ES2287979T3 - Est 5' para proteinas secretadas identificadas a partir de tejidos cerebrales. - Google Patents
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Abstract
Esta invención presenta las secuencias de marcadores secuenciales expresados 5'' (5''ESTs) derivadas de mRNAs que codifican las proteínas segregadas. Los 5''ESTs pueden servir para obtener cDNAs y DNAs genómicos correspondientes a los 5''ESTs. Los 5''EST se pueden también emplear en diagnóstico, técnicas forenses, terapia génica, y procedimientos para trazar el mapa cromosómico. Se pueden obtener también secuencias reguladoras de corrientes anteriores empleando los 5''ESTs. Los 5''EST se pueden emplear también para diseñar vectores de expresión y vectores de secreción.
Description
EST 5' para proteínas secretadas identificadas a
partir de tejidos cerebrales.
Los 50.000-100.000 genes
estimados diseminados a lo largo de los cromosomas humanos ofrecen
una promesa tremenda para la comprensión, diagnóstico y tratamiento
de enfermedades humanas. Además, las sondas que son capaces de
hibridarse específicamente con loci distribuidos a lo largo del
genoma humano encuentran aplicación en la construcción de mapas
cromosómicos de alta resolución y en la identificación de
individuos.
En el pasado, la caracterización de incluso un
solo gen humano era un proceso laborioso, que requería años de
esfuerzo. Recientes progresos en las áreas de vectores de clonación,
secuenciación de ADN y tecnología informática se han fundido para
acelerar en gran medida la velocidad a la que los genes humanos
pueden aislarse, secuenciarse, cartografiarse y caracterizarse. Los
vectores de clonación, tales como cromosomas artificiales de
levaduras (YAC) y cromosomas artificiales bacterianos (BAC) son
capaces de aceptar insertos de ADN que varían de 300 a 1000
kilobases (kb) o 100-400 kb de longitud,
respectivamente, facilitando, con ello, la manipulación y
ordenación de secuencias de ADN distribuidas a lo largo de grandes
distancias sobre los cromosomas humanos. Las máquinas de
secuenciación de ADN automáticas permiten la rápida secuenciación de
genes humanos. Los programas bioinformáticos permiten la
comparación de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas, ayudando,
con ello, a la caracterización de productos génicos humanos.
En la actualidad se siguen dos líneas diferentes
para identificar y caracterizar los genes distribuidos a lo largo
del genoma humano. En una línea, fragmentos grandes de ADN genómico
se aislan, se clonan y se secuencian. Se identifican los marcos de
lectura abiertos potenciales de estas secuencias genómicas
utilizando programas bioinformáticos. Sin embargo, esta línea
supone secuenciar tramos largos de ADN humano que no codifican
proteínas para encontrar las secuencias codificadoras de proteínas
dispersas a lo largo del genoma. Además de requerir una extensa
secuenciación, los programas bioinformáticos pueden caracterizar
erróneamente las secuencias genómicas obtenidas. Así, el programa
puede producir falsos positivos en los que se caracteriza
erróneamente un ADN que no codifica como un ADN codificador, o
falsos negativos en los que un ADN codificador se designa
erróneamente como un ADN no codificador.
Una línea alternativa toma una ruta más directa
para identificar y caracterizar genes humanos. En esta línea, se
sintetizan ADN complementarios (ADNc) a partir de ARN mensajeros
(ARNm) aislados que codifican proteínas humanos. Utilizando esta
línea, sólo se realiza la secuenciación sobre el ADN que se deriva
de porciones codificadoras de proteínas del genoma. A menudo, sólo
se secuencian tramos cortos del ADN para obtener secuencias
denominadas marcadores de secuencia expresada (EST, "expressed
sequence tags"). Los EST entonces pueden utilizarse para aislar
o purificar ADNc extendido que incluye secuencias adyacentes a las
secuencias de EST. Los ADNc extendidos pueden contener la secuencia
completa del EST que se utilizó para obtenerlos, o sólo una porción
de la secuencia del EST que se utilizó para obtenerlos. Además, los
ADNc extendidos pueden contener la secuencia completa del gen a
partir del cual se derivó el EST o, como alternativa, los ADNc
extendidos pueden incluir porciones de la secuencia codificadora
del gen a partir del cual se derivó el EST. Se apreciará que existen
varios ADNc extendidos que incluyen la secuencia EST como resultado
de un corte alternativo o de la actividad de promotores
alternativos.
En el pasado, estas secuencias EST cortas a
menudo se obtenían de bancos de ADNc cebados con
oligo-dT. Por consiguiente, corresponden
principalmente al región 3' no traducida del ARNm. En parte, el
predominio de secuencias EST derivadas del extremo 3' del ARNm es
un resultado del hecho de que las técnicas típicas para obtener ADNc
no son adecuadas para aislar secuencias de ADNc derivadas de los
extremos 5' de los ARNm (Adams et al., Nature, 377:
3-174, 1996; Hillier et al., Genome Res.,
6: 807-828, 1996).
Además, en los casos indicados en los que se han
obtenido secuencias de ADNc más largas, las secuencias indicadas
corresponden, de forma típica, a secuencias codificadoras y no
incluyen la región 5' completa no traducida del ARNm a partir del
cual se deriva el ADNc. Estas secuencias incompletas pueden no
incluir el primer exón del ARNm, en particular en situaciones en
las que el primer exón es corto. Además, pueden no incluir algunos
exones, a menudo los que son cortos, que están colocados cadena
arriba de los sitios de corte. Por tanto, existe la necesidad de
obtener secuencias derivadas de los extremos 5' de los ARNm.
Aunque muchas secuencias derivadas de cromosomas
humanos tienen aplicaciones prácticas, las líneas basadas en la
identificación y caracterización de aquellas secuencias cromosómicas
que codifican un producto proteico son particularmente relevantes
para usos de diagnóstico y terapéuticos. De los
50.000-100.000 genes codificadores de proteínas,
aquellos genes que codifican proteínas que se segregan desde la
célula en la que se sintetizan, así como las proteínas segregadas
en sí mismas, son particularmente valiosos como agentes terapéuticos
potenciales. Estas proteínas a menudo están implicadas en la
comunicación de célula a célula, y pueden ser responsables de
producir una respuesta clínicamente importante en sus células
diana.
De hecho, varias proteínas de secreción,
incluyendo el activador de plasminógeno tisular,
G-CSF, GM-CSF, eritropoyetina,
hormona del crecimiento humana, insulina,
interferón-\alpha,
interferón-\beta,
interferón-\gamma e
interleuquina-2, tienen un uso clínico en la
actualidad. Estas proteínas se utilizan para tratar una amplia gama
de trastornos, incluyendo infarto agudo de miocardio, ictus
isquémico agudo, anemia, diabetes, deficiencia de la hormona del
crecimiento, hepatitis, carcinoma renal, neutropenia inducida por
quimioterapia, y esclerosis múltiple. Por estas razones, los ADNc
extendidos que codifican proteínas segregadas, o porciones de éstas,
representan una fuente particularmente valiosa de agentes
terapéuticos. Por tanto, existe la necesidad de identificar y
caracterizar proteínas segregadas y los ácidos nucleicos que las
codifican.
Además de ser terapéuticamente útiles en sí
mismas, las proteínas de secreción incluyen péptidos cortos,
denominados péptidos señal, en sus terminales amino, que dirigen su
secreción. Estos péptidos señal son codificados por las secuencias
señal colocadas en los extremos 5' de las secuencias codificadoras
de genes que codifican proteínas segregadas. Debido a que estos
péptidos señal dirigen la secreción extracelular de cualquier
proteína a la que estén operablemente conectados, las secuencias
señal pueden aprovecharse para dirigir la secreción eficaz de
cualquier proteína mediante la conexión operable de las secuencias
señal a un gen que codifica la proteína cuya secreción se desea.
Además, también pueden utilizarse porciones de secuencias señal para
dirigir la importación intracelular de un péptido o una proteína de
interés. Esto puede resultar beneficioso en estrategias de terapia
génica, en las que se desea dirigir un producto génico concreto a
células distintas a la célula en el que se produce. Las secuencias
señal que codifican péptidos señal también tienen aplicación para
simplificar las técnicas de purificación de proteínas. En estas
aplicaciones, la secreción extracelular de la proteína deseada
facilita en gran medida la purificación mediante la reducción del
número de proteínas no deseadas, a partir de las cuales debe
seleccionarse la proteína deseada. Por tanto, existe la necesidad de
identificar y caracterizar las porciones 5' de los genes para
proteínas de secreción que codifican péptidos señal.
La información pública sobre el número de genes
humanos para los que se han identificado y caracterizado los
promotores y las regiones reguladoras cadena arriba es bastante
limitada. En parte, esto puede ser debido a la dificultad de aislar
estas secuencias reguladoras. Las secuencias reguladoras cadena
arriba, tales como los sitios de unión del factor de transcripción,
son, de forma típica, demasiado cortas para ser utilizadas como
sondas para aislar promotores a partir de bancos genómicos humanos.
En fechas recientes se han desarrollado algunas líneas para aislar
promotores humanos. Una de ellas consiste en fabricar un banco de
isla CpG (Cross et al., Nature Genetics, 6:
236-244, 1994). La segunda consiste en aislar
secuencias de ADN genómicas humanas que contienen sitios de unión
de SpeI utilizando la proteína de unión SpI (Mortlock et al.,
Genome Res., 6: 327-335, 1996). Ambas
líneas tienen sus límites, debido a la falta de especificidad o de
exhaustividad.
Los presentes 5' EST pueden utilizarse para
identificar y aislar, de forma eficaz, regiones reguladoras cadena
arriba que controlan la colocación, etapa del desarrollo, velocidad
y cantidad de síntesis proteica, así como la estabilidad del ARNm
(Theil, BioFactors, 4: 87-93, 1993).
Cuando se han identificado y caracterizado, estas regiones
reguladoras pueden utilizarse en terapia génica o en esquemas de
purificación de proteínas para obtener la cantidad y colocación
deseadas de síntesis proteica, o para inhibir, reducir o evitar la
síntesis de productos génicos no deseables.
Además, los EST que contienen los extremos 5' de
los genes de proteínas de secreción pueden incluir secuencias
útiles como sondas para el cartografiado cromosómico y la
identificación de individuos. Por tanto, existe la necesidad de
identificar y caracterizar secuecias cadena arriba de las secuencias
codificadoras 5' de genes que codifican proteínas de secreción.
La presente invención se refiere a un péptido
señal que tiene la secuencia de aminoácidos -22 a -1 de SEQ ID
NO:307. También se describen EST purificados, aislados o
recombinantes que incluyen secuencias derivadas de los extremos 5'
auténticos de sus correspondientes ARNm. La expresión "ARNm
correspondiente" se refiere al ARNm que es el molde para la
síntesis del ADNc que produjo el 5' EST. Estas secuencias se
indicarán en lo sucesivo como "5' EST". Tal como se utiliza en
la presente, el término "purificado" no requiere una pureza
absoluta; en realidad, pretende ser una definición relativa. Los
clones de 5' EST individuales aislados a partir de un banco de ADNc
se han purificado convencionalmente hasta una homogeneidad
electroforética. Las secuencias obtenidas a partir de estos clones
no pueden obtenerse directamente del banco ni del ADN humano total.
Los clones de ADNc no aparecen en la naturaleza como tales, sino que
se obtienen mediante manipulación de una sustancia parcialmente
purificada que aparece en la naturaleza (ARN mensajero). La
conversión de ARNm en un banco de ADNc implica la creación de una
sustancia sintética (ADNc), y los clones de ADNc individuales puros
pueden aislarse a partir del banco sintético mediante selección
clónica. Por tanto, la creación de un banco de ADNc a partir de ARN
mensajero y el posterior aislamiento de clones individuales a partir
de este banco produce una purificación de aproximadamente
10^{4}-10^{6} veces del mensajero nativo. La
purificación del material de partida o material natural hasta al
menos un orden de magnitud, preferiblemente dos o tres órdenes, y
más preferiblemente cuatro o cinco órdenes de magnitud, se contempla
expresamente.
Tal como se utiliza en la presente, el término
"aislado" requiere que el material se retire de su medio
original (por ejemplo, el medio natural, si aparece en la
naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido que aparece en la
naturaleza presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo
polinucleótido, separado de algunos o de todos los materiales
coexistentes en el sistema natural, está aislado.
Tal como se utiliza en la presente, el término
"recombinante" significa que el 5' EST es adyacente al
"esqueleto" del ácido nucleico, al cual no está adyacente en
su medio natural. Además, para que estén "enriquecidos", los
5' EST deben representar 5% o más del número de insertos de ácido
nucleico en una población de moléculas de esqueleto de ácido
nucleico. Las moléculas de esqueleto según la presente invención
incluyen ácidos nucleicos, tales como vectores de expresión, ácidos
nucleicos autorreplicantes, ácidos nucleicos integrantes, y otros
vectores o ácidos nucleicos utilizados para mantener o manipular un
inserto de ácido nucleico de interés. Preferiblemente, los 5' EST
enriquecidos representan 15% o más del número de insertos de ácido
nucleico en la población de moléculas de esqueleto recombinantes.
Más preferiblemente, los 5' EST enriquecidos representan 50% o más
del número de insertos de ácido nucleico en la población de
moléculas de esqueleto recombinantes. En una realización muy
preferida, los 5' EST enriquecidos representan 90% o más del número
de insertos de ácido nucleico en la población de moléculas de
esqueleto recombinantes.
Las condiciones de hibridación "rigurosas",
"moderadas" y "bajas" son como se define en el Ejemplo
29.
A menos que se indique lo contrario, una
secuencia "complementaria" es totalmente complementaria.
Por tanto, los 5' EST en bancos de ADNc en los
que uno o más de los 5' EST constituyen 5% o más del número de
insertos de ácido nucleico en las moléculas de esqueleto son "5'
EST recombinantes enriquecidos", como se define en la presente.
De forma similar, los 5' EST en una población de plásmidos en los
que uno o más de los 5' EST de la presente invención se han
insertado de forma que representan 5% o más del número de insertos
en el esqueleto del plásmido son "5' EST recombinantes
enriquecidos", como se define en la presente. Sin embargo, los
5' EST en bancos de ADNc en los que los 5' EST constituyen menos de
5% del número de insertos de ácido nucleico en la población de
moléculas de esqueleto, tales como los bancos en los que las
moléculas de esqueleto que tienen un inserto 5' EST son
extremadamente raras, no son "5' EST recombinantes
enriquecidos".
En particular, se describen 5' EST que se
derivan de genes que codifican proteínas segregadas. Tal como se
utiliza en la presente, una proteína "segregada" es aquella
que, cuando se expresa en una célula hospedante adecuada, es
transportada a través de una membrana, incluyendo el transporte como
resultado de tener péptidos señal en su secuencia de aminoácidos.
Las proteínas "segregadas" incluyen, sin limitación, proteínas
segregadas completamente (por ejemplo, proteínas solubles) o
parcialmente (por ejemplo, receptores) a partir de la célula en la
cual se expresan. Las proteínas "segregadas" también incluyen,
sin limitación, proteínas que se transportan a través de la membrana
del retículo endoplasmático.
Estos 5' EST incluyen secuencias de ácidos
nucleicos, denominadas secuencias señal, que codifican péptidos
señal que dirigen la secreción extracelular de proteínas codificadas
por los genes a partir de los cuales se derivan los 5' EST. En
general, los péptidos señal se colocan en los
amino-terminales de las proteínas segregadas.
Las proteínas segregadas son traducidas por
ribosomas asociados con el retículo endoplasmático "rugoso". En
general, las proteínas segregadas se trasladan cotraduccionalmente
a la membrana del retículo endoplasmático. La asociación del
ribosoma con el retículo endoplasmático durante la traducción de las
proteínas segregadas es mediada por el péptido señal. El péptido
señal, de forma típica, se escinde después de su entrada
cotraduccional en el retículo endoplasmático. Después del
transporte al retículo endoplasmático, las proteínas segregadas
pueden trasladarse a través del aparato de Golgi. En el aparato de
Golgi, las proteínas pueden sufrir una modificación postraduccional
antes de entrar en vesículas secretoras que las transportan a través
de la membrana celular.
Los 5' EST descritos en la presente tienen
varias aplicaciones importantes. Por ejemplo, pueden utilizarse
para obtener y expresar clones de ADNc que incluyen las secuencias
codificadoras completas de proteínas de los correspondientes
productos génicos, incluyendo los sitios de inicio de la traducción
auténticos derivados de los extremos 5' de las secuencias
codificadoras de los ARNm a partir de los cuales derivan los 5' EST.
Estos ADNc se denominan en lo sucesivo "ADNc de longitud
completa". Estos ADNc también pueden incluir ADN derivado de
secuencias de ADNm cadena arriba del sitio de inicio de la
traducción. Las secuencias de ADNc de longitud completa pueden
utilizarse para expresar las proteínas correspondientes a los 5'
EST. Como se analizó anteriormente, las proteínas segregadas son
terapéuticamente importantes. Por tanto, las proteínas expresadas a
partir de los ADNc pueden ser útiles en el tratamiento o control de
una diversidad de trastornos humanos. Los 5' EST también pueden
utilizarse para obtener el correspondiente ADN genómico. La
expresión "correspondiente ADN genómico" se refiere al ADN
genómico que codifica el ARNm a partir del cual deriva el 5'
EST.
Como alternativa, los 5' EST pueden utilizarse
para obtener y expresar porciones codificadoras del ADNc extendido
de la proteína segregada. Las porciones pueden comprender los
péptidos señal de las proteínas segregadas o las proteínas maduras
generadas cuando el péptido señal se escinde. Las porciones también
pueden comprender polipéptidos que tienen al menos 10 aminoácidos
consecutivos codificados por los ADNc extendidos o los ADNc de
longitud completa. Como alternativa, las porciones pueden comprender
al menos 15 aminoácidos consecutivos codificados por los ADNc
extendidos o los ADNc de longitud completa. En algunas
realizaciones, las porciones pueden comprender al menos 25
aminoácidos consecutivos codificados por los ADNc extendidos o los
ADNc de longitud completa. En otras realizaciones, las porciones
pueden comprender al menos 40 aminoácidos codificados por los ADNc
extendidos o los ADNc de longitud completa.
También pueden obtenerse anticuerpos que
reconocen específicamente las proteínas segregadas completas
codificadas por los ADN c extendidos, los ADNc de longitud
completa, o sus fragmentos que tengan al menos 10 aminoácidos
consecutivos, al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25
aminoácidos consecutivos, o al menos 40 aminoácidos consecutivos,
como se describe a continuación. Los anticuerpos que reconocen
específicamente la proteína madura generada cuando se escinde el
péptido señal también pueden obtenerse como se describe a
continuación. De forma similar, también pueden obtenerse
anticuerpos que reconocen específicamente los péptidos señal
codificados por los ADNc extendidos o los ADNc de longitud
completa.
Los ADNc extendidos obtenidos utilizando los 5'
EST pueden incluir la secuencia señal. Como alternativa, los ADNc
extendidos obtenidos utilizando los 5' EST pueden incluir las
secuencias codificadoras completas para la proteína madura (e
decir, la proteína generada cuando el polipéptido señal se escinde).
Además, los ADNc extendidos obtenidos utilizando los 5' EST pueden
incluir regiones reguladoras cadena arriba del sitio de inicio de
la traducción, o cadena abajo del codón de terminación que controla
la cantidad, colocación o etapa de desarrollo de la expresión
génica.
Como se analizó anteriormente, las proteínas
segregadas son terapéuticamente importantes. Por tanto, las
proteínas expresadas a partir de los ADNc extendidos o los ADNc de
longitud completa obtenidas utilizando los 5' EST pueden ser útiles
para tratar o controlar una diversidad de trastornos humanos.
Los 5' EST (o los ADNc o ADN genómicos derivados
de ellos) pueden utilizarse en procedimientos forenses para
identificar individuos, o en procedimientos de diagnóstico para
identificar individuos que tienen enfermedades genéticas como
resultado de la expresión anómala de los genes correspondientes a
los 5' EST. Además, la presente invención es útil para construir un
mapa de alta resolución de los cromosomas humanos.
La presente invención también se refiere a
vectores de secreción capaces de dirigir la secreción de una
proteína de interés. Estos vectores pueden utilizarse en
estrategias de terapia génica en las que se desea producir un
producto génico en una célula que se va a dirigir a otro
emplazamiento en el cuerpo. Los vectores de secreción también pueden
facilitar la purificación de proteínas deseadas.
La presente invención también se refiere a
vectores de expresión capaces de dirigir la expresión de un gen
insertado de una manera espacial o temporal deseada, o a un nivel
deseado. Estos vectores pueden incluir secuencias cadena arriba de
los 5' EST, tales como promotores o secuencias reguladoras cadena
arriba.
Los péptidos señal pueden fusionarse con
proteínas heterólogas para dirigir su secreción extracelular.
Los clones bacterianos que contienen plásmidos
Bluescript tienen insertos que contienen los 5' EST (SEQ ID NO:149
está conservada en la actualidad a 80ºC en glicerol al 4% (v/v) en
los laboratorios de los inventores con la denominación listada
junto a SEQ ID NO:en II). Los insertos pueden recuperarse a partir
de los materiales depositados cultivando los clones apropiados en
un medio adecuado. El ADN de Bluescript entonces puede aislarse
utilizando procedimientos de aislamiento de plásmidos familiares
para los expertos en la técnica, tal como procedimientos de
aislamiento de plásmidos de lisis alcalina a gran escala o de
minipreps de lisis alcalina. Si se desea, el ADN del plásmido puede
enriquecerse más mediante centrifugación en un gradiente de cloruro
de cesio, cromatografía de exclusión molecular, o cromatografía de
intercambio aniónico. El ADN del plásmido obtenido utilizando estos
procedimientos pueden entonces manipularse utilizando técnicas de
clonación convencionales familiares para los expertos en la
técnica. Como alternativa, puede realizarse una PCR con cebadores
diseñados en ambos extremos de la inserción de EST. El producto de
PCR que corresponde al 5' EST entonces puede manipularse utilizando
técnicas de clonación convencionales familiares para los expertos en
la técnica.
Se describe un ácido nucleico purificado o
aislado que tiene la secuencia de SEQ ID NO:149 o que tiene una
secuencia complementaria con ésta. En una realización, el ácido
nucleico es recombinante.
Se describe un ácido nucleico purificado o
aislado que comprende al menos 10 bases consecutivas de la secuencia
de SEQ ID NO:149 o una secuencia complementaria con ésta.
Se describe un ácido nucleico purificado o
aislado que comprende al menos 15 bases consecutivas de la secuencia
de SEQ ID NO:149 o una secuencia complementaria con ésta. En una
realización, el ácido nucleico es recombinante.
También se describe un ácido nucleico purificado
o aislado de al menos 15 bases capaz de hibridarse bajo condiciones
rigurosas con la secuencia de SEQ ID NO:149 o una secuencia
complementaria con la secuencia SEQ ID NO:149. En una realización,
el ácido nucleico es recombinante.
También se describe un ácido nucleico purificado
o aislado que codifica un producto génico humano, teniendo dicho
producto génico humano una secuencia parcialmente codificada por la
secuencia de SEQ ID NO:149.
También se describe un método para fabricar un
ADNc que codifica una proteína de secreción humana, estando dicha
proteína de secreción humana parcialmente codificada por SEQ ID
NO:149, que comprende las etapas de poner en contacto una colección
de moléculas de ARNm procedentes de células humanas con un cebador
que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de una secuencia
complementaria con SEQ ID NO:149; hibridar dicho cebador con un
ARNm en dicha colección que codifica dicha proteína; transcribir de
forma inversa dicho cebador hibridado para fabricar una primera
hebra de ADNc a partir de dicho ARNm; fabricar una segunda hebra de
ADNc complementaria con dicha primera hebra de ADNc; y aislar el
ADNc resultante que codifica dicha proteína que comprende dicha
primera hebra de ADNc y dicha segunda hebra de ADNc.
También se describe un ADNc aislado o purificado
que codifica una proteína de secreción humana, comprendiendo dicha
proteína de secreción humana la proteína codificada por SEQ ID
NO:149, o un fragmento de ésta de al menos 10 aminoácidos, siendo
obtenible dicho ADNc por el método descrito en el anterior párrafo.
En una realización, el ADNc comprende la secuencia codificadora
completa de la proteína de dicha proteína cuya secuencia está
parcialmente incluida en la secuencia de SEQ ID NO:149.
También se describe un método para fabricar un
ADNc que codifica una proteína de secreción humana que está
parcialmente codificada por SEQ ID NO:149, que comprende las etapas
de obtener un ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID NO:149;
poner en contacto dicho ADNc con una sonda detectable que comprende
al menos 15 nucleótidos consecutivos de dicha secuencia de SEQ ID
NO:149, o una secuencia complementaria con ésta, bajo condiciones
que permiten a dicha sonda hibridarse con dicho ADNc; identificar un
ADNc que se hibrida con dicha sonda detectable; y aislar dicho ADNc
que se hibrida con dicha sonda.
También se describe un ADNc aislado o purificado
que condifica una proteína de secreción humana, comprendiendo dicha
proteína de secreción humana la proteína codificada por SEQ ID
NO:149, o un fragmento de ésta de al menos 10 aminoácidos, siendo
obtenible dicho ADNc por el método descrito en el anterior párrafo.
En una realización, el ADNc comprende la secuencia codificadora
completa de la proteína parcialmente incluida en la secuencia de SEQ
ID NO:149.
También se describe un método para fabricar un
ADNc que comprende la secuencia de SEQ ID NO:149, que comprende las
etapas de poner en contacto una colección de moléculas de ARNm
procedentes de células humanas con un primer cebador capaz de
hibridarse con la cola de poliA de dicho ARNm; hibridar dicho primer
cebador con dicha cola de poliA; transcribir de modo inverso dicho
ARNm para fabricar una primera hebra de ADNc; fabricar una segunda
hebra de ADNc complementaria con dicha primera hebra de ADNc
utilizando al menos un cebador que comprende al menos 15
nucleótidos de la secuencia de SEQ ID NO:149; y aislar el ADNc
resultante que comprende dicha primera hebra de ADNc y dicha segunda
hebra de ADNc.
También se describe un ADNc aislado o purificado
que codifica una proteína de secreción humana, comprendiendo dicha
proteína de secreción humana la proteína codificada por SEQ ID
NO:149, o un fragmento de ésta de al menos 10 aminoácidos, siendo
obtenible dicho ADNc por el método descrito en el anterior párrafo.
En una realización, el ADNc comprende la secuencia codificadora
completa de la proteína parcialmente incluida en la secuencia de SEQ
ID NO:149.
En una realización del método descrito en los
dos párrafos anteriores, la segunda hebra de ADNc se fabrica
poniendo en contacto dicha primera hebra de ADNc con un primer par
de cebadores, comprendiendo dicho primer par de cebadores un
segundo cebador que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos
de la secuencia de SEQ ID NO:149, y un tercer cebador que tiene una
secuencia en su interior que está incluida dentro de la secuencia
de dicho primer cebador; realizar una primera reacción en cadena de
polimerasa con dicho primer par de cebadores anidados para generar
un primer producto de PCR; poner en contacto dicho primer producto
de PCR con un segundo par de cebadores, comprendiendo dicho segundo
par de cebadores un cuarto cebador, comprendiendo dicho cuarto
cebador al menos 15 nucleótidos consecutivos de dicha secuencia de
SEQ ID NO:149, y un quinto cebador, siendo capaces dichos cuarto y
quinto cebadores de hibridarse con secuencias dentro de dicho primer
producto de PCR; y realizar una segunda reacción en cadena con
polimerasa, generando, con ello, un segundo producto de PCR.
También se describe un ADNc aislado o purificado
que codifica una proteína de secreción humana, comprendiendo dicha
proteína de secreción humana la proteína codificada por SEQ ID
NO:149, o un fragmento de ésta de al menos 10 aminoácidos, siendo
obtenible dicho ADNc por el método descrito en el anterior párrafo.
En una realización, el ADNc comprende la secuencia codificadora
completa de la proteína parcialmente incluida en la secuencia de SEQ
ID NO:149.
También se describe el método descrito cuatro
párrafos antes, en el que la segunda hebra de ADNc se fabrica
poniendo en contacto dicha primera hebra de ADNc con un segundo
cebador que comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos de la
secuencia de SEQ ID NO:149; hibridar dicho segundo cebador con dicha
primera hebra de ADNc; y extender dicho segundo cebador hibridado
para generar dicha segunda hebra de ADNc.
También se describe un ADNc aislado o purificado
que codifica una proteína de secreción humana, comprendiendo dicha
proteína de secreción humana la proteína parcialmente codificada por
SEQ ID NO:149, o comprendiendo un fragmento de ésta de al menos 10
aminoácidos, siendo obtenible dicho ADNc por el método descrito en
el anterior párrafo. En una realización, el ADNc comprende la
secuencia codificadora completa de la proteína parcialmente incluida
en la secuencia de SEQ ID NO:149.
También se describe un método para fabricar una
proteína que comprende la secuencia de SEQ ID NO:307, que comprende
las etapas de obtener un ADNc que codifica la secuencia completa de
la proteína parcialmente incluida en la secuencia de SEQ ID NO:149;
insertar dicho ADNc en un vector de expresión, de forma que dicho
ADNc está operablemente conectado con un promotor; introducir dicho
vector de expresión en una célula hospedante, mediante lo cual
dicha célula hospedante produce la proteína codificada por dicho
ADNc; y aislar dicha proteína.
También se describe una proteína aislada
obtenible mediante el método descrito en el anterior párrafo.
También se describe un método para obtener un
ADN promotor que comprende las etapas de obtener ADN colocados
cadena arriba del ácido nucleico de SEQ ID NO:149, o secuencias
complementarias con éste; seleccionar dichos ADN cadena arriba para
identificar un promotor capaz de dirigir el inicio de la
transcripción; y aislar dicho ADN que comprende dicho promotor
identificado. En una realización, la etapa de obtención comprende un
paseo cromosómico desde dicho ácido nucleico de SEQ ID NO:149, o
una secuencia complementaria con éste. En otra realización, la
etapa de selección comprende insertar dichas secuencias cadena
arriba en un vector indicador promotor. En otra realización, la
etapa de selección comprende identificar motivos en dichos ADN
cadena arriba que son sitios de unión del factor de transcripción o
sitios de inicio de la transcripción.
También se describe una proteína aislada o
purificada que comprende la secuencia de SEQ ID NO:307.
También se describe la inclusión de la secuencia
de SEQ ID NO:149, o la secuencia complementaria con la secuencia de
SEQ ID NO:149, o un fragmento de al menos 15 nucleótidos
consecutivos, en una serie de EST discretos, o fragmentos de éstos
de al menos 15 nucleótidos de longitud.
También se describe un promotor que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 31, 34
y 37.
La Figura 1 es un resumen de un procedimiento
para obtener ADNc que se han seleccionado para incluir los extremos
5' de los ARNm de los cuales han derivado.
La Figura 2 muestra la distribución de
puntuaciones de Von Heijne para 5' EST en cada una de las categorías
descritas en la presente, y la probabilidad de que estos 5' EST
codifiquen un péptido señal.
La Figura 3 resume un método general utilizado
para clonar y secuenciar ADNc extendidos que contienen secuencias
adyacentes a 5' EST.
La Figura 4 (descripción de estructuras de
promotores aislados a partir de SignalTag 5' EST) proporciona una
descripción esquemática de promotores aislados y la forma en que se
ensamblan con los correspondientes marcadores 5'.
La Tabla IV es un análisis de los 43 aminoácidos
colocados en el N-terminal de todas las proteínas
SwissProt humanas para determinar la frecuencia de falsos positivos
y falsos negativos utilizando las técnicas para la identificación de
péptidos señal descritas en la presente.
La Tabla V muestra la distribución de 5' EST en
cada categoría descrita en la presente y el número de 5' EST en cada
categoría que tiene un puntuación mínima de Von Heijne dada.
La Tabla VI muestra la distribución de 5' EST en
cada categoría descrita en la presente con respecto al tejido a
partir del cual se obtienen los 5' EST del correspondiente ARNm.
La Tabla VII describe los sitios de unión del
factor de transcripción presentes en cada uno de estos
promotores.
Para obtener los 5' EST descritos en la
presente, deben obtenerse ARNm con extremos 5' intactos. En la
actualidad existen dos líneas para obtener dichos ARNm con extremos
5' intactos, como se describe a continuación: (1) métodos químicos,
o (2) métodos enzimáticos.
Una de estas líneas es un método de modificación
química que implica la derivatización de los extremos 5' de los
ARNm y la selección de los ARNm derivatizados. Los extremos 5' de
ARNm eucariotas poseen una estructura denominada "caperuza",
que comprende una guanosina metilada en la posición 7. La caperuza
se une a la primera base trancrita del ARNm mediante un enlace
5',5'-trifosfato. En algunos casos, la
5'-guanosina se metila en las posiciones 2 y 7. En
casos más raros, la 5'-guanosina se trimetila en las
posiciones 2, 7 y 7. En el método químico para obtener ARNm que
tienen extremos 5' intactos, la caperuza 5' se derivatiza
específicamente y se acopla a un grupo reactivo sobre un sustrato
inmovilizante. Esta derivatización específica se basa en el hecho
de que sólo la ribosa enlazada o la guanosina metilada en el extremo
5' del ARNm y la ribosa enlazada a la base en el
3'-terminal del ARNm, poseen
2',3'-cis-dioles.
Opcionalmente, el
2',3'-cis-diol de la ribosa
3'-terminal puede modificarse, sustituirse,
convertirse o eliminarse químicamente, dejando sólo la ribosa unida
a la guanosina metilada en el extremo 5' del ARNm con un
2',3'-cis-diol. Están disponibles
una diversidad de técnicas para eliminar el
2',3'-cis-diol sobre la ribosa
3'-terminal. Por ejemplo, puede utilizarse una
hidrólisis alcalina controlada para generar fragmentos de ARNm en
los que la ribosa 3'-terminal es un
3'-fosfato, 2'-fosfato o
(2',3')-ciclofosfato. Después, el fragmento que
incluye la ribosa 3' original puede eliminarse de la mezcla
mediante cromatografía en una columna oligodT. Como alternativa,
una base que carece del
2',3'-cis-diol puede añadirse al
extremo 3' del ARNm utilizando una ARN ligasa, tal como ARN ligasa
de T4. El ejemplo 1 a continuación describe un método para el
acoplamiento de un nucleósido difosfato al extremo 3' del ARN
mensajero.
Se incubó 1 \mug de ARN en un medio de
reacción final de 10 \mul en presencia de 5 U de ARN ligasa de
fago T_{4} en el tampón proporcionado por el fabricante
(Gibco-BRL), 40 U de inhibidor de ARNasa RNasin
(Promega), y 2 \mul de ^{32}pCp (Amersham, nº PB 10208). La
incubación se realizó a 37ºC durante 2 horas, o durante la noche a
7-8ºC.
Después de la modificación o eliminación del
2',3'-cis-diol en la ribosa 3', el
2',3'-cis-diol presente en el
extremo 5' del ARNm puede oxidarse utilizando reactivos, tales como
NaBH_{4}, NaBH_{3}CN, o peryodato de sodio, convirtiendo, con
ello, el 2',3'-cis-diol en un
dialdehído. El Ejemplo 2 describe la oxidación del
2',3'-cis-diol en el extremo 5' del
ARNm con peryodato de sodio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se trataron 0,1 unidades OD de un
oligorribonucleótido con caperuza de 47 nucleótidos (incluyendo la
caperuza), o un oligorribonucleótido sin caperuza de 46
nucleótidos, como sigue. Los oligorribonucleótidos se produjeron
mediante transcripción in vitro utilizando el kit de
transcripción "AmpliScribe T7" (Epicentre Technologies). Como
se indica a continuación, el molde de ADN para el transcripto de ARN
contenía una única citosina. Para sintetizar el ARN sin caperuza,
se incluyeron los cuatro NTP en la reacción de transcripción in
vitro. Para obtener el ARN con caperuza, se sustituyó el GTP
por un análogo de la caperuza, m7G(5')ppp(5')G. Este
compuesto, reconocido por la polimerasa, se incorporó en el extremo
5' del transcripto naciente durante el inicio de la transcripción,
pero no se incorporó durante la etapa de extensión. Por
consiguiente, el ARN resultante contenía una caperuza en su extremo
5'. Las secuencias de los oligorribonucleótidos producidos mediante
la reacción de transcripción in vitro eran:
\vskip1.000000\baselineskip
| +caperuza: | |
| 5'm7GpppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC-3' | (SEQ ID NO:1) |
| -caperuza: | |
| 5'-pppGCAUCCUACUCCCAUCCAAUUCCACCCUAACUCCUCCCAUCUCCAC-3' | (SEQ ID NO:2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligorribonucleótidos se disolvieron en 9
\mul de tampón acetato (acetato de sodio 0,1 M, pH 5,2) y 3
\mul de disolución de peryodato de sodio 0,1 M recién preparada.
La mezcla se incubó durante 1 hora en la oscuridad a 4ºC o
temperatura ambiente. Después, la reacción se detuvo mediante la
adición de 4 \mul de etilenglicol al 10%. El producto se
precipitó con etanol, se resuspendió en al menos 10 \mul de agua o
tampón apropiado y se dializó contra agua.
Los grupos aldehído resultantes entonces pueden
acoplarse a moléculas que tienen un grupo amina reactivo, tales
como grupos hidrazina, carbazida, tiocarbazida o semicarbazida, para
facilitar el enriquecimiento de los extremos 5' de los ARNm. Las
moléculas que tienen grupos amina reactivos que son adecuadas para
su uso en la selección de ARNm que tienen extremos 5' intactos
incluyen avidina, proteínas, anticuerpos, vitaminas, ligandos
capaces de unirse de forma específica a moléculas de receptor, u
oligonucleótidos. El Ejemplo 3 a continuación describe el
acoplamiento del dialdehído resultanta a biotina.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto de la oxidación obtenido en el
Ejemplo 2 se disolvió en 50 \mul de acetato de sodio a un pH
entre 5 y 5,2, y 50 \mul de disolución recién preparada de
hidrazida de biotina 0,02 M en una mezcla de metoxietanol/agua (1:1)
de fórmula:
En el compuesto utilizado en estos experimentos,
n = 5. Sin embargo, se apreciará que también pueden utilizarse
otras hidrazidas disponibles en el mercado, tales como moléculas de
la fórmula anterior en la que n varía de 0 a 5. La mezcla entonces
se incubó durante 2 horas a 37ºC, se precipitó con etanol y se
dializó contra agua destilada. El Ejemplo 4 demuestra la
especificidad de la reacción de biotinilación.
Se evaluó la especificidad de la biotinilación
en ARNm con caperuza mediante electroforesis en gel de las
siguientes muestras:
Muestra 1. El transcripto de 46 nucleótidos sin
caperuza in vitro preparado como en el Ejemplo 2, y marcado
con ^{32}pCp como se describe en el Ejemplo 1.
Muestra 2. El transcripto de 46 nucleótidos sin
caperuza in vitro preparado como en el Ejemplo 2, marcado
con ^{32}pCp como se describe en el Ejemplo 1, tratado con la
reacción de oxidación del Ejemplo 2, y sometido a las condiciones de
biotinilación del Ejemplo 3.
Muestra 3. El transcripto de 47 nucleótidos con
caperuza in vitro preparado como en el Ejemplo 2, y marcado
con ^{32}pCp como se describe en el Ejemplo 1.
Muestra 4. El transcripto de 47 nucleótidos con
caperuza in vitro preparado como en el Ejemplo 2, marcado
con ^{32}pCp como se describe en el Ejemplo 1, tratado con la
reacción de oxidación del Ejemplo 2, y sometido a las condiciones de
biotinilación del Ejemplo 3.
Las muestras 1 y 2 tenían idéntica velocidad de
migración, demostrando que los ARN sin caperuza no estaban oxidados
y biotinilados. La muestra 3 migra más lentamente que las muestras 1
y 2, mientras que la muestra 4 exhibe la migración más lenta. La
diferencia en la migración de los ARN de las muestras 3 y 4
demuestra que los ARN con caperuza estaban específicamente
biotinilados.
En algunos casos, los ARNm que tienen extremos
5' intactos pueden enriquecerse uniendo la molécula que contiene un
grupo amina reactivo a un sustrato en fase sólida adecuado, tal como
el interior de un recipiente que los ARNm, esferas magnéticas,
matrices de cromatografía, o membranas de nailon o nitrocelulosa.
Por ejemplo, cuando la molécula que tiene un grupo amina reactivo
es biotina, el sustrato en fase sólida puede estar acoplado con
avidina o estreptavidina. Como alternativa, cuando la molécula que
tiene el grupo amina reactivo es un anticuerpo o ligando de
receptor, el sustrato en fase sólida puede acoplarse al antígeno o
receptor cognado. Por último, cuando la molécula que tiene un grupo
amina reactivo comprende un oligonucleótido, el sustrato en fase
sólida puede comprender un oligonucleótido complementario.
Los ARNm que tienen extremos 5' intactos pueden
liberarse de la fase sólida después del procedimiento de
enriquecimiento. Por ejemplo, cuando el dialdehído se acopla a la
hidrazida de biotina y la fase sólida comprende estreptavidina, los
ARNm pueden liberarse de la fase sólida simplemente calentando hasta
95ºC en SDS al 2%. En algunos métodos, la molécula que tiene un
grupo amina reactivo también pueden escindirse de los ARNm que
tienen extremos 5' intactos después del enriquecimiento. El Ejemplo
5 describe la captura de ARNm biotinilados con esferas revestidas
con estreptavidina, y la liberación de los ARNm biotinilados de las
esferas después del enriquecimiento.
Las esferas magnéticas revestidas con
estreptavidina se prepararon según las instrucciones del fabricante
(CPG Inc., EEUU). Los ARNm biotinilados se añadieron a un tampón de
hibridación (NaCl 1,5 M, pH 5-6). Después de
incubar durante 30 minutos se retiró el material no unido y no
biotinilado. Las esferas entonces se lavaron varias veces en agua
con SDS al 1%. Las esferas obtenidas de esta manera se incubaron
durante 15 minutos a 95ºC en agua que contenía SDS al 2%.
El Ejemplo 6 demuestra la eficacia con la que se
recuperaron los ARNm de las esferas revestidas con
estreptavidina.
Se evaluó la eficacia del procedimiento de
recuperación como sigue. Se marcaron ARN con caperuza con
^{32}pCp, se oxidaron, se biotinilaron y se unieron a esferas
revestidas con estreptavidina como se describió anteriormente.
Posteriormente, los ARN unidos se incubaron durante 5, 15 ó 30
minutos a 95ºC en presencia de SDS al 2%.
Los productos de la reacción se analizaron
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% bajo
condiciones desnaturalizantes (urea 7 M). Los geles se sometieron a
autorradiografía. Durante esta manipulación, los enlaces de
hidrazona no se redujeron.
Se recuperaron cantidades crecientes de ácidos
nucleicos a medida que los tiempos de incubación en SDS al 2%
aumentaron, demostrando que los ARNm biotinilados se recuperaron de
forma eficaz.
En un método alternativo para obtener ARNm que
tienen extremos 5' intactos, un oligonucleótido que se había
derivatizado para que contenga un grupo amina reactivo se acopló de
forma específica a ARNm que tienen una caperuza intacta.
Preferiblemente, el extremo 3' del ARNm se bloquea antes de la etapa
en la que los grupos aldehído se unen al oligonucleótido
derivatizado, como se describió anteriormente, para evitar que el
oligonucleótido derivatizado se una al extremo 3' del ARNm. Por
ejemplo, puede unirse pCp al extremo 3' del ARNm utilizando ARN
ligasa de T4 como se describió en el Ejemplo 1. Sin embargo, como se
analizó anteriormente, el bloqueo del extremo 3' del ARNm es una
etapa opcional. Los oligonucleótidos derivatizados pueden prepararse
como se describe en el Ejemplo 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Un oligonucleótido fosforilado en su extremo 3'
se convirtió en una 3'-hidrazida en 3' mediante un
tratamiento con una disolución acuosa de hidrazina o de dihidrazida
de fórmula H_{2}N(R1)NH_{2} desde aproximadamente
1 a 3 M, y a pH 4,5 a una temperatura de 8ºC durante la noche. Esta
incubación se realizó en presencia de un agente de tipo
carbodiimida soluble en agua, tal como
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
a una concentración final de
0,3 M.
0,3 M.
El oligonucleótido derivatizado entonces se
separó de los otros agentes y los productos utilizando una técnica
convencional para aislar oligonucleótidos.
Como se analizó anteriormente, los ARNm que van
a ser enriquecidos se trataron para eliminar los grupos 3' OH que
pueden estar presentes sobre ellos. Esto puede lograrse mediante
acoplamiento enzimático de secuencias que carecen de 3' OH, tal
como pCp, como se describió en el Ejemplo 1. Como alternativa, los
grupos 3' OH pueden eliminarse mediante hidrólisis alcalina como se
describe en el Ejemplo 8, a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
En un volumen total de 100 \mul de hidróxido
de sodio 0,1 N, se incubaron 1,5 \mug de ARNm durante 40 a 60
minutos a 4ºC. La disolución se neutralizó con ácido acético y se
precipitó con etanol.
Después de la eliminación opcional de los grupos
3' OH, los grupos diol en los extremos 5' de los ARNm se oxidaron
como se describe a continuación en el Ejemplo 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron hasta 1 unidades OD de ARN en 9
\mul de tampón (acetato de sodio 0,1 M, pH 6-7) o
agua y 3 \mul de disolución de peryodato de sodio 0,1 M recién
preparada. La reacción se incubó durante 1 h en la oscuridad a 4ºC
o a temperatura ambiente. Después de la incubación, la reacción se
detuvo mediante la adición de 4 \mul de etilenglicol al 10%.
Después la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 15
minutos. Después de la precipitación en etanol, el producto se
resuspendió en al menos 10 \mul de agua o del tampón apropiado, y
se dializó contra agua.
Después de la oxidación de los grupos diol en
los extremos 5' de los ARNm, el oligonucleótido derivatizado se
unió a los aldehídos resultantes como se describe en el Ejemplo
10.
El ARNm oxidado se disolvió en un medio ácido,
tal como 50 \mul de acetato de sodio, pH 4-6. Se
añadieron 50 \mul de una disolución del oligonucleótido
derivatizado para obtener una proporción de ARNm:oligonucleótido
derivatizado de 1:20. La mezcla se redujo con un borohidruro y se
incubó durante 2 h a 37ºC o durante la noche (14 h) a 10ºC. La
mezcla entonces se precipitó con etanol, se resuspendió en 10 \mul
o más de agua o del tampón apropiado, y se dializó contra agua
destilada. Si se desea, el producto resultante puede analizarse
utilizando electroforesis en gel de acrilamida, análisis HPLC, u
otras técnicas convencionales.
Después de la unión del oligonucleótido
derivatizado a los ARNm, puede realizarse una reacción de
transcripción inversa como se describe en el Ejemplo 11, a
continuación.
Un oligodesoxirribonucleótido se derivatizó como
sigue. Se disolvieron 3 unidades OD de un oligodesoxirribonucleótido
de secuencia 5'ATCAAGAATTCGCACGAGACCATTA3' (SEQ ID NO:3) que tiene
extremos 5'-OH y 3'-P, en 70 \mul
de una disolución de hidroxibenzotriazol 1,5 M, pH 5,3, preparada
en dimetilformamida/agua (75:25) que contiene 2 \mug de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
La mezcla se incubó durante 2 h 30 min a 22ºC y después se
precipitó dos veces en LiClO_{4}/acetona. El sedimento se
resuspendió en 200 \mul de hidrazina 0,25 M y se incubó a 8ºC
desde 3 a 14 h. Después de la reacción de hidrazina, la mezcla se
precipitó dos veces en LiClO_{4}/acetona.
Los ARN mensajeros que se van a someter a una
transcripción inversa se extrajeron de bloques de placenta que
tienen lados de 2 cm, que se habían conservado a -80ºC. El ARN total
se extrajo utilizando técnicas de fenol ácidas convencionales. Se
utilizó una cromatografía con oligo-dT para
purificar los ARNm. La integridad de los ARNm se comprobó mediante
análisis de la transferencia Northern.
Los grupos diol en 7 \mug de ARNm de placenta
se oxidaron como se describió anteriormente en el Ejemplo 9. El
oligonucleótido derivatizado se unió a los ARNm como se describió en
el Ejemplo 10 anterior, excepto que la etapa de precipitación se
sustituyó por una etapa de cromatografía de exclusión para eliminar
los oligodesoxirribonucleótidos derivatizados que no se habían
unido a los ARNm. La cromatografía de exclusión se realizó como
sigue:
Se equilibraron 10 ml de gel Ultrogel AcA34
(BioSepra nº 230151), una mezcla de agarosa y acrilamida, en 50 ml
de una disolución de Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, EDTA 1 mM, y
SDS al 0,05%. Se dejó que la mezcla sedimentase. El sobrenadante se
eliminó y el gel se resuspendió en 50 ml de tampón. Este
procedimiento se repitió 2 ó 3 veces.
Se introdujo una esfera de vidrio (diámetro de 3
mm) en una pipeta desechable de 2 ml (longitud de 25 cm). La pipeta
se llenó con la suspensión del gel hasta que la altura del gel se
estabilizó a 1 cm del extremo superior de la pipeta. La columna
entonces se equilibró con 20 ml de tampón de equilibrio (Tris HCl 10
mM, pH 7,4, NaCl 20 mM).
Se mezclaron 10 \mul del ARNm que se había
hecho reaccionar con el oligonucleótido derivatizado, en 39 \mul
de urea 10 mM y 2 \mul de tampón de azul de glicerol, que se ha
preparado disolviendo 5 mg de azul de bromofenol en glicerol al 60%
(v/v), y haciendo pasar la mezcla a través de un filtro de diámetro
0,45 \mum.
La columna entonces se cargó con los ARNm
acoplados al oligonucleótido. En cuanto la muestra hubo penetrado
se añadió tampón de equilibrio. Entonces se recogieron fracciones de
100 \mul. El oligonucleótido derivatizado que no se ha unido al
ARNm aparece en la fracción 16 y las fracciones posteriores. Por
tanto, las fracciones 3 a 15 se reunieron y se precipitaron con
etanol.
Para determinar si el oligonucleótido
derivatizado estaba realmente unido al ARNm, una décima parte de las
fracciones reunidas se rociaron dos veces sobre una membrana de
nailon y se hibridaron con una sonda radiactiva utilizando técnicas
convencionales. La sonda marcada con ^{32}P utilizada en estas
hibridaciones era un oligodesoxirribonucleótido de secuencia 5'
TAATGGTCTCGTGCGAATTCTTGAT 3' (SEQ ID NO :4) anticomplementaria con
el oligonucleótido derivatizado. Se observó una señal después de la
autorradiografía, indicando que el oligonucleótido derivatizado sí
estaba realmente unido al ARNm.
Con el resto de las nueve décimas partes de los
ARNm que habían reaccionado con el oligonucleótido derivatizado se
realizó una transcripción inversa como sigue. Se llevó a cabo una
reacción de transcripción inversa con transcriptasa inversa
siguiendo las instrucciones del fabricante, y se utilizaron 50 pmol
de nonámeros con secuencias aleatorias como cebadores.
Para asegurarse de que la transcripción inversa
se había llevado a cabo a través de la estructura de caperuza se
realizaron dos tipos de experimentos.
En el primer tipo, después de la eliminación del
ARN de los heterodúplex de ADNc:ARN obtenidos de la reacción de
transcripción inversa mediante una hidrólisis alcalina, una porción
de los ADNc monocatenarios resultantes se roció sobre una membrana
cargada positivamente y se híbrido, utilizando métodos
convencionales, con una sonda marcada con ^{32}P que tiene una
secuencia idéntica a la del oligonucleótido derivatizado. Se
incluyeron rociados control contenían 1 pmol, 100 fmol, 50 fmol, 10
fmol y 1 fmol de un oligodesoxirribonucleótido control con una
secuencia idéntica a la del oligonucleótido derivatizado. La señal
observada en los rociados que contienen ADNc indicó que
aproximadamente 15 fmol del oligonucleótido derivatizado había sido
transcrito de modo inverso. Estos resultados demuestran que la
transcripción inversa puede realizarse a través de la caperuza y, en
particular, que la transcriptasa inversa atraviesa el enlace
5'-P-P-P-5'
de la caperuza de los ARN mensajeros de eucariotas.
En el segundo tipo de experimento, los ADNc
monocatenarios obtenidos a partir de la anterior síntesis de la
primera hebra se utilizaron como moldes para reacciones PCR. Se
realizaron dos tipos de reacciones. En primer lugar, se realizó una
amplificación específica de los ARNm para
alfa-globina, deshidrogenasa, pp15 y factor de
elongación E4 utilizando las siguientes parejas de cebadores de
oligodesoxirribonucleótidos.
| alfa-globina | ||
| GLO-S: | 5' CCG ACA AGA CCA ACG TCA AGG CCG C 3' | (SEQ ID NO:5) |
| GLO-As: | 5' TCA CCA GCA GGC AGT GGC TTA GGA G 3' | (SEQ ID NO :6) |
\vskip1.000000\baselineskip
| deshidrogenasa | ||
| 3 DH-S: | 5' AGT GAT TCC TGC TAC TTT GGA TGG C 3' | (SEQ ID NO:7) |
| 3 DH-As: | 5' GCT TGG TCT TGT TCT GGA GTT TAG A 3' | (SEQ ID NO:8) |
\vskip1.000000\baselineskip
| pp15 | ||
| PP15-S: | 5' TCC AGA ATG GGA GAC AAG CCA ATT T 3' | (SEQ ID NO:9) |
| PP15-As: | 5' AGG GAG GAG GAA ACA GCG TGA GTC C 3' | (SEQ ID NO:10) |
\vskip1.000000\baselineskip
| factor de elongación E4 | ||
| EFA1-S: | 5' ATG GGA AAG GAA AAG ACT CAT ATC A 3' | (SEQ ID NO:11) |
| EF1A-As: | 5' AGC AGC AAC AAT CAG GAC AGC ACA G 3' | (SEQ ID NO:12) |
\vskip1.000000\baselineskip
En segundo lugar, también se realizaron
amplificaciones no específicas con los oligodesoxirribonucleótidos
antisentido de las parejas descritas anteriormente, y con un cebador
derivado de la secuencia del oligodesoxirribonucleótido
derivatizado (5'ATCAAGAATTCGCACGAGACCATTA3') (SEQ ID NO:13).
Una vigésima parte de las siguientes muestras
del producto de RT-PCR se ensayaron en un gel de
agarosa al 1,5% y se tiñeron con bromuro de etidio.
Muestra 1: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de globina de SEQ ID NOs 5 y 6 en presencia
de ADNc.
Muestra 2: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de globina de SEQ ID NOs 5 y 6 en ausencia
de ADNc añadido.
Muestra 3: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de deshidrogenasa de SEQ ID NOs 7 y 8 en
presencia de ADNc.
Muestra 4: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de deshidrogenasa de SEQ ID NOs 7 y 8 en
ausencia de ADNc añadido.
Muestra 5: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de pp15 de SEQ ID NOs 9 y 10 en presencia
de ADNc.
Muestra 6: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de pp15 de SEQ ID NOs 9 y 10 en ausencia de
ADNc añadido.
Muestra 7: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de EIF4 de SEQ ID NOs 11 y 12 en presencia
de ADNc añadido.
Muestra 8: los productos de la reacción PCR
utilizando los cebadores de EIF4 de SEQ ID NOs 11 y 12 en ausencia
de ADNc añadido.
Se observó una banda del tamaño esperado para el
producto de PCR sólo en las muestras 1, 3, 5 y 7, indicando, con
ello, la presencia de la correspondiente secuencia en la población
de ADNc.
Las reacciones PCR también se realizaron con los
oligonucleótidos antisentido de los cebadores de globina y
deshidrogenasa (SEQ ID NOs 6 y 8), y un oligonucleótido cuya
secuencia se corresponde con la del oligonucleótido derivatizado.
La presencia de productos de PCR del tamaño esperado en las muestras
equivalentes a las anteriores muestras 1 y 3 indica que el
oligonucleótido derivatizado se ha unido al ARNm.
Los anteriores Ejemplos resumen el procedimiento
químico para enriquecer ARNm para los que tienen extremos 5'
intactos, como se ilustra en la Figura 1. Otros detalles con
respecto al procedimiento químico para obtener estos ARNm se
describen en la Solicitud Internacional nº WO96/34981, publicada el
7 de Noviembre, 1996. Las estrategias basadas en las anteriores
modificaciones químicas en la estructura de caperuza 5' pueden
utilizarse para generar ADNc seleccionados para que incluyan los
extremos 5' de los ARNm de los cuales derivan. En una versión de
estos procedimientos, los extremos 5' de los ARNm se modifican como
se describió anteriormente. Después se realiza una reacción de
transcripción inversa para extender un cebador complementario al
extremo 5' del ARNm. Los ARN monocatenarios se eliminan para
obtener una población de heterodúplex de ADNc/ARNm en los que el
ARNm incluye un extremo 5' intacto. Los heterodúplex resultantes
pueden capturarse sobre una fase sólida revestida con una molécula
capaz de interaccionar con la molécula utilizada para derivatizar el
extremo 5' del ARNm. Después, las hebras de los heterodúplex se
separan para recuperar las primeras hebras del ADNc monocatenario
que incluyen el extremo 5' del ARNm. Entonces puede realizarse la
síntesis de la segunda hebra del ADNc utilizando técnicas
convencionales. Por ejemplo, los procedimientos descritos en el
documento WO 96/34981, o en Carnici et al., Genomics,
37: 327-336, 1996, pueden emplearse para
seleccionar ADNc que incluyen la secuencia derivada del extremo 5'
de la secuencia codificadora del ARNm.
Después del acoplamiento del marcador de
oligonucleótido a la caperuza 5' del ARNm se realiza una reacción
de transcripción inversa para extender un cebador complementario con
el ARNm en el extremo 5' del ARNm. Después de la eliminación del
componente de ARN del heterodúplex resultante utilizando técnicas
convencionales, se realiza la síntesis de la segunda hebra del ADNc
con un cebador complementario con el marcador de
oligonucleótido.
Otras técnicas para seleccionar ADNc que se
extiende hasta el extremo 5' del ARNm del que deriva son totalmente
enzimáticas. Algunas versiones de estas técnicas se describen en
Dumas Milne Edwards, J.B. (Tesis doctoral de la Universidad de
París VI, Le clonage des ADNc complets: dificultes et perspectives
nouvelles. Apports pour l'etude de la regulation de l'expression de
la tryptophane hydroxylase de rat, 20 de Diciembre, 1993),
documento EPO 625572, y Kato et al., Gene, 150:
243-250, 1994.
Brevemente, en estas técnicas, el ARNm aislado
se trata con fosfatasa alcalina para eliminar los grupos fosfato
presentes en los extremos 5' de los ARNm incompletos sin caperuza.
Después de este procedimiento, la caperuza presente en los ARNm de
longitud completa se elimina enzimáticamente con una enzima de
eliminación de caperuza, tal como polinucleótido quinasa de T4 o
pirofosfatasa ácida de tabaco. Un oligonucleótido, que puede ser un
oligonucleótido de ADN o un oligonucleótido híbrido de
ADN-ARN que tiene ARN en su extremo 3', se acopla
entonces al fosfato presente en el extremo 5' del ARNm sin caperuza
utilizando ARN ligasa de T4. El oligonucleótido puede incluir un
sitio de restricción para facilitar la clonación de los ADNc después
de su síntesis. El Ejemplo 12 a continuación describe un método
enzimático basado en la tesis doctoral de Dumas.
Se desfosforilaron 20 microgramos de ARN poliA+
utilizando fosfatasa de intestino de ternera (Biolabs). Después de
una extracción en fenol y cloroformo, la estructura de caperuza del
ARNm se hidrolizó utilizando la pirofosfatasa ácida de tabaco
(purificada como se describe en Shinshi et al., Biochemistry,
15: 2185-2190, 1976), y un
hemioligonucleótido 5'ADN/ARN-3' que tiene un
extremo 5' no fosforilado, un tramo de adenosina ribofosfato en el
extremo 3', y un sitio EcoRI cerca del extremo 5', se acopló a los
extremos 5'P del ARNm utilizando la ARN ligasa de T4 (Biolabs). Los
oligonucleótidos adecuados para su uso en este procedimiento tienen
una longitud de preferiblemente 30 a 50 bases. Los oligonucleótidos
que tienen un extremo 5' no fosforilado pueden sintetizarse
añadiendo un fluorocromo al extremo 5'. La inclusión de un tramo de
adenosina ribofosfatos en el extremo 3' del oligonucleótido aumenta
la eficacia del acoplamiento. Se apreciará que el oligonucleótido
puede contener sitios de clonación diferentes de EcoRI.
Después del acoplamiento del oligonucleótido al
fosfato presente en el extremo 5' del ARNm sin caperuza, se realiza
la síntesis de la primera y segunda hebra del ARNc utilizando
métodos convencionales, o los indicados en el documento EPO
625.572, y Kato et al., supra, y Dumas Milne Edwards,
supra, cuyas descripciones se incorporan en la presente como
referencia. El ADNc resultante entonces puede acoplarse a vectores
como los descritos en Kato et al., supra, u otros vectores
de ácido nucleico conocidos por los expertos en la técnica
utilizando técnicas como las descritas en Sambrook et al.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989.
Los 5' EST descritos en la presente se
obtuvieron utilizando los métodos químicos y enzimáticos descritos
anteriormente para enriquecer ARNm para los que tienen extremos 5'
intactos, como se describe a continuación.
En primer lugar, se prepararon los ARNm como se
describe en el Ejemplo 13, a continuación.
Se adquirieron ARN totales humanos o ARN
poliA^{+} derivados de 29 tejidos diferentes en, respectivamente,
LABIMO y CLONTECH, y se utilizaron para generar 44 bancos de ADNc
como sigue. El ARN adquirido se había aislado de células o tejidos
utilizando extracción ácida de tiocianato de
guanidio-fenol-cloroformo
(Chomczyniski y Sacchi, Analytical Biochemistry, 162:
156-159, 1987). El ARN poliA^{+} se aisló a partir
de ARN total (LABIMO) mediante dos transferencias de cromatografía
de oligo-dT, como se describe en Aviv y Leder,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69:
1408-1412, 1972, para eliminar el ARN
ribosómico.
Se comprobó la calidad e integridad de los ARN
poliA^{+}. Se utilizaron análisis de la transferencia Northern
con una sonda de globina para confirmar que los ARNm no estaban
degradados. Se comprobó la contaminación de los ARNm poliA^{+}
por secuencias ribosómicas utilizando análisis de la transferencia
Northern y una sonda derivada de la secuencia del ARNr 28S. Se
usaron preparaciones de ARNm con menos de 5% de ARNr en la
construcción de los bancos. Para evitar construir bancos con ARN
contaminados por secuencias exógenas (procariotas o fúngicas), se
estudió la presencia de secuencias ribosómicas bacterianas 16S o de
dos ARNm fúngicos de alta expresión, utilizando PCR.
Después de la preparación de los ARNm, se
emplearon los procedimientos químicos y/o enzimáticos descritos
anteriormente para enriquecer ARNm para los que tienen extremos 5'
intactos, para obtener 5' EST de diversos tejidos. En ambos
procedimientos, se unió un marcador de oligonucleótido a los
extremos 5' de los ARNm. El marcador de oligonucleótido tenía un
sitio EcoRI para facilitar los procedimientos de clonación
posteriores. Para facilitar el procesamiento del ADNc monocatenario
y bicatenario obtenido en la construcción de los bancos, se utilizó
la misma secuencia nucleotídica para diseñar el oligonucleótido
acoplado en ambos procedimientos químico y enzimático. No obstante,
en el procedimiento químico, el marcador utilizado era un
oligodesoxirribonucleótido que está unido a la caperuza del ARNm,
mientras que en el acoplamiento enzimático, el marcador era un
hemioligonucleótido 5'ADN/ARN3' quimérico que se acopló al extremo
5' del ARNm sin caperuza como se describe en el Ejemplo 12.
Después de la unión del marcador de
oligonucleótido al ARNm mediante el método químico o enzimático, se
estudió la integridad del ARNm mediante un análisis de la
transferencia Northern con 200 a 500 ng de ARNm utilizando una
sonda complementaria con el marcador de oligonucleótido antes de
realizar la síntesis de la primera hebra, como se describe en el
Ejemplo 14.
Para los ARNm unidos a los marcadores de
oligonucleótidos utilizando los métodos químico y enzimático, se
realizó la síntesis de la primera hebra de ADNc utilizando la
transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL) o Rnase H Minus
M-MLV (Promega) con nonámeros aleatorios como
cebadores. Para proteger los sitios EcoRI internos en el ADNc de la
digestión en etapas posteriores del procedimiento, se utilizó dCTP
metilado para la síntesis de la primera hebra. Después de la
eliminación del ARN mediante una hidrólisis alcalina, la primera
hebra del ADNc se precipitó utilizando isopropanol para eliminar los
cebadores residuales.
Para los métodos químico y enzimático, la
segunda hebra del ADNc se sintetizó con un fragmento de Klenow
utilizando un cebador correspondiente al extremo 5' del
oligonucleótido acoplado descrito en el Ejemplo 12. Preferiblemente,
el cebador tiene una longitud de 20-25 bases.
También se utilizó dCTP metilado para la síntesis de la segunda
hebra para proteger los sitios EcoRI internos en el ADNc de la
digestión durante el proceso de clonación.
Después de la síntesis del ADNc, los ADNc se
clonaron en pBlueScript como se describe en el Ejemplo 15, a
continuación.
Después de la síntesis de la segunda hebra, se
crearon extremos romos en el ADNc con ARN polimerasa de T4
(Biolabs), y el ADNc se digirió con EcoRI. Puesto que se utilizó
dCTP metilado durante la síntesis de ADNc, el sitio EcoRI presente
en el marcador era el único sitio hemimetilado y, por tanto, es el
único sitio susceptible a la digestión con EcoRI. El ADNc entonces
se fraccionó según su tamaño utilizando cromatografía de exclusión
(AcA, Biosepra), y las fracciones que correspondían a ADNc de más de
150 pb se reunieron y se precipitaron con etanol. El ADNc se clonó
direccionalmente en los extremos SmaI y EcoRI del vector fágmido
pBlueScript (Stratagene). La mezcla de acoplamiento se electroporó
en bacterias y se propagó con una selección con antibióticos
apropiada.
Los clones que contenían el marcador de
oligonucleótido entonces se seleccionaron como se describe en el
Ejemplo 16, a continuación.
Los bancos de 5' EST que contienen ADN de
plásmidos fabricados como se describió anteriormente se purificaron
(Qiagen). Se realizó una selección positiva de los clones marcados
como sigue. Brevemente, en este procedimiento de selección, el ADN
del plásmido se convirtió en un ADN monocatenario utilizando
endonucleasa del gen II del fago F1, en combinación con una
exonucleasa (Chang et al., Gene, 127:
95-98, 1993), tal como exonucleasa III o
exonucleasa del gen 6 de T7. El ADN monocatenario resultante
entonces se purificó utilizando esferas paramagnéticas como se
describe en Fry et al., Biotechniques, 13:
124-131, 1992. En este procedimiento, el ADN
monocatenario se hibridó con un oligonucléotido biotinilado que
tiene una secuencia que se corresponde con el extremo 3' de los
oligonucleótidos descritos en el Ejemplo 13. Preferiblemente, el
cebador tienen una longitud de 20-25 bases. Los
clones que incluyen una secuencia complementaria al oligonucleótido
biotinilado se capturaron mediante incubación con esferas
magnéticas revestidas con estreptavidina, seguido de selección
magnética. Después de la captura de los clones positivos, el ADN del
plásmido se liberó de las esferas magnéticas y se convirtió en ADN
bicatenario utilizando ADN polimerasa, tal como la ThermoSequenase
obtenida en Amersham Pharmacia Biotech. Como alternativa, pueden
utilizarse protocolos como el descrito en el kit Gene Trapper,
disponible en Gibco BRL. El ADN bicatenario entonces se electroporó
en bacterias. Se estimó que el porcentaje de clones positivos que
tienen el marcador de oligonucleótido 5' varía, de forma típica,
entre 90% y 98%, utilizando análisis de transferencia por
puntos.
Después de la electroporación, los bancos se
ordenaron en placas de microvaloración (MTP) de 384 pocillos. Se
conservó una copia de MTP para necesidades futuras. Entonces los
bancos se trasladaron a MTP de 96 pocillos, y se secuenciaron como
se describe a continuación.
Los insertos de los plásmidos primero se
amplificaron mediante PCR en termocicladores PE 9600
(Perkin-Elmer, Applied Biosystems División, Foster
City, CA), utilizando cebadores convencionales
SETA-A y SETA-B (Genset SA),
AmpliTaqGold (Perkin-Elmer), dNTP (Boehringer),
tampón y condiciones de ciclación como las recomendadas por
Perkin-Elmer Corporation.
Los productos de PCR entonces se secuenciaron
utilizando secuenciadores ABI Prism 377
(Perkin-Elmer). Las reacciones de secuenciación se
realizaron utilizando termicicladores PE 9600 con química
convencional de tinte-cebador y ThermoSequenase
(Amersham Pharmacia Biotech). Los cebadores utilizados eran T7 o
21M13 (disponible en Genset SA), según sea apropiado. Los cebadores
se marcaron con los tintes JOE, FAM, ROX y TAMRA. Los dNTP y ddNTP
utilizados en las reacciones de secuenciación se obtuvieron en
Boehringer. El tampón de secuenciación, las concentraciones de los
reactivos y las condiciones de ciclación fueron como recomienda
Amersham.
Después de la reacción de secuenciación, las
muestras se precipitaron con etanol, se resuspendieron en tampón de
carga de formamida, y se cargaron en un gel de acrilamida al 4%
convencional. La electroforesis se realizó durante 2,5 horas a 3000
V en un secuenciador ABI 377, y los datos de las secuencias se
recogieron y analizaron utilizando el programa informático de
análisis de secuenciación de ADN ABI Prism, versión 2.1.2.
Los datos de las secuencias de los 44 bancos de
ADNc fabricados como se describió anteriormente se trasladaron a
una base de datos patentada, en la que se realizaron las etapas de
control de calidad y validación. Un programa de análisis de bases
("base-caller") patentada, que trabaja
utilizando el sistema Unix, marca de forma automática los picos
sospechosos, tomando en cuenta la forma de los picos, la resolución
interpicos, y el nivel de ruido. Este programa de análisis de bases
patentado también realizó un recorte automático. Cualquier tramo de
25 o menos bases que tiene más de 4 picos sospechosos no se
consideró fiable y se rechazó. Las secuencias que se corresponden
con el vector de clonación o los oligonucleótidos de acoplamiento se
retiraron automáticamente de las secuencias EST. Sin embargo, las
secuencias EST resultantes pueden contener de 1 a 5 bases que
pertenecen a las secuencias mencionadas anteriormente en su extremo
5'. Si fuera necesario, éstas pueden eliminarse con facilidad
basándose en el caso concreto.
Después de realizar la secuenciación como se
describió anteriormente, las secuencias de los 5' EST se
introdujeron en NetGene^{TM}, una base de datos patentada
utilizada para el almacenamiento y manipulación, como se describe a
continuación. Los expertos en la técnica apreciarán que los datos
pueden almacenarse y manipularse en cualquier medio que pueda
leerse y accederse mediante un ordenador. Los medios de lectura por
ordenador incluyen medios de lectura magnéticos, ópticos o
electrónicos. Por ejemplo, el medio de lectura por ordenador puede
ser un disco duro, un disquete, una cinta magnética,
CD-ROM, RAM o ROM, así como otros tipos de medios
conocidos por los expertos en la técnica.
Ademas, los datos de las secuencias pueden
almacenarse y manipularse en una diversidad de programas
procesadores de datos en una diversidad de formatos. Por ejemplo,
los datos de las secuencias pueden almacenarse como un texto en un
archivo de procesamiento de textos, tal como Microsoft WORD y
WORDPERFECT, o como un archivo ASCII en una diversidad de programas
de bases de datos conocidos por los expertos en la técnica, tales
como DB2, SYBASE u ORACLE.
Los medios de lectura por ordenador en los que
puede almacenarse la información de las secuencias pueden ser un
ordenador personal, una red, un servidor u otros sistemas de
ordenador conocidos por los expertos en la técnica. El ordenador u
otro sistema incluye preferiblemente el medio de almacenamiento
descrito anteriormente, y un procesador para acceder y manipular
los datos de las secuencias. Cuando los datos de la secuencia se
han almacenado, pueden manipularse y seleccionarse para localizar
las secuencias almacenadas que contienen una secuencia de ácido
nucleico deseada o que codifican una proteína que tiene un dominio
funcional particular. Por ejemplo, la información almacenada de las
secuencias puede compararse con otras secuencias conocidas para
identificar homologías, motivos implicados en una función biológica,
o motivos estructurales.
Los programas que pueden utilizarse para
seleccionar o comparar las secuencias almacenadas incluyen la serie
de programas MacPattern (EMBL), BLAST y BLAST2 (NCBI), programas de
herramientas de selección de alineación local básica para
comparaciones de nucleótidos (BLASTN) y péptidos (BLASTX) (Altschul
et al., J. Mol. Biol., 215: 403, 1990), y FASTA
(Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
2444, 1988). Los programas BLAST entonces extienden los
alineamientos en base a criterios definidos de apareamiento y
desapareamiento.
Los motivos que pueden detectarse utilizando los
anteriores programas y los descritos en el Ejemplo 28 incluyen
secuencias que codifican cremalleras de leucina, motivos de
hélice-curva-hélice, sitios de
glicosilación, sitios de ubiquitinación,
alfa-hélices y láminas-beta,
secuencias señal que codifican péptidos señal que dirigen la
secreción de las proteínas codificadas, secuencias implicadas en la
regulación de la transcripción, tales como homeocajas, tramos
ácidos, sitios enzimáticos activos, sitios de unión al sustrato, y
sitios de ruptura enzimática.
Antes de seleccionar los ADNc en la base de
datos NetGene^{TM} para detectar motivos de secuencias de interés,
se identificaron los ADNc derivados de los ARNm que no eran de
interés y se eliminaron de posteriores consideraciones, como se
describe en el Ejemplo 18, a continuación.
Los 5' EST de la base de datos NetGene^{TM}
que se derivan de secuencias no deseadas, tales como ARN de
transferencia, ARN ribosómicos, ARN mitocondriales, ARN procariota,
ARN fúngicos, secuencias Alu, secuencias L1, o secuencias
repetidas, se identificaron utilizando los programas informáticos
FASTA y BLASTN con los parámetros listados en la Tabla 1.
Para eliminar los 5' EST que codifican ARNt de
posterior consideración, las secuencias de 5' EST se compararon con
las secuencias de 1190 ARNt conocidos obtenidos de la descarga 38 de
EMBL, de las cuales 100 eran humanas. La comparación se realizó
utilizando FASTA en ambas hebras de los 5' EST. Las secuencias que
tienen más de 80% de homología en más de 60 nucleótidos se
identificaron como ARNt. De las 144.341 secuencias seleccionadas,
26 se identificaron como ARNt y se eliminaron de posterior
consideración.
Para eliminar los 5' EST que codifican ARNr de
posterior consideración, las secuencias 5' EST se compararon con
las secuencias de 2497 ARNr conocidos obtenidos de la descarga 38 de
EMBL, de las cuales 73 eran humanas. La comparación se realizó
utilizando BLASTN en ambas hebras de los 5' EST con el parámetro S =
108. Las secuencias que tienen más de 80% de homología en tramos
mayores de 40 nucleótidos se identificaron como ARNr. De las
144.341 secuencias seleccionadas, 3.312 se identificaron como ARNr y
se eliminaron de posterior consideración.
Para eliminar los 5' EST que codifican ARNmt de
posterior consideración, las secuencias 5' EST se compararon con
las secuencias de dos genomas mitocondriales conocidos, para los
cuales están disponibles las secuencias genómicas completas, y
todas las secuencias transcritas a partir de estos genomas
mitocondriales, incluyendo ARNt, ARNr y ARNm para un total de 38
secuencias. La comparación se realizó utilizando BLASTN en ambas
hebras de los 5' EST con el parámetro S = 108. Las secuencias que
tienen más de 80% de homología en tramos mayores de 40 nucleótidos
se identificaron como ARNmt. De las 144.341 secuencias
seleccionadas, 6.110 se identificaron como ARNmt y se eliminaron de
posterior consideración.
Las secuencias que pueden haber surgido de
contaminantes exógenos se eliminaron de posterior consideración
comparando las secuencias de 5' EST con la descarga 46 de las
divisiones bacterianas y fúngicas de EMBL, utilizando BLASTN con el
parámetro S = 144. Todas las secuencias que tienen más de 90% de
homología en al menos 40 nucleótidos se identificaron como
contaminantes exógenos. De los 42 bancos de ADNc estudiados, el
porcentaje medio de secuencias procariotas y fúngicas que contienen
era 0,2% y 0,5%, respectivamente. Entre estas secuencias, sólo una
pudo identificarse como una secuencia específica de hongos. Las
otras eran secuencias fúngicas o procariotas que tienen homologías
con secuencias de vertebrados o que incluyen secuencias repetidas
que no se habían enmascarado durante la comparación electrónica.
Además, los 5' EST se compararon con 6093
secuencias Alu y 1115 secuencias L1 para enmascarar los 5' EST que
contienen estas secuencias repetidas. Los 5' EST que incluyen
repeticiones THE y MER, secuencias SSTR o satélites, microsatélites
o repeticiones teloméricas también se eliminaron de posterior
consideración. De media, 11,5% de las secuencias en los bancos
contenían secuencias repetidas. De este 11,5%, 7% contenía
repeticiones Alu, 3,3% contenía repeticiones L1, y el 1,2% restante
derivaba de los otros tipos seleccionados de secuencias repetidas.
Estos porcentajes son coherentes con los descubiertos en los bancos
de ADNc preparados por otros grupos. Por ejemplo, los bancos de
ADNc de Adams et al. contienen entre 0% y 7,4% de
repeticiones Alu, dependiendo de la fuente de ARN que se utilizó
para preparar el banco de ADNc (Adams et al., Nature,
377: 174, 1996).
Las secuencias de los 5' EST que permanecieron
después de la eliminación de las secuencias no deseables se
compararon con las secuencias de ARNm humanos conocidos para
determinar la precisión de los procedimientos de secuenciación
descritos anteriormente.
Para determinar aún más la precisión del
procedimiento de secuenciación descrito anteriormente, las
secuencias de 5' EST derivadas de secuencias conocidas se
identificaron y se compararon con las secuencias conocidas
originales. En primer lugar, se realizó en los 5' EST un análisis
FASTA con proyecciones más cortas que 5 pb en ambos extremos, para
identificar los que se apareaban con una entrada en la base de datos
de ARNm humana pública. Los 6655 5' EST que se apareaban con un
ARNm humano conocido entonces se realinearon con su ARNm cognado y
se utilizó una programación dinámica para incluir sustituciones,
inserciones y deleciones en la lista de "errores" que pueden
reconocerse. Los errores que se producían en las últimas 10 bases de
las secuencias 5' EST se ignoraron para evitar la inclusión de
sitios de clonación espúreos en el análisis de la precisión de la
secuenciación.
Este análisis reveló que las secuencias
incorporadas en la base de datos NetGene^{TM} tenían una precisión
de más de 99,5%.
Para determinar la eficacia con la que los
anteriores procedimientos de selección seleccionan ADNc que incluyen
los extremos 5' de sus correspondientes ARNm se realizó el
siguiente análisis.
Para determinar la eficacia con la que los
anteriores procedimientos de selección aislan 5' EST que incluyen
los extremos 5' de los ARNm de los que derivan, las secuencias de
los extremos de los 5' EST derivadas de los genes de la subunidad
\alpha del factor de elongación I y de la cadena pesada de
ferritina se compararon con las secuencias de ADNc conocidas de
estos genes. Puesto que los sitios de inicio de la transcripción de
ambos genes están bien caracterizados, pueden utilizarse para
determinar el porcentaje de 5' EST derivado que incluye los sitios
de inicio de la transcripción auténticos.
Para ambos genes, más de 95% de los 5' EST
obtenidos incluían realmente secuencias cercanas o cadena arriba del
extremo 5' de los correspondientes ARNm.
Para extender el análisis de la fiabilidad de
los procedimientos para aislar 5' EST a partir de EST en la base de
datos NetGene^{TM}, se realizó un análisis similar utilizando una
base de datos compuesta de secuencias de ARNm humano extraídas de
la descarga 97 de la base de datos GenBank como comparación. Los
extremos 5' de más de 85% de los 5' EST derivados de los ARNm
incluidos en la base de datos GeneBank estaban localizados cerca de
los extremos 5' de la secuencia conocida. Como algunas de las
secuencias de ARNm disponibles en la base de datos GenBank se
deducen a partir de secuencias genómicas, un desapareamiento en el
extremo 5' con estas secuencias se cuenta como un apareamiento
interno. Por tanto, el método utilizado aquí subestima el
rendimiento de EST que incluyen los extremos 5' auténticos de sus
correspondientes ARNm.
Los bancos de EST fabricados anteriormente
incluyen múltiples 5' EST derivados del mismo ARNm. Las secuencias
de estos 5' EST se compararon entre sí, y se identificaron los 5'
EST más largos para cada ARNm identificado. Los ADNc solapantes se
ensamblaron en secuencias continuas (cóntigos). Las secuencias
continuas resultantes entonces se compararon con bases de datos
públicas para calibrar su similitud con secuencias conocidas, como
se describe en el Ejemplo 21, a continuación.
Para cada banco de EST secuenciados, las
secuencias se agruparon por el extremo 5'. Cada secuencia en el
banco se comparó con las otras con BLASTN2 (hebra directa,
parámetros S = 107). Los EST con los pares de segmentos de alta
puntuación (HSP, "High Scoring Segment Pairs") de al menos 25
pb de longitud, que tienen 95% bases idénticas y que empiezan más
cerca que 10 pb de cada extremo 5' de EST se agruparon. Se utilizó
la secuencia más larga que se encontró en la agrupación como
representativa del grupo. Entonces se realizó una agrupación global
entre bancos, lo cual conduce a la definición de supercóntigos.
Para evaluar el rendimiento de las nuevas
secuencias dentro de los bancos de EST, se definió una relación de
novedad (NR) como: NR = 100 X (número de secuencias exclusivas
nuevas descubiertas en el banco/Número total de secuencias del
banco). De forma típica, la relación de novedad varía entre 10% y
41%, dependiendo del tejido a partir del cual se obtuvo el banco de
EST. Para la mayoría de los bancos, se buscó la secuenciación
aleatoria de los bancos de 5' EST hasta que la relación de novedad
alcanzó 20%.
Después de la caracterización como se describió
anteriormente, la colección de 5' EST en NetGene^{TM} se
seleccionó para identificar aquellos 5' EST que portan secuencias
señal potenciales, como se describe en el Ejemplo 22, a
continuación.
Los 5' EST en la base de datos NetGene^{TM} se
seleccionaron para identificar aquellos que tienen un marco de
lectura abierto (ORF, "open reading frame") ininterrumpidos más
largos que 45 nucleótidos, que empieza con un codón ATG y se
extiende hasta el final del EST. Aproximadamente la mitad de las
secuencias de ADNc en NetGene^{TM} contienían este ORF. Los ORF
de estos 5' EST entonces se buscaron para identificar motivos señal
potenciales utilizando ligeras modificaciones de los procedimientos
descritos en Von Heijne, Nucleic Acids Res., 14:
4683-4690, 1986. Aquellas secuencias de 5' EST que
codifican un tramo de al menos 15 aminoácidos de longitud con una
puntuación de al menos 3,5 en la matriz de identificación de
péptidos señal de Von Heijne se consideraron que poseían una
secuencia señal. Aquellos 5' EST que se aparearon con una secuencia
EST o ARNm humana conocida, y tenían un extremo 5' más de 20
nucleótidos cadena abajo del extremo 5' conocido se excluyeron del
posterior análisis. El resto de los ADNc que tienen secuencias señal
en su interior se incluyeron en una base de datos denominada
SignalTag^{TM}.
Para confirmar la precisión del método anterior
para identificar secuencias señal se realizó el análisis del Ejemplo
23.
Se evaluó la precisión del procedimiento
anterior para identificar secuencias señal que codifican péptidos
señal aplicando el método de los 43 aminoácidos localizados en el
extremo N-terminal de todas las proteínas SwissProt
humanas. La puntuación de Von Heijne informatizada para cada
proteína se comparó con la caracterización conocida de la proteína
como proteína segregada o proteína no segregada. De esta manera, el
número de proteínas no segregadas que tienen una puntuación mayor
que 3,5 (falsos positivos) y el número de proteínas segregadas que
tienen una puntuación menor que 3,5 (falsos negativos) puede
calcularse.
Utilizando los resultados del anterior análisis,
la probabilidad de que un péptido codificado por la región 5' del
ARNm sea, de hecho, un péptido señal genuino basándose en su
puntuación de Von Heijne, se calculó basándose en la suposición de
que 10% de las proteínas humanas son segregadas, o la suposición de
que 20% de las proteínas humanas son segregadas. Los resultados de
este análisis se muestran en la Figura 2 y la Tabla IV.
Utilizando el método anterior para la
identificación de proteínas de secreción, se obtuvieron los 5' EST
de los siguientes polipéptidos que se sabe que son segregados:
glucagón humano, precursor de monoquinas inducido por
gamma-interferón, proteína de tipo ciclofilina
segregada, pleiotropina human, y precursor de biotinidasa humana.
Por tanto, el método anterior identifica con éxito aquellos 5' EST
que codifican un péptido señal.
Para confirmar que el péptido señal codificado
por los 5' EST actúa realmente con un péptido señal, las secuencias
señal de los 5' EST pueden clonarse en un vector diseñado para la
identificación de péptidos señal. Estos vectores se diseñan para
conferir la capacidad de crecer en un medio selectivo sólo a las
células hospedantes que contienen un vector con una secuencia señal
operablemente conectada. Por ejemplo, para confirmar que un 5' EST
codifica un péptido señal genuino, la secuencia señal del 5' EST
puede insertarse cadena arriba y dentro del marco con una forma no
segregada del gen de invertasa de levadura en los vectores de
selección de péptidos señal, como los descritos en la Patente de
EE.UU. nº 5.536.637. El crecimiento de las células hospedantes que
contienen los vectores de selección de secuencias señal con la
secuencia señal de 5' EST insertada de forma correcta confirma que
el 5' EST codifica un péptido señal genuino.
Como alternativa, la presencia de un péptido
señal puede confirmarse clonando los ADNc extendidos obtenidos
utilizando los EST en vectores de expresión, tales como pXT1 (como
se describe a continuación en el Ejemplo 30), o construyendo
vectores de promotor-secuencia
señal-gen indicador que codifican proteínas de
fusión entre el péptido señal y una proteína indicadora ensayable.
Después de la introducción de estos vectores en una célula
hospedante adecuada, tal como células COS o células NIH 3T3, el
medio de crecimiento puede recolectarse y analizarse para la
presencia de la proteína segregada. El medio procedente de estas
células se compara con el medio procedente de células control que
contienen vectores que carecen de la secuencia señal o el inserto
de ADNc extendido, para identificar vectores que codifican un
péptido señal funcional o una proteína segregada auténtica.
Aquellos 5' EST que codifican un péptido señal,
según se determina mediante el método del Ejemplo 22 anterior, se
agruparon después en cuatro categorías basadas en su homología con
secuencias conocidas, como se describe en el Ejemplo 24, a
continuación.
Aquellos 5' EST que tienen una secuencia que no
se aparea con ninguna secuencia de vertebrado conocida ni con
ninguna secuencia EST disponible públicamente se denomina
"nuevos". De las secuencias de la base de datos
SignalTag^{TM}, 947 de los 5' EST que tienen una puntuación de Von
Heijne de al menos 3,5 se encuentran dentro de esta categoría.
Aquellos 5' EST que tienen una secuencia que no
se aparea con ninguna secuencia de vertebrado pero sí se aparean
con un EST conocido públicamente se denominan
"EST-ext", con la condición de que la secuencia
de EST conocida se extiende al menos 40 nucleótidos en la dirección
5'. De las secuencias de la base de datos SignalTag^{TM}, 150 de
los 5' EST que tienen una puntuación de Von Heijne de al menos 3,5
se encuentran dentro de esta categoría.
Aquellos 5' EST que no se aparean con ninguna
secuencia de vertebrado pero sí se aparean con un EST conocido
públicamente sin extender el EST conocido en al menos 40 nucleótidos
en la dirección 5' se denominan "EST". De las secuencias de la
base de datos SignalTag^{TM}, 599 de los 5' EST que tienen una
puntuación de Von Heijne de al menos 3,5 se encuentran dentro de
esta categoría.
Aquellos 5' EST que se aparean con una secuencia
de ARNm humano pero extienden la secuencia conocida en al menos 40
nucleótidos en la dirección 5' se denominan
"VERT-ext". De las secuencias de la base de
datos SignalTag^{TM}, 23 de los 5' EST que tienen una puntuación
de Von Heijne de al menos 3,5 se encuentran dentro de esta
categoría. Se incluye en esta categoría un 5' EXT que extiende la
secuencia conocida del ARNm de translocasa humana en más de 200
bases en la dirección 5'. También se identificó un 5' EST que
extiende la secuencia de un gen supresor de tumor humano en la
dirección 5'.
La Tabla V muestra la distribución de los 5' EST
en cada categoría, y el número de 5' EST en cada categoría que
tienen una puntuación de Von Heijne mínima dada.
Cada uno de los 5' EST también se categorizó
basándose en el tejido del cual se obtuvo el correspondiente ARNm,
como se describe a continuación en el Ejemplo 25.
La Tabla VI muestra la distribución de los 5'
EST en cada una de las categorías definidas anteriormente con
respecto al tejido del cual se obtienen los 5' EST de los
correspondientes ARNm.
La Tabla II proporciona los números de
identificación de secuencia de secuencias 5' EST derivadas del
cerebro, las categorías en las que se incluyen estas secuencias, y
la puntuación de Von Heijne de los péptidos señal que codifican.
Las secuencias 5' EST y las secuencias de aminoácidos que codifican
se proporcionan en los listados de secuencia adjuntos. La Tabla III
proporciona los números de identificación de secuencia de los 5'
EST y las secuencias de los péptidos señal que codifican. Las
secuencias de los 5' EST y los polipéptidos que codifican aparecen
en el listado de secuencias adjunto.
La secuencia de ADN SEQ ID NO:149 puede
seleccionarse con facilidad para detectar cualquier error que
presente, y cualquier ambigüedad de la secuencia puede resolverse
mediante resecuenciación de un fragmento que contenga tales errores
o ambigüedades en ambas cadenas. Estos fragmentos pueden obtenerse a
partir de los plásmidos conservados en el laboratorio de los
inventores, o pueden aislarse utilizando las técnicas descritas en
la presente. La resolución de estas ambigüedades o errores puede
verse facilitada mediante la utilización de cebadores que se
hibridan con secuencias colocadas cerca de las secuencias ambiguas o
erróneas. Por ejemplo, los cebadores pueden hibridarse con
secuencias dentro de 50-75 bases de la ambigüedad o
error. Tras la resolución del error o ambigüedad, pueden realizarse
las correspondientes correcciones en las secuencias de proteínas
codificadas por el ADN que contiene el error o ambigüedad.
Además de categorizar los 5' EST con respecto a
su tejido de origen, los patrones de expresión espacial y temporal
de los ARNm correspondientes a los 5' EST, así como sus niveles de
expresión, pueden determinarse como se describe en el Ejemplo 26, a
continuación. La caracterización de los patrones de expresión
espacial y temporal y los niveles de expresión de estos ARNm es
útil para construir vectores de expresión capaces de producir un
nivel deseado de un producto génico de una manera espacial o
temporal deseada, como se analizará con más detalle a
continuación.
Además, los 5' EST cuyos correspondientes ARNm
se asocian con estados de enfermedad también pueden identificarse.
Por ejemplo, una enfermedad particular puede ser el resultado de la
falta de expresión, la sobreexpresión, o la infraexpresión de un
ARNm que se corresponde con un 5' EST. Comparando los patrones de
expresión de ARNm y las cantidades en las muestras tomadas de
individuos sanos, con los de aquellos individuos que padecen una
enfermedad particular, pueden identificarse los 5' EST responsables
de la enfermedad.
Se apreciará que los resultados del anterior
procedimiento de caracterización para 5' EST también se aplican a
ADNc extendidos (que pueden obtenerse como se describe a
continuación) que contienen secuencias adyacentes a los 5' EST.
También se apreciará que, si se desea, la caracterización puede
retrasarse hasta que se hayan obtenido los ADNc extendidos, en
lugar de caracterizar los EST en sí mismos.
Los niveles de expresión y patrones de ARNm que
corresponden a 5' EST o ADNc extendidos (que pueden obtenerse como
se describe a continuación en el Ejemplo 27) pueden analizarse
mediante hibridación en disolución con sondas largas como se
describe en la solicitud de Patente Internacional nº WO 97/05277.
Brevemente, un 5' EST, un ADNc extendido o un fragmento de éstos
que se corresponde con el gen que codifica el ARNm que se va a
caracterizar se inserta en un sitio de clonación inmediatamente
cadena abajo de un promotor de ARN polimerasa de bacteriófago (T3,
T7 o SP6) para producir ARN antisentido. Preferiblemente, el 5' EST
o ADNc extendido tiene 100 o más nucleótidos. El plásmido se
linealiza y se transcribe en presencia de ribonucleótidos que
comprenden ribonucleótidos modificados (es decir,
biotina-UTP y DIG-UTP). Un exceso de
este ARN doblemente marcado se hibrida en disolución con ARNm
aislado de células o tejidos de interés. Las hibridaciones se
realizan bajo condiciones rigurosas convencionales
(40-50ºC durante 16 horas en formamida al 80%,
tampón NaCl 0,4 M, pH 7-8). La sonda no hibridada
se retira mediante digestión con ribonucleasas específicas de ARN
monocatenario (es decir, ARNasa CL3, T1, Phy M, U2 o A). La
presencia de la modificación con biotina-UTP permite
la captura del híbrido sobre una placa de microvaloración revestida
con estreptavidina. La presencia de la modificación con DIG permite
detectar el híbrido y cuantificarse mediante ELISA utilizando un
anticuerpo anti-DIG acoplado con fosfatasa
alcalina.
Los 5' EST, ADNc extendidos o fragmentos de los
mismos también pueden marcarse con secuencias de nucleótidos para
el análisis en serie de la expresión génica (SAGE), según se
describe en la Solicitud de Patente del Reino Unido nº 2305241 A.
En este método, los ADNc se preparan a partir de una célula, tejido,
organimo u otra fuente de ácido nucleico para la cual deben
determinarse los patrones de expresión. Los ADNc resultantes se
separan en dos grupos. Los ADNc de cada grupo se rompen con una
primera endonucleasa de restricción, denominada una enzima de
anclaje, que tiene un sitio de reconocimiento que es probable que
esté presente al menos una vez en la mayoría de los ADNc. Los
fragmentos que contienen la región más 5' o 3' del ADNc roto se
aislan mediante la unión a un medio de captura, tal como esferas
revestidas con estreptavidina. Un primer conector de
oligonucleótido que tiene una primera secuencia para la hibridación
de un cebador de amplificación y un sitio de restricción interno
para una endonucleasa llamada de marcaje, se acopla al ADNc digerido
en el primer grupo. La digestión con la segunda endonucleasa
produce fragmentos marcadores cortos a partir de los ADNc.
Un segundo oligonucleótido que tiene una segunda
secuencia para la hibridación de un cebador de amplificación y un
sitio de restricción interna se acopla a los ADNc digeridos en el
segundo grupo. Los fragmentos de ADNc en el segundo grupo también
se digieren con la endonucleasa de marcaje para generar fragmentos
marcadores cortos derivados de los ADNc en el segundo grupo. Los
marcadores resultantes de la digestión del primer y segundo grupo
con la enzima de anclaje y la endonucleasa de marcaje se acoplan
entre sí para producir los denominados dimarcadores. En algunas
realizaciones, los dimarcadores se concatamerizan para producir
productos de acoplamiento que contienen de 2 a 200 dimarcadores.
Entonces se determinan las secuencias marcadoras y se comparan con
las secuencias de los 5' EST o ADNc extendidos para determinar
cuáles son los 5' EST o ADNc extendidos que se expresan en la
célula, tejido, organismo u otra fuente de ácidos nucleicos a partir
de la cual derivan los marcadores. De esta manera, se obtiene
el
patrón de expresión de los 5' EST o ADNc extendidos en la célula, tejido, organismo u otra fuente de ácidos nucleicos.
patrón de expresión de los 5' EST o ADNc extendidos en la célula, tejido, organismo u otra fuente de ácidos nucleicos.
También puede realizarse un análisis
cuantitativo de la expresión génica utilizando matrices. Tal como se
utiliza en la presente, el término matriz significa una ordenación
unidimensional, bidimensional o multidimensional de ADNc de
longitud completa (es decir, ADNc extendidos que incluyen la
secuencia codificadora del péptido señal, la secuencia codificadora
de la proteína madura, y un codón de terminación), ADNc extendidos,
5' EST o fragmentos de éstos de longitud suficiente para permitir
la detección específica de la expresión génica. Preferiblemente,
los fragmentos tienen una longitud de al menos 15 nucleótidos. Más
preferiblemente, los fragmentos tienen una longitud de al menos 100
nucleótidos. Más preferiblemente, los fragmentos tienen una longitud
de más de 100 nucleótidos. En algunas realizaciones, los fragmentos
pueden tener una longitud de más de 500 nucleótidos.
Por ejemplo, el análisis cuantitativo de la
expresión génica puede realizarse con ADNc de longitud completa
como se define a continuación, ADNc extendidos, 5' EST o fragmentos
de éstos en una micromatriz de ADN complementario, según se
describe en Schena et al. (Science, 270:
467-470, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93: 10614-10619, 1996). Los ADNc de longitud
completa, ADNc extendidos, 5' EST o fragmentos de éstos se
amplifican mediante PCR y se disponen en matrices desde placas de
microvaloración de 96 pocillos hacia portaobjetos de microscopio
sililados utilizando robótica de alta velocidad. Las matrices
impresas se incuban en una cámara húmeda para permitir la
rehidratación de los elementos de la matriz, y se enjuagan una vez
con SDS al 0,2% durante 1 min, dos veces con agua durante 1 min, y
una vez durante 5 min con disolución de borohidruro de sodio. Las
matrices se sumergen en agua durante 2 min a 95ºC, se trasladan a
SDS al 0,2% durante 1 min, se enjuagan dos veces con agua, se secan
al aire y se conservan en la oscuridad a 25ºC.
El ARNm celular o tisular se aisla o se obtiene
en el mercado, y las sondas se preparan mediante un solo ciclo de
transcripción inversa. Las sondas se hibridan con micromatrices de 1
cm^{2} bajo un cubreobjetos de vidrio de 14 x 14 cm durante
6-12 horas a 60ºC. Las matrices se lavan durante 5
min a 25ºC en tampón de lavado de baja severidad (1 x SSC/SDS al
0,2%), después durante 10 min a temperatura ambiente en tampón de
lavado de alta severidad (0,1 x SSC/SDS al 0,2%). Las matrices se
barren en 0,1 x SSC utilizando un dispositivo de barrido con láser
de fluorescencia equipado con un ajuste de filtro personalizado. Se
obtienen medidas de expresión diferencial precisas tomando la media
de las proporciones de dos hibridaciones independientes.
El análisis cuantitativo de la expresión de
genes también puede realizarse con ADNc de longitud completa, ADNc
extendidos, 5' EST o fragmentos de éstos en matrices de ADN
complementario, según se describe en Pietu et al. (Genome
Research, 6: 492-503, 1996). Los ADNc de
longitud completa, ADNc extendidos, 5' EST o fragmentos de éstos se
amplifican con PCR y se rocían sobre membranas. Después, los ARNm
que se originan de diversos tejidos o células se marcan con
nucleótidos radiactivos. Después de una hibridación y un lavado en
condiciones controladas, los ARNm hibridados se detectan mediante
formación de fosfoimágenes o autorradiografía. Se realizan
experimentos por duplicado y entonces se realiza un análisis
cuantitativo de los ARNm expresados diferencialmente.
Como alternativa, el análisis de la expresión de
los 5' EST o ADNc extendidos puede realizarse mediante matrices de
nucleótidos de alta densidad, según se describe en Lockhart et
al. (Nature Biotechnology, 14: 1675-1680,
1006), y Sosnowsky et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.,
94: 1119-1123, 1997). Los oligonucleótidos de
15-50 nucleótidos que se corresponden con las
secuencias de los 5' EST o ADNc extendidos se sintetizan
directamente sobre el chip (Lockhart et al., supra), o se
sintetizan y luego se trasladan al chip (Sosnowsky et al.,
supra). Preferiblemente, los oligonucleótidos tienen una
longitud de aproximadamente 20 nucleótidos.
Los sondas de ADNc marcadas con un compuesto
apropiado, tal como biotina, digoxigenina o un tinte fluorescente,
se sintetizan a partir de la población de ARNm apropiada, y después
se fragmentan de forma aleatoria hasta un tamaño medio de 50 a 100
nucleótidos. Dichas sondas entonce se hibridan con el chip. Después
de lavar como se describe en Lockhart et al., supra, y la
aplicación de diferentes campos eléctricos (Sonowsky et al.,
supra), los tintes o compuestos marcadores se detectan y se
cuantifican. Se realizan hibridaciones por duplicado. El análisis
comparativo de la intensidad de la señal que se origina de las
sondas de ADNc sobre el mismo oligonucleótido diana en diferentes
muestras de ADNc indica una expresión diferencial del ARNm
correspondiente al 5' EST o ADNc extendido a partir del cual se
diseñó la secuencia del oligonucleótido.
Cuando los 5' EST que incluyen el extremo 5' de
los correspondientes ARNm se han seleccionado utilizando los
procedimientos descritos anteriormente, pueden utilizarse para
aislar ADNc extendidos que contienen secuencias adyacentes a los 5'
EST. Los ADNc extendidos pueden incluir la secuencia codificadora
completa de la proteína codificada por el correspondiente ARNm,
incluyendo el sitio de inicio de la traducción auténtico, la
secuencia señal, y la secuencia que codifica la proteína madura que
permanece después de la ruptura del péptido señal. Estos ADNc
extendidos se denominan en la presente "ADNc de longitud
completa". Como alternativa, los ADNc extendidos pueden incluir
sólo la secuencia que codifica la proteína madura que permanece
después de la ruptura del péptido señal, o sólo la secuencia que
codifica el péptido señal.
El Ejemplo 27 a continuación describe un método
general para obtener ADNc extendidos utilizando 5' EST. El ejemplo
28 a continuación proporciona resultados experimentales, utilizando
el método explicado en el Ejemplo 27, que describen varios ADNc
extendidos que incluyen la secuencia codificadora completa y el
extremo 5' auténtico del correspondiente ARNm para varias proteínas
segregadas.
Los métodos de los Ejemplos 27, 28 y 29 también
pueden utilizarse para obtener ADNc extendidos que codifican menos
que la secuencia codificadora completa de las proteínas segregadas
codificadas por los genes correspondientes a los 5' EST. En algunas
realizaciones, los ADNc extendidos aislados utilizando estos métodos
codifican al menos 10 aminoácidos de la proteína codificada por la
secuencia de SEQ ID NO:149. En otras realizaciones, los ADNc
extendidos codifican al menos 20 aminoácidos de la proteína
codificada por la secuencia de SEQ ID NO:149. En otras
realizaciones, los ADNc extendidos codifican al menos 30 aminoácidos
de la secuencia de SEQ ID NO:149. En una realización preferida, los
ADNc extendidos codifican una secuencia de la proteína de longitud
completa, que incluye la secuencia codificadora de la proteína de
SEQ ID NO:149.
El siguiente método general se ha utilizado para
aislar de forma rápida y eficaz ADNc extendidos que tienen los
extremos 5' auténticos de sus correspondientes ARNm, así como la
secuencia codificadora de la proteína completa, e incluyen
secuencias adyacentes a las secuencias de los 5' EST utilizados para
obtenerlos. Este método puede aplicarse para obtener ADNc
extendidos para cualquier 5' EST en la base de datos NetGene^{TM},
incluyendo los 5' EST que codifican polipéptidos que pertenecen a
las proteínas segregadas. El método se resume en la Figura 3.
El método aprovecha la secuencia 5' conocida del
ARNm. Se realiza una reacción de transcripción inversa sobre el
ARNm purificado con un cebador poli-14dT que
contiene una secuencia de 49 nucleótidos en su extremo 5' que
permite la adición de una secuencia conocida en el extremo del ARNc
que se corresponde con el extremo 3' del ARNm. Por ejemplo, el
cebador puede tener la siguiente secuencia: 5'-ATC
GTT GAG ACT CGT ACC AGC AGA GTC ACG AGA GAG ACT ACA CGG TAC TGG TTT
TTT TTT TTT TTVN-3' (SEQ ID NO:14). Los expertos en
la técnica apreciarán que otras secuencias también pueden añadirse
a la secuencia poli-dT y utilizarse para cebar la
síntesis de la primera hebra. Utilizando este cebador y una
transcriptasa inversa, tal como la enzima Superscript II (Gibco
BRL) o Rnase H Minus M-MLV (Promega), se genera un
transcripto inverso anclado al sitio de poliA 3' de los ARN.
Después de la eliminación del ARNm hibridado con
la primera hebra del ADNc mediante hidrólisis alcalina, los
productos de la hidrólisis alcalina y el cebador
poli-dT residual se eliminan con una columna de
exclusión, tal como una matriz AcA34 (Biosepra), como se explica en
el Ejemplo 11.
Se diseña un par de cebadores anidados en cada
extremo, basándose en la secuencia 5' conocida de los 5' EST y el
extremo 3' conocido añadido por el cebador poli-dT
utilizado en la síntesis de la primera hebra. Los programas
informáticos utilizados para diseñar cebadores están basados en el
contenido en GC y las temperaturas de fusión de los
oligonucleótidos, tales como OSP (Illier y Green, PCR Meth.
Appl., 1: 124-128, 1991), o están
basados en el método de disparidad de frecuencia de octámeros
(Griffais et al., Nucleic Acids Res., 19:
3887-3891, 1991), tales como PC-Rare
(http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/PC-Rare/doc/manuel.html).
Preferiblemente, los cebadores anidados en el
extremo 5' están separados entre sí por cuatro a nueve bases. Las
secuencias de los cebadores 5' pueden seleccionarse para que tengan
unas temperaturas de fusión y especificidades adecuadas para su uso
en PCR.
Preferiblemente, los cebadores anidados en el
extremo 3' están separados entre sí por cuatro a nueve bases. Por
ejemplo, los cebadores anidados 3' pueden tener las siguientes
secuencias: 5'-CCA GCA GAG TCA CGA GAG AGA CTA CAC
GG-3' (SEQ ID NO:15), y 5'-CAC GAG
AGA GAC TAC ACG GTA CTG G-3' (SEQ ID NO:16). Estos
cebadores se seleccionaron porque tienen temperaturas de fusión y
especificidades compatibles con su uso en PCR. Sin embargo, los
expertos en la técnica apreciarán que otras secuencias también
pueden utilizarse como cebadores.
El primer ensayo PCR de 25 ciclos se realiza
utilizando Advantage Tth Polymerase Mix (Clontech) y el cebador
externo de cada uno de los pares anidados. Entonces se realiza una
segunda PCR de 20 ciclos utilizando la misma enzima y el cebador
interno de cada par anidado en 1/2500 del primer producto de PCR.
Después se eliminan los cebadores y nucleótidos.
Debido a la falta de limitaciones de posición en
el diseño de cebadores anidados 5' compatibles para PCR utilizando
el programa informático OSP, se obtienen amplicones de dos tipos.
Preferiblemente, el segundo cebador 5' se localiza cadena arriba
del codon de inicio de la traducción produciendo, por tanto, un
producto de PCR anidado que contiene la secuencia codificadora
completa. Este ADNc extendido de longitud completa se somete a un
procedimiento de clonación directa, según se describe en la sección
a). Sin embargo, en algunos casos, el segundo cebador 5' se
localiza cadena abajo del codon de inicio de la traducción
produciendo, por tanto, un producto de PCR que contiene sólo parte
del ORF. Estos productos de PCR incompletos se someten a un
procedimiento modificado descrito en la sección b).
Cuando el producto de PCR anidado resultante
contiene la secuencia codificadora completa, como se predice a
partir de la secuencia de 5' EST, se clona en un vector apropiado,
tal como pED6dpc2, como se describe en la sección 3.
Cuando el amplicón no contiene la secuencia
codificadora completa, son necesarias etapas intermedias para
obtener la secuencia codificadora completa y un producto de PCR que
contiene la secuencia codificadora completa. La secuencia
codificadora completa puede ensamblarse a partir de varias
secuencias parciales determinadas directamente a partir de los
diferentes productos de PCR, como se describe en la siguiente
sección.
Cuando la secuencia codificadora completa se ha
determinado completamente, se diseñan nuevos cebadores compatibles
para usar en PCR para obtener amplicones que contienen la región
codificadora completa. Sin embargo, en estos casos, los cebadores
3' compatibles para usar en PCR se localizan dentro del 3' UTR del
correspondiente ARNm, produciendo, con ello, amplicones que carecen
de parte de esta región, es decir, el tramo de poliA y, a veces, la
señal de poliadenilacion, como se ilustra en la Figura 3. Estos ADNc
extendidos de longitud completa entonces se clonan en un vector
apropiado, como se describe en la sección 3.
La secuenciación de los ADNc extendidos se
realiza utilizando un enfoque de Die Terminator con el kit de ADN
polimerasa FS AmpliTaq disponible en Perkin Elmer.
Para secuenciar fragmentos de PCR, se realiza un
paseo de cebadores utilizando un programa informático, tal como
OSP, para elegir cebadores, y un programa informático de ordenador
automático, tal como ASMG (Sutton et al., Genome Science
Technol., 1: 9-19, 1995) para construir
cóntigos de secuencias de paseo que incluyen el marcador 5' inicial
utilizando solapamientos mínimos de 32 nucleótidos. Preferiblemente,
el paseo de cebadores se realiza hasta que se obtienen las
secuencias de los ADNc de longitud completa.
Se evalúa si la secuenciación de un fragmento de
ADNc extendido concreto se ha completado como sigue. Puesto que las
secuencias colocadas después del tramo de poliA son difíciles de
determinar con precisión en el caso de productos no clonados, los
procesos de secuenciación y paseo de cebadores para productos de PCR
se interrumpen cuando un tramo de poliA se identifica en los ADNc
extendidos obtenidos como se describe en el caso b). La longitud de
la secuencia se compara con el tamaño del producto de PCR anidado
obtenido como se describió anteriormente. Debido a la precisión
limitada de la determinación del tamaño de los productos de PCR
mediante electroforesis en gel, una secuencia se considera completa
si el tamaño de la secuencia obtenida es al menos 70% del tamaño
del primer producto de PCR anidado. Si la longitud de la secuencia
determinada a partir del análisis por ordenador no tiene al menos
70% de la longitud del producto de PCR anidado, estos productos de
PCR se clonan y se determina la secuencia de la inserción. Cuando
están disponibles datos de un análisis de la transferencia Northern,
el tamaño del ARNm detectado para un producto de PCR concreto se
utiliza para evaluar finalmente que la secuencia está completa. Las
secuencias que no cumplen los criterios anteriores se rechazan y se
someten a un nuevo procedimiento de aislamiento.
Los datos de las secuencias de todos los ADNc
extendidos entonces se trasladan a una base de datos patentada, en
la que se realizan los controles de calidad y las etapas de
validación como se describe en el Ejemplo 15.
El producto de PCR que contiene la secuencia
codificadora completa entonces se clona en un vector apropiado. Por
ejemplo, los ADNc extendidos pueden clonarse en el vector de
expresión pED6dpc2 (DiscoverEase, Genetics Institute, Cambridge,
MA) como sigue. Se prepara el ADN del vector pED6dpc2 con extremos
romos realizando una digestión con EcoRI, seguida de una reacción
de relleno. El vector con extremos romos se desfosforila. Después
de retirar los cebadores de PCR y de una precipitación en etanol, el
producto de PCR que contiene la secuencia codificadora completa o
el ADNc extendido obtenido como se describió anteriormente se
fosforila con una quinasa, que posteriormente se retira mediante
extracción con fenol-Sevag y precipitación. El ADNc
extendido bicatenario entonces se acopla al vector, y el plásmido de
expresión resultante se introduce en células hospedantes
adecuadas.
Puesto que los productos de PCR obtenidos como
se describió anteriormente son moléculas con extremos romos que
pueden clonarse en cualquier dirección, se determina la orientación
de varios clones para cada producto de PCR. Entonces de 4 a 10
clones se ordenan en placas de microvaloración y se someten a una
reacción de PCR utilizando un primer cebador colocado en el vector
cerca del sitio de clonación, y un segundo cebador colocado en la
porción del ADNc extendido que se corresponde con el extremo 3' del
ARNm. Este segundo cebador puede ser el cebador antisentido
utilizado en la PCR anclada en el caso de la clonación directa (caso
a), o el cebador antisentido colocado en el interior del 3' UTR en
el caso de la clonación indirecta (caso b). Los clones en los que
el codón de inicio del ADNc extendido está operablemente conectado
al promotor en el vector para permitir la expresión de la proteína
codificada por el ADNc extendido se conservan y secuencian. Además
de los extremos de los insertos de ADNc, también se secuencian
aproximadamente 50 pb del ADN del vector en cada lado del inserto de
ADNc.
Los productos de PCR clonados entonces se
secuencian completamente según el procedimiento mencionado
anteriormente. En este caso, se realiza entonces la contigación de
fragmentos largos en las secuencias de paseo que ya están
contigadas para los productos de PCR no clonados durante el paseo de
cebadores. La secuenciación de amplicones clonados está completa
cuando los cóntigos resultantes incluyen la región codificadora
completa, así como las secuencias solapantes con el ADN del vector
en ambos extremos.
Las secuencias de todos los ADNc extendidos de
longitud completa entonces se someten a un posterior análisis como
se describe a continuación. Antes de buscar en los ADNc extendidos
de longitud completa las secuencias de interés, los ADNc extendidos
que no son de interés (ARN de vectores, ARN de transferencia, ARN
ribosómicos, ARN mitocondriales, ARN procariotas y ARN fúngicos) se
rechazan utilizando métodos fundamentalmente similares a los
descritos para los 5' EST en el Ejemplo 18.
Las características estructurales, por ejemplo,
cola de poliA y señal de poliadenilación, de las secuencias de ADNc
extendidos de longitud completa se determinan posteriormente como
sigue.
Una cola de poliA se define como un tramo
homopolimérico de al menos 11 A, con una base alternativa, como
mucho, dentro de él. La búsqueda de colas de poliA se restringe a
los últimos 100 nucleótidos de la secuencia, y está limitada a
tramos de 11 A consecutivas porque las reacciones de secuenciación a
menudo no pueden leerse después de este tramo de poliA. Los tramos
que tienen más de 90% de homología en 8 nucleótidos se identifican
como colas de poliA utilizando BLAST2N.
Para buscar una señal de poliadenilación, la
cola de poliA se corta de la secuencia de longitud completa. Las 50
pb que preceden a la cola de poliA se buscan en primer lugar para
encontrar la señal de poliadenilación canónica AAUAAA y, si no se
detecta la señal canónica, para encontrar la señal alternativa
AUUAAA (Sheets et al., Nuc. Acids Res., 18:
5799-5805, 1990). Si no encuentra ninguna de estas
señales de poliadenilación consenso, el motivo canónico se busca de
nuevo permitiendo un desapareamiento para explicar posibles errores
de secuenciación. Más de 85% de las señales de poliadenilación
identificadas de cualquier tipo terminan realmente de 10 a 30 pb de
la cola de poliA. Las señales AUUAAA alternativas representan
aproximadamente 15% del número total de señales de poliadenilación
identificadas.
Las características funcionales, por ejemplo,
ORF y secuencias señal, de las secuencia de ADNc extendidos de
longitud completa se determinaron posteriormente como sigue.
Los marcos de la cadena superior 3 de los ADNc
extendidos se buscan para encontrar ORF definidos como los
fragmentos de longitud máxima con un codón de inicio de la
traducción y que terminan con un codón de terminación. Se prefieren
los ORF que codifican al menos 20 aminoácidos.
Cada ORF encontrado entonces se barre para
detectar la presencia de un péptido señal en los primeros 50
aminoácidos o, cuando sea apropiado, dentro de regiones más cortas
de hasta 20 aminoácidos o menos en el ORF, utilizando el método de
matriz de Von Heijne (Nuc. Acids Res., 14:
4683-4690, 1986), como se describe en el Ejemplo
22.
Puede lograrse la categorización de secuencias
de longitud completa utilizando procedimientos fundamentalmente
similares a los descritos para los 5' EST en el Ejemplo 24.
Los ADNc extendidos preparados como se describió
anteriormente pueden modificarse posteriormente para obtener ácidos
nucleicos que incluyen porciones deseadas de ADNc extendido
utilizando técnicas convencionales, tales como subclonación, PCR, o
síntesis de oligonucleótidos in vitro. Por ejemplo, pueden
obtenerse ácidos nucleicos que incluyen sólo las secuencias
codificadoras completas (es decir, las secuencias que codifican el
péptido señal y la proteína madura que permanece después de que se
haya escindido el péptido señal) utilizando técnicas conocidas por
los expertos en la técnica. Como alternativa, pueden aplicarse
técnicas convencionales para obtener ácidos nucleicos que contienen
sólo las secuencias codificadoras para la proteína madura que
permanece después de que se haya escindido el péptido señal, o
ácidos nucleicos que contienen sólo las secuencias codificadoras
para los péptidos señal.
De forma similar, pueden obtenerse ácidos
nucleicos que contienen cualquier otra porción deseada de las
secuencias codificadoras para la proteína segregada. Por ejemplo,
el ácido nucleico puede contener al menos 10 bases consecutivas de
un ADNc extendido, tal como uno de los ADNc extendidos descritos a
continuación. En otra realización, el ácido nucleico puede contener
al menos 15 bases consecutivas de un ADNc extendido, tal como uno de
los ADNc extendidos descritos a continuación. Como alternativa, el
ácido nucleico puede contener al menos 20 bases consecutivas de un
ADNc extendido, tal como uno de los ADNc extendidos descritos a
continuación. En otra realización, el ácido nucleico puede contener
al menos 25 bases consecutivas de un ADNc extendido, tal como uno de
los ADNc extendidos descritos a continuación. En otra realización,
el ácido nucleico puede contener al menos 40 bases consecutivas de
un ADNc extendido, tal como uno de los ADNc extendidos descritos a
continuación.
Cuando se ha obtenido un ADNc extendido, puede
secuenciarse para determinar la secuencia de aminoácidos que
codifica. Cuando se ha determinado la secuencia de aminoácidos
codificada, se puede crear e identificar cualquier de los muchos
ADNc concebibles que codifican esa proteína simplemente utilizando
la degeneración del código genético. Por ejemplo, pueden
identificarse variantes alélicos u otros ácidos nucleicos homólogos
como se describe a continuación. Como alternativa, pueden
sintetizarse in vitro ácidos nucleicos que codifican la
secuencia de aminoácidos deseada.
En una realización preferida, la secuencia
codificadora puede seleccionarse utilizando el codón conocido o las
preferencias de la pareja del codón para el organismo hospedante en
el cual se va a expresar el ADNc.
Los ADNc extendidos derivados de los 5' EST
descritos en la presente se obtuvieron como se describe en el
Ejemplo 28, a continuación.
Se usó el procedimiento descrito en el Ejemplo
27 anterior para obtener ADNc extendidos derivados de los 5' EST de
la presente invención en una diversidad de tejidos. La siguiente
lista proporciona unos cuantos ejemplos de los ADNc extendidos
obtenidos de esta manera.
Utilizando este enfoque, se obtuvo el ADNc de
longitud completa de SEQ ID NO:17 (número de identificación interna
48-19-3-G1-FL1).
Este ADNc se incluye en la categoría "EST-ext"
descrita anteriormente, y codifica el péptido señal
MKKVLLLITAILAVAVG (SEQ ID NO:18), que tiene una puntuación de Von
Heijne de 8,2.
También se obtuvo el ADNc de longitud completa
de SEQ ID NO:19 (número de identificación interna
58-34-2-E7-FL2)
utilizando este procedimiento. Este ADNc se incluye en la categoría
"EST-ext" descrita anteriormente, y codifica el
péptido señal MWWFQQGLSFLPSALVIWTSA (SEQ ID NO:20), que tiene una
puntuación de Von Heijne de 5,5.
Otro ADNc de longitud completa obtenido
utilizando el procedimiento descrito anteriormente tiene la
secuencia de SEQ ID NO:21 (número de identificación interna
51-27-1-E8-FL1).
Este ADNc se incluye en la categoría "EST-ext"
descrita anteriormente, y codifica el péptido señal
MVLTTLPSANSANSPVNMPTTGPNSLSYASSALSPCLT (SEQ ID NO:22), que tiene
una puntuación de Von Heijne de 5,9.
El anterior procedimiento también se utilizó
para obtener un ADNc de longitud completa que tiene la secuencia de
SEQ ID NO:23 (número de identificación interna
76-4-1-G5-FL1).
Este ADNc se incluye en la categoría "EST-ext"
descrita anteriormente, y codifica el péptido señal ILSTVTALTFAXA
(SEQ ID NO:24), que tiene una puntuación de Von Heijne de 5,5.
También se obtuvo el ADNc de longitud completa
de SEQ ID NO:25 (número de identificación interna
51-3-3-B10-FL3)
utilizando este procedimiento. Este ADNc se incluye en la categoría
"nuevo" descrita anteriormente, y codifica el péptido señal
LVLTLCTLPLAVA (SEQ ID NO:26), que tiene una puntuación de Von Heijne
de 10,1.
También se obtuvo el ADNc de longitud completa
de SEQ ID NO:27 (número de identificación interna
58-35-2-F10-FL2)
utilizando este procedimiento. Este ADNc se incluye en la categoría
"nuevo" descrita anteriormente, y codifica el péptido señal
LWLLFFLVTAIHA (SEQ ID NO:28), que tiene una puntuación de Von Heijne
de 10,7.
Los clones bacterianos que contienen plásmidos
que contienen los ADNc de longitud completa descritos anteriormente
se conservan en la actualidad en los laboratorios de los inventores
con los números de identificación internos indicados anteriormente.
Los insertos pueden recuperarse de los materiales conservados
cultivando una parte alícuota del clon bacteriano apropiado en el
medio apropiado. El ADN del plásmido entonces puede aislarse
utilizando procedimientos de aislamiento de plásmidos familiares
para los expertos en la técnica, tales como procedimientos de
aislamiento de plásmidos de minipreps de lisis alcalina o de lisis
alcalina a gran escala. Si se desea, el ADN del plásmido puede
enriquecerse aún más mediante centrifugación en un gradiente de
cloruro de cesio, cromatografía de exclusión molecular, o
cromatografía de intercambio aniónico. El ADN del plásmido obtenido
utilizando estos procedimientos puede entonces manipularse
utilizando técnicas de clonación convencionales familiares para los
expertos en la técnica. Como alternativa, puede realizarse una PCR
con cebadores diseñados en ambos extremos de la inserción de ADNc.
El producto de PCR que se corresponde con el ADNc puede entonces
manipularse utilizando técnicas de clonación convencionales,
familiares para los expertos en la técnica.
Los polipéptidos codificados por los ADNc
extendidos pueden seleccionarse para determinar la presencia de
motivos estructurales o funcionales conocidos, o la presencia de
firmas, secuencias pequeñas de aminoácidos que están bien
conservadas entre los miembros de una familia de proteínas. También
se han utilizado las regiones conservadas para derivar patrones
consenso o matrices incluidas en el banco de datos PROSITE, en
particular en el archivo prosite.dat (descarga 13.0 de Noviembre
1995, localizado en http://expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html).
Pueden utilizarse los programas prosite_convert y prosite_scan
(http://ulrec3.unil.ch/ftpserveur/prosite_scan) para encontrar
firmas sobre los ADNc extendidos.
Para cada patrón obtenido con el programa
prosite_convert del archivo prosite.dat, puede ensayarse la
precisión de la detección en una nueva secuencia de proteína,
evaluando la frecuencia de aciertos irrelevantes en la población de
proteínas segregadas humanas incluidas en el banco de datos
SWISSPROT. La proporción entre el número de aciertos en proteínas
barajadas (con un tamaño de ventana de 20 aminoácidos) y el número
de aciertos en proteínas nativas (no barajadas) puede utilizarse
como un índice. Los patrones para los cuales la proporción es mayor
que 20% (un acierto en proteínas barajadas por 5 aciertos en
proteínas nativas) pueden omitirse durante la búsqueda con
prosite_scan. El programa utilizado para barajar secuencias de
proteínas (db_shuffled) y el programa utilizado para determinar la
estadística para cada patrón en los bancos de datos de proteínas
(prosite_statistics) están disponibles en el sitio ftp
http://ulrec.3.unil.ch/ftpserveur/prosite_scan.
Además de los métodos basados en PCR para
obtener ADNc extendidos, también pueden emplearse métodos basados
en la hibridación tradicionales. Estos métodos también pueden
utilizarse para obtener ADN genómicos que codifican los ARNm a
partir de los cuales derivan los 5' EST, los ARNm que corresponden a
los ADNc extendidos, o los ácidos nucleicos que son homólogos con
los ADNc extendidos o 5' EST. El ejemplo 29, a continuación,
proporciona ejemplos de estos métodos.
\vskip1.000000\baselineskip
Puede fabricarse un banco de ADNc de longitud
completa utilizando las estrategias descritas en los Ejemplos 13,
14, 15 y 16 anteriores, sustituyendo el nonámero aleatorio utilizado
en el Ejemplo 14 con un cebador de oligo-dT. Por
ejemplo, puede emplearse el oligonucleótido de SEQ ID NO:14.
Como alternativa, puede obtenerse un banco de
ADNc o un banco de ADN genómico a partir de una fuente comercial, o
fabricarse utilizando técnicas familiares para los expertos en la
técnica. Estos bancos de ADNc o ADN genómico pueden usarse para
aislar ADNc extendidos obtenidos a partir de 5' EST, o ácidos
nucleicos homólogos con ADNc extendidos o 5' EST como sigue. El
banco de ADNc o el banco de ADN genómico se hibrida con una sonda
detectable que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos del
5' EST o del ADNc extendido utilizando técnicas convencionales.
Preferiblemente, la sonda comprende al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos
consecutivos de 5' EST o del ADNc extendido. Más preferiblemente,
la sonda comprende al menos 20 a 30 nucleótidos consecutivos de 5'
EST o del ADNc extendido. En algunas realizaciones, la sonda
comprende más de 30 nucleótidos consecutivos de 5' EST o del ADNc
extendido.
Las técnicas para identificar los clones de ADNc
en un banco de ADNc que se hibridan con una secuencia sonda
concreta se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989. Pueden utilizarse las mismas técnicas para aislar ADN
genómicos.
Brevemente, los clones de ADNc o ADN genómico
que se hibridan con la sonda detectable se identifican y se aislan
para su posterior manipulación como sigue. Una sonda que comprende
al menos 10 nucleótidos consecutivos del 5' EST o ADNc extendido se
marca con un marcador detectable, tal como un radioisótopo o una
molécula fluorescente. Preferiblemente, la sonda comprende al menos
12, 15 ó 17 nucleótidos consecutivos del 5' EST o del ADNc
extendido. Más preferiblemente, la sonda comprende 20 a 30
nucleótidos consecutivos del 5' EST o del ADNc extendido. En
algunas realizaciones, la sonda comprende más de 30 nucleótidos del
5' EST o del ADNc extendido.
Las técnicas para marcar la sonda son muy
conocidas e incluyen la fosforilación con polinucleótido quinasa,
la traducción de mellas, la transcripción in vitro, y
técnicas no radiactivas. Los ADNc o ADN genómicos en el banco se
trasladan a un filtro de nitrocelulosa o nailon y se desnaturalizan.
Después de bloquear los sitios no específicos, el filtro se incuba
con la sonda marcada durante una cantidad de tiempo suficiente para
permitir la unión de la sonda a los ADNc o ADN genómicos que
contienen una secuencia capaz de hibridarse con ella.
Variando la severidad de las condiciones de
hibridación utilizadas para identificar los ADNc extendidos o ADN
genómicos que se hibridan con la sonda detectable, pueden
identificarse los ADNc extendidos que tienen diferentes niveles de
homología con la sonda y aislarse como se describe a
continuación.
\newpage
Para identificar los ADNc extendidos o ADN
genómicos que tienen un alto grado de homología con la secuencia de
la sonda, puede calcularse la temperatura de fusión de la sonda
utilizando las siguientes fórmulas:
Para sondas con una longitud entre 14 y 70
nucleótidos, la temperatura de fusión (Tf) se calcula utilizando la
fórmula: Tf = 81,5 + 16,6(log [Na^{+}]) +
0,41(fracción G+C) - (600/N), en la que N es la longitud de
la sonda.
Si la hibridación se realiza en una disolución
que contiene formamida, la temperatura de fusión puede calcularse
utilizando la ecuación: Tf = 81,5 + 16,6(log [Na^{+}]) +
0,41(fracción G+C) - (formamida al 0,63%) - (600/N), en la
que N es la longitud de la sonda.
La prehibridación puede realizarse en 6 x SSC, 5
x reactivo de Denhardt, SDS al 0,5%, 100 \mug de ADN de esperma
de salmón fragmentado desnaturalizado, o 6 x SSC, 5 x reactivo de
Denhardt, SDS al 0,5%, 100 \mug de ADN de esperma de salmón
fragmentado desnaturalizado, formamida al 50%. Las fórmulas para SSC
y las disoluciones de Denhardt se listan en Sambrook et al.,
supra.
La hibridación se realiza añadiendo la sonda
detectable a las disoluciones de prehibridación listadas
anteriormente. Cuando la sonda comprende ADN bicatenario, se
desnaturaliza antes de la adición a la disolución de hibridación.
El filtro se pone en contacto con la disolución de hibridación
durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que la sonda
se hibride con los ADNc extendidos o los ADN genómicos que contienen
secuencias complementarias con ella u homólogas con ella. Para
sondas con una longitud mayor que 200 nucleótidos, la hibridación
puede realizarse a 15-25ºC por debajo de la Tf.
Para sondas más cortas, tales como sondas de oligonucleótidos, la
hibridación puede realizarse a 15-25ºC por debajo de
la Tf. Preferiblemente, para hibridaciones en 6 x SSC, la
hibridación se realiza a aproximadamente 68ºC. Preferiblemente, para
hibridaciones en disoluciones que contienen formamida al 50%, la
hibridación se realiza a aproximadamente 42ºC.
Se considera que todas las anteriores
hibridaciones estaban bajo condiciones "rigurosas".
Después de la hibridación, el filtro se lava en
2 x SSC, SDS al 0,1% a temperatura ambiente durante 15 minutos. El
filtro entonces se lava con 0,1 x SSC, SDS al 0,5% a temperatura
ambiente durante 30 minutos a 1 hora. Después la disolución se lava
a la temperatura de hibridación en 0, 1 x SSC, SDS al 0,5%. Se
realiza un lavado final en 0,1 x SSC a temperatura ambiente.
Los ADNc extendidos, los ácidos nucleicos
homólogos con los ADNc extendidos o 5' EST, o los ADN genómicos que
se han hibridado con la sonda se identifican mediante
autorradiografía u otras técnicas convencionales.
El anterior procedimiento puede modificarse para
identificar ADNc extendidos, ácidos nucleicos homólogos con los
ADNc extendidos, o ADN genómicos que tienen niveles disminuidos de
homología con la secuencia de la sonda. Por ejemplo, para obtener
ADNc extendidos, ácidos nucleicos homólogos con los ADNc extendidos,
o ADN genómicos que tienen niveles disminuidos de homología con la
sonda detectable, pueden utilizarse condiciones menos rigurosas.
Por ejemplo, la temperatura de hibridación puede disminuir en
incrementos de 5ºC desde 68ºC hasta 42ºC en un tampón de
hibridación que tiene una concentración de sodio de aproximadamente
1 M. Después de la hibridación, el filtro puede lavarse con 2 x
SSC, SDS al 0,5% a la temperatura de hibridación. Se considera que
estas condiciones son "moderadas" por encima de 50ºC, y
"bajas" por debajo de 50ºC.
Como alternativa, la hibridación puede
realizarse en tampones, tales como 6 x SSC, que contienen formamida
a una temperatura de 42ºC. En este caso, la concentración de
formamida en el tampón de hibridación puede reducirse en
incrementos de 5% desde 50% hasta 0% para identificar los clones que
tienen unos niveles disminuidos de homología con la sonda. Después
de la hibridación, el filtro puede lavarse con 6 x SSC, SDS al 0,5%
a 50ºC. Se considera que estas condiciones son "moderadas" por
encima de formamida al 25%, y "bajas" por debajo de formamida
al 25%.
Los ADNc extendidos, ácidos nucleicos homólogos
con los ADNc extendidos, o ADN genómicos que se han hibridado con la
sonda se identifican mediante autorradiografía.
Si se desea obtener ácidos nucleicos homólogos
con los ADNc extendidos, tales como variantes alélicos de éstos o
ácidos nucleicos que codifican proteínas relacionadas con las
proteínas codificadas por los ADNc extendidos, el nivel de
homología entre el ácido nucleico hibridado y el ADNc extendido o 5'
EST utilizado como sonda puede determinarse con más precisión
utilizando BLAST2N; los parámetros pueden adaptarse dependiendo de
la longitud de la secuencia y del grado de homología estudiado.
Para determinar el nivel de homología entre el ácido nucleico
hibridado y el ADNc extendido o 5' EST a partir del cual deriva la
sonda, se comparan las secuencias de nucleótidos del ácido nucleico
hibridado y el ADNc extendido o 5' EST a partir del cual deriva la
sonda. Por ejemplo, utilizando los métodos anteriores, los ácidos
nucleicos que tienen una homología de ácido nucleico de al menos
95% con el ADNc extendido o 5' EST a partir del cual deriva la sonda
pueden obtenerse e identificarse. De forma similar, usando
condiciones de hibridación progresivamente menos rigurosas, se
pueden obtener e identificar ácidos nucleicos que tienen una
homología de al menos 90%, al menos 85%, al menos 80% o al menos 70%
con el ADNc extendido o 5' EST a partir del cual deriva la
sonda.
Para determinar si un clon codifica una proteína
que tiene una cantidad concreta de homología con la proteína
codificada por el ADNc extendido o 5' EST, la secuencia de
aminoácidos codificada por el ADNc extendido o 5' EST se compara
con la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico
hibridado. Se determina que existe homología cuando una secuencia
de aminoácidos en el ADNc extendido o 5' EST está muy relacionada
con una secuencia de aminoácidos en el ácido nucleico que se está
hibridando. Una secuencia está muy relacionada cuando es idéntica a
la del ADNc extendido o 5' EST, o cuando contiene una o más
sustituciones de aminoácidos en ella, en la que los aminoácidos que
tienen características similares se han sustituido por otro.
Utilizando los anteriores métodos y algoritmos, tales como FASTA,
con parámetros que dependen de la longitud de la secuencia y grado
de homología estudiado, se pueden obtener ácidos nucleicos que
codifican proteínas que tienen una homología de al menos 95%, al
menos 90%, al menos 85%, al menos 80% o al menos 75% con las
proteínas codificadas por el ADNc extendido o 5' EST del cual deriva
la sonda.
Además de los métodos descritos anteriormente,
están disponibles otros protocolos para obtener ADNc extendidos
utilizando 5' EST como se indica en los siguientes párrafos.
Pueden prepararse ADNc extendidos obteniendo
ARNm del tejido, célula u organismo de interés utilizando
procedimientos de preparación de ARNm que emplean procedimientos de
selección de poliA u otras técnicas conocidas por los expertos en
la técnica. Un primer cebador capaz de hibridarse con la cola de
poliA del ARNm se hibrida con el ARNm, y se realiza una reacción de
transcripción inversa para generar una primera hebra de ADNc.
La primera hebra de ADNc se hibrida con un
segundo cebador que contiene al menos 10 nucleótidos consecutivos
de la secuencia de SEQ ID NO:149. Preferiblemente, el cebador
comprende al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos consecutivos de la
secuencia de SEQ ID NO:149. Más preferiblemente, el cebador
comprende 20 a 30 nucleótidos consecutivos de la secuencia de SEQ
ID NO:149. En algunas realizaciones, el cebador comprende más de 30
nucleótidos de la secuencia de SEQ ID NO:149. Si se desea obtener
ADNc extendidos que contienen la secuencia codificadora completa de
la proteína, incluyendo el sitio de inicio de la traducción
auténtico, el segundo cebador utilizado contiene secuencias
localizadas cadena arriba del sitio de inicio de la traducción. El
segundo cebador se extiende para generar una segunda hebra de ADNc
complementaria con la primera hebra de ADNc. Como alternativa,
puede realizarse una RT-PCR como se describió
anteriormente utilizando cebadores de ambos extremos del ADNc que se
va a obtener.
Pueden prepararse ADNc extendidos que contienen
fragmentos 5' del ARNm hibridando un ARNm que comprende la
secuencia del 5' EST del cual se desea un ADNc extendido, con un
cebador que comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos de la
secuencia complementaria con el 5' EST, y realizando una
transcripción inversa con el cebador hibridado para fabricar una
primera hebra de ADNc a partir de los ARNm. Preferiblemente, el
cebador comprende al menos 12, 15 ó 17 nucleótidos consecutivos del
5' EST. Más preferiblemente, el cebador comprende 20 a 30
nucleótidos consecutivos del 5' EST.
Después, se sintetiza una segunda hebra de ADNc
complementaria con la primera hebra de ADNc. La segunda hebra de
ADNc puede fabricarse hibridando un cebador complementario con
secuencias en la primera hebra de ADNc, con la primera hebra de
ADNc, y extendiendo el cebador para generar la segunda hebra de
ADNc.
Los ADNc extendidos bicatenarios fabricados
utilizando los métodos descritos anteriormente se aislan y se
clonan. Los ADNc extendidos pueden clonarse en vectores, tales como
plásmidos o vectores víricos, capaces de replicarse en una célula
hospedante adecuada. Por ejemplo, la célula hospedante puede ser una
célula bacteriana, de mamífero, de ave o de insecto.
Las técnicas para aislar ARNm, para realizar una
transcripción inversa de un cebador hibridado con ARNm para generar
una primera hebra de ADNc, para extender un cebador para fabricar
una segunda hebra de ADNc complementaria con la primera hebra de
ADNc, para aislar el ADNc bicatenario, y para clonar el ADNc
bicatenario son muy conocidas por los expertos en la técnica, y se
describen en Current Protocols in Molecular Biology, John
Wiley and Sons, Inc., 1997, y Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989.
Como alternativa, pueden emplearse
procedimientos, tales como el descrito en el ejemplo 29, para
obtener ADNc de longitud completa o ADNc extendidos. En este
enfoque, se preparan ADNc de longitud completa o extendidos a
partir de ARNm, y se clonan en fágmidos bicatenarios como sigue. El
banco de ADNc en los fágmidos bicatenarios entonces se hace
monocatenario mediante un tratamiento con una endonucleasa, tal como
el producto del gen II del fago F1, y una exonucleasa (Chang et
al., Gene, 127:95-98, 1993). Un
oligonucleótido biotinilado que comprende la secuencia de 5' EST, o
un fragmento que contiene al menos 10 nucleótidos de ésta, se
híbrida con los fágmidos monocatenarios. Preferiblemente, el
fragmento comprende 12, 15 ó 17 nucleótidos consecutivos del 5'
EST. Más preferiblemente, el fragmento comprende
20-30 nucleótidos consecutivos del 5' EST. En
algunos procedimientos, el fragmento puede comprender más de 30
nucleótidos consecutivos del 5' EST.
Los híbridos entre el oligonucleótido
biotinilado y los fágmidos que tienen insertos que contienen la
secuencia 5' EST se aislan incubando los híbridos con esferas
paramagnéticas revestidas con estreptavidina y recuperando las
esferas con un imán (Fry et al., Biotechniques, 13:
124-131, 1992). Después, los fágmidos resultantes
que contienen la secuencia 5' EST se liberan de las esferas y se
convierten en ADN bicatenario utilizando un cebador específico para
la secuencia de 5' EST. Como alternativa, pueden usarse protocolos,
tales como el kit Gene Trapper (Gibco BRL). El ADN bicatenario
resultante se transforma en bacterias. Los ADNc extendidos que
contienen la secuencia de 5' EST se identifican mediante PCR de
colonias o hibridación de colonias.
Utilizando cualquiera de los métodos descritos
anteriormente en la sección III, puede proporcionarse una pluralidad
de ADNc extendidos que contienen secuencias codificadoras completas
de la proteína o secuencias que codifican sólo la proteína madura
que permanece después de escindir el péptido señal, como bancos de
ADNc para la posterior evaluación de las proteínas codificadas o
para uso en ensayos de diagnóstico como se describe a
continuación.
Los ADNc extendidos que contienen las secuencias
codificadoras completas de la proteína de sus correspondientes
ARNm, o porciones de éstos, tales como ADNc que codifican la
proteína madura, pueden usarse para expresar las proteínas
segregadas codificadas o porciones de éstas, como se describe en el
Ejemplo 30, a continuación. Si se desea, los ADNc extendidos pueden
contener las secuencias que codifican el péptido señal para
facilitar la secreción de la proteína expresada. Se apreciará que
una pluralidad de ADNc extendidos que contienen las secuencias
codificadoras completas de la proteína o porciones de éstas pueden
clonarse simultáneamente en vectores de expresión para crear un
banco de expresión para el análisis de las proteínas codificadas,
como se describe a continuación.
Para expresar las proteínas codificadas por los
genes correspondientes a los 5' EST (o porciones de éstos), se
obtienen ADNc de longitud completa que contienen la región
codificadora completa de la proteína o ADNc extendidos que
contienen secuencias adyacentes a los 5' EST (o porciones de éstas)
como se describe en los Ejemplos 27-29, y se clonan
en un vector de expresión adecuado. Si se desea, los ácidos
nucleicos pueden contener la secuencias que codifican el péptido
señal para facilitar la secreción de la proteína expresada. Los
ácidos nucleicos insertados en los vectores de expresión también
pueden contener secuencias cadena arriba de las secuencias que
codifican el péptido señal, tales como secuencias que regulan los
niveles de expresión o secuencias que confieren una expresión
específica de tejido.
El ácido nucleico que codifica la proteína o
polipéptido que se va a expresar se conecta operablemente a un
promotor en un vector de expresión utilizando la tecnología de
clonación convencional. El vector de expresión puede ser cualquiera
de los sistemas de expresión de mamífero, levadura, insecto o
bacteriano conocidos en la técnica. Los vectores y sistemas de
expresión disponibles en el mercado pueden adquirirse de una
diversidad de suministradores, incluyendo Genetics Institute
(Cambridge, MA), Stratagene (La Jolla, California), Promega
(Madison, Wisconsin), e Invitrogen (San Diego, California). Si se
desea, para potenciar la expresión y facilitar el correcto
plegamiento de la proteína, puede optimizarse el contexto de codones
y el apareamiento de codones de la secuencia para el organismo de
expresión concreto en el que se introduce el vector de expresión,
como se explica en Hatfield et al., patente de EEUU nº
5.082.767.
El ADNc clonado en el vector de expresión puede
codificar la proteína completa (es decir, el péptido señal y la
proteína madura), la proteína madura (es decir, la proteína creada
por la escisión del péptido señal), sólo el péptido señal o
cualquier otra porción de ésta.
El siguiente método se proporciona como ejemplo
para expresar las proteínas codificadas por los ADNc extendidos que
corresponden a los 5' EST o los ácidos nucleicos descritos
anteriormente. En primer lugar, se identifica el codón de inicio de
metionina para el gen, y la señal de poliA del gen. Si el ácido
nucleico que codifica el polipéptido que se va a expresar carece de
una metionina para actuar como el sitio de inicio, puede
introducirse una metionina de inicio junto al primer codón del
ácido nucleico utilizando técnicas convencionales. De forma
similar, si el ADNc extendido carece de una señal de poliA, esta
secuencia puede añadirse al constructo, por ejemplo, escindiendo la
señal de poliA de pSG5 (Stratagene) utilizando las enzimas
endonucleasas de restricción BglII y SalI, e incorporándola en el
vector de expresión de mamífero pXT1 (Stratagene). El pXT1 contiene
los LTR y una porción del gen gag del virus de la leucemia
murina de Moloney. La posición de los LTR en el constructo permite
una transfección estable y eficaz. El vector incluye el promotor de
timidina quinasa de Herpes simplex y el gen seleccionable de
neomicina. El ADNc extendido o una porción de éste que codifica el
polipéptido que se va a expresar se obtiene mediante PCR a partir
del vector bacteriano utilizando cebadores de oligonucleótidos
complementarios con el ADNc extendido o una porción de éste, y
contiene secuencias de endonucleasas de restricción para PstI
incorporadas en el cebador 5', y BglII en el extremo 5' del
correspondiente cebador 3' de ADNc, teniendo cuidado de asegurarse
de que el ADNc extendido está colocado con la señal de poliA. El
fragmento purificado obtenido de la reacción de PCR resultante se
digiere con PstI, se crean extremos romos con una exonucleasa, se
digiere con BgIII, se purifica y se acopla con pXT1 que contiene una
señal de poliA, y se prepara para este acoplamiento (extremo
romo/BgIII).
El producto acoplado se transfecta en células
NIH 3T3 utilizando Lipofectin (Life Technologies, Inc., Grand
Island, Nueva York) bajo condiciones indicadas en la especificación
del producto. Los transfectantes positivos se seleccionan después
de cultivar las células transfectadas en G418 600 \mug/ml (Sigma,
St. Louis, Missouri). Preferiblemente, la proteína expresada se
libera en el medio de cultivo, facilitando, con ello, la
purificación.
Como alternativa, los ADNc extendidos pueden
clonarse en pED6dpc2 como se describe anteriormente. Los constructos
pED6dpc2 resultantes pueden transfectarse en una célula hospedante
adecuada, tal como células COS1. Las células resistentes a
metotrexato se seleccionan y expanden. Preferiblemente, la proteína
expresada a partir del ADNc extendido se libera en el medio de
cultivo, facilitando, con ello, la purificación.
Las proteínas en el medio de cultivo se separan
mediante electroforesis en gel. Si se desea, las proteínas puede
precipitarse en sulfato de amonio o separarse basándose en el tamaño
o carga antes de la electroforesis.
Como control, el vector de expresión que carece
de un inserto ADNc se introduce en células u organismos hospedantes
y se recolectan las proteínas en el medio. Las proteína segregadas
presentes en el medio se detectan utilizando técnicas familiares
para los expertos en la técnica, tales como tinción con azul de
Coomassie o plata, o utilizando anticuerpos contra la proteína
codificada por el ADNc extendido.
Pueden generarse anticuerpos capaces de
reconocer específicamente la proteína de interés utilizando péptidos
15-meros sintéticos que tienen una secuencia
codificada por el 5' EST apropiado, el ADNc extendido apropiado o
una porción de éstos. Los péptidos sintéticos se inyectan en ratones
para generar anticuerpos contra el polipéptido codificado por el 5'
EST, el ADNc extendido o una porción de éstos.
Las proteínas segregadas a partir de las células
u organismos hospedantes que contienen un vector de expresión que
contiene el ADNc extendido derivado de un 5' EST o una porción de
éste se comparan con las de células u organismos control. La
presencia de una banda en el medio procedente de las células que
contienen el vector de expresión, que está ausente en el medio
procedente de las células control, indica que el ADNc extendido
codifica una proteína segregada. En general, la banda
correspondiente a la proteína codificada por el ADNc extendido
tendrá una movilidad cercana a la esperada basándose en el número de
aminoácidos en el marco de lectura abierto del ADNc extendido. Sin
embargo, la banda puede tener una movilidad diferente de la esperada
como resultado de modificaciones, tales como glicosilación,
ubiquitinación o ruptura enzimática.
Como alternativa, si la proteína expresada a
partir de los anteriores vectores de expresión no contiene
secuencias que dirigen su secreción, las proteínas expresadas a
partir de células hospedantes que contienen un vector de expresión
con un inserto que codifica una proteína segregada o una porción de
ésta pueden compararse con proteínas expresadas en células
hospedantes control que contienen el vector de expresión sin
inserto. La presencia de una banda en las muestras procedentes de
células que contienen el vector de expresión con un inserto que
está ausente en muestras procedentes de células que contienen el
vector de expresión sin inserto indica que la proteína deseada, o
una porción de ésta, está siendo expresada. En general, la banda
tendrá la movilidad esperada para la proteína segregada o una
porción de ésta. Sin embargo, la banda puede tener una movilidad
diferente de la esperada como resultado de modificaciones, tales
como glicosilación, ubiquitinación o ruptura enzimática.
La proteína codificada por el ADNc extendido
puede purificarse utilizando técnicas de inmunocromatografía
convencionales. En estos procedimientos, una disolución que contiene
la proteína segregada, tal como el medio de cultivo o un extracto
celular, se aplica a una columna que tiene anticuerpos contra la
proteína segregada unidos a la matriz de cromatografía. Se permite
que la proteína segregada se una a la columna de
inmunocromatografía. Después, la columna se lava para eliminar las
proteínas unidas de forma no específica. La proteína segregada
unida de forma específica entonces se libera de la columna y se
recupera utilizando técnicas convencionales.
Si no es posible la producción de anticuerpos,
la secuencia del ADNc extendido o una porción de ésta puede
incorporarse en vectores de expresión diseñados para usar en
esquemas de purificación que emplean polipéptidos quiméricos. En
estas estrategias, la secuencia codificadora del ADNc extendido o
una porción de ésta se inserta dentro del marco con un gen que
codifica la otra mitad de la quimera. La otra mitad de la quimera
puede ser \beta-globina o un polipéptido de unión
a níquel. Entonces se utiliza una matriz de cromatografía que tienen
un anticuerpo contra \beta-globina o níquel unido
a ella para purificar la proteína quimérica. Pueden introducirse
sitios de ruptura por proteasas entre el gen de
\beta-globina o el polipéptido de unión a níquel y
el ADNc extendido o una porción de éste. Por tanto, los dos
polipéptidos de la quimera pueden separarse entre sí mediante
digestión con proteasas.
Un vector de expresión útil para generar
quimeras de \beta-globina es pSG5 (Stratagene),
que codifica la \beta-globina de conejo. El
intrón II del gen de \beta-globina de conejo
facilita la ruptura del transcripto expresado, y la señal de
poliadenilación incorporada al constructo aumenta el nivel de
expresión. Estas técnicas, según están descritas, son muy conocidas
por los expertos en la técnica de la biología molecular. Los métodos
convencionales están publicados en textos metodológicos, tales como
Davis et al. (Basic Methods in Molecular Biology,
Davis, Dibner y Battey, ed., Elsevier Press, NY, 1986) y muchos de
los métodos están disponibles en Stratagene, Life Technologies,
Inc., o Promega. El polipéptido también puede producirse a partir
del constructo utilizando sistemas de traducción in vitro,
tales como el kit In vitro Express^{TM} Translation
(Stratagene).
\newpage
Después de la expresión y purificación de las
proteínas segregadas codificadas por los 5' EST, los ADNc extendidos
o fragmentos de éstos, las proteínas purificadas pueden ensayarse
para determinar la capacidad para unirse a la superficie de
diversos tipos celulares, como se describe en el ejemplo 31, a
continuación. Se apreciará que una pluralidad de proteínas
expresadas a partir de estos ADNc puede incluirse en un panel de
proteínas para ser evaluadas simultáneamente para determinar las
actividades descritas específicamente a continuación, así como
otros papeles biológicos para los cuales están disponibles ensayos
para determinar la actividad.
Las proteínas codificadas por los 5' EST, ADNc
extendidos o fragmentos de éstos se clonan en vectores de expresión,
tales como los descritos en el Ejemplo 30. Las proteínas se
purifican mediante cromatografía de exclusión, de carga,
inmunocromatografía u otras técnicas familiares para los expertos en
la técnica. Después de la purificación, las proteínas se marcan
utilizando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Las
proteínas marcadas se incuban con células o líneas celulares
derivadas de una diversidad de órganos o tejidos para permitir que
las proteínas se unan a cualquier receptor presente sobre la
superficie celular. Después de la incubación, las células se lavan
para eliminar la proteína unida de forma no específica. Las
proteínas marcadas se detectan mediante autorradiografía. Como
alternativa, las proteínas no marcadas pueden incubarse con las
células y detectarse con anticuerpos que tienen un marcador
detectable, tal como una molécula fluorescente, unido a ellos.
La especificidad de la unión a la superficie
celular puede analizarse realizando un análisis de competencia en
el que diversas cantidades de proteína no marcada se incuban junto
con la proteína marcada. La cantidad de proteína marcada unida a la
superficie celular disminuye a medida que aumenta la cantidad de
proteína no marcada competitiva. Como control en algunas reacciones
de unión se incluyen diversas cantidades de una proteína no marcada
no relacionada con la proteína marcada. La cantidad de proteína
marcada unida a la superficie celular no disminuye en las
reacciones de unión que contienen cantidades crecientes de proteína
no marcada no relacionada, indicando que la proteína codificada por
el ADNc se une específicamente a la superficie celular.
Como se indicó anteriormente, se ha demostrado
que las proteínas segregadas tienen un serie de importantes efectos
fisiológicos y, por consiguiente, representan un valioso recurso
terapéutico. Las proteínas segregadas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos fabricadas según los Ejemplos
27-29 pueden evaluarse para determinar sus
actividades fisiológicas, como se describe a continuación.
Como se analizó anteriormente, las proteínas
segregadas pueden actuar como citoquinas, o pueden afectar a la
proliferación o diferenciación celular. Muchos factores de proteínas
descubiertos hasta la fecha, incluyendo todas las citoquinas
conocidas, han mostrado actividad en uno o más ensayos de
proliferación celular dependientes de factor y, por tanto, los
ensayos sirven como una confirmación conveniente de actividad de
citoquinas. La actividad de una proteína codificada por el ADNc
extendido queda demostrada por uno cualquiera de una serie de
ensayos de proliferación celular dependientes de factor rutinarios
que incluyen, sin limitación: 32D, DA2, DA1G, T10, B9, B9/11, BaF3,
MC9/G, M^{+} (preB M^{+}), 2E8, RB5, DA1, 123, T1165, HT2,
CTLL2, TF-1, Mo7c y CMK. Las proteínas codificadas
por los anteriores ADNc extendidos o porciones de éstos pueden
evaluarse para determinar su capacidad para regular la
proliferación de células T o timocitos en ensayos tales como los
descritos anteriormente, o en las siguientes referencias: Current
Protocols in Immunology, Ed. por Coligan et al., Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience; Takai
et al., J. Immunol., 137: 3494-3500,
1986; Bertagnolli et al., J. Immunol., 125:
1706-1712, 1990; Bertagnolli et al., Cell.
Immunol., 133: 327-341, 1991;
Bertagnolli et al., J. Immunol., 149:
3778-3783, 1992; Bowman et al., J. Immunol.,
152: 1756-1761, 1994.
Además, se conocen numerosos ensayos para la
producción de citoquinas y/o la proliferación de células del bazo,
células de nódulos linfáticos y timocitos. Estos incluyen las
técnicas descritas en Current Protocols in Immunology,
supra, 1: 3.12.1-3.12.14; y Schreiber, en
Current Protocols in Immunology, supra, 1:
6.8.1-6.8.8.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden ensayarse para determinar su capacidad para regular la
proliferación y diferenciación de células hematopoyéticas o
linfopoyéticas. Muchos ensayos para determinar esta actividad son
familiares para los expertos en la técnica, incluyendo los ensayos
en las siguientes referencias: Bottomly et al., en
Current Protocols in Immunology, supra, 1:
6.3.1-6.3.12; deVries et al., J. Exp. Med.,
173: 1205-1211, 1991; Moreau et al.,
Nature, 36: 690-692, 1988; Greenberg
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:
2931-2938, 1983; Nordan, R., en Current Protocols
in Immunology, supra, 1: 6.6.1-6.6.5; Smith
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:
1857-1861, 1986; Bennett et al., en
Current Protocols in Immunology, supra, 1: 6.15.1;
Ciarletta et al., en Current Protocols in Immunology,
supra, 1: 6.13.1.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden ensayarse para determinar su capacidad para regular las
respuestas de células T a antígenos. Muchos ensayos para dicha
actividad son familiares para los expertos en la técnica,
incluyendo los ensayos descritos en las siguientes referencias:
capítulo 3 (In Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function),
capítulo 6 (Cytokines and Their Cellular Receptors) y capítulo 7
(Immunologic Studies in Humans) en Current Protocols in
Immunology, supra; Weinberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77: 6091-6095, 1980; Weinberg et
al., Eur. J. Immunol., 11: 405-411, 1981;
Takai et al., J. Immunol., 137:
3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol.,
140: 508-512, 1988.
Las proteínas que muestran actividad de
citoquinas, de proliferación celular o de diferenciación celular
entonces pueden formularse como productos farmacéuticos y
utilizarse para tratar trastornos clínicos en los que la inducción
de la proliferación o diferenciación celular es beneficiosa. Como
alternativa, como se describe con más detalle a continuación, los
genes que codifican estas proteínas o ácidos nucleicos que regulan
la expresión de estas proteínas pueden introducirse en las células
hospedantes apropiadas para aumentar o disminuir la expresión de las
proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar sus efectos como
inmunorreguladores. Por ejemplo, las proteínas pueden evaluarse
para determinar su actividad para influir en la citotoxicidad de
timocitos o esplenocitos. Numerosos ensayos para dicha actividad son
familiares para los expertos en la técnica, incluyendo los ensayos
descritos en las siguientes referencias: capítulo 3 (In Vitro
Assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19) y
capítulo 7 (Immunologic Studies in Humans) en Current Protocols
in Immunology, Coligan et al., eds., Greene Publishing
Associates and Wiley-Interscience; Herrmann et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:
2488-2492, 1981; Herrmann et al., J.
Immunol., 128: 1968-1974, 1982; Handa
et al., J. Immunol., 135: 1564-1572,
1985; Takai et al., J. Immunol., 137:
3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol.,
140: 508-512, 1988; Bowman et al., J.
Virology, 61: 1992-1998; Bertagnolli
et al., Cell Immunol., 133: 327-341,
1991; Brown et al., J. Immunol., 153:
3079-3092, 1994.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar sus efectos sobre respuestas de
inmunoglobulinas dependientes de células T y cambio de isotipo.
Numerosos ensayos para dicha actividad son familiares para los
expertos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en las
siguientes referencias: Maliszewski, J. Immunol.,
144: 3028-3033, 1990; Mond et al., en
Current Protocols in Immunology, 1:
3.8.1-3.8.16, supra.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar sus efectos sobre células
efectoras inmunológicas, incluyendo su efecto sobre células Th1 y
linfocitos citotóxicos. Numerosos ensayos para dicha actividad son
familiares para los expertos en la técnica, incluyendo los ensayos
descritos en las siguientes referencias: capítulo 3 (In
Vitro Assays for Mouse Lymphocyte Function
3.1-3.19) y capítulo 7 (Immunologic Studies in
Humans) en Current Protocols in Immunology, supra; Takai
et al., J. Immunol., 137: 3494-3500,
1986; Takai et al., J. Immunol., 140:
508-512, 1988; Bertagnolli et al., Cell
Immunol., 149: 3778-3783, 1992.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar sus efectos sobre la activación de
células T indiferenciadas mediada por células dendríticas. Numerosos
ensayos para dicha actividad son familiares para los expertos en la
técnica, incluyendo los ensayos descritos en las siguientes
referencias: Guery et al., J. Immunol., 134:
536-544, 1995; Inaba et al., J. Exp. Med.,
173: 549-559, 1991; Macatonia et al., J.
Immunol., 154: 5071-5079, 1995; Porgador
et al., J. Exp. Med., 182: 255-260,
1995; Nair et al., J. Virol., 67:
4062-4069, 1993; Huang et al., Science,
264: 961-965, 1994; Macatonia et al., J.
Exp. Med., 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj
et al., Journal of Clinical Investigation, 94:
797-807, 1994; e Inaba et al., J. Exp. Med.,
172: 631-640, 1990.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar su influencia sobre el tiempo de
vida de los linfocitos. Numerosos ensayos para dicha actividad son
familiares para los expertos en la técnica, incluyendo los ensayos
descritos en las siguientes referencias: Darzynkiewitcz et al.,
Cytometry, 13: 795-808, 1992; Gorczyca
et al., Leukemia, 7: 659-670, 1993;
Gorczyca et al., Cancer Res., 53:
1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell,
66: 233-243, 1991; Zacharchurk, J.
Immunol., 145: 4037-4045, 1990; Zamai
et al., Cytometry, 14: 891-897, 1993;
Gorczyca et al., Int. J. Oncol., 1:
639-648, 1992.
Las proteínas codificadas por los ADNc también
pueden evaluarse para determinar su influencia sobre las etapas
tempranas del desarrollo y compromiso de células T. Numerosos
ensayos para dicha actividad son familiares para los expertos en la
técnica, incluyendo los ensayos descritos en las siguientes
referencias: Antica et al., Blood, 84:
111-117, 1994; Fine et al., Cell. Immunol.,
155: 111-122, 1994; Galy et al.,
Blood, 84: 2770-2778, 1995; Toki et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:
7548-7551, 1991.
Aquellas proteínas que muestran actividad como
reguladores del sistema inmunológico entonces pueden formularse
como productos farmacéuticos y utilizarse para tratar trastornos
clínicos en los que la regulación de la actividad inmunológica es
beneficiosa. Por ejemplo, la proteína puede ser útil en el
tratamiento de diversas deficiencias y trastornos inmunológicos
(incluyendo inmunodeficiencia combinada grave), por ejemplo, para
regular (hacia arriba o hacia abajo) el crecimiento y proliferación
de linfocitos T y/o B, así como efectuar la actividad citolítica de
células NK y otras poblaciones celulares. Estas deficiencias
inmunológicas pueden ser genéticas o provocadas por virus (por
ejemplo, VIH), así como infecciones bacterianas o fúngicas, o pueden
ser el resultado de trastornos autoinmunológicos. Más
específicamente, las enfermedades infecciosas provocadas por virus,
bacterias, hongos u otras infecciones pueden tratarse utilizando
una proteína codificada por los ADNc extendidos derivados de los 5'
EST de la presente invención, incluyendo infecciones por VIH, virus
de la hepatitis, herpes virus, micobacterias, Leishmania spp.,
Plasmodium y diversas infecciones fúngicas, tal como candidiasis.
Por supuesto, a este respecto, una proteína codificada por los ADNc
extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención también
puede ser útil cuando sea deseable, en general, un refuerzo del
sistema inmunológico, es decir, en el tratamiento del cáncer.
Como alternativa, las proteínas codificadas por
los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente
invención pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos
autoinmunológicos incluyendo, por ejemplo, enfermedad del tejido
conectivo, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico,
artritis reumatoide, inflamación pulmonar autoinmunológica,
síndrome de Guillian-Barre, tiroiditis
autoinmunológica, diabetes mellitus dependiente de insulina,
miastenia grave, enfermedad del receptor frente al injerto, y
enfermedad ocular inflamatoria autoinmunológica. Esta proteína
codificada por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la
presente invención también puede ser útil en el tratamiento de
reacciones y trastornos alérgicos, tales como asma (en particular,
asma alérgico) u otros problemas respiratorios. Otros trastornos,
en los que se desea una supresión inmunológica (incluyendo, por
ejemplo, el transplante de órganos) también pueden ser tratables
utilizando una proteína codificada por los ADNc extendidos
derivados de los 5' EST de la presente invención.
Utilizando las proteínas de la invención también
es posible regular las respuestas inmunológicas, hacia arriba o
hacia abajo.
La infrarregulación puede implicar inhibir o
bloquear una respuesta inmunológica que ya está en progreso, o
puede implicar prevenir la inducción de una respuesta inmunológica.
Las funciones de células T activadas pueden inhibirse mediante la
supresión de las respuestas de las células T, o la inducción de una
tolerancia específica en células T, o ambas. La inmunosupresión de
las respuestas de las células T es, en general, un proceso activo
no específico de antígeno que requiere una exposición continuada de
las células T al agente supresor. La tolerancia, que implica la
inducción de la no respuesta o anergia en células T, puede
distinguirse de la inmunosupresión porque, en general, es
específica de antígeno y persiste tras el final de la exposición al
agente tolerizante. En la práctica, la tolerancia puede demostrarse
por la falta de respuesta de células T tras la reexposición a un
antígeno específico en ausencia del agente tolerizante.
La infrarregulación o prevención de una o más
funciones del antígeno (incluyendo, sin limitación, las funciones
del antígeno de linfocitos B, tales como, por ejemplo, la
coestimulación de B7), por ejemplo, la prevención de unos niveles
altos de síntesis de linfoquinas por las células T activadas, que
sería útil en situaciones de transplante de tejido, piel y órganos,
y en la enfermedad del receptor frente al injerto (GVHD). Por
ejemplo, el bloqueo de la función de las células T debería producir
una menor destrucción del tejido en un transplante de tejido. De
forma típica, en transplantes de tejidos, el rechazo del transplante
se inicia mediante su reconocimiento como extraño por las células
T, seguido de una reacción inmunológica que destruye el transplante.
La administración de una molécula que inhibe o bloquea la
interacción de un antígeno de linfocito B7 con su(s)
ligando(s) natural(es) en células inmunológicas
(tales como una forma soluble y monómera de un péptido que tiene
actividad B7-2 por sí solo o junto con una forma
monómera de un péptido que tiene actividad de otro antígeno de
linfocitos B (por ejemplo, B7-1,
B7-3) o anticuerpo de bloqueo), antes del
transplante, puede conducir a la unión de la molécula
al(los) ligando(s) natural(es) en las células
inmunológicas sin transmitir la correspondiente señal
coestimulatoria. El bloqueo de la función de antígeno de linfocitos
B, en este caso, evita la síntesis de citoquinas por las células
inmunológicas, tales como células T, y, por tanto, actúa como un
inmunosupresor. Además, la falta de coestimulación también puede
ser suficiente para anergizar las células T, induciendo, con ello,
la tolerancia en un sujeto. La inducción de tolerancia a largo plazo
por reactivos que bloquean antígenos de linfocitos B puede evitar
la necesidad de la administración repetida de estos reactivos de
bloqueo. Para lograr una tolerancia o inmunosupresión suficiente en
un sujeto, también puede ser necesario bloquear la función de una
combinación de antígenos de linfocitos B.
La eficacia de los reactivos de bloqueo
particulares para prevenir el rechazo de transplantes de órganos o
GVHD puede evaluarse utilizando modelos animales que son predictivos
de la eficacia en seres humanos. Los ejemplos de sistemas
apropiados que pueden utilizarse incluyen injertos cardíacos
alogénicos en ratas e injertos de células de isletas pancreáticas
xenogénicos en ratones, ambos de los cuales se han utilizado para
estudiar los efectos inmunosupresores de proteínas de fusión
CTLA41g in vivo, como se describe en Lenschow et al.,
Science, 257: 789-792, 1992, y Turka
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
11102-11105, 1992. Además, pueden usarse modelos
murinos de GVHD (véase Paul ed., Fundamental Immunology,
Raven Press, Nueva York, 1989, pp. 846-847) para
determinar el efecto del bloqueo de la función de antígeno de
linfocitos B in vivo sobre el desarrollo de esta
enfermedad.
El bloqueo de la función de antígeno también
puede ser terapéuticamente eficaz para tratar enfermedades
autoinmunológicas. Muchas enfermedades autoinmunológicas son el
resultado de la activación inapropiada de células T que son
reactivas frente al propio tejido y que estimulan la producción de
citoquinas y autoanticuerpos implicados en la patología de las
enfermedades. La prevención de la activación de células T
autorreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de la
enfermedad. La administración de reactivos que bloquean la
coestimulación de células T interrumpiendo las interacciones
receptor/ligando de antígenos de linfocitos B puede utilizarse para
inhibir la activación de células T y prevenir la producción de
autoanticuerpos o citoquinas derivadas de células T que están
potencialmente implicados en el proceso de la enfermedad. Además,
los reactivos de bloqueo pueden inducir tolerancia específica de
antígeno de células T autorreactivas, lo que puede conducir a un
alivio a largo plazo de la enfermedad. La eficacia de los reactivos
de bloqueo en la prevención o alivio de enfermedades
autoinmunológicas puede determinarse utilizando una serie de
modelos animales bien caracterizados de enfermedades
autoinmunológicas humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis
autoinmunológica experimental murina, lupus eritematoso sistémico
en ratones MRL/pr/pr o ratones híbridos NZB, artritis de colágeno
autoinmunológica murina, diabetes mellitus en ratones OD y ratas
BB, y miatenia grave experimental murina (véase Paul ed.,
supra, pp. 840-856).
La sobrerregulación de una función de antígeno
(preferiblemente una función de antígeno de linfocitos B), como un
medio para sobrerregular las respuestas inmunológicas, también puede
ser útil en terapia. La sobrerregulación de las respuestas
inmunológicas puede implicar potenciar una respuesta inmunológica
existente, o provocar una respuesta inmunológica inicial como se
muestra en los siguientes Ejemplos. Por ejemplo, la potenciación de
una respuesta inmunológica mediante la estimulación de la función de
antígeno de linfocitos B puede ser útil en casos de infección
vírica. Además, enfermedades víricas sistémicas, tales como gripe,
resfriado común y encefalitis, pueden aliviarse mediante la
administración de una forma estimulatoria de antígenos de linfocitos
B por vía sistémica.
Como alternativa, las respuestas inmunológicas
antivíricas pueden potenciarse en un paciente infectado retirando
células T del paciente, coestimulando las células T in vitro
con APC marcados con antígenos víricos que expresan un péptido
codificado por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la
presente invención o junto con una forma estimulatoria de un
péptido soluble codificado por los ADNc extendidos derivados de los
5' EST de la presente invención, y reintroduciendo las células T
cebadas in vitro en el paciente. Las células infectadas
entonces serán capaces de dirigir una señal coestimulatoria a las
células T in vivo, activando, con ellos, las células T.
En otra aplicación, la sobrerregulación o
potenciación de la función de antígeno (preferiblemente una función
de antígeno de linfocitos B) puede ser útil en la inducción de
inmunidad tumoral. Células tumorales (por ejemplo, sarcoma,
melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, carcinoma) transfectadas
con un ácido nucleico que codifica al menos un péptido codificado
por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente
invención pueden administrarse a un sujeto para superar la
tolerancia específica de tumor en el sujeto. Si se desea, la célula
tumoral puede transfectarse para expresar una combinación de
péptidos. Por ejemplo, células tumorales obtenidas de un paciente
pueden transfectarse ex vivo con un vector de expresión que
dirige la expresión de un péptido que tiene sólo actividad de tipo
B7-2, o junto con un péptido que tiene actividad de
tipo B7-1 y/o B7-3. Las células
tumorales transfectadas se devuelven al paciente para dar como
resultado la expresión de los péptidos sobre la superficie de la
célula transfectada. Como alternativa, pueden utilizarse técnicas de
terapia génica para seleccionar una célula tumoral para la
transfección in vivo.
La presencia del péptido codificado por los ADNc
extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención que
tiene actividad de antígeno(s) de linfocitos B sobre la
superficie de la célula tumoral proporciona la señal de
coestimulación necesaria para que las células T induzcan una
respuesta inmunológica mediada por células T contra las células
tumorales transfectadas. Además, las células tumorales que carecen o
que no reexpresan cantidades suficientes de moléculas de MHC de
clase I o MHC de clase II pueden transfectarse con ácidos nucleicos
que codifican toda o una porción (por ejemplo, una porción truncada
del dominio citoplásmico) de una cadena \alpha y \beta_{2} de
microglobulina MHC de clase I o una cadena \alpha de MHC de clase
II y una cadena \beta de MHC de clase II, para expresar, con
ello, proteínas MHC de clase I o MHC de clase II sobre la superficie
celular, respectivamente. La expresión de las moléculas apropiadas
de MHC de clase I o clase II junto con un péptido que tiene la
actividad de un antígeno de linfocitos B (por ejemplo,
B7-1, B7-2, B7-3)
induce una respuesta inmunológica mediada por células T contra la
célula tumoral transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica un
constructo antisentido que bloquea la expresión de una proteína
asociada con MHC de clase I, tal como la cadena invariable, también
puede cotransfectarse con un ADN que codifica un péptido que tiene
la actividad de un antígeno de linfocito B para estimular la
presentación de antígenos asociados con tumores e inducir una
inmunidad específica de tumor. Por tanto, la inducción de una
respuesta inmunológica mediada por células T en un sujeto humano
puede ser suficiente para superar la tolerancia específica de tumor
en el sujeto. Como alternativa, como se describe con más detalle a
continuación, los genes que codifican estas proteínas reguladoras
del sistema inmunológico o los ácidos nucleicos que regulan la
expresión de dichas proteínas pueden introducirse en células
hospedantes adecuadas para aumentar o disminuir la expresión de las
proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su actividad reguladora de la hematopoyesis. Por
ejemplo, puede evaluarse el efecto de las proteínas sobre la
diferenciación de células pluripotenciales embrionarias. Numerosos
ensayos para dicha actividad son familiares para los expertos en la
técnica, incluyendo los ensayos descritos en las siguientes
referencias: Johansson et al., Cell. Biol., 15:
141-151, 1995; Keller et al., Mol. Cell.
Biol., 13: 473-486, 1993; McClanahan
et al., Blood, 81: 2903-2915,
1993.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su influencia en el tiempo de vida de células
pluripotenciales y la diferenciación de células pluripotenciales.
Numerosos ensayos para dicha actividad son familiares para los
expertos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en las
siguientes referencias: Freshney, Methylcellulose Colony Forming
Assays, en Culture of Hematopoietic Cells, Freshney et
al., eds., pp. 265-268,
Wiley-Liss, Inc., Nueva York, NY, 1994; Hirayama
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
5907-5911, 1992; McNiece y Briddell, en Culture
of Hematopoietic Cells, supra; Neben et al., Exp.
Hematol., 22: 353-359, 1994; Ploemacher y
Cobblestone, en Culture of Hematopoietic Cells, supra,
1-21; Spooncer et al., Culture of Hematopoietic
Cells, supra, 163-179; y Sutherland, en
Culture of Hematopoietic Cells, supra,
139-162.
Aquellas proteínas que muestran actividad
reguladora de la hematopoyesis entonces puede formularse como
producto farmacéutico y usarse para tratar trastornos clínicos en
los que la regulación de la hematopoyesis es beneficiosa, tales
como el tratamiento de deficiencias de células mieloides o
linfoides. La implicación en la regulación de la hematopoyesis
viene indicada incluso por una actividad biológica marginal en apoyo
a células formadoras de colonias o líneas celulares dependientes de
factor. Por ejemplo, las proteínas que apoyan el crecimiento y
proliferación de células progenitoras eritroides por sí solas, o en
combinación con otras citoquinas, indica utilidad, por ejemplo, en
el tratamiento de diversas anemias o para su uso junto con terapia
de irradiación/quimioterapia para estimular la producción de
precursores eritroides y/o células eritroides. Las proteínas que
apoyan el crecimiento y proliferación de células mieloides, tales
como granulocitos y monocitos/macrófagos (es decir, la actividad
CSF tradicional) pueden ser útiles, por ejemplo, junto con
quimioterapia, para prevenir o tratar la mielosupresión
consequente. Las proteínas que apoyan el crecimiento y proliferación
de megacariocitos y, por consiguiente, de plaquetas, permiten la
prevención o el tratamiento de diversos trastornos de plaquetas,
tales como trombocitopenia y, en general, pueden utilizarse en lugar
o como complemento de transfusiones de plaquetas. Las proteínas que
apoyan el crecimiento y proliferación de células pluripotenciales
hematopoyéticas que son capaces de madurar para formar cualquiera y
todas las células hematopoyéticas mencionadas anteriormente pueden
encontrar utilidad terapéutica, por tanto, en diversos trastornos de
células pluripotenciales (tales como los que se tratan
habitualmente con transplantes, incluyendo, sin limitación, anema
aplásica y hemoglobinuria nocturna paroxísmica), así como en la
repoblación del compartimento de células pluripotenciales después de
una terapia de irradiación/quimioterapia, in vivo o in
vitro (es decir, junto con transplante de médula ósea o con
transplante (homólogo o heterólogo) de células progenitoras
periféricas) como células normales o manipuladas genéticamente para
la terapia génica. Como alternativa, como se describe con más
detalle a continuación, los genes que codifican proteínas de
actividad reguladora de la hematopoyeis o los ácidos nucleicos que
regulan la expresión de estas proteínas pueden introducirse en las
células hospedantes apropiadas o disminuir la expresión de las
proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su efecto sobre el crecimiento de tejidos. Numerosos
ensayos para dicha actividad son familiares para los expertos en la
técnica, incluyendo los ensayos descritos en la publicación de
Patente Internacional nº WO95/16035, publicación de Patente
Internacional nº WO95/05846, y publicación de Patente Internacional
nº WO91/07491.
Los ensayos para la actividad de curación de
heridas incluyen, sin limitación, los descritos en: Winter,
Epidermal Wound Healing, pp. 71-112, Maibach
y Rovee, eds., Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago,
modificado por Eaglstein y Mertz, J. Invest. Dermatol.,
71: 382-384, 1978.
Aquellas proteínas que están implicadas en la
regulación del crecimiento de tejidos entonces pueden formularse
como productos farmacéuticos y utilizarse para tratar trastornos
clínicos en los que la regulación del crecimiento de tejidos es
beneficiosa. Por ejemplo, una proteína codificada por los ADNc
extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención también
puede tener utilidad en composiciones utilizadas para crecimiento o
regeneración de tejido de hueso, cartílago, tendón, ligamento y/o
nervio, así como para la curación de heridas y la reparación y
sustitución de tejido, y en el tratamiento de quemaduras, incisiones
y úlceras.
Una proteína codificada por los ADNc extendidos
derivados de los 5' EST de la presente invención, que induce el
crecimiento de cartílago y/o hueso en circunstancias en las que el
hueso no se ha formado con normalidad, tiene aplicación en la
curación de fracturas de huesos y daños o defectos en cartílagos en
seres humanos y otros animales. Esta preparación que emplea una
proteína de la invención puede tener uso profiláctico en la
reducción de fracturas abiertas y cerradas, y también en una mejor
fijación de articulaciones artificiales. La síntesis de hueso de
novo inducida por un agente osteogénico contribuye a la
reparación de defectos craneofaciales inducidos por resección
oncológica, inducidos por traumatismos o congénitos, y también es
útil en cirugía plástica cosmética.
Una proteína de esta invención también puede
utilizarse en el tratamiento de la enfermedad periodontal, y en
otros procesos de reparación de dientes. Estos agentes pueden
proporcionar un entorno para atraer a células formadoras de hueso,
estimular el crecimiento de células formadoras de hueso, o inducir
la diferenciación de progenitores de células formadoras de hueso.
Una proteína de la invención también puede ser útil en el
tratamiento de la osteoporosis u osteoartritis, tal como mediante la
estimulación de la reparación de hueso y/o cartílago, o bloqueando
la inflamación o los procesos de destrucción de tejidos (actividad
colagenasa, actividad de osteoclastos, etc.) mediada por procesos
inflamatorios.
Otra categoría de actividad de regeneración de
tejidos que puede atribuirse a la proteína codificada por los ADNc
extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención es la
formación de tendones/ligamentos. Una proteína codificada por los
ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención,
que induce tejido de tipo tendón/ligamento u otra formación de
tejido en circunstancias en las que dicho tejido no se ha formado
con normalidad, tiene aplicación en la curación de desgarros de
tendones o ligamentos, deformidades y otros defectos de tendones o
ligamentos en seres humanos y otros animales. Esta preparación que
emplea proteínas inductoras de tejido de tipo tendón/ligamento
puede tener uso profiláctico para prevenir daños en tejido de
tendón o ligamento, así como uso en una mejor fijación de tendones o
ligamentos al hueso u otros tejidos, y en la reparación de defectos
del tejido de tendón o ligamento. La formación de novo de
tejido de tendón/ligamento inducida por una composición codificada
por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente
invención contribuye a la reparación de defectos de tendones o
ligamentos de origen congénito, traumático o de otro origen, y
también es útil en cirugía plástica cosmética para la unión o
reparación de tendones o ligamentos. Las composiciones codificadas
por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente
invención pueden proporcionar un entorno para atraer a células
formadoras de tendones o ligamentos, estimulan el crecimiento de
células formadoras de tendones o ligamentos, inducen la
diferenciación de progenitores de células formadoras de tendones o
ligamentos, o inducen el crecimiento de progenitores o células de
tendones/ligamentos ex vivo para devolverlos in vivo
para realizar la reparación del tejido. Las composiciones de la
invención también pueden ser útiles en el tratamiento de la
tendinitis, síndrome del túnel carpal y otros defectos de tendones
o ligamentos. Las composiciones también pueden incluir una matriz
y/o agente secuestrante apropiados como vehículos, como se conoce en
la técnica.
La proteína codificada por los ADNc extendidos
derivados de los 5' EST de la presente invención también puede ser
útil para la proliferación de células neurales y para la
regeneración de tejido nervioso y cerebral, es decir, para el
tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central y
periférico y neuropatías, así como trastornos mecánicos y
traumáticos, que implican degeneración, muerte o traumatismo de
células neurales o tejido nervioso. Más específicamente, una
proteína puede usarse en el tratamiento de enfermedades del sistema
nervioso periférico, tales como lesiones de nervios periféricos,
neuropatía periférica y neuropatías localizadas, y enfermedades del
sistema nervioso central, tales como enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis
lateral amiotrófica y síndrome de Shy-Drager. Otros
trastornos que pueden tratarse según la presente invención incluyen
trastornos mecánicos y traumáticos, tales como trastornos de la
médula espinal, traumatismos cefálicos y enfermedades
cerebrovasculares, tales como el ictus. Las neuropatías periféricas
que surgen como resultado de quimioterapia u otras terapias médicas
también pueden ser tratables utilizando una proteína de la
invención.
Las proteínas de la invención también pueden ser
útiles para estimular un cierre mejor o más rápido de heridas que
no curan, incluyendo, sin limitación, úlceras de presión, úlceras
asociadas con insuficiencia vascular, heridas quirúrgicas y
traumáticas, y similares.
Se espera que una proteína codificada por los
ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención
también pueda mostrar actividad para la generación o regeneración de
otros tejidos, tales como tejidos de órganos (incluyendo, por
ejemplo, páncreas, hígado, intestino, riñón, piel, endotelio), de
músculo (liso, esquelético o cardíaco) y vascular (incluyendo
endotelio vascular), o para estimular el crecimiento de células que
comprenden dichos tejidos. Parte de los efectos deseados puede
producirse mediante la inhibición o modulación de la formación de
escaras fibróticas para permitir que el tejido normal se genere. Una
proteína de la invención también puede mostrar actividad
angiogénica.
Una proteína codificada por los ADNc extendidos
derivados de los 5' EST de la presente invención también puede ser
útil para la protección o regenación del intestino y el tratamiento
de fibrosis pulmonar o hepática, lesiones por reperfusión en
diversos tejidos, y trastornos que se producen como resultado de
lesiones sistémicas de citoquinas.
Una proteína codificada por los ADNc extendidos
derivados de los 5' EST de la presente invención también puede ser
útil para estimular o inhibir la diferenciación de tejidos descritos
anteriormente a partir de tejidos o células precursores; o para
inhibir el crecimiento de tejidos descritos anteriormente.
Como alternativa, como se describe con más
detalle a continuación, los genes que codifican las proteínas de
actividad reguladora del crecimiento de tejidos o los ácidos
nucleicos que regulan la expresión de estas proteínas pueden
introducirse en células hospedantes apropiadas para aumentar o
disminuir la expresión de las proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su capacidad para regular hormonas reproductoras, tales
como la hormona estimulante del folículo. Numerosos ensayos para
dicha actividad son familiares para los expertos en la técnica,
incluyendo los ensayos descritos en las siguientes referencias:
Vale et al., Endocrinol., 91: 562-572,
1972; Ling et al., Nature, 321:
779-782, 1986; Vale et al., Nature,
321: 776-779, 1986; Mason et al.,
Nature, 318: 659-663, 1985; Forage et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:
3091-3095, 1986, capítulo 6.12 en Current
Protocols in Immunology, Coligan et al. eds., Greene
Publishing Associates and Wiley-Interscience; Taub
et al., J. Clin. Invest., 95:
1370-1376, 1995; Lind et al., APMIS,
103: 140-146, 1995; Muller et al., Eur.
J. Immunol., 25: 1744-1748; Gruber et
al., J. Immunol., 152: 5860-5867, 1994;
Johnston et al., J. Immunol., 153:
1762-1768, 1994.
Aquellas proteínas que muestran actividad como
hormonas reproductoras o reguladores del movimiento celular
entonces pueden formularse como productos farmacéuticos y utilizarse
para tratar trastornos clínicos en los que la regulación de las
hormonas reproductoras es beneficiosa. Por ejemplo, una proteína
codificada por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la
presente invención también puede mostrar actividades relacionadas
con activina o inhibina. Las inhibinas se caracterizan por su
capacidad para inhibir la liberación de la hormona estimulante del
folículo (FSH), mientras que las activinas se caracterizan por su
capacidad para estimular la liberación de FSH. Por tanto, una
proteína codificada por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST
de la presente invención, por sí sola o en heterodímeros con un
miembro de la familia de inhibinas-\alpha, puede
ser útil como anticonceptivo basándose en la capacidad de las
inhibinas para disminuir la fertilidad en hembras de mamífero y
disminuir la espermatogénesis en machos de mamífero. La
administración de cantidades suficientes de otras inhibinas puede
inducir la infertilidad en estos mamíferos. Como alternativa, la
proteína de la invención, como un homodímero o como un heterodímero
con otras subunidades de una proteína del grupo de
inhibinas-B, puede ser útil como producto
terapéutico inductor de la fertilidad, basándose en la capacidad de
las moléculas de activina para estimular la liberación de FSH de las
células de la pituitaria anterior. Véase, por ejemplo, la Patente
de EE.UU. 4.798.885. Una proteína de la invención también puede ser
útil para adelantar la aparición de la fertilidad en mamíferos
sexualmente inmaduros, para aumentar el tiempo de vida del
rendimiento reproductor de animales domésticos, tales como vacas,
ovejas y cerdos.
Como alternativa, como se describe con más
detalle a continuación, los genes que codifican las proteínas de
actividad reguladora de las hormonas reproductoras o los ácidos
nucleicos que regulan la expresión de estas proteínas pueden
introducirse en células hospedantes apropiadas para aumentar o
disminuir la expresión de las proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su actividad quimiotáctica/quimiocinética. Por ejemplo,
una proteína codificada por los ADNc extendidos derivados de los 5'
EST de la presente invención puede tener actividad quimiotáctica o
quimiocinética (por ejemplo, puede actuar como una quimioquina)
para células de mamífero, incluyendo, por ejemplo, monocitos,
fibroblastos, neutrófilos, células T, células cebadas, eosinófilos,
células epiteliales y/o endoteliales. Las proteínas quimiotácticas
y quimiocinéticas pueden utilizarse para movilizar o atraer una
población de células deseada hasta un sitio de acción deseado. Las
proteínas quimiotácticas o quimiocinéticas proporcionan ventajas
particulares en el tratamiento de heridas y otros traumatismos en
tejidos, así como en el tratamiento de infecciones localizadas. Por
ejemplo, la atracción de linfocitos, monocitos o neutrófilos hacia
tumores o sitios de infección puede producir mejores respuestas
inmunológicas contra el tumor o el agente infeccioso.
Una proteína o péptido tiene actividad
quimiotáctica por una población de células particular si puede
estimular, directa o indirectamente, la orientación o movimiento
dirigido de esta población de células. Preferiblemente, la proteína
o péptido tiene la capacidad de estimular directamente el movimiento
dirigido de las células. Se puede determinar con facilidad si una
proteína concreta tiene actividad quimiotáctica para una población
de células empleando dicha proteína o péptido en cualquier ensayo
conocido para la quimiotaxis de células.
La actividad de una proteína de la invención
puede medirse, entre otros medios, mediante los siguientes
métodos:
Los ensayos para determinar la actividad
quimiotáctica (que identifican proteínas que inducen o previenen la
quimiotaxis) consisten en ensayos que miden la capacidad de una
proteína para inducir la migración de células a través de la
membrana, así como la capacidad de una proteína para inducir la
adhesión de una población de células a otra población de células.
Los ensayos adecuados para el movimiento y adhesión incluyen, sin
limitación, los descritos en: Current Protocols in
Immunology, ed. por Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach y
Strober, pub. Green Publishing Associates and
Wiley-Interscience, capítulo 6.12:
6.12.1-6.12.28; Taub et al., J. Clin.
Invest., 95: 1370-1376, 1995; Lind et
al., APMIS, 103: 140-146, 1995; Mueller
et al., Eur. J. Immunol., 25:
1744-1748; Gruber et al., J. Immunol.,
152: 5860-5867, 1994; Johnston et al., J.
Immunol., 153: 1762-1768, 1994.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar sus efectos sobre la coagulación sanguínea. Numerosos
ensayos para dicha actividad son familiares para los expertos en la
técnica, incluyendo los ensayos descritos en las siguientes
referencias: Linet et al., J. Clin. Pharmacol., 26:
131-140, 1986; Burdick et al., Thrombosis
Res., 45: 413-419, 1987; Humphrey et
al., Fibrinolysis, 5: 71-79, 1991;
Schaub, Prostaglandins, 35: 467-474,
1988.
Aquellas proteínas que están implicadas en la
regulación de la coagulación sanguínea entonces pueden formularse
como productos farmacéuticos y utilizarse para tratar trastornos
clínicos en los que la regulación de la coagulación sanguínea es
beneficiosa. Por ejemplo, una proteína de la invención también puede
mostrar actividad hemostática o trombolítica. Como resultado, se
espera que esta proteína sea útil en el tratamiento de diversos
trastornos de la coagulación (incluyendo trastornos hereditarios,
tales como hemofilias), o para potenciar la coagulación y otros
acontecimientos hemostáticos en el tratamiento de heridas producidas
por traumatismos, cirugía u otras causas. Una proteína de la
invención también puede ser útil para disolver o inhibir la
formación de trombos y para el tratamiento y prevención de
trastornos resultantes de éstos (tales como infarto de vasos
cardíacos y del sistema nervioso central (por ejemplo, ictus)).
Como alternativa, como se describe con más detalle a continuación,
los genes que codifican las proteínas de actividad de coagulación
sanguínea o los ácidos nucleicos que regulan la expresión de estas
proteínas pueden introducirse en células hospedantes apropiadas para
aumentar o disminuir la expresión de las proteínas, según se
desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su implicación en interacciones de receptor/ligando.
Numerosos ensayos para dicha actividad son familiares para los
expertos en la técnica, incluyendo los ensayos descritos en las
siguientes referencias: capítulo 7, 7.28.1-7.28.22
en Current Protocols in Immunology, Coligan et al.
eds., Greene Publishing Associates and
Wiley-Interscience; Takai et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 84: 6864-6868, 1987;
Bierer et al., J. Exp. Med., 168:
1145-1156, 1988; Rosenstein et al., J. Exp.
Med., 169: 149-160, 1989; Stoltenborg
et al., J. Immunol. Methods, 175:
59-68, 1994; Stitt et al., Cell, 80:
661-670, 1995; Gyuris et al., Cell,
75: 791-803, 1993.
Por ejemplo, las proteínas codificadas por los
ADNc extendidos derivados de los 5' EST de la presente invención
también pueden mostrar actividad como receptores, ligandos de
receptores, o inhibidores o agonistas de interacciones de
receptor/ligando. Los ejemplos de estos receptores y ligandos
incluyen, sin limitación, receptores de citoquinas y sus ligandos,
receptores de quinasas y sus ligandos, receptores de fosfatasas y
sus ligandos, receptores implicados en interacciones de
célula-célula y sus ligandos (incluyendo, sin
limitación, moléculas de adhesión celular (tales como selectinas,
integrinas y sus ligandos), y parejas de receptor/ligando implicadas
en la presentación de antígenos, el reconocimiento de antígenos y
el desarrollo de respuestas inmunológicas celulares y humorales).
Los receptores y ligandos también son útiles para seleccionar
péptidos o moléculas pequeñas de inhibidores potenciales de la
interacción de receptor/ligando pertinente. Una proteína codificada
por los ADNc extendidos derivados de los 5' EST descritos
(incluyendo, sin limitación, fragmentos de receptores y ligandos)
puede, en sí misma, ser útil como inhibidor de interacciones de
receptor/ligando. Como alternativa, como se describe con más
detalle a continuación, los genes que codifican proteínas implicadas
en interacciones de receptor/ligando o los ácidos nucleicos que
regulan la expresión de estas proteínas pueden introducirse en
células hospedantes apropiadas para aumentar o disminuir la
expresión de las proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su actividad antiinflamatoria. La actividad
antiinflamatoria puede lograrse proporcionando un estímulo a células
implicadas en la respuesta inflamatoria, inhibiendo o estimulando
las interacciones célula-célula (tales como, por
ejemplo, la adhesión celular), inhibiendo o estimulando la
quimiotaxis de células implicadas en el proceso inflamatorio,
inhibiendo o estimulando la extravasación celular, o estimulando o
suprimiendo la producción de otros factores que inhiben o
estimulan, más directamente, una respuesta inflamatoria. Las
proteínas que muestran estas actividades pueden utilizarse para
tratar trastornos inflamatorios, incluyendo trastornos crónicos o
agudos, incluyendo, sin limitación, la inflamación asociada con
infección (tal como choque séptico, sepsis o síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica), lesiones por
isquemia-reperfusión, letalidad por endotoxinas,
artritis, rechazo hiperagudo mediado por el complemento, nefritis,
lesiones pulmonares inducidas por citoquinas o quimioquinas,
enfermedad del intestino inflamatoria, enfermedad de Crohn, o
trastorno resultante de la sobreproducción de citoquinas, tales
como TNF o IL-1. Las proteínas de la invención
también pueden ser útiles para tratar la anafilaxis e
hipersensibilidad frente a una sustancia o material antigénico. Como
alternativa, como se describe con más detalle a continuación, los
genes que codifican proteínas de actividad antiinflamatoria o los
ácidos nucleicos que regulan la expresión de estas proteínas pueden
introducirse
en células hospedantes apropiadas para aumentar o disminuir la expresión de las proteínas, según se desee.
en células hospedantes apropiadas para aumentar o disminuir la expresión de las proteínas, según se desee.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos o porciones de éstos también pueden evaluarse para
determinar su actividad inhibidora de tumores. Además de las
actividades descritas anteriormente para el tratamiento
inmunológico o la prevención de tumores, una proteína de la
invención puede mostrar otras actividades antitumorales. Una
proteína puede inhibir el crecimiento tumoral directa o
indirectamente (tal como, por ejemplo, mediante ADCC). Una proteína
puede mostrar su actividad inhibidora de tumores actuando sobre
tejido de tumor o tejido precursor de tumor, inhibiendo la
formación de tejidos necesarios para soportar el crecimiento del
tumor (tal como, por ejemplo, inhibiendo la angiogénesis),
provocando la producción de otros factores, agentes o tipos
celulares que inhiben el crecimiento del tumor, o suprimiendo,
eliminando o inhibiendo factores, agentes o tipos celulares que
estimulan el crecimiento del tumor. Como alternativa, como se
describe con más detalle a continuación, los genes que codifican
proteínas de actividad de inhibición de tumores o los ácidos
nucleicos que regulan la expresión de estas proteínas pueden
introducirse en células hospedantes apropiadas para aumentar o
disminuir la expresión de las proteínas, según se desee.
Una proteína de la invención también puede
mostrar una o más de las siguientes actividades o efectos
adicionales: inhibir el crecimiento, infección o función o matando
agentes infecciosos, incluyendo, sin limitación, bacterias, virus,
hongos u otros parásitos; afectando (suprimiendo o potenciando) a
características corporales, incluyendo, sin limitación, la altura,
peso, color del pelo, color de los ojos, piel, proporción de grasa a
tejido magro u otras pigmentaciones de tejidos, o el tamaño o forma
de un órgano o parte del cuerpo (tal como, por ejemplo, aumento o
disminución del busto, cambio en la forma del hueso); afectando a
los biorritmos o ritmos o ciclos circadianos; afectando a la
fertilidad de sujetos macho o hembra; afectando al metabolismo,
catabolismo, anabolismo, procesamiento, utilización, almacenamiento
o eliminación de grasas, lípidos, proteínas, carbohidratos,
vitaminas, minerales, cofactores u otros factores o componentes
nutricionales de la dieta; afectando a las características del
comportamiento, incluyendo, sin limitación, el apetito, líbido,
estrés, cognición (incluyendo trastornos cognitivos), depresión
(incluyendo trastornos depresivos) y comportamientos violentos;
proporcionar efectos analgésicos u otros efectos reductores del
dolor; estimular la diferenciación y el crecimiento de células
pluripotenciales embrionarias en linajes diferentes de los linajes
hematopoyéticos; actividad hormonal o endocrina; en el caso de
enzimas, corregir deficiencias de las enzimas y tratar enfermedades
relacionadas con las deficiencias; tratamiento de enfermedades
hiperproliferativas (tales como, por ejemplo, psoriasis); actividad
de tipo inmunoglobulina (tal como, por ejemplo, la capacidad de
unir antígenos o complementos); y la capacidad para actuar como
antígeno en una composición de vacuna para producir una respuesta
inmunológica contra dicha proteína u otro material o entidad que
presenta reactividad cruzada con dicha proteína. Como alternativa,
como se describe con más detalle a continuación, los genes que
codifican proteínas implicadas en cualquiera de las actividades
mencionadas anteriormente o los ácidos nucleicos que regulan la
expresión de estas proteínas pueden introducirse en células
hospedantes apropiadas para aumentar o disminuir la expresión de las
proteínas, según se
desee.
desee.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteínas que interaccionan con los
polipéptidos codificados por los ADNc derivados de los 5' EST, o
fragmentos de éstos, tales como proteínas de receptores, pueden
identificarse utilizando sistemas de dos híbridos, tales como
Matchmaker Two Hybrid System 2 (nº de catálogo
K1604-1, Clontech). Como se describe en el manual
que acompaña al kit que se incorpora en la presente como
referencia, los ADNc derivados de los 5' EST, o fragmentos de
éstos, se insertan en un vector de expresión, de forma que están en
marco con el ADN que codifica el dominio de unión a ADN del
activador transcripcional de levadura GAL4. Los ADNc en un banco de
ADNc que codifica proteínas que pueden interaccionar con los
polipéptidos codificados por los ADNc extendidos, o fragmentos de
éstos, se insertan en un segundo vector de expresión, de forma que
están en marco con el ADN que codifica el dominio de activación de
GAL4. Los dos plásmidos de expresión se transforman en levaduras y
las levaduras se cultivan en placa en medio de selección que
selecciona la expresión de marcadores seleccionables sobre cada uno
de los vectores de expresión, así como la expresión dependiente de
GAL4 del gen HIS3. Los transformantes capaces de crecer sobre un
medio que carece de histidina se seleccionan para la expresión de
lacZ dependiente de GAL4. Aquellas células que son positivas en la
selección de histidina y el ensayo de lacZ contienen plásmidos que
codifican proteínas que interaccionan con el polipéptido codificado
por los ADNc extendidos, o porciones de éstos.
Como alternativa, el sistema descrito en Lustig
et al., Methods in Enzymology, 283:
83-99, 1997, y en la Patente de EE.UU. nº
5.654.150, puede utilizarse para identificar moléculas que
interaccionan con los polipéptidos codificados por los ADNc
extendidos. En estos sistemas, las reacciones de transcripción in
vitro se realizan en una agrupación de vectores que contienen
insertos de ADNc extendido clonados cadena abajo de un promotor que
dirige la transcripción in vitro. Las agrupaciones
resultantes de ARNm se introducen en oocitos de Xenopus
laevis. Los oocitos entonces se ensayan para una actividad
deseada.
Como alternativa, los productos de la
transcripción in vitro agrupados producidos como se describió
anteriormente pueden traducirse in vitro. Los productos de
la traducción in vitro agrupados pueden ensayarse para una
actividad deseada o para la interacción con un polipéptido
conocido.
Pueden descubrirse proteínas u otras moléculas
que interaccionan con polipéptidos codificados por los ADNc
extendidos mediante una diversidad de otras técnicas. En un método,
pueden construirse columnas de afinidad que contienen el
polipéptido codificado por el ADNc extendido o una porción de éste.
En algunas versiones de este método, la columna de afinidad
contiene proteínas quiméricas en las que la proteína codificada el
ADNc extendido o una porción de éste se fusiona con glutatión
S-tranferasa. Una mezcla de proteínas celulares o
agrupación de proteínas expresadas como se describió anteriormente
se aplica a la columna de afinidad. Las proteínas que interaccionan
con el polipéptido unido a la columna entonces pueden aislarse y
analizarse en un gel de electroforesis 2-D, como se
describe en Ramunsen et al., Electrophoresis, 18:
588-598, 1997. Como alternativa, las proteínas
retenidas en la columna de afinidad pueden purificarse por métodos
basados en electroforesis y secuenciarse. El mismo método puede
emplearse para aislar anticuerpos, para seleccionar productos de
presentación de fagos, o para seleccionar anticuerpos humanos de
presentación de fagos.
Las proteínas que interaccionan con polipéptidos
codificados por los ADNc extendidos o porciones de éstos también
pueden seleccionarse utilizando un biosensor óptico, como se
describe en Edwards y Leatherbarrow, Analytical
Biochemistry, 246: 1-6, 1997. La ventaja
principal del método es que permite la determinación de la
velocidad de asociación entre la proteína y otras moléculas de
interacción. Así, es posible seleccionar específicamente moléculas
de interacción con una velocidad de asociación alta o baja. De forma
típica, una molécula diana se une a la superficie del sensor
(mediante una matriz de carboximetildextrano) y una muestra de
moléculas de ensayo se pone en contacto con las moléculas diana. La
unión de una molécula de ensayo a la molécula diana provoca un
cambio en el índice de refracción y/o espesor. Este cambio se
detecta mediante el biosensor, con la condición de que se produzca
en el campo evanescente (que se extiende desde la superficie del
sensor en unos pocos cientos de nanómetros). En estos ensayos de
selección, la molécula diana puede ser uno de los polipéptidos
codificados por los ADNc extendidos o una porción de éstos, y la
muestra de ensayo puede ser una colección de proteínas extraída de
tejidos o células, una agrupación de proteínas expresadas, bancos
de péptidos combinatorios y/o químicos, o péptidos de presentación
de fagos. Los tejidos o células de los que se extraen las proteínas
de ensayo pueden originarse de cualquier especie.
En otros métodos, una proteína diana se
inmoviliza y la población de ensayo es una colección de polipéptidos
exclusivos codificados por los ADNc extendidos o porciones de
éstos.
Para estudiar la interacción de las proteínas
codificadas por los ADNc extendidos, o porciones de éstos, con
fármacos, puede utilizarse la microdiálisis acoplada con un método
de HPLC descrito por Wang et al., Chromatographia,
44: 205-208, 1997, o el método de
electroforesis capilar por afinidad descrito por Busch et al., J.
Chromatogr., 777: 311-328, 1997.
Los expertos en la técnica apreciarán que las
proteínas expresadas a partir de los ADNc extendidos o porciones
pueden ensayarse para numerosas actividades además de las enumeradas
de forma específica anteriormente. Por ejemplo, las proteínas
expresadas pueden evaluarse para aplicaciones que implican el
control y la regulación de la inflamación, proliferación o
metástasis tumoral, infección, u otros trastornos clínicos. Además,
las proteínas expresadas a partir de los ADNc extendidos, o
porciones de éstos, pueden ser útiles como agentes nutricionales o
agentes cosméticos.
Las proteínas expresadas a partir de los ADNc
extendidos, o porciones de éstos, pueden utilizarse para generar
anticuerpos capaces de unirse de forma específica a la proteína
expresada, o fragmentos de ésta, como se describe en el ejemplo 40
a continuación. Los anticuerpos pueden ser capaces de unirse a una
proteína de longitud completa codificada por un ADNc derivado de un
5' EST, una proteína madura (es decir, la proteína generada por la
escisión del péptido señal) codificada por un ADNc derivado de un
5' EST, o un péptido señal codificado por un ADNc derivado de un 5'
EST. Como alternativa, los anticuerpos pueden ser capaces de unir
fragmentos de al menos 10 aminoácidos de las proteínas codificadas
por los anteriores ADNc. En algunas realizaciones, los anticuerpos
pueden ser capaces de unir fragmentos de al menos 15 aminoácidos de
las proteínas codificadas por los anteriores ADNc. En otras
realizaciones, los anticuerpos pueden ser capaces de unir fragmentos
de al menos 25 aminoácidos de las proteínas expresadas a partir de
los ADNc extendidos que comprenden al menos 25 aminoácidos de las
proteínas codificadas por los anteriores ADNc. En otras
realizaciones, los anticuerpos pueden ser capaces de unir
fragmentos de al menos 40 aminoácidos de las proteínas codificadas
por los anteriores ADNc.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisla una proteína o polipéptido
sustancialmente puros a partir de las células transfectadas o
transformadas como se describió en el ejemplo 30. La concentración
de la proteína en la preparación final se ajusta, por ejemplo,
mediante concentración en un dispositivo de filtro Amicon, hasta un
nivel de unos pocos \mug/ml. Entonces puede prepararse un
anticuerpo monoclonal o policlonal contra la proteína como
sigue:
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
contra epitopos de cualquiera de los péptidos identificados y
aislados como se describió, a partir de hibridomas murinos según el
método clásico de Kohler y Milstein, Nature, 256:
495, 1975, o métodos derivados de éste. Brevemente, un ratón se
inocula repetidas veces con unos pocos microgramos de la proteína
seleccionada, o péptidos derivados de ésta, a lo largo de un periodo
de varias semanas. Entonces se sacrifica el ratón, y se aislan las
células productoras de anticuerpos del bazo. Las células del bazo
se fusionan mediante polietilenglicol con células de mieloma de
ratón, y el exceso de células no fusionadas se destruyen mediante
el crecimiento del sistema en un medio selectivo que comprende
aminopterina (medio HAT). Las células que se habían fusionado con
éxito se diluyeron, y se colocaron partes alícuotas de la dilución
en pocillos de una placa de microvaloración en los que continúa el
crecimiento del cultivo. Los clones productores de anticuerpos se
identifican mediante detección del anticuerpo en el fluido
sobrenadante de los pocillos mediante procedimientos de
inmunoensayo, tales como ELISA, como describió originariamente
Engvall, Meth. Enzymol. 70: 419, 1980, y métodos
derivados de éste. Los clones positivos seleccionados se
expandieron y su producto de anticuerpo monoclonal se recolectó para
uso. Los procedimientos detallados para la producción de
anticuerpos monoclonales se describen en Davis et al., en
Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, Nueva York,
sección 21-2.
Puede prepararse antisuero policlonal que
contiene anticuerpos contra epitopos heterogéneos de una única
proteína, inmunizando animales adecuados con la proteína expresada,
o péptidos derivados de ésta, que pueden estar sin modificar o
modificados para potenciar la inmunogenicidad. La producción eficaz
de anticuerpos policlonales se ve afectada por muchos factores
relacionados con el antígeno y la especie hospedante. Por ejemplo,
las moléculas pequeñas tienden a ser menos inmunogénicas que otras,
y pueden requerir el uso de vehículos y adyuvantes. Además, la
respuesta de los animales hospedantes varía dependiendo del sitio de
inoculación y la dosis, produciendo una dosis inadecuada o excesiva
de antígeno un antisuero con menor valoración. Las dosis pequeñas
(nivel de ng) de antígeno administradas en múltiples sitios
intradérmicos parecen ser las más fiables. Un protocolo de
inmunización eficaz para conejos puede encontrarse en Vaitukaitis
et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 33:
988-991 (1971).
Pueden administrarse inyecciones de refuerzo a
intervalos regulares, y el antisuero se recolecta cuando la
valoración de anticuerpos, determinada de forma semicuantitiva, por
ejemplo, mediante inmunodifusión doble en agar contra
concentraciones conocidas del antígeno, empieza a caer. Véase, por
ejemplo, Ouchterlony et al., capítulo 19, en: Handbook of
Experimental Immunology, D. Wier (ed.), Blackwell (1973). La
concentración meseta del anticuerpo normalmente está en el
intervalo de 0,1 a 0,2 mg/ml de suero (aproximadamente 12 \muM).
Se determina la afinidad de los antisueros por el antígeno
preparando curvas de unión competitiva, como se describe, por
ejemplo, en Fisher, D., capítulo 42, en: Manual of Clinical
Immunology, 2ª ed. (Rose y Friedman, eds.), Amer. Soc. For
Microbiol., Washington D.C. (1980).
Las preparaciones de anticuerpos según
cualquiera de los protocolos son útiles en inmunoensayos
cuantitativos que determinan las concentraciones de sustancias que
portan antígenos en muestras biológicas; también se emplean de modo
semicuantitativo o cualitativo para identificar la presencia de
antígenos en una muestra biológica. Los anticuerpos también pueden
utilizarse en composiciones terapéuticas para matar células que
expresan la proteína, o para reducir los niveles de la proteína en
el cuerpo.
Los 5' EST de la presente invención (o ADNc o
ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) pueden utilizarse como
reactivos en procedimientos de aislamiento, ensayos de diagnóstico y
procedimientos forenses. Por ejemplo, las secuencias de los 5' EST
(o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) pueden
marcarse de forma detectable y utilizarse como sondas para aislar
otras secuencias capaces de hibridarse con ellas. Además, las
secuencias de los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir
de éstos) pueden utilizarse para diseñar cebadores de PCR para
utilizar en procedimientos de aislamiento, diagnóstico o
forenses.
Las secuencias de los 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos) pueden utilizarse para
preparar cebadores de PCR para una diversidad de aplicaciones,
incluyendo procedimientos de aislamiento para clonar ácidos
nucleicos capaces de hibridarse con dichas secuencias, técnicas de
diagnóstico y técnicas forenses. Los cebadores de PCR tienen una
longitud de al menos 10 bases, y preferiblemente al menos 12, 15 ó
17 bases. Más preferiblemente, los cebadores de PCR tienen una
longitud de al menos 20-30 bases. En algunas
realizaciones, los cebadores de PCR pueden tener una longitud de
más de 30 bases. Se prefiere que las parejas de cebadores tengan
aproximadamente la misma proporción G/C, de forma que las
temperaturas de fusión son aproximadamente las mismas. Una
diversidad de técnicas de PCR son familiares para los expertos en la
técnica. Para un informe acerca de la tecnología PCR, véase
Molecular Cloning to Genetic Engineering, White Ed., en Methods
in Molecular Biology, 67: Humana Press, Totowa, 1997. En
cada uno de estos procedimientos de PCR, se añaden cebadores de PCR
a cada lado de las secuencias de ácidos nucleicos que se van a
amplificar, a una muestra de ácidos nucleicos preparada de forma
adecuada, junto con dNTP y una polimerasa termoestable, tal como Taq
polimerasa, Pfu polimerasa o Vent polimerasa. El ácido nucleico en
la muestra se desnaturaliza y los cebadores de PCR se hibridan
específicamente con las secuencias de ácidos nucleicos
complementarias en la muestra. Los cebadores hibridados se
extienden. Después se inicia otro ciclo de desnaturalización,
hibridación y extensión. Los ciclos se repiten múltiples veces para
producir un fragmento amplificado que contiene la secuencia de ácido
nucleico entre los sitios de los cebadores.
Las sondas derivadas de los 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos), incluyendo los ADNc de
longitud completa o las secuencias genómicas, pueden marcarse con
marcadores detectables familiares para los expertos en la técnica,
incluyendo radioisótopos y marcadores no radiactivos, para
proporcionar una sonda detectable. La sonda detectable puede ser
monocatenaria o bicatenaria, y puede fabricarse utilizando técnicas
conocidas en la técnica, incluyendo la transcripción in
vitro, traducción de mellas o reacciones de quinasas. Una
muestra de ácido nucleico que contiene una secuencia capaz de
hibridarse con la sonda marcada se pone en contacto con la sonda
marcada. Si el ácido nucleico en la muestra es bicatenario, puede
desnaturalizarse antes de ponerlo en contacto con la sonda. En
algunas aplicaciones, la muestra de ácido nucleico puede
inmovilizarse sobre una superficie, tal como una membrana de
nitrocelulosa o nailon. La muestra de ácido nucleico puede
comprender ácidos nucleicos obtenidos a partir de una diversidad de
fuentes, incluyendo ADN genómico, bancos de ADNc, ARN o muestras de
tejidos.
Los procedimientos utilizados para detectar la
presencia de ácidos nucleicos capaces de hibridarse con la sonda
detectable incluyen técnicas bien conocidas, tales como análisis de
la transferencia Southern, análisis de la transferencia Northern,
análisis de la transferencia por puntos, hibridación de colonias, e
hibridación en placas. En algunas aplicaciones, el ácido nucleico
capaz de hibridarse con la sonda marcada puede clonarse en
vectores, tales como vectores de expresión, vectores de
secuenciación, o vectores de transcripción in vitro para
facilitar la caracterización y expresión de los ácidos nucleicos que
se están hibridando en la muestra. Por ejemplo, estas técnicas
pueden utilizarse para aislar y clonar secuencias en un banco
genómico o banco de ADNc que son capaces de hibridarse con la sonda
detectable como se describe en el Ejemplo 30 anterior.
Los cebadores de PCR fabricados como se describe
en el ejemplo 44 anterior puede utilizarse en análisis forenses,
tal como las técnicas de huella de ADN descritas en los ejemplos
46-50, a continuación. Estos análisis pueden
utilizar cebadores o sondas detectables basadas en las secuencias de
los 5' EST o de los ADNc o ADN genómicos aislados utilizando los 5'
EST.
En un método ejemplar, se aislan muestras de ADN
a partir de especimenes forenses, por ejemplo, de pelo, semen,
sangre o células de la piel mediante métodos convencionales.
Entonces un panel de cebadores de PCR basado en una serie de los 5'
EST del Ejemplo 25, o ADNc o ADN genómicos aislados a partir de
éstos como se describió anteriormente, se utiliza según el Ejemplo
44 para amplificar ADN de aproximadamente 100-200
bases de longitud a partir del espécimen forense. Se obtienen las
secuencias correspondientes a partir de un sujeto de ensayo. Cada
una de estas identificaciones de ADN entonces se secuencia
utilizando técnicas convencionales, y una simple comparación en la
base de datos determina las diferencias, si hay, entre las
secuencias del sujeto y las de la muestra. Las diferencias
estadísticamente significativas entre las secuencias de ADN del
sospechoso y las de la muestra demuestran, de forma concluyente, la
carencia de equivalencia. Esta carencia de equivalencia puede
demostrarse, por ejemplo, con sólo una secuencia. La equivalencia,
por otra parte, debe demostrarse con una gran cantidad de
secuencias, correspondiéndose todas. Preferiblemente, se utiliza un
mínimo de 50 secuencias estadísticamente idénticas de 100 bases de
longitud para demostrar la equivalencia entre el sospechoso y la
muestra.
La tecnología esbozada en el ejemplo previo
también puede utilizarse a mayor escala para proporcionar una
identificación exclusiva de huella de cualquier individuo. En esta
técnica, se preparan cebadores a partir de un gran número de
secuencias de 5' EST del Ejemplo 25, o secuencias de ADNc o ADN
genómico que pueden obtenerse de éstos. Preferiblemente, se
utilizan de 20 a 50 cebadores diferentes. Estos cebadores se
utilizan para obtener un número correspondiente de segmentos de ADN
generados por PCR a partir del individuo en cuestión según el
Ejemplo 44. Cada uno de estos segmentos de ADN se secuencia,
utilizando los métodos indicados en el Ejemplo 46. La base de datos
de las secuencias generada mediante este procedimiento identifica,
de forma exclusiva, el individuo del cual se obtuvieron las
secuencias. Entonces puede emplearse el mismo panel de cebadores en
cualquier momento posterior para correlacionar absolutamente tejidos
u otros especimenes biológicos con ese individuo.
Se repitió el procedimiento del Ejemplo 47 para
obtener un panel de al menos 10 secuencias amplificadas a partir de
un individuo y un espécimen. Preferiblemente, el panel consiste en
al menos 50 secuencias amplificadas. Más preferiblemente, el panel
contiene 100 secuencias amplificadas. En algunas realizaciones, el
panel contiene 200 secuencias amplificadas. Este ADN generado por
PCR entonces se digiere con una o con una combinación de,
preferiblemente, cuatro enzimas de restricción específicas de base.
Estas enzimas están disponibles en el mercado y son conocidas por
los expertos en la técnica. Después de la digestión, los fragmentos
génicos resultantes se separan por tamaño en múltiples pocillos por
duplicado en un gel de agarosa, y se trasladan a nitrocelulosa
utilizando técnicas de análisis de la transferencia Southern muy
conocidas por los expertos en la técnica. Para un informe acerca
del análisis de la transferencia Southern, véase Davis et al.
(Basic Methods in Molecular Biology, 1986, Elsevier Press, pp.
62-65).
Un panel de sondas basadas en las secuencias de
los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos), o
fragmentos de éstos de al menos 10 bases, se marcan de modo
radiactivo o colorimétrico utilizando métodos conocidos en la
técnica, tal como traducción de mellas o marcaje en el extremo, y se
hibridan con la transferencia Southern utilizando técnicas
conocidas en la técnica (Davis et al., supra).
Preferiblemente, la sonda comprende al menos 12, 15 ó 17
nucleótidos consecutivos de los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos
obtenibles a partir de éstos). Más preferiblemente, la sonda
comprende al menos 20-30 nucleótidos consecutivos de
los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos).
En algunas realizaciones, la sonda comprende más de 30 nucleótidos
de los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de
éstos).
Preferiblemente, se utilizan al menos 5 a 10 de
estas sondas marcadas, y más preferiblemente se utilizan al menos
aproximadamente 20 ó 30 para proporcionar un patrón exclusivo. Las
bandas resultantes que aparecen tras la hibridación de una muestra
grande de 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de
éstos) serán un identificador exclusivo. Puesto que la ruptura con
enzimas de restricción será diferente en cada individuo, el patrón
de bandas del análisis de la transferencia Southern también será
exclusivo. El aumento del número de sondas de 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos) proporciona un nivel
estadísticamente superior de confianza en la identificación, puesto
que existirá un número mayor de conjuntos de bandas utilizado para
la identificación.
Otra técnica para identificar individuos que
utiliza las secuencias de 5' EST descritas en la presente utiliza
una técnica de hibridación de transferencia por puntos.
Se aisla ADN genómico a partir de núcleos del
sujeto que se va a identificar. Se sintetizan sondas de
oligonucleótidos con una longitud de aproximadamente 30 pb, que
corresponden al menos a 10, preferiblemente a 50 secuencias de los
5' EST, o los ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos. Las
sondas se utilizan para hibridarse con el ADN genómico mediante
condiciones conocidas en la técnica. Los oligonucleótidos se marcan
en el extremo con P^{32} utilizando polinucleótido quinasa
(Pharmacia). Las transferencias por puntos se crean rociando el ADN
genómico sobre nitrocelulosa o similar utilizando un colector de
transferencia por puntos al vacío (BioRad, Richmond, California).
El filtro de nitrocelulosa que contiene las secuencias genómicas se
cuece o se une mediante UV al filtro, se prehibrida y se híbrida
con sonda marcada utilizando técnicas conocidas en la técnica
(Davis et al., supra). Los fragmentos de ADN marcados con
P^{32} se hibridan secuencialmente con condiciones sucesivamente
rigurosas para detectar las diferencias mínimas entre la secuencia
de 30 pb y el ADN. El cloruro de tetrametilamonio es útil para
identificar clones que contienen pocos apareamientos erróneos de
nucleótidos (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82(6): 1585-1588, 1985). Un patrón
exclusivo de puntos distingue un individuo de otro individuo.
Las secuencias de los 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos), o los oligonucleótidos que
contienen al menos 10 bases consecutivas de estas secuencias, pueden
utilizarse como sondas en la siguiente técnica alternativa de
huella. Preferiblemente, la sonda comprende al menos 12, 15 ó 17
nucleótidos consecutivos de las secuencias de 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos). Más preferiblemente, la
sonda comprende al menos 20-30 nucleótidos
consecutivos de las secuencias de 5' EST (o ADNc o ADN genómicos
obtenibles a partir de éstos). En algunas realizaciones, la sonda
comprende más de 30 nucleótidos de las secuencias 5' EST (o ADNc o
ADN genómicos obtenibles a partir de éstos).
Preferiblemente, se utiliza una pluralidad de
sondas que tienen secuencias de genes diferentes en la técnica
alternativa de huella. El Ejemplo 50 a continuación proporciona un
procedimiento alternativo de huella representativo, en el que las
sondas se derivan de 5' EST.
Se preparan oligonucleótidos
20-meros a partir de un gran número, por ejemplo,
50, 100 ó 200 de 5' EST utilizando servicios de oligonucleótidos
disponibles en el mercado, tales como Genset, París, Francia. Las
muestras celulares de los sujetos de ensayo se procesan para
obtener ADN utilizando técnicas muy conocidas por los expertos en
la técnica. El ácido nucleico se digiere con enzimas de restricción,
tales como EcoRI y XbaI. Después de la digestión, las muestras se
aplican a pocillos para una electroforesis. El procedimiento, como
se conoce en la técnica, puede modificarse para acomodarse a una
electroforesis en poliacrilamida, sin embargo, en este ejemplo, las
muestras que contienen 5 ug de ADN se cargan en pocillos y se
separan en geles de agarosa al 0,8%. Los geles se trasladan a
nitrocelulosa utilizando técnicas de análisis de la transferencia
Southern convencionales.
Se reúnen 10 ng de cada uno de los
oligonucleótidos y se marcan en el extremo con ^{32}P. La
nitrocelulosa se prehibrida con disolución de bloqueo y se híbrida
con las sondas marcadas. Después de la hibridación y el lavado, el
filtro de nitrocelulosa se expone a una película de rayos X
X-Omat AR. El patrón de hibridación resultante será
exclusivo para cada individuo.
También se contempla en este Ejemplo que el
número de secuencias de sondas utilizado puede variarse para mayor
precisión o claridad.
Las proteínas codificadas por los ADNc
extendidos también pueden utilizarse para generar anticuerpos como
se explica en los Ejemplos 30 y 43, para identificar el tipo de
tejido o especie celular a partir del cual se deriva una muestra,
como se describe en el Ejemplo 51.
La identificación de tejidos específicos se
logra mediante la visualización de antígenos específicos de tejidos
mediante preparaciones de anticuerpos según los Ejemplos 30 y 43,
que se conjugan, directa o indirectamente, con un marcador
detectable. Las especies de anticuerpos marcados seleccionados se
unen a su pareja de unión de antígeno específica en secciones de
tejidos, suspensiones celulares, o en extractos de proteínas
solubles procedentes de una muestra de tejido para proporcionar un
patrón para la interpretación cualitativa o semicualitativa.
Los antisueros para estos procedimientos deben
tener una potencia mayor que la de la preparación nativa y, por
esta razón, los anticuerpos se concentran hasta un nivel de mg/ml
mediante aislamiento de la fracción de
gamma-globulina, por ejemplo, mediante cromatografía
de intercambio iónico, o mediante fraccionamiento en sulfato de
amonio. Además, para proporcionar los antisueros más específicos,
deben retirarse los anticuerpos no deseados, por ejemplo contra
proteínas comunes, de la fracción de
gamma-globulina, por ejemplo mediante
inmunoabsorbentes insolubles, antes de que los anticuerpos se
marquen con el marcador. Los antisueros monoclonales o heterólogos
son adecuados para cualquier procedimiento.
Anticuerpos purificados de alta valoración,
preparados como se describió anteriormente, se conjugan con un
marcador detectable, como se describe, por ejemplo, en Fudenberg,
capítulo 26, en: Basic and Clinical Immunology, 3ª ed.,
Lange, Los Altos, California, 1980, o Rose, et al., capítulo
12, en: Methods in Immunodiagnosis, 2ª ed., John Wiley and
Sons, Nueva York (1980).
Se prefiere un marcador fluorescente, como
fluoresceína o rodamina, pero los anticuerpos también pueden
marcarse con una enzima que soporta una reacción productora de
color con un sustrato, tal como peroxidasa de rábano. Pueden
añadirse marcadores al anticuerpo unido al tejido en una segunda
etapa, como se describe a continuación. Como alternativa, los
anticuerpos antitejido específicos pueden marcarse con ferritina u
otras partículas densas a electrones, y se logra la localización de
los complejos antígeno-anticuerpo acoplados a
ferritina mediante un microscopio electrónico. En otro enfoque, los
anticuerpos se marcan radiactivamente, por ejemplo, con ^{125}I,
y se detectan cubriendo la preparación tratada con anticuerpos con
emulsión fotográfica.
Las preparaciones para realizar estos
procedimientos pueden comprender anticuerpos monoclonales o
policlonales contra una única proteína o péptido identificado como
específico de un tipo de tejido, por ejemplo, tejido cerebral, o
pueden emplearse preparaciones de anticuerpos contra varios
antígenos específicos de tejidos antigénicamente diferenciados, en
paneles, independientemente o en mezclas, según se requiera.
Las secciones de tejidos y suspensiones
celulares se preparan para el examen inmunohistoquímico según
técnicas histológicas habituales. Se montan múltiples secciones de
criostato (aproximadamente 4 \mum, sin fijar) del tejido
desconocido y el control conocido, y cada portaobjetos se cubre con
diferentes diluciones de la preparación de anticuerpos. Secciones
de tejidos conocidos y desconocidos también deben tratarse con
preparaciones para proporcionar un control positivo, un control
negativo, por ejemplo, sueros preinmunes, y un control para la
tinción no específica, por ejemplo, tampón.
Las secciones tratadas se incuban en una cámara
húmeda durante 30 min a temperatura ambiente, se enjuagan, después
se lavan en tampón durante 30-45 min. El exceso de
fluido se elimina con papel secante, y el marcador se revela.
Si el anticuerpo específico de tejido no se
marcó en la primera incubación, puede marcarse en este momento en
una segunda reacción de anticuerpo-anticuerpo, por
ejemplo, añadiendo anticuerpo conjugado con fluoresceína o enzima
contra la clase de inmunoglobulinas de la especie productora de
antisuero, por ejemplo, anticuerpo marcado con fluoresceína contra
IgG de ratón. Estos sueros marcados están disponibles en el
mercado.
El antígeno descubierto en los tejidos mediante
el anterior procedimiento puede cuantificarse midiendo la
intensidad de color o fluorescencia en la sección de tejido, y
calibrando esa señal utilizando patrones apropiados.
La visualización de proteínas específicas de
tejido y la identificación de tejidos desconocidos a partir de este
procedimiento se realiza utilizando reactivos de anticuerpos
marcados y una estrategia de detección como la descrita para la
inmunohistoquímica; sin embargo, la muestra se prepara según una
técnica electroforética para distribuir las proteínas extraídas a
partir del tejido en una matriz ordenada basada en el peso molecular
para la detección.
Una muestra de tejido se homogeneiza utilizando
un aparato Virtis; las suspensiones celulares se rompen mediante
homogeneización Dounce o lisis osmótica, utilizando detergentes en
cada caso según se requiera para romper las membranas celulares,
como es la práctica en la técnica. Los componentes celulares
insolubles, tales como núcleos, microsomas y fragmentos de
membranas se retiran mediante ultracentrifugación, y la fracción que
contiene proteínas solubles se concentra, si es necesario, y se
reserva para análisis.
Una muestra de la disolución de proteínas
solubles se resuelve en especies proteicas individuales mediante
electroforesis en SDS-poliacrilamida convencional,
como se describe, por ejemplo, en Davis et al., sección
19-2, en: Basic Methods in Molecular
Biology, Leder ed., Elsevier, Nueva York, 1986, utilizando una
variedad de cantidades de poliacrilamida en un conjunto de geles
para resolver el intervalo completo de peso molecular de las
proteínas que se van a detectar en la muestra. Se ensaya un marcador
de tamaño en paralelo para estimar los pesos moleculares de las
proteínas constituyentes. Un tamaño de muestra para el análisis es
un volumen conveniente de 5 a 55 \mul, y contiene de
aproximadamente 1 a 100 \mug de proteína. Se traslada una parte
alícuota de cada una de las proteínas resueltas mediante
transferencia a un papel de filtro de nitrocelulosa, un proceso que
mantiene el patrón de resolución. Se preparan múltiples copias. El
procedimiento, conocido como análisis de la transferencia Western,
se encuentra bien descrito en Davis, L. et al., supra,
sección 19-3. Un conjunto de transferencias de
nitrocelulosa se tiñe con tinte de azul de Coomassie para visualizar
el conjunto completo de proteínas para la comparación con las
proteínas unidas a anticuerpos. El resto de los filtros de
nitrocelulosa entonces se incuban con una disolución de uno o más
antisueros específicos contra proteínas específicas de tejido
preparados como se describe en los ejemplos 30 y 43. En este
procedimiento, al igual que en el procedimiento A anterior, se
ensayan las muestras positivas y negativas y los controles de
reactivo apropiados.
En cualquiera de los procedimientos A o B, un
marcador detectable puede unirse al complejo primario de antígeno
de tejido-anticuerpo primario según diversas
estrategias y sus permutaciones. En un enfoque directo, el
anticuerpo específico primario puede marcarse; como alternativa, el
complejo no marcado puede unirse con un anticuerpo
anti-IgG secundario marcado. En otros enfoques, el
anticuerpo primario o secundario se conjuga con una molécula de
biotina que puede unir, en una etapa posterior, un marcador
conjugado con avidina. Según otra estrategia, la proteína A marcada
con enzimas o radiactiva, que tiene la propiedad de unirse con
cualquier IgG, se une en una etapa final al anticuerpo primario o
secundario.
La visualización de la unión de antígenos
específicos de tejido a niveles superiores a los observados en
tejidos control, a uno o más anticuerpos específicos de tejido,
preparados a partir de secuencias de genes identificadas a partir
de secuencias de ADNc extendidas, puede identificar tejidos de
origen desconocido, por ejemplo, muestras forenses, o tejido
tumoral diferenciado que ha metastatizado hacia otros sitios
corporales.
Además de sus aplicaciones forenses e
identificativas, los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a
partir de éstos) pueden cartografiarse en sus localizaciones
cromosómicas. El Ejemplo 52 a continuación describe el
cartografiado de híbridos por radiación (RH) de regiones
cromosómicas utilizando 5' EST. El Ejemplo 53 a continuación
describe un procedimiento representativo para cartografiar un 5' EST
en su localización en un cromosoma humano. El Ejemplo 54 a
continuación describe el cartografiado de 5' EST en cromosomas en
metafase mediante hibridación in situ de fluorescencia
(FISH). Los expertos en la técnica apreciarán que el método de los
Ejemplos 52-54 también puede utilizarse para
cartografiar ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de los 5' EST
en sus localizaciones cromosómicas.
Un cartografiado de híbridos con radiación (RH)
es un enfoque genético de células somáticas que puede utilizarse
para el cartografiado de alta resolución del genoma humano. En este
enfoque, las líneas celulares que contienen uno o más cromosomas
humanos se irradian letalmente, rompiendo cada cromosoma en
fragmentos cuyo tamaño depende de la dosis de radiación. Estos
fragmentos se rescatan mediante fusión con células de roedor
cultivadas, produciendo subclones que contienen porciones
diferentes del genoma humano. Esta técnica se describe en Benham
et al., Genomics, 4: 509-517, 1989; y
Cox et al., Science, 250: 245-250,
1990. La naturaleza aleatoria e independiente de los subclones
permite un cartografiado eficaz de cualquier marcador del genoma
humano. El ADN humano aislado a partir de un panel de
80-100 líneas celulares proporciona un reactivo de
cartografiado para ordenar los 5' EST. En este enfoque, la
frecuencia de ruptura entre los marcadores se utiliza para medir la
distancia, permitiendo la construcción de mapas de resolución
finos, como se ha hecho utilizando EST convencionales (Schuler et
al., Science, 274: 540-546, 1996).
El cartografiado de RH se ha utilizado para
generar un mapa de híbridos por radiación del genoma completo de
alta resolución del cromosoma humano 17q22-a25.3 a
lo largo de los genes para la hormona del crecimiento (GH) y la
timidina quinasa (TK) (Foster et al., Genomics, 33:
185-192, 1996), la región que rodea el gen del
síndrome de Gorlin (Obermayr et al., Eur. J. Hum. Genet.,
4: 242-245, 1996), 60 loci que cubren el
brazo corto completo del cromosoma 12 (Raeymaekers et al.,
Genomics, 29: 170-178, 1995), la región
del cromosoma humano 22 que contiene el locus de la
neurofibromatosis de tipo 2 (Frazer et al., Genomics,
14: 574-584, 1992) y 13 loci sobre el brazo
largo del cromosoma 5 (Warrington et al., Genomics,
11: 701-708, 1991).
Los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a
partir de éstos) pueden asignarse a cromosomas humanos utilizando
metodologías basadas en PCR. En estos enfoques, se diseñan parejas
de cebadores de oligonucleótidos a partir de los 5' EST (o ADNc o
ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) para minimizar la
probabilidad de amplificar a través de un intrón. Preferiblemente,
los cebadores de oligonucleótidos tienen una longitud de
18-23 pb y se diseñan para la amplificación por
PCR. La creación de cebadores de PCR a partir de secuencias
conocidas es muy conocida por los expertos en la técnica. Para un
informe acerca de la tecnología de PCR, véase Erlich en PCR
Technology, Principles and Applications for DNA Amplification,
Freeman and Co., Nueva York, 1992.
Los cebadores se utilizan en reacciones en
cadena de polimerasa (PCR) para amplificar moldes a partir del ADN
genómico humano completo. Las condiciones de PCR son como sigue: se
usan 60 ng de ADN genómico como molde para PCR con 80 ng de cada
cebador de oligonucleótido, 0,6 unidades de Taq polimerasa, y 1
\muCu de una desoxicitidina trifosfato marcada con ^{32}P. La
PCR se realiza en un termociclador de microplacas (Techne) con las
siguientes condiciones: 30 ciclos de 94ºC, 1,4 min; 55ºC, 2 min; y
72ºC, 2 min; con una extensión final a 72ºC durante 10 min. Los
productos amplificados se analizan en un gel de secuenciación de
poliacrilamida al 6% y se visualizan mediante autorradiografía. Si
la longitud del producto PCR resultante es idéntica a la distancia
entre los extremos de las secuencias de los cebadores en el ADNc
extendido a partir del cual derivan los cebadores, entonces la
reacción de PCR se repite con moldes de ADN procedentes de dos
paneles de híbridos de células somáticas de
humano-roedor, ADN BIOS PCRable (BIOS Corporation) y
panel nº 1 de cartografiado de híbridos de células somáticas de
humano-roedor NIGMS (NIGMS, Camden, NJ).
Se utiliza PCR para seleccionar una serie de
líneas celulares de híbridos de células somáticas que contienen
conjuntos definidos de cromosomas humanos para detectar la presencia
de un 5' EST concreto (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de
éste). El ADN se aisla a partir de los híbridos somáticos y se
utiliza como molde de partida para reacciones de PCR utilizando las
parejas de cebadores de los 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible
a partir de éste). Sólo aquellos híbridos de células somáticas con
cromosomas que contienen el gen humano correspondiente al 5' EST (o
ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste) producirá un
fragmento amplificado. El 5 ' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible
a partir de éste) se asigna a un cromosoma mediante análisis del
patrón de segregación de los productos de PCR a partir de los moldes
de ADN de híbridos somáticos. El único cromosoma humano presente en
todos los híbridos celulares que produce un fragmento amplificado es
el cromosoma que contiene ese 5' EST (o ADNc o ADN genómico
obtenible a partir de éste). Para un informe acerca de las técnicas
y análisis de los resultados de experimentos de cartografiado de
genes de células somáticas, véase Ledbetter et al., Genomics,
6: 475-481, 1990.
La hibridación in situ de fluorescencia
permite cartografiar el 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a
partir de éste) en un localización particular sobre un cromosoma
concreto. Los cromosomas que se utilizan para las técnicas de
hibridación in situ de fluorescencia pueden obtenerse a
partir de una diversidad de fuentes, incluyendo cultivos celulares,
tejidos o sangre completa.
En una realización preferida, la localización
cromosómica de un 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir
de éste) se obtiene mediante FISH, como se describe en Cherif et
al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
6639-6643, 1990). Los cromosomas en metafase se
preparan a partir de donantes de células sanguíneas estimuladas con
fitohemaglutinina (PHA). Los linfocitos estimulados con PHA de
hombres sanos se cultivan durante 72 h en medio
RPMI-1640. Para la sincronización se añade
metotrexato (10 \muM) durante 17 h, seguido de la adición de
5-bromodesoxiuridina (5-BrdU, 0,1
mM) durante 6 h. Se añade colcemida (1 \mug/ml) durante los
últimos 15 min antes de recolectar las células. Las células se
recolectan, se lavan en RPMI, se incuban con una disolución
hipotónica de KCl (75 mM) a 37ºC durante 15 min, y se fijan en tres
cambios de metanol:ácido acético (3:1). La suspensión celular se
rocia sobre un portaobjetos de vidrio y se seca al aire. El 5' EST
(o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste) se marca con
biotina-16 dUTP mediante traducción de mellas según
las instrucciones del fabricante (Bethesda Research Laboratories,
Bethesda, MD), se purifica utilizando una columna Sephadex
G-50 (Pharmacia, Upsala, Suecia) y se precipita.
Justo antes de la hibridación, el sedimento de ADN se disuelve en
tampón de hibridación (formamida al 50%, 2 x SSC, sulfato de
dextrano al 10%, 1 mg/ml de ADN de esperma de salmón sonicado, pH
7), y la sonda se desnaturaliza a 70ºC durante 5-10
min.
Los portaobjetos mantenidos a -20ºC se tratan
durante 1 h a 37ºC con RNasa A (100 \mug/ml), se enjuagan tres
veces en 2 x SSC, y se deshidratan en una serie de etanol. Las
preparaciones de cromosomas se desnaturalizan en formamida al 70%,
2 x SSC durante 2 min a 70ºC, después se deshidrata a 4ºC. Los
portaobjetos se tratan con proteinasa K (10 \mug/100 ml en
Tris-HCl 20 mM, CaCl_{2} 2 mM) a 37ºC durante 8
min y se deshidratan. La mezcla de hibridación que contiene la
sonda se coloca sobre el portaobjetos, se cubre con un cubreobjetos,
se sella con un cemento de goma y se incuba durante la noche en una
cámara húmera a 37ºC. Después de los lavados de hibridación y
poshibridación, la sonda biotinilada se detecta mediante
avidina-FTCC y se amplifica con más capas de
antiavidina de cabra biotinilada y avidina-FTCC.
Para la localización cromosómica, se obtienen bandas R
fluorescentes como se ha descrito previamente (Cherif et al.,
supra). Los portaobjetos se observan bajo un microscopio de
fluorescencia LEICA (DMRXA). Los cromosomas se contratiñen con
yoduro de propidio y la señal de fluorescencia de la sonda aparece
como dos manchas de color amarillo-verde simétricas
en ambas cromátidas del cromosoma de banda R fluorescente (rojo).
Por tanto, un 5' EST concreto (o ADNc o ADN genómico obtenible a
partir de éste) puede localizarse en una banda R citogenética
concreta sobre un cromosoma dado.
Cuando el 5' EST (o ADNc o ADN genómico
obtenible a partir de éste) se ha asignado a un cromosoma concreto
utilizando las técnicas descritas en los Ejemplos
52-54 anteriores, se puede utilizar para construir
un mapa de los cromosomas de alta resolución sobre los cuales se
localiza, o para identificar los cromosomas en una muestra.
El cartografiado de cromosomas implica asignar
una secuencia exclusiva concreta a un cromosoma particular, como se
describió anteriormente. Cuando la secuencia exclusiva se ha
cartografiado en un cromosoma dado, se ordena con relación a otras
secuencias exclusivas localizadas en el mismo cromosoma. Un enfoque
para el cartografiado de cromosomas utiliza una serie de cromosomas
artificiales de levaduras (YAC) que portan varios miles de insertos
largos derivados de los cromosomas del organismo a partir del cual
se obtienen los ADNc extendidos (o ADN genómicos obtenibles a
partir de éstos). Este enfoque se describe en Nagaraja et al.,
Genome Research, 7: 210-222, 1997.
Brevemente, en este enfoque cada cromosoma se rompe en trozos
solapantes que se insertan en el vector YAC. Los insertos de YAC se
seleccionan utilizando PCR u otros métodos para determinar si
incluyen el 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de
éste) cuya posición se va a determinar. Cuando se encuentra un
inserto que incluye el 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a
partir de éste), el inserto puede analizarse mediante PCR u otros
métodos para determinar si el inserto contiene también otras
secuencias que se sabe que están sobre el cromosoma o en la región
de la cual deriva el 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a
partir de éste). Este proceso puede repetirse para cada inserto en
el banco de YAC para determinar la localización de cada uno de los
ADNc extendidos (o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) en
relación con cada uno y con otros marcadores cromosómicos
conocidos. De esta manera, puede obtenerse un mapa de alta
resolución de la distribución de numerosos marcadores exclusivos a
lo largo de cada uno de los cromosomas del organismo.
Como se describe en el Ejemplo 56, a
continuación, los ADNc extendidos (o ADN genómicos obtenibles a
partir de éstos) también pueden utilizarse para identificar genes
asociados con un fenotipo particular, tal como una enfermedad
hereditaria o la respuesta a un fármaco.
Este Ejemplo ilustra un enfoque útil para la
asociación de 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de
éstos) con características fenotípicas particulares. En este
Ejemplo, un 5' EST particular (o ADNc o ADN genómico obtenible a
partir de éste) se usa como una sonda de ensayo para asociar ese 5'
EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste) con una
característica fenotípica particular.
Los 5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a
partir de éstos) se cartografían para una localización particular
sobre un cromosoma humano utilizando técnicas tales como las
descritas en los Ejemplos 52 y 53, u otras técnicas conocidas en la
técnica. Una búsqueda de la herencia mendeliana en el ser humano
(disponible en Mendelian Inheritance in Man (disponible en
línea a través de Johns Hopkins University Welch Medical Library))
revela que la región del cromosoma humano que contiene el 5' EST (o
ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste) es una región muy
rica en genes que contiene varios genes conocidos y varias
enfermedades o fenotipos para los cuales no se han identificado los
genes. El gen correspondiente a este 5' EST (o ADNc o ADN genómico
obtenible a partir de éste), por tanto, se transforma en un
candidato inmediato para cada una de estas enfermedades
genéticas.
Se aislan y expanden en cultivo células
procedentes de pacientes con estas enfermedades o fenotipos. Se
utilizan cebadores de PCR procedentes del 5' EST (o ADNc o ADN
genómico obtenible a partir de éste) para seleccionar ADN genómico,
ARNm o ADNc obtenido de los pacientes. Los 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos) que no se amplifican en los
pacientes pueden asociarse de forma positiva con una enfermedad
particular mediante posteriores análisis. Como alternativa, el
análisis de PCR puede producir fragmentos de longitudes diferentes
cuando las muestras se derivan de un individuo que tiene el fenotipo
asociado con la enfermedad, que cuando las muestras se derivan de
un individuo sano, indicando que el gen que contiene el 5' EST puede
ser responsable de la enfermedad genética.
Los presentes 5' EST (o ADNc o ADN genómicos
obtenibles a partir de éstos) también pueden utilizarse para
construir vectores de secreción capaces de dirigir la secreción de
las proteínas codificadas por los genes en su interior. Estos
vectores de secreción pueden facilitar la purificación o
enriquecimiento de las proteínas codificadas por genes insertados
en ellos mediante la reducción del número de proteínas de fondo a
partir de las cuales la proteína deseada debe purificarse o
enriquecerse. En el Ejemplo 57, a continuación, se describen
ejemplos de vectores de secreción.
Los vectores de secreción incluyen un promotor
capaz de dirigir la expresión de genes en la célula, tejido u
organismo hospedante de interés. Estos promotores incluyen el
promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de SV40, el
promotor del citomegalovirus humano, y otros promotores familiares
para los expertos en la técnica.
Una secuencia señal de un 5' EST (o ADNc o ADN
genómico obtenible a partir de éste) se conecta operablemente con
el promotor, de forma que el ARNm transcrito a partir del promotor
dirige la traducción del péptido señal. La célula, tejido u
organismo hospedante puede ser cualquier célula, tejido u organismo
que reconoce el péptido señal codificado por la secuencia señal en
el 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste). Los
hospedantes adecuados incluyen células, tejidos u organismos
mamíferos, células, tejidos u organismos aviares, células, tejidos u
organismos insectos, o levaduras.
Además, el vector de secreción contiene sitios
de clonación para insertar genes que codifican las proteínas que se
van a segregar. Los sitios de clonación facilitan la clonación del
gen inserto dentro de marco con la secuencia señal, de forma que
una proteína de fusión en la que el péptido señal está fusionado con
la proteína codificada por el gen insertado se expresa a partir del
ARNm transcrito a partir del promotor. El péptido señal dirige la
secreción extracelular de la proteína de fusión.
El vector de secreción puede ser ADN o ARN, y
puede integrarse en el cromosoma del hospedante para ser mantenido,
de manera estable, como un replicón extracromosómico en el
hospedante, para ser un cromosoma artificial, o para estar presente
de forma transitoria en el hospedante. Muchos esqueletos de ácidos
nucleicos adecuados para su uso como vectores de secreción son
conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo vectores
retrovíricos, vectores de SV40, vectores del virus del papiloma
bovino, plásmidos de integración en levaduras, plásmidos episómicos
de levaduras, cromosomas artificiales de levaduras, cromosomas
artificiales humanos, vectores de elemento P, vectores de
baculovirus, o plásmidos bacterianos capaces de ser introducidos de
forma transitoria en el hospedante.
El vector de secreción también puede contener
una señal de poliA, de forma que la señal de poliA se localiza
cadena abajo del gen insertado en el vector de secreción.
Después de que el gen que codifica la proteína
de la cual se desea la secreción se inserta en el vector de
secreción, el vector de secreción se introduce en la célula, tejido
u organismo hospedante utilizando precipitación con fosfato de
calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección
mediada por liposomas, partículas víricas o como ADN desnudo. La
proteína codificada por el gen insertado entonces se purifica o
enriquece a partir del sobrenadante utilizando técnicas
convencionales, tales como precipitación con sulfato de amonio,
inmunoprecipitación, inmunocromatografía, cromatografía de
exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico, y HPLC.
Como alternativa, la proteína segregada puede estar en un estado
suficientemente enriquecido o puro en el sobrenadante o medio de
crecimiento del hospedante para permitir que pueda utilizarse para
su fin previsto sin más enriquecimiento.
Las secuencias señal también pueden insertarse
en vectores diseñados para terapia génica. En estos vectores, la
secuencia señal está operablemente conectada con un promotor, de
forma que el ARNm transcrito a partir del promotor codifica el
péptido señal. Un sitio de clonación se localiza cadena abajo de la
secuencia señal, de forma que un gen que codifica una proteína cuya
secreción se desea puede insertarse con facilidad en el vector y
fusionarse con la secuencia señal. El vector se introduce en una
célula hospedante apropiada. La proteína expresada a partir del
promotor se segrega extracelularmente, produciendo, con ello, un
efecto terapéutico.
Los 5' EST también pueden utilizarse para clonar
secuencias localizadas cadena arriba de los 5' EST que son capaces
de regular la expresión génica, incluyendo secuencias de promotores,
secuencias de potenciadores y otras secuencias cadena arriba que
influyen en los niveles de transcripción o traducción. Una vez
identificadas y clonadas, estas secuencias reguladores cadena
arriba pueden usarse en vectores de expresión diseñados para
dirigir la expresión de un gen insertado de una manera espacial,
temporal, de desarrollo o cuantitativa deseada. El ejemplo 58
describe un método para clonar secuencias cadena arriba de los ADNc
extendidos o 5' EST.
Las secuencias derivadas de ADNc extendidos o 5'
EST pueden usarse para aislar los promotores de los correspondientes
genes utilizando técnicas de paseo cromosómico. En una técnica de
paseo cromosómico, que utiliza el kit GenomeWalker^{TM}
disponible en Clontech, cinco muestras de ADN genómico completo se
digieren cada una con una enzima de restricción diferente que tiene
un sitio de reconocimiento de 6 bases y deja un extremo romo.
Después de la digestión, los adaptadores de oligonucleótidos se
ligan a cada extremo de los fragmentos de ADN genómico
resultantes.
Para cada uno de los cinco bancos de ADN
genómico se realiza una primera reacción de PCR según las
intrucciones del fabricante, utilizando un cebador adaptador
externo proporcionado en el kit y un cebador expecífico de gen
externo. El cebador específico de gen debe seleccionarse para que
sea específico para el ADNc extendido o 5' EST de interés, y debe
tener una temperatura de fusión, longitud y localización en el ADNc
extendido o 5' EST que sea coherente con su uso en las reacciones
de PCR. Cada primera reacción de PCR contiene 5 ng de ADN genómico,
5 \mul de 10 x tampón de reacción Tth, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2
\muM de cada cebador adaptador externo y cebador específico de
gen externo, 1,1 mM de Mg(OAc)_{2}, y 1 \mul de la
mezcla 50 x polimerasa Tth en un volumen total de 50 \mul. El
ciclo de reacción para la primera reacción de PCR es como sigue: 1
min - 94ºC/2 seg - 94ºC, 3 min - 72ºC (7 ciclos)/2 seg - 94ºC, 3 min
- 67ºC (32 ciclos)/5 min - 67ºC.
El producto de la primera reacción de PCR se
diluye y se utiliza como molde para una segunda reacción de PCR
según las instrucciones del fabricante utilizando una pareja de
cebadores anidados que se localizan internamente en el amplicón
resultante de la primera reacción de PCR. Por ejemplo, 5 \mul del
producto de reacción de la primera mezcla de reacción de PCR puede
diluirse 180 veces. Las reacciones se realizan en un volumen de 50
\mul que tiene una composición idéntica a la de la primera
reacción de PCR, excepto que se utilizan los cebadores anidados. El
primer cebador anidado es específico para el adaptador, y se
proporciona en el kit GenomeWalker^{TM}. El segundo cebador
anidado es específico del ADNc extendido o 5' EST particular para
el cual debe clonarse el promotor, y debe tener una temperatura de
fusión, longitud y localización en el ADNc extendido o 5' EST que
sea coherente con su uso en las reacciones de PCR. Los parámetros de
reacción de la segunda reacción de PCR son los siguientes: 1 min -
94ºC/2 seg - 94ºC, 3 min - 72ºC (6 ciclos)/2 seg - 94ºC, 3 min -
67ºC (25 ciclos)/5 min - 67ºC. El producto de la segunda reacción de
PCR se purifica, se clona y se secuencia utilizando técnicas
convencionales.
Como alternativa, pueden construirse dos o más
bancos de ADN genómico humano utilizando dos o más enzimas de
restricción. El ADN genómico digerido se clona en vectores que
pueden convertirse en ADN monocatenario, circular o lineal. Un
oligonucleótido biotinilado que comprende al menos 15 nucleótidos de
la secuencia del ADNc extendido o 5' EST se híbrida con el ADN
monocatenario. Los híbridos entre el oligonucleótido biotinilado y
el ADN monocatenario que contiene la secuencia del ADNc extendido o
5' EST se aislan como se describió en el Ejemplo 29 anterior.
Después, el ADN monocatenario que contiene la secuencia del ADNc
extendido o 5' EST se libera de las esferas y se convierte en ADN
bicatenario utilizando un cebador específico para la secuencia del
ADNc extendido o 5' EST, o un cebador que corresponde a una
secuencia incluida en el vector de clonación. El ADN bicatenario
resultante se transforma en bacterias. Los ADN que contienen las
secuencias de 5' EST o ADNc extendido se identifican mediante PCR
de colonias o hibridación de colonias.
Cuando las secuencias genómicas cadena arriba se
han clonado y secuenciado como se describió anteriormente, pueden
identificarse presuntos promotores y sitios de inicio de la
transcripción dentro de las secuencias cadena arriba, comparando
las secuencias cadena arriba de los ADNc extendidos o 5' EST con
bases de datos que contienen sitios de inicio de la transcripción,
sitios de unión del factor de transcripción o secuencias promotoras
conocidos.
Además, los promotores en las secuencias cadena
arriba pueden identificarse utilizando vectores indicadores de
promotores como se describe en el Ejemplo.
Las secuencias genómicas cadena arriba de los
ADNc extendidos o 5' EST se clonan en un vector indicador de
promotores adecuado, tal como los vectores indicadores de promotores
pSEAP-Basic, pSEAP-Enhancer,
p\betagal-Basic,
p\betagal-Enhancer o pEGFP-1,
disponibles en Clontech. Brevemente, cada uno de estos vectores
indicadores de promotores incluyen múltiples sitios de clonación
colocados cadena arriba de un gen indicador que codifica una
proteína fácilmente ensayable, tal como fosfatasa alcalina
segregada, \beta-galactosidasa, o proteína
fluorescente verde. Las secuencias cadena arriba de los ADNc
extendidos o 5' EST se insertan en los sitios de clonación cadena
arriba del gen indicador en ambas orientaciones y se introducen en
una célula hospedante adecuada. Se ensaya el nivel de proteína
indicadora y se compara con el nivel obtenido a partir de un vector
que carece de un inserto en el sitio de clonación. La presencia de
un nivel de expresión elevado en el vector que contiene el inserto,
con respecto al vector control, indica la presencia de un promotor
en el inserto. Si fuera necesario, las secuencias cadena arriba
pueden clonarse en vectores que contienen un potenciador para
aumentar los niveles de transcripción de secuencias promotoras
débiles. Un nivel significativo de expresión por encima de la
observada cuando el vector carece de un inserto indica que una
secuencia promotora está presente en la secuencia insertada cadena
arriba.
Las células hospedantes apropiadas para los
vectores indicadores de promotores pueden elegirse basándose en los
resultados de la determinación, descrita anteriormente, de los
patrones de expresión de los ADNc extendidos o 5' EST. Por ejemplo,
si el análisis de patrón de expresión indica que el ARNm
correspondiente a un ADNc extendido o 5' EST particular se expresa
en fibroblastos, el vector indicador de promotores puede
introducirse en una línea celular de fibroblastos humanos.
Las secuencias promotoras dentro del ADN
genómico cadena arriba pueden definirse aún más construyendo
deleciones anidadas en el ADN cadena arriba utilizando técnicas
convencionales, tales como una digestión con exonucleasas III. Los
fragmentos de deleción resultantes pueden insertarse en el vector
indicador de promotores para determinar si la deleción ha reducido
o eliminado la actividad promotora. De esta manera pueden definirse
los límites de los promotores. Si se desea, pueden identificarse
sitios reguladores individuales potenciales dentro del promotor
utilizando mutágenesis dirigida específica de sitio o barrido de
conectores para eliminar los sitios de unión del factor de
transcripción potenciales dentro del promotor, de forma individual o
en combinación. Los efectos de estas mutaciones sobre los niveles
de transcripción pueden determinarse insertando mutaciones en los
sitios de clonación en los vectores indicadores de promotores.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando el método descrito en el Ejemplo 58
anterior con 5' EST, se obtienen secuencias cadena arriba de varios
genes. Utilizando la pareja de cebadores GGG AAG ATG GAG ATA GTA TTG
CCT G (SEQ ID NO:29) y CTG CCA TGT ACA TGA TAG AGA GAT TC (SEQ ID
NO:30), se obtiene el promotor que tiene la denominación interna
P13H2 (SEQ ID NO:31).
Utilizando la pareja de cebadores GTA CCA GGG
ACT GTG ACC ATT GC (SEQ ID NO:32) y CTG TGA CCA TTG CTC CCA AGA GAG
(SEQ ID NO:33), se obtiene el promotor que tiene la denominación
interna P15B4 (SEQ ID NO:34).
Utilizando la pareja de cebadores CTG GGA TGG
AAG GCA CGG TA (SEQ ID NO:35) y GAG ACC ACA CAG CTA GAC AA (SEQ ID
NO:36), se obtiene el promotor que tiene la denominación interna
P29B6 (SEQ ID NO:37).
La Figura 4 proporciona una descripción
esquemática de los promotores aislados, y de la manera en que son
ensamblados con los correspondientes marcadores 5'. Las secuencias
cadena arriba se seleccionaron para la presencia de motivos
parecidos a sitios de unión del factor de transcripción, o sitios de
inicio de la transcripción conocidos, utilizando el programa de
ordenador MatInspector, descarga 2.0, Agosto 1996.
La Tabla VII describe los sitios de unión del
factor de transcripción presentes en cada uno de estos promotores.
Las columnas indicadas como "matriz" proporcionan el nombre de
la matriz MatInspector utilizada. La columna indicada como
"posición" proporciona la posición 5' del sitio del promotor.
La numeración de la secuencia comienza desde el sitio de
transcripción, según se determina emparejando las secuencias
genómicas con la secuencia del 5' EST. La columna indicada como
"orientación" indica la hebra de ADN sobre el cual se encuentra
el sitio, siendo la hebra + la secuencia codificadora, según se
determina emparejando la secuencia genómica con la secuencia del 5'
EST. La columna indicada como "puntuación" proporciona la
puntuación MatInspector encontrada en ese sitio. La columna
indicada como "longitud" proporciona la longitud del sitio en
nucleótidos. La columna indicada como "secuencia" proporciona
la secuencia del sitio encontrado.
Los clones bacterianos que contienen plásmidos
que contienen las secuencias promotoras descritas anteriormente se
conservan, en la actualidad, en los laboratorios de los inventores
con los números de identificación internos proporcionados
anteriormente. Los insertos pueden recuperarse a partir del material
depositado cultivando una parte alícuota del clon bacteriano
apropiado en el medio apropiado. El ADN del plásmido entonces puede
aislarse utilizando procedimientos de aislamiento de plásmidos
familiares para los expertos en la técnica, tales como
procedimientos de aislamiento de plásmidos de minipreps de lisis
alcalina o de lisis alcalina a gran escala. Si se desea, el ADN del
plásmido puede enriquecerse aún más mediante centrifugación sobre un
gradiente de cloruro de cesio, cromatografía de exclusión
molecular, o cromatografía de intercambio aniónico. El ADN del
plásmido obtenido utilizando estos procedimientos entonces puede
manipularse utilizando técnicas de clonación convencionales
familiares para los expertos en la técnica. Como alternativa, puede
realizarse una PCR con cebadores diseñados en ambos extremos de la
inserción de EST. El producto de PCR que corresponde a los 5' EST
entonces puede manipularse utilizando técnicas de clonación
convencionales familiares para los expertos en la técnica.
Los promotores y otras secuencias reguladoras
localizadas cadena arriba de los ADNc extendidos o 5' EST pueden
utilizarse para diseñar vectores de expresión capaces de dirigir la
expresión de un gen insertado de una manera espacial, temporal, de
desarrollo y cuantitativa deseada. Un promotor capaz de dirigir los
patrones espaciales, temporales, de desarrollo y cuantitativos
deseados puede seleccionarse utilizando los resultados de los
análisis de expresión descritos en el Ejemplo 26, anterior. Por
ejemplo, si se desea un promotor que confiere un alto nivel de
expresión en el músculo, la secuencia promotora cadena arriba de un
ADNc extendido o 5' EST derivado de un ARNm que se expresa con un
nivel elevado en el músculo, según se determina mediante el método
del Ejemplo 26, puede emplearse en el vector de expresión.
Preferiblemente, el promotor deseado se coloca
cerca de múltiples sitios de restricción para facilitar la
clonación del inserto deseado cadena abajo del promotor, de forma
que el promotor sea capaz de dirigir la expresión del gen
insertado. El promotor puede insertarse en esqueletos de ácidos
nucleicos convencionales diseñados para la replicación
extracromosómica, la integración en los cromosomas hospedantes, o la
expresión transitoria. Los esqueletos adecuados para los presentes
vectores de expresión incluyen esqueletos retrovíricos, esqueletos
de episomas eucariotas, tales como SV40 o virus del papiloma bovino,
esqueletos de episomas bacterianos, o cromosomas artificiales.
Preferiblemente, los vectores de expresión
también incluyen una señal de poliA cadena abajo de los múltiples
sitios de restricción para dirigir la poliadenilación del ARNm
transcrito a partir del gen insertado en el vector de expresión.
Después de la identificación de las secuencias
promotoras utilizando los procedimientos de los ejemplo
58-60, pueden identificarse proteínas que
interaccionan con el promotor, como se describe en el Ejemplo 61, a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las secuencias dentro de la región promotora que
es probable que se unan a factores de transcripción pueden
identificarse mediante homología con sitios de unión de factores de
transcripción conocidos, o mediante mutagénesis convencional o
análisis de deleción de plásmidos indicadores que contienen la
secuencia promotora. Por ejemplo, pueden realizarse deleciones en
un plásmido indicador que contiene la secuencia promotora de interés
conectada operablemente con un gen indicador ensayable. Los
plásmidos indicadores que portan diversas deleciones dentro de la
región promotora se transfectan en una célula hospedante adecuada, y
se evalúan los efectos de las deleciones sobre los niveles de
expresión. Los sitios de unión del factor de transcripción dentro de
las regiones en las que las deleciones reducen los niveles de
expresión pueden localizarse con más precisión utilizando
mutagénesis dirigida específica de sitio, análisis de barrido de
conectores u otras técnicas familiares para los expertos en la
técnica.
Los ácidos nucleicos que codifican proteínas que
interaccionan con secuencias en el promotor pueden identificarse
utilizando sistemas de un híbrido, tales como los descritos en el
manual que acompaña el kit Matchmaker One-Hybrid
System, disponible en Clontech (nº de catálogo
K1603-1). Brevemente, el sistema Matchmaker
One-Hybrid se utiliza como sigue. La secuencia
diana para la cual se desean identificar las proteínas de unión se
clona cadena arriba de un gen indicador seleccionable, y se integra
en el genoma de levaduras. Preferiblemente, se insertan múltiples
copias de las secuencias diana en el plásmido indicador en tándem.
Un banco formado por fusiones entre los ADNc que se van a evaluar
por su capacidad para unirse al promotor y el dominio de activación
de un factor de transcripción de levaduras, tal como GAL4, se
transforma en la cepa de levaduras que contiene la secuencia
indicadora integrada. Las levaduras se cultivan en placa en medios
selectivos para seleccionar células que expresan el marcador
seleccionable conectado a la secuencia promotora. Las colonias que
crecen en los medios selectivos contienen genes que codifican
proteínas que se unen a la secuencia diana. Los insertos en los
genes que codifican las proteínas de fusión se caracterizan más a
fondo mediante secuenciación. Además, los insertos pueden
insertarse en vectores de expresión o en vectores de transcripción
in vitro. La unión de los polipéptidos codificados por los
insertos en el ADN del promotor puede confirmarse mediante técnicas
familiares para los expertos en la técnica, tal como análisis de
desplazamiento en gel o análisis de protección de ADNasa.
También se describe en la presente el uso de 5'
EST (o ADNc o ADN genómico obtenibles a partir de éstos) en
estrategias de terapia génica, incluyendo estrategias antisentido y
de triple hélice, como se describe en los Ejemplos 62 y 63, a
continuación. En los enfoques antisentido, secuencias de ácidos
nucleicos complementarias con un ARNm se hibridan con el ARNm
intracelularmente, bloqueando, con ello, la expresión de la proteína
codificada por el ARNm. Las secuencias antisentido pueden evitar la
expresión génica mediante una diversidad de mecanismos. Por
ejemplo, las secuencias antisentido pueden inhibir la capacidad de
los ribosomas para traducir el ARNm. Como alternativa, las
secuencias antisentido pueden bloquear el transporte del ARNm desde
el núcleo al citoplasma, limitando, con ello, la cantidad de ARNm
disponible para la traducción. Otro mecanismo mediante el cual
dichas secuencias antisentido pueden inhibir la expresión de genes
es interfiriendo con la ruptura del ARNm. En otra estrategia, el
ácido nucleico antisentido puede incorporarse en una ribozima capaz
de romper específicamente el ARNm diana.
Las moléculas de ácidos nucleicos antisentido
para ser utilizadas en la terapia génica pueden ser secuencias de
ADN o ARN. Pueden comprender una secuencia complementaria con la
secuencia del 5' EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de
éste). Los ácidos nucleicos antisentido deben tener una longitud y
temperatura de fusión suficientes para permitir la formación de un
dúplex intracelular con suficiente estabilidad para inhibir la
expresión del ARNm en el dúplex. Las estrategias para diseñar ácidos
nucleicos antisentido adecuados para su uso en terapia génica se
describen en Green et al., Ann. Rev. Biochem., 55:
569-597, 1986; e Izant y Weintraub, Cell,
36: 1007-1015, 1984.
En algunas estrategias, se obtienen moléculas
antisentido a partir de una secuencia de nucleótidos que codifica
una proteína invirtiendo la orientación de la región codificadora
con respecto a un promotor, de forma que se transcribe la hebra
opuesta de la que se transcribe normalmente en la célula. Las
moléculas antisentido pueden transcribirse utilizando sistemas de
transcripción in vitro, tales como aquellos que emplean
polimerasa T7 o SP6, para generar el transcripto. Otro enfoque
implica la transcripción de los ácidos nucleicos antisentido in
vivo conectando operablemente ADN que contiene la secuencia
antisentido, con un promotor en un vector de expresión.
Como alternativa, pueden sintetizarse in
vitro oligonucleótidos que son complementarios con la hebra que
normalmente se transcribe en la célula. Así, los ácidos nucleicos
antisentido son complementarios con el correspondiente ARNm, y son
capaces de hibridarse con el ARNm para crear un dúplex. En algunas
realizaciones, las secuencias antisentido pueden contener
esqueletos de azúcar fosfato modificados para aumentar la
estabilidad y hacerlas menos sensibles a la actividad ARNasa. Los
ejemplos de modificaciones adecuadas para su uso en las estrategias
antisentido se describen en Rossi et al.., Pharmacol. Ther.,
50(2): 245-254, 1991.
Pueden utilizarse diversos tipos de
oligonucleótidos antisentido complementarios con la secuencia del 5'
EST (o ADNc o ADN genómico obtenible a partir de éste). En una
realización preferida, se utilizan los oligonucleótidos antisentido
estables y semiestables descritos en la Solicitud de Patente
Internacional nº PCT WO94/23026. En estas moléculas, el extremo 3',
o ambos extremos 3' y 5', están implicados en enlaces de hidrógeno
intramoleculares entre pares de bases complementarias. Estas
moléculas son más capaces de aguantar los ataques de exonucleasas,
y muestran mayor estabilidad comparadas con oligonucleótidos
antisentido convencionales.
En otra realización preferida, se utilizan los
oligodesoxinucleótidos antisentido contra el virus del Herpes
simplex de tipo 1 y 2 descritos en la Solicitud de Patente
Internacional nº WO 95/04141.
En otra realización preferida, se utilizan los
oligonucleótidos antisentido covalentamente entrelazados descritos
en la Solicitud de Patente Internacional nº WO 96/31523. Estos
oligonucleótidos bicatenarios o monocatenarios comprenden uno o
más, respectivamente, enlaces entrelazados covalentes inter- o
intraoligonucleótido, en los que el enlace consiste en un enlace
amida entre un grupo amina primario de una hebra y un grupo
carboxilo de la otra hebra o de la misma hebra, respectivamente,
estando el grupo amina primario directamente sustituido en la
posición 2' del anillo de monosacárido del nucleótido de la hebra, y
estando portado el grupo carboxilo por un grupo espaciador
alifático sustituido en un nucleótido o análogo de nucleótido de la
otra hebra o de la misma hebra, respectivamente.
También pueden utilizarse los
oligodesoxinucleótidos y oligonucleótidos antisentido descritos en
la Solicitud de Patente Internacional nº WO 92/18522. Estas
moléculas son estables frente a la degradación, y contienen al
menos una secuencia de reconocimiento de control de la transcripción
que se une a proteínas control, y son eficaces como reclamo para
éstas. Estas moléculas pueden contener estructuras de
"horquilla", estructuras de tipo "dumbbell" (de dos
horquillas), estructuras de tipo "dumbbell modificadas",
estructuras de reclamo "entrecruzadas", y estructuras de
"bucle".
En otra realización preferida, se utilizan los
oligonucleótidos bicatenarios cíclicos descritos en la Solicitud de
Patente Europea nº 0572287 A2. Estos oligonucleótidos
"dumbbell" ligados contienen un sitio de unión para un factor
de transcripción e inhiben la expresión del gen bajo el control del
factor de transcripción secuestrando el factor.
También se contempla el uso de los
oligonucleótidos antisentido cerrados descrito en la Solicitud de
Patente Internacional nº WO 92/19732. Debido a que estas moléculas
no tienen extremos libres, son más resistentes a la degradación por
exonucleasas que los oligonucleótidos convencionales. Estos
oligonucleótidos pueden ser multifuncionales, interaccionando con
varias regiones que no son adyacentes al ARNm diana.
El nivel apropiado de ácidos nucleicos
antisentido requerido para inhibir la expresión génica puede
determinarse utilizando un análisis de expresión in vitro.
La molécula antisentido puede introducirse en las células mediante
difusión, inyección, infección, transfección o importación mediada
por la región h, utilizando procedimientos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los ácidos nucleicos antisentido pueden introducirse en
el cuerpo como un oligonucleótido desnudo, un oligonucleótido
encapsulado en lípidos, una secuencia de oligonucleótido encapsidada
por proteínas víricas, o como un oligonucleótido operablemente
conectado con un promotor contenido en un vector de expresión. El
vector de expresión puede ser cualquiera de una diversidad de
vectores de expresión conocidos en la técnica, incluyendo vectores
retrovíricos o víricos, vectores capaces de la replicación
extracromosómica, o vectores de integración. Los vectores pueden
ser de ADN o ARN.
Las moléculas antisentido se introducen en
muestras celulares en una serie de concentraciones diferentes,
preferiblemente entre 1 x 10^{-10} M a 1 x 10^{-4} M. Cuando se
identifica la concentración mínima que puede controlar de forma
adecuada la expresión génica, la dosis optimizada se traduce en una
dosificación adecuada para uso in vivo. Por ejemplo, una
concentración inhibidora en cultivo de 1 x 10^{-7} se traduce en
una dosis de aproximadamente 0,6 mg/kg de peso corporal. Pueden ser
posibles unos niveles de oligonucleótidos cerca de 100 mg/kg de
peso corporal o mayores, después de ensayar la toxicidad del
oligonucleótido en animales de laboratorio. También se contempla
que las células del vertebrado se retiran, se tratan con el
oligonucleótido antisentido, y se reintroducen en el vertebrado.
También se contempla que la secuencia del
oligonucleótido antisentido se incorpore en una secuencia de
ribozima para permitir que el oligonucléotido antisentido se una de
forma específica y rompa su ARNm diana. Para las aplicaciones
técnicas de ribozimas y oligonucleótidos antisentido, véase Rossi
et al., supra.
En una aplicación preferida de esta invención,
en primer lugar se identifica el polipéptido codificado por el gen,
de modo que la eficacia de la inhibición del oligonucleótido
antisentido sobre la traducción puede controlarse utilizando
técnicas que incluyen, pero no se limitan a ensayos mediados por
anticuerpos, tales como RIA y ELISA, ensayos funcionales, o
radiomarcaje.
Los 5' EST de la presente invención (o ADNc o
ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) también pueden
utilizarse en enfoques de terapia génica basados en la formación de
triples hélices intracelulares. Los oligonucleótidos de triple
hélice se utilizan para inhibir la transcripción de un genoma. Son
particularmente útiles para estudiar alteraciones en la actividad
celular, asociada con un gen particular. Las secuencias de 5' EST (o
ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) de la presente
invención o, más preferiblemente, una porción de estas secuencias,
puede utilizarse para inhibir la expresión génica en individuos que
tienen enfermedades asociadas con la expresión de un gen
particular. De forma similar, una porción de las secuencias de los
5' EST (o ADNc o ADN genómicos obtenibles a partir de éstos) puede
utilizarse para estudiar el efecto de inhibir la transcripción de
un gen particular dentro de una célula. De forma tradicional, las
secuencias de homopurina se consideran las más útiles para las
estrategias de triple hélice. Sin embargo, las secuencias de
homopirimidina también pueden inhibir la expresión génica. Estos
oligonucleótidos de homopirimidina se unen al surco mayor en las
secuencias de homopurina:homopirimidina. Por tanto, ambos tipos de
secuencias procedentes del 5' EST o procedentes del gen
correspondiente al 5' EST se contemplan como dentro del alcance de
esta invención.
Las secuencias de los 5' EST (o ADNc o ADN
genómicos obtenibles a partir de éstos) se barren para identificar
tramos de homopirimidina u homopurina 10-meros a
20-meros que pueden utilizarse en estrategias
basadas en triples hélices para inhibir la expresión génica.
Después de la identificación de los tramos de homopirimidina u
homopurina candidatos, su eficacia para inhibir la expresión génica
se evalúa introduciendo cantidades variables de oligonucleótidos
que contienen las secuencias candidatas en células de cultivo de
tejidos que normalmente expresan el gen diana. Los oligonucleótidos
pueden prepararse en un sintetizador de oligonucleótidos, o pueden
adquirirse en el mercado en una empresa especializada en síntesis de
oligonucleótidos a medida, tal como GENSET, París, Francia.
Los oligonucleótidos pueden introducirse en las
células utilizando una diversidad de métodos conocidos por los
expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a
precipitación con fosfato de calcio, DEAE-dextrano,
electroporación, transfección mediada por liposomas, o captación
nativa.
Las células tratadas se controlan para detectar
una función celular alterada o una expresión génica reducida
utilizando técnicas, tales como análisis de la transferencia
Northern, ensayos de protección de ARNasa, o estrategias basadas en
PCR, para controlar los niveles de transcripción del gen diana en
células que se han tratado con el oligonucleótido. Las funciones
celulares que se van a controlar se predicen basándose en las
homologías del gen diana correspondiente al ADNc extendido a partir
del cual deriva el oligonucleótido, con secuencias génicas
conocidas que se han asociado con una función particular. Las
funciones celulares también pueden predecirse basándose en la
presencia de fisiologías anómalas en células derivadas de individuos
con una enfermedad heredada concreta, en particular cuando el ADNc
extendido está asociado con la enfermedad utilizando las técnicas
descritas en el Ejemplo 56.
Los oligonucleótidos que son eficaces para
inhibir la expresión génica en células de cultivo de tejidos
entonces pueden introducirse in vivo utilizando las técnicas
descritas anteriormente y en el Ejemplo 62, en una dosificación
calculada basada en los resultados in vitro, como se describe
en el Ejemplo 62.
En algunas realizaciones, los anómeros naturales
(beta) de las unidades de oligonucleótidos pueden sustituirse por
anómeros alfa para producir oligonucleótidos más resistentes a
nucleasas. Además, puede unirse un agente intercalante, tal como
bromuro de etidio o similares, al extremo 3' del
alfa-oligonucleótido para estabilizar la triple
hélice. Para obtener información sobre la generación de
oligonucleótidos estables para la formación de triples hélices,
véase Griffin et al., Science, 245:
967-971, 1989.
Los ADNc obtenidos como se describió
anteriormente utilizando los 5' EST de la presente invención también
pueden utilizarse para expresar una proteína codificada en un
organismo hospedante para producir un efecto beneficioso. En estos
procedimientos, la proteína codificada puede expresarse de modo
transitorio en el organismo hospedante, o puede expresarse de forma
estable en el organismo hospedante. La proteína codificada puede
tener cualquiera de las actividades descritas anteriormente. La
proteína codificada puede ser una proteína que el organismo
hospedante carece o, como alternativa, la proteína codificada puede
aumentar los niveles existentes de la proteína en el organismo
hospedante.
Un ADNc extendido de longitud completa que
codifica el péptido señal y la proteína madura, o un ADNc extendido
que codifica sólo la proteína madura, se introduce en el organismo
hospedante. El ADNc extendido puede introducirse en el organismo
hospedante utilizando una diversidad de técnicas conocidas por los
expertos en la técnica. Por ejemplo, el ADNc extendido puede
inyectarse en el organismo hospedante como ADN desnudo, de forma que
la proteína codificada se expresa en el organismo hospedante,
produciendo, con ello, un efecto beneficioso.
Como alternativa, el ADNc extendido puede
clonarse en un vector de expresión cadena abajo de un promotor que
es activo en el organismo hospedante. El vector de expresión puede
ser cualquier vector de expresión diseñado para uso en terapia
génica, incluyendo vectores víricos o retrovíricos. El vector de
expresión puede introducirse directamente en el organismo
hospedante, de forma que la proteína codificada se exprese en el
organismo hospedante para producir un efecto beneficioso. En otro
enfoque, el vector de expresión puede introducirse en células in
vitro. Las células que contienen el vector de expresión después
se seleccionan y se introducen en el organismo hospedante, en donde
expresan la proteína codificada para producir un efecto
beneficioso.
La región hidrófoba (h) corta central de
péptidos señal codificados por los 5' EST o ADNc extendidos
derivados de SEQ ID NO:149 también pueden utilizarse como portador
para importar un péptido o proteína de interés, denominado
cargamento, hacia células de cultivo de tejidos (Lin et al., J.
Biol. Chem., 270: 14225-14258, 1995; Du
et al., J. Peptide Res., 51: 235-243,
1998; Rojas et al., Nature Biotech., 16:
370-375, 1998).
Cuando se van a trasladar péptidos permeables a
células de tamaño limitado (aproximadamente hasta 25 aminoácidos) a
través de la membrana celular, puede utilizarse síntesis química
para añadir la región h al extremo C-terminal o al
extremo N-terminal del péptido cargamento de
interés. Como alternativa, cuando proteínas o péptidos más largos
se van a importar hacia células, los ácidos nucleicos pueden
modificarse genéticamente, utilizando técnicas conocidas por los
expertos en la técnica, para conectar la secuencia de ADNc extendido
que codifica la región h con el extremo 5' o 3' de una secuencia de
ADN que codifica un polipéptido cargamento. Estos ácidos nucleicos
modificados genéticamente entonces se traducen in vitro o
in vivo después de una transfección en células apropiadas,
utilizando técnicas convencionales para producir el polipéptido
permeable a células resultante. Las células hospedantes adecuadas
entonces se incuban sencillamente con el polipéptido permeable a
células, que entonces se traslada a través de la membrana.
Este método puede aplicarse para estudiar
diversas funciones intracelulares y procesos celulares. Por ejemplo,
se ha utilizado para sondar dominios funcionalmente relevantes de
proteínas intracelulares y para estudiar las interacciones
proteína-proteína implicadas en las vías de
transducción de señales (Lin et al., supra; Lin et al.,
J. Biol. Chem., 271: 5305-5308, 1996;
Rojas et al., J. Biol. Chem., 271:
27456-27461, 1996; Liu et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93: 11819-11824, 1996; Rojas
et al., Bioch. Biophys. Res. Commun., 234:
675-680, 1997).
Estas técnicas pueden utilizarse en terapia
celular para importar proteínas que producen efectos terapéuticos.
Por ejemplo, células aisladas de un paciente pueden tratarse con
proteínas terapéuticas importadas y después reintroducirse en el
organismo hospedante.
Como alternativa, la región h de los péptidos
señal de la presente invención puede utilizarse en combinación con
una señal de localización nuclear para dirigir ácidos nucleicos
hacia el núcleo celular. Estos oligonucleótidos puede ser
oligonucleótidos antisentido u oligonucleótidos diseñados para
formar triples hélices, como se describió en los ejemplo 62 y 63,
respectivamente, para inhibir el procesamiento y/o maduración de un
ARN celular diana.
Como se analizó anteriormente, los ADNc o
porciones de éstos obtenidos utilizando los 5' EST de la presente
invención pueden utilizarse para diversos fines. Los polinucleótidos
pueden utilizarse para expresar proteínas recombinantes para
análisis, caracterización o uso terapéutico; como marcadores para
tejidos en los que la correspondiente proteína se expresa con
preferencia (de manera constitutiva o en una etapa particular de la
diferenciación o desarrollo del tejido, o en estados de enfermedad);
como marcadores de peso molecular en geles de transferencia
Southern; como marcadores de cromosomas (cuando están marcados) para
identificar cromosomas o para cartografiar posiciones de genes
relacionados; para comparar con secuencias de ADN endógenas en
pacientes para identificar potenciales trastornos genéticos; como
sondas para hibridarse y, por tanto, descubrir nuevas secuencias de
ADN relacionadas; como fuente de información para derivar cebadores
de PCR para realizar una huella genética; para seleccionar y
fabricar oligómeros para su unión a un "chip genético" u otro
soporte, incluyendo para el estudio de patrones de expresión; para
producir anticuerpos antiproteína utilizando técnicas de
inmunización de ADN; y como antígeno para producir anticuerpos
anti-ADN o para provocar otra respuesta
inmunológica. Cuando el polinucleótido codifica una proteína que se
une o potencialmente se une a otra proteína (tal como, por ejemplo,
en una interacción receptor-ligando), el
polinucleótido también puede emplearse en ensayos de trampa de
interacción (tales como, por ejemplo, los descritos en Gyuris et
al., Cell, 75: 791-803, 1993) para
identificar polinucleótidos que codifican la otra proteína con la se
produce la unión, o para identificar inhibidores de la interacción
de unión.
Las proteínas o polipéptidos proporcionados por
la presente invención pueden utilizarse, de modo similar, en
ensayos para determinar la actividad biológica, incluyendo un panel
de múltiples proteínas para una selección de alta transferencia;
para producir anticuerpos o para provocar otra respuesta
inmunológica; como reactivo (incluyendo el reactivo marcado) en
ensayos diseñados para determinar cuantitativamente los niveles de
la proteína (o su receptor) en fluidos biológicos; como marcadores
para tejidos en los que la correspondiente proteína se expresa de
manera preferente (de forma constitutiva o en una etapa concreta de
la diferenciación o desarrollo del tejido, o en estados de
enfermedad); y, por supuesto, para aislar receptores o ligandos
correlativos. Cuando la proteína se une o potencialmente se une a
otra proteína (tal como, por ejemplo, en una interacción
receptor-ligando), la proteína puede utilizarse para
identificar la otra proteína con la que se produce la unión, o para
identificar inhibidores de la interacción de unión. Las proteínas
implicadas en estas interacciones de unión también pueden
utilizarse para seleccionar inhibidores o agonistas peptídicos o de
molécula pequeña de la interacción de unión.
Cualquiera o todas estas utilidades de
investigación se pueden desarrollar en un formato de calidad de
reactivo o kit para la comercialización como productos de
investigación.
Los métodos para realizar los usos listados
anterioremente son muy conocidos por los expertos en la técnica.
Las referencias que describen dichos métodos incluyen, sin
limitación, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, Fritsch y Maniatis
eds., 1989, y Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning
Techniques, Academic Press, Berger y Kimmel eds., 1987.
Los polinucleótidos y proteínas de la presente
invención también pueden utilizarse como suplementos o fuentes
nutricionales. Estos usos incluyen, sin limitación, el uso de un
suplemento de proteínas o aminoácidos, el uso como una fuente de
carbono, el uso como una fuente de nitrógeno, y el uso como una
fuente de carbohidratos. En estos casos, la proteína o
polinucleótido de la invención puede añadirse al pienso de un
organismo particular, o puede administrarse como una preparación
sólida o líquida separada, tal como en forma de polvo, píldoras,
disoluciones, suspensiones o cápsulas. En el caso de
microorganismos, la proteína o polinucleótido de la invención puede
añadirse al medio en el que se cultiva o sobre el que se cultiva el
microorganismo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: GENSET SA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 24, RUE ROYALE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARÍS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75008
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: 5' EST PARA PROTEÍNAS SEGREGADAS IDENTIFICADAS A PARTIR DE TEJIDO DE CEREBRO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 353
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Win95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Word
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: caperuza
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: m7Gppp añadido a 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAUCCUAC UCCCAUCCAA UUCCACCCUA ACUCCUCCCA UCUCCAC
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 46 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCAUCCUACU CCCAUCCAAU UCCACCCUAA CUCCUCCCAU CUCCAC
\hfill46
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCAAGAATT CGCACGAGAC CATTA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATGGTCTC GTGCGAATTC TTGAT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCGACAAGAC CAACGTCAAG GCCGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCACCAGCAG GCAGTGGCTT AGGAG
\hfill25
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGATTCCT GCTACTTTGG ATGGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTTGGTCTT GTTCTGGAGT TTAGA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCAGAATGG GAGACAAGCC AATTT
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGGGAGGAGG AAACAGCGTG AGTCC
\hfill25
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGGAAAGG AAAAGACTCA TATCA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCAGCAACA ATCAGGACAG CACAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCAAGAATT CGCACGAGAC CATTA
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 67 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCCAGCAGAGT CACGAGAGAG ACTACACGG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACGAGAGAG ACTACACGGT ACTGG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 526 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Ganglios linfáticos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (261..376)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 96
\hskip6.6cmregión 166..281
\hskip6.6cmid N70479
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (380..486)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 97
\hskip6.6cmregión 54..160
\hskip6.6cmid N70479
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (110..145)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 94
\hskip6.6cmregión 403..438
\hskip6.6cmid N70479
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (196..229)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 94
\hskip6.6cmregión 315..348
\hskip6.6cmid N70479
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 90..140
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 8,2
\hskip6.6cmsec LLLITAILAVAVG/FP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..17
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 8,2
\hskip6.6cmsec LLLITAILAVAVG/FP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Lys Val Leu Leu Leu Ile Thr Ala Ile
Leu Ala Val Ala Val}
\sac{Gly}
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 822 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ETAPA DEL DESARROLLO: fetal
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: riñón
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 260..464
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 96
\hskip6.6cmregión 153..357
\hskip6.6cmid H57434
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 118..184
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 98
\hskip6.6cmregión 98..164
\hskip6.6cmid H57434
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 56..113
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 98
\hskip6.6cmregión 35..92
\hskip6.6cmid H57434
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 454..485
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 100
\hskip6.6cmregión 348..379
\hskip6.6cmid H57434
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 118..545
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 98
\hskip6.6cmregión 1..428
\hskip6.6cmid N27248
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 65..369
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 98
\hskip6.6cmregión 41..345
\hskip6.6cmid H94779
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 61..399
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 99
\hskip6.6cmregión 6..344
\hskip6.6cmid H09880
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 408..458
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 92
\hskip6.6cmregión 355..405
\hskip6.6cmid H09880
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 60..399
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 97
\hskip6.6cmregión 56..395
\hskip6.6cmid H29351
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 393..432
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 90
\hskip6.6cmregión 391..430
\hskip6.6cmid H29351
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 346..408
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,5
\hskip6.6cmsec SFLPSALVIWTSA/AF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..21
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,5
\hskip6.6cmsec SFLPSALVIWTSA/AF
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Trp Trp Phe Gln Gln Gly Leu Ser Phe Leu
Pro Ser Ala Leu Val}
\sac{Ile Trp Thr Ser Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 405 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Testículos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (103..398)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 96
\hskip6.6cmregión 1..296
\hskip6.6cmid AA442893
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 185..295
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,9
\hskip6.6cmsec LSYASSALSPCLT/AP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..37
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,9
\hskip6.6cmsec LSYASSALSPCLT/AP
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Val Leu Thr Thr Leu Pro Leu Pro Ser Ala
Asn Ser Pro Val Asn}
\sac{Met Pro Thr Thr Gly Pro Asn Ser Leu Ser
Tyr Ala Ser Ser Ala Leu}
\sac{Ser Pro Cys Leu Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 496 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Próstata cancerosa
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 149..331
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 98
\hskip6.6cmregión 1..183
\hskip6.6cmid AA397994
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 328..485
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 96
\hskip6.6cmregión 179..336
\hskip6.6cmid AA397994
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (182..496)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 97
\hskip6.6cmregión 14..328
\hskip6.6cmid AA399680
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 196..240
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,5
\hskip6.6cmsec ILSTVTALTFAXA/LD
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..15
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 5,5
\hskip6.6cmsec ILSTVTALTFAXA/LD
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Ile Leu Ser Thr Val Thr Ala Leu Thr
Phe Ala Xaa Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 623 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Testículos
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 49..96
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 10,1
\hskip6.6cmsec LVLTLCTLPLAVA/SA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..16
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 10,1
\hskip6.6cmsec LVLTLCTLPLAVA/SA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Glu Arg Leu Val Leu Thr Leu Cys Thr Leu
Pro Leu Ala Val Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 848 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ETAPA DEL DESARROLLO: fetal
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: riñón
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 32..73
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 10,7
\hskip6.6cmsec LWLLFFLVTAIHA/EL
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 14 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..14
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 10,7
\hskip6.6cmsec LWLLFFLVTAIHA/EL
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Leu Trp Leu Leu Phe Phe Leu Val Thr Ala
Ile His Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGAAGATGG AGATAGTATT GCCTG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGCCATGTA CATGATAGAG AGATTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 546 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..517
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de inicio de la transcripción
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 518
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 17..25
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre CMYB_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,983
\hskip6.6cmsecuencia TGTCAGTTG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (18..27)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MYOD_Q6
\hskip6.6cmpuntuación 0,961
\hskip6.6cmsecuencia CCCAACTGAC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (75..85)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre S8_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,960
\hskip6.6cmsecuencia AATAGAATTAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 94..104
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre S8_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,966
\hskip6.6cmsecuencia AACTAAATTAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (129..139)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre DELTAEF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,960
\hskip6.6cmsecuencia GCACACCTCAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (155..165)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre GATA_C
\hskip6.6cmpuntuación 0,964
\hskip6.6cmsecuencia AGATAAATCCA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 170..178
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre CMYB_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,958
\hskip6.6cmsecuencia CTTCAGTTG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 176..189
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre GATA1_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,959
\hskip6.6cmsecuencia TTGTAGATAGGACA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 180..190
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre GATA_C
\hskip6.6cmpuntuación 0,953
\hskip6.6cmsecuencia AGATAGGACAT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 284..299
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre TAL1ALPHA4E7_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,973
\hskip6.6cmsecuencia CATAACAGATGGTAAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 284..299
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre TAL1BETAE47_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,983
\hskip6.6cmsecuencia CATAACAGATGGTAAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 284..299
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre TAL1BETAITF2_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,978
\hskip6.6cmsecuencia CATAACAGATGGTAAG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (287..296)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MYOD_Q6
\hskip6.6cmpuntuación 0,954
\hskip6.6cmsecuencia ACCATCTGTT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (302..314)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre GATA1_04
\hskip6.6cmpuntuación 0,953
\hskip6.6cmsecuencia TCAAGATAAGTA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 393..405
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre IK1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,963
\hskip6.6cmsecuencia AGTTGGGAATTCC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 393..404
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre IK2_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,985
\hskip6.6cmsecuencia AGTTGGGAATTC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 396..405
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre CREL_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,962
\hskip6.6cmsecuencia TGGGAATTCC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 423..436
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre GATA1_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,950
\hskip6.6cmsecuencia TCAGTGATATGGCA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (478..489)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre SRY_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,951
\hskip6.6cmsecuencia TAAAACAAAACA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 486..493
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre E2F_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,957
\hskip6.6cmsecuencia TTTAGCGC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (514..521)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,975
\hskip6.6cmsecuencia TGAGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACCAGGGA CTGTGACCAT TGC
\hfill23
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGTGACCAT TGCTCCCAAG AGAG
\hfill24
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 861 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..806
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de inicio de la transcripción
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 807
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (60..70)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre NFY_Q6
\hskip6.6cmpuntuación 0,956
\hskip6.6cmsecuencia GGACCAATCAT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 70..77
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,962
\hskip6.6cmsecuencia CCTGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 124..132
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre CMYB_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,994
\hskip6.6cmsecuencia TGACCGTTG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (126..134)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre VMYB_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,985
\hskip6.6cmsecuencia TCCAACGGT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 135..143
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre STAT_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,968
\hskip6.6cmsecuencia TTCCTGGAA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (135..143)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre STAT_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,951
\hskip6.6cmsecuencia TTCCAGGAA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (252..259)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,956
\hskip6.6cmsecuencia TTGGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 357..368
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre IK2_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,965
\hskip6.6cmsecuencia GAATGGGATTTC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 384..391
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,986
\hskip6.6cmsecuencia AGAGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (410..421)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\newpage
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre SRY_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,955
\hskip6.6cmsecuencia GAAAACAAAACA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 592..599
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,960
\hskip6.6cmsecuencia GAAGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 618..627
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MYOD_Q6
\hskip6.6cmpuntuación 0,981
\hskip6.6cmsecuencia AGCATCTGCC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 632..642
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre DELTAEF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,958
\hskip6.6cmsecuencia TCCCACCTTCC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (813..823)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre S8_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,992
\hskip6.6cmsecuencia GAGGCAATTAT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (824..831)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,986
\hskip6.6cmsecuencia AGAGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGGATGGA AGGCACGGTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro ácido nucleico
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGACCACAC AGCTAGACAA
\hfill20
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 555 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..500
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de inicio de la transcripción
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 501
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 191..206
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre ARNT_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,964
\hskip6.6cmsecuencia GGACTCACGTGCTGCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 193..204
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre NMYC_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,965
\hskip6.6cmsecuencia ACTCACGTGCTG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 193..204
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre USF_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,985
\hskip6.6cmsecuencia ACTCACGTGCTG
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (193..204)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre USF_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,985
\hskip6.6cmsecuencia CAGCACGTGAGT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (193..204)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre NMYC_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,956
\hskip6.6cmsecuencia CAGCACGTGAGT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (193..204)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MYCMAX_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,972
\hskip6.6cmsecuencia CAGCACGTGAGT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 195..202
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre USF_C
\hskip6.6cmpuntuación 0,997
\hskip6.6cmsecuencia TCACGTGC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (195..202)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre USF_C
\hskip6.6cmpuntuación 0,991
\hskip6.6cmsecuencia GCACGTGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (210..217)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre MZF1_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,968
\hskip6.6cmsecuencia CATGGGGA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 397..410
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre ELK1_02
\hskip6.6cmpuntuación 0,963
\hskip6.6cmsecuencia CTCTCCGGAAGCCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 400..409
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre CETS1P54_01
\hskip6.6cmpuntuación 0,974
\hskip6.6cmsecuencia TCCGGAAGCC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (460..470)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre API_Q4
\hskip6.6cmpuntuación 0,963
\hskip6.6cmsecuencia AGTGACTGAAC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (460..470)
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre APIFJ_Q2
\hskip6.6cmpuntuación 0,961
\hskip6.6cmsecuencia AGTGACTGAAC
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: sitio de unión TF
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 547..555
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: predicción MatInspector
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: nombre PADS_C
\hskip6.6cmpuntuación 1,000
\hskip6.6cmsecuencia TGTGGTCTC
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 149:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 472 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: DOBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Sustancia negra
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 245..466
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 92
\hskip6.6cmregión 74..295
\hskip6.6cmid R61190
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: otro
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 181..258
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: blastn
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: coincidencia 94
\hskip6.6cmregión 11..88
\hskip6.6cmid R61190
\hskip6.6cmest
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 89..154
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 11,1
\hskip6.6cmsec QLLALFFLPFCLC/QD
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 149:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 307:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 128 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Sustancia negra
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: -22..-1
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: matriz de Von Heijne
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: puntuación 11,1
\hskip6.6cmsec QLLALFFLPFCLC/QD
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 307:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Un péptido señal que tiene la secuencia de
aminoácidos -22 a -1 de SEQ ID NO:307.
2. Un polinucleótido que codifica el péptido
señal de la reivindicación 1.
3. El polinucleótido de la reivindicación 2, que
tiene la secuencia de nucleótidos 89 a 154 de SEQ ID NO:149.
4. Un ácido nucleico purificado y aislado que
codifica un polipéptido que comprende el péptido señal de la
reivindicación 1 en el extremo 5' de la secuencia codificadora, en
el que dicha secuencia de ácido nucleico está fusionada dentro de
marco al extremo 5' de una secuencia que codifica un polipéptido que
es heterólogo con respecto a un polipéptido que comprende los
aminoácidos 1 a 106 de SEQ ID NO:307.
5. Un ácido nucleico según la reivindicación 4,
en el que el ácido nucleico comprende una secuencia de
polinucleótidos que tiene la secuencia de nucleótidos 89 a 154 de
SEQ ID NO:149.
6. Un vector de expresión que comprende un
polinucleótido según la reivindicación 2 ó 3 conectado operablemente
a un promotor.
7. Un vector de expresión que comprende un ácido
nucleico según la reivindicación 4 ó 5 conectado operablemente a un
promotor.
8. Un vector de expresión según la
reivindicación 6 ó 7, en el que dicho vector es un vector de
secreción.
9. Un vector de expresión según la
reivindicación 6 ó 7, en el que dicho vector es un vector de terapia
génica.
10. Un polipéptido codificado por un
polinucleótido de la reivindicación 4 ó 5.
11. Un polipéptido según la reivindicación 10,
en el que dicho polipéptido es una proteína segregada humana.
12. Una proteína de fusión codificada por un
ácido nucleico según la reivindicación 4.
13. El uso de un péptido señal según la
reivindicación 1, para dirigir la secreción extracelular de un
polipéptido que es heterólogo con respecto a un polipéptido que
comprende los aminoácidos 1 a 106 de SEQ ID NO:307.
14. El uso de un péptido señal según la
reivindicación 1, para simplificar la purificación de proteínas de
un polipéptido que es heterólogo con respecto a un polipéptido que
comprende los aminoácidos 1 a 106 de SEQ ID NO:307.
15. El uso de un vector según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 9, para dirigir la secreción extracelular
de un polipéptido.
16. El uso de un vector según una cualquiera de
las reivindicaciones 6 a 9, para simplificar la purificación de
proteínas de un polipéptido deseado.
17. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 13 a 16, en el que dicho polipéptido es un
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a
15.
18. Un método para fabricar una proteína
segregada que es heteróloga con respecto a un polipéptido que
comprende los aminoácidos 1 a 106 de SEQ ID NO:307, que comprende la
etapa de insertar un gen que codifica una proteína no segregada
dentro de marco con un polinucleótido según la reivindicación 2 ó 3,
en un vector de forma que la proteína codificada por el gen
insertado se expresa a partir del ARNm transcrito.
19. Un método según la reivindicación 18, que
comprende además la etapa de introducir dicho vector en una célula,
tejido u organismo hospedante in vitro.
20. Un método para fabricar una proteína
segregada, que comprende la etapa de introducir un vector según la
reivindicación 7 en una célula, tejido u organismo hospedante in
vitro.
21. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 18 a 20, que comprende además la etapa de aislar la
proteína segregada in vitro.
22. Un método según la reivindicación 21, en el
que la etapa de aislar la proteína segregada comprende purificar la
proteína segregada a partir del sobrenadante, el medio de cultivo, o
el extracto celular de dicha célula hospedante.
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