ES2288016T3 - Estañocalcina humana y usos de la misma para inhibir la adipogenesis. - Google Patents
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Abstract
Una proteína aislada de fibroblastos pulmonares fetales humanos; que se purifica de un caldo de cultivo de fibroblastos pulmonares fetales humanos por cromatografía usando columna de intercambio iónico, columnas de afinidad de heparina y columnas de fase inversa; y que se caracteriza por las siguientes propiedades: a) tiene una actividad que suprime la diferenciación y/o maduración de adipocitos, b) tiene un peso molecular por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de aproximadamente 45 kD en condiciones no reductoras, y aproximadamente 28 kD y/o 23 kD en condiciones reductoras, c) muestra afinidad a heparina de acuerdo con un intervalo específico de concentraciones de NaCI, d) contiene cadenas de azúcar unidas a N, que se retiran para formar una proteína con PM de aproximadamente 18 kD por SDS-PAGE en condiciones reductoras, y e) está compuesta por la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 13.
Description
Estañocalcina humana y usos de la misma para
inhibir la adipogénesis.
La presente invención se refiere a un factor
inhibidor de la adipogénesis (ADIF) que es una nueva proteína que
tiene una actividad de supresión de la diferenciación y/o maduración
de adipocitos, y a métodos para producir la misma.
La proteína de la presente invención es útil
como una composición farmacéutica para prevenir o tratar la obesidad
o como un antígeno para establecer un diagnóstico inmunológico.
La obesidad es un factor de riesgo de
enfermedades tales como la diabetes mellitus, hipertonía, y
enfermedad cardiaca, que amenazan la salud de la gente de países
avanzados. La obesidad significa afecciones físicas en las que los
tejidos adiposos se han acumulado de forma anormal. Los tejidos
adiposos son órganos especiales en los que se almacena in
vivo el excedente de energía como grasa o triglicéridos, y está
construido de fibroblastos que incluyen adipocitos y sus
precursores, macrófagos, células que rodean los vasos sanguíneos,
células sanguíneas, y similares.
Se dice que los adipocitos representan 1/3 a 2/3
de las células que están presentes en tejidos adiposos y acumulan
grasas o triglicéridos. Los adipocitos se diferencian y maduran a
través del proceso que comienza desde las células madre
multipotenciales mesenquimáticas, y que crecen en lipoblastos que
han adquirido una base como adipocitos, adipocitos precursores sin
gotas de lípidos pero que tienen marcadores iniciales de
adipocitos, adipocitos inmaduros que contienen gotas de lípidos, y
finalmente en adipocitos maduros que contienen gran cantidad de
grasas acumuladas. Los adipocitos de los adultos que sufren ligera
obesidad crecen hipertróficamente debido al aumento en la cantidad
de triglicéridos acumulados. La cantidad de adipocitos aumenta según
el grado de obesidad llega a ser visible. Por lo tanto,
disminuyendo la cantidad de adipocitos controlando la diferenciación
y maduración o suprimiendo la hipertrofia de adipocitos madurados
se espera que se detenga el progreso de la obesidad suprimiendo el
aumento en la cantidad de grasas acumuladas, y para tratar la
obesidad. Se ha demostrado que el control de la diferenciación de
adipocitos in vivo sucede positiva o negativamente de acuerdo
con varios factores derivados de factores ambientales tales como la
ingestión, ejercicio, y etc. Como citoquinas que controlan la
diferenciación de los adipocitos a partir de precursores de
adipocitos, se presentan el factor de necrosis
tumoral-\alpha (TNF-\alpha:
Torti F. M. et al., Science, Vol. 229, p 867 (1985)), factor
de crecimiento transformante-\beta (Ignotz R. A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 82, p 8530 (1985)),
factor de preadipocitos-1 (Pref-1:
Smas CM. et al., Cell, Vol. 73, p 725 (1993)), y similares.
Además, se ha informado de que la leptina, el producto de
traducción de un gen ob que se ha clonado recientemente,
posiblemente disminuye la cantidad de ingesta y el peso de los
tejidos adiposos mediante el sistema nervioso central (Levin N.
et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93. P 1726,
1996).
Además, el péptido
intracerebral-neuropéptido Y que muestra un fuerte
efecto de estimulación del apetito y su receptor están atrayendo la
atención como materiales para el desarrollo de un compuesto
farmacéutico para suprimir la obesidad (Sainsburg A. et al.,
Diabetologia, Vol. 39, p 353, 1996). Se espera que estas citoquinas
lleguen a ser un agente terapéutico para la obesidad debido a su
acción de depresión de adipocitos sobre la acumulación de la grasa.
Están en curso ensayos clínicos como agentes terapéuticos o
preventivos de la obesidad sobre algunas de estas citoquinas tales
como la leptina.
Actualmente, está disponible en el mercado un
agente terapéutico o preventivo de la obesidad en los Estados
Unidos como el Redux^{TM} (American Home Products Co.). Otros
fármacos tales como Meridia (Kunol Co.) y Xenical (Roche Co.) se
aprobarán como un agente de tratamiento de la obesidad o un
inhibidor de la absorción de grasa en los Estados Unidos. El método
de tratamiento que usa estos compuestos farmacéuticos, sin embargo,
no son necesariamente satisfactorios en los efectos y resultados
terapéuticos. Se ha deseado el desarrollo de un nuevo agente que
esté disponible y muestre para estos compuestos farmacéuticos mayor
efecto curativo y menos efectos secundarios, útil.
El documento WO 96/15147 y Chang et al,
molecular and cellular vol. 141, p. 95-99,1998 se
refieren a la identificación de los polipéptidos
estañocalcina-\alpha y
estañocalcina-2 [que tienen secuencias de
aminoácidos similares a las proteínas estudiadas en la presente
invención.
Como resultado de la exploración extensiva para
descubrir un nuevo compuesto que tenga un efecto
anti-obesidad o un efecto de control de la
obesidad, en la presente invención se ha descubierto una proteína
que muestra una actividad inhibidora de la adipogénesis, que es una
actividad para suprimir la diferenciación y/o maduración de
adipocitos, en un caldo de cultivo de fibroblasto pulmonar fetal
humano IMR-90 (depositado con ATCC, Nº de depósito
CCL186). En la presente invención se ha descubierto adicionalmente
un proceso para acumular esta proteína en una concentración elevada
cultivando las células que usan trozos de cerámica de alúmina como
una matriz celular y para purificar la proteína de forma eficaz.
Además, en la presente invención también se ha establecido un
método eficaz para aislar la proteína del caldo de cultivo
mencionado anteriormente repitiendo la absorción y elución
secuencialmente con una columna de intercambio iónico, columna de
afinidad, y columna de fase inversa.
Específicamente, un objeto de la presente
invención es proporcionar un factor inhibidor de la adipogénesis
(ADIF) que sea una nueva proteína que tenga actividad de supresión
de la diferenciación y/o maduración de adipocitos, y a un proceso
para producir la proteína a partir de un caldo de cultivo obtenido
cultivando fibroblastos humanos.
La presente solicitud proporciona un ADNc que
codifica la proteína de presente invención y un proceso para
producir la proteína usando el ADNc.
Como se ha descrito anteriormente, la presente
invención se refiere a un factor inhibidor de la adipogénesis (a
partir de ahora llamado "ADIF" de vez en cuando) que es una
nueva proteína que tiene una actividad de supresión de la
diferenciación y/o maduración de adipocitos, y a un proceso para
producir la proteína.
La proteína de la presente invención es una
proteína aislada de acuerdo con la reivindicación 1.
El método para obtener la proteína de la
presente invención comprende cultivar fibroblastos pulmonares
fetales humanos en trozos de cerámica de alúmina y purificar el
caldo de cultivo por cromatografía usando una columna de
intercambio iónico, columna de afinidad a heparina, y columna de
fase inversa.
La Figura 1 muestra el perfil de elución de la
proteína ADIF en bruto (fracción de Superose 12 en el Ejemplo 3,
vii); Muestra 7) de una columna de heparina 5PW.
La Figura 2 muestra el perfil de elución de la
proteína ADIF en bruto (fracción de heparina 5PW en el Ejemplo 3,
viii); Muestra 8) de columna Polycat-A.
La Figura 3 muestra el perfil de elución de la
proteína ADIF (fracciones de Polycat-A en el Ejemplo
3, ix)) de una columna de fase inversa.
La Figura 4 muestra una actividad ADIF del pico
de la fracción 5 de una columna de fase inversa.
La Figura 5 muestra la electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida de la proteína ADIF finalmente
purificada en condiciones reductoras y no reductoras.
Carril 1: Marcador de peso molecular
(SDS-PAGE en condiciones no reductoras)
Carril 2: ADIF (SDS-PAGE en
condiciones no reductoras)
Carril 3: Marcador de peso molecular
(SDS-PAGE en condiciones reductoras)
Carril 4: ADIF (SDS-PAGE en
condiciones reductoras)
La Figura 6 muestra SDS-PAGE
después de que el producto finalmente purificado se haya tratado con
N-glicanasa.
Carril 1: Marcador de peso molecular
Carril 2: ADIF no tratado
Carril 3: ADIF que se trató para retirar las
cadenas de azúcar tipo unión N por N-glicanasa
La Figura 7 muestra la actividad ADIF del
Ejemplo 16.
La presente invención se refiere a una proteína
ADIF que tiene actividad de supresión de la diferenciación y/o
maduración de adipocitos, que se origina a partir de fibroblastos
humanos, que tiene un peso molecular por SDS-PAGE
de aproximadamente 45 kD en condiciones no reductoras,
aproximadamente 28 kD y/o 23 kD en condiciones reductoras, y que
muestra afinidad a heparina. La proteína ADIF de la presente
invención tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 18 kD
por SDS-PAGE en condiciones reductoras si se retiran
las cadenas de azúcar tipo unión N por tratamiento con
N-glicanasa. La proteína ADIF de la presente
invención suprime el proceso de diferenciación y/o maduración de
lipoblastos, precursores de adipocitos o adipocitos inmaduros, en
adipocitos madurados que contienen gran cantidad de grasas
acumuladas. La proteína ADIF de la presente invención difiere
claramente de factores inhibidores de la adipogénesis conocidos en
el peso molecular o la secuencia de aminoácidos
N-terminal.
\newpage
La presente invención se refiere a un proceso
para producir la proteína ADIF que comprende cultivar fibroblastos
pulmonares fetales humanos en trozos de cerámica de alúmina
aplicando el caldo de cultivo a una columna de heparina, eluyendo
las fracciones adsorbidas, cargando las fracciones en una columna de
intercambio catiónico y eluyendo las fracciones adsorbidas, y
tratando adicionalmente las fracciones con una columna de
intercambio iónico, columna de filtración en gel, y columna de fase
inversa, purificando y recogiendo de este modo la proteína ADIF.
El tratamiento en columna en la presente
invención incluye no solamente el tratamiento para provocar que un
caldo de cultivo fluya a través de una columna de heparina sepharose
o similares, sino también un tratamiento que consigue el mismo
efecto que el tratamiento en columna tal como mezcla y agitación del
caldo de cultivo con heparina sepharose o similares por un proceso
discontinuo (en la presente invención "tratamiento de columna"
se usa con este significado).
En la presente invención, la proteína también
puede producirse de forma eficaz cultivando los fibroblastos
pulmonares fetales humanos usando trozos de cerámica de alúmina como
un vehículo de adhesión celular.
Además, la presente invención se refiere a un
ADNc que codifica la proteína ADIF, estando obtenida la proteína
ADIF por ingeniería genética usando el ADNc, y un proceso para
producir la proteína ADIF.
ADIF que es la proteína de la presente invención
puede aislarse y purificarse de forma eficaz a partir de un caldo
de cultivo de fibroblastos pulmonares fetales humanos. Aunque no hay
limitaciones específicas a los fibroblastos humanos usando como la
célula de producción, es particularmente preferible el fibroblasto
pulmonar de embrión humano IM R-90 (depositado con
ATCC, Nº de depósito CCL186). Se provoca que el fibroblasto pulmonar
fetal humano se adhiera a trozos de cerámica de alúmina y se
cultiva de forma estática en un Medio de Eagle modificado por
Dulbecco (DMEM) al que se añade suero de vacas neonatas en un matraz
de tipo T o un frasco rotatorio durante una semana a diez días. La
proteína ADIF de la presente invención se aísla y purifica de este
caldo de cultivo. Como método de aislamiento y purificación, pueden
realizarse diversos procesos de purificación usando las
características físicas o químicas de la proteína ADIF diana de
acuerdo con métodos convencionales que se usan para la purificación
de proteínas a partir de muestras biológicas. Como método de
concentración, pueden usarse métodos convencionales tales como
ultrafiltración, secado por congelación, desalado, y similares.
Como medio de purificación, pueden usarse diversas operaciones de
purificación habitualmente usadas para la purificación de
proteínas, tales como cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, cromatografía de filtración en gel,
cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa,
electroforesis preparativa, y similares de forma independiente o en
combinación. Puede añadirse un tensioactivo cuando la proteína de
la presente invención se purifica a partir de un caldo de cultivo.
Aunque no hay limitaciones específicas al tensioactivo usando en
este caso, preferiblemente se usa CHAPS
(3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato)
al 0,1%, polisorbato 80 al 0,01%, o polisorbato 20 al 0,01%. De
forma particularmente preferible, la proteína ADIF de la presente
invención puede aislarse y purificarse procesando el caldo de
cultivo en el orden de una columna de heparina, columna de
intercambio catiónico-SP, columna de intercambio
aniónico-Q, columna de filtración en gel, columna
de heparina, columna de intercambio catiónico débil, y columna de
fase inversa. La proteína ADIF de la presente invención puede
especificarse por las siguientes características biológicas y
fisicoquímicas:
(a) Actividad: suprime la diferenciación y/o
maduración de adipocitos,
(b) Peso molecular (por
SDS-PAGE): tiene un peso molecular de
aproximadamente 45 kD en condiciones no reductoras, y
aproximadamente 28 kD y/o 23 kD en condiciones reductoras,
(c) Afinidad: tiene afinidad a heparina,
(d) contiene azúcares,
(e) secuencia de aminoácidos
N-terminal:
(Xaa indica un aminoácido no identificado).
\newpage
La proteína ADIF de la presente invención
también puede producirse por una técnica de ingeniería genética.
Específicamente, se clona un ADNc que codifica esta proteína basada
en la información de la secuencia de aminoácidos de ADIF natural
obtenido de acuerdo con el método descrito anteriormente, y se
provoca que este ADNc exprese un ADIF recombinante génico por una
técnica de ingeniería genética. Más específicamente, la secuencia de
aminoácidos N-terminal del ADIF natural obtenido
por la presente invención se analiza y se prepara una mezcla de
oligonucleótidos que pueden codificar esta secuencia. A
continuación, se adquieren fragmentos de ADNc de ADIF por el método
de PCR (preferiblemente el método de RT-PCR) usando
la mezcla de oligonucleótidos como cebador. Puede obtenerse el ADNc
de longitud completa de ADIF clonando la biblioteca de ADNc
preparada a partir de células IMR-90 usando los
fragmentos de ADNc como sonda (Tabla de Secuencias, SEC ID Nº
12).
Puede obtenerse una proteína ADIF recombinante
génica insertando el ADNc de longitud completa resultante en un
vector de expresión para producir un plásmido de expresión de ADIF,
insertando el plásmido en diversos microorganismos o células
animales, y provocando el se exprese el ADIF. El ADIF recombinante
génico obtenido de este modo tiene las mismas características
fisicoquímicas que el ADIF natural descrito anteriormente y su
secuencia de aminoácidos N-terminal se muestra del
siguiente modo (se muestra la misma secuencia en la Tabla de
Secuencias, SEC ID Nº 3).
Secuencia de aminoácidos
N-terminal (Esperada del ADNc):
La actividad biológica de ADIF puede
determinarse estimando los efectos de supresión de la adipogénesis
inducida por dexametasona con retardo de la acumulación de
triglicéridos usando una célula pre-adipocito de
ratón como una diana de acuerdo con el método de Kodama H. et
al. (Journal of Cellular Physiology, Vol. 112, p 83 (1982)).
El factor inhibidor de la adipogénesis (ADIF)
que es la proteína de la presente invención es útil como una
composición farmacéutica para prevenir o tratar la obesidad o como
un antígeno para establecer un diagnóstico inmunológico. ADIF puede
administrarse de forma segura a seres humanos y animales. ADIF puede
prepararse en una preparación y administrarse por vía oral o
parenteral. Los ejemplos de la composición farmacéutica incluyen
composiciones para inyección, infusión por goteo, supositorios,
agente nasal, agente sublingual, agente de absorción percutánea, y
similares. Estas composiciones se formulan de acuerdo con métodos de
preparación farmacéutica conocidos usando excipientes, vehículos,
estabilizadores, agentes colorantes y/u otros aditivos
farmacéuticamente aceptables, y se preparan en preparaciones diana.
Cuando se preparan composiciones para inyección, puede mezclarse
una cantidad farmacológicamente eficaz del factor inhibidor de la
adipogénesis de la presente invención con vehículos o agentes de
activación farmacéuticamente aceptables, tales como aminoácidos,
sacáridos, derivados de celulosa, y otros compuestos
orgánicos/inorgánicos. Además, cuando se prepara una composición
para inyección a partir del factor inhibidor de la adipogénesis de
la presente invención y dichos vehículos o agentes de activación,
puede añadirse un agente de ajuste del pH, agente tamponante,
estabilizador, agente solubilizante, y similares, de acuerdo con un
método convencional según sea necesario.
La presente invención se describirá ahora con
mayor detalle a modo de ejemplos del siguiente modo. Sin embargo,
debe observarse que los ejemplos simplemente muestran una
ilustración y la invención no restringe a ellos.
Se cultivaron fibroblastos pulmonares fetales
humanos IMR-90 (depositados en la ATCC, Nº de
depósito. CCL186) en 80 g de trozos de cerámica de alúmina
(alúmina: 99,5%, fabricado por Toshiba Ceramic Corp.) y se
cultivaron en frascos rotatorios (490 cm^{2}, 110 x 171 mm,
fabricados por Corning Co.). El cultivo se realizó usando 40
frascos rotatorios, que contenían cada uno 500 ml de DMEM
suplementado con suero sanguíneo de vacas neonatas al 5% y HEPES 10
mM (Gibco BRL), a 37ºC en presencia de CO_{2} al 5% durante 7 a 10
días sin rotar los frascos. Después de cultivar, el caldo de
cultivo se recogió y se añadió medio reciente para completar un
ciclo de cultivo. Se obtuvieron 20 l de caldo de cultivo
IMR-90 para cada ciclo de cultivo. El caldo de
cultivo se denominó Muestra 1.
La actividad del ADIF que es la proteína de la
presente invención se midió de acuerdo con el método de Kodama H.
et al. (Journal of Cellular Physiology, Vol. 112, pág. 83,
(1982)). Específicamente, la actividad supresora se determinó
estimando la adipogénesis inducida por dexametasona con acumulación
de triglicéridos usando una célula MC3T3-G2/PA6 de
pre-adipocitos de ratón (RIKEN GENE BANK, RCB1127)
como diana. Específicamente, se cargaron 50 \mul de una muestra
diluida con \alpha-MEM (Gibco BRL) que contenía
suero bovino fetal al 10% en una placa de microtitulación de 96
pocillos. Las células MC3T3-G2/PA6 de
pre-adipocitos de ratón se suspendieron en
\alpha-MEM que contenía dexametasona 2 x 10^{-7}
M y suero bovino fetal al 10%, se inocularon en la placa de
microtitulación a una concentración celular de 3 x 10^{3}/50
\mul/pocillo, y se incubaron durante una semana en condiciones de
CO_{2} al 5% a 37ºC, y humedad del 100% Después de siete días, se
retiró el cultivo por aspiración y se secaron las células para
medir la cantidad de triglicéridos acumulados en los adipocitos
usando un kit de ensayo de triglicéridos (Triglyceride
G-Test Wako, fabricado por Wako Pure Chemicals Co.,
Ltd.). La reducción de la OD a 510 nm se tomó como la actividad
ADIF.
Se filtraron aproximadamente 60 l de caldo de
cultivo IMR-90 (Muestra 1) con un filtro de 0,22
\mum (Hydrophilic Milldisk, 2.000 cm^{2}, fabricado por
Millipore Co.) y se dividió en tres partes. Cada parte (20 l) se
aplicó a una columna de heparina-sepharose
CL-6B (5 x 4,1 cm, volumen de gel 80 ml) equilibrada
con un tampón Tris-HCl 10 mM que contenía NaCl 0,3
M (pH 7,5). Después de lavar la columna con tampón
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) (a partir de ahora llamado
"Tris-HCl") a un caudal de 500 ml/h, la muestra
se eluyó con Tris-HCl que contenía NaCl 2 M (pH
7,5) para obtener 1,5 l de una fracción adsorbida en
heparina-sepharose CL-6B, que se
denomina Muestra 2.
La fracción adsorbente de
heparina-sepharose (Muestra 2) se dializó frente a
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), suplementado con CHAPS a
una concentración final del 0,1%, se incubó a 4ºC durante una noche
y se dividió en seis partes. Cada parte después se aplicó a una
columna de intercambio catiónico (HiLoad-SP/HP, 2,6
x 10 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) equilibrada
con Tris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al 0,1% (pH
7,5). Después de lavar la columna con Tris-HCl 50
mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1%, la proteína adsorbida se
eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0 a 0,5 M en 120 minutos a un
caudal de 6 ml/min y se recogieron fracciones de 12 ml de tamaño.
Usando 30 \mul de cada fracción, se midió la actividad ADIF de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2. Se obtuvieron
fracciones activas de ADIF (936 ml) eluidas a concentraciones de
NaCl de aproximadamente 0,15 a 0,25 M que se obtuvieron y se
denominaron Muestra 3.
La Muestra 3 resultante se diluyó con 1900 ml de
Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) que contenía CHAPS al 0,1% y
se dividió en seis partes. Cada parte se aplicó a una columna de
intercambio catiónico (HiLoad-Q/HP, 2,6 x 10 cm,
Amasham-Pharmacia Biotech Co.) equilibrada con
Tris-HCl 50 mM que contenía CHAPS a 0,1% (pH 7,5).
Después de lavar la columna con Tris-HCl 50 mM (pH
7,5) que contenía CHAPS al 0,1%, la proteína adsorbida se eluyó con
un gradiente lineal de NaCl 0 a 0.5 M en 120 minutos a un caudal de
6 ml/min y se recogieron fracciones de 12 ml de tamaño. Usando 30
\mul de cada fracción se midió la actividad ADIF de acuerdo con el
método descrito en el Ejemplo 2. Se descubrió que una fracción (936
ml) eluida con concentraciones de NaCl de aproximadamente 0,1 a
0,18 M tenía actividad ADIF y se denominó Muestra 4.
La Muestra 4 resultante se diluyó con 1900 ml de
BisTris-HCl 50 mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al
0,1% y se dividió en tres partes. Cada parte se aplicó a una
columna de intercambio catiónico (HiLoad-SP/HP, 2,6
x 10 cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) equilibrada
con BisTris-HCl 50 mM que contenía CHAPS a 0,1% (pH
6,0). Después de lavar la columna con BisTris-HCl
50 mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al 0,1%, la proteína adsorbida se
eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0,1 a 0,6 M en 100 minutos a
un caudal de 6 ml/min y se recogieron fracciones de 12 ml de
tamaño. Usando 30 \mul de cada fracción, se midió la actividad
ADIF de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2. Se
descubrió que una fracción (460 ml) eluida a concentraciones de NaCl
de aproximadamente 0,3 a 0,45 M tenía actividad ADIF y se denominó
Muestra 5.
La Muestra 5 resultante se diluyó con 1.080 ml
de BisTris-HCl 50 mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al
0,1% y se dividió en tres partes. Cada parte se aplicó a un columna
de intercambio catiónico (Resource S, 0,5 x 5 cm,
Amasham-Pharmacia Biotech Co.) equilibrada con
BisTris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al 0,1% (pH
6,0) en tres partes. Después de lavar la columna con
BisTris-HCl 50 mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al 0,1
%, la proteína adsorbida se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0
a 0,6 M en 40 minutos a un caudal de 1 ml/min y se recogieron
fracciones de 1 ml de tamaño. Usando 10 \mul de cada fracción, se
midió la actividad ADIF de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 2. Se descubrió que una fracción (30 ml) eluida a
concentraciones de NaCl de aproximadamente 0,2 a 0,3 M tenía
actividad ADIF y se denominó Muestra 6.
La Muestra 6 resultante se concentró usando un
concentrador de centrifugación (Centricon 10, Millipore Co.) a
aproximadamente 600 \mul y se dividió en tres partes. Cada parte
se aplicó a una columna de filtración en gel (Superose 12, 1,0 x 60
cm, Amasham-Pharmacia Biotech Co.) equilibrada con
Tris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al 0,1% y NaCl
0,5 M (pH 7,5). Las proteínas se revelaron con
Tris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al 0,1% CHAPS y
NaCl 0,5 M NaCl (pH 7,5) a un caudal de 0,5 ml/min y se recogieron
fracciones de 0,5 ml de tamaño. Usando 10 \mul de cada fracción,
se midió la actividad ADIF de acuerdo con el método descrito en el
Ejemplo 2. Se descubrió que una fracción (9 ml) revelada entre
aproximadamente 25 a 30 minutos tenía actividad ADIF y se denominó
Muestra 7.
La Muestra 7 resultante se diluyó con 41 ml de
BisTris-HCl 50 mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al
0,1%, y se aplicó a una columna de afinidad de heparina (Heparina
5PW, 0,5 x 5 cm, Tosoh Corporation) equilibrada con
BisTris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al 0,1% (pH
6,0). Después de lavar la columna con BisTris-HCl 50
mM (pH 6,0) que contenía CHAPS al 0,1%, se eluyó la proteína
adsorbida con un gradiente lineal de NaCl 0,2 a 0,8 M en 120
minutos a un caudal de 0,5 ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml
de tamaño. Usando 10 \mul de cada fracción, se midió la actividad
ADIF de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2. Se descubrió
que una fracción (16 ml) eluida a concentraciones de NaCl de
aproximadamente 0,2 a 0,3 M tenía actividad ADIF y se denominó
Muestra 8.
La Muestra 8 resultante se concentró usando un
concentrador de centrifugación (Centricon 10, fabricado por
Millipore Co.) a aproximadamente 300 \mul y se diluyó con 600
\mul de BisTris-HCl 50 mM que contenía CHAPS al
0,1% (pH 6,0) y se aplicó a una columna de intercambio catiónico
débil (Polycat A, 0,46 x 20 cm, Poly LC Co.) equilibrada. Después
de lavar la columna con BisTris-HCl 50 mM (pH 6,0)
que contenía CHAPS al 0,1%, se eluyó la proteína adsorbida con un
gradiente lineal de NaCl 0 a 0,4 M en 50 minutos a un caudal de 1,0
ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml de tamaño (Fig. 2).
Usando 10 \mul de cada fracción, se midió la actividad ADIF de
acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2. Se descubrió que una
fracción de número de fracción 37 a 46 eluida a concentraciones de
NaCl de aproximadamente 0,3 a 0,4 M tenía actividad ADIF.
Se acidificó un ml de la fracción Polycat A
resultante Nº 43 con 10 \mul de TFA (ácido trifluoroacético) al
20% y se aplicó a una columna de fase inversa (C4, 2,1 x 250 mm,
VYDAC Co.) que se equilibró con acetonitrilo al 30% que contenía
TFA al 0,1% La proteína adsorbida se eluyó con un gradiente lineal
de acetonitrilo del 30 al 55% en 50 minutes a un caudal de 0,2
ml/min, y se recogió cada pico de proteína (Figura 3). La actividad
ADIF se midió de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2
usando 35 \mul de cada fracción de pico. El pico 5 muestra una
actividad ADIF dependiente de la concentración.
Los resultados se muestran en la Figura 4.
Se sometieron cien \mul de la fracción del
pico 5 que muestra la actividad ADIF a electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida en condiciones reductoras y no
reductoras. Específicamente, se concentraron 50 \mul de la
fracción del pico 5 al vacío y se disolvieron en 1,5 \mul de
Tris-HCl 10 mM (pH 8) que contenía EDTA 1 mM, SDS
al 2,5%, y azul de bromofenol al 0,01%, y se incubaron a 37ºC
durante una noche en condiciones reductoras (en presencia de
2-mercaptoetanol al 5%) o en condiciones no
reductoras a 37ºC durante noche, y cada 1 \mul de muestra se
analizó por gel en SDS-poliacrilamida por
electroforesis. La electroforesis se realizó usando un gel de
gradiente de acrilamida del 10-15% (Amasham
Pharmacia Biotech Co.) y un dispositivo de electroforesis Phast
System (Amasham Pharmacia Biotech Co.).
Se usaron fosforilasa b (94 kDa), albúmina
sérica bovina (67 kDa), ovalbúmina (43 kDa), anhidrasa carbónica
(30 kDa), inhibidor de tripsina (20,1 kDa), y
\alpha-lactalbúmina (14,4 kDa) como marcadores de
peso molecular. Después de la electroforesis, se realizó tinción
con plata usando el kit Phast Gel Silver Stain (Amasham Pharmacia
Biotech Co.). El peso molecular de la proteína del pico 5 se
determinó del siguiente modo. Específicamente, la distancia
recogida desde el extremo superior del gel de separación se midió
cuando se sometió a electroforesis cada marcador de peso molecular.
Se produjo una línea recta patrón representando la distancia
recorrida de cada marcador frente al peso molecular (en logaritmo).
El peso molecular de la proteína del pico 5 se determinó aplicando
la distancia de movimiento medida de la proteína a la línea recta
patrón. Los resultados se muestran en la Figura 5. Como puede
observarse a partir de los resultados, se detectó una única banda de
proteína de 45 kDa en condiciones no reductoras, y se detectaron
bandas de proteínas a aproximadamente 28 kDa y 23 kDa en condiciones
reductoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Se concentró una muestra que contenía
aproximadamente 0,2 \mug de ADIF purificado usando la columna de
fase inversa de acuerdo con el método del Ejemplo 3, ix) al vacío.
Se añadió un \mul de tampón fosfato sódico 0,5 M (pH 8,6), 1
\mul de 2-mercaptoetanol 0,5 M, 1 \mul de agua,
y 1 \mul de 250 U/ml de solución N-glicanasa
(Genzyme Co.) a la muestra. La muestra se agitó minuciosamente y se
incubó a 37ºC durante 24 horas. Después de la adición de 2 \mul
de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) que contenía EDTA
2 mM, SDS al 5%, azul de bromofenol al 0,02%, y
2-mercaptoetanol al 5%, la mezcla se agitó
minuciosamente y se incubó a 37ºC durante 24 horas. Un \mul de la
muestra resultante se sometió a electroforesis en gel de SDS
poliacrilamida de acuerdo con el método del Ejemplo 4, seguido por
tinción con plata. Como control, 0,2 \mul de ADIF no tratado
preparado de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 3, ix) se
sometió a la misma electroforesis y tinción con plata. Los
resultados se muestran en la Figura 6. Como resultado, el peso
molecular aparente de la proteína ADIF que no contiene cadenas de
azúcar de tipo de unión N medido por SDS-PAGE en
condiciones reductoras fue aproximadamente 18 kD. Como el peso
molecular aparente de la proteína ADIF no tratada medido por
SDS-PAGE en condiciones reductoras era
aproximadamente 23 kD y/o 28 kD, se demostró que ADIF era una
glicoproteína que contenía cadenas de azúcar de tipo de unión N en
la molécula. La diferencia entre 23 kD y 28 kD en los pesos
moleculares aparentes de la proteína ADIF no tratada medidos por
SDS-PAGE en condiciones reductoras puede
considerarse que se debe a la cantidad de uniones de las cadenas de
azúcar de tipo de unión N.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de las fracciones de Polycat A Nº
37-46 obtenidas en el Ejemplo 3, viii) se concentró
usando un concentrador de centrifugación (Centricon 10, Millipore
Co.) a aproximadamente 500 \mul, se acidificó con 10 \mul de
TFA al 20% y se aplicó a una columna de fase inversa (C4, 2,1 x 250
mm, VYDAC Co.) equilibrada con acetonitrilo 30% que contenía TFA al
0,1%. La proteína adsorbida se eluyó con un gradiente lineal de
acetonitrilo del 30 al 55% en 50 minutos a un caudal de 0,2 ml/min
y se recogió la fracción proteica correspondiente al pico 5. El
pico 5 resultante se concentró al vacío usando un concentrador de
centrifugación. La fracción concentrada se disolvió en 0,5 \mul
de Tris-HCl 10 mM (pH 8) que contenía EDTA 1 mM, SDS
al 2,5%, y azul de bromofenol al 0,01%, y se incubó en condiciones
reductoras (en presencia de 2-mercaptoetanol al 5%)
a 37ºC durante una noche, y se aplicaron 4 \mul de la fracción a
gel de SDS-poliacrilamida para electroforesis. La
electroforesis se realizó usando gel de gradiente de acrilamida del
10-15% (Amasham Pharmacia Biotech Co.) en un
dispositivo de electroforesis Phast System (Amasham Pharmacia
Biotech Co.). Después de la electroforesis, la proteína se
transfirió a una membrana de PVDF (ProBlot, Perkin Elmer Co.) a 20 V
y 25 mA usando un dispositivo de transferencia Phast Transfer
(Amasham Pharmacia Biotech Co.). Después de la transferencia, la
proteína se tiñó con azul de Coomassie al 2%/metanol al
40%/solución de ácido acético al 10%, y se destiñó con una solución
de metanol al 60% para retirar los colores excesivos. Las bandas de
aproximadamente 23 kDa y 28 kDa se cortaron, y se sometieron a
análisis de secuencia de aminoácidos N-terminal
usando un secuenciador de proteínas (Procise, tipo 492, fabricador
por Perkin Elmer Co.). Los resultados se muestran en la Tabla de
Secuencias SEC ID Nº 1.
Cada fracción de las fracciones 37 a 46 de
Polycat A obtenidas del mismo modo que se ha descrito anteriormente
de aproximadamente 80 l de medio de cultivo IMR-90
se acidificó con 10 \mul de TEA al 20 % y se aplicó a una columna
de fase inversa (C4, 2,1 x 250 mm, VYDAC Co.) equilibrada con
acetonitrilo al 30% que contenía TFA al 0,1% diez veces. La
proteína adsorbida se eluyó con un gradiente lineal de acetonitrilo
del 30 al 55% en 55 minutos a un caudal de 0,2 ml/min, y se recogió
la fracción proteica correspondiente al pico 5. La proteína
resultante del pico 5 estaba piridiletilada en condiciones
reductoras y se sometió a análisis de secuencia de aminoácidos
N-terminal usando un secuenciador de proteínas
(Procise, tipo 492, fabricado por Perkin Elmer Co.) Como resultado,
pudo determinarse una secuencia de aminoácidos del aminoácido
N-terminal al número 40. Los resultados se muestran
en la Tabla de Secuencias, SEC ID Nº 2.
Se aislaron aproximadamente 10 \mug de
poli(A) + ARN de 1 x 10^{8} células IMR-90
usando el kit de aislamiento de ARNm Fast Truck (fabricado por
Invitro Gene Co.) de acuerdo con el manual del kit.
Se sintetizaron los siguientes dos cebadores
mixtos basados en la secuencia de aminoácidos
N-terminal obtenida en el Ejemplo 6 y descrita en
la Tabla de Secuencias, SEC ID Nº 2. Específicamente, se
sintetizaron todos los oligonucleótidos (cebador mixto, TAE/F) que
pueden codificar la secuencia de aminoácidos desde el resto 13
(Thr) hasta el resto 19 (Cys) desde el extremo N. Además, se
sintetizaron todos los oligonucleótidos complementarios (cebador
mixto, CFE/R) que puede codificar la secuencia de aminoácidos desde
el resto 29 (Gly) al resto 35 (Glu) desde el extremo N. Las
secuencias de bases de los cebadores mixtos usados se muestran en la
Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generó un ADNc monocatenario usando el kit de
síntesis de ADNc Superscript II (Gibco BRL Co.) y 1 \mug de
poli(A) + ARN obtenido en el Ejemplo 7, i) de acuerdo con el
protocolo de Gibco BRL Co. El fragmento de ADN que codifica ADIF se
obtuvo por PCR usando el ADNc y el molde y los cebadores descritos
en el Ejemplo 8, ii). La composición de la solución de reacción es
la siguiente.
| Tampón Ex Taq 10X (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 10 \mul |
| dNTP 2,5 mM | 8 \mul |
| Solución de ADNc | 2,5 \mul |
| Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 1 \mul |
| Agua destilada | 73,5 \mul |
| Cebador TAE/F 20 \muM | 2,5 \mul |
| Cebador CFE/R 20 \muM | 2,5 \mul |
Las soluciones anteriores se mezclaron en un
tubo de microcentrífuga y se realizó la PCR en las siguientes
condiciones. Después del pre-tratamiento a 95ºC
durante 3 minutos, se repitió 40 veces una reacción de 3 etapas
compuesta por las etapas a 95ºC durante 30 segundos, a 50ºC durante
30 segundos, y a 72ºC durante un segundo. Después, la mezcla de
reacción se incubó durante 5 minutos a 72ºC. Se analizó una parte de
la mezcla de reacción por electroforesis en gel de agarosa, y se
acidificó un fragmento de ADNc de aproximadamente 68 pb que se
esperaba de la secuencia de aminoácidos
N-terminal.
El fragmentos de ADNc obtenido en el Ejemplo 7,
iii) se insertó en el Tvector pT7 (Novagen Co.) usando un kit de
ligamiento de ADN Ver. 2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) y se transformó
Escherichia coli XL2Blue (Stratagene Co.) con la reacción de
ligamiento. Los transformantes resultantes se amplificaron y se
purificó el plásmido que contenía el ADNc de ADIF (aproximadamente
68 pb) de acuerdo con un método convencional. Este plásmido se
llamó pBSADIF. La secuencia de ADNc de ADIF en este plásmido se
determinó usando un kit de secuenciación de ADN (Perkin Elmer). La
secuencia de aminoácidos de los 23 aminoácidos predichos a partir de
esta secuencia podría encontrarse en la secuencia de aminoácidos
N-terminal (Tabla de Secuencias, SEC ID Nº 2) de
ADIF que se usó para diseñar los cebadores mixtos. En base a los
resultados anteriores, se confirmó que el ADNc de 68 pb clonado era
un fragmentos de ADNc de ADIF.
El fragmento de ADNc de ADIF se amplificó por
PCR en las condiciones del Ejemplo 6, iii) usando el fragmento de
ADNc de ADIF de 68 pb insertado en el plásmido preparado en el
Ejemplo 8 como molde. El fragmento de ADNc de ADIF con
aproximadamente 68 pb se sometió a una electroforesis en gel de
agarosa preparativa, y se purificó usando un kit de aislamiento
QIAEXIIDNA (Qiagen Co.). Este ADNc se marcó con plásmido
[\alpha32P]dCTP usando un kit de marcaje de ADN megaprime
(Amasham Pharmacia Biotech Co.) y se usó como sonda para seleccionar
el ADNc de ADIF de longitud completa.
Se sintetizó al ADNc usando 2,5 \mug de la
poli (A) + ARN obtenido en el Ejemplo 7, i) cebador oligo (dT), y
el kit de síntesis de ADNc Greatlength (fabricado por Clonetech Co.)
de acuerdo con el protocolo de Clonetech Co., se ligó el adaptador
EcoRI-SalI-NotI al ADNc y se separó el ADNc por
fraccionamiento de tamaño. Se precipitó el ADNc purificado con
etanol y se disolvió en 10 \mul de una solución tampón TE. El
ADNc resultante con el adaptador (0,1 \mul) se insertó por ADN
ligasa T4 en un vector de expresión \lambdaZAP (Stratagene Co.)
que se había digerido previamente con EcoRI. El ADN del fago
recombinante resultante que contenía el ADNc se empaquetó in vitro
usando Gigapack Gold II (Stratagene Co.) y se preparó una biblioteca
de fagos de expresión de \lambdaZAP recombinante.
El fago recombinante obtenido en el Ejemplo 10
se infectó con Escherichia coli XL1-Blue MRF
(Stratagene Co.) durante 15 minutos a 37ºC. Las células de
Escherichia coli infectadas se añadieron a un medio NZY a 50ºC que
contenía agar al 0,7% y se sembraron en placas de agar NZY. Después
de incubación a 37ºC durante una noche, se unió Hybond N (Amasham
Pharmacia Biotech Co.) a la superficie de la placa que contenía
Plague durante aproximadamente 30 minutos. El filtro se
desnaturalizó en solución alcalina, se neutralizó, y se lavó en
2XSSC de acuerdo con un método convencional. El ADN del fago se
inmovilizó en el filtro por reticulación con UV (Stratagene Co.).
El filtro se incubó en un tampón de hibridación rápida que contenía
100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón (Amasham Co.) a 65ºC
durante 1 hora y después se incubó durante una noche en el mismo
tampón que contenía 2 x 10^{5} cpm/ml de sonda de ADN
desnaturalizada preparada en el Ejemplo 9. Después de la reacción,
se lavó el filtro dos veces con 2XSSC, dos veces con 0,1XSSC, y dos
veces con una solución de SDS al 0,1%, cada una a 65ºC durante 10
minutos. El filtro lavado se unió a un película de rayos X y se dejó
reposar durante una noche a -80ºC. Los clones positivos se
seleccionaron por revelado de la película de rayos X. Algunos clones
positivos obtenidos se purificaron seleccionando una vez más. Entre
estos clones, se usaron los que contienen un inserto de ADN de
aproximadamente 2,0 kb en los siguientes experimentos. El fago
purificado y el fago auxiliar ExAssisi (Stratagene Co.) se
introdujeron por infección en Escherichia coli
XL1-Blue MRF' (Stratagene Co.) usando un kit de
clonación de expresión \lambdaZAP (Stratagene Co.) de acuerdo con
el protocolo de Stratagene Co. Se preparó el caldo de cultivo de
XLI-Blue MRF' infectadas. El caldo que contenía los
fagómidos escindidos se introdujo por infección en Escherichia
coli XLOLR (Stratagene Co.) y se obtuvo el transformante que
tiene el plásmido que contiene pBKADIF que consta de pBKCMV
(Stratagene Co.) con el inserto de 2,0 kb mencionado anteriormente
recogiendo las colonias resistentes a kanamicina. El transformante
se depositó en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, the Ministry of International Trade and Industry, el 11
de agosto de 1998, con el número de depósito FERM
BP-6459 con el nombre de XLOLR/pBKADIF. La solución
madre de transformante que tiene este plásmido se amplificó y se
purificó el plásmido de acuerdo con el protocolo convencional.
La secuencia de nucleótidos del ADNc de ADIF
obtenida en el Ejemplo 11 se determinó usando un kit de
secuenciación de ADN (Perkin Elmer Co.). Los cebadores usados
fueron los cebadores T3, T7 (Stratagene Co.) y cebadores sintéticos
diseñados de acuerdo con la secuencia de ADNc de ADIF, cuyas
secuencias se muestran en la Tabla de Secuencias, SEC ID Nº
4-11. La secuencia de nucleótidos del ADNc de ADIF
determinada de este modo y la secuencia de aminoácidos
correspondiente predicha por la secuencia de ADNc se muestran en las
SEC ID Nº 12 y 13 de la Tabla de Secuencias respectivamente.
El plásmido pBKADIF obtenido en el Ejemplo 10 se
digirió con la enzima de restricción, SalI. El inserto de ADNc de
ADIF se cortó, se separó por electroforesis en gel de agarosa, y se
purificó usando un kit de aislamiento QIAEXIIDNA (Qiagen Co.). El
ADNc de ADIF purificado se ligó usando un kit de ligamiento Ver. 2
(Takara Shuzo Co., Ltd.) al plásmido de expresión pCEP4 (Inviro
Gene Co.) previamente diferido con la enzima de restricción
XhoI y se transformó E. coli DH5\alpha (Gibco BRL
Co.) tratado con fosfatasa alcalina con la mezcla de ligamiento.
Los transformantes resultantes se cultivaron y se purificó el
plásmido pCEPADIF que contenía el ADNc de ADIF usando QIAGEN
Plasmid Midi Kit (Qiagen Co.). El plásmido de expresión de ADIF
pCEPADIF se precipitó con etanol y el precipitado se disolvió en
agua destilada esterilizada a usar para los siguientes
experimentos.
Se produjo ADIF recombinante usando el plásmido
de expresión de ADIF pCEPADIF preparado en el Ejemplo 13, i) de
acuerdo con el siguiente método y su actividad biológica medida se
suspendieron 2x10^{5} células 293/EBNA (Invitro Gene Co.) en IMDM
(Gibco BRL Co.) que contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco BRL
Co.) y se inocularon en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.
En el siguiente día, se mezclaron pCEPADIF y un reactivo de
transfección FuGENE ^{TM}6 (Roche Diagnostic Co.) previamente
diluido con IMDM, y la mezcla se añadió a las células en cada
pocillo de acuerdo con el protocolo de los fabricantes adjunto al
FuGENE ^{TM}6. Se usaron 0,5 mg del pCEPADIF y 1 \mul de FUGENE
^{TM}6 para cada transfección. Después de 72 horas, se recogió el
medio condicionado y se usó para la determinación de la actividad
ADIF. La actividad ADIF se determinó por el siguiente método.
Específicamente, se midió la formación de adipocitos inducida por
dexametasona mediante acumulación de triglicéridos usando
preadipocitos de ratón MC3T3-G2/PA6 como células
diana para determinar la actividad supresora. Más específicamente,
se pusieron 50 \mul de la muestra diluida con
\alpha-MEM (Gibco BRL) que contenía suero bovino
fetal al 10% en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se
inocularon células preadipocitos de ratón
MC3T3-G2/PA6 (3 x 10^{3}), suspendidas en 50
\mul de \alpha-MEM que contenía dexametasona 2
x 10^{-7} M y suero bovino fetal al 10%, en la placa de
microtitulación y se incubaron durante una semana en condiciones de
CO_{2} al 5% a 37ºC y humedad del 100%. Después de siete días, se
retiró el medio por aspiración y las células se secaron al aire
para medir la cantidad de triglicéridos acumulados en los adipocitos
usando un kit de ensayo de triglicéridos (Triglyceride
G-Test Wako, Nº de Código 274-69802,
fabricado por Wako Pure Chemicals Co., Ltd.). La disminución de la
OD a 510 nm se tomó como la actividad ADIF. Como resultado, como se
muestra en el Tabla 2, se confirmó que el caldo de cultivo de
células 293/EBNA transfectadas con el gen de ADIF mostraba la misma
actividad que ADIF natural previamente obtenido del caldo de cultivo
de IMR-90.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad ADIF se evaluó estimando los
efectos de supresión de la adipogénesis inducida por dexametasona y
1-metil-3-isobutil-xantina
con acumulación de triglicéridos usando células preadipocitos
precursores de ratón 3T3-LI (Depositadas en la
ATCC, Nº de Depósito CL173) como células diana. Específicamente, se
pusieron 50 \mul de la muestra diluida con
\alpha-MEM (Gibco BRL) que contenía suero bovino
fetal al 10% en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se
suspendieron las células de reserva preadipocitos de ratón
3T3-LI (5 x 10^{3}) en 50 \mul de medio
\alpha-MEM que contenía dexametasona 4 x 10^{-7}
M,
1-metil-3-isobutil-xantina
2 x 10^{-5} M, y suero bovino fetal al 10%, se inocularon en la
placa de microtitulación y se incubaron durante una semana en
condiciones de CO_{2} al 5% a 37ºC y humedad del 100%. Después de
siete días, se retiró el medio por aspiración y las células se
secaron al aire para medir la cantidad de triglicéridos acumulados
en los adipocitos usando un kit de ensayo de triglicéridos
(Triglyceride G-Test Wako, Nº de Código
274-69802, fabricado por Wako Pure Chemicals Co.,
Ltd.). La disminución de la OD a 510 nm se tomó como la actividad
ADIF. Como resultado, como se muestra en la Tabla 3, también se
confirmó que el caldo de cultivo de las células 293/EBNA
transfectadas con el gen de ADIF mostraba la actividad ADIF cuando
se usaban células 3T3-LI como célula diana.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadieron una secuencia que reconoce la
enzima de restricción XhoI y una secuencia que codifica FLAG
inmediatamente después de la secuencia que codifica la Arg 265que
es el extremo C de la secuencia de aminoácidos de ADIF descrita en
la SEC ID Nº 13. Se añaden diez aminoácidos, Leu, Glu, Asp, Tyr,
Lys, Asp, Asp, Asp, Asp, y Lys, después la Arg 265 por esta
secuencia. La mutagénesis se realizó por el método de PCR. Las
secuencias de los cebadores usados para la mutagénesis se muestran
en la Tabla 4 y las SEC ID Nº 14-19.
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR se realizó en las siguientes
condiciones.
Después de la reacción durante 3 minutos a 95ºC,
1 minuto a 55ºC, y 3 minutos a 72ºC, se repitió 25 veces una
reacción de 3 etapas compuesta por las reacciones durante un minuto
a 96ºC, un minuto a 55ºC, y tres minutos a 72ºC. Después, se incubó
la mezcla de reacción durante cinco minutos a 72ºC. La composición
de la solución de reacción de PCR se muestra a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
La solución de reacción de PCR para
mutagénesis
| Ex Taq polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 0,5 \mul |
| Tampón Ex Taq 10x (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 10 \mul |
| Solución dNTP 2,5 mM | 8 \mul |
| Vector plasmídico molde (pCEPADIF 40 ng/\mul) | 1 \mul |
| Cebador 0,1 M (ADFY1 Hd) | 1 \mul |
| Cebador 0,1 M (ADFLSXR) | 1 \mul |
| Agua destilada esterilizada | 78,5 \mul |
El ADN obtenido por PCR se separó por
electroforesis en gel de agarosa y se extrajo con 20 \mul de agua
destilada esterilizada usando el kit de Extracción de Gel QIAEXII
(Qiagen Co.). Se trataron diez \mul de una solución que contenía
el ADN extraído con la enzima de restricción HindIII (Takara
Shuzo Co., Ltd.) y SalI (Takara Shuzo Co., Ltd.) para
digerir el ADN. La solución de ADN se sometió a electroforesis
usando gel de agarosa al 1,5% y el ADN diana se extrajo con 20
\mul de agua destilada esterilizada usando el kit de Extracción de
Gel QIAEXII (Solución de ADN 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Se digirió pCEP4 con la enzima de restricción
HindIII y XhoI (Takara Shuzo Co., Ltd.) y se sometió
a electroforesis usando gel de agarosa al 1,0%. Se extrajo un
fragmento de ADN con aproximadamente 10 kpb usando el kit de
Extracción de Gel QIAEXII (Solución de ADN 2).
Se añadieron cuatro \mul de la solución del
kit de ligamiento de ADN Ver. 2I (Takara Shuzo Co., Ltd.) a 3
\mul de Solución de ADN 1 y 1 \mul de Solución de ADN 2, y la
mezcla se sometió a una reacción de ligamiento manteniéndola a 16ºC
durante 30 minutos. Se transformó Escherichia coli
DH5\alpha usando la solución de reacción resultante. La
estructura de ADN de Escherichia coli transformado que era
resistente a ampicilina se analizó para seleccionar los
transformantes que tenían el plásmido diana. El análisis de la
estructura de ADN se realizó midiendo la longitud del fragmento
obtenido por digestión con enzima de restricción y determinando la
secuencia de ADN. El vector de expresión se llamó pCEP4
ADIF-FLAG(+ XhoI).
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivó Escherichia coli que tenía
pCEP4-ADIF-FLAG (+XhoI) en 25 ml de
medio LB (bacto-triptona al 1%,
bacto-extractos de levadura al 0,5%, NaCl al 1%) y
se purificó por el kit QIAGEN Plasmid Midi (Qiagen Co.). el vector
de expresión se precipitó con etanol y se disolvió el precipitado en
50 \mul de agua destilada esterilizada a usar para el siguiente
experimento.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon mutantes que tienen la misma
secuencia de aminoácidos que la SEC ID Nº 13, pero está delecionada
en las secuencias de Arg 236 a Arg 265, de Gly 206 a Arg 265, de Ser
176a Arg 265, de Glu 146 a Arg 265, o de Thr 116a Arg 265. Los
mutantes con deleción de las secuencias de Arg 236 a Arg 265, de Gly
206 a Arg 265, de Ser 176 a Arg 265, de Glu 146a Arg 265, y de Thr
116a Arg 265se llamaron respectivamente ADIF-R1,
ADIF-R2, ADIF-R3,
ADIF-R4, y ADIF-R5.
La mutagénesis para la preparación de los
mutantes se realizó por el método de PCR. Los cebadores usados para
la mutagénesis se muestran en la Tabla y las secuencias de los
cebadores se muestran en las SEC ID Nº. La PCR se realizó en las
siguientes condiciones. Después de la reacción durante 3 minutos a
97ºC, 1 minuto a 55ºC, y 3 minutos a 72ºC, se repitió 25 veces una
reacción de 3 etapas compuesta por las reacciones durante un minuto
a 96ºC, un minuto a 55ºC, y tres minutos a 72ºC. Después, la mezcla
de reacción se incubó durante cinco minutos a 72ºC. La composición
de la solución de reacción de PCR se muestra a continuación.
La solución de reacción de PCR para la
mutagénesis de deleción C-terminal
| Ex Taq polimerasa (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 0,5 \mul |
| Tampón Ex Taq 10x (Takara Shuzo Co., Ltd.) | 10 \mul |
| Solución dNTP 2,5 mM | 8 \mul |
| Vector plasmídico molde (pCEPADIF 40 ng/\mul) | 1 \mul |
| Cebador 0,1 M (ADFY1 Hd) | 1 \mul |
| Cebador de mutagénesis 0,1 M | 1 \mul |
| Agua destilada esterilizada | 78,5 \mul |
El ADN obtenido por el método de PCR se separó
por electroforesis en gel de agarosa y se extrajo con 20 \mul de
agua destilada esterilizada usando el kit de Extracción de Gel
QIAEXII. Se trataron diez \mul de una solución que contenía ADN
extraído con la enzima de restricción HindIII y SalI
para digerir el ADN. La solución de ADN se sometió a electroforesis
usando gel de agarosa al 1,5% y se extrajo el fragmento de ADN
diana con 20 \mul de agua destilada esterilizada usando el kit de
Extracción de Gel QIAEXII (Solución de ADN 3).
Se digirió
pCEP4-ADIF-FLAG(+ XhoI) con
la enzima de restricción HindIII y XhoI y se sometió
a electroforesis usando gel de agarosa al 1,0%. Se extrajo un
fragmento de ADN con una longitud de aproximadamente 10 kpb usando
el kit de Extracción de Gel QIAEXII (Solución de ADN 4).
Se añadieron cuatro \mul de solución de kit de
ligamiento de ADN Ver. 2I a 3 \mul de Solución de ADN 3 y 1
\mul de Solución de ADN 4, y la mezcla se sometió a una reacción
de ligamiento manteniéndola a 16ºC durante 30 minutos. Se
transformó Escherichia coli DH5\alpha usando la solución de
reacción resultante. La estructura de ADN de Escherichia
coli transformada que era resistente a ampicilina se analizó
para seleccionar el transformante que tenía el plásmido diana. El
análisis de la estructura de ADN se realizó midiendo la longitud
del fragmento obtenido por digestión con enzima de restricción y
determinando la secuencia de ADN. Los vectores de expresión para
ADIF-R1, ADIF-R2,
ADIF-R3, ADIF-R4 y
ADIF-R5 se llamaron respectivamente
pCEP4-ADIF-R1,
pCEP4-ADIF-R2,
pCEP4-ADIF-R3,
pCEP4-ADIF-R4, y
pCEP4-ADIF-R5.
Se cultivó Escherichia coli que tenía el
vector de expresión mutante en 25 ml de medio LB y se purificó por
el kit QIAGEN Plasmid Midi. Cada vector de expresión se precipitó
con etanol y el precipitado se disolvió en 50 \mul de agua
destilada esterilizada a usar para el siguiente experimento.
Se suspendieron 2 x 10^{6} células
293-EBNA en 20 ml de IMDM que contenía suero bovino
fetal al 10%, se propagaron en un matraz de cultivo de 75 cm^{2},
y se cultivaron durante 24 horas en CO_{2} a 37ºC. Se añadieron
cien ml de FuGENE6 (Roche Diagonostic) a 3,5 ml de medio IMDM libre
de suero. La mezcla se dejó reposar durante 5 minutos a temperatura
ambiente y se añadió gota a gota a una solución que contenía 35
\mug de ADIF-FLAG (+ XhoI). La mezcla
resultante se dejó reposar durante 15 minutos a temperatura
ambiente. Esta mezcla se añadió gota a gota a las células en los
cinco matraces de 75 cm^{2}, de 700 \mul cada uno,
introduciendo por transfección de este modo el vector de expresión
en las células. Se aplicó el mismo procedimiento a los otros
vectores de expresión mutantes. Las células transfectadas con los
vectores de expresión se incubaron en un incubador de CO_{2} a
37ºC durante 24 horas. Después de cultivar, se añadieron 20 ml de
IMDM libre de suero, reciente y las células se cultivaron en un
incubador de CO_{2} a 37ºC durante 48 horas. Se recogió el caldo
de los matraces de cultivo, se añadieron 20 ml de IMDM libre de
suero, reciente, a los matraces de cultivo, y se continuó
cultivando las células en un incubador de CO_{2} a 37ºC durante 48
horas. El caldo de cultivo se recogió y combinó con el caldo de
cultivo recogido previamente para obtener un total de 200 ml de
caldo de cultivo.
Se purificó ADIF-FLAG(+
XhoI) y mutantes de 200 ml del caldo de cultivo obtenido de
las células de expresión transitoria. En la purificación, se
adsorbieron específicamente ADIF-FLAG(+ XhoI)
y mutantes en y se eluyeron de un vehículo de gel que contenía un
anticuerpo anti-FLAG (M2, Sigma Co.) como
ligando.
Se cargó un ml del gel suspendido en TBS/T
(Tris-HCI 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, Tween 80 al
0,01% (Sigma Co.)) en 8 tubos de centrífuga (volumen: 50 ml). Se
añadieron veinte ml del caldo de cultivo recogido a cada tubo y la
mezcla se giró suavemente a 4ºC durante 24 horas para provocar que
se adsorbieran ADI F-FLAG(+ XhoI) y los
mutantes al anticuerpo. Los geles precipitados por centrifugación se
recogieron en un tubo de centrífuga (Volumen: 15 ml). El gel se
lavó suspendiéndolo en 10 ml de TBS/T y centrifugando la suspensión.
Después de lavar tres veces, el gel se suspendió en 5 ml de un
tampón de elución (GIicina-HCl 0,1 M (pH 2,8), NaCl
150 mM, Tween 80 al 0,01%) y se centrifugó para recoger la solución
eluida. Este procedimiento se repitió para obtener 10 ml de la
solución eluida en total. La solución eluida se neutralizó con la
adición de 100 \mul de Tris 3 M. La solución eluida se reemplazó
con un tampón fosfato sódico (fosfato sódico 10 mM (pH 7,0), NaCl
0,3 M) usando Centriplus 10 (Millipore Co.) y se ajustó la
concentración de proteína a 32 \mug/ml con el mismo tampón.
El ADIF-FLAG (+ XhoI)
purificado y los mutantes se sometieron a SDS-PAGE.
La electroforesis se realizó en condiciones reductoras usando Phast
System (Amasham Pharmacia Biotech Co.). El
ADIF-FLAG(+ XhoI) purificado y los mutantes,
60 ng cada uno, se sometieron a un gel de gradiente del
10-15% (Amasham Pharmacia Biotech Co.) para
electroforesis.
Como resultado, cada peso molecular de
ADIF-FLAG(+ XhoI) y los mutantes fue casi
uniforme con el basado en las secuencias de nucleótidos. La pureza
fue de más del 90%.
Se inocularon células 3T3-L1
suspendidas en DMEM que contenía suero bovino fetal al 10%
(DMEM-FCS) a una concentración de 5 x 10^{4}
células/ml en una placa de 96 pocillos en la cantidad de 100
\mul/pocillo, y se cultivaron en un incubador de CO_{2} durante
96 horas a 37ºC. Para diferenciar las células confluyentes en
adipocitos, se reemplazó el medio en la placa de 96 pocillos con
DMEM-FCS que contenía
1-metil-3-isobutil-xantina
5 x 10^{-4} M y dexametasona 1 x 10^{-6} M y las células se
cultivaron durante 48 horas en un incubador de CO_{2} a 37ºC. Se
añadió DMEM-FCS al medio de cultivo para preparar
las concentraciones de ADIF-FLAG (+ XhoI) o
los mutantes de 200 ng/ml a 6,4 \mug/ml. Después de cultivar
durante 48 horas, se retiró el medio y se añadieron a cada pocillo
100 \mul de DMEM-FCS que contenía
ADIF-FLAG(+ XhoI) o los mutantes en la misma
concentración que anteriormente. El cultivo se continuó en un
incubador de CO_{2} a 37ºC durante cinco días, y las células se
diferenciaron en adipocitos. Después de cultivar, se examinó la
actividad inhibidora de la adipogénesis (actividad ADIF) de las
células en la placa de 96 pocillos, que se secó minuciosamente
después de retirar el caldo de cultivo, usando el
Triglyceride-G Test Wako (Wako Pure Chemicals Co.,
Ltd.). La disminución de la absorbancia encontrada en una muestra a
parir de la absorbancia a 510 nm en el pocillo en sin mutantes se
tomó como la actividad ADIF de la muestra.
Los resultados se muestran en la Figura 7. La
medida de la actividad se realizó dos veces para cada muestra y se
muestra el valor medio de las dos medidas. Los mutantes
ADIF-R1, ADIF-R2 y
ADIF-R3 mostraron casi la misma actividad
específica que ADIF-FLAG (+ XhoI). La
actividad específica de ADIF-R4 fue menor de 1/30
de la de ADIF-FLAG (+ XhoI).
ADIF-R5 no mostró actividad ADIF incluso a una
concentración de 6,4 \mug/ml.
Se proporciona un factor inhibidor de la
adipogénesis (ADI F) que es una nueva proteína que tiene una
actividad que suprime la diferenciación y/o maduración de
adipocitos; un proceso para producir la proteína cultivando
fibroblastos humanos y purificándolos del caldo de cultivo usando
cromatografía en columna de intercambio iónico, columna de
afinidad, y columna de fase inversa; y un proceso para producir de
forma eficaz la proteína cultivando los fibroblastos humanos usando
trozos de cerámica de alúmina como un vehículo de adhesión celular.
También se proporciona un ADNc que codifica la proteína y un proceso
para producir la proteína usando el ADNc. La proteína de la
presente invención es útil como una composición farmacéutica para
prevenir o tratar la obesidad o como un antígeno para establecer un
diagnóstico inmunológico.
Nombre y dirección de la organización en la que
se han depositado los microorganismos:
Nombre: National Institute of Bioscience and
Human-Technology, the Agency of Industrial Science
and Technology, the Ministry of International Trade and
Industries
Dirección:
1-1-3, Higashi,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón
(Código Postal: 305-8566).
Fecha de deposición: 11 de agosto de 1998
Número de depósito dado por la organización de
deposición: FERM BP-6459
<110> Snow Brand Milk Products Co.,
Ltd.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva proteína y procesos para
producir la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> SNOW-126/42445
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>PCT/JP99/01906
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
09-04-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 10-99741
\hskip1cmJP 10-243355
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-04-1998
\hskip1cm28-08-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Xaa Gln Gln Xaa Gly Arg Leu Xaa Leu Gln
Asn Thr Ala Glu Ile}
\sac{Gln His Xaa Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212>PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Xaa Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu Ser Leu Gln
Asn Thr Ala Glu Ile}
\sac{Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val
Gly Cys Gly Val Phe Glu}
\sac{Cys Phe Glu Asn Asn Xaa Xaa Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Gln Gln Lys GLy Arg Leu Ser Leu Gln
Asn Thr Ala Glu Ile}
\sac{Gln His Cys Leu Val Asn Ala Gly Asp Val
Gly Cys Gly Val Phe Glu}
\sac{Cys Phe Glu Asn Asn Ser Cys Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATTAACCCT CACTAAAGGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTAATACGAC TCACTATAGG GC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGAGGGGAG CACAAAGGAT
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCCCTGCAG AATACAGCGG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAAGGACTTG CTGCTGCACG
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGACGGCGT GGAGGAAAGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCAAGATG GAGCACAGGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGTGCAGA AAAGTCATGC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGAAGCT TGCGGCGAAG AGGAAGAGG
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCGAGGG CATGGGCGTT TGGGTGG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCGAGTG CTTCCCCGTG GTGGGCC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCGAGGG TGCAGAAGCT CAAGATG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTCGAGCC CACAGGTCAG CAGCAAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
ADN Sintetizado
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGGGGCTCGA GGTTCTCCTG GGCAGCCGCG CACAG
\hfill35
Claims (7)
1. Una proteína aislada de fibroblastos
pulmonares fetales humanos; que se purifica de un caldo de cultivo
de fibroblastos pulmonares fetales humanos por cromatografía usando
columna de intercambio iónico, columnas de afinidad de heparina y
columnas de fase inversa; y que se caracteriza por las
siguientes propiedades:
a) tiene una actividad que suprime la
diferenciación y/o maduración de adipocitos,
b) tiene un peso molecular por electroforesis en
gel de SDS-poliacrilamida de aproximadamente 45 kD
en condiciones no reductoras, y aproximadamente 28 kD y/o 23 kD en
condiciones reductoras,
c) muestra afinidad a heparina de acuerdo con un
intervalo específico de concentraciones de NaCl,
d) contiene cadenas de azúcar unidas a N, que se
retiran para formar una proteína con PM de aproximadamente 18 kD por
SDS-PAGE en condiciones reductoras, y
e) está compuesta por la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº 13.
2. Un método para producir la proteína de
acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar fibroblastos
pulmonares fetales humanos en trozos de cerámica de alúmina y
purificar la proteína del caldo de cultivo por cromatografía usando
columnas de intercambio iónico, columnas de afinidad de heparina y
columnas de fase inversa.
3. Un polipéptido recombinante que comprende los
restos aminoacídicos 1 a 175 de la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº 13; tiene una actividad para suprimir la diferenciación
y/o maduración de adipocitos; y se produce usando la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID Nº 12 por una técnica de
ingeniería genética.
4. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 3, que tiene los restos aminoacídicos
1-175; 1-205; 1-235
ó 1-265 de la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID Nº 13.
5. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 3, que se produce en células de mamífero como células
hospedadoras por una técnica de ingeniería genética.
6. Una composición farmacéutica para suprimir la
diferenciación y/o maduración de adipocitos, que comprende la
proteína de la reivindicación 1 o el polipéptido recombinante de las
reivindicaciones 3, 4 ó 5.
7. Uso de la proteína de la reivindicación 1 o
el polipéptido recombinante de las reivindicaciones 3, 4 ó 5 en la
fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de
la obesidad.
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