ES2287959T3 - Receptores clonados de peptidos 2 de tipo glucagon. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS NUCLEOTIDOS Y SECUENCIAS DE ACIDOS AMINADOS QUE CODIFICAN UNOS RECEPTORES DE PEPTIDOS SIMILARES AL GLUCAGON, CELULAS HUESPEDES DE RECOMBINACION TRANSFORMADAS POR DICHOS NUCLEOTIDOS, ASI COMO A SUS PROCEDIMIENTOS DE USO ESPECIALMENTE EN LA INVESTIGACION DE MEDICAMENTOS.

Description

Receptores clonados de péptidos 2 de tipo glucagón.

Campo de la invención

La invención hace referencia al campo de la biología molecular. Se refiere, más particularmente, a receptores clonados de péptidos 2 de tipo glucagón y su uso en el cribado de fármacos y en aplicaciones relacionadas.

Antecedentes de la invención

El péptido 2 de tipo glucagón (GLP-2) es un péptido de 33 aminoácidos, que se expresa en un tejido determinado a partir del gen de glucagón pleiotrófico y se encuentra altamente relacionado en términos de secuencia aminoacídica al péptido 1 de glucagón y de tipo glucagón (GLP-1). Las formas de los mamíferos de GLP-2 se encuentran altamente conservadas: por ejemplo, las formas humanas y de degu (un roedor de Sur-América) se diferencian por uno y tres aminoácidos respectivamente del GLP-2 de rata. Recientemente se ha demostrado que el GLP-2 es una hormona peptídica intestinotrófica; cuando se da de forma exógena, el GLP-2 puede producir un aumento marcado en la proliferación del epitelio intestinal pequeño de los ratones de la prueba (Drucker et al, (1996) PNAS, 93:7911-7961). Más recientemente, se ha mostrado que el GLP-2 aumenta la velocidad de transporte máxima de D-Glucosa a través de la membrana vasolateral intestinal (Cheeseman and Tseng: American Journal of Physiology (1996) 271:G477-G482). La WO 93/19175 revela la clonación del receptor GLP-1 de rata y humano.

Para acelerar la investigación en la biología gastrointestinal y el desarrollo de fármacos útiles en el tratamiento de varias condiciones médicas incluyendo desórdenes gastrointestinales, será útil proporcionar el receptor a través del cual se medía los efectos de GLP-2.

Resumen de la invención

El receptor de GLP-2 ha sido clonado y caracterizado. Como consecuencia, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica el receptor de GLP-2, en particular incluyendo las formas de los mamíferos y sus homólogos como, en unas realizaciones específicas, las formas de rata y humanas. En aspectos de la invención, el polinucleótido que codifica para un receptor de GLP-2 se utiliza para la expresión para obtener una proteína de receptor funcional y, en una forma identificada opcionalmente, para la clonación génica adicional para identificar proteínas de receptor estructuralmente relacionadas. En aspectos relacionados de la invención, las versiones anti-sentido de los polinucleótidos que codifican el receptor de GLP-2 y sus fragmentos se obtienen y se utilizan para regular la expresión del receptor de GLP-2.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona el receptor de GLP-2 como producto de la producción recombinante en un huésped celular. En aspectos relacionados, se proporcionan células huésped recombinantes que expresan el receptor de GLP-2, así como membranas que soportan el receptor derivadas de estas células, y construcciones de expresión en las que el polinucleótido que codifica para el receptor de GLP-2 se encuentra unido a controles de expresión funcionales en la célula huésped seleccionada.

En otro de sus aspectos, el receptor de GLP-2 se utiliza en el programa de cribado de moléculas químicas para identificar ligandos del receptor de GLP-2. Este método comprende los pasos de incubar los ligandos candidatos con una célula que produce receptor de GLP-2 de la presente invención, o con una preparación de membrana derivada de ahí, y después midiendo el grado de unión. Utilizando las células que expresan un receptor de GLP-2 acoplado funcionalmente a un sistema de segundo mensajero, de tal forma que la unión se pueda determinar indirectamente, para mostrar el ligando frente a la actividad, mediante la detección de un reportero apropiado.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona anticuerpos dirigidos al receptor de GLP-2, para el uso por ejemplo en procedimientos de diagnóstico.

La invención se describe además con referencia a las siguientes figuras en las que:

Breve referencia a las figuras

La Figura 1 revela una secuencia de cADN (SEQ ID NO: 1), nucleótidos 137-1786 que codifican el receptor de GLP-2 de rata dónde los pares de bases ambiguos se indican utilizando la nomenclatura IUB estándar (R: A o G, Y: C o T, M: A o C, K: G o T, S: G o C, W: A o T).

La Figura 2 revela la secuencia aminoacídica del producto de expresión (SEQ ID NO: 2) del cADN de la Figura 1.

La Figura 3 ilustra las potencias relativas del péptido GLP-2 y los péptidos GLP-1 para el receptor codificad mediante la SEQ ID NO: 1.

La Figura 4 revela una secuencia de cADN de 667 nucleótidos (SEQ ID NO: 9) que codifica un fragmento de 222 aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de un receptor de GLP-2 humano.

La Figura 5 revela la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) expresada a partir del cADN de la Figura 4.

La Figura 6 revela una secuencia de cADN (SEQ ID NO: 11), nucleótidos 122-1780 que codifican el receptor de GLP-2 humano.

La Figura 7 revela la secuencia de aminoácidos del producto de expresión (SEQ ID NO: 12) a partir del cADN de la Figura 6.

La Figura 8 ilustra la activación funcional mediante el péptido de GLP-2 del receptor humano codificado mediante la SEQ ID NO: 11 (Figura 8).

La Figura 9 compara las secuencias de aminoácidos del receptor de GLP-2 de rata y el receptor de GLP-2 humano.

La Figura 10 compara las secuencias de aminoácidos del receptor de GLP-2 de rata y el receptor de GLP-2 humano frente el receptor de GLP-1 de rata.

Descripción detallada y realizaciones preferidas

La invención se refiere a los polinucleótidos, en su forma aislada, que codifican para el receptor de GLP-2s. Tal y como se utiliza aquí "aislado" significa separado de los polinucleótidos que codifican otras proteínas. En el contexto de librerías de polinucleótido, por ejemplo, el polinucleótido que codifica para el receptor de GLP-2 se considera "aislado" cuando se ha seleccionado, y en consecuencia se ha eliminado la asociación con otros polinucleótidos dentro de la librería. Estos polinucleótidos se pueden encontrar en la forma de ARN, o en la forma de ADN incluyendo cADN, ADN genómico y ADN sintético. Los receptores de GLP-2s se caracterizan por características estructurales comunes a la clase de los receptores acoplados a proteína G, incluyendo siete regiones transmembrana, y mediante las propiedades funcionales de unirse al péptido GLP-2 de forma selectiva, es decir, preferentemente, el péptido de GLP-1. Esta unión selectiva se revela como una mayor unión significativa estadísticamente a GLP-2 respeto a GLP-1, en el contexto del ensayo seleccionado para medir esta afinidad. Cuando se expresa funcionalmente en una célula huésped, es decir, en conexión operable con un sistema de segundo mensajero sensible los receptores de GLP-2s son capaces además de responder a la unión de GLP-2 mediante la transducción del señal. En este sentido, la actividad de un receptor acoplado a proteína G como un receptor de GLP-2 se puede medir utilizando cualquiera de una variedad de ensayos funcionales apropiados en los que la activación del receptor resulta en un cambio detectable a nivel de alguno de los sistemas de segundo mensajero, como el adenilato ciclasa, la movilización de calcio, los productos de hidrólisis de fosfolípido de inositol o el guanililo ciclasa.

Con referencia a la Figura 9 y la Figura 10, que revelan homologías a través de las secuencia de aminoácido que representan el receptor de GLP-2s de rata y humano, las regiones del 100% de identidad se indican mediante barras verticales sólidas. En las realizaciones de la invención, los receptores de GLP-2s se definen estructuralmente como receptores que incorporan estas regiones de secuencia aminoacídica y que también exhiben la característica funcional de unión del péptido GLP-2 de forma selectiva, respeto al péptido GLP-1. En uno de los ejemplos de realización más preferida, la estructura del receptor de GLP-2 también incorpora aquellos aminoácidos que, a través del receptor de las especies de rata y humano, se encuentran altamente conservados (indicados mediante ':'). En estas posiciones, será apreciable que la secuencia puede contener cualquier aminoácido dentro de la familia de aminoácidos altamente conservados a la que pertenecen los aminoácidos identificados. En unas realizaciones todavía más preferidas, los receptores de GLP-2s presentan una estructura que además incorpora a los aminoácidos conservados de forma moderada (indicados mediante '.') que significa, que en estas posiciones, los aminoácidos dentro de la familia a la que pertenecen se encuentran conservados de forma moderada. Además de estas secuencias, la estructura del receptor de GLP-2 puede
variar ampliamente en realizaciones de la invención, ya que permite sustituciones de aminoácidos no conservativas.

En uno de los ejemplos de realización de la invención, el receptor de GLP-2 es un receptor de GLP-2 de rata que presenta la secuencia aminoacídica de SEQ ID NO:2. En uno de los ejemplos de realización específica de la invención, este receptor de GLP-2 de rata está codificado por la secuencia de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1. Este polinucleótido que codifica el receptor de GLP-2 particular, también denominado como el gen WBR, es un cADN de origen de rata. El producto de expresión de este polinucleótido incorpora la forma madura del receptor de GLP- 2, y de forma adicional incorpora una señal de secreción que se elimina antes de integrarse a la membrana del producto de receptor de GLP-2 maduro. Esta secuencia señal se puede presentar de forma natural sobre los polipéptidos o se puede reemplazar con una señal de secreción equivalente funcionalmente que es heterólogo al receptor de GLP-2. Esta señal de secreción de reemplazo dependerá del sistema de expresión que se utiliza y normalmente, pero no esencialmente será endógeno al huésped seleccionado y, también normalmente pero no esencialmente, será homólogo a las secuencias que controlan la expresión seleccionadas.

El producto del receptor de GLP-2 de rata expresado (Figura 2, SEQ ID NO: 2) se caracteriza estructuralmente como una sola cadena polipeptídica de 550 aminoácidos que presenta un peso molecular pronosticado de 72kDa. Se han identificado dos sitios de inicio de traducción funcional del receptor de GLP-2 de rata, estos son los codones que codifican la metionina 1 y la metionina 42 de la SEQ ID NO:2. Sin deseo a limitarse, por analogía con el receptor de GLP-1, se cree que los residuos de 1-66 de la SEQ ID NO:2 se separan para proporcionar una proteína madura (es decir, la secuencia aminoacídica del receptor ya que se hace presente en la membrana celular) de 484 aminoácidos. Con respeto a los dominios estructurales de este receptor de GLP-2, los análisis de hidropatía y los alineamientos de secuencias con los miembros relacionados de esta subfamilia de receptores acoplados a proteína G indican siete dominios transmembrana, uno que abarca los residuos 181-203 inclusive (TM 1), otro que abarca los residuos 211-230 (TM II), un tercero que abarca los residuos 262-285 (TM III), un cuarto que abarca los residuos 300-321 (TM VI), un quinto que abarca los residuos 339-362 (TM V), un sexto que abarca los residuos 386-405 (TM VI) y un séptimo que abarca los residuos 422-441 (TM VII). Basándose en esta asignación, es muy probable que este receptor de GLP-2, en su forma de unido a la membrana natural, consista de un dominio N-terminal extracelular, seguido por un dominio transmembrana que contiene siete regiones hidrofóbicas y un dominio C-terminal de los aminoácidos 442-550 intracelular. La proteína exhibe el mayor grado de homología con el receptor de GLP-1 de rata con un 49% de identidad a nivel aminoacídico.

En uno de los ejemplos de realización relacionada, el receptor de GLP-2 es de origen humano (SEQ ID NO: 9) e incorpora el fragmento de receptor humano de GLP-2 que presenta los aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

Este polinucleótido se aisló utilizando la secuencia de cADN de rata tal y como se describe de forma general más adelante y tal y como se detalla en el Ejemplo 3. En uno de los ejemplos de realización relacionada adicional de la invención, el cADN es de origen humano (SEQ ID NO: 11) y codifica el receptor de GLP-2 humano en toda su longitud presentando los residuos 67-533 de la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 12. El producto precursor del receptor de GLP-2 humano (Figura 7, SEQ ID NO: 12) se caracteriza estucturalmente como una cadena polipeptídica de 553 aminoácidos que presenta un peso molecular pronosticado de 72 kDa. Se cree que, tal y como para el receptor de GLP-2 de rata, esta secuencia, esta forma de precursor del receptor de GLP-2 humano incorpora una secuencia señal N-terminal, que se puede sustituir mediante una secuencia señal heteróloga equivalente funcionalmente. Sin deseos de limitar se cree que la forma madura del receptor de GLP-2 humano resulta después de la separación de los residuos 1-66 de la SEQ ID NO:12 (Figura 7). Con respecto a los dominios estructurales de este receptor de GLP-2, los análisis de hidropatía y el alineamiento de secuencia con los miembros relacionados de esta sub-familia de receptores acoplados a proteína G indica siete dominios transmembrana putativos, uno que abarca los residuos 181-203 inclusive (TM I), otro que abarca los residuos 211-230 (TM II), un tercero que abarca los residuos 262- 285 (TM III), un cuarto que abarca los residuos 300-321 (TM IV), un quinto que abarca los residuos 339-362 (TM V), un sexto que abarca los residuos 386-405 (TM VI), y un séptimo que abarca los residuos 422-441 (TM VII). Basándose en esta asignación, parece que este receptor de GLP-2, en su forma unida a la membrana natural, consiste en un dominio N-terminal extracelular, seguido por una región hidrofóbica que contiene siete dominios transmembrana combinados con seis dominio hidrofílicos cortos, y un dominio intracelular, que se pronostica que abarca los residuos 442-553. Una segunda forma de este receptor de GLP-2 incluida por la invención presenta un sitio de inicio de traducción en el codón de metionina en la posición 26 de la secuencia aminoacídica que se presenta en la Figura 7 de SEQ ID No. 12. La cadena polipeptídica de 528 aminoácidos resultante también consiste en un dominio extracelular, siete dominios transmembrana, y un dominio C-terminal intracelular, y es al menos un 95% idéntico a nivel de secuencia a los residuos 26-553 de la secuencia presentada en la Figura 7, SEQ ID NO: 12.

En otra realización, la invención proporciona las secuencias de polinucleótido del receptor de GLP-2 y sus fragmentos de secuencia únicos como herramienta útil para identificar y asilar los polinucleótidos relacionados estructuralmente. Para facilitar el aislamiento de los genes homólogos del receptor de GLP-2 de rata que también son codificantes del receptor de GLP-2, se desean condiciones de alta estringencia para identificar los homólogos que presentan al menos el 80% (estringencia media) de homología de identidad de secuencia a nivel de polinucleótido del gen del receptor. Más deseablemente los homólogos del gen son el 90% idénticos, (alta estringencia) y más deseablemente presentan al menos un 95% (alta estringencia) de identidad cuando se comparan respeto a WBR. Preferentemente, los homólogos de WBR aislados se caracterizan en qué (1) se pueden amplificar utilizando los iniciadores de PCR de la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y (2) se unen al detector de la SEQ ID NO: 5 bajo condiciones de alta estringencia.

De forma todavía más preferible, los homólogos aisaldos son aquellos que se unen, bajo condiciones de alta estringencia, con regiones consenso de los polinucleótidos que codifican el receptor de GLP-2, es decir, aquellas regiones de los polinucleótidos que codifican los receptores de GLP-2 de rata y humanos que son idénticos y, respeto a las secuencias que codifican el receptor de GLP-1, también son únicas a los polinucleótidos que codifican el receptor de GLP-2. El alineamiento de esta naturaleza revela un número de regiones consenso para el GLP-2: por ejemplo los nucleótidos que abarcan desde 1460-1786. En uno de los ejemplos de realización de la invención, estas secuencias, y sus complementos, constituyen fragmentos de polinucleótidos útiles, tal y como se describe para el gen intacto, para identificar polinucleótidos relacionados estructuralmente con el receptor de GLP-2 humano y de rata.

En uno de los ejemplos de realización relacionada, la secuencia de cADN o los fragmentos únicos del receptor de GLP-2, más preferiblemente el receptor de GLP-2 humano, se puede utilizar de forma marcada apropiadamente, por ejemplo, p^{32}Marcado, para el diagnóstico de las condiciones asociadas con la expresión aberrante del receptor de GLP-2. Por ejemplo, sobre o bajo la expresión o la expresión en un tejido inapropiado. En uno de los ejemplos de realización apropiada los iniciadores de la PCR (por ejemplo, regiones únicas al receptor de GLP-2 pero conservadas entre las especies) se pueden utilizar en forma de diagnóstico para identificar la estructura aberrante o los niveles de ARNm de receptor de GLP-2, por ejemplo, asociados con los estados de enfermedad heredados o adquiridos.

Se ha encontrado que el receptor de GLP-2 de humano se encuentra en el cromosoma 17P13. Así pues, en uno de los ejemplos de realización adicional, la invención proporciona el producto de expresión a partir de este locus que hibridiza respecto al polinucleótido del receptor de GLP-2 de humano (Figura 6; SEQ ID NO: 11) bajo condiciones rigurosas.

Como material fuente para aislar los homólogos que codifican el receptor de GLP-2 de rata que el gen de polinucleótido que codifican el receptor de GLP-2, es deseable pero no necesario utilizar librerías de tejido fetal o maduro del hipotálamo, yeyunal, cerebelo o estómago obtenidos a partir de leas especies vertebradas apuntadas para el aislamiento del receptor. La invención como consecuencia incluye no solo polinucleótidos que codifican el receptor de GLP-2 de rata de SEQ ID NO:1, también sus homólogos estructurales y particularmente aquellos que codifican para proteínas que presentan las propiedades del receptor de GLP-2. Tal y como se ejemplifica más adelante, el gen de WBR se ha utilizado de forma exitosa como material de partida para clonar el homólogo humano del receptor de GLP-2 de rata. Así pues, la invención proporciona polinucleótidos que codifican el receptor de GLP-2s, que incluyen el receptor de GLP-2 de rata y los homólogos de vertebrado, particularmente sus homólogos de mamífero incluyendo los homólogos de humanos, así como las variantes sintéticas de éstos.

Se apreciará que estos homólogos también se pueden identificar en las librerías mediante el cribado, tal y como se indica, con fragmentos del gen de recepto de rata o el homólogo humano, que incorpora al menos 15 nucleótidos, y preferentemente al menos 25 nucleótidos. Con referencia a la SEQ ID NO: 1 y el numerado de nucleótidos que aparece, los fragmentos de nucleótidos adecuados incluyen además de los fragmentos de nucleótido consenso indicados anteriormente, aquellos que se corresponden a nivel de secuencia con el dominio de unión de GLP-2 extracelular, y las regiones transmembrana estipuladas y la porción C-terminal del receptor.

Técnicamente, la identificación de los genes del receptor de GLP-2 se puede conseguir mediante la aplicación de las técnicas de hibridización estándar o amplificación a una librería de polinucleótidos derivada de un tejido. Una gran variedad de estas librerías de encuentran comercialmente disponibles. Cuando se requiere la construcción de una librería de cADN, se aplican técnicas establecidas. Por ejemplo, el aislamiento del homólogo de WBR normalmente conllevará la extracción del ARN mensajero total a partir de la fuente fresca del tejido, como el tejido del hipotálamo, el yeyunal, el estómago o el cerebelo, preferentemente el tejido del hipotálamo o las líneas celulares derivadas de estos tejidos, seguido por la conversión del mensaje a cADN y la formación de una librería en por ejemplo un plásmido de bacteria, más habitualmente un bacteriófago.

Este bacteriófago que contiene fragmentos del ADN normalmente se crece mediante el sembrado sobre una placa de bacteria E. coli susceptible, de forma que las placas de fago individual o las colonias se pueden aislar. El ADN llevado a cabo por la colonia de fagos entonces normalmente se inmoviliza en una membrana de nitrocelulosa o una membrana de hibridación basada en nylon, y después se hibridiza, bajo condiciones controladas cuidadosamente, a una secuencia de sonda marcada radiactivamente (o de otra forma) para identificar la colonia de fagos particular que lleva el fragmento de ADN de interés particular, en este caso un homólogo de GLP-2 de rata o humano. El fago que lleva el gen particular de interés entonces se purifica lejos de todos los otros fagos de la librería, para que el gen ajeno sea más fácilmente caracterizado. Normalmente, el gen o una porción de éste entonces se aíslan mediante la subclonación en un vector plasmídico por comodidad, especialmente con respecto a la determinación total de su secuencia de ADN.

Como alternativa para obtener el ADN que codifica para GLP-2 como un inserto de ADN de una librería de cADN disponible o construida, por la presente divulgación se puede sintetizar de novo utilizando técnicas de síntesis de gen establecidas. Debido a la longitud del los ADNs que codifican el receptor de GLP-2 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11, la aplicación de la síntesis automática puede requerir la construcción génica por etapas, en qué las regiones del gen de hasta 300 nucleótidos de longitud se sintetizan de forma individual y después se ligan en una sucesión correcta para el ensamblaje final. Las regiones génicas sintetizadas de forma individual se pueden amplificar por PCR. La aplicación de la síntesis automática normalmente se aplicará a regiones o fragmentos específicas que se sintetizan del gen y uniéndolos, normalmente mediante solapamientos diseñados, en una correcta sucesión para formar la secuencia del gen final. En este caso, como más largo sean los bloques de construcción del oligonucleótido, menos uniones se necesitarán, resultando más fácil el ensamblaje.

La aplicación de las técnicas de síntesis génicas automatizadas proporciona una oportunidad de generar variantes de secuencia del gen del receptor de GLP-2 de origen natural. Se apreciará, por ejemplo, que los polinucleótidos que codifican para el receptor de GLP-2 descritos aquí se pueden generar mediante la sustitución de 1 a 20 codones para aquellos que se representan en las secuencias de polinucleótido de origen natural que se proporcionan aquí y estas "variantes" se encuentran dentro del objetivo de la presente invención. Además, los polinucleótidos que codifican para las variantes sintéticas del receptor de GLP-2 proporcionados aquí se pueden generar con la incorporación de 1 a 20, por ejemplo, de 1 a 5, sustituciones o deleciones o adiciones de aminoácidos. Los sitios preferidos para esta modificación incluyen áreas de no homología entre la secuencia de rata y humano, por ejemplo los rangos de aminoácidos de 70-92, de 328-350 y de 475-504. Ya que normalmente se desea retener el perfil de unión del ligando natural del receptor para propósitos de cribado, se desea limitar las sustituciones de aminoácidos, por ejemplo a las denominadas sustituciones conservativas en las que los aminoácidos de cara similar se sustituyen (Fig. 9), y limitar las sustituciones a aquellos sitios menos críticos para la actividad del receptor. Por ejemplo, la sustitución de nucleótidos "G" y "A" por nucleótidos "A" y "G" respectivamente en las posiciones 374 y 375 de la secuencia de cADN humano de SEQ ID NO: 11; resultando en la sustitución del residuo de arginina de origen natural en la posición 85 de la SEQ ID NO: 12 por el residuo de ácido glutámico, proporciona un receptor funcional. Este receptor funcional se encuentra referido como la variante Glu^{85} del receptor de GLP-2 de humano.

Una vez obtenido el polinucleótido que codifica el receptor de GLP-2, el receptor de GLP-2 se puede producir de varias formas, incluyendo la trascripción in vitro y mediante la incorporación del ADN a un vector de expresión adecuado y la expresión en el huésped apropiado, por ejemplo en una bacteria como E. coli, en levadura o en una célula de insecto o de mamífero. La variedad de sistemas de expresión génicos se han adaptado para el uso con estos huéspedes y ahora se encuentran disponibles comercialmente, y cualquiera de estos se pueden seleccionar para conducir la expresión del ADN que codifica el receptor de GLP-2. Los vectores de expresión se pueden seleccionar para proporcionar las líneas celulares transformadas que expresan el ADN que codifica el receptor de forma temporal o de forma estable. Para la expresión temporal, las células huésped normalmente se transforman con un vector de expresión que contiene un origen de replicación funcional en una célula de mamífero. Para la expresión estable, estos orígenes de replicación son innecesarios, pero los vectores normalmente contendrán un gen que codifica para un producto que confiere sobre los transformantes una ventaja de supervivencia, para facilitar su selección como un gen que codifica
para la resistencia a neomicina, en este caso los transformantes se colocan en medios suplementados con neomicina.

Los sistemas de expresión, normalmente disponibles pero no exclusivamente en forma de vectores plasmídicos, incorporan casetes de expresión los componentes funcionales de los cuales incluyen secuencias que controlan la expresión constituidas por ADN y de forma opcional también péptidos señal que codifican las secuencias, que son reconocidas por el huésped y que facilitan la expresión del ADN que codifica el receptor cuando se une a su 5'. Los sistemas además incorporan secuencias de ADN que terminan la expresión cuando de encuentran unidas al 3' de la región que codifica el receptor. Así, para la expresión en el huésped celular de mamífero seleccionado, se genera un constructo de expresión de ADN recombinante en el que el ADN que codifica para el receptor se encuentra unido con las secuencias de ADN que controlan la expresión reconocidas por el huésped, y que incluyen una región 5' del ADN que codifica el receptor para conducir la expresión, y una región 3' para terminar la expresión.

Incluidos entre los varios sistemas de expresión de ADN recombinante que se pueden utilizar para conseguir la expresión de la célula de mamífero del ADN que codifica el receptor, se encuentran aquellos que explotan los promotores de los virus que infectan las células de mamífero, como el promotor del citomegalovirus (CMV), el virus Rous sarcoma (RSV), el virus simian (SV40), el virus de tumor mamario de murine (MMTV) y otros. También son útiles para conducir la expresión los promotores como el LTR de retroviruses, los promotores celulares de insecto como aquellos que se encuentran regulados por la temperatura, y aislados de Drosophila, así como los promotores del gen de mamífero como aquellos que se encuentran regulados por metales pesados, es decir, el promotor del gen de metalotioneina, y otros promotores inducibles de esteroide.

En otro de sus aspectos, la invención proporciona células o membranas derivadas de allí que se adaptan mediante la alteración genética para el uso, por ejemplo, en la identificación de los ligandos del receptor de GLP-2. En las realizaciones preferidas, estas células se adaptan genéticamente por la inserción del polinucleótido que codifica para un receptor de GLP-2. En las realizaciones particularmente preferidas, estas células incorporan una molécula de ADN recombinante, por ejemplo un constructo/vector de expresión, en el que el ADN que codifica para el receptor de GLP-2 y los elementos funcionales que controlan la expresión en el huésped se encuentran unidos de forma operable para conducir la expresión del ADN. Para la incorporación del receptor en las membranas de plasma celular, el vector se puede, si se desea, diseñar para proporcionar una secuencia de péptido señal heteróloga adecuada para sustituir el péptido señal codificado de forma natural dentro del ADN del receptor.

Las células que producen GLP-2 incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) por ejemplo de linaje K1 (ATCC CCL 61) incluyendo la variante Pro5 (ATCC CRL 1281); las células de tipo fibroblasto derivadas de riñón de mono verde de África transformadas de SV40 del linaje CV-1 ATCC CCL 70), del linaje COS-1 (ATCC CRL 1650) y del linaje COS-7 (ATCC CRL 1651); las L-células de murine, las células 3T3 de murine (ATCC CRL 1658), las células C127 de murine, células de riñón embrionarias humanas del linaje 293 (ATCC CRL 1573), células de carcinoma humano incluyendo aquellos del linaje HeLa (ATCC CCL 2), y células del neuroblastoma de las líneas IMR-32 (ATCC CCL 127), SK-N-MC (ATCC HTB 10) y SK-N-SH (ATCC HTB 11).

Para el uso en ensayos de cribado de ligandos, las líneas celulares que expresan el ADN que codifica el receptor se pueden almacenar congeladas para su uso posterior. Estos ensayos se pueden llevar a cabo con células intactas, o con preparaciones de membrana derivadas de estas células. Las preparaciones de membrana normalmente proporcionarán un sustrato más conveniente para los experimentos de unión de ligando, y en consecuencia se prefieren como sustratos de unión. Para preparar las preparaciones de membrana para el propósito de cribado, es decir, experimentos de unión de ligandos, las células intactas congeladas se homogenizan mientras se hallan en suspensiones de agua fría y una pastilla de membrana se recoge después de la centrifugación. El comprimido entonces se lava en agua fría, y se dializa para eliminar cualquiera de los ligandos de receptor de GLP-2 endógenos que si no competiría en la unión en los ensayos. Las membranas dializadas se pueden utilizar entonces como tal, o después del almacenamiento en la forma liofilizada, en el ensayo de unión de ligandos.

La unión de un ligando candidato a un receptor de GLP-2 seleccionado de la invención se puede conseguir normalmente utilizando una cantidad predeterminada de membrana derivada de célula (medida por ejemplo mediante la determinación de proteína), generalmente desde alrededor de 25 ug hasta 100 ug. Generalmente, los ensayos de unión competitiva serán útiles para evaluar la afinidad de un compuesto probado respeto a GLP-2. Este ensayo de unión competitiva se lleva a cabo mediante la incubación de una preparación de membrana con el péptido de GLP-2 radiomarcado, por ejemplo [H^{3}] o un análogo de GLP-2 radioiodinado, en presencia de un compuesto de prueba no marcado añadido a concentraciones que varían. Después de la incubación, se puede recuperar el GLP-2 unido desplazado o radiomarcado y se puede medir, para determinar las afinidades de unión relativas del compuesto de la prueba y el GLP-2 para el receptor de GLP-2 utilizado como sustrato. De este modo, las afinidades de varios compuestos para el receptor de GLP-2 se pueden medir.

De forma alternativa, la unión de un ligando candidato a un receptor de GLP-2 se puede conseguir utilizando un ensayo funcional. Utilizando esta aproximación, por ejemplo, las células intactas recogidas aproximadamente dos días después de la transfección transitoria o después de alrededor del mismo periodo después del sembrado de las células transfectadas estables se pueden utilizar para conseguir la unión del ligando. En uno de los ejemplos de realización preferida, las células 293 EBNA (Invitrogen Cat. R620-07) se transforman establemente con el vector pREP7 (Invitrogen Cat. V007-50) que incorpora de forma expresable un receptor de GLP-2. Después, la unión de un agonista (o utilizando un formato de base de competición de un antagonista) al receptor se puede discernir mediante la medida del nivel de cAMP intracelular. De forma más conveniente, el cAMP intracelular se mide de forma indirecta utilizando un sistema de reportero, en que un evento fácilmente mesurable y de forma preferible cuantificable indica el nivel de cAMP intracelular. Por ejemplo, midiendo el nivel de la expresión de un constructo génico reportero que presente la secuencia de polinucleótido bajo el control de un promotor que responde a cAMP. De forma alternativa, una medida del calcio intracelular, liberado a partir del almacenamiento como respuesta a un aumento del cAMP intracelular, se puede utilizar como indicador del nivel de cAMP intracelular, por ejemplo, mediante la incorporación a la célula transformada de una proteína que emite fluorescencias con la unión a calcio. En uno de los ejemplos de realización preferida, los niveles de cAMP intracelular se miden utilizando el kit EIA disponible comercialmente. Una ventaja adicional de la aproximación basada en la funcionalidad para conseguir la unión del ligando es que el sistema permite de forma automática un alto y ultra alto rendimiento a través del cribado de librerías químicas vas-
tas.

Como alternativa a utilizar células que expresan el ADN que codifica el receptor, la caracterización del ligando también se puede llevar a cabo utilizando células por ejemplo de oocitos de Xenopus, que producen receptor unido a la membrana funcional después de la introducción del ARN mensajero que codifica para el receptor de GLP-2. En este caso, el polinucleótido que codifica el receptor de GLP-2 de la invención normalmente se subclonaba a un vector plasmídico de forma que el gen introducido se puede transcribir de forma fácil a ARN mediante un promotor de transcripción de ARN adyacente subministrado por el vector plasmídico, por ejemplo los promotores T3 o T7 de bacteriofago. El ARN entonces se transcribe del gen insertado in vitro, y después se puede inyectar a oocitos de Xenopus. Cada oocito es una sola célula, pero es suficientemente grande para ser penetrada por una microaguja de tipo fino sin causar daño irreparable. Después de la inyección de nL volúmenes de una solución de ARN, los oocitos se dejan incubar durante varios días, hasta que se prueba la habilidad de los oocitos de responder a una molécula de ligando particular que se subministra en una solución bañada.

Los ligandos del receptor de GLP-2 candidato pueden variar ampliamente en estructura, y de forma más adecuada incluyen proteínas que se encuentran altamente relacionadas con el GLP-2 en términos de secuencia aminoacídica. Por ejemplo, los péptidos divulgados en las aplicaciones de patentes co-pendientes de Estados Unidos WO97/39031 y WO96/32414, se pueden cribar de forma útil para la actividad de unión del receptor de GLP-2.

Además de las secuencias del receptor de GLP-2 de origen natural funcionales quiméricas, los receptores, que incorporan porciones de secuencia del receptor de GLP-2 y los polinucleótidos que los codifican también son realizaciones de la invención. El receptor funcional quimérico de GLP-2s se construye mediante la combinación de las secuencias receptoras extracelulares de un receptor de GLP-2 con uno o más de los segmentos transmembrana e intracelular de los receptores acoplados a proteína G conocidos con el propósito de la prueba. Este concepto se demostró por Kobilka et al. (1988, Science 240:1310-1316) que creó una serie de receptores \alpha2-\beta2 adrenérgicos quiméricos (AR) mediante la inserción progresiva de cantidades mayores de secuencia trasnmembránica de \alpha2-AR al \beta2-AR. La actividad de unión de los agonistas conocidos cambió cuando la molécula cambió de la conformación \alpha2 a \beta2, y los elementos intermediarios mostraron una especificidad mezclada. La especificidad para la unión de antagonistas, sin embargo, se relacionó con la fuente del dominio VII transmembrana. La importancia del dominio transmembrana VII para el reconocimiento de ligando también se encontró en quimeras utilizando dos receptores de factor \alpha de levadura, y ello es significativo porque los receptores de levadura se clasifican como receptores misceláneos. Así, el papel funcional de los dominios específicos aparece conservado a través de la familia de receptores acoplados a proteína G de siete hélices transmembrana, independientemente de la categoría concreta a la que pertenezcan.

De forma paralela, los segmentos internos o los dominios citoplasmáticos de un receptor de GLP-2 particular se intercambian con los dominios análogos de un receptor acoplado a proteína G de siete hélices transmembrana y se utilizan para identificar los determinantes estructurales responsables del acoplamiento de los receptores a proteínas G triméricas (Dohlman et al. (1991) Annu Rev Biochem 60:653-688). Un receptor quimérico en el que los dominios V, VI, y los lazos intracelulares que conectan de \beta2-AR se sustituyeron por \alpha2-AR mostró que unía ligandos con especificidad por \alpha2-AR, pero estimulaba el adenilato ciclasa como el \beta2-AR. Esto demostró que para los receptores de tipo adrenérgico, el reconocimiento de proteínas G se encuentra presente en los dominios V y VI y su lazo enlazante. La situación opuesta se predijo y se observó para un quimera en el que el lazo V->VI de \alpha1-AR sustituyó el dominio correspondiente de \beta2-AR y el receptor resultante unió ligandos con especificidad por \beta2-AR y activó la proteína G mediante el movimiento de fosfatidilinositol de la forma \alpha1-AR. Finalmente, las quimeras construidas a partir de los receptores muscarínicos también mostraron que el lazo V->VI es el mayor determinante de la especificidad para la actividad de la proteína G.

Los receptores acoplados a proteína G de siete hélices transmembrana quiméricos o modificados que contienen sustituciones en las regiones extracelulares y transmembrana han mostrado que estas porciones del receptor determinan la especificidad de unión del ligando. Por ejemplo, dos residuos de Ser conservados en el dominio V de todos los receptores adrenérgicos y de D catecolamina son necesarios para una potente actividad agonista. Estas serinas se cree que forman enlaces de hidrógeno con el motivo catecol de los agonistas en el sitio de unión. De forma similar, un residuo de Asp presente en el dominio III de todos los receptores acoplados a proteína G de siete transmembrana que une las aminas biogénicas se cree que forma un par con el grupo amina del ligando en el sitio de unión.

Los receptores acoplados a proteína G de siete hélices transmembrana funcionales clonados se expresan en sistemas de expresión heterólogos y se consigue su actividad biológica (por ejemplo, Marullo et al. (1988) Proc Natl Acad Sci 85:7551-7555; King et al. (1990) Science 250:121-123). Un sistema heterólogo introduce genes para un receptor acoplado a proteína G de siete hélices transmembrana de mamífero y una proteína G de mamífero en las células de levadura. El receptor acoplado a proteína G transmembrana de siete se ha mostrado que presenta la especificidad y la afinidad del ligando apropiada y detecta la activación biológica apropiada -detención del crecimiento y cambios morfológicos- de las células de levadura.

Un procedimiento alternativo para testar los receptores quiméricos se basa en el procedimiento de utilizar el receptor purinérgico P_{2u} (P_{2u} ) tal y como se publica por Erb et al. (1993, Proc Natl Acad Sci 90:104411-104453). La función se prueba fácilmente en células de leucemia K562 cultivadas porque estas células carecen de los receptores P_{2u}. Las células K562 se transfieren con vectores de expresión que contienen P_{2u} normales o quiméricos y cargados con fura-a, prueba fluorescente de Ca++. La activación de los receptores P_{2u} ensamblados de forma correcta y funcionales con UTP o ATP extracelular mobiliza el Ca++ intracelular que reacciona con fura-a y se mide de forma espectrofluormétrica. Tal y como los receptores acoplados a proteína G de siete hélices transmembrana anteriores, los genes quiméricos se crean mediante la combinación de secuencias por segmentos receptivos extracelulares de cualquier polipéptido de receptores acoplados a proteína G de siete transmembrana nuevo descubierto con los nucleótidos para los segmentos transmembrana y intracelular de la molécula de P_{2u} conocida. El baño de las células K562 transfectadas en micropozos que contienen los ligandos apropiados provoca la unión y la actividad fluorescente que define los efectores de la molécula de los receptores acoplados a proteína G de siete transmembrana. Cuando se establece el ligando y la función, el sistema P_{2u} es útil para definir los antagonistas o los inhibidores que bloquean la unión y que previene estas reacciones fluorescentes.

Además de utilizar el ADN que codifica el receptor para construir líneas celulares útiles para el cribado de ligandos, la expresión del ADN puede, de acuerdo con otro aspecto de la invención, ser llevado a cabo para producir fragmentos del receptor en la forma soluble, para la investigación de la estructura, para construir anticuerpos y para otros usos experimentales. Se espera que la porción extracelular del receptor de GLP-2 contribuya de forma significativa a la unión de la molécula de ligando. En consecuencia se desea en primera instancia facilitar la caracterización de la interacción receptor-ligando mediante el subministro del dominio de unión del ligando extracelular en cantidad y en la forma aislada, es decir, libre del resto del receptor. Este constructo se ha hecho para el receptor de GLP-1 de rata, y se mostró que unía a GLP-1 (Wilmen et al. (1996) FEBS LETTS, 398:43-47).

Para conseguirlo, el ADN que codifican el receptor de GLP-2 en toda su longitud se puede modificar por mutagénesis dirigida, se manera que se introduce un codón stop de traducción en la región N-terminal extracelular, immediatamente antes de la secuencia que codifica el primer dominio transmembrana (TM1), es decir, antes del residuo 181 de la SEQ ID NO: 2 y antes del residuo 181 de la SEQ ID NO: 12. Como ya no se producirá ningún dominio transmembrana para "ancorar" el receptor a la membrana, la expresión del gen modificado resultará en la secreción, en la forma soluble, de sólo el dominio de unión del ligando extracelular. Los ensayos de unión del ligando estándar entonces se pueden llevar a cabo para averiguar el grado de unión de un compuesto candidato al dominio extracelular producido. Evidentemente puede ser necesario, utilizando la mutagénesis dirigida, producir diferentes versiones de las regiones extracelulares, para optimizar el grado de unión del ligando a los dominios aislados.

Se apreciará que la producción de los dominios de unión del ligando extracelulares se pueden conseguir en una variedad de células huésped. Las células de mamífero como las células CHO se pueden utilizar con este propósito, la expresión conducida normalmente por un promotor de expresión capaz de un alto nivel de expresión, por ejemplo el promotor de CMV (citomegalovirus). De forma alternativa, las células de no mamífero, como las células Sf 9 de insecto (Spodoptera frugiperda) se pueden utilizar, con la expresión normalmente conducida por los promotores de expresión del baculovirus, por ejemplo el promotor de proteína de polihedron fuerte, tardío. Los sistemas de expresión filamentosos fungoideos también se pueden utilizar para secretar grandes cantidades de estos dominios extracelulares del receptor de GLP-2. El Aspergillus nidulans, por ejemplo, con la expresión siendo conducida por el promotor alcA, constituiría este sistema aceptable. Además de estos huéspedes de expresión, se apreciará también que cualquier sistema de expresión procariótico o de otros eucarióticos capaz de expresar genes o fragmentos de genes heterólogos, intracelular o extracelular será de forma similar aceptable.

La disponibilidad de los dominio de unión al ligando extracelulares de la proteína del receptor hace posible determinar las estructuras tridimensional de estas regiones de unión de estos ligandos, con o sin un ligando candidato que se compleje allí, mediante una combinación de técnicas de cristalografía de Rayos X y RMN de 2D avanzada. De esta forma, los nuevos compuestos candidatos adicionales, que se predice que requieren interacciones con la estructura del receptor tridimensional, se pueden diseñar y probar de forma específica.

Con grandes dominios, la cristalografía es el método de elección para la determinación de la estructura del dominio en el aislamiento, y del co-complejo con el ligando natural (o una molécula antagonista o agonista apropiada). Si un dominio en particular se puede hacer suficientemente pequeño, por ejemplo aproximadamente 100-130 aminoácidos de longitud, entonces la técnica potente de NMR 2-D también se puede aplicar a la determinación de la estructura. Esto permite no sólo la determinación de la estructura del dominio, sino que también proporciona información dinámica sobre la interacción fármaco-receptor.

Para el uso particularmente en la detección de la presencia y/ o la localización, por ejemplo en el tejido intestinal, la presente invención también proporciona, en otro de sus aspectos, anticuerpo marcado a un receptor de GLP-2. Para aumentar estos anticuerpos, se pueden utilizar como inmunogen al receptor intacto, soluble o su fragmento inmunogénico, producido en una célula huésped microbiana o de mamífero tal y como se ha descrito anteriormente mediante las técnicas de síntesis de péptido estándar. Las regiones del receptor de GLP-2 particularmente adecuadas para el uso como fragmentos inmunogénicos incluyen aquellas que se corresponden a nivel de secuencia con una región extracelular del receptor, o una porción de la región extracelular, tal como los péptidos que consisten en 10 o más aminoácidos de la región 401-509 de la SEQ ID NO: 2. Respecto el receptor de GLP-2 de humano (SEQ ID NO: 12), los péptidos que comprenden el dominio extracelular maduro (residuos 65-180); intracelular del lazo 3 (residuos 363-385) y el dominio intracelular C-terminal (residuos 442-533) pueden ser útiles como inmunogenes para la producción de anticuerpos al receptor de GLP-2 de humano.

Los anticuerpos al receptor de GLP-2 deseado o al inmunogen de fragmento se encuentran disponibles, para la producción de anticuerpos policlonales, de la sangre de un animal que se ha inmunizado con el inmunogen. De forma alternativa, para la producción de anticuerpos monoclonales, los inmunecitos como los esplenocitos se pueden recuperar del animal inmunizado y se pueden fusionar, utilizando la tecnología de hibridoma, a unas células de mieloma. Los productos de fusión entonces se criban mediante el cultivo en un medio de selección, y las células que producen el anticuerpo se recuperan para un crecimiento continuo y la recuperación del anticuerpo. El anticuerpo recuperado entonces se puede acoplar de forma covalente a un marcador detectable, como un radiomarcador, un marcador de enzima, un marcador luminescente o similares, utilizando la tecnología de unión establecida para este propósito.

Los sistemas de modelo animal que explican los papeles fisiológicos y de comportamiento del receptor de GLP-2 se producen mediante la creación de animales transgénicos en los que la actividad del receptor de GLP-2 se aumenta o se disminuye, o la secuencia aminoacídica del receptor de GLP-2 expresado se altera, mediante una variedad de técnicas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen, pero no se limitan a: 1) Inserción de las versiones normales o mutantes de ADN que codifica un receptor de GLP-2, mediante la microinyección, la electroporación, la transfección retroviral u otros modos conocidos por aquellos especialistas en el campo, a un embrión fertilizado apropiado para producir un animal transgénico o 2) La recombinación homóloga de las versiones humana o animal mutante o normal, de estos genes con el locus génico nativo en los animales transgénicos para alterar la regulación de la expresión o la estructura de estas secuencias de receptor de GLP-2. La técnica de recombinación homóloga es bien conocida en el campo. Se sustituye el gen nativo con un gen insertado y en consecuencia es útil para producir un animal que no puede expresar el receptor de GLP-2 nativo pero que expresa, por ejemplo, un receptor de GLP-2 insertado mutante, que ha reemplazado el receptor de GLP-2 nativo en el genoma del animal mediante recombinación, resultando en una expresión por debajo del transportador. La microinyección añade genes al genoma, pero no los elimina, y en consecuencia es útil para producir un animal que exprese su propio y añadido receptor de GLP-2s, resultando en una sobreexpresión del receptor de GLP-2s.

Una forma posible para producir animales transgénicos, con un ratón como ejemplo, es tal y como se muestra a continuación: los ratones hembra se aparean, y los huevos fertilizados resultantes se diseccionan fuera de sus oviductos. Los huevos se almacenan en un medio apropiado como el medio M2. El ADN o cADN que codifica el receptor de GLP-2 se purifica con cloruro de cesio a partir de un vector mediante métodos bien conocidos en el campo. Los promotores inducibles se pueden fusionar con las regiones codificantes de ADN para proporcionar un medio experimental para regular la expresión del transgen. De forma alternativa o adicional, los elementos de regulación del tejido específicos se pueden fusionar con la región codificante para permitir la expresión específica del trans-gen. El ADN, en una solución tamponada de forma apropiada, se coloca en una aguja de microinyección (que se puede hacer a partir de la pipeta capilar utilizando un dispensador de pipetas) y el huevo al que se debe inyectar se coloca en una hoja de depresión. La aguja se inserta al pronúcleo del huevo, y la solución de ADN se inyecta. El huevo inyectado después se transfiere a un oviducto de un ratón pseudopreñado (un ratón estimulado mediante las hormonas apropiadas para mantener el embarazo pero que en realidad no está preñada), de dónde procede al útero, se implanta, y se desarrolla hasta el término. Tal y como se ha indicado anteriormente, la microinyección no es el único método para insertar ADN a una célula huevo, y se utiliza aquí sólo para propósitos ejemplares.

La invención que se ha descrito anteriormente, se puede entender mejor a partir de los siguientes ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen con el propósito de ilustrar la invención y no se debe interpretar como una limitación de la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento del receptor de GLP-2 Clonación asistido por PCR de los cADNs del receptor de GLP-2 de rata y ratón parcial

Se preparó la librería de cADN de Intestino neonatal de rata (Stratagene, La Jolla, CA; Cat. 936508) y el cADN de primera cadena de yeyuno de ratón. Se utilizaron los iniciadores degenerados M-2F/S (SEQ ID NO: 3) y M-7R/S (SEQ ID NO: 4) para amplificar el fragmento parcial del receptor de GLP-2 de rata a partir de la librería de cADN de Intestino neonatal de rata y del receptor de GLP-2 de ratón del modelo de Yeyuno de ratón. El protocolo se describe a continuación:

\global\parskip0.950000\baselineskip

PCR Degenerada

6 \mul de tampón VENT 10x de New England Biolabs

6 \mul cada stock de dATP, dCTP, dGTP y dTTP 2.5 \muM

4 \mul de cADN de intestino de rata neonatal (1:10 dilución)

3 \mul de iniciador M2F/S 25 \muM [5'-TTTTTCTAGAASRTSATSTACACNGTSGGCTAC-3'] (SEQ ID NO: 3)

3 \mul de iniciador M7R/S 25 \muM [5'-TTTTCTCGAGCCARCARCCASSWRTARTTGGC-3'] (SEQ ID NO: 4)

2 \mul (10 unidades) Amplitaq ADN polimerasa (Perkin Elmer)

36 \mul de ddH_{2}O.

Condiciones de reacción: 35 ciclos a 94ºC, 2 minutos; 94ºC, 1 minuto; 53ºC, 30 sec.; 72ºC, 1 minuto.

El producto de la PCR predominante era un fragmento de ADN de 303 pares de bases (bp). Se purificaron 30 \mul de muestras de la PCR anterior utilizando el kit de purificación de QIAGEN PCR y se eluyó en 30 \mul de ddH_{2}O. El producto resultante entonces se re-amplificó utilizando las mismas condiciones de PCR Degenerada, con la excepción sólo de 31 ciclos a 94ºC.

El producto predominante de 303 pares de bases (bp) se eliminó y se purificó utilizando el protocolo de purificación de gel QIAGEN QIAquick a 30 \mul ddH_{2}O. El producto resultante entonces se reamplificó utilizando las mismas condiciones de PCR Degenerada, con la excepción sólo de 31 ciclos a 94ºC.

A continuación, la doble digestión (Xba I y Xho I) se llevó a cabo sobre la reacción de PCR reamplificada totalmente tal y como se muestra a continuación: 28 \mul ADN; 16 \mul 10X de tampón One-Phor-All (Pharmacia); 2 \mul (40 unidades) enzima Xba I (Pharmacia); 2 \mul (40 unidades) enzima Xho I (Pharmacia); y 30 \mul ddH_{2}O.

Las muestras se digirieron 4 horas en un baño de agua de bloque a 37ºC, se llevó hasta 100 \mul de volumen con ddH_{2}O (estéril) y se purificó mediante (1) cantidades equivalentes (100 ul) de extracción de cloroformo; (2) precipitación el fin de semana con 2 volúmenes de etanol/10 volúmenes de acetato de sodio 3M; (3) 1x lavado con EtOH al 70%; y (4) resuspensión en 10 \mul 1x TE (pH 8.0).

A continuación se digirió el clon 5HT1F#9 de pBluescript con Xba I y Xho I tal y como se muestra a continuación:

10 \mul de ADN (clon 5HT1F#9 de pBluescript)

5 \mul de Tampón 2 NE 10X (New England Biolabs)

3 \mul de (dilución 1:20 =3 unidades) Xba I (New England Biolabs)

3 \mul de (dilución 1:20 =3 unidades) Xho I (New England Biolabs)

5 \mul de (10x) BSA (New England Biolabs)

24 \mul de ddH_{2}O.

La muestra se digirió durante 3 horas en un baño de agua de bloque a 37 C, se inactivó por calor a 65ºC durante 20 minutos y se purificó utilizando el kit GeneCleanII de BIO 101. Las alícuotas de las reacciones de la PCR se clonaron al vector de plásmido pBluescript anterior utilizando el kit T4 ADN ligasa (New England Biolabs) y se transformaron a células ultracompetentes Epicurean Coli XL-2 Blue MRF' (Stratagene). La transformación se colocó sobre placas 2xYT + AMP y se seleccionaron colonias únicas. Se hicieron minipreps de ADN utilizando el kit de miniprep QIAGEN QIA-prep 8 y las secuencias de los fragmentos se determinaron utilizando el sistema ABI. Se identi-
ficaron secuencias nuevas que contenían un fragmento parcial de la secuencia del receptor de GLP-2 de rata y ratón.

Se consiguió la clonación de cADN con la región que codifica el receptor de GLP-2 completo tal y como se muestra a continuación: Primero, se utilizaron las librerías de cADN a partir de los siguientes tres tejidos para el cribado.

1.

Hipotálamo de rata (RHT)

2.

Cerebelo de rata Brain (RHB)

3.

Duodeno y Yeyuno de rata (RDJ)

\global\parskip1.000000\baselineskip

Se prepararon las tres librerías de cADN mediante el priming con un iniciador aleatorio y la subclonación indirecta a los sitios Hind III y no I de pcADN3.

A continuación, las tres librerías de cADN se cribaron por homología mediante un oligo C4-4 degenerado

[5'-AACTACATCCACMKGMAYCTGTTYVYGTCBTTCATSCT-3'] (SEQ ID NO: 5)

mediante el levantamiento de colonia y la hibridización sobre filtro. Se utilizaron las siguientes condiciones de hibridización: 5X SSPE (1X SSPE es NaCl 0.18M, NaH_{2} PO_{4} 10 mM (pH 7.4), EDTA 10 mM (pH 7.4)) y solución 5X Denharts (Ficoll al 1%, Polivinilpirrolidona al 1%, BSA al 1%); ADN de esperma de salmón a 25 mg/ml.

Los filtros se hibridizaron a 50ºC toda la noche. Después se lavaron los filtros 2 veces en 2X SSPE y SDS al 1% a temperatura ambiente durante 30 minutos, 2 veces en 2X SSPE y SDS al 1% a 50ºC durante 20 minutos por lavado, y finalmente dos veces en 1X SSPE y SDS al 0.5%. Se identificaron clones positivos mediante autoradiografía. Un taco de 1cm^{2} que envolvía el clon positivo se eliminó de la placa y se colocó en 1 ml de 2x YT + Glicerol al 20%, se sometió a vórtice y se congeló a -80ºC.

Se preparó el ADN de plásmido a partir de los tacos positivos tal y como se muestra a continuación: 100 ml de cultivo de bacteria de cada taco positivo se creció en una placa de agar. Las células de bacteria se rasparon y se resuspendieron en 1 ml de medio 2xYT + Glicerol al 20%. El aglomerado de bacteria de los 250 mL de la resuspensión de bacteria se resuspendió en 150 ml de la Solución I (Glucosa 50 mM, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA), se lisó en la Solución II (NAOH 0.2M, SDS al 1%), se neutralizó con la Solución III enfriada en hielo (acetato de potasio; 4 vol. de acetato de potasio 5M + 1 vol. de ácido acético 10M). Después de la aglomeración de ADN de bacteria, se añadió 340 ml de isopropanol al sobrenadante. Éste se centrifugó al máximo durante 15 minutos. El aglomerado se resuspendió en TE + RNasa a 20 mg/ml, se incubó a 37ºC durante 30 minutos y se precipitó con isopropanol + acetato de potasio 0.2M. Después de la centrifugación, se lavó el aglomerado con alcohol al 70% alcohol, se dejó al aire seco y se resuspendió en TE.

El ADN de Plásmido del conjunto de 2777 clones de la librería RHT de cADN de hipotálamo de rata a continuación se aprovechó tal y como se muestra a continuación: Se diseñaron dos iniciadores a partir de una área de la secuencia de cADN de receptor de GLP-2 clonado por PCR que no presentaba identidad con receptores de la familia de los genes conocidos. Los dos iniciadores P23-R1 y P23-F1 amplificaron un fragmento de 196 bp sólo a partir de un ADN de clon nuevo pero no con el cADN de receptor de GLP-1 o cADN de receptor de PACAP. Se utilizó el sistema Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Cat. 1681-842) bajo las siguientes condiciones:

2 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

2.8 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

0.6 \mul del iniciador P23-R1 [5'-TCATCTCCCTCTTCTTGGCTCTTAC-3'] (SEQ ID NO: 6)

0.6 \mul del iniciador P23-F1 [5'-TCTGACAGATATGACATCCATCCAC-3'] (SEQ ID NO: 7)

0.3 \mul de la enzima PCR Expand (1 unidad)

12.7 \mul de agua

1 \mul de ADN

Condiciones de reacción: 32 ciclos a 93ºC, 40 segundos; (ciclos) 58ºC, 40 segundos; (ciclos) 68ºC, 40 segundos.

Los ADNs de cada taco positivo o un conjunto de 2777 clones se amplificaron con los iniciadores específicos P23-F1 y P23-R1 bajo las condiciones especificadas anteriormente. Fuera de los tacos positivos de 1057 C4-4 hibridización y 884 del conjunto de 2777 clones de clon sólo cinco fuentes de modelo amplificaron un producto de PCR de 196 bp. Éstas eran: (1) Taco 334, (2) Taco 780, (3) RHT conjunto de 233, (4) RHT conjunto de 440, y (5) RHT conjunto de 587.

La amplificación de cADN de GLP-2R a partir de los cinco modelos positivos entonces se llevó a cabo. Utilizando un iniciador específico (P23-R1 o P23-F1) y un iniciador basado en la secuencia del vector de pcADN3 (Invitrogen) (830F o 1186R), el inserto de cADN de GLP-2R se amplificó directamente a partir de los tacos impuros de forma clónica o los 2777 conjuntos de clones. Las secuencias de los iniciadores del vector son tal y como se muestra a continuación:

830F:	[5'-AACCCACTGCTTAC-3']	(SEQ ID NO:14)
1186R:	[5'-CCCAGAATAGAATGACACC-3']	(SEQ ID NO:15)

Se llevó a cabo la PCR, bajo las siguientes condiciones que se apuntan, utilizando el sistema Expand^{^{TM}}PCR.

La banda más prominente se reamplificó, se purificó y se secuenció. Basándose en la secuencia amplificada obtenida, se diseñaron iniciadores adicionales y se llevó a cabo una nueva secuenciación. De esta forma las secuencias completas de los insertos de cADN de GLP-2R en las cinco fuentes de los clones se determinaron. El análisis de secuencia mostró que sólo el conjunto RHT 440 y el conjunto RHT 587 contenían clones con la secuencia codificante completa de GLP-2R y que los dos clones eran idénticos (derivados del mismo clon de cADN).

Debido a la dificultad de purificar de forma clónica el clon de cADN del receptor de GLP-2 a partir de los conjuntos de librería de cADN de RHT 440 o RHT 587, el cADN se amplificó y se reclonó a pcADN3. Basándose en la secuencia obtenida a partir de RUT 440 y RHT 587, se diseñaron dos iniciadores en los que se primaba empezar 4bp más arriba del codón de iniciación y otro en el que se primaba empezar 8bp antes del codón de stop.

WBR-C5:	[5'-CAGGGGCCGGTACCTCTCCACTCC-3']	(SEQ ID NO:16)
WBR-C3:	[5'-TTGGGTCCTCGAGTGGCCAAGCTGCG-3']	(SEQ ID NO:17)

Los dos iniciadores se utilizaron para amplificar un fragmento de ADN de aproximadamente 1525 bp bajo las siguientes condiciones de PCR utilizando el sistema Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Número de Catálogo 1681-842).

10 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}PCR

14 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

3.0 \mul de Iniciador 1 (10 \muM) (WBR-C5)

3.0 \mul de Iniciador 2 (10 \muM) (WBR-C3)

1.5 \mul de Enzima (5 unidades)

63.5 \mul de agua

5 \mul de ADN

Condiciones de reacción: 5 ciclos (93ºC, 1 Min; 72ºC, 40s; 60ºC, 45 sec; 68ºC, 2 min) y 25 ciclos (93ºC, 1 min; 72ºC, 1 min; 68ºC, 2 min).

El producto amplificado se subclonó a los sitios Kpn I y Xho I del vector pcADN3 (Invitrogen). El ADN de plásmido se preparó utilizando el método descrito anteriormente.

Ejemplo 2 Ensayo funcional

Las células Cos-1 se transfectaron tal y como se describe en Analytical Biochemistry, 218:460-463 (1994) con un clon de rata de 587 de receptor de GLP-2, receptor de GLP-2 de humano clonado (pC3/HuGL2R-2), o receptor de GLP-2 de humano de variante del residuo 85 clonado (pC3.1/HuGL2R-MH4), pcADN3. Amida de GLP-1 de rata (7-36) se utilizó como péptido control. Las soluciones utilizadas fueron tal y como se muestra a continuación:

RSC en RPMI 1640 (49 ml RPMI + 1 ml FCS + 50 ul cloroquina, 100 mM);

DEAE/RSC Solución: 18.4 ml RSC +1.6 ml DEAE/Dextran (10 mg/ml).

El procedimiento del ensayo implicó lo siguiente:

a) se añadió 50 mg de receptor de GLP-2 de 587 de clon de rata, o receptor de GLP-2 de humano clonado, o receptor de GLP-2 de humano de variante de residuo 85 clonado (como pcADN3 de plásmido) a un tubo de 50 ml que contenía 6 mls de RSC y se incubó a 37ºC.

b) Se añadió seis ml de solución DEAE/RSC a cada tubo y se incubó a 37ºC durante 2 minutos

c) Se añadió 1.5 ml de suspensión de células COS-1 (5.5 millones de células) a cada tubo y se incubó durante 1 hora 45 minutos a 37ºC.

\newpage

d) Después de la incubación, la muestra se hizo girar durante 5 minutos a baja velocidad, se lavó con DMEM/F12 + FBS al 10% dos veces, y el aglomerado resultante se resuspendió en 12.5 ml de medio DMEM/F12 + FBS al 10%.

e) Se añadió un ml de suspensión de célula (paso d) a cada pozo de placas de 6 pozos recubiertas con poli-D-lisina (de Collaborative Biomedical), que contenía 3 ml de media (0.45 millón de células/pozo).

f) Las placas se incubaron a 37ºC durante 3 días.

Se llevó a cabo el Tratamiento de células Cos-1 transfectadas con análogo de GLP-1/GLP-2 tal y como se muestra a continuación:

Soluciones: DMEM/F12 (SFM)+ IBMX (3-isobutil-1-metilxantin) 0.85 mM +0.1% ácido ascórbico y 10 um de pargilina (todas las soluciones compradas de Sigma). El medio se preparó fresco el día de su uso.

Procedimiento del ensayo: El medio de cultivo de cada pozo (placas de 6 pozos transfectadas, células) se eliminó, y los pozos se lavaron una vez con medio SFM. Después 2 ml de medio SFM + IBMX se añadió a cada pozo y las placas se incubaron a 37ºC durante 10 minutos. Después de la incubación, el SFM + IBMX se eliminó de cada pozo y se añadió medio SFM + IBMX fresco que contenía GLP-1/GLP-2 (GLP-1,7-36,amida de Sigma, [Gly2]hGLP-2 de Allelix) concentración 1, 3, 10 y 30 nM a los pozos apropiados. Las placas se incubaron en un incubador a 37ºC durante 30 minutos. Después de la incubación, el medio se eliminó de cada pozo. Se lavaron los pozos una vez con 1ml de PBS (Salina tamponada fosfato). Cada pozo entonces se trató con 1ml de etanol al 95% frío: EDTA 5 mM (2:1) a 4ºC durante 1 hora. Las células de cada pozo entonces se rasparon y se transfirieron a tubos eppendorf individuales. Los Tubos se centrifugaron durante 5 minutos a 4ºC, y los sobrenadantes se transfirieron a tubos eppendorf nuevos y se secaron al vacío a velocidad. Después del secado, los tubos se reconstituyeron en 100 ul de Acetato de Na y se mantuvieron a 4ºC, 25 \mul de esta solución se utilizaron para un ensayo de cAMP.

El ensayo funcional se llevó a cabo tal y como se muestra a continuación: se determinó el contenido de cAMP para cada extracto por duplicado por EIA (Enzima ImmunoAssay) utilizando el Amersham Biotrak cAMP EIA Kit (Amersham 225). Los resultados de los ensayos, ilustrados en la Figura 3 y la Figura 8, mostraron la selectividad de GLP-2 por los receptores de rata y humano clonados. En un ensayo funcional similar utilizado a la unión del receptor de GLP-1, se observó especificidad para GLP-1.

Ejemplo 3 Aislamiento de cADN de Receptor de GLP-2 humano Cribado de la hibridización de estringencia media de una librería de cADN de hipotálamo humano

Se cribaron un millón de clones de una librería de cADN de \lambdagt10 del hipotálamo humano (Clontech; Cat. No. 1172a) mediante elevadores de placas sobre filtros de nitrocelulosa (Amersham; Cat.RPN137E). La prueba se preparó mediante el marcado de iniciadores al azar de un fragmento de ADN que contenía la región codificante completa del receptor de GLP-2 de rata. El fragmento de ADN se aisló del clon 587-C1, que contenía la región codificante completa de la SEQ ID NO: 2.

La Pre-hibridización y hibridización se llevaron a cabo toda la noche en una solución de hibridización que consistía en formamida al 50%, 5X SSPE, solución de Denhart's 5X, SDS al 0.5% y ADN de esperma de salmón (200 mg/ml). Después de la hibridización se lavaron los filtros bajo las siguientes condiciones (estringencia media):

dos veces a temperatura ambiente en 2X SSPE y SDS al 0.01%.

dos veces a 42ºC en 2X SSPE y SDS al 0.01%.

dos veces a 42ºC en 0.2X SSPE y SDS al 0.01%.

Los filtros se autoradiografiaron y se recogieron bloques de agar, cada uno contenía numerosas placas de bacteriofago, de las regiones en las placas que correspondían a señales positivas sobre el filtro. De un millón de clones de cADN muestreados en el cribado de primera ronda, se identificaron dos clones positivos (HHP6-1 y HHP13). En el segundo cribado sólo HHP13 se volvió positivo. Diversas placas positivas (HHS13) de la placa HHP13 se recogieron para un tercer cribado. Se recogieron tres placas individuales positivas de esta ronda del cribado (HHT13-1, HHT13-2, HHT13-3).

La amplificación por PCR entonces se utilizó para la secuenciación parcial de los clones positivos. De una siembra de células de bacteria (E. coli C600Hfl), 10 \mul de suspensión de fago de cada clon se aplicó una manchas marcadas. Después de 5 horas de incubación a 37ºC, las placas de fago fueron claramente visibles y se cubrieron con \sim1 cm^{2}. Una porción de cada placa se transfirió a 200 \mul de agua. Las muestras se incubaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos y se centrifugaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se utilizó un mililitro de muestra para la amplificación por PCR con dos sets de iniciadores degenerados:

\newpage

M2FS	[5'-TTTTTCTAGAASRTSATSTACACNGTSGGCTAC-3']	(SEQ ID NO: 3) y
M7RS	[5'-TTTTCTCGAGCCARCARCCASSWRTARTTGGC-3']	(SEQ ID NO: 4); o
C4-4	[5'-AACTACATCCACMKGMAYCTGTTYVYGTCBTTCATSCT-3']	(SEQ ID NO: 5) y
C9-2R	[5'-TCYRNCTGSACCTCMYYRTTGASRAARCAGTA-3']	(SEQ ID NO: 8).

Se utilizó el sistema de Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Cat. 1681-842) bajo las siguientes condiciones:

5 \mul de tampón 3 de 10x Expand^{^{TM}}

7 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

1.5 \mul de iniciador M2FS o C4-4

1.5 \mul de iniciador M7RS (con M2FS) o C9-2R (con C4-4)

0.75 \mul de Enzima de PCR de expansión (1 unidad)

33.25 \mul de agua y

1 \mul de ADN.

Las condiciones de reacción fueron: 32 ciclos a 93ºC, 1 minuto; ciclos de 50ºC, 1 minuto; ciclos de 45ºC, 1 minuto; ciclos de 68ºC, 2 minutos.

El M2F/S y M7R/S amplificaron un fragmento de ADN de alrededor de 300 bp y C4-4 y C92-R amplificaron un fragmento de ADN de alrededor de 700 bp. Los productos de la PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAGEN QIAquick PCR (Cat. 28104) y se eluyó en 50 \mul de Tris 10 mM, pH 8.0. El análisis de secuencia de los productos no reveló ninguna diferencia entre los modelos, tal y como se esperaba a partir del hecho que representaban múltiples copias de un clon de cADN individual (HHT13).

Un número de factores indican que este clon contiene secuencia del receptor de GLP-2 de humano. Un factor es el grado de similitud de secuencia. El cADN de receptor de glucagón se puede utilizar para predecir el grado esperado de conservación de secuencia encontrado entre los receptores de rata y humano. A nivel de nucleótido, se encuentra un 82.6% de identidad dentro de las regiones codificantes de los receptores de glucagón de rata y humano. A nivel de aminoácidos, se encuentra un 80.9% de identidad y un 89.1% de similitud de aminoácido entre los receptores de glucagón de las dos especies.

En el caso del receptor de GLP-2 humano clonado aquí, la secuencia del cADN de receptor de GLP-2 de humano parcial (HHT13) es altamente homólogo al cADN del receptor de GLP-2 de rata a nivel de nucleótido y a nivel de aminoácidos. La SEQ ID NO: 9 muestra un 87.1% de identidad con la secuencia del receptor de GLP-2 de rata. La secuencia aminoacídica pronosticada de esta región de cADN presenta un 87.4% de identidad y un 93.2% de similitud con la secuencia aminoacídica pronosticada del receptor de GLP-2 de rata. La longitud total pronosticada del receptor de preproteína de rata es de 550 aminoácidos, cosa que sugiere que alrededor el 44% de la región codificante del receptor humano se ha identificado.

Más evidencias que dan suporte a esta conclusión viene de la comparación de la secuencia aminoacídica del receptor de GLP-2 de humano parcial con el receptor de GLP-2 de rata y los siguientes 3 miembros más cercanos, que se muestra a continuación:

1

Estas comparaciones, junto con el estándar de comparación proporcionado por la similitud de las secuencias entre los receptores de glucagón de rata y humano, proporcionan una prueba definitiva que el cADN designado HHT13 representa un fragmento del homólogo de humano del receptor de GLP-2 de rata.

La secuencia aminoacídica completa del receptor de GLP-2 de humano se puede obtener primero mediante la determinación de la secuencia de los insertos de cADN completos en HHT13-1, HHT13-2 y HHT13-3. Utilizando los iniciadores degenerados para la amplificación de PCR y la secuenciación siguiente, obtuvimos la secuencia a partir de sólo parte de cada inserto. Es posible que estos clones idénticos contengan un inserto que abarque la secuencia codificante completa de la preproteína de receptor de GLP-2 de humano. Para determinar la secuencia completa del inserto de cADN, los clones se crecen en gran cantidad para preparar aproximadamente 20 mg de cada clon equivalente. El inserto de cADN completo se corta por restricción con Eco RI, y se subclona a pcADN3 (Invitrogen). De forma alternativa, dos iniciadores de la secuencia de vector que flanquea el inserto se utilizan para amplificar el inserto de cADN completo utilizando el sistema Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Catálogo 1681-842). El cADN amplificado se corta con las enzimas de restricción apropiadas y se subclona a pcADN3 (Invitrogen).

Si una secuencia codificante completa no se encuentra presente en los clones de HHT13, se criban las librerías de cADN para clones adicionales para completar la región codificante del cADN de receptor de GLP-2 de humano. De forma preferible las librerías de cADN humanas (de Stratagene o Clontech) que representan los siguientes tejidos se utilizan para el cribado: Hipotálamo humano; cerebro fetal humano; duodeno y yeyuno humano; estómago humano; e intestino fetal humano.

Dos iniciadores de PCR se diseñan a partir de la secuencia de cADN del receptor de GLP-2 de humano ya determinada. Estos iniciadores se diseñan de forma que no puedan amplificar ningún miembro de la familia génica relacionada excepto el cADN del receptor de GLP-2. Una dilución del stock de librería de cADN librería se utiliza para hacer los sub-conjuntos de librería de forma que 50,000 clones se representan en cada conjunto. La PCR se lleva a cabo con los iniciadores específicos del receptor de GLP-2 para diagnosticar los conjuntos que contienen un clon de cADN de GLP-2 cADN, utilizando el sistema de Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Cat. 1681-842) bajo las siguientes condiciones:

2 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

2.8 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

0.6 \mul de iniciador P1

0.6 \mul de iniciador P2

0.3 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

12.7 \mul de agua

1 \mul de conjunto de librería que contiene 50,000 clones

Condiciones de reacción: 32 ciclos a 93ºC, 40 segundos; 50-58ºC, 40 segundos; 68ºC, 40 segundos.

La secuencia entonces se obtiene a partir del inserto de cADN del receptor de GLP-2 completo a partir de un conjunto positivo. Utilizando un iniciador específico y un iniciador basado en la secuencia de vector cerca del sitio de clonación, el inserto de cADN de receptor de GLP-2 se amplifica directamente a partir de los conjuntos del clon impuros de forma clónica, utilizando el sistema Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Número de Catálogo 1681-842) más adecuadamente bajo las siguientes condiciones:

2 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

2.8 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

0.6 \mul de Iniciador 1

0.6 \mul de Iniciador 2

0.3 \mul de Enzima (1 unidad)

12.7 \mul de agua

1 \mul de stock de conjunto de librería

Condiciones de reacción: 32 ciclos a 93ºC, 45 segundos; 50ºC, 45 segundos; 68ºC, 1 minuto.

La reacción se conduce en un gel de agarosa preparativo, y se purifica y se secuencia la banda más prominente. Basándose en la secuencia amplificada obtenida, se diseñan iniciadores adicionales para obtener la secuencia y los clones de la región codificante completa y clonar el cADN completo.

Se utiliza 5' RACE y 3' RACE para obtener la secuencia codificante del cADN de receptor de GLP-2 de humano. La amplificación rápida de los terminales de cADN (RACE) es un procedimiento rutinario utilizado para la amplificación de secuencias de ADN del modelo de la primera cadena de cADN (preparada fácilmente a partir de ARNm) entre un sitio interno definido y el terminal 3' o el 5' del ARNm. El Total o el ARNm de los distintos tejidos humanos se encuentran disponibles comercialmente por Clontech. Se utilizan los kits del sistema 3' RACE (Gibco-BRL Life Technologies; Cat. 18373-019) y del sistema 5' RACE (Catálogo 18374-058). Los manuales de estos dos productos proporcionan protocoles detallados. En breve, los protocoles son tal y como se describe a continuación.

Para el procedimiento 3' RACE, la síntesis del cADN de primera cadena se inicia como una cola poli (A) de ARNm utilizando el iniciador adaptador (que se proporciona con el sistema) que incorpora una única secuencia para la amplificación de PCR universal de los productos RACE. Después de la síntesis de la primera cadena de cADN a partir de este iniciador, el modelo original de ARNm se destruye con RNasa H. La amplificación se lleva a cabo utilizando dos iniciadores: uno es un iniciador específico de gen (que se diseñará a partir de la secuencia de HHT13 de cADN parcial); el otro es el iniciador de amplificación universal proporcionado por el kit. El producto amplificado se subclona a un vector de plásmido para la secuenciación.

Para el Sistema 5' RACE, el cADN de primera cadena se sintetiza a partir de ARNm utilizando un iniciador específico de gen (que se basa en la secuencia de cADN parcial disponible de HHT13) y la transcriptasa reversa SuperScript II. El modelo original de ARNm se elimina mediante el tratamiento con RNasa H. Los dNTPs, iniciadores, y proteínas no incorporados se separan del cADN utilizando un cartucho de giro. Una cola de dCTP homopolimérica entonces se añade al terminal 3' del cADN de primera cadena utilizando enzima TdT y nucleótidos dCTP. La amplificación por PCR se lleva a cabo utilizando dos iniciadores: uno es un iniciador anidado, específico de gen diseñado para la secuencia de ADN parcial disponible de HHT13; y el otro es un "iniciador de anclaje" proporcionado por el sistema. Ambos iniciadores incorporan sitios de restricción para los plásmidos de subclonación y las siguientes secuenciacio-
nes.

Sub-clonación clones de HHT13 \pigt10 a pcdna3, su secuenciación y su expresión A. Amplificación de insertos de cADN con iniciadores \pigt10.

En una siembra de células de bacteria (E. coli C600Hf1), 10 \mul de resuspensión de fago de cada clon se colocaron en una mancha marcada. Después de 5 horas de incubación a 37ºC, las placas de fago eran claramente visibles. La superficie de cada placa se transfirió a 200 \mul de agua. Las muestras se mantuvieron en un baño de agua en ebullición durante 5 minutos y se centrifugó a temperatura ambiente durante 10 minutos. 1 \mul de muestra se utilizó para amplificar con un set de iniciadores \pigt10.

GT10-5KXb	[5'-GGGTAGTCGGTACCTCTAGAGCAAGTTCAGCC-3']	(SEQ ID NO:18)
vs
GT10-3BXh	[5'-ATAACAGAGGATCCTCGAGTATTTCTTCCAG-3']	(SEQ ID NO:19)

Se utilizó el sistema Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Catálogo 1681-842) bajo las siguientes condiciones:

5 \mul de Tampón 3 de 10x Expand^{^{TM}}

7 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

1.5 \mul de iniciador GT10-5KXb

1.5 \mul de iniciador GT10-3BXh

0.75 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

33.25 \mul de agua

1 \mul de ADN

Condiciones de reacción: 5 ciclos de 93ºC-40 segundos; 50ºC- 1 minuto; 68ºC-2 minutos y 30 ciclos de 93ºC-40 segundos; salto a 68ºC-1 minuto; 68ºC-2 minutos.

\newpage

Un fragmento de ADN de amplificado de alrededor de 2200 bp de longitud se percibió en el gel de agarosa de los tres clones. Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit de purificación de PCR QIAGEN's QIAquick (número de Catálogo 28104) y se eluyó en 50 \mul de Tris10 mM, pH 8.0. Los modelos se secuenciaron.

B. Subclonación al vector pcADN3

Al ADN amplificado y purificado de los tres clones se le aplicó restricción con Kpn I y Xho I y se subclonó a pcADN3 restringido con enzimas de restricción similares. Los plásmidos se nombraron pHHT13-1, pHHT13-2, y pHHT13-3. Los ADNs de plásmidos se prepararon utilizando el método natural (tratamiento alcalino, precipitación de ADN de bacteria con KOAc 3 M, precipitación de isopropanol seguido por el tratamiento con ARNsa y segunda ronda de precipitación con isopropanol) o los kits de ADN de plásmido de Qiagen Inc. Los modelos preparados utilizando el kit de Qiagen's se secuenciaron.

C. Ensayo funcional

Las transfecciones se llevaron a cabo con cada clon, utilizando el clon GLP-2R de rata, clon 587 como control positivo para la respuesta de cAMP al péptido GLP-2. Los métodos para la transfección, el cultivo celular y el ensayo de cAMP eran idénticos a aquellos que se describen para el ensayo funcional de rata, clon 587. Los resultados mostraron que a pesar que el control positivo dio buena respuesta a cAMP en las células COS, ninguno de los clones de HHT13 dio ninguna respuesta de cAMP. Tal y como se confirma por la secuenciación que mostró una mutación frame-shift, los datos funcionales sugieren que ninguna proteína GLP-2R funcional se expresó a partir de estos clones de cADN.

D. Comparación de secuencia de ADN entre subclones de GLP-2R de rata y EEHT13

La comparación mostró una deleción de 2 bp a una posición correspondiente a los nucleótidos 389-390 del cADN de GLP- 2R de rata, resultando en la pérdida de los nucleótidos 374-375 de la secuencia de cADN de GLP-2R humano que se presenta aquí.

Se utilizó la PCR para incorporar dos bp de la secuencia de ADN de GLP-2R de rata a ADN de HHT13-1 al sitio de la deleción de 2 bp identificada respeto a la secuencia codificante de GLP-2R de rata. Los siguientes iniciadores se diseñaron a partir de secuencia de ADN de HHT13 para insertar dos bp.

HWBR/2BPI-475F
[5'-ACAGGCATGTCTGGAAGACTTACTCAAGGAACCTTCTGGCAT-3']	(SEQ ID NO:20)

\vskip1.000000\baselineskip

HWBR/2BPI-506R
[5'-ATGCCAGAAGGTTCCT1TGAGTAAGTCTTCCAGACATGCCTGT-3']	(SEQ ID NO:21)

\vskip1.000000\baselineskip

HWBR-F7
[5'-TTCCTCTGTGGTACCAAGAGGAATGC-3']	(SEQ ID NO:22) y

\vskip1.000000\baselineskip

HWBR-1910R
[5'-GGTGGACTCGAGGTACCGATCTCACTCTCTTCCAGAATC-3']	(SEQ ID NO:23)

\vskip1.000000\baselineskip

PCR 1: Se utilizó 1 ng de ADN de pHHT13-1 como modelo de las dos PCRs con iniciadores, HWBR-F7 vs HWBR/2BPI-506R y HWBR/2BPI-475F vs HWBR-1910R. Se utilizó el Sistema de Expand^{^{TM}}PCR de Boehringer Mannheim (Catálogo 1681-842) bajo las siguientes condiciones:

5 \mul de Tampón 3 de Lox Expand^{^{TM}}

7 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

1.5 \mul de iniciador HWBR-F7 o HWBR/2BPI-475F

1.5 \mul de iniciador HWBR-2BPI-506R o HWBR-1910R

0.75 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

33.25 \mul de agua y

1 \mul de ADN.

Condiciones de reacción: 10 ciclos de 92ºC-40 segundos; 48ºC-1 mm; 68ºC-3 mm y 30 ciclos de 92ºC-40 segundos; 55ºC-40 segundos; 68ºC-2 mm.

Los iniciadores HWBR-F7 y HWBR/2BPI-506R amplificaron un fragmento de ADN de 400 bp y HWBR/2BPI-475F y HWBR-1910R amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 1.4 kb sobre un gel de agarosa. Las dos bandas se cortaron del gel de agarosa y se purificaron con el kit de extracción de gel de Qiaquick de Qiagen Inc. (número de catálogo 28706) y los ADNs se eluyeron en 50 \mul de Tris 10 mM (pH 8.5).

PCR 2 (Extensión sin los iniciadores): Aproximadamente 75 ng de los dos productos amplificados a partir de la PCR 1 anterior se mezclaron y después se recombinaron sin los iniciadores mediante la extensión bajo las siguientes condiciones:

2 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

2.8 \mul de de mezcla de dNTP 2.5 mM

0.3 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

8.9 \mul de agua

6 \mul de de productos de PCR 1 combinados

Condiciones de reacción: 15 ciclos de 92ºC-1 minuto; 60ºC-5 minutos; 68ºC-3 minutos.

PCR 3: Se utilizó 1 \mul de mezcla amplificada de la PCR 2 como modelo para amplificar con los iniciadores HWBR-F7 y HWBR- 1910R utilizando las siguientes condiciones:

10 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

14 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

3.0 \mul de iniciador HWBR-F7 o HWBR/2BPI-475F

3.0 \mul de iniciador HWBR/2BPI-506R o HWBR-1910R

1.5 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

67.5 \mul de agua y

1 \mul de ADN.

Condiciones de reacción: 30 ciclos de 92ºC-1 minuto; 60ºC- 1 minuto; 68ºC-2 minutos.

Un fragmento de ADN de aproximadamente 1.7 kb se amplificó tal y como se veía sobre el gel de agarosa. El producto se PCR se purificó utilizando el kit de purificación de PCR de QIAGEN's QIAquick (número de catálogo 28104) y se eluyó en 50 \mul de Tris 10 mM, pH 8.0. El producto purificado se sometió a restricción con Kpn I y se subclonó a pcADN3.1(-)/Myc-His A sometido a restricción de Kpn I (Invitrogen, número de catálogo V855-20). Un clon, denominado pc3.1/HuGL2R/MH6 (pHuMH6), presentaba el inserto de 1.7 kb en la orientación correcta tal y como se comprobó por PCR utilizando el vector vs. Los iniciadores de inserto.

Ensayo funcional

Se comparó el clon híbrido a GLP-2R de rata utilizando el ensayo descrito en el Ejemplo 2. Los resultados muestran que la sustitución de 2 bp de "GA" al sitio de la deleción supuesto dio como resultado un clon que codificaba una proteína GLP-2R funcional, tal y como se muestra por la respuesta de CAMP al tratamiento de GLP-2.

Ejemplo 6 Aislamiento del cADN de Receptor de GLP-2 humano en toda su longitud

Veinte mil clones de la Librería de cADN de \pigt10 de Estómago Humano (Clontech; Cat. HL3O17a) se colocaron en cada placa de 150 mm de agar 100. Se añadió tampón SM (NaCl 0.1 M, Mg_{2} So_{4} 10 mM, Tris35 mM, pH-7.5, gelatina al 0.01%) a cada placa para obtener 100 lisatos de fago cada uno conteniendo un conjunto de 20,000 (20K) clones. Los primeros cincuenta 20K lisatos de fago (conjunto de 20K) se cribaron por PCR utilizando dos iniciadores diseñados a partir de la secuencia de ADN de HHT13. El modelo de ADN de cada conjunto se preparó mediante el hervido de lisato de fago durante 10 minutos y la centrifugación durante 10 minutos.

\newpage

HWBR-113F
[5'-GTGGAGAGGATTTGTGCAAACATTTC-3']	(SEQ ID NO:24)

\vskip1.000000\baselineskip

HWBR-578R
[5'-AGAGACATTTCCAGGAGAAGAATGAG-3']	(SEQ ID NO:25)

\vskip1.000000\baselineskip

1 \mul de cada ADN del conjunto de 20K se diagnosticó por PCR con los iniciadores HWBR-113F y HWBR578R utilizando las siguientes condiciones:

2 \mul de Tampón 1 de 10x Expand^{^{TM}}

2.8 \mul de mezcla de dNTP 2.5 mM

0.6 \mul de iniciador HWBR-113F

0.6 \mul de iniciador HWBR-578R

0.3 \mul de enzima de PCR de Expand (1 unidad)

12.7 \mul de agua

1 \mul del conjunto de 20K de ADN

Condiciones de reacción: 35 ciclos de 92ºC-40 segundos.; 60ºC-40 segundos.; 68ºC-1 minuto.

Se visualizó un fragmento de ADN de aproximadamente 450 bp en la amplificación de los modelos a partir de dos conjuntos (HST 19 y HST 38).

B. El cribado de los clones a partir de dos conjuntos positivos: HST 19 y HST 38

Se cribaron 40,000 clones colocados a partir de cada dos conjuntos de 20K positivos mediante elevadores de placas sobre filtros de nitrocelulosa (Amersham; Catálogo RPN137E). La prueba se preparó mediante el marcado del iniciador aleatorio de un fragmento de ADN a partir de pHHT13-1.

1. Los filtros se pre-hibridizaron y se hibridizaron a 42ºC toda la noche. La solución de hibridización consistía en formamida al 50%, 5X SSPE, solución de Denhart's 5X, SDS al 0.5% y ADN de esperma de salmón (200 mg/ml).

2. Después de la hibridización los filtros se lavaron bajo las siguientes condiciones:

-

dos veces a temperatura ambiente en 2X SSPE y SDS al 0.01%;

-

dos veces a 42ºC en 2X SSPE y SDS al 0.01%; y

-

dos veces a 50ºC en 0.1X SSPE y SDS al 0.01%.

3. Los filtros se autoradiografiaron y las regiones sobre las placas que coincidían con los signos positivos se aislaron. Un clon positivo (HST 38-4-30) se aisló a partir del conjunto HST 38. Se amplificó un fragmento de ADN de 450 bp a partir del clon positivo utilizando los iniciadores HWBR-113F y HWBR-578R y se secuenciaron. La secuencia claramente mostró que el plásmido contenía 2 bp (A G) en la posición 373-374 de la secuencia de ADN de HHT13.

El inserto completo de clon HST 38-4-30 se amplificó utilizando iniciadores \lambdagt10 tal y como se describe en el Ejemplo 1. La PCR amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1.4 kb. El ADN amplificado se purificó y se secuenció.

Ejemplo 7 Reconstrucción de un clon de cADN de GLP-2R de humano funcional en toda su longitud y ensayo funcional

Un fragmento de 700 bp obtenido por digestión de restricción de Kpn I y Pvu II del ADN amplificado a partir del clon UST 38-4- 30, y el fragmento de ADN de 1.4 kb a partir de ADN de pHHT13-1 sometido a restricción de Xho I y Pvu II se subclonaron a pcADN3 sometidos a restricción de Kpn I y Xho I en una ligación de tres modos. El constructo de plásmido nuevo se denominó pc3/HuGL2R-2. De esta manera se obtuvo la secuencia del receptor de GLP-2 de humano en toda su longitud.

Ensayo funcional

El nuevo clon se comparó con el clon de GLP-2R de rata 587 tal y como se ha descrito anteriormente. Los resultados muestran que el clon codificó la proteína de GLP-2R humana funcional, que lleva a la producción de cAMP en células COS como respuesta al tratamiento de GLP-2 (Figura 8).

Ejemplo 8 Anticuerpos dirigidos al receptor de GLP-2 1. Anticuerpos de Antipéptidos

Anticuerpos de Antipéptido se crecieron en conejos contra el péptido N-terminal (QTRENTTDIWQDESE) (SEQ ID NO:26), un péptido C-terminal (SEGDGSETLQKLR) (SEQ ID NO:27) y un lazo extracelular 1(SHNSUSKRPDDESG) (SEQ ID NO:28) del receptor de GLP-2 de rata.

El análisis inmunoquímico de suero producido tal y como se ha indicado anteriormente confirmó que el suero contenía anticuerpos dirigidos al receptor de GLP-2 que no reaccionaban de forma cruzada con el receptor de GLP-1 de rata.

2. Anticuerpos a un receptor de GLP-2 aumentados contra una proteína de fusión

El polinucleótido que codifica la región C-terminal del receptor de GLP-2 de rata (aminoácidos 444-550) se unió al C-terminal de glutationa 5-transferasa (GST) en pGEX-2T y se expresó en la cadena de E. coli SUREI. Se purificó la proteína utilizando cromatografía de afinidad utilizando el fragmento C-terminal de GLP-2 fusionado al C-terminal de la proteína que une maltosa. Se minimizó la degradación de la proteasa utilizando un cocktail o inhibidores de proteasa (Boeringer Mannheim).

Los anticuerpos se crecieron en general de acuerdo con el método divulgado en Antibodies: A laboratory manual, Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. De forma breve, la proteína de fusión GLP-2-GST se utilizó para crecer anticuerpos en conejos tal y como se muestra a continuación. La inyección inicial era con 100 \mug de proteína de fusión en un adyuvante de Freund's completo a múltiples sitios, de forma intramuscular y subcutánea. Las inyecciones de Booster se llevaron a cabo a múltiples sitios de forma intramuscular con 100 \mug de proteína de fusión en un adyuvante de Freund's incompleto a los días 14, 21, 42 y 56.

El antisuero se purificó por afinidad utilizando una columna de afinidad de fusión de GLP-2-MBP. El análisis inmunocitoquímico confirmó que estos anticuerpos reconocen de forma específica el receptor de GLP-2.

Equivalentes

La especificación escrita más arriba se considera que es suficiente para facilitar que el experto en la materia practique la invención. Además, varias modificaciones de los modos descritos anteriormente de llevar a cabo la invención que son obvios para el experto en el campo de la bioquímica, la biología molecular o los campos relacionados pretenden estar dentro del objetivo de las siguientes reivindicaciones.

\global\parskip0.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: ALLELIX BIOPHARMACEUTICALS, INC.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GLUCAGÓN RECEPTORES DE TIPO PÉPTIDO 2 CLONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 28

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DIRECCIÓN: Osler, Hoskin & Harcourt

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 50 O'Connor Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Ottawa

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Ontario

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Canada K1P 6L2

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquet

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM Compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: FastSEQ Version 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/CA97/00969

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 15-DEC-1997

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE MANDATARIO /AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Aitken, David W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/ETIQUETA: 12771

\vskip0.500000\baselineskip

8607-021

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 613-235-7234

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 613-235-2867

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2575 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 137...1786

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

2

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 550 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

6

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTCTAGA ASRTSATSTA CACNGTSGGC TAC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTCTCGAG CCARCARCCA SSWRTARTTG GC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTACATCC ACMKGMAYCT GTTYVYGTCB TTCATSCT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATCTCCCT CTTCTTGGCT CTTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGACAGAT ATGACATCCA TCCAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCYRNCTGSA CCTCMYYRTT GASRAARCAG TA

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 667 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1...664

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 222 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2112 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 122...1780

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 553 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 462 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCCACTGC TTAC

\hfill

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCAGAATAG AATGACACC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGGGCCGG TACCTCTCCA CTCC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGGTCCTC GAGTGGCCAA GCTGCG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTAGTCGG TACCTCTAGA GCAAGTTCAC CC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAACAGAGG ATCCTCGAGT ATTTCTTCCA G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGGCATGT CTGGAAGACT TACTCAAGGA ACCTTCTGGC AT

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCCAGAAG GTTCCTTGAG TAAGTCTTCC AGACATGCCT GT

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCCTCTGTG GTACCAAGAG GAATGC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGACTCG AGGTACCGAT CTCACTCTCT TCCAGAATC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGGAGAGGA TTTGTGCAAA CATTTC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGACATTT CCAGGAGAAG AATGAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Thr Arg Glu Asn Thr Thr Asp Ile Trp Gln Asp Glu Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu Gly Asp Gly Ser Glu Thr Leu Gln Lys Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser His Asn Ser Ser Lys Arg Pro Asp Asp Glu Ser Gly}

Claims (32)

1. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de GLP-2 seleccionado de entre:

(a) un receptor de GLP-2 de humano que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-553 de la SEQ ID NO: 12;

(b) un receptor de GLP-2 de rata que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-550 de SEQ ID NO: 2;

(c) un homólogo de mamífero que presenta al menos el 80% de identidad de secuencia respecto a (a) o (b) que exhibe la característica funcional de unirse a GLP-2, y

(d) una variante de (a), (b), o (c) que exhibe la característica funcional de unirse selectivamente a GLP-2, comprendiendo la variante la/s sustitución/es del 1 al 20, en la que la/s sustitución/es es/son (i) una/s sustitución/es conservativa/s cuando se halla/n en una posición conservada entre los receptores (a) y (b), y/o (ii) una/s sustitución/es conservativa/s o no conservativa/s cuando se halla/n en una posición no conservada entre los receptores (a) y
(b).

2. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho receptor de GLP-2 es un receptor de GLP-2 de humano que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-553 de la SEQ ID NO: 12.

3. Un polinucleótido aislado que codifica un receptor de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho receptor de GLP-2 es un receptor de GLP-2 de rata que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-550 de la SEQ ID NO: 2.

4. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los nucleótidos 320-1780 de la SEQ ID NO: 11.

5. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que presenta los nucleótidos 335-1786 de SEQ ID NO: 1.

6. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido codifica una variante Glu85 de dicho receptor de GLP-2 de humano, tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 12.

7. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido codifica para el receptor de GLP-2 de humano y dicho polinucleótido codifica para la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 1-553 de la SEQ ID NO: 12.

8. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido codifica para el receptor de GLP-2 de humano y dicho polinucleótido codifica para la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 26-553 de la SEQ ID NO: 12.

9. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polinucleótido codifica para el receptor de GLP-2 de humano y dicho polinucleótido codifica para la secuencia aminoacídica que es al menos el 95% idéntica a los aminoácidos 26-553 de la SEQ ID NO: 12.

10. Un polinucleótido aislado que hibridiza bajo condiciones de alta estringencia con un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 9, o con el complementario de dicho polinucleótido.

11. Un oligonucleótido que comprende al menos 15 nucleótidos y que presenta una secuencia de polinucleótido que hibridiza bajo condiciones de alta estringencia a un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10 o con el complementario de dicho polinucleótido.

12. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótido del oligonucleótido es idéntica a la región del polinucleótido definida en las reivindicaciones 4 o 5 o con el complementario de dicho polinucleótido.

13. Un oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la secuencia de nucleótido del oligonucleótido es idéntica a una región común a los polinucleótidos definidos en las reivindicaciones 4 o 5, o con el complementario de dichos polinucleótidos.

14. En la forma marcada, un polinucleótido seleccionado del polinucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10.

\newpage

15. Un polinucleótido recombinante que comprende un polinucleótido que codifica el receptor de GLP-2 tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, y los elementos que controlan la expresión unidos de forma operable para conducir su expresión.

16. Una célula que se ha ingeniado genéticamente por la incorporación de forma expresa allí de un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10.

17. La célula de acuerdo con la reivindicación 16, que es una célula de mamífero.

18. Un anticuerpo que se une selectivamente a un receptor de GLP-2 codificado por el polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, 7 - 10.

19. Un receptor recombinante de GLP-2 seleccionado de:

(a) un receptor de GLP-2 de humano que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-553 de la SEQ ID NO: 12;

(b) un receptor de rata de GLP-2 que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos de 67-550 de la SEQ ID NO: 2;

(c) un homólogo de mamífero que presenta al menos un 80% de identidad de secuencia a (a) o (b) que exhibe la característica funcional de unirse selectivamente a GLP-2,

(d) una variante de (a), (b), o (c) que exhibe la característica funcional de unirse selectivamente a GLP-2, comprendiendo la variante de 1 a 20 sustitución/es aminoacídica/s, en la que las sustitución/es es/son (i) una/s sustitución/es conservativa/s cuando se halla/n en una posición conservada entre los receptores (a) y (b), y/o (ii) una/s sustitución/es conservativa/s o no conservativa/s cuando se halla/n en una posición no conservada entre los receptores (a) y (b), y

(e) una forma quimérica de (a), (b), (c) o (d) que comprende uno o más dominios de un receptor acoplado a proteína G distinto al receptor de GLP-2, en la que los dominios son un dominio transmembrana, o un dominio intracelular.

20. Un receptor de GLP-2 recombinante de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho receptor de GLP-2 es el receptor de GLP-2 de humano que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-553 de la SEQ ID NO: 12.

21. Un receptor recombinante de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 19, en el que dicho receptor de GLP-2 es un receptor de GLP-2 de rata que comprende la secuencia aminoacídica de los aminoácidos 67-550 de la SEQ ID NO: 2.

22. Un receptor recombinante de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 19, en el que el receptor de GLP-2 es una variante Glu85 del receptor de GLP-2 de humano tal y como se muestra en la SEQ ID NO: 12.

23. Un fragmento de un receptor de GLP-2 tal y como se define en las reivindicaciones 19 - 22, en el que dicho fragmento comprende una secuencia aminoacídica que constituye un dominio C-terminal intracelular de un receptor de GLP-2.

24. Un fragmento de un receptor de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 23, que comprende al menos 10 residuos de aminoácido dentro de las regiones de la SEQ ID NO: 12 correspondientes a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los aminoácidos 65-180, 363-385 y 442-533.

25. Un anticuerpo que une selectivamente a un receptor de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 19 - 21.

26. Una preparación de membrana de célula derivada de una célula de acuerdo con la reivindicación 16 o la reivindicación 17.

27. Un método para identificar los ligandos del receptor de GLP-2, que comprende los pasos de:

(1) incubar un ligando candidato con una célula tal y como se define en la reivindicación 16 o 17 o con una preparación de membrana obtenida de allí, y después

(2) determinar si la unión entre el receptor de GLP-2 y el ligando candidato ha ocurrido.

28. Un método para identificar los ligandos del receptor de GLP-2, que comprende los pasos de:

a. identificar una célula que expresa un receptor de GLP-2 funcional, conteniendo dicha célula una molécula de ADN recombinante que codifica para el receptor de GLP-2,

b. incubar un ligando candidato con la célula que expresa un receptor funcional de GLP-2, o con una preparación de membrana derivada de dicha célula; y

c. determinar si la unión entre el receptor de GLP-2 y el ligando ha ocurrido.

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el ligando candidato se incuba con una célula que produce un receptor de GLP-2 funcional, y la determinación de si la unión entre el receptor de GLP-2 y el ligando candidato ha ocurrido se consigue mediante la medida del cambio en el nivel de cAMP intracelular, en el que un aumento en el nivel de cAMP indica que el ligando candidato es un agonista de GLP-2.

30. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótido que presenta al menos el 80% de identidad de secuencia respecto a la SEQ ID NO: 1, en el que dicho polinucleótido codifica un receptor de GLP-2 de mamífero que exhibe las características funcionales de unirse selectivamente a GLP-2.

31. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótido presenta al menos un 90% de identidad de secuencia respeto la SEQ ID NO: 1, en el que dicho polinucleótido codifica un receptor de GLP-2 de mamífero que exhibe las características funcionales de unirse selectivamente a GLP-2.

32. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótido presenta al menos el 95% de identidad de secuencia de la SEQ ID NO: 1, en el que dicho polinucleótido codifica un receptor de GLP-2 de mamífero que exhibe las características funcionales de unirse selectivamente a GLP-2.