al
alza de la expresión inducida por DEX. La expresión aumentada de
CD163 por parte del tratamiento con IL-10 y
glucocorticoides también se puso asimismo de manifiesto mediante
técnicas de western blot de lisados de monocitos. Estos datos
indican que la regulación al alza del CD163 tiene un papel
importante en los efectos antiinflamatorios de los
glucocorticoides.
Con el fin de determinar si la expresión
aumentada de CD163 en monocitos es debida a la síntesis aumentada
de ARN y proteínas, se llevaron a cabo técnicas de northern blot en
lisados de monocitos. Se trataron los monocitos durante 8 horas con
IL-10, el glucocorticoide FP o medio de control. Los
niveles de mARN CD163 aumentaron desde un nivel indetectable hasta
bandas intensas con la adición de IL-10 ó FP. Esto
indica que la inducción de CD163 por la IL-10 o
glucocorticoides es debida, por lo menos en parte, a la síntesis
aumentada de ARN y proteínas.
Se determinó una relación
dosis-respuesta entre el tratamiento con
IL-10 y la expresión de CD163 cultivando PBMC
durante 24 horas en presencia de 0,1 a 100 ng/ml de
IL-10. El resultado fue una curva sigmoidal de
respuesta a la dosis cuando los niveles de expresión de CD163 se
relacionaban con la concentración de IL-10. La
expresión de CD163 aumentó aproximadamente 3,5 veces en el
tratamiento con 10 y 100 ng/ml de IL-10 en
comparación con el control (p < 0,01).
Era posible que, además de los efectos directos
sobre fagocitos mononucleares, el DEX regulara indirectamente al
alza la expresión de CD163 modificando la cantidad de
IL-10 producida por linfocitos. Con el fin de
comprobar esta posibilidad, se cultivaron PBMC con
IL-10, DEX o medio de control en presencia o
ausencia de una IgG anti-IL-10
bloqueante. Los resultados mostraron que la expresión de CD163 no
resultaba significativamente afectada por la presencia de
anti-IL-10 en las células de control
o tratadas con DEX. Sin embargo, la regulación de
IL-10 al alza de la expresión de CD163 se inhibía
mediante anti-IL-10 (p < 0,01),
reduciéndose la expresión de CD163 a niveles próximos a los de
control. Estos resultados indican que el DEX hacía aumentar la
expresión de CD163 a través de un mecanismo independiente de
IL-10.
Además de comprobar los efectos de citoquinas en
combinación con glucocorticoides sobre los niveles de CD163, se
llevaron a cabo estudios con el fin de examinar los efectos de
glucocorticoides en combinación con lipopolisacáridos (LPS). Los
monocitos cultivados únicamente con LPS tenían niveles bajos de
CD163 detectados en su superficie utilizando una técnica
inmunofluorescente para la detección de CD163. El tratamiento de
células únicamente con DEX o IL-10 hizo aumentar la
expresión de CD163, tal como se había mostrado anteriormente. Sin
embargo, cuando se cultivaron los monocitos durante 48 horas con
DEX combinado con LPS, se produjo un aumento sinérgico de la
expresión de CD163, aumentando el efecto del DEX solo en un factor
superior a dos cuando se añadió el tratamiento con LPS.
Estudios in vitro adicionales con LPS
mostraron que el LPS induce la eliminación del CD163 de la
superficie de los monocitos en un tiempo de 2 horas, un resultado
consistente con los estudios realizados por otros utilizando el
éster de forbol PMA. Se ha puesto de manifiesto que el PMA induce la
rápida eliminación del CD163 de la superficie de los monocitos en
cultivo, un efecto bloqueado por los inhibidores de la proteasa
(Droste, A. y otros, 1999. Biochem. Biophys. Res. Commun.
256:110-113). En consecuencia, como el PMA, el LPS
es capaz de inducir la eliminación de CD163. La eliminación
inducida por LPS tuvo lugar incluso con monocitos que habían sido
cultivados durante 48 horas en DEX y, en consecuencia, tenían
niveles entre 5 y 10 veces más elevados de CD163 superficial que
los monocitos recién aislados. En las células que presentaban
niveles mayores de CD163 debido al tratamiento con glucocorticoides
más LPS, tal como se ha descrito anteriormente, las moléculas de
CD163 superficiales son muy resistentes a la eliminación inducida
por el tratamiento posterior con LPS, aunque permanecieron
sensibles a la eliminación inducida por PMA. Esta resistencia
conferida por LPS a la eliminación posterior inducida por LPS del
CD163 es similar al preacondicionamiento con endotoxinas descrito
para la resistencia a los posteriores procesos
inflama-
torios.
torios.
Se puso de manifiesto que el efecto de la
citoquina IL-10 es único entre las citoquinas
examinadas por el hecho de que, tal como los glucocorticoides,
aumenta la expresión de CD163 en fagocitos mononucleares recién
aislados. Se cree que este aumento en CD163 es un efecto directo
sobre los monocitos, dado que estudios que utilizaban monocitos
altamente purificados o la línea celular establecida de monocitos
humanos THP-1 dieron resultados de acuerdo con los
obtenidos utilizando PBMC. Por el contrario, un número de otras
citoquinas (incluyendo IL-4 e IL-13)
no hicieron aumentar la expresión de CD163 para las concentraciones
ensayadas. Aunque se ha confirmado que la IL-4, la
IL-10 y la IL-13 inhiben la
producción por monocitos de citoquinas inflamatorias, tales como
TNF\alpha (Cosentino, G. y otros, 1995. J. Immunol.
155:3145-3151; Joyce, D.A. y otros, 1996. Cytokine
8:49-57; Joyce, D.A. y otros, 1996. J. Interferon
Cytokine Res. 16:511-517), la regulación diferencial
de las moléculas superficiales de fagocitos mononucleares por parte
de la IL-10 y la
IL-4/IL-13 no está exenta de
precedentes. Por ejemplo, el CD64, tal como el CD163, está regulado
al alza por parte de la IL-10, pero no de la
IL-4 o la IL-13 (de Waal Malefyt, R.
y otros, 1993. J. Immunol. 151:6370-6381; te Velde,
A.A. y otros, 1992. J. Immunol. 149:4048-4052).
Al utilizarse en combinación con DEX, la
IL-10 es la única citoquina ensayada que hizo
aumentar significativamente la expresión de CD163 por encima del
tratamiento sólo con DEX. Dado que la concentración de DEX utilizada
es > 90% de saturación para el receptor de glucocorticoide y la
dosis de IL-10 utilizada proporciona una inducción
de CD163 máxima, el efecto aditivo de estos tratamientos sugiere que
los glucocorticoides y la IL-10 afectan a la
expresión de CD163 por mecanismos distintos. Esta conclusión se
confirma adicionalmente mediante el descubrimiento de que un
anticuerpo anti-IL-10 (que bloquea
la actividad biológica de la IL-10) reduce la
inducción por IL-10 de CD163 a niveles de control,
pero no tiene ningún efecto sobre la inducción por DEX de CD163.
Este hecho demuestra que el efecto de los glucocorticoides no
depende de niveles elevados de IL-10 extracelular,
y no regula al alza la expresión de CD163 incrementando inicialmente
la síntesis y liberación de IL-10.
El hallazgo de que ni el GM-CSF
ni la IL-4 junto con DEX aumentan la expresión de
CD163 por encima del tratamiento sólo con DEX contrasta con el de
una publicación reciente. Mientras que Van den Heuvel y colegas (van
den Heuvel, M. et al., 1999. J. Leuk. Biol.
66:858-866) comprobaron que ni el
GM-CSF ni la IL-4 solos tenían
ningún efecto sobre la expresión de CD163, detectaron un efecto
sinérgico utilizando GM-CSF ó IL-4
junto con DEX. Probablemente, esta disparidad se debe a las
diferencias en el procedimiento experimental, tales como la técnica
de aislamiento, los estados de cultivo y la duración del estímulo.
En la publicación anterior, los monocitos se purificaban por
centrifugación por gradiente, rosetas de linfocitos y adherencia de
los monocitos, mientras que los presentes estudios utilizaron PBMC
purificadas por centrifugación por densidad. Además, las células se
trataron durante 24 horas, mientras que en el estudio anterior las
células se trataron durante 2 días.
La curva de respuesta a la dosis para el efecto
de la IL-10 sobre la expresión de CD163 demuestra un
intervalo dinámico de concentraciones de IL-10 entre
0,1 ng/ml y 10 ng/ml. Esto concuerda con los descubrimientos
anteriores, que hacen referencia al efecto de la
IL-10 sobre un amplio espectro de funciones de los
monocitos, tales como expresión de factor de tejido y actividad
procoagulante asociada (Ernofsson, M et al., 1996, Br. H.
Haematol. 95:249-257; Ones, L.T. et al. 1996.
Cytokine 8:822-827), así como
MIP-1\alpha (Berkman, N. y otros, 1995. J.
Immunol. 155:4412-4418), expresión de
metaloproteinasa (Lacraz, S. y otros, 1992. J. Clin. Invest.
90:382-388) y de receptor TNF (Hart, P.H. y otros,
1996. J. Immunol. 157:3672-3680).
El hecho de que el CD163 se regule al alza
mediante mediadores antiinflamatorios potentes, tales como los
glucocorticoides e IL-10, indica que este CD163
puede ser una molécula antiinflamatoria importante. Además, estos
datos apoyan la utilización de detección de CD163 en muestras
biológicas, tales como sangre o plasma, como medio para detectar la
presencia de inflamación o estados inflamatorios en pacientes.
Con el fin de proporcionar la utilización de
CD163 como biomarcador de inflamación, se desarrolló un
procedimiento para la detección de CD163 en muestras biológicas,
tales como plasma. El ensayo de detección es un ensayo ELISA que
utiliza un anticuerpo específico a CD163, tal como
MAC2-158 ó MAC2-48, como el
anticuerpo capturador de CD163, y el anticuerpo RM3/1 biotinilado
comercialmente disponible como anticuerpo de detección de CD163. En
resumen, se recubrieron unas placas con anticuerpo
MAC2-158 ó MAC2-48 purificado y se
incubaron durante una noche a 4ºC. Después del lavado, los enlaces
no específicos se bloquearon añadiendo tampón bloqueante a cada
pocillo de placa e incubando durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Después del lavado, se añadieron las muestras de plasma
que se deben analizar y las placas se incubaron durante una noche a
4ºC o a temperatura ambiente durante 2 horas. Después del lavado,
se añadió el anticuerpo de detección, RM3/1, y las placas se
incubaron nuevamente. Se utilizó un complejo
estreptavidina/fosfatasa alcalina y se revelaron las placas.
Utilizando este ensayo, se obtuvieron los
niveles relativos de CD163 en el plasma de 4 pacientes sometidos a
cirugía cardiaca llevada a cabo con un by-pass
cardiopulmonar normotérmico. Se conoce el hecho de que los
pacientes de cirugía cardiaca muestran una respuesta inflamatoria
aguda reproducible, tal como indica un aumento de TNF,
IL-6 y cortisol, seguido por la liberación hepática
de proteínas de fase aguda. Esta respuesta puede estar causada por
diversos mecanismos, incluyendo trauma de tejido, daño por
isquemia-reperfusión, exposición a membranas
extrañas (cuando se utiliza un by-pass
cardiopulmonar) y endotoxemia temporal. En 4 muestras de 4 de estos
pacientes analizados, el CD163 en plasma aumentó aproximadamente el
doble en los 60 minutos siguientes al by-pass
cardiopulmonar, y retornó a un nivel ligeramente inferior a la línea
de base en el día 1 del postoperatorio. Además, se puso de
manifiesto que los niveles de CD163 en plasma de estos pacientes se
correlacionaba con los niveles de interleuquina-6
(IL-6) en plasma. Este descubrimiento es importante
porque, antes del estrés quirúrgico, la infección u otros procesos
inflamatorios, no existe IL-6 detectable en el
plasma humano. En consecuencia, estos datos demuestran la unión de
la evolución de CD163 con otros marcadores de inflamación y
proporcionan la primera demostración de que el CD163 soluble actúa
como una proteína de fase aguda durante una respuesta
inflamatoria.
Con el fin de imitar más fielmente la respuesta
inflamatoria in vivo a una infección en un entorno más
controlado que los pacientes cardiacos descritos anteriormente, se
administraron a voluntarios sanos 4 ng/kg de infusión de bolus de
PS y se realizó un seguimiento de los niveles de CD163 soluble en
plasma. Tal como se ha descrito anteriormente, se había puesto de
manifiesto que el LPS induce la eliminación de CD163 de monocitos
in vitro. Se tomaron muestras de plasma en la línea de base
(antes de la administración de LPS) y, a continuación, en diversos
momentos después de la infusión de LPS, hasta 72 horas después del
inicio de la infusión. Se midieron los niveles de CD163 en plasma
utilizando el ensayo según la presente invención. Los niveles de
CD163 en plasma aumentaron hasta 7 veces en comparación con los
niveles de base, alcanzaron un máximo entre 1 y 2 horas después del
inicio de la infusión y permanecían elevados en 4 de 5 voluntarios
12 horas después de la administración de LPS. En el voluntario en
el que los niveles habían disminuido a las 12 horas, los niveles
permanecieron elevados hasta 4 horas antes de retornar a los
niveles de línea de base al cabo de 8 horas. También se controlaron
los cambios en los niveles de las proteínas de fase aguda conocidas,
glucocorticoides y citoquinas proinflamatorias y antiinflamatorias,
con el fin de determinar si sus niveles se correlacionaban con la
aparición de CD163 en plasma. Los niveles de CRP, una proteína
plasmática de fase aguda secretada en hepatocitos como respuesta a
un estímulo inflamatorio, aumentaron en plasma a partir de las 8
horas pero no alcanzaron un máximo hasta 24 horas después de la
administración de LPS. Los niveles plasmáticos de TNF\alpha,
IL-6 e IL-10, que es sabido se
producen tras la infusión de LPS, alcanzaron un máximo a 1, 2 y 4
horas después de la administración de LPS, respectivamente. Los
niveles de cortisol en plasma empezaron a aumentar a las 4 horas de
la administración de LPS, pero no alcanzaron un máximo hasta las 6
horas. Estos datos demuestran que el CD163 soluble es uno de los
cambios inducidos por una respuesta inflamatoria aguda que se
producen más temprano de los que se pueden detectar en plasma. En
consecuencia, el CD163 actúa como acontecimiento temprano indicador
en la cascada de respuesta inflamatoria.
Correspondientemente, la presente invención da a
conocer un procedimiento para diagnosticar una respuesta
inflamatoria mediante la detección de niveles de CD163 en muestras
biológicas de individuos de los que se conoce o se sospecha que
tienen inflamación o estados inflamatorios. Se pretende incluir como
muestras biológicas, aunque sin limitarse a las mismas, plasma,
sangre entera, suero, orina, esputo, semen, fluido cerebroespinal o
fluido sinovial. El estado inflamatorio puede ser debido a una
variedad de causas, incluyendo, sin limitarse a las mismas, lupus,
artritis reumatoide, infección y cirugía. El procedimiento incluye
el contacto de una muestra biológica, tal como plasma, con un
anticuerpo específico a CD163, tal como MAC2-158 ó
MAC2-48, y a continuación la detección en el ensayo
ELISA con un anticuerpo biotinilado, tal como RM3/1. Este
procedimiento es particularmente útil en el seguimiento de la
presencia o la evolución de la inflamación o los estados
inflamatorios en un paciente.
A continuación se describe con mayor detalle la
presente invención a partir de los siguientes ejemplos no
limitativos.
Se aislaron PBMC a partir de sangre venosa
entera humana heparinizada utilizando Ficoll-Hypaque
(d = 1.077 g) según el método de Böyum (Boyum, A. 1968. Scand. J.
Clin. Lab. Invest. Suppl. 97:77-89). A continuación
se lavaron las PMBC tres veces con RPMI 1640 tamponado con HEPES
(Hazelton Biologicals, Lenexa, KS)/0,05% de gentamicina
(Elkins-Sinn, Inc., Cherry Hill, NJ)/1% de suero
bovino fetal (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT).
Para los estudios de tratamiento con citoquinas,
se suspendieron las PBMC en RPMI 1640 tamponado con HEPES/0,05% de
gentamicina/10% FBS a una concentración de 2,0 x 10^{6} to 2,5 x
10^{6} células/ml y se cultivaron en placas de 96 pocillos a 37ºC
y 5% CO_{2} en presencia de diversos mediadores (tabla 1). Se
tiñeron las células mononucleares para análisis de flujo
citométrico tras 24 horas en cultivo, a menos que se indique lo
contrario. Esto favoreció la recuperación celular, dado que los
monocitos, que se adhieren inicialmente a los recipientes de
plástico, se separan temporalmente de los pocillos de cultivo a las
24-48 horas.
Todos los procedimientos de tinción se llevaron
a cabo a 4ºC. En resumen, las PMBC cultivadas se incubaron con IgG
humana normal (6 mg/ml) con el fin de bloquear el enlace de mAbs
específico a receptor de Fc y 30 \mug/ml del control de isótopo
mAb P3 o una cantidad saturadora de mAb MAC2-48 (20
\mug/ml) durante una hora. A continuación se lavaron las células y
se tiñeron durante una hora con 17,5 \mug/ml de Ig de cabra
antirratón F(ab=)_{2}. Las células se lavaron nuevamente y
se fijaron con formalina 1% libre de metanol.
Para dos estudios de color, las células se
tiñeron durante una hora con 20 \mug/ml de MAC2-48
biotinilado, RM3/1, ó P3 más 20 \mug/ml de FITC AML 2,23 ó FITC
mAb de ratón de control en presencia de por lo menos 2 mg/ml de IgG
humana normal en un volumen total de 60 ml. Después de la tinción
con mAbs primaria, las células se lavaron y tiñeron con SAPE a una
dilución de 1:40. Se llevó a cabo análisis de flujo citométrico
sobre las células lavadas y no fijadas poco después del la
tinción.
La fluorescencia celular de los monocitos
capturados utilizando dispersión frontal y dispersión lateral se
analizó utilizando un Becton Dickenson FACScan (Franklin Lakes, New
Jersey). La intensidad promedio de fluorescencia (MFI) se calculó
sustrayendo la MFI de las células mononucleares marcadas con P3 a la
MFI de las células marcadas con MAC2-48
correspondientes.
Se aislaron y cultivaron monocitos humanos
durante una noche tal como se describe para técnicas de western
blot. A continuación se estimularon los monocitos durante 8 horas
con 5 ng/ml de IL-10 (R&D Systems) ó FP
10^{-8} M. Se aisló el ARN total de monocitos estimulados con
IL-10, monocitos estimulados con glucocorticoide y
monocitos de control, tal como se describe en Dreier, y otros,
(Dreier, J. y otros, 1998. DNA Cell Biol.
17:321-323). 10 \mug de ARN total por muestra se
separaron por electroforesis en un gel al 1% de agarosa y 2% de
formaldehído y se transfirieron a una membrana Hybond N+ de nilón
(Amersham Inc., Arlington Heights, IL) en citrato sódico salino 20x
(SSC) utilizando un aparato de transferencia LKB 2016 VacuGene. Se
generaron sondas de ARN antisentido para la hibridación Northern a
partir de patrones de ADN utilizando un kit de marcación de ARN de
digoxigenina (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) y ARN T7
polimerasa (New England Biolabs, Schwalbach, Alemania), tal como
describe el fabricante. Se llevó a cabo una prehibridación a 68ºC
durante 1 hora en un tampón de hibridación SDS (7% SDS, 5x SSC, 50%
formamida, fosfato sódico 50 mM, 2% caseína, 0,1%
N-lauroilsarcosina, pH 7,0). Posteriormente, las
sondas desnaturalizadas por calor (10 minutos a 95ºC) se añadieron a
la solución de prehibridación (100 ng/ml) y se hibridaron a 68ºC
durante 16 horas. La membrana de nilón se lavó dos veces durante 5
minutos a temperatura ambiente en una solución de 2x SSC, 0,1% SDS,
y dos veces durante 15 minutos a 68ºC en 0,5x SSC y 0,1% SDS. Los
resultados de hibridación se visualizaron por detección
quimioluminiscente con fragmentos Fab= antidigoxigenina conjugados
con fosfatasa alcalina y substrato CSPD, tal como describe el
fabricante (Boehringer Mannheim). La carga igualitaria de las
muestras se examinó por hibridación de ARN con una sonda de ARN
antisentido de actina.
Se recubrieron placas para ELISA, a razón de 100
\mug por pocillo, con 5 \mug/ml de MAC2-158
purificado (tampón de recubrimiento de NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,5
M, ajustado a pH 8,4 con HCl). Las placas se incubaron durante una
noche a 4ºC y a continuación se lavaron 4 veces con tampón de lavado
(1X solución salina tamponada con fosfato y 0,05% Tween 20). Los
enlaces no específicos se bloquearon añadiendo 200 \mul de tampón
de bloqueo a cada pocillo (solución salina tamponada con fosfato con
10% de FBS) e incubando las placas durante 30 minutos a temperatura
ambiente. A continuación se lavaron las placas 3 veces con tampón de
lavado. Se añadieron 100 \mul de plasma (dilución 1:10) y las
placas se incubaron durante una noche a 4ºC, o durante 2 horas a
temperatura ambiente. Cada placa se lavó 4 veces con tampón de
lavado. Se añadió el anticuerpo de detección RM3/1 en el tampón de
bloqueo (100 \mul; solución salina tamponada con fosfato + 10% de
FBS) y se incubaron las placas durante 1 hora seguido de 4 lavados
con tampón de lavado. Se añadió estreptavidina/fosfatasa alcalina
(1/1000) en el tampón de bloqueo y las placas se incubaron durante
30 minutos a temperatura ambiente, seguido de 4 lavados con tampón
de lavado. La reacción se desarrolló con un sistema PNPP,
disolviendo una pastilla de 15 mg de PNPP (Sigma Chemical Co.) en 15
ml de disolvente de PNPP (Na_{2}CO_{3} 0,05 M, MgCl_{2} 0,001
M, pH 9,75) y añadiendo 100 \mul de solución a cada pocillo. Las
placas se revelaron de 5 a 30 minutos. Se añadieron 100 \mul de
NaOH 1 M con el fin de detener la reacción. Las placas se leyeron en
un espectrofotómetro a 405 nm.
Claims (4)
1. Procedimiento in vitro para el
diagnóstico de una respuesta inflamatoria mediante la detección de
la presencia de CD163 soluble en una muestra biológica,
comprendiendo dicho procedimiento:
a) poner en contacto la muestra con un
anticuerpo de captura de CD163 para formar un complejo
CD163-anticuerpo; y
b) poner en contacto el complejo
CD163-anticuerpo con un anticuerpo de detección de
CD163, de manera que se detectan los niveles de CD163 en la
muestra.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el anticuerpo de captura de CD163 es MAC2-158
ó MAC2-48, y el anticuerpo de detección de CD163 es
RM3/1.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la muestra biológica es plasma humano.
4. Procedimiento para el seguimiento de la
evolución de un estado inflamatorio o un proceso inflamatorio, que
comprende la detección de la presencia de CD163 en muestras
biológicas mediante un procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores.
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