ES2287660T3 - Composicion farmaceutica de los derivados peptidicos de trombina. - Google Patents
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Abstract
Una composición farmacéutica que comprende: a) un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp- Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y b) un agente quelante y/o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
Description
Composición farmacéutica de los derivados
peptídicos de trombina.
La trombina es una proteasa de serina presente
en el plasma sanguíneo en forma de precursor, protrombina. Se
conoce por su actividad promotora de crecimiento de una amplia
variedad de células de diversos tejidos por activación de un
receptor específico de superficie celular conocido como el receptor
de trombina no activado proteolíticamente. Por ejemplo, se ha
demostrado que la trombina promueve la angiogénesis, desarrollo de
nuevos vasos sanguíneos, y estimula la proliferación de células
endoteliales (ver, ej., Patentes EE.UU. Nos. 5. 352.664, 5.
500.412).
Los derivados peptídicos de trombina son
análogos sintéticos de la trombina que poseen una secuencia de
aminoácidos derivada por lo menos en parte de la trombina y son
activos en el receptor de trombina no activado proteolíticamente.
Por ejemplo, los inventores de la presente invención han descrito
que los derivados peptídicos de trombina de los aminoácidos
508-530 de la protrombina humana promueven la
estimulación de células mediada por el receptor de trombina y que
se pueden utilizar en el tratamiento de heridas, estimulando el
crecimiento óseo y el crecimiento o reparación de cartílagos y
promueven la reparación del tejido cardíaco (ver, ej., Patentes
EE.UU. Nos. 5.352.664, 5.500.412, WO 02/07748, WO 02/005836, WO
02/004008 y WO 03/013569).
Los derivados peptídicos de trombina muestran un
gran potencial como productos farmacéuticos debido a su actividad
terapéutica en el tratamiento de heridas, estimulación del
crecimiento óseo y crecimiento de cartílagos y en la promoción de
la reparación cardíaca. Sin embargo, desafortunadamente los
derivados peptídicos de trombina son altamente susceptibles a la
dimerización. Por ejemplo, TP508, ejemplo de un derivado peptídico
de trombina que posee la secuencia de aminoácidos
H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-N-H2
(SEQ ID NO: 4), dimeriza con el tiempo y tiene una vida media de
alrededor de 2 a aproximadamente 4 horas en ciertas soluciones
tamponadas a pH neutro y, una vida media de aproximadamente 7 días a
altas concentraciones de péptidos en salina estéril (Ver ejemplo
1).
Por tanto, es necesario desarrollar métodos para
mantener la pureza de los derivados peptídicos de trombina durante
períodos de tiempo prolongados y evitar o reducir la dimerización de
manera que los derivados peptídicos de trombina tengan un tiempo de
vida largo en almacenamiento y sea posible ofrecer dosis precisas y
reproducibles, incluso después del almacenamiento durante períodos
de tiempo prolongados.
En la actualidad se ha encontrado que una
composición farmacéutica que incluya a un derivado peptídico de
trombina y un inhibidor de dimerización retiene la forma monomérica
del derivado peptídico de trombina esencialmente libre de dímeros.
Un inhibidor de dimerización es un compuesto que inhiba o reduzca la
dimerización de un derivado peptídico de trombina. Los inhibidores
de dimerización incluyen agentes quelantes y/o compuestos que
contienen tiol. En un ejemplo, TP508 en presencia de un agente
quelante, ácido
etilen-diamino-tetra-acético
(EDTA), retenía su forma monomérica por encima del 90% en peso
durante 2 semanas a 4ºC (ver Ejemplo 3). También se puede utilizar
un antioxidante en combinación con el agente quelante y/o el
compuesto que contiene tiol. En base a este hallazgo, la invención
ofrece una composición farmacéutica que comprende:
- a)
- un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 residuos de aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y
- b)
- un agente quelante y/o un compuesto, que contiene tiol, aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
y el uso de la composición farmacéutica según la
reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para activar el
receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
La composición farmacéutica además comprende
opcionalmente un antioxidante.
Las ventajas de la composición farmacéutica de
la presente invención incluyen una vida de almacenamiento más
prolongada para los derivados peptídicos de trombina que la que
anteriormente era posible. Por tanto, es posible ofrecer dosis
precisas y reproducibles con derivados peptídicos de trombina
incluso después del almacenamiento durante prolongados períodos de
tiempo. La composición farmacéutica se puede utilizar en el
tratamiento y/o prevención de enfermedades y/o condiciones, en las
que la angiogénesis y la proliferación celular serían beneficiosas.
La composición farmacéutica se puede utilizar para acelerar, por
ejemplo, el crecimiento óseo, crecimiento o reparación de
cartílagos, y la cicatrización de heridas como úlceras diabéticas, y
para estimular el crecimiento óseo en lugares donde el mismo no
ocurriría con ausencia de tratamiento (ej., fractura sin unión,
vacíos o huecos en los huesos o injertos óseos). La composición
farmacéutica de la presente invención también se puede utilizar
para prevenir la restenosis en pacientes después de la angioplastia
y para regenerar los vasos sanguíneos en el tejido cardíaco.
\newpage
La Figura 1 es un gráfico que muestra el dímero
del monómero TP508, y otros (aductos, etc.) en el momento de la
mezcla (Tiempo 0) con inhibidor de dimerización (Tioglicerol (T),
EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en atmósfera de N2
(EN).
La Figura 2 es un gráfico que muestra la
estabilidad de TP508 en geles Pluronic después de 2 semanas de
almacenamiento a 4ºC en presencia del inhibidor de dimerización
(Tioglicerol (T), EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en
atmósfera de N2 (EN).
La Figura 3 es un gráfico que muestra la
estabilidad de TP508 en geles Pluronic después de dos meses de
almacenamiento a 4ºC en presencia del inhibidor de dimerización
(Tioglicerol) (T). EDTA (E), Tioglicerol y EDTA (TE), y EDTA en
atmósfera de 2 (EN).
Los solicitantes han encontrado que ciertos
derivados peptídicos de trombina retienen su forma monomérica
esencialmente libre de dímeros en presencia de un inhibidor de
dimerización tales como un agente quelante o un compuesto que
contiene tiol, ej., por encima del 90% libre por peso durante un
período de tiempo de 2 meses y preferiblemente por encima del 95%
libre por peso durante un período de tiempo de 2 meses (Ejemplo 3).
El agente quelante y el compuesto que contiene tiol se pueden
utilizar juntos o por separado para prevenir o reducir la
dimerización de los derivados peptídicos de trombina. Opcionalmente
se puede utilizar un antioxidante en combinación con el agente
quelante y/o el compuesto que contiene tiol.
Un "agente quelante," tal como se utiliza
aquí, es un compuesto que posee múltiples sitios (dos, tres, cuatro
o más) que pueden simultáneamente enlazarse a un ión de metal o
iones de metal tales como, por ejemplo, iones de plomo, cobalto,
hierro o cobre. Los sitios de enlace típicamente comprenden oxígeno,
nitrógeno, azufre o fósforo. Por ejemplo, las sales de EDTA (ácido
etilen-diamino-tetra-acético)
pueden formar por lo menos de cuatro a seis enlaces con un ión de
metal o iones de metal por vía de los átomos de oxígeno de las
cuatro restos de ácido acético (-CH_{2}C(O)O-) y
los átomos de nitrógeno de los restos de
etilen-diamino
(>N-CH_{2}-CH_{2}-N<)
de EDTA. Se entiende que un agente quelante también incluye un
polímero que tiene múltiples sitios de enlace con un metal o iones
de metal. Preferiblemente, un agente quelante de la invención no es
tóxico y no provoca efectos secundarios inaceptables a las dosis
que se administran. Como un agente quelante de la invención, se
prefiere un agente quelante de cobre. Un "agente quelante de
cobre" se refiere a un agente quelante que puede enlazarse a un
ión de cobre o iones de cobre. Ejemplos de agente quelante de cobre
incluyen el ácido
etilen-diamino-tetra-acético
(EDTA), penicilamina, trientina,
N,N'-dietil-ditio-carbamato
(DDC), 2,3,2'-tetramina
(2,3,2'-tet), neocuproína,
N,N,N',N'-tetrakis(2-piridil-metil)
etilen-diamina (TPEN),
1,10-fenantrolina (PHE),
tetraetilen-pentamina (TEPA),
trinquetilla-tetramina y
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
Otros agentes quelantes son ácido
dietilen-triamino-penta-acético
(DTPA) y ácido batofenantrolina-disulfónico (BPADA).
EDTA es un agente quelante preferido. Las cantidades típicas de un
agente quelante presentes en la composición farmacéutica de la
presente invención se encuentran en un rango entre aproximadamente
0,00001% y aproximadamente 0,1% en peso, preferiblemente entre
aproximadamente 0,0001% y aproximadamente 0,05% en peso.
Un "compuesto que contiene tiol aceptable
desde el punto de vista farmacéutico", tal como se utiliza aquí,
es un compuesto que comprende por lo menos un grupo tiol (-SH) y que
no provoca efectos secundarios inaceptables a las dosis que se
administran. Ejemplos del compuesto que contiene tiol aceptable
desde el punto de vista farmacéutico incluyen tioglicerol,
mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteína, tioglucosa,
ditiotreitol (DTT), y
ditio-bis-maleímido-etano
(DTME). Típicamente, entre aproximadamente 0,001% y aproximadamente
5% en peso, preferiblemente entre aproximadamente 0,05% y
aproximadamente 1,0% en peso de un compuesto que contiene tiol
aceptable desde el punto de vista farmacéutico está presente en la
composición farmacéutica de la invención.
Un "antioxidante," tal como se utiliza
aquí, es un compuesto que se usa para evitar o reducir una reacción
de oxidación causada por un agente oxidante como el oxígeno.
Ejemplos de antioxidante incluyen tocoferol, cisteína, metionina,
glutatión, toco-trienol,
dimetil-glicina, betaína, hidroxianisol butilado,
hidroxitolueno butilado, vitamina E, ácido ascórbico, palmitato de
ascorbilo, ácido tioglicólico péptidos antioxidantes tales como,
por ejemplo, turmerin. Típicamente, entre aproximadamente 0,001% y
aproximadamente 10% en peso, preferiblemente entre aproximadamente
0,01% y aproximadamente 5%, más preferiblemente entre
aproximadamente 0,05% y aproximadamente 2,0% en peso de un
antioxidante está presente en la composición farmacéutica de la
invención.
Se entiende que ciertos agentes quelantes o
compuestos que contienen tiol pueden también funcionar como un
antioxidante, por ejemplo,
tris(2-carboxietil)fosfina, cisteína o
ditio-treitol. Sin embargo, otros tipos de
antioxidantes comúnmente utilizados no contienen un grupo tiol.
También se entiende que ciertos compuestos que contienen tiol
también pueden funcionar como un agente quelante, por ejemplo,
ditio-treitol. Sin embargo, otros tipos de agentes
quelantes comúnmente utilizados no contienen un grupo tiol. También
se entiende que la composición farmacéutica de la presente
invención puede comprender más de un agente quelante, un compuesto
que contiene tiol o un antioxidante. Es decir, por ejemplo, que un
agente quelante puede utilizarse solo o en combinación con uno o más
agentes quelantes adecuados.
Un "agonista de receptor de trombina" se
refiere a un compuesto que estimula o activa el receptor de trombina
no activado proteolíticamente (NPAR) (R. Horvat, et. al., J.
Cell Sci. 108, 1155-1164, 1995). Se dice que los
compuestos que estimulan el NPAR son agonistas. El NPAR es un
receptor de trombina de alta afinidad presente en la superficie de
la mayoría de las células. Este compuesto NPAR es en gran medida
responsable del enlace de alta afinidad de la trombina, de la
trombina proteolíticamente inactivada y de los péptidos derivados de
la trombina con las células. El NPAR parece mediar varias señales
celulares que son iniciadas por la trombina independiente de su
actividad proteolítica. Ejemplo de una de esas señales es la
sobrerregulación de anexina V y otras moléculas identificadas por
hibridización substractiva (ver Sower, et. al., Experimental
Cell Research 247:422 (1999)). Por tanto, el NPAR se caracteriza
por su interacción de alta afinidad con la trombina en las
superficies celulares y su activación por derivados proteolítcamente
inactivos de trombina y agonistas peptídicos derivados de trombina
como se describe abajo. La activación del NPAR se puede evaluar en
base a la capacidad de las moléculas de estimular la proliferación
celular al ser añadido a fibroblastos en presencia de
concentraciones submitogénicas de trombina o moléculas que activan
la quinasa proteica C como se muestra en la Patente de EE.UU.,
Nos. 5.352.664 y 5.500.412. Los agonistas de NPAR se pueden
identificar por esta activación o por su capacidad de competir con
el enlace de trombina 125l con las células. Los derivados peptídicos
de trombina son ejemplos del agonista receptor de trombina. Un
derivado peptídico de trombina es un polipéptido con menos de
alrededor de 50 aminoácidos, preferiblemente menos de alrededor de
treinta y tres aminoácidos y tiene suficiente homología con el
fragmento de trombina humana correspondiente a los aminoácidos de la
protrombina 508-530
(Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val:
SEQ ID NO: 3), de manera que el derivado peptídico de trombina
posee por lo menos 25% de la actividad de TP508 en el NPAR,
preferiblemente por lo menos 50%. Los derivados peptídicos de
trombina descritos aquí tienen entre aproximadamente 14 y 23
aminoácidos, más preferiblemente entre aproximadamente 19 y 23
aminoácidos. Opcionalmente, los derivados peptídicos de trombina
descritos aquí pueden tener amidas C-terminales y/o
un extremo con terminación en N acilado.
Un "extremo con terminación en N acilado"
es un extremo con terminación en N, en el que el nitrógeno del
residuo aminoácido con terminación en N está acilado. Por ejemplo,
los residuos aminoácidos terminales acilados tienen la fórmula:
R3C(O)-N-H-CHRaC(O)-.
R_{a} es una cadena lateral de aminoácidos y R3 es hidrógeno (-H)
o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}, preferiblemente
grupo metil (-CH_{3}). Un grupo acilo preferido es un grupo
acetilo. Un "-H" en el extremo con terminación en N indica que
el extremo con terminación en N es insustituido; y ninguna
designación en el extremo con terminación en N indica que el
terminal es acilado o insustituido.
Una "amida C-terminal" es
una amida en el residuo aminoácido C-terminal en el
que el ácido alfa carboxílico se sustituye por una amida. Por
ejemplo, los residuos aminoácidos C-terminales
amidados tienen la fórmula:
-NH-CH(R_{a})C
(O)-NR4R5. R_{a} es una cadena lateral de
aminoácidos, y R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo
C_{1}-C_{6} o, R4 y R5 son independientemente
-H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados
juntos con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo
heterocíclico como el piperidinil, morfolinil, tiomorfinil o
pirolidinil. Preferiblemente, la amida C-terminal es
una carboxamida (-C(O)NH_{2}). Tal como se usa
aquí, "-NH_{2}" en el extremo C-terminal
indica una carboxamida en el extremo C-terminal;
"-OH" en el extremo C-terminal indica que el
péptido tiene un extremo C-terminal libre, y ninguna
designación en el extremo C-terminal indica que el
péptido está amidado en el extremo C-terminal o
tiene un extremo C-terminal libre.
Preferiblemente, el extremo con terminación en N
de un derivado peptídico de trombina está libre (i.e., insustituido)
y el extremo C-terminal está libre (i.e.,
insustituido) o amidado, preferiblemente una carboxamida
(i.e.,
-C(O)NH_{2}).
-C(O)NH_{2}).
Un derivado peptídico de trombina preferido para
uso en la composición revelada está compuesto por la secuencia de
aminoácidos siguiente:
R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2:
SEQ ID NO: 1. R1 es -H o R3-C(O)-; R2 es -OH
o -NR4R5; R3 es -H o grupo alquilo C_{1}-C_{6}
(preferiblemente -CH_{3}); y R4 y R5 son independientemente -H,
un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados juntos
con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo
heterocíclico no aromático tales como piperidinil, morfolinil,
tiomorfinil o pirolidinil (preferiblemente, R4 y R5 son ambos -H).
Preferiblemente R1 es -H y R2 es -NH_{2}; o R1 es -H y R2 es
-OH.
Alternativamente, se puede utilizar en la
formulación un fragmento con terminación en N truncado del derivado
peptídico de trombina de SEQ ID NO: 1 que tiene por lo menos catorce
aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del
derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 1 que tiene por lo
menos dieciocho aminoácidos. Otra alternativa que se puede utilizar
en la formulación es un fragmento con terminación en N truncado del
derivado peptídico de trombina que tiene la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 5,
R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2.
R1 y R2 son según se describe arriba, teniendo por lo menos
diecinueve aminoácidos o un fragmento C-terminal
truncado del derivado peptídico de trombina de la SEQ ID NO: 5 que
tiene veintitrés aminoácidos.
Un "fragmento C-terminal
truncado" se refiere a un fragmento que queda después de eliminar
un aminoácido o bloque de aminoácidos del extremo
C-terminal. Un "fragmento con terminación en N
truncado" se refiere a un fragmento que queda después de
eliminar un aminoácido o bloque de aminoácidos del extremo con
terminación en N. Es para entender que los términos "fragmento
C-terminal truncado" y "fragmento con
terminación en N truncado" abarcan la acilación en el extremo
con terminación en N y/o amidación del extremo
C-terminal, según se describe arriba. También se
entiende que la invención incluye fragmentos
C-terminales truncados y fragmentos con
terminaciones en N con las modificaciones de residuos aminoácidos
hechas en los derivados peptídicos originales de trombina antes de
la truncación, según se describe arriba.
Otro derivado peptídico de trombina preferido
que se describe aquí comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ
ID NO: 2:
R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2.
X1 es Glu o Gln; X2 es Phe, Met, Leu, His o Val; y R1 y R2 son
según se describe arriba. Alternativamente, se puede utilizar en la
formulación un fragmento con terminación en N truncado del derivado
peptídico de trombina de SEQ ID NO: 2 que tiene por lo menos
catorce aminoácidos o un fragmento C-terminal
truncado del derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 2 que
tiene por lo menos dieciocho aminoácidos. Otra alternativa es que
se puede utilizar en la formulación un fragmento con terminación en
N truncado del derivado peptídico de trombina que tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6,
R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2.
X1 es Glu o Gln; X2 es Phe, Met, Leu, His o Val; y R1 y R2 son
según se describe arriba teniendo por lo menos diecinueve
aminoácidos o un fragmento C-terminal truncado del
derivado peptídico de trombina de SEQ ID NO: 6 que tiene veintitrés
aminoácidos.
Otro derivado peptídico de trombina preferido
para uso en la composición revelada comprende la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO: 3:
Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val.
Este péptido tiene preferiblemente una longitud de 23
aminoácidos.
Otro derivado peptídico de trombina preferido
para uso en la composición revelada es TP508. TP508 es un ejemplo
de un derivado peptídico de trombina con la secuencia de aminoácidos
de SEQ ID NO: 4:
H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2}.
Otro ejemplo de un derivado peptídico de trombina tiene la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7:
H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-OH
("deamida TP508").
En la formulación revelada se utiliza un
derivado peptídico de trombina representado por la Fórmula
Estructural (I), entre 14 y 23 aminoácidos de longitud:
(I),Asp-Ala-R
Donde R es un dominio conservado de la esterasa
de serina. Las esterasas de serina, ej., tripsina, quimotripsina de
trombina, etc., poseen una región que es altamente conservada.
"Dominio conservado de la esterasa de serina" se refiere a un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una de estas
regiones conservadas o es suficientemente homólogo a una de estas
regiones conservadas de manera que el derivado peptídico de trombina
retiene su capacidad de activación del NPAR. En una realización, la
secuencia conservada de la esterasa de serina tiene la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID NO. 8
(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)
o un fragmento C-terminal truncado de un polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8.
Otros ejemplos de derivados peptídicos de
trombina que se pueden utilizar en la formulación revelada incluyen
fragmentos con terminaciones en N truncados de TP508 (o deamida
TP508), los fragmentos con terminaciones en N truncados que tienen
por lo menos catorce aminoácidos o fragmentos
C-terminales truncados de TP508 (o deamida TP508),
los fragmentos C-terminales truncados que tienen por
lo menos dieciocho aminoácidos. Opcionalmente, estos péptidos están
amidados en el extremo C-terminal y son
insustituidos en el extremo con terminación en N. En otra
alternativa, opcionalmente, estos péptidos están amidados en el
extremo C-terminal como
-C(O)-NH_{2} y son insustituidos en el
extremo con terminación en N.
Una "sustitución conservadora" es la
sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene la misma
carga electrónica neta y aproximadamente el mismo tamaño y la misma
forma. Los aminoácidos con cadenas laterales de aminoácidos
alifáticas o alifáticas sustituidas tienen aproximadamente el mismo
tamaño cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus
cadenas laterales difieren en no más de alrededor de cuatro. Ellos
tienen aproximadamente la misma forma cuando el número de
ramificaciones en sus cadenas laterales difieren en no más de una.
Se considera que los aminoácidos con grupos de fenil o fenil
sustituidos en sus cadenas laterales tienen aproximadamente el
mismo tamaño y la misma forma. Abajo aparecen cinco grupos de
aminoácidos. La sustitución de un aminoácido en un polipéptido por
otro aminoácido del mismo grupo tiene como resultado una sustitución
conservadora:
Grupo I: glicina, alanina, valina, leucina,
isoleucina, serina, treonina, cisteína y aminoácidos que no ocurren
de forma natural con cadenas laterales alifáticas
C1-C4 o cadenas laterales alifáticas sustituidas
hidroxiladas C_{1}-C_{4} (cadena lineal o
monoramificada).
Grupo II: ácido glutámico, ácido aspártico y
aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales
alifáticas de ácidos carboxílicas C_{1}-C_{4}
sustituidos (sin ramificar o un punto de ramificación).
Grupo III: lisina, orinitina, arginina y
aminoácidos que no ocurren de forma natural con cadenas laterales
alifáticas sustituidas aminas o guanidina
C_{1}-C_{4} (sin ramificar o un punto de
ramificación).
Grupo IV: glutamina, asparagina y aminoácidos
que no ocurren de forma natural con cadenas laterales alifáticas
sustituidas de amidas C_{1}-C_{4} (sin ramificar
o un punto de ramificación).
Grupo V: fenilalanina, fenilglicina, tirosina y
triptófano.
Una "sustitución altamente conservadora" es
la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene el
mismo grupo funcional en la cadena lateral y casi el mismo tamaño y
la misma forma. Los aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o
de aminoácidos alifáticos sustituidos tienen casi el mismo tamaño
cuando el número total de carbono y heteroátomos en sus cadenas
laterales difieren en no más de dos. Tienen casi la misma forma
cuando tienen el mismo número de ramificaciones en sus cadenas
laterales. Ejemplos de sustituciones altamente conservadoras
incluyen valina por leucina, treonina por serina, ácido aspártico
por ácido glutámico y fenilglicina por fenilalanina. Ejemplos de
sustituciones que no son altamente conservadoras incluyen la
alanina por valina, alanina por serina y ácido aspártico por
serina.
En una realización, la composición farmacéutica
revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente
quelante o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto
de vista farmacéutico. Preferiblemente, la composición farmacéutica
revelada comprende un derivado peptídico de trombina; el agente
quelante; y el compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto
de vista farmacéutico. Como agente quelante de la invención se
prefiere un agente quelante de cobre tal como se describe
previamente.
Alternativamente, la composición farmacéutica
revelada comprende un derivado peptídico de trombina y un agente
quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre y/o un
compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista
farmacéutico, y además comprende un antioxidante.
En una realización preferida, la composición
farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y
un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre, y
un antioxidante. En una realización más preferida, la composición
farmacéutica revelada comprende un derivado peptídico de trombina y
un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de cobre, y
metionina. Preferiblemente, el agente quelante es EDTA.
Preferiblemente, la composición farmacéutica
revelada se encuentra en un rango de pH entre aprox. 5 y aprox. 6,
más preferiblemente, entre aprox. 5,5 y aprox. 6. En un ejemplo, la
composición farmacéutica, que comprende un derivado peptídico de
trombina y un agente quelante, preferiblemente un agente quelante de
cobre, y un antioxidante, se encuentra en un rango de pH entre
aprox. 5 y aprox. 6, más preferiblemente, entre aprox. 5,5 y aprox.
6. En esta composición, preferiblemente, el antioxidante es
metionina.
Otra realización de la invención es el uso de la
composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para
activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un
sujeto.
Un "sujeto" es preferiblemente un humano
pero también puede ser un animal que necesite tratamiento con un
agonista de receptor de trombina, ej., animales de compañía (e.g.,
perros, gatos, etc), animales de granja (ej., vacas, cerdos,
caballos, etc) y animales de laboratorio (ej., ratas, ratones,
curieles, etc).
Sujetos "que necesitan tratamiento" con un
agonista de receptor de trombina, son sujetos con enfermedades y/o
condiciones que pueden tratarse con agonistas de receptor de
trombina y derivados peptídicos de trombina para lograr un
resultado terapéutico y/o profiláctico beneficioso. Un resultado
beneficioso incluye una disminución en la severidad de los síntomas
o retardo del comienzo de los síntomas, longevidad incrementada y/o
resolución más rápida o más completa de la enfermedad o condición.
Por ejemplo, un sujeto que necesita tratamiento requiere
proliferación celular que implique condrocitos, angiogénesis,
crecimiento óseo, reparación cardíaca, cicatrización de heridas,
crecimiento o reparación de cartílago o inhibición de
restenosis.
Se ha demostrado que los derivados peptídicos de
trombina estimulan la proliferación de las células endoteliales,
fibroblastos y queratinocitos (ver, ej., Patentes de E.U Nos.
5.500.412 y 5.352.664). Por tanto, los derivados peptídicos de
trombina se pueden utilizar para promover la cicatrización en
heridas agudas tales como, por ejemplo, quemaduras, heridas en la
piel, heridas quirúrgicas y fracturas óseas. Además, se ha
demostrado recientemente que los derivados peptídicos de trombina
son particularmente efectivos en promover la cicatrización de
heridas crónicas tales como úlceras diabéticas, úlceras venosas y
llagas (ver, ej., WO 03/013569). También se ha demostrado que los
derivados peptídicos de trombina estimulan el crecimiento o
reparación de cartílago y el crecimiento de los condrocitos (ver,
ej., WO 02/07748). Así, los derivados peptídicos de trombina se
pueden utilizar para estimular el crecimiento o reparación de
cartílago o el crecimiento y reparación de condrocitos en, por
ejemplo pacientes con osteoartritis o lesiones en las
articulaciones. Otros usos de los derivados peptídicos de trombina
incluyen la estimulación del crecimiento óseo para promover la
curación de fracturas simples, fracturas sin uniones, vacíos y
huecos en el hueso e injertos óseos, evitando la restenosis en
pacientes después de la angioplastia y promoviendo la regeneración
de vasos sanguíneos en el tejido cardíaco (ver, ej., WO 02/005836,
WO 02/004008, y US Pat Appl. Publ. No. 2002/0128202).
El crecimiento óseo inducido también puede ser
beneficioso desde el punto de vista terapéutico en ciertos sitios
dentro de un sujeto (referidos como sitios "ectópicos") donde
normalmente no se encontraría tejido óseo, como el caso de un sitio
que necesite un injerto óseo o fusión ósea. Las fusiones comúnmente
se utilizan para tratar el dolor en la parte inferior de la espalda
acoplando físicamente una o más vértebras a su vecina. El hueso que
se crea con esa fusión se coloca en un sitio que normalmente no está
ocupado por tejido óseo. El crecimiento óseo inducido en estos
sitios ectópicos puede actuar como un "sustituto de injerto"
mediante el cual el crecimiento óseo inducido entre las vértebras
toma el lugar de un injerto y obvia la necesidad de una segunda
operación para cosechar tejido óseo del procedimiento de injerto. La
inducción del crecimiento óseo también es necesaria para tratar
anomalías adquiridas y congénitas craneofaciales y otras del
esqueleto y los dientes (ver ej., Glowacki et al., Lancet 1:
959 (1981)); realizar reconstrucciones dentales y periodontales
donde se requiere la sustitución del hueso perdido o aumento óseo
como en un hueso mandibular; y suplir la pérdida ósea alveolar
provocada por enfermedad periodontal para retardar o prevenir la
pérdida de los dientes (ver ej., Sigurdsson et al., J.
Periodontol., 66: 511 (1995)).
La composición farmacéutica de la presente
invención que comprende un derivado peptídico de trombina puede por
tanto utilizarse en los tratamientos descritos arriba.
Una "cantidad eficaz" es la cantidad de un
derivado peptídico de trombina en la composición farmacéutica de la
presente invención que tiene como resultado la mejoría clínica de la
condición que se está tratando con el derivado peptídico de
trombina comparado con la ausencia del tratamiento. La cantidad de
derivados peptídicos de trombina administrados dependerá del grado,
severidad, y tipo de la enfermedad o condición, la cantidad de
terapia deseada, y las características de liberación de la
formulación farmacéutica. También dependerá de la salud, tamaño,
peso, edad, sexo y tolerancia a las drogas del sujeto. Típicamente,
el derivado peptídico de trombina se administra durante un período
de tiempo suficiente para lograr le efecto terapéutico deseado.
Para la indicación de reparación cardíaca, se administra típicamente
entre aprox. 0,1 \muM a 10 \muM o más típicamente entre aprox.
50 a 250 \mug por una sola inyección del derivado peptídico de
trombina al tejido dañado para el aumento satisfactorio en la tasa
de reparación. Para la indicación de crecimiento o reparación de
cartílago, típicamente se administra entre aprox. 0,1 \mug por una
sola aplicación y aprox. 1 mg por una sola aplicación del derivado
peptídico de trombina, preferiblemente entre aprox. 25 \mug y
aprox. 100 \mug por 20 mm cúbicos. Para el tratamiento de úlcera
crónica de la piel, se administra típicamente entre aprox. 0,1
\mug y aprox. 1 mg por una sola aplicación, preferiblemente entre
aprox. 1 \mug y aprox. 100 \mug por una sola aplicación, del
derivado peptídico de trombina. Particularmente, se administra de
una a siete aplicaciones por semana del derivado peptídico de
trombina para el tratamiento de úlcera crónica de la piel. Para la
indicación de crecimiento óseo, se administra típicamente entre
aprox. 1 \mug y aprox. 1 mg por día, preferiblemente entre aprox.
5 \mug y aproximadamente 100 \mug por día, del derivado
peptídico de trombina.
En otra realización, la composición farmacéutica
revelada además comprende un portador aceptable desde el punto de
vista farmacéutico como parte de la composición farmacéutica. Los
portadores farmacéuticos adecuados pueden contener ingredientes
inertes que no inhiben la actividad biológica de un derivado
peptídico de trombina y la función de un agente quelante, un
compuesto que contiene tiol y un antioxidante. Los portadores deben
ser biocompatibles, es decir, no tóxicos, no inflamatorios, no
inmunogénicos y desprovistos de otras reacciones indeseables en el
sitio de administración. Los portadores aceptables desde el punto de
vista farmacéutico varían de acuerdo a la ruta de administración
seleccionada y la indicación que se está tratando. Ejemplos de
portadores aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen,
por ejemplo, salina, aerosoles, geles inertes comercialmente
disponibles, o líquidos suplementados con albúmina, metilcelulosa o
una matriz de colágeno. Se pueden utilizar técnicas de formulación
farmacéutica estándar como las descritas en Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Las composiciones de la presente invención
pueden ser soluciones, suspensiones, emulsiones, siropes, geles,
ungüentos, lociones, cremas, pastas, masillas, extrusiones,
micropartículas, cápsulas, tabletas, etc.
Comúnmente se utiliza una formulación en gel
cuando el derivado peptídico de trombina se usa para promover la
reparación cardíaca y la cicatrización de heridas. Los geles están
formados por una base seleccionada de una base oleaginosa, agua, o
una base emulsión-suspensión. La base oleaginosa
contiene aceites fijos o hidrocarburos como petrolato blanco o
aceite mineral, o una base absorbente, ej., compuesta por una
sustancia o sustancias anhidras absorbentes, por ejemplo lanolina
anhidra. La base emulsión-suspensión comprende una
fase oleosa (fase interna) que típicamente contiene aceites fijos,
hidrocarburos, etc, tales como ceras, petrolato, aceite mineral,
etc, y una fase acuosa (fase continua) que contiene agua y cualquier
sustancia soluble en agua como sales añadidas. Las dos fases se
estabilizan con el uso de un agente emulsificante, por ejemplo, un
agente surfactante como el lauril-sulfato sódico,
coloides hidrófilos como las arcillas coloidales de acacia, beegum,
etc. A la base se añade un agente gelificante que forma una matriz
en la base, aumentando su viscosidad hasta una consistencia
semisólida. Ejemplos de agentes gelificantes adecuados incluyen
celulosa de hidroxipropilo, polímeros de ácido acrílico, polímeros
de óxido de polietileno o copolímeros de oxido de etileno y
propileno (ver Cao et al., J. Biomater. Sci 9:475 (1998) y
Sims et al., Plast Reconstr.Surg. 98:_843 (1996)). Los geles
Pluronic son copolímeros en bloque no tóxicos de óxido de etileno y
óxido de propileno. Exhiben propiedades termoestabilizadoras que
les permite existir como líquidos viscosos a temperatura ambiente,
pero como geles a temperaturas corporales. Los ingredientes activos
se añaden a la formulación a la concentración deseada en un punto
que precede la adición del agente gelificante o puede mezclarse
después del proceso de gelificación. Los geles para el tratamiento
de cicatrización de heridas se pueden administrar en una
administración local tópica. En el ejemplo 7 se describe la
preparación de los geles.
Las formulaciones para una administración local
tópica además de los geles incluyen ungüentos y cremas. Los
ungüentos típicamente se preparan utilizando la base oleaginosa
descrita previamente. Las cremas generalmente comprenden la base
emulsión-suspensión descrita previamente. Después de
formada la base, los ingredientes activos se añaden a la
concentración deseada.
En otra realización preferida, las composiciones
farmacéuticas reveladas son pelets liofilizados que se pueden
reconstituir antes del uso. Los mismos se utilizan comúnmente para
indicaciones como el crecimiento óseo y reparación cardíaca. Las
composiciones liofilizadas comprenden opcionalmente un agente de
relleno de cargas además de los otros ingredientes activos
descritos previamente. Agentes de carga adecuados incluyen manitol,
celulosa, sorbitol, dextrosa dextrana, polidextrosa, maltitol,
xilitol, isomaltosa, eritritol, glicerol, etc. Las composiciones
liofilizadas se pueden reconstituir para formar soluciones, y pueden
contener sustancias auxiliares como agentes emulsificantes o
humectantes, agentes tampones de pH, aditivos mejoradores de la
viscosidad, preservantes, etc, en dependencia de la ruta de
administración y la preparación deseadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención son típicamente formulaciones de liberación sostenida
para indicaciones como el crecimiento óseo, crecimiento o reparación
de cartílago y reparación cardíaca. Estas formulaciones pueden
ofrecer la liberación continua del medicamento durante horas. Los
polímeros se utilizan con frecuencia para crear las formulaciones
de liberación sostenida. Ejemplos de polímeros incluyen
poli-\alpha-hidroxi-ésteres como
los homopolímeros y copolímeros de ácido poliláctico/ácido
poliglicólico, (PLGA), polifosfacenos (PPHOS), polianhídridos y
poli (fumaratos de propileno) (PPF).
Los homopolímeros y copolímeros de ácido
poliláctico/ácido poliglicólico (PLGA) son muy bien conocidos en la
técnica como vehículos de liberación sostenida. La tasa de
liberación se puede ajustar por un artesano experto mediante la
variación de la proporción ácido poliláctico:ácido poliglicólico y
del peso molecular del polímero (ver Anderson, et al., Adv.
Drug Deliv. Rev. 28: 5 (1997)). La incorporación de polietilenglicol
en el polímero como una mezcla para formar portadores de
micropartículas permite la modificación adicional del perfil de
liberación del ingrediente activo (ver Cleek et al., J.
Control Release 48:259 (1997)). Las cerámicas como el fosfato de
calcio y la hidroxiapatita también pueden ser incorporadas en la
formulación para mejorar las cualidades mecánicas. Las
micropartículas de PLGA también pueden mezclarse con geles Pluronic
o colágeno para prevenir la agregación y hacer que las
micropartículas sean convenientes para la inyección directa. La
preparación de microesferas PLGA de TP508 se describe detalladamente
en WO 03/061690.
Los polímeros PPHOS contienen nitrógeno y
fósforo alternantes sin carbono en la cadena principal del polímero,
según se muestra en la Fórmula Estructural (I):
Las propiedades del polímero pueden ajustarse
con la variación conveniente de los grupos laterales R y R' que
están enlazados a la cadena principal del polímero. Por ejemplo, la
degradación de y liberación del medicamento por PPHOS puede ser
controlada variando la cantidad de grupos laterales hidrolíticamente
inestables. Con mayor incorporación de PPHOS sustituidos con
imidazolil o etilglicol, por ejemplo, se observa un aumento en el
índice de degradación (ver Laurencin et al., J Biomed Mater.
Res. 27:963 (1993)), incrementando así el índice de liberación del
medicamento.
Los polianhídridos, mostrados en la Fórmula
Estructural (II), han definido bien la degradación y las
características de liberación que pueden controlarse por la
inclusión de cantidades variables de monómeros hidrofóbicos o
hidrofílicos como el ácido sebácico y
1,3-bis(p-carboxifenoxi)
propano (ver Leong et al., J. Biomed. Mater. Res. 19:941
(1985)). Para mejorar la fuerza mecánica, los anhídridos están a
menudo copolimerizados con imidas para formar
polianhidridos-co-imidas. Ejemplos
de polianhidrido-co-imidas que son
convenientes para aplicaciones ortopédicas son los copolímeros
poli(trimelitilimido-glicina-co-1,6-bis(carboxifenoxi)hexano
y
piromeliti-imido-alanina:1,6-bis
(p-carboxifenoxi) hexano.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden administrarse por cualquier ruta adecuada,
localmente o sistemáticamente. Típicamente, la ruta de
administración depende del tipo de formulación usada y la
indicación tratada. La administración tópica se usa comúnmente para
tratar heridas. Para la administración tópica, las composiciones
farmacéuticas son típicamente cremas, geles, ungüentos o aerosoles,
como se describe previamente en detalle. Para ciertas indicaciones
como la estimulación de crecimiento óseo, reparación o crecimiento
de cartílago y reparación cardíaca, es ventajoso inyectar o
implantar la composición farmacéutica de la presente invención
directamente al sitio de tratamiento.
\newpage
Para las indicaciones con necesidad de
reparación cardíaca, crecimiento o reparación de cartílago y
crecimiento óseo, las composiciones farmacéuticas de la invención
son formas típicamente inyectables. Por ejemplo, las composiciones
inyectables reveladas pueden ser inyectadas directamente al sitio
con necesidad de crecimiento óseo y pueden ser usadas
convenientemente para llenar vacíos y unir huesos sin necesidad de
cirugía invasiva. "Inyectable" significa que el material puede
inyectarse con la jeringuilla a través de una aguja estándar usada
para inyectar soluciones, pastas o geles. Las composiciones
inyectables pueden ser administradas intravenosa o directamente en
el sitio con necesidad de tratamiento. Las composiciones inyectables
pueden incluir además salina fisiológica, salina bacteriostática
(salina que contiene aproximadamente 0,9% mg/ml de bencil alcohol),
salina de fosfato tamponada, solución de Hank, lactato de Ringer's,
o líquidos suplementados con albúmina, metil celulosa, o ácido
hialurónico. Las composiciones inyectables también pueden incluir
polímeros de (óxido de polietileno) o copolímeros de óxido de
etileno y propileno. Los geles Pluronic son ejemplos de tales
polímeros, y exponen propiedades termoestabilizadoras que les
permite existir como líquidos viscosos a temperatura ambiente, pero
como geles a temperatura corporal, como se discute previamente.
Otras composiciones para las composiciones para dispensar
inyectables incluyen las soluciones de copolímeros de
poli(fumarato de propileno) (PPF) y las pastas de cerámicas
de fosfato de calcio (ver Schmitz et al., J Oral
Maxillofacial Surgery 57:1122 (1999)).
Las composiciones farmacéuticas implantables son
beneficiosas especialmente para indicaciones como la estimulación
de crecimiento óseo, crecimiento o reparación de cartílagos y
reparación cardíaca. "La implantación" o "administración en
un sitio" significa en la suficiente proximidad al sitio con
necesidad de tratamiento de modo que ocurra la curación deseada (p.
ej, un resultado clínico mejorado de la condición tratada en
presencia del medicamento comparado con su ausencia) en el sitio
cuando el derivado peptídico de trombina es liberado desde la
composición farmacéutica. Se entiende que una composición
farmacéutica implantable también puede ser una formulación de
liberación sostenida o una formulación inyectable descrita
anteriormente. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas
implantables también pueden comprender a un portador de liberación
sostenida para lograr medicaciones lentas y continuadas en el sitio
de implantación.
Las composiciones farmacéuticas implantables
pueden moldearse como se desee antes de la cirugía o moldearse por
el médico o técnico durante la cirugía. Se prefiere moldear la
matriz para cubrir un defecto del tejido y lograr la forma deseada
del nuevo tejido. En caso de reparación ósea de un defecto sin
unión, por ejemplo, es deseable usar dimensiones que cubran la
no-unión. En procedimientos de formación ósea, el
material es lentamente absorbido por el cuerpo y es sustituido por
el hueso en forma de o muy cercano a la forma del implante.
Alternativamente, la composición farmacéutica
implantable puede ser parcialmente encerrada en una estructura
física de apoyo como una malla, matriz de alambre, jaula de acero
inoxidable, jaula de fusión intercorporal enhebrada, etc., antes de
administrar al sitio, por ejemplo, en la necesidad de crecimiento
óseo.
Incluso, en otra alternativa, las composiciones
farmacéuticas reveladas especialmente para estimular el crecimiento
óseo y reparación o crecimiento de cartílago ventajosamente
comprenden a portadores que incluyen matrices porosas que pueden
servir entonces como andamiaje para crecimiento óseo y de tejido
sobre el cual las células progenitoras de hueso y las células
osteogénicas pueden emigrar y atarse. Se dice que tales portadores
son osteoconductivos. Para ciertas aplicaciones, el portador debe
tener la suficiente fuerza mecánica para mantener su estructura
tridimensional y ayudar a apoyar la inmovilización de los segmentos
de hueso o tejido unidos o injertados juntos. Ejemplos de
portadores osteoconductivos convenientes incluyen colágeno (p. ej,
colágeno bovino), fibrina, cerámica de fosfato de calcio (p. ej,
hidroxiapatita y fosfato tricálcico), sulfato de calcio, hueso
alogénico extraído de guanidina y combinaciones por el estilo.
Varios portadores convenientes están comercialmente disponibles,
como COLLAGRAFT ® (Cohension Technologies, Inc, Palo Alto, CA), que
es una mezcla de hidroxiapatita, fosfato tricálcico y colágeno
fibrilar, y PRO OSTEON 500 ^{TM} (Interpore Cross International,
Irvine, CA), que es una biomatriz de hidroxiapatita formada por la
conversión del carbonato de calcio de coral marino en
hidroxiapatita cristalina. Las descripciones de polímeros
biodegradables sintéticos que pueden servir como portadores
osteoconductivos con características de liberación sostenida, pueden
encontrarse en Behravesh et al., Clinical Orthopaedics
367:S118 (1999) y Lichun et al., Polymeric Delivery Vehicles
for Bone Growth Factors en "Controlled Drug Delivery - Designing
Technologies for the Future" Park and Mrsny eds., American
Chemical Society, Washington, DC (2000). Ejemplos de los polímeros
biodegradables incluyen ésteres poli
\alpha-hidroxi como los homopolímeros y
copolímeros de ácido poliláctico/poliglicólico, polifosfacenos
(PPHOS), polianhídridos y poli(fumaratos de propileno), que
arriba se describen
detalladamente.
detalladamente.
Alternativamente, las composiciones
farmacéuticas pueden implantarse al sitio en forma de
micropartículas o microesferas. Por ejemplo, las micropartículas se
colocan en contacto o en cercana proximidad al sitio con necesidad
de reparación cardíaca, crecimiento óseo, o reparación de cartílago,
exponiendo quirúrgicamente el sitio y aplicando las micropartículas
en o en cercana proximidad al sitio, pintando, pipeteando, rociando,
inyectando, etc. Las micropartículas también pueden entregarse al
sitio por endoscopía o por laparoscopía. Los poli(fumaratos
de propileno) (PPF) son portadores implantables biocompatibles muy
deseables para el uso en la reparación de defectos óseos porque
constituyen un material biodegradable, inyectable, polimerizable
in situ. PPF, combinado con un vinilo monómero
(N-vinil pirrolidinona) y un iniciador (peróxido de
benzoílo), forma una solución inyectable que se puede polimerizar
in situ. Está particularmente preparado para rellenar defectos del
esqueleto de una amplia variedad de tamaños y formas (ver Suggs
et al., Macromolecules 30:4318 (1997), Peter et al.,
J. Biomater. Sci. Poly,. Ed. 10:363 (1999) y Yaszemski et
al., Tissue Eng. 1:41 (1995)). La adición de componentes de
fase sólida como \beta-fosfato tricálcico y
cloruro de sodio puede mejorar las propiedades mecánicas de los
polímeros de PPF (ver Peter et al., J. Biomed. Mater. Res.
44: 314 (1999)). Los métodos para encapsular las composiciones
(tales como en un revestimiento de gelatina dura o ciclodextrano)
se conocen en la técnica (Baker, et al., "Controlled
Release of Biological Active Agents", John Wiley y Sons,
1986).
Las enfermedades y condiciones, tratables con la
composición farmacéutica revelada que comprende un derivado
peptídico de trombina, por ejemplo, heridas y angioplastia, están a
menudo acompañadas de síntomas y dolencias como dolor e infección.
En ciertos ejemplos, puede ser ventajoso coadministrar uno o más
agentes adicionales farmacológicamente activos junto con la
composición farmacéutica de la presente invención para tratar tales
cuestiones. Por ejemplo, tratar el dolor y la inflamación puede
requerir la coadministración con agente analgésico o
anti-inflamatorio. Tratar la infección puede
requerir la coadministración con agentes antimicrobianos,
antibióticos o desinfectantes.
Los derivados peptídicos de trombina pueden ser
sintetizados por método de síntesis del péptido de fase sólida (p.
ej, BOC o FMOC), por síntesis de la fase de solución, o por otras
técnicas convenientes incluyendo combinaciones de los métodos
anteriores. Los métodos BOC y FMOC, que están establecidos y son
utilizados ampliamente, se describen en Merrifield, J. Am. Chem.
Soc. 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides,
C.H. Li, Ed., Academic Press, 1983, pp. 48-267; y
Barany and Merrifield, en The Peptides, E. Gross y J. Meienhofer,
Eds., Academic Press, New York, 1980, pp. 3-285. Los
métodos de la síntesis del péptido de fase sólida se describen en
Merrifield, R.B., Science, 232: 341 (1986); Carpino, L.A. y Han,
G.Y., J. Org. Chem., 37: 3404 (1972); y Gauspohl, H. et al.,
Synthesis, 5: 315 (1992)).
La invención se ilustra en los siguientes
ejemplos que no se pretende sean limitados de ninguna manera.
TP508 fue disuelto en 150 mM salina estéril para
dar una concentración final de 5 mg/ml. Las muestras (100 \mul)
fueron transferidas a un tubo Cryo estéril de 2 ml y almacenadas,
protegidas de la luz, a 4ºC utilizando la columna C18 (Alltech
Adsorbosphere XL columna C18 90A 5 Pm 250 x 4,6 mm) en puntos de
tiempo definidos. Se realizó un método de gradiente en el que fase
móvil B se incrementa de 20% a 50% desde 1-15
minutos (fase móvil A - TFA al 0,1% en agua; fase móvil B - 0,1%
TFA in acetonitrilo) y el volumen de inyección es 10 \mul. TP508,
el dímero de TP508 y los pico no identificados se identificaron y se
cuantificaron a partir del área de cromatograma.
TP508 fue disuelto a 1 mg/ml en soluciones
tamponadas o no tamponadas, con o sin EDTA. Las soluciones fueron
incubadas a temperatura ambiente y las muestras tomadas a intervalos
para análisis por HPLC. La formación porcentaje de dímero se
calculó a partir de los cromatogramas resultantes. Las soluciones
siguientes fueron utilizadas para disolver TP508 (1 mg/ml):
PBS, pH 7.4 (rociada con N2 durante 30 min)
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,0
10 mM Hepes, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, pH 7,0
Se colocó 1 ml de cada solución en un tubo
microcentrífuga de polipropileno de 1.5 ml, y se dejó en reposo a
temperatura ambiente. A intervalos definidos, se tomaron 100 uL para
análisis por el método HPLC mencionado en el Ejemplo 1. El
porcentaje de dímeros formado con el tiempo se resume en la Tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
En fosfato salino tamponado (PBS) o Hepes/NaCL,
el índice de formación de dímeros fue muy rápido. Como se muestra,
la adición de 5 mM EDTA redujo en gran medida el índice de formación
de dímeros. Estos resultados sugieren que la formación de dímeros
puede ser promovida por la presencia de cantidades traza de iones
divalentes ya que la formación de dímeros se evita o reduce por
EDTA.
\vskip1.000000\baselineskip
Las muestras preparadas como se describe en la
Tabla 3 típicamente contenían 50 ug/ml de TP508 disuelto en geles
Pluronic. Luego las mismas fueron almacenadas con el tiempo a 4ºC.
Para el análisis, las muestras fueron diluidas diez veces con 0,1%
TFA y analizadas por HPLC. Típicamente, 50 uL de la muestra diluida
fue analizado. La cuantificación de TP508 se realizó por un
estándar externo. Un estándar TP508 dual se analizó antes del
análisis de la muestra. Se analizó una muestra de cada grupo de la
Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Figura 1, se observó una
concentración de dímero muy baja en el tiempo 0 para todas las
muestras preparadas como se describe en la Tabla 3. Los picos
desconocidos que comprenden aproximadamente el 20% y 6% de la
muestra total se observaron en las muestras que contienen
tioglicerol (Grupo T) y tioglicerol/EDTA (Grupo TE),
respectivamente. Estos picos desconocidos tuvieron un tiempo de
retención ligeramente más prolongado que el de TP508, lo que
sugiere que ellos pudieran corresponder a un aducto de TP508 y
tioglicerol ya que la cantidad de la formación de aducto es
proporcional al contenido de tioglicerol en las dos muestras.
Las muestras almacenadas durante dos semanas a
4ºC mostraron esencialmente la misma concentración de dímeros que
la del tiempo 0, según se muestra en la Figura 2. En la muestra que
contiene EDTA (Grupo E) o EDTA c/N2 (Grupo EN), más del 90% de
TP508 todavía retenía su forma monomérica.
Como se muestra en la Figura 3, todas las
muestras que contienen un inhibidor de dimerización (Grupo T, E, TE
y EN) mostraron estabilidad incrementada de TT508 comparado con las
muestras sin un inhibidor de dimerización. La muestra que contiene
tioglicerol y EDTA (Grupo TE) mostró esencialmente la misma cantidad
de dímeros que la del tiempo 0, lo que indica que TP508 retuvo su
forma monomérica esencialmente libre de dímeros incluso después de
dos meses de almacenamiento en presencia de tioglicerol y EDTA con
sólo 10% del aducto TP508-tioglicerol.
Aproximadamente el 80% de TP508 permaneció como monómero en la
muestra que contenía EDTA (Grupo E) o EDTA c/N2 (Grupo EN). Tener
manta de nitrógeno durante la preparación de geles no parece afectar
la dimerización. La muestra que contiene tioglicerol (Grupo T)
mostró que aproximadamente el 60% de TP508 retuvo su forma
monomérica y aproximadamente el 40% restante de TP508 formó un
aducto TP508-tioglicerol. Estos resultados
demuestran que EDTA y las sustancias químicas que contienen tio- se
pueden utilizar para estabilizar TP508 de la dimerización.
Los siguientes antioxidantes fueron evaluados
por su capacidad de inhibir la dimerización de TP508 en combinación
con EDTA. El % normal utilizado en la formulación se muestra en la
Tabla 4:
Se preparó y utilizó una base de gel (17%
Pluronic, 0,0004% EDTA y citrato tamponado, pH 5.0 con
preservantes). Cada tipo de antioxidante (% bajo o alto) se añadió
a la concentración deseada. Luego, TP508 fue añadido al gel para
dar una concentración de 50 \mug/ml. Las muestras se incubaron a
4ºC durante 3 semanas. Luego se diluyeron 100 \mul de la muestra
con 900 \mul de TFA al 0,1% y se analizaron por HPLC según el
método descrito en el Ejemplo 1. Se analizó un estándar antes del
análisis de la muestra. También se analizó un gel blanco con
preservantes y antioxidantes.
Los resultados se muestran abajo en la Tabla 5.
En resumen, TP508 fue muy estable a una concentración alta de
antioxidantes a 4ºC durante tres semanas. A excepción del ácido
ascórbico, las concentraciones bajas de antioxidantes fueron también
eficaces.
Se evaluaron las preparaciones de muestras
tamponadas con 10 \muM de EDTA a pH diferente y a pH 5,5 con
adición de antioxidantes para valorar su capacidad de inhibir la
dimerización de TP508 y la formación de otras formas moleculares.
Las muestras evaluadas a varios pH y el por ciento de oxidante se
muestran en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó TP508 en citrato tamponado 50 mM
desde un pH 4.5 hasta 6,0 con 10 mM de EDTA. Las muestras se
filtraron, se esterilizaron y se incubaron a temperatura ambiente
alejadas de cualquier fuente de luz. A puntos de tiempo indicados,
cada muestra fue analizada por HPLC para determinar la concentración
de monómero TP508 (Tabla 7), porcentaje de dímero (Tabla 8),
porcentaje de aducto (Tabla 9), y entidades moleculares desconocidas
(Tabla 10).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los resultados muestran que todos los
antioxidantes evaluados en este estudio previenen o reducen la
dimerización de TP508 como se muestra en la Tabla 8 con relación a
lo que se forma en tampones de citrato con un pH que oscila entre
4.5 y 6,0. Los resultados de la Tabla 9 muestran que la metionina es
incapaz de crear aductos de TP508 debido a la carencia de un grupo
tiol. Estos resultados sugieren que el mejor pH para inhibir la
formación de dímeros de TP508 fue a pH 6,0 de este experimento sin
ningún antioxidante. Con la adición de 0,5% (p/v) de metionina a pH
5,5, se obtuvo el índice más lento (0.0183) mostrado en la Tabla 10.
El índice de formación desconocida es inversamente proporcional al
pH de 4.5 a 6,0, lo que indica que TP508 es propenso a la
hidrólisis ácida en este sistema tamponado. También, en este
experimento, la metionina no previno o causó la formación
desconocida. En resumen la metionina parece ser el mejor
antioxidante para prevenir o reducir la dimerización de TP508 sin
formar aductos TP508 y el índice más lento de la formación pico
desconocida estuvo a pH 6,0 en este experimento.
Los quelantes divalentes, ácido
dietilen-triamino-penta-acético
(DTPA) y ácido bato-fenantrolina disulfónico
(BPADA), que se conocen por la quelación de un ión de cobre, se evaluaron para conocer su capacidad de inhibir la formación del dímero TP508.
(BPADA), que se conocen por la quelación de un ión de cobre, se evaluaron para conocer su capacidad de inhibir la formación del dímero TP508.
A. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4
B. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4 con 10 uM
DTPA
C. 50 mM acetato/ 100 mM NaCl, pH 5.4 con 10 uM
BPADA
TP508 (10 ug/ml) se incubó con o sin agentes
quelantes en tubos de centrífuga de polipropileno a temperaturas
ambientes y se analizaron en los puntos de tiempo indicados mediante
electrofóresis capilar para monitorear cualquier formación de
dímeros.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados muestran que los agentes
quelantes además de EDTA también pueden estabilizar a TP508 para
evitar o reducir la formación de dímeros.
Se añadió TP508 (3,60 mg., Bachem Fmoc) a geles
Pluronic (72 ml), teniendo como resultado una concentración de 50
ug/ml en un beaker de cristal de 100 ml con una barra de agitación
magnética. Los geles se removieron a 4ºC durante 1 hora para
facilitar la mezcla completa. Para la Muestra D, los geles fueron
removidos bajo una atmósfera de nitrógeno usando un manta de gas
de nitrógeno. Luego los geles se llenaron por el borde de un bulbo
de polipropileno de 1 ml. El frasco fue cubierto con una tapa rayada
de Teflón para evitar la introducción de cualquier burbuja de aire
en los geles. Las muestras se almacenaron a 4ºC o en la gaveta
(25ºC) lejos de la luz.
En una formulación comercial, TP508 podría
añadirse a un gel completamente formulado o a una fase intermedia
que contiene estabilizadores apropiados como se describe en el
Ejemplo 3, Tabla 3.
Mientras esta invención se ha mostrado en
particular y descrito con referencias a expresiones preferidas, se
entenderá por aquellos expertos en la técnica, que se pueden
realizar varios cambios de forma y detalles sin apartarse del
alcance de la invención abarcado por las reivindicaciones
añadidas.
<110> The Board of Regents, El Sistema de
la Universidad de Texas
\hskip1cmHobson, David W._
\hskip1cmCrowther, Roger S._
\hskip1cmCarney, Darrel H.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE LOS
DERIVADOS PEPTIDICOS DE TROMBINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 3033.1009-004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/533,730
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-12-31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en la posición 1 está
opcionalmente N-acilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está
opcionalmente C-aminada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly
Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en la posición 1 está
opcionalmente N-acilada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa-Phe, Met, Leu,
His o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está
opcionalmente C-aminada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly
Asp Ala Cys Xaa Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de Trombina Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly
Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina es insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está
amidada con NH_{2}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly
Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El ácido aspártico en la posición 1
está opcionalmente N-acilado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fenilalanina en la posición 33 está
opcionalmente C-amidada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp
Glu Gly Lys Arg Gly}
\sac{Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro
Phe Val Met Lys Ser Pro}
\sac{Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El ácido aspártico en la posición1
está opcionalmente N-acilado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Glu o Gln
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa = Phe, Met, Leu, His o Val
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fenilalanina en la posición 33 está
opcionalmente C-amidada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp
Glu Gly Lys Arg Gly}
\sac{Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro
Phe Val Met Lys Ser Pro}
\sac{Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Alanina en al posición 1 está
insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> VARIANTE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Valina en la posición 23 está
insustituida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly
Asp Ala Cys Glu Gly}
\sac{Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de secuencia conservada de
esterasa de serina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe
Val}
Claims (30)
1. Una composición farmacéutica que
comprende:
- a)
- un derivado peptídico de trombina con una longitud de 14 a 23 aminoácidos y que comprende la secuencia de aminoácidos Asp-Ala-R, en la que R es el dominio conservado de la esterasa de la serina; y
- b)
- un agente quelante y/o un compuesto que contiene tiol aceptable desde el punto de vista farmacéutico.
2. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que además comprende un antioxidante.
3. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el agente quelante es un agente quelante de
cobre.
4. La composición farmacéutica según la
reivindicación 3, donde el agente quelante de cobre se selecciona
entre un grupo que consta de ácido
dietilen-triamino-penta-acético
(DTPA) y ácido batofenantrolina-disulfónico
(BPADA).
5. La composición farmacéutica según la
reivindicación 3, donde el agente quelante de cobre se selecciona
entre un grupo que consta de ácido
etilen-diamino-tetra-acético
(EDTA), penicilamina, trientina,
N,N'-dietil-ditio-carbamato
(DDC), 2,3,2'-tetramina
(2,3,2'-tet), neocuproína,
N,N,N',N'-tetrakis(2-piridil-metil)etilen-diamina
(TPEN), 1,10-fenantrolina (PHE),
tetraetilen-pentamina,
trietilen-tetramina y
tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP).
6. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde la composición farmacéutica comprende un
compuesto que contiene un tiol aceptable desde el punto de vista
farmacéutico seleccionado entre un grupo que consta de tioglicerol,
mercaptoetanol, tioglicol, tiodiglicol, cisteína, tioglucosa,
ditiotreitol (DTT), y
ditio-bis-maleímido-etano
(DTME).
7. La composición farmacéutica según la
reivindicación 2, donde el antioxidante se selecciona entre un grupo
que consta de tocoferol, cisteína, metionina, glutatión,
tocotrienol, dimetil-glicina, betaína, hidroxianisol
butilado, hidroxitolueno butilado, turmerin, vitamina E, ácido
ascórbico, palmitato de ascorbilo y ácido tioglicólico
8. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1 que comprende un agente quelante de cobre y un
compuesto que contiene un tiol aceptable desde el punto de vista
farmacéutico.
9. La composición farmacéutica según la
reivindicación 2, donde el compuesto comprende un agente quelante de
cobre y un antioxidante.
10. La composición farmacéutica según la
reivindicación 9, donde el antioxidante es la metionina.
11. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es:
- a)
- R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-!Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2 (SEQ ID NO: 1), donde:
- R1 es -H o R3-C(O)-;
- R2 es -OH o -NR4R5;
- R3 es -H o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}; y
- R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados juntos con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico no aromático;
- b)
- un fragmento con terminación en N truncado de a) que tiene por lo menos catorce aminoácidos; o
- c)
- un fragmento C-terminal truncado de a) que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos.
12. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es:
- a)
- R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2 (SEQ ID NO: 2), donde:
- X1 es Glu o Gln;
- X2 es Phe, Met, Leu, His, o Val;
- R1 es -H o R3-C(O)-;
- R2 es -OH o -NR4R5;
- R3 es -H o un grupo alquilo C_{1}-C_{6}; y
- R4 y R5 son independientemente -H, un grupo alquilo C_{1}-C_{6} o, tomados junto con el átomo de nitrógeno con el que se enlazan, un grupo heterocíclico no aromático;
- b)
- un fragmento con terminación en N truncado de a) que tiene por lo menos catorce aminoácidos; o
- c)
- un fragmento C-terminal truncado de a) que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos.
13. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es un
polipéptido de 23 aminoácidos compuesto por
Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val
(SEQ ID NO: 3).
14. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es
H-Ala-Gly-Tyr-Lis-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2}
(SEQ ID NO: 4).
(SEQ ID NO: 4).
15. La composición farmacéutica según la
reivindicación 14, donde la composición comprende un agente quelante
y un antioxidante.
16. La composición farmacéutica según la
reivindicación 15, donde el antioxidante es metionina.
17. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, donde el derivado peptídico de trombina es un
fragmento con terminación en N truncado que tiene por lo menos
catorce aminoácidos de, o un fragmento C-terminal
truncado que tiene por lo menos dieciocho aminoácidos de,
H-Ala-my-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2}
(SEQ ID NO: 4), opcionalmente amidado al extremo
C-terminal en forma de
C(O)-NH_{2}.
18. La composición farmacéutica según la
reivindicación 1, que se selecciona entre el grupo que consta de una
tableta; una cápsula; una formulación de micropartículas; una
solución; una suspensión o elixir, una formulación a liberación
sostenida, una formulación inyectable; una formulación implantable y
una formulación tópica.
19. Uso de la composición farmacéutica de la
reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para activar el
receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
20. Uso según la reivindicación 19, donde el
medicamento es para promover el crecimiento o reparación del
cartílago.
21. Uso según la reivindicación 19, donde el
medicamento se utiliza para tratar a un sujeto con necesidad de
crecimiento óseo.
22. Uso según la reivindicación 19, donde el
medicamento se utiliza para promover la cicatrización de
heridas.
23. Uso según la reivindicación 22, donde la
herida es una herida crónica.
24. Uso según la reivindicación 19, donde el
medicamento se utiliza para promover la reparación cardíaca o
inhibir la restenosis.
25. Uso de una composición farmacéutica, donde
la composición farmacéutica es un gel, que comprende:
- a)
- H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH_{2} (SEQ ID NO. 4);
- b)
- un agente quelante; y
- c)
- un antioxidante en la fabricación de un medicamento para activar el receptor de trombina no activado proteolíticamente en un sujeto.
26. Uso según la reivindicación 25, donde el
medicamento se utiliza para promover el crecimiento o reparación del
cartílago.
27. Uso según la reivindicación 25, donde el
medicamento se utiliza para tratar a un sujeto con necesidad de
crecimiento óseo.
28. Uso según la reivindicación 25, donde el
medicamento se utiliza para promover la cicatrización de
heridas.
29. Uso según la reivindicación 28, donde la
herida es una herida crónica.
30. Uso según la reivindicación 25, donde el
medicamento se utiliza para promover la reparación cardíaca o
inhibir la restenosis.
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